CN106148484B

CN106148484B - 一种诊断y染色体微缺失的试剂盒

Info

Publication number: CN106148484B
Application number: CN201510141295.9A
Authority: CN
Inventors: 郭安亮; 姚见儿; 刘榴; 王方金
Original assignee: Shanghai Tou Jing Life Science Limited-Liability Co
Current assignee: Shanghai Tou Jing Life Science Limited-Liability Co
Priority date: 2015-03-27
Filing date: 2015-03-27
Publication date: 2019-10-25
Anticipated expiration: 2035-03-27
Also published as: CN106148484A

Abstract

本发明涉及一种诊断Y染色体微缺失的试剂盒。揭示了适用于PCR检测Y染色体微缺失的优化的检测试剂，所述检测试剂经过合理的设计、优选而获得，用于PCR扩增时特异性良好、扩增效率高、灵敏度高，可以同时检测多个Y染色体微缺失位点，检测程序简单易操作。本发明人还优化了PCR扩增反应，进一步提高了扩增效率。

Description

一种诊断Y染色体微缺失的试剂盒

技术领域

本发明属于基因诊断领域，更具体地，本发明涉及一种诊断Y染色体微缺失的试剂盒。

背景技术

目前，全世界约10-15％的夫妇罹患不育症，其中，男性不育因素占50％，引起男性不育的原因有很多，因遗传缺陷导致的不育约占男性不育的30％。导致男性遗传学异常的原因主要为Y染色体微缺失、染色体结构和数目异常、基因突变。Y染色体长臂上存在着与精子发生相关的基因，称为无精子症因子(Azoospermia Factor，AZF)。AZF分为AZFa、AZFb、AZFc三个相互独立的区域。任何一个区域的微缺失都会导致精子生成的障碍，引起少精子症或无精子症。Y染色体AZF区域的微缺失是导致男性不育的重要遗传学因素之一，对男性不育患者进行Y染色体微缺失的检测，可查明部分不育患者的病因，避免不必要的药物和手术治疗，并为临床辅助生殖提供指导和依据。

辅助生育技术的发展，如睾丸精子穿刺技术(testicular sperm extraction，TESE)、卵胞浆内单精子显微注射技术(Intracytoplasmic sperm injection，ICSI)、试管受精技术(in-vitro fertilization，IVF)，使许多少精症甚至是无精子症患者可以生育下一代，为男性不育的治疗带来了革命性的突破。但是，对于AZFa全缺失患者、AZFb全缺失患者、AZFc区域缺失患者和AZFb+c缺失患者而言，虽然可以进行ICSI，但会将缺失遗传给下一代，导致子代男性不育。另外，对于AZFa和AZFa、AZFb、AZFc3个区域都缺失的患者，100％表现为无精子症，对这类患者进行TESE获得精子的机会几乎为零。

因此，手术前对Y染色体微缺失进行筛查对男性不育治疗手段的选择具有很重要的价值。在精子发生障碍的不育患者中，Y染色体微缺失的发生率仅次于Klinefelter综合症，是居于第二位的遗传因素。目前，在欧美很多国家都已广泛开展Y染色体微缺失的检测工作，对Y染色体微缺失进行检测，一方面可以为临床上一些不明病因的男性不育患者找到病因，另外一方面可以为男性不育患者的临床诊断提供依据和指导。

目前，Y染色体微缺失的检测方法主要采用PCR技术，检测位点为Y染色体各个区域的序列标签位点(Sequence tagged site，STS)或候选基因。在Y染色体微缺失研究中STS的选择上仍然存在部分争议，缺乏统一的标准。原则上，AZF各区域仅检测一个非多态性STS就可以说明该区域是否存在缺失。为了增加实验的可信度、提高灵敏度，有必要增加STS位点，2004年欧洲男科协会和欧洲质控组织公布Y染色体微缺失检测指南中推荐在每个AZF区域使用2个STS：AZFa(sY84，sY86)，AZFb(sY127，sY134)，AZFc(sY254，sY255)，并且指出这6个STS位点能够反映超过95％的AZF缺失。

