CN109072301A - Mtrnr1基因突变的测定 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于测定受试者样品中人线粒体编码的12S RNA(MTRNR1)基因的突变存在的方法和试剂盒，所述突变选自由1555A>G和1494C>T组成的组，尤其包括：扩增至少部分MTRNR1基因并用共价偶联到吗啉代寡核苷酸探针的等离子体金纳米颗粒检测扩增的DNA。要求保护的方法可用于测定受试者患氨基糖苷类引起的听力丧失的风险。

Description

MTRNR1基因突变的测定
本申请参考并要求2016年2月17日提交的新加坡专利申请No.10201601165V的优先权，依据PCT细则第4.18条，其内容通过引用并入本发明用于所有目的，包括不包含在本发明中的以及在PCT细则第20.5(a)条提及的说明书、权利要求或附图的任何元素或部分。
技术领域
本发明总体上涉及用于检测人线粒体编码的12S RNA(MTRNR1)基因(SEQ ID NO：1)中突变存在的方法和试剂盒。
背景技术
遗传突变是儿童早期听力丧失的主要原因。已知人线粒体基因MTRNR1(12S rRNA)中的两种致病变体，即1555A>G和1494C>T，与暴露于氨基糖苷类引起的失聪密切相关。这种突变也是母性遗传的，从一个女人传给她所有的后代。
氨基糖苷类，包括链霉素、庆大霉素、卡那霉素、妥布霉素和新霉素，是通常用于治疗细菌感染的抗生素。然而，众所周知，这些抗生素也是耳毒性的。如果将氨基糖苷类抗生素施用于携带mtDNA 1555A>G或1494C>T突变的个体，即使药物水平在正常范围内，他们也可能会遭受进展快速的、严重的和永久性的听力丧失。
因此，在用氨基糖苷类治疗之前对致病性mtDNA变体进行遗传筛选，可能会提供关于氨基糖苷类引起的听力丧失的风险信息。通过选择替代性疗法，可以预防易感个体的听力丧失。
现有技术中已存在用于测定基因突变的各种技术。然而，仍然急切需要新技术来克服现有技术的缺点。
发明内容
本发明通过提供一种新的用于测定人MTRNR1基因(SEQ ID NO：1)中突变存在的方法和试剂盒，从而满足了上述本领域的需要。
在一个方面，本发明提供了一种测定样品中人线粒体编码的12S RNA(MTRNR1)基因(SEQ ID NO：1)中突变存在的方法，其中所述突变选自由1555A>G和1494C>T组成的组，并且所述方法包括以下步骤：
(a)在允许扩增产生PCR扩增产物(扩增子)的条件下，在聚合酶链式反应(PCR)中使用一对引物扩增至少部分MTRNR1基因，所述部分包含突变状态待分析的位置；
(b)在允许寡核苷酸类似物探针和扩增子彼此杂交的条件下，将不同试管中的扩增子分别与对野生型或突变的扩增子特异的等离子体纳米探针接触，所述等离子体纳米探针包括等离子体纳米颗粒和与其共价偶联的非离子寡核苷酸类似物探针，所述寡核苷酸类似物探针包含与野生型或突变的扩增子互补的碱基序列，其中探针在与扩增子杂交时产生可检测信号，该信号可与未杂交探针的信号区分开；
(c)基于测定纳米探针和扩增子的杂交体的解链温度Tm来确定突变的存在。
在各种实施方案中，在该方法的步骤(a)中使用的PCR是不对称PCR(aPCR)。
在各种实施方案中，在该方法的步骤(b)中使用的等离子体纳米探针包含的等离子体纳米颗粒是等离子体金纳米颗粒。
在各种实施方案中，在该方法的步骤(b)中使用的等离子体纳米探针包含的非离子寡核苷酸类似物探针是吗啉代寡核苷酸(MOR)探针。
在各种实施方案中，在该方法的步骤(b)中产生的可检测信号是测定溶液的颜色，其指示探针是否与扩增子杂交。
在各种实施方案中，步骤(c)中测定的所述解链温度由纳米探针解离和随后的聚集引起的颜色变化来指示。
在各种实施方案中，该方法还包括在该方法的步骤(a)之前从样品中分离基因组DNA。
在各种实施方案中，该方法包括使用一种包含至少部分包含1555A>G和1494C>T突变的MRNR1基因的核酸分子作为阳性对照，和/或使用一种包含至少部分不含所述突变的MRNR1基因的核酸分子作为阴性对照。
在各种实施方案中，在该方法中使用的PCR引物具有核酸序列5'-GAGTGCTTAGTTGAACAGGGC-3'(SEQ ID NO：2)和5'-GGGTTTGGGGCTAGGTTTAG-3'(SEQ ID NO：3)，并且使用的寡核苷酸类似物探针是具有核酸序列5'-CGACTTGTCTCCTCTTTTTTTTTTT-3'(SEQ ID NO：4)(特定于1555A>G WT)、5'-CGACTTGCCTCCTCTTTTTTTTTTTT-3'(SEQ ID NO：5)(特定于1555A>G MUT)、5'-TTGAGGAGGGTGACGTTTTTTTTTT-3'(SEQ ID NO：6)(特定于1494C>T WT)或5'-TTGAGGAGAGTGACGTTTTTTTTTT-3'(SEQ ID NO：7)(特定于1494C>T MUT)的吗啉代寡核苷酸。
在各种实施方案中，吗啉代寡核苷酸在3'末端用二硫酰胺修饰。
在各种实施方案中，该方法用于测定受试者对与MTRNR1基因突变相关的疾病或病症的易感性，例如测定受试者对氨基糖苷类诱导的听力丧失的风险。
另一方面，本发明提供了用于测定样品中MTRNR1基因(SEQ ID NO：1)中突变存在的试剂盒，其中所述突变选自由1555A>G和1494C>T组成的组，并且所述试剂盒包含如本发明所述的方法中使用的一对PCR引物和一对等离子体纳米探针。
在各种实施方案中，试剂盒被设计为用于测定1555A>G和1494C>T两个突变，并且因此包含四个等离子体纳米探针。
