CN104263848B - 一种耳聋易感基因突变检测试剂盒及其制备方法与应用 - Google Patents

一种耳聋易感基因突变检测试剂盒及其制备方法与应用 Download PDF

Info

Publication number
CN104263848B
CN104263848B CN201410583806.8A CN201410583806A CN104263848B CN 104263848 B CN104263848 B CN 104263848B CN 201410583806 A CN201410583806 A CN 201410583806A CN 104263848 B CN104263848 B CN 104263848B
Authority
CN
China
Prior art keywords
gene
expanding
fluorescent probe
hhlpcr
sites
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201410583806.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN104263848A (zh
Inventor
黄秋英
李庆阁
王旭东
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Xiamen University
Original Assignee
Xiamen University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Xiamen University filed Critical Xiamen University
Priority to CN201410583806.8A priority Critical patent/CN104263848B/zh
Publication of CN104263848A publication Critical patent/CN104263848A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104263848B publication Critical patent/CN104263848B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

一种耳聋易感基因突变检测试剂盒及其制备方法与应用，涉及基因突变检测。试剂盒设有盒体、盒盖、隔板、HHL？PCR混合液A瓶、HHL？PCR混合液B瓶、HHL？PCR混合液C瓶、HHL？PCR混合液D瓶、HHL酶混合液瓶、HHL标准对照瓶、HHL阴性对照瓶。先制备扩增试剂和对照试剂，将扩增试剂和对照试剂设在瓶内，即得耳聋易感基因突变检测试剂盒。所述试剂盒可在临床进行遗传性耳聋基因筛查、致聋基因类型的识别中的应用，从而预防耳聋疾病的发生。

