CN103937875A - 用于人类药物致聋基因突变筛查的引物、探针及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了用于人类药物致聋基因突变筛查的引物、探针及其使用方法，属于基因检测技术领域。本发明公开了32种用于人类药物致聋基因突变筛查的引物和探针的组合，以及这32种用于人类药物致聋基因突变筛查的引物和探针的组合在的应用方法。本发明提供的引物和探针组合以及其使用方法，可以在同一次PCR反应中检测多个样本，相比传统的检测方法具有准确率高、步骤少，耗时少的优点。
Description
技术领域
本发明属于基因检测技术领域，特别涉及用于人类药物致聋基因突变筛查的引物、探针及其使用方法。
背景技术
耳聋是严重影响人类健康的一种常见疾病，也是临床上最常见的遗传性疾病之一，因其病因复杂、发生率高且治疗困难，从而极大的影响着患者的人际交往与生活质量。据统计，耳聋在新生儿中的发病率约为1‰～3‰，全世界约有7000万人罹患不同程度的听力缺损，而我国是世界上听力障碍人口最多的国家，在全国各类残疾人中，听力残疾约占总数的24%，累及全国数千万个家庭。
耳聋的致病因素有很多，包括遗传因素和环境因素等，其中约50%-60%由遗传因素导致，即遗传性耳聋。在大量迟发性听力下降的患者中，许多也是由于自身基因缺陷或由于基因缺陷和多态性造成对环境因素的易感性增加而致病。根据是否伴有耳外组织的异常或病变，遗传性耳聋分为综合征性耳聋（SHL）和非综合征性耳聋（NSHL），其中NSHL占70%甚至更多。而根据遗传方式的不同又可将遗传性耳聋分为常染色体显性遗传（DFNA）、常染色体隐性遗传（DFNB）、X连锁遗传、Y连锁遗传及线粒体遗传五类，其中以DFNB最为常见，约占60%～75%；其次为DFNA，约占20%～30%。一般情况下，DFNB多表现为语前聋或先天性耳聋，DFNA多表现为语后聋或渐进性听力下降。
随着基因组学以及分子生物学技术的迅猛发展，对于遗传性耳聋相关基因及发病机制的研究已经取得了很大的进展。研究发现，在70%～80%的遗传性耳聋患者中可发现致聋基因突变，已知有数百个基因与遗传性耳聋有关，且绝大多数的遗传性耳聋为单基因病，而耳聋相关的遗传基因突变在正常群体中也并不少见，在我国现有人口中，携带遗传性致聋基因的比例约为6%。研究结果还表明，遗传性耳聋的致病基因及同一基因的突变位点在不同种族，甚至在同一种族的不同地区的人群中都不完全相同。目前，欧美发达国家列入耳聋致病基因临床检测的项目包括EYA1、TIMM8A、GJB2、GJB6、SLC26A4、USH2A、USH3A、POU3F4、WFS1、COCH、OTOF、TECTA以及线粒体DNA（mtDNA）等，但最普遍也是最基本的检测项目是GJB2、GJB6、SLC26A4、COCH和mtDNA基因的突变检测。而国内进行的耳聋分子流行病学调查结果显示，我国大部分的遗传性耳聋主要由GJB2、GJB3、SLC26A4以及mtDNA等为数不多的几个基因突变引起，对这几个基因进行遗传学检测可以明确耳聋人群中40%的遗传学病因，结合家族史分析和查体可以诊断95%以上的遗传性耳聋，这为我国耳聋致病基因筛查以及临床基因诊断工作的大规模开展提供了理论依据。
mtDNA是唯一存在于人细胞质中的DNA分子，是独立于细胞核染色体外的基因组，具有自我复制、转录和编码功能，但同时也受核DNA的调控。研究发现，mtDNA突变与遗传性耳聋有着密切关系，线粒体12S rRNA（MT-RNR1）上C1494T和A1555G的点突变可通过改变mtDNA的空间结构，使形成新的与氨基糖甙类抗生素结合的位点，从而导致突变携带者对此类药物敏感，造成使用正常剂量甚至微量该类药物即可导致突变携带者出现听力损失。流行病学调查结果表明，C1494T和A1555G突变在中国耳聋患者中的携带率分别为0.45%和3.34%。由于mtDNA遗传属于母系遗传，mtDNA的突变可通过母亲遗传给后代，所以检测到女性患者携带该基因突变时，需要提醒其本人及后代一定要禁止使用氨基糖甙类药物。
综上所述，对mtDNA的热点突变进行筛查，依据基因检测结果指导临床医生及患者的疾病治疗情况以规避耳聋风险，对夫妻双方均为遗传性耳聋致病基因携带者的胎儿进行产前诊断，对于我国防治遗传性耳聋、推进优生优育、提高人口素质具有重要意义。目前，对遗传性耳聋致病基因进行检测的方法包括限制性片段长度多态性分析（RFLP），变性高效液相色谱分析（DHPLC），直接测序法等，这些方法或者不能定性，或者耗时费力、所需设备和耗材昂贵，更重要的是这些方法难以同时对不同基因或同一基因的多个突变位点进行检测。由于遗传性耳聋具有遗传异质性强、突变位点多以及人群患病率及携带致病基因比例高等特点，因此有必要建立一种高通量、高效率的基因突变检测方法，以实现临床快速检测或大规模的人群筛查。基因芯片技术用于遗传性耳聋致病基因检测，具有通量高、自动化程度高等优点，但存在重复性差、易产生交叉污染从而造成假阳性结果等缺点。Real-Time PCR法在实时荧光定量PCR平台上进行闭管检测，能够有效克服PCR产物遗留污染的问题，且操作简便、快捷，根据引物和探针的优化设计，可同时检测多个样品不同基因或同一基因的多个突变位点，能够有效的应用于遗传性耳聋致病基因检测，是一种极具潜力的耳聋基因检测工具。
发明内容
为解决上述问题，本发明提出了一种用于人类药物致聋基因突变筛查的引物、探针及其使用方法。
一种用于人类药物致聋基因突变mtDNA-M1和mtDNA-M2筛查的引物和探针，所述的引物和探针如下：
所述的引物为Primer-F和Primer-R，所述的探针为Probe；Primer-F、Primer-R和Probe选自如下任意一种组合：
第1种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.4所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.10所示的DNA序列；
第2种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.4所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.11所示的DNA序列；
第3种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.4所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.7所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.10所示的DNA序列；
第4种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.4所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.7所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.11所示的DNA序列；
第5种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.5所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.10所示的DNA序列；
第6种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.5所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.11所示的DNA序列；
第7种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.5所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.7所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.10所示的DNA序列；
第8种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.5所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.7所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.11所示的DNA序列；
第9种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.4所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示的DNA序列；
第10种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.4所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.11所示的DNA序列；
第11种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.4所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.7所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示的DNA序列；
第12种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.4所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.7所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.11所示的DNA序列；
第13种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.5所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示的DNA序列；
第14种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.5所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.11所示的DNA序列；