在各种实施方案中，试剂盒包含一对PCR引物，其具有核酸序列5'-GAGTGCTTAGTTGAACAGGGC-3'(SEQ ID NO：2)和5'-GGGTTTGGGGCTAGGTTTAG-3'(SEQ ID NO：3)，并且四种等离子体金纳米颗粒各自分别用吗啉代寡核苷酸进行官能化处理，所述吗啉代寡核苷酸具有核酸序列5'-CGACTTGTCTCCTCTTTTTTTTTTTT-3'(SEQ ID NO：4)(针对于1555A>G WT)、5'-CGACTTGCCTCCTCTTTTTTTTTTT-3'(SEQ ID NO：5)(针对于1555A>G MUT)、5'-TTGAGGAGGGTGACGTTTTTTTTTT-3'(SEQ ID NO：6)(针对于1494C>T WT)或5'-TTGAGGAGAGTGACGTTTTTTTTTT-3'(SEQ ID NO：7)(针对于1494C>T MUT)，所述吗啉代寡核苷酸在3'末端被二硫酰胺修饰。
在各种实施方案中，试剂盒用于测定受试者对与MTRNR1基因突变相关的疾病或病症的易感性，例如测定受试者对氨基糖苷类引起的听力丧失的风险。
附图说明
当结合非限制性实施例和附图考虑时，参考发明详述将能够更好地理解本发明。
图1显示了靶向mtDNA 1555A>G的(a)WT和(b)MUT探针的解链温度作为目标浓度的函数。样品是合成的单链WT DNA(SEQ ID NO：8)和MUT DNA(SEQ ID NO：9)。Tm测量误差＝±1℃。
图2显示了靶向mtDNA 1494C>T的(a)WT和(b)MUT探针的解链温度作为目标浓度的函数。样品是合成的单链WT DNA(SEQ ID NO：8)和MUT DNA(SEQ ID NO：9)。Tm测量误差＝±1℃。
图3显示了用于(a)mtDNA 1555A>G和(b)mtDNA 1494C>T的基因分型的Tm WT和Tm MUT的散点图。Tm测量误差＝±1℃。
发明详述
以下详细描述通过说明的方式涉及可以实施本发明的具体细节和实施方案。这些实施方案描述地足够详细，以使本领域技术人员能够实施本发明。在不脱离本发明范围的情况下，可以利用其他实施方案进行结构和逻辑的改变。各种实施方案不必是相互排斥的，因为一些实施方案可以与一个或多个其他实施方案组合以形成新的实施方案。
本发明的目的是提供一种测定人MTRNR1基因(SEQ ID NO：1)中突变存在的方法。
为此，本发明的发明人提供了一种采用聚合酶链式反应(PCR)和基于等离子体探针的检测的方法。
在一个方面，本发明公开了一种测定样品中人MTRNR1基因(SEQ ID NO：1)中突变存在的方法，其中所述突变选自由1555A>G和1494C>T组成的组，并且该方法包括以下步骤：
(a)在允许扩增产生PCR扩增产物(扩增子)的条件下，在聚合酶链式反应(PCR)中使用一对引物扩增至少部分MTRNR1基因，所述部分包含突变状态待分析的位置；
(b)在允许寡核苷酸类似物探针和扩增子彼此杂交的条件下，将不同试管中的扩增子分别与对野生型(WT)或突变(MUT)的扩增子特异的等离子体纳米探针接触，所述等离子体纳米探针包括等离子体纳米颗粒优选等离子体金纳米颗粒，和与其共价偶联的非离子寡核苷酸类似物探针优选吗啉代寡核苷酸(MOR)探针，所述寡核苷酸类似物探针包含与野生型或突变的扩增子互补的碱基序列，其中探针在与扩增子杂交时产生可检测信号，该信号可与未杂交探针的信号区分开，其中所述可检测信号优选是测定溶液的颜色，其指示探针是否与扩增子杂交；
(c)基于测定纳米探针和扩增子的杂交体的解链温度Tm来确定突变的存在，其中解链温度优选由纳米探针解离和随后的聚集引起的颜色变化来指示。
如SEQ ID NO：1所示，完整的人MTRNR1基因序列跨越人线粒体基因组的第648位至第1601位(GenBank登录号：NC_012920.1)。本发明使用的术语“突变”或“基因突变”是指与野生型参考链相比DNA链碱基序列的改变。更具体地，1555A>G指人线粒体基因组第1555位的A→G的突变，1494C>T指人线粒体基因组第1494位的C→T的突变。应理解，在本发明的上下文中，所述术语包括术语“多态性”或任何其他类似或等同的术语。
如本发明所用的术语“样品”是指能够通过本发明所述方法分析的任何物质。样品可包括例如纯化的DNA、细胞、血液、精液、唾液、尿液、粪便、直肠拭子等。
在某些实施方案中，本发明公开的方法还可包括在步骤(a)之前从样品中分离基因组DNA。
本发明所述的方法采用PCR进行至少部分MTRNR1基因的特异性扩增，所述MTRNR1基因包括突变状态待分析的位点，以及基于等离子体探针的所得扩增子的检测，因此可用于确定MTRNR1基因的突变状态。
任何可产生与等离子体纳米探针的寡核苷酸类似物探针杂交的单链扩增子的PCR可以用于本方法中。此类PCR技术包括但不限于等位基因特异性PCR、组装PCR、不对称PCR、拨出PCR(Dial-out PCR)、数字PCR、解旋酶依赖性扩增、热启动PCR、序列间特异性PCR(ISSR)、反向PCR、连接介导的PCR、甲基化特异性PCR(MSP)、微引物PCR、多重连接依赖性探针扩增(MLPA)、多重PCR、纳米颗粒辅助PCR(nanoPCR)、巢式PCR、重叠延伸PCR或重叠剪接扩展(SOEing)、PAN-AC、逆转录PCR(RT-PCR)、固相PCR、热不对称交错PCR(TAIL-PCR)、降落PCR(逐步下降PCR)、通用快速步移或转录介导的扩增(TMA)。这些技术在本领域中是公知的(McPherson,M J and Moller,S G(2000)PCR(Basics),Springer-Verlag Telos；第一版)。