Description

一种耳聋易感基因突变检测试剂盒及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及基因突变检测，尤其是涉及一种耳聋易感基因突变检测试剂盒及其制备方法与应用。
背景技术
据统计表明，目前已知的遗传性疾病有4000多种，包括地中海贫血、先天愚型、耳聋等。其中，耳聋是一种严重影响人类生活质量的常见疾病，是交流障碍最常见的病因。在所有致聋因素中，遗传因素是导致聋儿出生的主要原因，比例高达50％～60％，其具有较高的遗传异质性。另外，在大量的迟发性听力下降患者中，亦有许多患者是由于自身的基因缺陷所致，或由于基因缺陷和多态性造成对致聋环境因素易感性增加所致。
近年来，随着人类基因组计划的实施与完成，大量与耳聋相关的基因被定位及克隆，耳聋基因检测也随之得以快速发展。迄今为止，与耳聋相关的基因座位有122个，其中仅有64个基因被克隆出来。耳聋易感基因的突变位点多样化，且具有明显的种族及区域差异，在不同国家或不同种族，甚至在同一国家的不同地区，其突变的类型和频率也存在较大差异。大量流行病学调查数据表明，GJB2、SLC26A4、线粒体12SrRNA以及GJB3基因是中国人群最常见的易感基因。这些基因在中国人群中的携带率高达5％～6％。由此可见，耳聋疾病的防控具有重要的优生学意义。
目前耳聋筛查普遍采用的是传统的物理学听力缺陷筛查方法，存在着确诊时间过长(2年)和漏检(尤其是迟发性耳聋)的缺陷，从而造成耳聋悲剧的不断发生。耳聋的基因检测能够将耳聋的发生由传统的被动治疗转向主动预防，做到早发现、早干预，从而避免耳聋的发生，因此耳聋易感基因检测有非常重要的意义。目前对耳聋易感基因进行检测的方法主要是基于PCR技术的一系列分子生物学方法，包括限制性片段长度多态性分析(RFLP)、变性高效液相色谱(DHPLC)技术、等位特异性PCR、SNaPshot测序技术、高通量测序技术、基因芯片以及DNA直接测序等，这些方法为耳聋易感基因的发现及鉴定做出了巨大的贡献，但由于其耗时费力，所需设备和耗材昂贵，尤其是难以同时对不同基因多个突变位点进行检测，一直未能被临床广泛接受。同时，我国分子诊断市场近年来也陆续出现了多种可用于临床检测的耳聋基因检测试剂，其中最具影响力的是北京博奥生物技术有限公司开发的可同时检测上述4个耳聋相关基因中的9个国人热点突变的遗传性耳聋基因诊断芯片。该产品将等位基因特异性引物延伸PCR与通用芯片相结合，可以达到灵敏、准确检测的目的，但因其仪器设备昂贵，且操作步骤多、需要PCR后处理、检测位点较少，使其无法更好地满足临床耳聋基因诊断的需求。此外，也有国内其他企业开发针对个别位点的实时PCR检测试剂，这些试剂针对性强，操作简便，适合特殊位点的快速检测，但是显然不适合作为筛查目的使用。由此可见，目前我国尚缺乏一种操作简便、成本低、检测基因数目多、覆盖突变位点全面的遗传性耳聋高通量筛查试剂，这也极大制约了耳聋疾病的防控。
熔解曲线(DissociationCurve)是指随温度升高反映DNA的双螺旋结构解链的曲线。DNA双螺旋结构解链一半的温度称为熔解温度，即熔点(Tm)，熔点是双链DNA固有的属性，不同序列的双链DNA，其Tm值不同，这与双链DNA的序列长度、碱基组成相关。在实时PCR(Real-timePCR)技术推出来之后，熔解曲线技术常用来分析基于荧光染料的实时PCR扩增的特异性，根据PCR产物的Tm值的大小判定产物是目标产物还是非特异扩增产物。随着生物技术的发展，仪器设备分辨率的改进，目前基于荧光染料的熔解曲线技术已经发展成的高分辨熔解曲线(HighResolutionMeltingCurve)技术，该技术可以识别单个碱基的突变，Chen等人(NengChen,etc.MutationAnalysisofSLC26A4forPendredSyndromeandNonsyndromicHearingLossbyHigh-ResolutionMelting.TheJournalofMolecularDiagnostics,2011,13:416-426.)将该技术用于SLC26A4基因突变的快速检测，但由于该技术本身的局限性，只能对基因突变进行扫描，同时需要对突变样本进行测序验证，以确定突变的类型，且对DNA样本质量要求非常高，不太适合在各临床实验室的推广应用。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术中存在的操作繁琐、耗时长、检测成本高、易污染及通量较低等缺点，提供简便快捷、灵敏度高、可靠性强、成本较低的基于多色探针熔解曲线技术的一种耳聋易感基因突变检测试剂盒及其制备方法。
本发明的另一目的在于提供耳聋易感基因突变检测试剂盒在临床进行遗传性耳聋基因筛查、致聋基因类型的识别中的应用，从而预防耳聋疾病的发生。
所述耳聋易感基因突变检测试剂盒设有盒体、盒盖、隔板、HHLPCR混合液A瓶、HHLPCR混合液B瓶、HHLPCR混合液C瓶、HHLPCR混合液D瓶、HHL酶混合液瓶、HHL标准对照瓶、HHL阴性对照瓶；HHLPCR混合液A瓶中装有HHLPCR混合液A，HHLPCR混合液B瓶中装有HHLPCR混合液B，HHLPCR混合液C瓶中装有HHLPCR混合液C，HHLPCR混合液D瓶中装有HHLPCR混合液D，HHL酶混合液瓶中装有HHL酶混合液，HHL标准对照瓶中装有HHL标准对照，HHL阴性对照瓶1中装有HHL阴性对照，隔板设在盒体内，盒盖与盒体连接，HHLPCR混合液A瓶、HHLPCR混合液B瓶、HHLPCR混合液C瓶、HHLPCR混合液D瓶、HHL酶混合液瓶、HHL标准对照瓶、HHL阴性对照瓶设在隔板上。
所述HHLPCR混合液A、HHLPCR混合液B、HHLPCR混合液C、HHLPCR混合液D和HHL酶混合液组成扩增试剂；所述HHLPCR混合液A包括1×PCR缓冲液，3.0mMMgCl2，dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dUTP各0.2mM，0.04mMGJB2基因扩增引物F1，0.04μMGJB3基因扩增引物F2，0.4μMGJB2基因扩增引物R1，0.4μMGJB3基因扩增引物R2，0.2μM荧光探针P1，0.2μM荧光探针P2，0.2μM荧光探针P3，0.2μM荧光探针P4，0.2μM荧光探针P5；