第15种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.5所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.7所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示的DNA序列；
第16种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.5所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.7所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.11所示的DNA序列；
第17种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.10所示的DNA序列；
第18种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.11所示的DNA序列；
第19种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.7所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.10所示的DNA序列；
第20种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.7所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.11所示的DNA序列；
第21种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.5所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.10所示的DNA序列；
第22种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.5所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.11所示的DNA序列；
第23种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.5所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.7所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.10所示的DNA序列；
第24种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.5所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.7所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.11所示的DNA序列；
第25种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示的DNA序列；
第26种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.11所示的DNA序列；
第27种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.7所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示的DNA序列；
第28种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.7所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.11所示的DNA序列；
第29种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.5所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示的DNA序列；
第30种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.5所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.11所示的DNA序列；
第31种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.5所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.7所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示的DNA序列；
第32种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.5所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.7所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.11所示的DNA序列；
其中，所述的人类药物致聋基因突变mtDNA-M1为线粒体DNA的1494C>T突变；所述的人类药物致聋基因突变mtDNA-M2为线粒体DNA的1555A>G突变。
含有上述的用于人类药物致聋基因突变mtDNA-M1和mtDNA-M2筛查的引物和探针的试剂盒也属于本发明的保护范围。
一种用于人类药物致聋基因突变mtDNA-M1和mtDNA-M2筛查的引物和探针的使用方法，包括如下步骤：
步骤1：样品的DNA提取；
步骤2：荧光PCR扩增：
PCR体系如下：
PCR反应条件如下：
95℃预变性5分钟；95℃变性25秒，64℃退火20秒，72℃延伸20秒，15个循环；93℃变性25秒，60℃退火35秒，72℃延伸20秒，31个循环；
在上述PCR体系中，所述的Primer-F、Primer-R和Probe选自如下任意一种组合：
第1种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.4所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.10所示的DNA序列；
第2种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.4所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.11所示的DNA序列；
第3种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.4所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.7所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.10所示的DNA序列；
第4种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.4所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.7所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.11所示的DNA序列；
第5种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.5所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.10所示的DNA序列；
第6种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.5所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.11所示的DNA序列；
第7种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.5所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.7所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.10所示的DNA序列；
第8种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.5所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.7所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.11所示的DNA序列；
第9种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.4所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示的DNA序列；
第10种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.4所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.11所示的DNA序列；
第11种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.4所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.7所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示的DNA序列；
第12种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.4所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.7所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.11所示的DNA序列；