在优选的实施方案中，使用不对称PCR(aPCR)。aPCR是两种引物的量不相等的PCR。以较高量存在的引物称为过量引物，并且由过量引物的延伸产生的链会过量积累，并且随后与本发明的等离子体纳米探针的寡核苷酸类似物探针杂交。
在允许寡核苷酸类似物探针和扩增子彼此杂交的条件下，PCR扩增子进一步分别与对野生型或突变型扩增子特异的等离子体纳米探针接触，所述等离子体纳米探针包含等离子体纳米颗粒和与其共价偶联的非离子寡核苷酸类似物探针，所述寡核苷酸类似物探针包含与野生型或突变体扩增子互补的碱基序列。
不希望受任何特定理论的束缚，本发明所述探针如果与扩增子杂交，则产生可检测信号，该信号可与未杂交探针的信号区分开。所述信号可以是可通过任何手段检测的任何信号。
在优选的实施方案中，这些探针通过显示处于其杂交状态的颜色(例如红色)和处于其未杂交的聚集状态的另一种颜色(例如浅灰色)来指示靶标的存在或不存在。非杂交纳米探针的聚集通常可以通过控制测定溶液的离子强度来实现，例如通过控制盐浓度。纳米探针的这种特殊行为(即，只要它们与其靶标杂交就保持非聚集形式，如果不与其靶杂交就聚集)可以归因于纳米探针的非离子特征。
该方法的步骤(b)中等离子体纳米探针和扩增子的杂交可以在低于纳米探针和与其完全互补的扩增子的二聚体的解链温度的温度下进行，并且高于纳米探针和与其不完全互补的扩增子的二聚体的解链温度的温度下进行，以允许这两组之间的最大差异。在这些实施方案中，步骤(c)也可以在上述温度下通过简单地测定指示杂交是否已经形成的测定溶液的颜色进行。在这些实施方案中，由于测定时无论形成的杂交是否具有高于测定温度的解链温度(表明与等离子体完全互补的扩增子的存在)或具有低于测定温度的解链温度(其指示了不存在与等离子体完全互补的扩增子)，因此目前为止只测定了杂交的解链温度。
如本发明所用的术语“纳米颗粒”是指具有大小为约1至约250纳米的任何颗粒，并且具有与如本发明所述的至少一种寡核苷酸类似物共价偶联的能力。在某些实施方案中，纳米颗粒是金属纳米颗粒。在其他实施方案中，纳米颗粒是胶体金属。
在一些实施方案中，金属是贵金属。可以使用的贵金属的非限制性实例可包括银、金、铂、钯、钌、锇、铱或其混合物，更不用说其中几种。其他也可用于形成纳米颗粒的金属可包括但不限于铝、铜、钴、铟、镍或适于形成纳米颗粒的任何其他金属。如本发明所述的纳米颗粒还可包含半导体(包括例如但不限于，CdSe、CdS和包覆有ZnS的CdS或CdSe)或磁性(例如，铁磁)胶体材料。可用于本发明实施的其他纳米颗粒包括但不限于ZnS、ZnO、Ti、TiO2、Sn、SnO2、Si、SiO2、Fe、Ag、Cu、Ni、Al、钢、钴铬合金、Cd、钛合金、AgI、AgBr、HgI2、PbS、PbSe、ZnTe、CdTe、In2S3、In2Se3、Cd3P2、Cd3As2、InAs和GaAs。
只要纳米颗粒能够提供光学性质，本发明的缀合物中使用的纳米颗粒的尺寸可以在需要时以任何尺寸进行变化。例如，产生对杂交反应敏感的光学信号。如本发明所述纳米颗粒的直径可以在约1nm至约250nm、约1nm至约200nm、约1nm至约160nm、约1nm至约140nm、约1nm至约120nm、约1nm至约80nm、约1nm至约60nm、约1nm至约50nm、约5nm至约250nm、约8nm至约250nm、约10nm至约250nm、约20nm至约250nm、约30nm至约250nm、约40nm至约250nm、约85nm至约250nm、约100nm至约250nm、或约150nm至约250nm的尺寸范围内。在一些实施方案中，纳米颗粒直径的直径在约1nm至约100nm的范围内。
在某些实施方案中，纳米颗粒包含表面活性剂。如本发明所用，“表面活性剂”是指在分子中具有亲水部分和疏水部分的表面活性溶剂。表面活性剂可以例如用于稳定纳米颗粒。表面活性剂也可用于防止寡核苷酸类似物在纳米颗粒表面上的非特异性吸附。在一些实施方案中，表面活性剂是非离子表面活性剂。可以使用的其他类型的表面活性剂可以包括但不限于阳离子、阴离子或两性离子表面活性剂。特定的表面活性剂可以单独使用或与其他表面活性剂组合使用。一类表面活性剂包括亲水性头部和疏水性尾部。与阴离子表面活性剂相关的亲水性头部包括羧酸盐、磺酸盐、硫酸盐、磷酸盐和膦酸盐。与阳离子表面活性剂相关的亲水性头部包括季胺盐、锍和鏻。季胺盐包括季铵、吡啶鎓、联吡啶鎓和咪唑鎓。与非离子表面活性剂相关的亲水性头部包括醇和酰胺。与两性离子表面活性剂相关的亲水性头部包括甜菜碱。疏水尾部通常包含烃链。烃链通常包含约6至约24个碳原子，更典型的是约8至约16个碳原子。
本发明方法中使用的等离子体纳米颗粒用优先识别待分析扩增子的非离子寡核苷酸类似物探针进行官能化处理。对于本发明的实施，可以同时使用总共四种等离子体纳米颗粒来确定两种突变的存在。
在一些实施方案中，本发明公开的方法中使用的非离子寡核苷酸类似物探针是吗啉代寡核苷酸探针或其衍生物。术语“寡核苷酸类似物”是指具有(i)修饰的骨架结构，例如除天然寡核苷酸和多核苷酸中发现的标准磷酸二酯键之外的骨架的寡核苷酸，和(ii)任选地，修饰的糖部分，例如吗啉部分而非核糖或脱氧核糖部分的寡核苷酸。该类似物支持与标准多核苷酸碱基通过Watson-Crick碱基配对形成氢键的碱基，其中类似物骨架以允许在寡核苷酸类似物分子和标准物多核苷酸(例如单链RNA或单链DNA)的碱基之间以序列特异性方式进行这种氢键形成的方式呈现碱基。类似物可以例如包括那些具有基本上不带电荷的含磷骨架。
寡核苷酸类似物中基本上不带电荷的含磷骨架可以是例如大多数例如60-100％亚基键为在生理pH下不带电荷、并含有单个磷原子的骨架。寡核苷酸类似物可包含与如下定义的靶标扩增子互补的核苷酸序列。在优选的实施方案中，本发明的寡核苷酸类似物是磷酸二酰吗啉代寡核苷酸，其中糖和磷酸骨架被氨基磷酸酯连接的吗啉基团取代，并且核碱基例如胞嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶被偶联至吗啉环或其衍生物上。