所述HHLPCR混合液B包括1×PCR缓冲液，3.0mMMgCl2，dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dUTP各0.2mM，0.04mM用于扩增线粒体12SrRNA基因的1494和1555位点的引物F3，0.04μM用于扩增线粒体12SrRNA基因的961位点的引物F4，0.04μM用于扩增线粒体TS基因的7444和7445位点的引物F5，0.4μM用于扩增线粒体12SrRNA基因的1494和1555位点的引物R3，0.4μM用于扩增线粒体12SrRNA基因的961位点的引物R4，0.4μM用于扩增线粒体MT-TS基因的7444和7445位点的引物R5，0.2μM荧光探针P6，0.2μM荧光探针P7，0.2μM荧光探针P8，0.2μM荧光探针P9；
所述HHLPCR混合液C包括1×PCR缓冲液，3.0mMMgCl2，dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dUTP各0.2mM，0.04μM用于扩增SLC26A4基因的IVS7-2位点的引物F6，0.04μM用于扩增SLC26A4基因的2162和2168位点的引物F7，0.04μM用于扩增SLC26A4基因的1174、1226和1229位点的引物F8，0.4μM用于扩增SLC26A4基因的IVS7-2位点的引物R6，0.4μM用与扩增SLC26A4基因的2162和2168位点的引物R7，0.4μM用于扩增SLC26A4基因的1174、1226和1229位点的引物R8，0.2μM荧光探针P10，0.2μM荧光探针P11，0.2μM荧光探针P12，0.2μM荧光探针P13；
所述HHLPCR混合液D包括1×PCR缓冲液，3.0mMMgCl2，dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dUTP各0.2mM，0.04μM用于扩增SLC26A4基因的IVS15+5位点的引物F9，0.04μM用于扩增SLC26A4基因的1975和2027位点的引物F10，0.04μM用于扩增SLC26A4基因的749和754位点的引物R11，0.4μM用于扩增SLC26A4基因的IVS15+5位点的引物R9，0.4μM用于扩增SLC26A4基因的1975和2027位点的引物R10，0.4μM用于扩增SLC26A4基因的749和754位点的引物F11，0.2μM荧光探针P14，0.2μM荧光探针P15，0.2μM荧光探针P16，0.2μM荧光探针P17；所述HHL酶混合液包括5U/μLTaqDNA聚合酶、0.1U/μLUNG酶。
上述各基因扩增引物的长度为15～40bp的寡核苷酸链，Tm(熔点)为50～70℃。
优选的，各基因扩增引物序列见表1。
上述各荧光探针可为与靶序列杂交能生成特征熔解曲线峰并给出熔点的荧光探针，包括但不限于自淬灭探针、相邻探针、容忍型分子信标等。
优选的，荧光探针可为5′末端和3′末端分别标记荧光基团和淬灭基团的自淬灭探针。
优选的，荧光基团可为ALEX-350、FAM、VIC、TET、CALFluorGold540、JOE、HEX、CALFlourOrange560、TAMRA、CalFluorRed590、ROX、CALFluorRed610、TEXASRED、CALFlourRed635、Quasar670、CY3、CY5、CY5.5、Quasar705等中的一种。
优选的，淬灭基团可为DABCYL、BHQ系列、ECLIPSE、TAMRA等中的一种。
优选的，荧光探针的长度可为15～40bp的寡核苷酸链，Tm为50～80℃，GC含量40％～70％。
优选的，所述各位点及其相应检测探针序列见表2。
表1优选的基因扩增引物序列信息表
表2优选的荧光探针序列信息表
所述对照试剂包括HHL标准对照和HHL阴性对照。
优选的，HHL标准对照为正常人基因组DNA，即为野生型人基因组DNA。
所述HHL阴性对照不含目的基因片段，优选为无菌水或Tris-HCl缓冲液。
所述PCR缓冲液可以是1×PCR缓冲液，也可以换用其它合适的PCR缓冲液。
所述耳聋易感基因突变检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
1)制备扩增试剂，所述扩增试剂包括HHLPCR混合液A、HHLPCR混合液B、HHLPCR混合液C、HHLPCR混合液D和HHL酶混合液；所述HHLPCR混合液A包括1×PCR缓冲液，3.0mMMgCl2，dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dUTP各0.2mM，0.04mMGJB2基因扩增引物F1，0.04μMGJB3基因扩增引物F2，0.4μMGJB2基因扩增引物R1，0.4μMGJB3基因扩增引物R2，0.2μM荧光探针P1，0.2μM荧光探针P2，0.2μM荧光探针P3，0.2μM荧光探针P4，0.2μM荧光探针P5；
所述HHLPCR混合液B包括1×PCR缓冲液，3.0mMMgCl2，dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dUTP各0.2mM，0.04mM用于扩增线粒体12SrRNA基因的1494和1555位点的引物F3，0.04μM用于扩增线粒体12SrRNA基因的961位点的引物F4，0.04μM用于扩增线粒体TS基因的7444和7445位点的引物F5，0.4μM用于扩增线粒体12SrRNA基因的1494和1555位点的引物R3，0.4μM用于扩增线粒体12SrRNA基因的961位点的引物R4，0.4μM用于扩增线粒体MT-TS基因的7444和7445位点的引物R5，0.2μM荧光探针P6，0.2μM荧光探针P7，0.2μM荧光探针P8，0.2μM荧光探针P9；
所述HHLPCR混合液C包括1×PCR缓冲液，3.0mMMgCl2，dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dUTP各0.2mM，0.04μM用于扩增SLC26A4基因的IVS7-2位点的引物F6，0.04μM用于扩增SLC26A4基因的2162和2168位点的引物F7，0.04μM用于扩增SLC26A4基因的1174、1226和1229位点的引物F8，0.4μM用于扩增SLC26A4基因的IVS7-2位点的引物R6，0.4μM用与扩增SLC26A4基因的2162和2168位点的引物R7，0.4μM用于扩增SLC26A4基因的1174、1226和1229位点的引物R8，0.2μM荧光探针P10，0.2μM荧光探针P11，0.2μM荧光探针P12，0.2μM荧光探针P13；