第13种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.5所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示的DNA序列；
第14种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.5所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.11所示的DNA序列；
第15种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.5所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.7所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示的DNA序列；
第16种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.5所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.7所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.11所示的DNA序列；
第17种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.10所示的DNA序列；
第18种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.11所示的DNA序列；
第19种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.7所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.10所示的DNA序列；
第20种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.7所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.11所示的DNA序列；
第21种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.5所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.10所示的DNA序列；
第22种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.5所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.11所示的DNA序列；
第23种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.5所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.7所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.10所示的DNA序列；
第24种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.5所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.7所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.11所示的DNA序列；
第25种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示的DNA序列；
第26种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.11所示的DNA序列；
第27种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.7所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示的DNA序列；
第28种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.7所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.11所示的DNA序列；
第29种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.5所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示的DNA序列；
第30种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.5所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.11所示的DNA序列；
第31种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.5所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.7所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示的DNA序列；
第32种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.5所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.7所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.11所示的DNA序列；
步骤3：检测：
采用实时PCR扩增仪于每个循环步骤的退火阶段检测FAM和HEX荧光信号，得到mtDNA基因的FAM信号和HEX信号扩增曲线；
步骤4：结果判定：
根据步骤3得到的mtDNA基因的FAM信号和HEX信号扩增曲线，判断样品提供者的mtDNA基因突变情况：
如果样品孔只有FAM信号，表明样品提供者的mtDNA基因存在mtDNA-M1突变；
如果样品孔只有HEX信号，表明样品提供者的mtDNA基因存在mtDNA-M2突变；
如果样品孔同时有FAM信号和HEX信号，表明样品提供者的mtDNA基因同时存在mtDNA-M1和mtDNA-M2突变；
如果样品孔无FAM信号和HEX信号，表明样品提供者的mtDNA基因为未发生mtDNA-M1和mtDNA-M2突变的野生型；
其中，
步骤1中所述的样品为人全血样品；
所述的人类药物致聋基因突变mtDNA-M1为线粒体DNA的1494C>T突变；所述的人类药物致聋基因突变mtDNA-M2为线粒体DNA的1555A>G突变。
表1：用于人类药物致聋基因突变筛查的引物和探针序列
| 引物名称 | 序列 | 序列编号 |
| mtDNA-M1-F1 | 5’-CACACCGCCCGTCACT-3’ | SEQ ID NO.1 |
| mtDNA-M1-F2 | 5’-ACACCGCCCGTCACTC-3’ | SEQ ID NO.2 |
| mtDNA-M1-R | 5’-TGTTAAGCTACACTCTGGTTCGT-3’ | SEQ ID NO.3 |
| mtDNA-M1-P1 | FAM-5’-CAAAGGACATTTAACTAAAACC-3’-MGB | SEQ ID NO.8 |
| mtDNA-M1-P2 | FAM-5’-CAAAGGACATTTAACTAA-3’-MGB | SEQ ID NO.9 |
| mtDNA-M2-F1 | 5’-CTACGCATTTATATAGAGGAGGC-3’ | SEQ ID NO4 |
| mtDNA-M2-F2 | 5’-CTACGCATTTATATAGAGGAGG-3’ | .SEQ ID NO.5 |
| mtDNA-M2-R1 | 5’-GCTAAGGTTGTCTGGTAGTAAGG-3’ | SEQ ID NO.6 |
| mtDNA-M2-R2 | 5’-TTTGGCTAAGGTTGTCTGGTA-3’ | SEQ ID NO.7 |
| mtDNA-M2-P1 | HEX-5’-CACCCAACTTACACTTAGG-3’-MGB | SEQ ID NO.10 |
| mtDNA-M2-P2 | HEX-5’-AGCACCCAACTTACACTTAG-3’-MGB | SEQ ID NO.11 |
本发明的有益效果是：
使用本发明提供的用于人类药物致聋基因突变筛查的引物和探针序列检测人类药物致聋基因突变的多重实时荧光PCR，可以在同一次PCR反应中检测多个样本，准确率高、步骤少，耗时少。
附图说明
图1是本发明实施例1中mtDNA野生型扩增曲线图；
图2是本发明实施例1中mtDNA-M1突变扩增曲线图；
图3是本发明实施例1中mtDNA-M2突变扩增曲线图。
具体实施方式
下面结合附图和具体的实施例对本发明做进一步说明：
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中使用的全血样品均为非肝素抗凝全血；使用的10×PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs、Taq酶均购自中国大连宝生物公司。
实施例1：
本实施例以mtDNA检测为例来说明单管荧光PCR检测待检样品的方法，其中聋哑人400例，家属800例。
实验用样品为某聋哑人学校学员及其亲属共计1200例样本。
利用荧光PCR方法来鉴定1200人中mtDNA基因突变的方法包括以下步骤：
（1）样品的DNA提取：
每人抽取400μL全血样品，采用RBC公司MagCore Genomic DNA Whole Blood Kit试剂盒（Cat.No.MGB400-04），按试剂盒的操作说明提取DNA。经紫外分光光度计检测提取的DNA质量后，将提取的DNA用Tris-HCl溶液（10mmol/L，pH8.0）调整到10ng/μL作为PCR扩增 的模板；
（2）荧光PCR扩增：
PCR反应条件如下：
95℃预变性5分钟；95℃变性25秒，64℃退火20秒，72℃延伸20秒，15个循环；93℃变性25秒，60℃退火35秒，72℃延伸20秒，31个循环。