如本发明所用，术语“互补”或“互补性”涉及两条DNA或RNA不同链上核苷酸/碱基对的关系，或寡核苷酸类似物探针的核苷酸序列和DNA/RNA链的核苷酸/碱基的关系，其中碱基是配对的(例如通过Watson-Crick碱基配对：鸟嘌呤与胞嘧啶，腺嘌呤与胸腺嘧啶(DNA)或尿嘧啶(RNA))。因此，如本发明所述的寡核苷酸类似物探针包含能够与另一核苷酸序列(例如DNA或RNA序列)形成氢键的核苷酸序列，其中可通过常规Watson-Crick碱基进行配对或其他非常规类型例如在互补核苷或核苷酸之间形成Hoogsteen或反向Hoogsteen氢键进行配对。在本发明中，术语“进行杂交”或“杂交”是指依据Watson-Crick DNA互补性、Hoogsteen结合或本领域已知的其他序列特异性结合的规则，两条不同的DNA或RNA链之间或寡核苷酸类似物探针的核苷酸序列和DNA/RNA序列的核苷酸/碱基之间通过氢键的相互作用。在本发明中，本领域技术人员应理解，本发明所述的寡核苷酸类似物的核苷酸序列与靶标核酸序列特异性或选择性地进行杂交时，并不需要100％的互补。
互补性是通过一个核酸分子中可与第二个核酸分子形成氢键的连续残基的百分比来指示。例如，如果第一个核酸分子具有10个核苷酸并且第二个核酸分子具有10个核苷酸，则第一个和第二个核酸分子之间的5、6、7、8、9或10个核苷酸的碱基配对代表分别为50％、60％、70％、80％、90％或100％的互补性，更不用说其中的几种。
因此，在一些实施方案中，本发明使用的寡核苷酸类似物可以与靶标扩增子100％互补(即完全匹配)。在其他实施方案中，寡核苷酸类似物探针可以是与靶标扩增子至少约95％互补、至少约85％互补、至少约70％互补、至少约65％互补、至少约55％互补、至少约45％、或至少约30％互补，条件是其可以特异性识别非预期扩增子上的预期靶标扩增子。
本发明所述的寡核苷酸类似物探针的长度可包含约5个单体单元至约40个单体单元、约10个单体单元到约35个单体单元、或约15个单体单元至约35个单体单元。如本发明所用的术语寡核苷酸类似物探针的术语“单体单元”是指寡核苷酸类似物的一个核苷酸单元。
在某些实施方案中，寡核苷酸类似物探针经由官能团共价偶联至纳米颗粒。官能团通常包含在寡核苷酸类似物探针的间隔区部分中，用于共价结合至纳米颗粒。在一些实施方案中，官能团可包括硫醇(SH)基团，其可例如用于共价连接至纳米颗粒的表面。但是，也可以使用其他官能团。在其3'末端或5'末端用硫醇官能化的寡核苷酸可以容易地附着到金纳米颗粒上。例如，参见Mucic et al.Chem.Commun.555-557(1996)，其描述了将3'硫醇DNA连接到平坦的金表面的方法。硫醇部分也可用于将寡核苷酸连接至其他金属、半导体和磁性胶体以及本发明所述的其他类型的纳米颗粒。用于将寡核苷酸连接到固体表面的其他官能团包括硫代磷酸酯基团(参见例如美国专利No.5,472,881，用于寡核苷酸-硫代磷酸酯与金表面的结合)、取代的烷基硅氧烷(参见例如Grabar et al.,Anal.Ghent.,67,735-743)。具有5'硫代核苷或3'硫代核苷的寡核苷酸也可用于将寡核苷酸连接到固体表面。本领域技术人员已知的可用于将寡核苷酸类似物探针连接至纳米颗粒的其他官能团可包括但不限于二硫化物例如二硫酰胺、羧酸、芳香环化合物、环丁砜亚砜、硅烷，更不用说其中的几种了。
在PCT国际专利公开号WO 2011/087456A1中可以找到用于实施本发明方法的等离子体纳米颗粒和纳米探针的更详细描述，其中公开了适合于感兴趣靶标的探针序列，在此通过引用其全文并入本发明。
由本发明的发明人开发的等离子体纳米探针在识别核酸序列方面是高度特异的。在优选的实施方案中，用非离子吗啉代寡核苷酸官能化处理等离子体金纳米颗粒。与稳定分散在盐溶液中的DNA修饰的金纳米颗粒不同，吗啉代寡核苷酸的非离子特性使得吗啉代寡核苷酸修饰的纳米粒子更不稳定，并且仅在具有低离子强度的溶液中分散(例如，[NaCl]<10mmol/L)。由于纳米颗粒的聚集，溶液离子强度的增加将导致溶液颜色从红色变为浅灰色/无色。然而，在与带负电荷的DNA分子杂交时，由于表面电荷的增加，纳米探针变得更加稳定，并且溶液在高离子强度(例如，[NaCl]～100mmol/L)下保持红色。当温度升高时，解链温度(Tm)会发生急剧的解链转变，由此DNA分子从纳米探针释放，导致溶液中快速的颜色变化。纳米探针在识别DNA靶标方面具有高度特异性，单碱基错配可导致Tm降低5-12℃。该技术允许使用标准设备和简单的工作流程进行精确的终点检测。比色信号可以容易地被可视化和记录。
在某些实施方案中，本发明公开的方法包括使用一种包含至少部分1555A>G和1494C>T突变的MRNR1基因的核酸分子作为阳性对照，和/或使用一种包含至少部分不含所述突变MRNR1基因的核酸分子作为阴性对照。通过将Tm数据或其颜色信息与对照进行比较，可以容易地确定样品中MRNR1基因的突变状态。
在优选的实施方案中，用于该方法的PCR引物具有核酸序列5'-GAGTGCTTAGTTGAACAGGGC-3'(SEQ ID NO：2)和5'-GGGTTTGGGGCTAGGTTTAG-3'(SEQ ID NO：3)，并且所用的寡核苷酸类似物探针是吗啉代寡核苷酸，其具有核酸序列5'-CGACTTGTCTCCTCTTTTTTTTTTTT-3'(SEQ ID NO：4)(特定于1555A>G WT)、5'-CGACTTGCCTCCTCTTTTTTTTTTT-3'(SEQ ID NO：5)(特定于1555A>G MUT)、5'-TTGAGGAGGGTGACGTTTTTTTTTT-3'(SEQ ID NO：6)(特定于1494C>T WT)或5'-TTGAGGAGAGTGACGTTTTTTTTTT-3'(SEQ ID NO：7)(特定于1494C>T MUT)。在优选的实施方案中，这些吗啉代寡核苷酸在3'末端用二硫酰胺修饰。