所述HHLPCR混合液D包括1×PCR缓冲液，3.0mMMgCl2，dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dUTP各0.2mM，0.04μM用于扩增SLC26A4基因的IVS15+5位点的引物F9，0.04μM用于扩增SLC26A4基因的1975和2027位点的引物F10，0.04μM用于扩增SLC26A4基因的749和754位点的引物R11，0.4μM用于扩增SLC26A4基因的IVS15+5位点的引物R9，0.4μM用于扩增SLC26A4基因的1975和2027位点的引物R10，0.4μM用于扩增SLC26A4基因的749和754位点的引物F11，0.2μM荧光探针P14，0.2μM荧光探针P15，0.2μM荧光探针P16，0.2μM荧光探针P17；所述HHL酶混合液包括5U/μLTaqDNA聚合酶、0.1U/μLUNG酶；
各基因扩增引物的长度为15～40bp的寡核苷酸链，Tm为50～70℃；
2)制备对照试剂，所述对照试剂包括HHL标准对照和HHL阴性对照；
3)将步骤1)制备的扩增试剂和步骤2)制备的对照试剂设在盒体内，即得耳聋易感基因突变检测试剂盒。
所述耳聋易感基因突变检测试剂盒可在临床进行遗传性耳聋基因筛查、致聋基因类型的识别中的应用，从而预防耳聋疾病的发生，所述应用的具体操作步骤如下：
1)PCR扩增和熔解曲线分析，具体方法如下：
(1)试剂准备——配液区
①首先将扩增试剂从冰箱取出并平衡至室温。PCR反应液配液标准为：取n×19.8μLHHLPCRMixA(n根据反应管数确定)和n×0.2μLHHL酶混合液加入到1.5mL离心管中，振荡混匀数秒，然后瞬时离心(如3000rpm离心5s)。取n×19.8μLHHLPCRMixB(n根据反应管数确定)和n×0.2μLHHL酶混合液加入到1.5mL离心管中，振荡混匀数秒，然后瞬时离心(如3000rpm离心5s)。取n×19.8μLHHLPCRMixC(n根据反应管数确定)和n×0.2μLHHL酶混合液加入到1.5mL离心管中，振荡混匀数秒，然后瞬时离心(如3000rpm离心5s)。取n×19.8μLHHLPCRMixD(n根据反应管数确定)和n×0.2μLHHL酶混合液加入到1.5mL离心管中，振荡混匀数秒，然后瞬时离心(如3000rpm离心5s)。PCR反应液应即配即用，隔夜使用需-18℃以下贮存。
②PCR反应液的分装：PCR反应液分别以每管20μL分装于PCR薄壁反应管。
③将配制好的PCR反应管转移至提取间，贮存于-18℃以下冰箱储存直至样本提取完。
(2)样品的加样——模板间
①用微量加液器向每支PCR薄壁反应管中加入5μL相应的待检DNA样本、HHL标准对照和HHL阴性对照，并立即盖严管盖。
②将已加入模板的PCR薄壁反应管转移至PCR扩增区。
(3)PCR扩增和熔解曲线分析——扩增区
①PCR扩增程序可为：
第一步：50℃2min，95℃10min；
第二步：95℃15s→65～56℃15s→76℃20s，10个循环，其中65～56℃15s每个循环下降1℃；
第三步：95℃15s→55℃15s→76℃20s，50个循环；
②熔解曲线分析程序可为：
95℃1min→35℃3min→45～85℃，其中45～85℃以0.5℃/5s的升温速率进行熔解曲线分析，且在此阶段采集探针所对应通道FAM、HEX、ROX、CY5的荧光信号。
③程序运行完毕，将PCR薄壁反应管(闭管)取出放入凹凸袋，将封口封严，按污染源处理。
2)结果判读：
根据多色探针熔解曲线分析结果中，待检测样本与标准对照在各通道熔解峰的Tm值的变化进行判断待检样本是否含有相应基因突变，以及基因突变的类型。这其中涉及待测样本和标准对照Tm值的读取(由荧光PCR仪配置软件自动获得)，标准对照作为校正，用来减少不同仪器和人员操作而引起的熔点误差。按以下步骤进行：
(1)读取标准对照在各检测通道的熔解峰的Tm值；
(2)读取待检测样本在各检测通道的Tm值；
(3)将待检测样本在各检测通道的Tm值减去标准(即野生型)对照在各检测通道对应的Tm值，得到各通道的ΔTm值，参照表3，判断待检是否含有突变，以及突变的类型。
本发明的基本原理是针对耳聋易感基因的序列设计特异性扩增引物和突变位点的检测荧光探针，然后按照所优选的条件将所有引物和探针分别加入不同的PCR反应管后，进行不对称PCR扩增，PCR扩增后产生大量可与相应荧光探针互补的单链产物，随后进行低温到高温的熔解曲线分析，在熔解曲线分析阶段，低温时各荧光探针与对应的PCR单链产物结合，形成异源双链，随着温度的升高，异源双链慢慢解链，其中荧光变化最快时的温度，即是异源双链的熔解温度，即熔点(Tm值)。由于荧光探针与匹配程度不同靶形成的异源双链的稳定性不同，故其Tm值亦有所不同，荧光探针与完全互补的靶形成的异源双链的熔点最高，与有一个或两个碱基错配的靶形成的异源双链的熔点较低，其熔点与错配碱基的类型、位置均有关系。
本发明的有益效果是：
1.简便快速、可检测多个基因多个位点、耗时短：本发明在四个PCR体系中即可完成多种耳聋易感基因突变的检测，PCR扩增结束后只需一次荧光PCR熔解曲线分析就可知道样本的基因型，整个操作在2～3h即可完成，操作步骤少、耗时短；
2.均相检测、闭管操作：本发明为均相检测体系，PCR及熔解曲线分析都在同一封闭的反应管中完成，无需PCR后处理，减少了PCR产物污染的可能性；
3.检测通量高：本发明基于多色探针熔解曲线分析技术，PCR之后只需运行一个简单的熔解曲线分析步骤(在荧光PCR仪上40min以内完成)即可完成，而PCR可以在普通仪器上运行，一台荧光PCR仪可配合多台普通PCR仪完成熔解曲线分析，故可以大大提高检测通量，提高荧光PCR仪的利用率；
4.检测特异性高、结果容易判读：本发明是通过熔解峰的熔点变化来判定突变与否，其中熔点可由仪器进行自动判读，结果客观，不易出错，故检测特异性高。
附图说明
图1为本发明检测实施例1反应体系A的FAM荧光通道的熔解曲线结果图。其中1代表c.35delG的突变型峰，2代表c.35delG的野生型峰。
图2为本发明检测实施例1反应体系A的HEX荧光通道的熔解曲线结果图。其中1代表c.167delT的突变型峰，2代表c.176_191del16的突变型峰，3代表c.167delT和c.176_191del16的野生型峰。
图3为本发明检测实施例1反应体系A的ROX荧光通道的熔解曲线结果图。其中1代表c.538C>T的突变型峰，2代表c.547G>A的突变型峰，3代表c.538C>T和c.547G>A的野生型峰,4代表c.235delC的突变型峰，5代表c.235delC的野生型峰。
图4为本发明检测实施例1反应体系A的CY5荧光通道的熔解曲线结果图。其中1代表c.299_300delAT的突变型峰，2代表c.299_300delAT的野生型峰。
图5为本发明检测实施例1反应体系B的FAM荧光通道的熔解曲线结果图。其中1代表m.1555A>G的突变型峰，2代表m.1555A>G的野生型峰。