在上述PCR体系中，Primer-F、Primer-R和Probe选自如下任意一种组合：
第1种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.4所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.10所示的DNA序列；
第2种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.4所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.11所示的DNA序列；
第3种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.4所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.7所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.10所示的DNA序列；
第4种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.4所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.7所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.11所示的DNA序列；
第5种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.5所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.10所示的DNA序列；
第6种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.5所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.11所示的DNA序列；
第7种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.5所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.7所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.10所示的DNA序列；
第8种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.5所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.7所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.11所示的DNA序列；
第9种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.4所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示的DNA序列；
第10种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.4所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.11所示的DNA序列；
第11种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.4所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.7所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示的DNA序列；
第12种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.4所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.7所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.11所示的DNA序列；
第13种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.5所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示的DNA序列；
第14种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.5所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.11所示的DNA序列；
第15种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.5所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.7所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示的DNA序列；
第16种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.5所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.7所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.11所示的DNA序列；
第17种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.10所示的DNA序列；
第18种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.11所示的DNA序列；
第19种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.7所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.10所示的DNA序列；
第20种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.7所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.11所示的DNA序列；
第21种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.5所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.10所示的DNA序列；
第22种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.5所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.11所示的DNA序列；
第23种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.5所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.7所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.10所示的DNA序列；
第24种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.5所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.7所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.11所示的DNA序列；
第25种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示的DNA序列；
第26种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.11所示的DNA序列；
第27种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.7所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示的DNA序列；
第28种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.7所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.11所示的DNA序列；
第29种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.5所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示的DNA序列；
第30种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.5所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.11所示的DNA序列；
第31种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.5所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.7所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示的DNA序列；
第32种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.5所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.7所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.11所示的DNA序列；
（3）检测：