本发明进一步公开了用于确定样品中MTRNR1基因(SEQ ID NO：1)中突变存在的试剂盒，其中所述突变选自1555A>G和1494C>T，并且该试剂盒包含一对PCR引物和一对如上所述的等离子体纳米探针。在优选的实施方案中，试剂盒被设计用于确定两种所述突变，因此其包含如上所述的四种等离子体探针。
在某些实施方案中，试剂盒包含一对PCR引物，其具有核酸序列5'-GAGTGCTTAGTTGAACAGGGC-3'(SEQ ID NO：2)和5'-GGGTTTGGGGCTAGGTTTAG-3'(SEQ ID NO：3)，并且四种等离子体金纳米颗粒各自分别用吗啉代寡核苷酸进行官能化处理，所述吗啉代寡核苷酸具有核酸序列5'-CGACTTGTCTCCTCTTTTTTTTTTTT-3'(SEQ ID NO：4)(针对于1555A>G WT)、5'-CGACTTGCCTCCTCTTTTTTTTTTT-3'(SEQ ID NO：5)(针对于1555A>G MUT)、5'-TTGAGGAGGGTGACGTTTTTTTTTT-3'(SEQ ID NO：6)(特定于1494C>T WT)或5'-TTGAGGAGAGTGACGTTTTTTTTTT-3'(SEQ ID NO：7)(特定于1494C>T MUT)，所述吗啉寡核苷酸在3'末端用二硫酰胺修饰。
进一步包含在本发明范围内的是如上所述的方法和试剂盒，其用于测定受试者对与MTRNR1基因(SEQ ID NO：1)的突变相关的疾病或病症的倾向，包括但不限于确定受氨基糖苷类引起的听力丧失的风险。
除非另有定义，否则本发明使用的所有技术和科学术语具有的含义与本领域普通技术人员通常理解的含义相同。若有冲突，将由本发明文件包括定义来控制。
具体实施方式
通过以下实施例进一步说明本发明。然而应该理解的是，本发明不限于这些示例性实施方案。
材料和方法
A.纳米探针的制备
本发明使用的纳米探针的制备类似于先前的报道(Zu Y,et al.AnalChem.2011Jun 1；83(11):4090-4；Zu Y,et al.Small.2011Feb 7；7(3):306-10)。简而言之，用二硫苏糖醇处理3'末端被二硫酰胺修饰的MOR(Gene Tools，LLC)以还原二硫键，然后通过使用NAP-5柱(GE Healthcare)进行纯化。将金纳米颗粒(40nm直径，～0.1nM，TedPella，Inc)与～2μM硫醇化MOR和10mM磷酸盐缓冲液(pH7.5)混合，并在室温下孵育过夜。接着，通过离心将MOR-NP缀合物用磷酸盐缓冲溶液(5mM，pH 7.5)洗涤至少5次，以除去未反应的MOR。该缀合物可以立即用作纳米探针或储存在4℃冰箱中直至使用。当储存在4℃时，纳米探针可保持稳定至少6个月。使用前，纳米探针溶液应通过涡旋均匀分散。
B.gDNA的提取
可以从全血、面颊拭子中提取人gDNA样品。根据制造商的说明，可以使用商业试剂盒Gentra Puregene DNA提取试剂盒(Qiagen)进行提取。可以使用Nanodrop1000(ThermoScientific)测量吸光度来检查gDNA样品的数量(ng/μl)和质量。样品的质量通过260nm和280nm处的吸光度比值(A260/A280比值)来表征，其通常在1.6至2.0之间变化。
C.aPCR
aPCR用于产生单链DNA靶标。终体积为25μL的PCR溶液含有gDNA、12.5μL主要混合物(Fermentas或Promega，2×)、1000nM正向引物和100nM反向引物。在PTC-200DNA机器(Bio-Rad)上进行PCR循环(表3)。通过用SafeViewTM染料染色的1.5％琼脂糖凝胶上运行5μL等份的PCR产物，来验证PCR中成功地生产了特定大小的扩增子。
D.Tm的检测
将合成的靶标或PCR扩增子简单地与特异性WT和MUT纳米探针混合。接着用热循环仪测量靶标-探针杂交体的Tm值。温度从32℃以1.0℃的间隔递增。在每个温度下，在其颜色可视化或用相机记录之前使溶液孵育1分钟。当观察到其从红色到浅灰色的明显颜色变化时，该温度记录为Tm。
E.基因分型
用合成的DNA靶标(图3)获得的Tm WT-Tm MUT散点图用作标准基因分型图。可以在图中绘制样品的实验数据点(Tm WT，Tm MUT)，并且可以通过数据点所在的区域容易地确定基因型。
实施例：人MTRNR1基因突变的检测
本发明公开了用于测定MTRNR1基因的两个mtDNA突变(1555A>G和1494C>T)的方法和试剂盒，所述突变与氨基糖苷类引起的听力丧失有关。使用最近在本发明发明人的实验室中开发的基于双纳米探针的方法进行遗传测试(Zu,et al.,Small,7(2011)306-310；Zu,et al.,Nano Today,9(2014)166-171))。使用的纳米探针具有高度特异性，其等离子体的特性允许进行比色检测。
对于每个突变测试，使用两组纳米探针，即野生型(WT)和突变型(MUT)探针。通过用吗啉代寡核苷酸(MOR)官能化金纳米颗粒来制备纳米探针。寡核苷酸序列如表1所示。WT纳米探针的寡核苷酸序列与WT基因区段完全匹配，而MUT纳米探针的寡核苷酸序列与突变的等位基因完全匹配。纳米探针显示为红色溶液(pH～8)，稳定地分散在5mM磷酸盐缓冲液中至少6个月。然而，添加100mM NaCl将导致纳米颗粒的不可逆聚集，并且溶液颜色将在1分钟内变为无色。