图6为本发明检测实施例1反应体系B的HEX荧光通道的熔解曲线结果图。其中1代表m.1494C>T的突变型峰，2代表m.1494C>T的野生型峰。
图7为本发明检测实施例1反应体系B的ROX荧光通道的熔解曲线结果图。其中1代表m.7444G>A和m.7445A>G的突变型峰，2代表m.7444G>A和m.7445A>G的野生型峰。
图8为本发明检测实施例1反应体系B的CY5荧光通道的熔解曲线结果图。其中1代表m.961T>G的突变型峰，2代表m.961T>G的野生型峰。
图9为本发明检测实施例1反应体系C的FAM荧光通道的熔解曲线结果图。其中1代表c.919-2A>G的突变型峰，2代表c.919-2A>G的野生型峰。
图10为本发明检测实施例1反应体系C的HEX荧光通道的熔解曲线结果图。其中1代表c.2162C>T的突变型峰，2代表c.2162C>T和c.2168A>G的野生型峰，3代表c.2168A>G的突变型峰。
图11为本发明检测实施例1反应体系C的ROX荧光通道的熔解曲线结果图。其中1代表c.1174A>T的突变型峰，2代表c.1174A>T的野生型峰。
图12为本发明检测实施例1反应体系C的CY5荧光通道的熔解曲线结果图。其中1代表c.1229C>T的突变型峰，2代表c.1229C>T和c.1226G>A的野生型峰，3代表c.1226G>A的突变型峰。
图13为本发明检测实施例1反应体系D的FAM荧光通道的熔解曲线结果图。其中1代表c.1707+5G>A的突变型峰，2代表c.1707+5G>A的野生型峰。
图14为本发明检测实施例1反应体系D的HEX荧光通道的熔解曲线结果图，其中1代表c.1975G>C的野生型峰，2代表c.1975G>C的突变型峰。
图15为本发明检测实施例1反应体系D的ROX荧光通道的熔解曲线结果图。其中1代表c.749T>C的突变型峰，2代表c.749T>C和c.754T>C的野生型峰，3代表c.754T>C的突变型峰。
图16为本发明检测实施例1反应体系D的CY5荧光通道的熔解曲线结果图。其中1代表c.2027T>A的野生型峰，2代表c.2027T>A的突变型峰。
图17为本发明所述耳聋易感基因突变检测试剂盒实施例的结构组成示意图。
具体实施方式
参见图17，本发明所述耳聋易感基因突变检测试剂盒实施例设有盒体1、盒盖2、隔板3、HHLPCR混合液A瓶4、HHLPCR混合液B瓶5、HHLPCR混合液C瓶6、HHLPCR混合液D瓶7、HHL酶混合液瓶8、HHL标准对照瓶9、HHL阴性对照瓶10；HHLPCR混合液A瓶4中装有HHLPCR混合液A，HHLPCR混合液B瓶5中装有HHLPCR混合液B，HHLPCR混合液C瓶6中装有HHLPCR混合液C，HHLPCR混合液D瓶7中装有HHLPCR混合液D，HHL酶混合液瓶8中装有HHL酶混合液，HHL标准对照瓶9中装有HHL标准对照，HHL阴性对照瓶10中装有HHL阴性对照，隔板3设在盒体1内，盒盖2与盒体1连接，HHLPCR混合液A瓶4、HHLPCR混合液B瓶5、HHLPCR混合液C瓶6、HHLPCR混合液D瓶7、HHL酶混合液瓶8、HHL标准对照瓶9、HHL阴性对照瓶10设在隔板3上。
所述HHLPCR混合液A包括1×PCR缓冲液，3.0mMMgCl2，dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dUTP各0.2mM，0.04mMGJB2基因扩增引物F1，0.04μMGJB3基因扩增引物F2，0.4μMGJB2基因扩增引物R1，0.4μMGJB3基因扩增引物R2，0.2μM荧光探针P1，0.2μM荧光探针P2，0.2μM荧光探针P3，0.2μM荧光探针P4，0.2μM荧光探针P5；
所述HHLPCR混合液B包括1×PCR缓冲液，3.0mMMgCl2，dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dUTP各0.2mM，0.04mM用于扩增线粒体12SrRNA基因的1494和1555位点的引物F3，0.04μM用于扩增线粒体12SrRNA基因的961位点的引物F4，0.04μM用于扩增线粒体MT-TS基因的7444和7445位点的引物F5，0.4μM用于扩增线粒体12SrRNA基因的1494和1555位点的引物R3，0.4μM用于扩增线粒体12SrRNA基因的961位点的引物R4，0.4μM用于扩增线粒体MT-TS基因的7444和7445位点的引物R5，0.2μM荧光探针P6，0.2μM荧光探针P7，0.2μM荧光探针P8，0.2μM荧光探针P9；
所述HHLPCR混合液C包括1×PCR缓冲液，3.0mMMgCl2，dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dUTP各0.2mM，0.04μM用于扩增SLC26A4基因的IVS7-2位点的引物F6，0.04μM用于扩增SLC26A4基因的2162和2168位点的引物F7，0.04μM用于扩增SLC26A4基因的1174、1226和1229位点的引物F8，0.4μM用于扩增SLC26A4基因的IVS7-2位点的引物R6，0.4μM用与扩增SLC26A4基因的2162和2168位点的引物R7，0.4μM用于扩增SLC26A4基因的1174、1226和1229位点的引物R8，0.2μM荧光探针P10，0.2μM荧光探针P11，0.2μM荧光探针P12，0.2μM荧光探针P13；
所述HHLPCR混合液D包括1×PCR缓冲液，3.0mMMgCl2，dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dUTP各0.2mM，0.04μM用于扩增SLC26A4基因的IVS15+5位点的引物F9，0.04μM用于扩增SLC26A4基因的1975和2027位点的引物F10，0.04μM用于扩增SLC26A4基因的749和754位点的引物R11，0.4μM用于扩增SLC26A4基因的IVS15+5位点的引物R9，0.4μM用于扩增SLC26A4基因的1975和2027位点的引物R10，0.4μM用于扩增SLC26A4基因的749和754位点的引物F11，0.2μM荧光探针P14，0.2μM荧光探针P15，0.2μM荧光探针P16，0.2μM荧光探针P17；
所述HHL酶混合液包括5U/μLTaqDNA聚合酶、0.1U/μLUNG酶；
各基因扩增引物的长度为15～40bp的寡核苷酸链，Tm为50～70℃；
优选的，各基因扩增引物序列见表1。
所述荧光探针可为与靶序列杂交能生成特征熔解曲线峰并给出熔点的荧光探针，包括但不限于自淬灭探针、相邻探针、容忍型分子信标等。
优选的，荧光探针可为5′末端和3′末端分别标记荧光基团和淬灭基团的自淬灭探针。