目前常用的检测方法主要有多重PCR-电泳法、多重PCR-基因芯片法、荧光原位杂交技术，实时荧光PCR法等。

(1)多重PCR-电泳法：检测AZF 3个区域不同的STS位点的多重定性PCR是目前Y染色体微缺失应用最为广泛的方法，应用多重PCR扩增Y染色体上的不同区域的STS位点，最后通过多重PCR的方法扩增Y染色体上的不同区域的STS位点，最后通过琼脂糖电泳检测的方法来确定Y染色体相应区域是否存在缺失。多重PCR-电泳的方法成本低，但是操作比较繁琐，不易实现高通量检测，并且容易出现污染。

(2)多重PCR-基因芯片：基因芯片是近二十年发展起来的新技术，基因芯片分析方法较多重PCR-电泳法相比，灵敏度和特异性都有所提高，并且具有高通量、自动化、快速等优点，同时相对减少了人工操作；但是，相对而言成本较高。

(3)荧光原位杂交技术：荧光原位杂交与传统的放射性标记原位杂交相比具有快速、检测信号强、杂交特异性高和可以多重染色等特点，但是，检测步骤繁琐，检测周期长。

(4)实时荧光定量PCR：多重PCR由于需要电泳检测PCR产物比较繁琐，实时荧光定量PCR法相对自动化程度高、不需要电泳检测和杂交等步骤，能够有效减少污染问题所致的结果判读，同时由于荧光变化非常灵敏，因此比传统的PCR更加灵敏，另外，实时荧光PCR法还可以对基因进行定量，是一种高效简单的检测方法，以往的实时荧光定量方法，多为单通道或者2通道检测，检测Y染色体微缺失需要多个位点进行检测，检测通量低，且不方便设置内参，容易造成缺失误判，大大限制了实时荧光定量PCR的检测应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种操作简单、结果准确、高通量、高灵敏度、重复性好的Y染色体微缺失检测用的试剂盒以及检测方法。

在本发明的第一方面，提供一种检测Y染色体微缺失试剂盒，所述的试剂盒中含有扩增引物和对应的检测探针，所述的引物和探针序列如下：

(1)特异性扩增AZFa区sY84的上游引物SEQ ID NO:4，下游引物SEQ ID NO:5，及识别探针SEQ ID NO:6；

(2)特异性扩增AZFb区sY127的上游引物SEQ ID NO:7，下游引物SEQ ID NO:8，及识别探针SEQ ID NO:9；

(3)特异性扩增AZFc区sY255的上游引物SEQ ID NO:10，下游引物SEQ ID NO:11，及识别探针SEQ ID NO:12；

(4)特异性扩增AZFa区sY86的上游引物SEQ ID NO:16，下游引物SEQ ID NO:17，及识别探针SEQ ID NO:18；

(5)特异性扩增AZFb区sY134的上游引物SEQ ID NO:19，下游引物SEQ ID NO:20，及识别探针SEQ ID NO:21；

(6)特异性扩增AZFc区sY254的上游引物SEQ ID NO:22，下游引物SEQ ID NO:23，及识别探针SEQ ID NO:24。

在一个优选例中，所述的试剂盒中还包括：

(7)特异性扩增SRY的上游引物SEQ ID NO:1，下游引物SEQ ID NO:2，及识别探针SEQ ID NO:3；

(8)特异性扩增ZFX/ZFY的上游引物SEQ ID NO:13，下游引物SEQ ID NO:14，及识别探针SEQ ID NO:15。

在另一优选例中，所述的试剂盒中还包括：Unitag引物SEQ ID NO:25。

在另一优选例中，所述的试剂盒设置2个试剂组：试剂组1包括：(1)、(2)、(3)及(7)；试剂组2包括：(4)、(5)、(6)及(8)。

在另一优选例中，试剂组1中，以VIC作为(1)中的探针的荧光基团；以ROX作为特异性(2)中的探针的荧光基团；以Cy5作为(3)中的探针的荧光基团，以FAM作为(7)中的探针的荧光基团。

在另一优选例中，试剂组2中，以VIC作为(4)中的探针的荧光基团；以ROX作为特异性(5)中的探针的荧光基团；以Cy5作为(6)中的探针的荧光基团，以FAM作为(8)中的探针的荧光基团。

在另一优选例中，所述的试剂盒中还包括(但不限于)：PCR缓冲液，DNA聚合酶和/或使用说明书。

在另一优选例中，所述的试剂盒中，上游引物的终浓度为0.04±0.02uM(较佳地0.04±0.01uM)，下游引物的终浓度为0.04±0.02uM(较佳地0.04±0.01uM)，Unitag引物的终浓度0.4±0.2uM(较佳地0.4±0.1uM)。