表1.该工作中使用的MOR序列。每对探针的单碱基差异加了下划线。
由于在DNA附着时纳米颗粒的表面负电荷增加，溶液中靶向DNA的存在可以增加纳米探针的稳定性。如果附着的DNA的表面密度足够高，则即使在100mM NaCl的存在下，纳米颗粒也将稳定地分散。为了揭示DNA-纳米探针杂交体的热力学性质，测量了解链温度(Tm)。在Tm时，DNA序列将从纳米颗粒表面解离，使得纳米颗粒不稳定并导致溶液颜色从红色变为浅灰色。然后使用Tm数据确定样品的基因型。
为了表征纳米探针，在100mM NaCl(最终浓度)和5nM至500nM的宽浓度范围内的合成DNA样品的存在下测量Tm数据(图1和2以及表2)。由靶标和探针之间的单碱基错配诱导的Tm差异为～6-15℃，允许明显的差异。
表2.本发明使用的合成DNA的序列。突变位置加了下划线。
图1和图2中所示的数据可以表示为Tm WT-Tm MUT散点图(图3)，其用作确定样品基因型的标准图。对于未知样品，一旦获得Tm WT和Tm MUT的数据，就可以基于标准基因分型图中的数据点所在的区域来进行基因分型。
对于人基因组DNA(gDNA)样品，可以进行PCR扩增以产生足够量的mtDNA基因的特异性靶向序列。设计位于两个突变位点侧翼的引物对。表3和4显示了PCR引物和热循环参数。在PCR之后，可以将两个等分的PCR产物分别与WT和MUT纳米探针直接混合，并且可以测量WT探针/扩增子和MUT探针/扩增子的杂交体的Tm值。可以在标准基因分型图中绘制获得的数据点(Tm WT，Tm MUT)以确定样品的基因型。
表3.用于靶标序列扩增的PCR引物(扩增子大小：250nt)。
表4.用于PCR扩增的热循环仪方案。
总之，本发明人开发了一种双纳米颗粒测定试剂盒，以测量与氨基糖苷类引起的听力丧失相关的两种mtDNA突变。唯一使用的设备是标准的热循环仪，其可以进行经济有效的检测。高度特异的等离子体探针确保了基于比色信号的准确的基因分型。
本发明在此已广泛和概括地进行了描述。落入通用的公开内容中的每个较窄物种和亚属群体也构成本发明的一部分。这包括本发明的一般性描述、附带从该类中去除任何主题的但书或否定限制，无论被去除的材料是否在本发明中具体叙述。其他实施例在以下权利要求的范围内。另外，在根据马库什群描述本发明的特征或方面的情况下，本领域技术人员应当认识到，本发明也因此以马库什群的任何单个成员或成员子群的形式描述。
本领域技术人员将容易理解，本发明非常适合于实现所述目的并获得所提到的结论和优点，以及其中固有的结论和优点。此外，对于本领域技术人员来说显而易见的是，在不脱离本发明的范围和精神的情况下，可以对本发明公开的发明进行各种替换和修改。本发明所述的组合物、方法、程序、处理、分子和特定化合物目前是优选实施方案的代表，其是示例性的，并不意图作为对本发明范围的限制。包含在本发明范围精神内的本领域技术人员将想到的变化和其它用途由权利要求的范围限定。本说明书中先前公开的文献的列表或讨论不应被视为承认该文件是现有技术的一部分或是公知常识。
本发明说明性地描述可以在缺少本发明未具体公开的任何一个或多个要素、限制的情况下适当地实施。因此，例如术语“包含”、“包括”、“含有”等应被广泛且不受限制阅读。因此，词语“包含”的变体将被理解为暗示包括所述整数或整数组但不排除任何其他整数或整数组。另外，本发明使用的术语和表达已被用作说明性术语而非限制，并且无意使用这些术语和表达来排除所示和所述特征的任何等同物或其部分，但应当意识到，在所要求保护的本发明的范围内可以进行各种修改。因此，应该理解的是，尽管已经通过示例性实施例和可选特征具体地公开了本发明，但是本领域技术人员可以对这里公开的本发明进行修改和变化，并且这些修改和变化是被认为是在本发明的保护范围内。
本发明引用的所有文献和专利文献其全部内容通过引用并入本发明。
SEQUENCE LISTING
<110> 新加坡科技研究局
<120> MTRNR1基因突变的测定
<130> P181115637WP
<150> 新加坡专利申请10201601165V
<151> 2016-02-17
<160> 10
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 954
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
aataggtttg gtcctagcct ttctattagc tcttagtaag attacacatg caagcatccc 60
cgttccagtg agttcaccct ctaaatcacc acgatcaaaa ggaacaagca tcaagcacgc 120
agcaatgcag ctcaaaacgc ttagcctagc cacaccccca cgggaaacag cagtgattaa 180
cctttagcaa taaacgaaag tttaactaag ctatactaac cccagggttg gtcaatttcg 240
tgccagccac cgcggtcaca cgattaaccc aagtcaatag aagccggcgt aaagagtgtt 300
ttagatcacc ccctccccaa taaagctaaa actcacctga gttgtaaaaa actccagttg 360
acacaaaata gactacgaaa gtggctttaa catatctgaa cacacaatag ctaagaccca 420
aactgggatt agatacccca ctatgcttag ccctaaacct caacagttaa atcaacaaaa 480