采用Mx3000P实时PCR扩增仪（StrataGene公司）于每个循环步骤的退火阶段检测FAM和HEX荧光信号，得到mtDNA基因扩增曲线。一次可检测96份样品。
（4）结果判定：
根据步骤（3）得到的mtDNA基因的FAM信号和HEX信号扩增曲线，判断样品提供者的mtDNA基因突变情况：
如果样品孔只有FAM信号，表明样品提供者的mtDNA基因存在mtDNA-M1突变；
如果样品孔只有HEX信号，表明样品提供者的mtDNA基因存在mtDNA-M2突变；
如果样品孔同时有FAM信号和HEX信号，表明样品提供者的mtDNA基因同时存在mtDNA-M1和mtDNA-M2突变；
如果样品孔无FAM信号和HEX信号，表明样品提供者的mtDNA基因为未发生mtDNA-M1和mtDNA-M2突变的野生型。
其中，所述的人类药物致聋基因突变mtDNA-M1为线粒体DNA的1494C>T突变；所述的人类药物致聋基因突变mtDNA-M2为线粒体DNA的1555A>G突变。
结果显示，前述样本中，400例聋哑人中共计检出1494C>T突变2例，1555A>G突变15例；800例家属中共计检出1494C>T突变5例，1555A>G突变33例。
同时采用测序法将上述所有DNA样品送上海生工进行测序验证。经测序得到的结果和使用本发明提供的方法得到的结果对比如表2所示：
表2
由表2可知，使用本实施例提供的方法与使用测序方法得到的结果完全一致，说明本实施例提供的方法准确率很高；但是，与测序相比，本方法步骤少，耗时少，可满足产前诊断的快速筛查。
Claims (4)
1.一种用于人类药物致聋基因突变mtDNA-M1和mtDNA-M2筛查的引物和探针，其特征在于，所述的引物和探针如下：
所述的引物为Primer-F和Primer-R，所述的探针为Probe；Primer-F、Primer-R和Probe选自如下任意一种组合：
第1种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.4所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.10所示的DNA序列；
第2种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.4所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.11所示的DNA序列；
第3种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.4所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.7所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.10所示的DNA序列；
第4种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.4所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.7所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.11所示的DNA序列；
第5种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.5所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.10所示的DNA序列；
第6种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.5所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.11所示的DNA序列；
第7种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.5所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.7所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.10所示的DNA序列；
第8种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.5所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.7所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.11所示的DNA序列；
第9种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.4所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示的DNA序列；
第10种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.4所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.11所示的DNA序列；
第11种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.4所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.7所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示的DNA序列；
第12种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.4所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.7所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.11所示的DNA序列；
第13种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.5所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示的DNA序列；
第14种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.5所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.11所示的DNA序列；
第15种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.5所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.7所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示的DNA序列；
第16种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.5所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.7所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.11所示的DNA序列；
第17种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.10所示的DNA序列；
第18种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.11所示的DNA序列；
第19种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.7所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.10所示的DNA序列；
第20种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.7所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.11所示的DNA序列；
第21种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.5所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.10所示的DNA序列；
第22种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.5所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.11所示的DNA序列；
第23种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.5所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.7所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.10所示的DNA序列；
第24种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.5所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.7所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.11所示的DNA序列；
第25种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示的DNA序列；
第26种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.11所示的DNA序列；
第27种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.7所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示的DNA序列；