优选的，荧光基团可为ALEX-350、FAM、VIC、TET、CALFluorGold540、JOE、HEX、CALFlourOrange560、TAMRA、CalFluorRed590、ROX、CALFluorRed610、TEXASRED、CALFlourRed635、Quasar670、CY3、CY5、CY5.5、Quasar705等中的一种。
优选的，淬灭基团可为DABCYL、BHQ系列、ECLIPSE、TAMRA等中的一种。
优选的，荧光探针的长度可为15～40bp的寡核苷酸链，Tm为50～80℃，GC含量40％～70％。
优选的，所述各位点相应检测探针序列见表2。
所述对照试剂包括HHL标准对照和HHL阴性对照。
HHL标准对照为正常人基因组DNA，即为野生型人基因组DNA。
所述HHL阴性对照不含目的基因片段，优选的为无菌水或Tris-Hcl缓冲液。
所述PCR缓冲液可以是1×PCR缓冲液，也可以是其它类型的PCR缓冲液。
以下给出具体实施例：
实施例1：利用本试剂盒检测已知基因型的参考品HHLW(野生型)，HHLM1(c.35delG纯合突变型)，HHLM2(c.167delT纯合突变型)，HHLM3(c.176_191del16纯合突变型)，HHLM4(c.538C>T纯合突变型)，HHLM5(c.547G>A纯合突变型)，HHLM6(c.235delC纯合突变型)，HHLM7(c.299_300delAT纯合突变型)，HHLM8(m.1555A>G纯合突变型)，HHLM9(m.1494C>T纯合突变型)，HHLM10(m.7444G>A纯合突变型)，HHLM11(m.7445G>A纯合突变型)，HHLM12(m.961T>G纯合突变型)，HHLM13(c.919-2A>G纯合突变型)，HHLM14(c.2162C>T纯合突变型)，HHLM15(c.2168A>G纯合突变型)，HHLM16(c.1174A>T纯合突变型)，HHLM17(c.1226G>A纯合突变型)，HHLM18(c.1229C>T纯合突变型)，HHLM19(c.1707+5G>A纯合突变型)，HHLM20(c.1975G>C纯合突变型)，HHLM21(c.749T>C纯合突变型)，HHLM22(c.754T>C纯合突变型)，HHLM23(c.2027T>A纯合突变型))，考察试剂盒检测样本的特异性和准确性。
利用本发明对24个已知基因型的参考品进行检测，同时设置一份标准对照和阴性对照，包括以下步骤：
1)分别以各已经基因型的参考品、标准对照为模板，配制PCR反应液：25μLPCR反应液A、B、C、D中分别包括：5μLDNA模板(阴性对照为水)，1×PCR缓冲液，3.0mMMgCl2，1UTaqDNA聚合酶、dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dUTP各0.2mM，以及相对应的引物探针。
2)将上述装有PCR反应液的PCR反应管置于荧光PCR仪器(Bio-RadCFX96)上(进行PCR扩增和熔解曲线分析，具体反应程序为：
(1)50℃2min，95℃10min；
(2)95℃15s→65～56℃15s→76℃20s，10个循环，其中65～56℃15s每个循环下降1℃；
(3)95℃15s→55℃15s→76℃20s，50个循环；
(4)95℃1min→35℃3min→45～85℃，其中45～85℃以0.5℃/5s的升温速率进行熔解曲线分析，且在此阶段采集探针所对应通道(FAM、HEX、ROX、CY5)的荧光信号。
3)结果分析：阴性对照在各通道均无熔解峰，标准对照及各已知基因型的参考品在各通道的熔解曲线分析结果见图1-16(反应体系A、B、C、D的FAM通道、HEX通道、ROX通道和CY5通道)，由荧光PCR仪自带的熔解曲线分析软件读取标准对照及各基因型样本在各通道的Tm值(见表2)，再将样本的各检测通道的Tm值减去标准对照在对应通道的Tm值，得到各通道的ΔTm值，根据结果判读表(表3)，获得各样本的基因型。
本实施例得到的24个参考品的基因型均与其实际的基因型一致，准确性及特异性均为100％。
实施例2：利用本试剂盒检测148例已知基因型的DNA样本，同时设置标准对照和阴性对照，包括以下步骤：
1)分别以待检样品基因、标准对照基因为模板，配制PCR反应液：25μLPCR反应液A、B、C、D中分别包括：5μLDNA模板(阴性对照为水)，1×PCR缓冲液，3.0mMMgCl2，1UTaqDNA聚合酶、dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dUTP各0.2mM，以及相对应的引物探针。
2)将上述装有PCR反应液的PCR反应管置于荧光PCR仪器(Bio-RadCFX96)上(进行PCR扩增和熔解曲线分析，具体反应程序为：
(1)50℃2min，95℃10min；
(2)95℃15s→65～56℃15s→76℃20s，10个循环，其中65～56℃15s每个循环下降1℃；
(3)95℃15s→55℃15s→76℃20s，50个循环；
(4)95℃1min→35℃3min→45～85℃，其中45～85℃以0.5℃/5s的升温速率进行熔解曲线分析，且在此阶段采集探针所对应通道(FAM、HEX、ROX、CY5)的荧光信号。
3)结果分析：阴性对照在各通道均无熔解峰，标准对照及各基因型的参考品在各通道的熔解曲线分析结果见图1-16(反应体系A、B、C、D的FAM通道、HEX通道、ROX通道和CY5通道)，由荧光PCR仪自带的熔解曲线分析软件读取标准对照及各基因型样本在各通道的Tm值，再将样本的各检测通道的Tm值减去标准对照在各检测通道对应的Tm值，得到各通道的ΔTm值，根据结果判读表(表3)，获得各样本的基因型，统计结果见表4。由表可知，待检样本的基因型符合率为100％。
表4148份基因组DNA样本检测基因型统计结果
基因型 样本数 基因型符合率(DNA测序)
野生型 129 100％
c.35delG杂合 1 100％
c.176_191del16杂合 1 100％
c.235delC杂合 3 100％
c.235delC纯合 3 100％
c.299_300delAT杂合 2 100％
c.235delC和c.299_300delAT复合杂合 1 100％
c.547G>A杂合 1 100％
m.1555A>G纯合 2 100％
c.919-2A>G杂合 1 100％
c.919-2A>G纯合 2 100％
c.1229C>T纯合 1 100％
c.919-2A>G和c.1229C>T复合杂合 1 100％
本实施例得到的148个待检DNA样本的基因型均与其实际的基因型一致，准确性及特异性均为100％。