ctgctcgcca gaacactacg agccacagct taaaactcaa aggacctggc ggtgcttcat 540
atccctctag aggagcctgt tctgtaatcg ataaaccccg atcaacctca ccacctcttg 600
ctcagcctat ataccgccat cttcagcaaa ccctgatgaa ggctacaaag taagcgcaag 660
tacccacgta aagacgttag gtcaaggtgt agcccatgag gtggcaagaa atgggctaca 720
ttttctaccc cagaaaacta cgatagccct tatgaaactt aagggtcgaa ggtggattta 780
gcagtaaact aagagtagag tgcttagttg aacagggccc tgaagcgcgt acacaccgcc 840
cgtcaccctc ctcaagtata cttcaaagga catttaacta aaacccctac gcatttatat 900
agaggagaca agtcgtaaca tggtaagtgt actggaaagt gcacttggac gaac 954
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 合成构建体（synthetic construct）
<400> 2
gagtgcttag ttgaacaggg c 21
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 合成构建体（synthetic construct）
<400> 3
gggtttgggg ctaggtttag 20
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 合成构建体（synthetic construct）
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(25)
<223> n is T modified with disulfide amide
<400> 4
cgacttgtct cctctttttt ttttn 25
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 合成构建体（synthetic construct）
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(25)
<223> n is T modified with disulfide amide
<400> 5
cgacttgcct cctctttttt ttttn 25
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 合成构建体（synthetic construct）
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(25)
<223> n is T modified with disulfide amide
<400> 6
ttgaggaggg tgacgttttt ttttn 25
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 合成构建体（synthetic construct）
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(25)
<223> n is T modified with disulfide amide
<400> 7
ttgaggagag tgacgttttt ttttn 25
<210> 8
<211> 100
<212> DNA
<213> 合成构建体（synthetic construct）
<400> 8
gtacacaccg cccgtcaccc tcctcaagta tacttcaaag gacatttaac taaaacccct 60
acgcatttat atagaggaga caagtcgtaa catggtaagt 100
<210> 9
<211> 100
<212> DNA
<213> 合成构建体（synthetic construct）
<400> 9
gtacacaccg cccgtcaccc tcctcaagta tacttcaaag gacatttaac taaaacccct 60
acgcatttat atagaggagg caagtcgtaa catggtaagt 100
<210> 10
<211> 100
<212> DNA
<213> 合成构建体（synthetic construct）
<400> 10
gtacacaccg cccgtcactc tcctcaagta tacttcaaag gacatttaac taaaacccct 60
acgcatttat atagaggaga caagtcgtaa catggtaagt 100

Claims (15)

1.测定样品中人线粒体编码的12S RNA(MTRNR1)基因(SEQ ID NO：1)中突变存在的方法，其特征在于，所述突变选自由1555A>G和1494C>T组成的组，并且所述方法包括以下步骤：
(a)在允许扩增产生PCR扩增产物(扩增子)的条件下，在聚合酶链式反应(PCR)中使用一对引物扩增至少部分MTRNR1基因，所述部分包含突变状态待分析的位置；