第28种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.7所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.11所示的DNA序列；
第29种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.5所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示的DNA序列；
第30种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.5所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.11所示的DNA序列；
第31种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.5所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.7所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示的DNA序列；
第32种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.5所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.7所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.11所示的DNA序列；
其中，所述的人类药物致聋基因突变mtDNA-M1为线粒体DNA的1494C>T突变；所述的人类药物致聋基因突变mtDNA-M2为线粒体DNA的1555A>G突变。
2.用于人类药物致聋基因突变mtDNA-M1和mtDNA-M2筛查的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒含有权利要求1所述的用于人类药物致聋基因突变mtDNA-M1和mtDNA-M2筛查的引物和探针；
其中，所述的人类药物致聋基因突变mtDNA-M1为线粒体DNA的1494C>T突变；所述的人类药物致聋基因突变mtDNA-M2为线粒体DNA的1555A>G突变。
3.一种用于人类药物致聋基因突变mtDNA-M1和mtDNA-M2筛查的引物和探针的使用方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：样品的DNA提取；
步骤2：荧光PCR扩增：
PCR体系如下：
PCR反应条件如下：
95℃预变性5分钟；95℃变性25秒，64℃退火20秒，72℃延伸20秒，15个循环；93℃变性25秒，60℃退火35秒，72℃延伸20秒，31个循环；
在上述PCR体系中，所述的Primer-F、Primer-R和Probe选自如下任意一种组合：
第1种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.4所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.10所示的DNA序列；
第2种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.4所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.11所示的DNA序列；
第3种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.4所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.7所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.10所示的DNA序列；
第4种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.4所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.7所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.11所示的DNA序列；
第5种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.5所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.10所示的DNA序列；
第6种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.5所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.11所示的DNA序列；
第7种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.5所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.7所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.10所示的DNA序列；
第8种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.5所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.7所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.11所示的DNA序列；
第9种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.4所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示的DNA序列；
第10种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.4所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.11所示的DNA序列；
第11种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.4所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.7所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示的DNA序列；
第12种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.4所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.7所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.11所示的DNA序列；
第13种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.5所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示的DNA序列；
第14种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.5所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.11所示的DNA序列；
第15种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.5所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.7所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示的DNA序列；
第16种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.5所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.7所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.11所示的DNA序列；
第17种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.10所示的DNA序列；
第18种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.11所示的DNA序列；
第19种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.7所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.10所示的DNA序列；
第20种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.7所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.11所示的DNA序列；
第21种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.5所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.10所示的DNA序列；
第22种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.5所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.11所示的DNA序列；
第23种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.5所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.7所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.10所示的DNA序列；