Claims (4)

1.一种耳聋易感基因突变检测试剂盒，其特征在于设有盒体、盒盖、隔板、HHLPCR混合液A瓶、HHLPCR混合液B瓶、HHLPCR混合液C瓶、HHLPCR混合液D瓶、HHL酶混合液瓶、HHL标准对照瓶、HHL阴性对照瓶；HHLPCR混合液A瓶中装有HHLPCR混合液A，HHLPCR混合液B瓶中装有HHLPCR混合液B，HHLPCR混合液C瓶中装有HHLPCR混合液C，HHLPCR混合液D瓶中装有HHLPCR混合液D，HHL酶混合液瓶中装有HHL酶混合液，HHL标准对照瓶中装有HHL标准对照，HHL阴性对照瓶1中装有HHL阴性对照，隔板设在盒体内，盒盖与盒体连接，HHLPCR混合液A瓶、HHLPCR混合液B瓶、HHLPCR混合液C瓶、HHLPCR混合液D瓶、HHL酶混合液瓶、HHL标准对照瓶、HHL阴性对照瓶设在隔板上；
所述HHLPCR混合液A包括1×PCR缓冲液，3.0mMMgCl2，dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dUTP各0.2mM，0.04mMGJB2基因扩增引物F1，0.04μMGJB3基因扩增引物F2，0.4μMGJB2基因扩增引物R1，0.4μMGJB3基因扩增引物R2，0.2μM荧光探针P1，0.2μM荧光探针P2，0.2μM荧光探针P3，0.2μM荧光探针P4，0.2μM荧光探针P5；
所述HHLPCR混合液B包括1×PCR缓冲液，3.0mMMgCl2，dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dUTP各0.2mM，0.04mM用于扩增线粒体12SrRNA基因的1494和1555位点的引物F3，0.04μM用于扩增线粒体12SrRNA基因的961位点的引物F4，0.04μM用于扩增线粒体TS基因的7444和7445位点的引物F5，0.4μM用于扩增线粒体12SrRNA基因的1494和1555位点的引物R3，0.4μM用于扩增线粒体12SrRNA基因的961位点的引物R4，0.4μM用于扩增线粒体MT-TS基因的7444和7445位点的引物R5，0.2μM荧光探针P6，0.2μM荧光探针P7，0.2μM荧光探针P8，0.2μM荧光探针P9；
所述HHLPCR混合液C包括1×PCR缓冲液，3.0mMMgCl2，dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dUTP各0.2mM，0.04μM用于扩增SLC26A4基因的IVS7-2位点的引物F6，0.04μM用于扩增SLC26A4基因的2162和2168位点的引物F7，0.04μM用于扩增SLC26A4基因的1174、1226和1229位点的引物F8，0.4μM用于扩增SLC26A4基因的IVS7-2位点的引物R6，0.4μM用与扩增SLC26A4基因的2162和2168位点的引物R7，0.4μM用于扩增SLC26A4基因的1174、1226和1229位点的引物R8，0.2μM荧光探针P10，0.2μM荧光探针P11，0.2μM荧光探针P12，0.2μM荧光探针P13；
所述HHLPCR混合液D包括1×PCR缓冲液，3.0mMMgCl2，dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dUTP各0.2mM，0.04μM用于扩增SLC26A4基因的IVS15+5位点的引物F9，0.04μM用于扩增SLC26A4基因的1975和2027位点的引物F10，0.04μM用于扩增SLC26A4基因的749和754位点的引物R11，0.4μM用于扩增SLC26A4基因的IVS15+5位点的引物R9，0.4μM用于扩增SLC26A4基因的1975和2027位点的引物R10，0.4μM用于扩增SLC26A4基因的749和754位点的引物F11，0.2μM荧光探针P14，0.2μM荧光探针P15，0.2μM荧光探针P16，0.2μM荧光探针P17；所述HHL酶混合液包括5U/μLTaqDNA聚合酶、0.1U/μLUNG酶；
所述HHL标准对照为正常人基因组DNA，即为野生型人基因组DNA；
所述HHL阴性对照不含目的基因片段，采用无菌水或Tris-HCl缓冲液；
各荧光探针为与靶序列杂交能生成特征熔解曲线峰并给出熔点的荧光探针，包括但不限于自淬灭探针、相邻探针、容忍型分子信标；
所述荧光探针为5′末端和3′末端分别标记荧光基团和淬灭基团的自淬灭探针；
荧光基团为ALEX-350、FAM、VIC、TET、CALFluorGold540、JOE、HEX、CALFlourOrange560、TAMRA、CalFluorRed590、ROX、CALFluorRed610、TEXASRED、CALFlourRed635、Quasar670、CY3、CY5、CY5.5、Quasar705中的一种；
淬灭基团为DABCYL、BHQ系列、ECLIPSE、TAMRA中的一种；
荧光探针的长度为15～40bp的寡核苷酸链，Tm为50～80℃，GC含量40％～70％；
各位点及其相应检测探针序列如下：
2.如权利要求1所述一种耳聋易感基因突变检测试剂盒，其特征在于各基因扩增引物的长度为15～40bp的寡核苷酸链，Tm为50～70℃。
3.如权利要求2所述一种耳聋易感基因突变检测试剂盒，其特征在于各基因扩增引物序列如下：
4.如权利要求1～3中任一所述耳聋易感基因突变检测试剂盒的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1)制备扩增试剂，所述扩增试剂包括HHLPCR混合液A、HHLPCR混合液B、HHLPCR混合液C、HHLPCR混合液D和HHL酶混合液；所述HHLPCR混合液A包括1×PCR缓冲液，3.0mMMgCl2，dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dUTP各0.2mM，0.04mMGJB2基因扩增引物F1，0.04μMGJB3基因扩增引物F2，0.4μMGJB2基因扩增引物R1，0.4μMGJB3基因扩增引物R2，0.2μM荧光探针P1，0.2μM荧光探针P2，0.2μM荧光探针P3，0.2μM荧光探针P4，0.2μM荧光探针P5；
所述HHLPCR混合液B包括1×PCR缓冲液，3.0mMMgCl2，dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dUTP各0.2mM，0.04mM用于扩增线粒体12SrRNA基因的1494和1555位点的引物F3，0.04μM用于扩增线粒体12SrRNA基因的961位点的引物F4，0.04μM用于扩增线粒体TS基因的7444和7445位点的引物F5，0.4μM用于扩增线粒体12SrRNA基因的1494和1555位点的引物R3，0.4μM用于扩增线粒体12SrRNA基因的961位点的引物R4，0.4μM用于扩增线粒体MT-TS基因的7444和7445位点的引物R5，0.2μM荧光探针P6，0.2μM荧光探针P7，0.2μM荧光探针P8，0.2μM荧光探针P9；
所述HHLPCR混合液C包括1×PCR缓冲液，3.0mMMgCl2，dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dUTP各0.2mM，0.04μM用于扩增SLC26A4基因的IVS7-2位点的引物F6，0.04μM用于扩增SLC26A4基因的2162和2168位点的引物F7，0.04μM用于扩增SLC26A4基因的1174、1226和1229位点的引物F8，0.4μM用于扩增SLC26A4基因的IVS7-2位点的引物R6，0.4μM用与扩增SLC26A4基因的2162和2168位点的引物R7，0.4μM用于扩增SLC26A4基因的1174、1226和1229位点的引物R8，0.2μM荧光探针P10，0.2μM荧光探针P11，0.2μM荧光探针P12，0.2μM荧光探针P13；
所述HHLPCR混合液D包括1×PCR缓冲液，3.0mMMgCl2，dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dUTP各0.2mM，0.04μM用于扩增SLC26A4基因的IVS15+5位点的引物F9，0.04μM用于扩增SLC26A4基因的1975和2027位点的引物F10，0.04μM用于扩增SLC26A4基因的749和754位点的引物R11，0.4μM用于扩增SLC26A4基因的IVS15+5位点的引物R9，0.4μM用于扩增SLC26A4基因的1975和2027位点的引物R10，0.4μM用于扩增SLC26A4基因的749和754位点的引物F11，0.2μM荧光探针P14，0.2μM荧光探针P15，0.2μM荧光探针P16，0.2μM荧光探针P17；所述HHL酶混合液包括5U/μLTaqDNA聚合酶、0.1U/μLUNG酶；
各基因扩增引物的长度为15～40bp的寡核苷酸链，Tm为50～70℃；
2)制备对照试剂，所述对照试剂包括HHL标准对照和HHL阴性对照；
3)将步骤1)制备的扩增试剂和步骤2)制备的对照试剂设在盒体内，即得耳聋易感基因突变检测试剂盒。
CN201410583806.8A 2014-10-24 2014-10-24 一种耳聋易感基因突变检测试剂盒及其制备方法与应用 Active CN104263848B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410583806.8A CN104263848B (zh) 2014-10-24 2014-10-24 一种耳聋易感基因突变检测试剂盒及其制备方法与应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410583806.8A CN104263848B (zh) 2014-10-24 2014-10-24 一种耳聋易感基因突变检测试剂盒及其制备方法与应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104263848A CN104263848A (zh) 2015-01-07
CN104263848B true CN104263848B (zh) 2016-06-15