(b)在允许寡核苷酸类似物探针和扩增子彼此杂交的条件下，将不同试管中的扩增子分别与对野生型或突变的扩增子特异的等离子体纳米探针接触，所述等离子体纳米探针包括等离子体纳米颗粒和与其共价偶联的非离子寡核苷酸类似物探针，所述寡核苷酸类似物探针包含与野生型或突变的扩增子互补的碱基序列，其中探针在与扩增子杂交时产生可检测信号，该信号可与未杂交探针的信号区分开；
(c)基于测定纳米探针和扩增子的杂交体的解链温度Tm来确定突变的存在。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述方法的步骤(a)中使用的PCR是不对称PCR(aPCR)。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在所述方法的步骤(b)中使用的等离子体纳米探针包含的等离子体纳米颗粒是等离子体金纳米颗粒。
4.如权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于，在所述方法的步骤(b)中使用的等离子体纳米探针包含的非离子寡核苷酸类似物探针是吗啉代寡核苷酸(MOR)探针。
5.如权利要求1～4任一项所述的方法，其特征在于，在所述方法的步骤(b)中产生的可检测信号是测定溶液的颜色，其指示探针是否与扩增子杂交。
6.如权利要求1～5任一项所述的方法，其特征在于，步骤(c)中测定的所述解链温度由纳米探针解离和随后的聚集引起的颜色变化来指示。
7.如权利要求1～6任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括在所述方法的步骤(a)之前从所述样品中分离基因组DNA。
8.如权利要求1～7任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括使用一种包含至少部分包含1555A>G和1494C>T突变的MRNR1基因的核酸分子作为阳性对照，和/或使用一种包含至少部分不含所述突变的MRNR1基因的核酸分子作为阴性对照。
9.如权利要求1～8任一项所述的方法，其特征在于，在所述方法中使用的PCR引物具有核酸序列5'-GAGTGCTTAGTTGAACAGGGC-3'(SEQ ID NO：2)和5'-GGGTTTGGGGCTAGGTTTAG-3'(SEQ ID NO：3)，并且使用的寡核苷酸类似物探针是具有核酸序列5'-CGACTTGTCTCCTCTTTTTTTTTTT-3'(SEQ ID NO：4)(特定于1555A>G WT)、5'-CGACTTGCCTCCTCTTTTTTTTTTTT-3'(SEQ ID NO：5)(特定于1555A>G MUT)、5'-TTGAGGAGGGTGACGTTTTTTTTTT-3'(SEQ ID NO：6)(特定于1494C>T WT)或5'-TTGAGGAGAGTGACGTTTTTTTTTT-3'(SEQ ID NO：7)(特定于1494C>T MUT)的吗啉代寡核苷酸。
10.如权利要求1～9任一项所述的方法，其特征在于，所述吗啉代寡核苷酸在3'末端用二硫酰胺修饰。
11.如权利要求1～10任一项所述的方法，其特征在于，所述方法用于测定受试者对与MTRNR1基因突变相关的疾病或病症的易感性，例如测定受试者对氨基糖苷类引起的听力丧失的风险。
12.用于测定样品中MTRNR1基因(SEQ ID NO：1)中突变存在的试剂盒，其特征在于，所述突变选自由1555A>G和1494C>T组成的组，并且所述试剂盒包含如权利要求1～11任一项所述的方法中使用的一对PCR引物和一对等离子体纳米探针。
13.如权利要求12所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒被设计为用于测定1555A>G和1494C>T两个突变，并且因此包含四个等离子体纳米探针。
14.如权利要求12或13所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含一对PCR引物，所述PCR引物具有核酸序列5'-GAGTGCTTAGTTGAACAGGGC-3'(SEQ ID NO：2)和5'-GGGTTTGGGGCTAGGTTTAG-3'(SEQ ID NO：3)，并且四种等离子体金纳米颗粒各自分别用吗啉代寡核苷酸进行官能化处理，所述吗啉寡核苷酸具有核酸序列5'-CGACTTGTCTCCTCTTTTTTTTTTTT-3'(SEQ ID NO：4)(特定于1555A>G WT)、5'-CGACTTGCCTCCTCTTTTTTTTTTT-3'(SEQ ID NO：5)(特定于1555A>G MUT)、5'-TTGAGGAGGGTGACGTTTTTTTTTT-3'(SEQ ID NO：6)(特定于1494C>T WT)或5'-TTGAGGAGAGTGACGTTTTTTTTTT-3'(SEQ ID NO：7)(特定于1494C>T MUT)，所述吗啉寡核苷酸在3'末端用二硫酰胺修饰。
15.如权利要求12～14任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于测定受试者对与MTRNR1基因突变相关的疾病或病症的易感性，例如测定受试者对氨基糖苷类引起的听力丧失的风险。
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YANBING ZU ET AL.: "Nanoprobe-based genetic testing", 《NANO TODAY 》 *

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