第24种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.5所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.7所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.11所示的DNA序列；
第25种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示的DNA序列；
第26种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.11所示的DNA序列；
第27种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.7所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示的DNA序列；
第28种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.7所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.11所示的DNA序列；
第29种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.5所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示的DNA序列；
第30种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.5所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.11所示的DNA序列；
第31种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.5所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.7所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示的DNA序列；
第32种组合：
Primer-F为序列表中SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.5所示的DNA序列；
Primer-R为序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.7所示的DNA序列；
Probe为序列表中SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.11所示的DNA序列；
步骤3：检测：
采用实时PCR扩增仪于每个循环步骤的退火阶段检测FAM和HEX荧光信号，得到mtDNA基因的FAM信号和HEX信号扩增曲线；
步骤4：结果判定：
根据步骤3得到的mtDNA基因的FAM信号和HEX信号扩增曲线，判断样品提供者的mtDNA基因突变情况：
如果样品孔只有FAM信号，表明样品提供者的mtDNA基因存在mtDNA-M1突变；
如果样品孔只有HEX信号，表明样品提供者的mtDNA基因存在mtDNA-M2突变；
如果样品孔同时有FAM信号和HEX信号，表明样品提供者的mtDNA基因同时存在mtDNA-M1和mtDNA-M2突变；
如果样品孔无FAM信号和HEX信号，表明样品提供者的mtDNA基因为未发生mtDNA-M1和mtDNA-M2突变的野生型；
其中，所述的人类药物致聋基因突变mtDNA-M1为线粒体DNA的1494C>T突变；所述的人类药物致聋基因突变mtDNA-M2为线粒体DNA的1555A>G突变。
4.根据权利要求3所述的用于人类药物致聋基因突变mtDNA-M1和mtDNA-M2筛查的引物和探针的使用方法，其特征在于，步骤1中所述的样品为人全血样品。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| CN201410026187.2A CN103937875A (zh) | 2014-01-21 | 2014-01-21 | 用于人类药物致聋基因突变筛查的引物、探针及其使用方法 |
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|---|---|---|---|
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| CN (1) | CN103937875A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109072301A (zh) * | 2016-02-17 | 2018-12-21 | 新加坡科技研究局 | Mtrnr1基因突变的测定 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102534031A (zh) * | 2012-02-14 | 2012-07-04 | 北京科聆金仪生物技术有限公司 | 一种高特异性聋病易感基因检测试剂盒及其应用 |
| CN103436625A (zh) * | 2013-09-11 | 2013-12-11 | 步迅 | 6聋病易感基因位点分型/突变比例检测试剂盒 |
| CN103451302A (zh) * | 2013-09-11 | 2013-12-18 | 步迅 | 聋病易感基因线粒体12SrDNA 1555A＞G、1494C＞T突变比例检测试剂盒 |
-
2014
- 2014-01-21 CN CN201410026187.2A patent/CN103937875A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102534031A (zh) * | 2012-02-14 | 2012-07-04 | 北京科聆金仪生物技术有限公司 | 一种高特异性聋病易感基因检测试剂盒及其应用 |
| CN103436625A (zh) * | 2013-09-11 | 2013-12-11 | 步迅 | 6聋病易感基因位点分型/突变比例检测试剂盒 |
| CN103451302A (zh) * | 2013-09-11 | 2013-12-18 | 步迅 | 聋病易感基因线粒体12SrDNA 1555A＞G、1494C＞T突变比例检测试剂盒 |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109072301A (zh) * | 2016-02-17 | 2018-12-21 | 新加坡科技研究局 | Mtrnr1基因突变的测定 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
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| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| ASS | Succession or assignment of patent right |
Owner name: CENG JIMENG Free format text: FORMER OWNER: RUIBAO BIO-MEDICINE TECHNOLOGY (XIAMEN) CO., LTD. Effective date: 20150303 |
|
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| C53 | Correction of patent of invention or patent application | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Zeng Jimeng Inventor after: Zhuang Jianli Inventor after: Liu Bin Inventor after: Lai Jinjiao Inventor after: Guan Zhenqun Inventor before: Zeng Jimeng Inventor before: Zhuang Jianli Inventor before: Liu Bin Inventor before: Lai Jinjiao |
|
| COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: INVENTOR; FROM: CENG JIMENG ZHUANG JIANLI LIU BIN LAI JINJIAO TO: CENG JIMENG ZHUANG JIANLI LIU BIN LAI JINJIAO GUAN ZHENQUN Free format text: CORRECT: ADDRESS; FROM: 361115 XIAMEN, FUJIAN PROVINCE TO: 361102 XIAMEN, FUJIAN PROVINCE |
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Effective date of registration: 20150303 Address after: 361102 School of pharmacy, Xiangan campus, Xiamen University, Fujian 259, Xiamen, China Applicant after: Zeng Jimeng Address before: 301 block D, Jianye Building, industrial zone, torch hi tech Zone (Xiangan), Fujian, Xiamen 361115, China Applicant before: Rui Bao biological medicine technology (Xiamen) Co., Ltd. |
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| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20140723 |