Family

ID=52155422

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410583806.8A Active CN104263848B (zh) 2014-10-24 2014-10-24 一种耳聋易感基因突变检测试剂盒及其制备方法与应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN104263848B (zh)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105331708A (zh) * 2015-11-18 2016-02-17 温州迈拓生物科技有限公司 一种tRNASer(UCN)基因检测方法及应用
CN105624281A (zh) * 2015-11-18 2016-06-01 温州迈拓生物科技有限公司 一种非综合征性耳聋相关的线粒体tRNASer(UCN)7444G>A突变检测方法及其应用
KR101986193B1 (ko) * 2015-11-26 2019-06-07 주식회사 시선바이오머티리얼스 유전성 난청 검출용 ｐｎａ 프로브 및 이를 이용한 유전성 난청 검출방법
JP2019506870A (ja) * 2016-02-17 2019-03-14 エージェンシー フォー サイエンス，テクノロジー アンド リサーチ Ｍｔｒｎｒ１遺伝子突然変異の決定
CN106086186A (zh) * 2016-06-22 2016-11-09 武汉大学 一种临床检测耳聋相关基因突变的hrm方法及试剂盒
CN106811533B (zh) * 2017-03-06 2020-10-16 亚能生物技术（深圳）有限公司 一种遗传性耳聋基因检测试剂盒
CN107142305A (zh) * 2017-04-25 2017-09-08 郑州大学第附属医院 基于高分辨熔解曲线技术的迟发性耳聋基因突变检测引物组及试剂盒和应用
CN108823302A (zh) * 2018-07-04 2018-11-16 无锡市申瑞生物制品有限公司 一种耳聋基因突变检测的引物探针组合及其应用
CN110195017B (zh) * 2019-06-11 2022-04-15 郑州大学第二附属医院 一种帕金森病致病基因突变筛查检测方法
CN116656804B (zh) * 2023-05-24 2023-12-22 北京阅微基因技术股份有限公司 遗传性耳聋基因分型试剂盒

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102864232A (zh) * 2012-09-26 2013-01-09 潮州凯普生物化学有限公司 耳聋易感基因联合检测试剂盒
CN202925021U (zh) * 2012-10-09 2013-05-08 湖南农安生物技术有限公司 一种猪瘟病毒血样采集与检测试剂盒
CN103352080A (zh) * 2013-07-11 2013-10-16 无锡中德美联生物技术有限公司 一种遗传性耳聋基因检测试剂盒

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102864232A (zh) * 2012-09-26 2013-01-09 潮州凯普生物化学有限公司 耳聋易感基因联合检测试剂盒
CN202925021U (zh) * 2012-10-09 2013-05-08 湖南农安生物技术有限公司 一种猪瘟病毒血样采集与检测试剂盒
CN103352080A (zh) * 2013-07-11 2013-10-16 无锡中德美联生物技术有限公司 一种遗传性耳聋基因检测试剂盒

Also Published As

Publication number Publication date
CN104263848A (zh) 2015-01-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104263848B (zh) 一种耳聋易感基因突变检测试剂盒及其制备方法与应用
CN104120080B (zh) 一种α-珠蛋白基因突变检测试剂盒及其制备方法与应用
CN104862402B (zh) 检测ApoE基因多态性的引物、试剂盒及其PCR方法
CN105861710A (zh) 测序接头、其制备方法及其在超低频变异检测中的应用
CN102925562B (zh) 氨基糖苷类药物性耳聋易感基因检测试剂盒及方法
CN105624272A (zh) 基因组预定区域核酸测序文库的构建方法及装置
CN104651488B (zh) 检测染色体非整倍体数目异常的扩增组合物及快速检测试剂盒
CN107460235A (zh) 一种基于ARMS‑PCR熔解曲线法的人类ApoE基因多态性检测试剂盒
CN105969859A (zh) 乳腺癌易感基检测芯片及其制备方法
CN102586456A (zh) 一种多重竞争性pcr检测拷贝数变异的方法
CN111088382A (zh) 一种玉米全基因组snp芯片及其应用
CN106148484B (zh) 一种诊断y染色体微缺失的试剂盒
CN106191311A (zh) 一种快速检测豚鼠LCMV、SV、PVM、Reo‑3病毒的多重液相基因芯片方法及试剂
CN108060237A (zh) 基于55个y染色体snp遗传标记的法医学复合检测试剂盒
CN104830975A (zh) 一种玉米亲本来源真实性及其比例测试新方法
CN106497916A (zh) 一种用于高通量测序检测的nk细胞多基因变异文库的构建方法及其应用
CN107502679A (zh) 鉴别prrsv毒株基因亚型的lamp引物及鉴别方法和应用
CN104818340A (zh) 检测jak2基因v617f位点多态性的引物、试剂盒及其pcr方法
CN105603081B (zh) 一种非诊断目的的肠道微生物定性与定量的检测方法
CN102533957B (zh) 一种检测p53基因突变的引物和探针
CN113564266B (zh) Snp分型遗传标记组合、检测试剂盒及用途
CN114085926B (zh) Abcb1基因c3435t的snp位点多态性的引物和探针、试剂盒及检测方法
CN102888467A (zh) 检测猪呼吸道疾病综合症病毒的基因芯片及其检测方法
CN111172248B (zh) 一种基于片段分析技术验证拷贝数变异的通用试剂盒
CN104805186B (zh) 一种测试玉米品种实质性派生关系的方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
EE01 Entry into force of recordation of patent licensing contract

Application publication date: 20150107

Assignee: XIAMEN ZHISHAN BIOLOGICAL TECHNOLOGY CO.,LTD.

Assignor: Xiamen University

Contract record no.: 2016350000051

Denomination of invention: Deafness susceptibility gene mutation detection kit as well as preparation method and application thereof

Granted publication date: 20160615

License type: Exclusive License

Record date: 20161202

LICC Enforcement, change and cancellation of record of contracts on the licence for exploitation of a patent or utility model