在另一优选例中，所述的试剂盒中，各上游引物、下游引物与Unitag引物的浓度比(摩尔比)为：(0.9-1.1):(0.9-1.1):(9-11)；较佳地为1:1:10。

在本发明的另一方面，提供所述的试剂盒的用途，用于非诊断性地检测Y染色体微缺失。

在本发明的另一方面，提供一种检测Y染色体微缺失的方法，所述的方法包括：

利用所述的试剂盒中的试剂对待测样品进行荧光PCR检测，从而确定待测样品是否存在Y染色体微缺失。

在另一优选例中，所述的检测Y染色体微缺失的方法为非疾病诊断方法。

在另一优选例中，PCR检测时，PCR扩增体系中，上游引物的终浓度为0.04±0.02uM(较佳地0.04±0.01uM)，下游引物的终浓度为0.04±0.02uM(较佳地0.04±0.01uM)，还加入Unitag引物且终浓度0.4±0.2uM(较佳地0.4±0.1uM)。

在另一优选例中，所述的试剂盒设置2个试剂组：试剂组1包括：(1)、(2)、(3)及(7)；且以VIC作为(1)中的探针的荧光基团；以ROX作为特异性(2)中的探针的荧光基团；以Cy5作为(3)中的探针的荧光基团，以FAM作为(7)中的探针的荧光基团；试剂组2包括：(4)、(5)、(6)及(8)；且以VIC作为(4)中的探针的荧光基团；以ROX作为特异性(5)中的探针的荧光基团；以Cy5作为(6)中的探针的荧光基团，以FAM作为(8)中的探针的荧光基团；

将试剂组1和试剂组2分别在各自独立PCR体系中进行扩增反应，通过检测荧光基团确定是否存在Y染色体微缺失及Y染色体微缺失发生位点。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、本发明的诊断Y染色体微缺失的多重实时荧光PCR方法的原理示意图。

图2、实时荧光定量PCR的反应条件示意图。

图3A、实时荧光定量PCR结果图。

图3B、组一和组二不同模板DNA浓度的Ct值曲线。

图3C、实时荧光定量曲线截图。其中，组1：a(10^6拷贝/ul)，b(10^5拷贝/ul)，c(10^4拷贝/ul)，d(10^3拷贝/ul)，e(10^2拷贝/ul)，f(10^1拷贝/ul)；组2：A(10^6拷贝/ul)，B(10^5拷贝/ul)，C(10^4拷贝/ul)，D(10^3拷贝/ul)，E(10^2拷贝/ul)，F(10^1拷贝/ul)。

图4A-B、正常男性样本多重PCR扩增实验结果；其中，图4A为A组，图4B为B组。

图5A-B、AZFa区域缺失样本多重PCR扩增实验结果，其中，图5A为A组，图5B为B组。

图6A-B、AZFb区域缺失样本多重PCR扩增实验结果，其中，图6A为A组，图6B为B组。

图7A-B、AZFc区域缺失样本多重PCR扩增实验结果，其中，图7A为A组，图7B为B组。

图8A-B、AZFb+c缺失样本多重PCR扩增实验结果，其中，图8A为A组，图8B为B组。

图9A-B、AZFa+b+c缺失样本多重PCR扩增实验结果，其中，图9A为A组，图9B为B组。

图10A-B、正常女性样本多重PCR扩增实验结果，其中，图10A为A组，图10B为B组。

图11A-B、阴性对照多重PCR扩增实验结果，其中，图11A为A组，图11B为B组。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，揭示了适用于PCR检测Y染色体微缺失的优化的检测试剂，所述检测试剂经过合理的设计、优选而获得，用于PCR扩增时特异性良好、扩增效率高、灵敏度高，可以同时检测多个Y染色体微缺失位点，检测程序简单易操作。本发明人还优化了PCR扩增反应，进一步提高了扩增效率。

如本文所用，“待测样本”、“待测样品”或“待测核酸(如DNA)样品”是指待检测的核酸样本，其中含有一种核酸或多种核酸，需要了解其中是否存在目标核酸。

如本文所用，“目标核酸”是指感兴趣的核酸片段，其是一种存在Y染色体上的STS(Sequence-Tagged Sites，序列特异性标签位点)的序列片段。

如本文所用，“探针”是指一种具有已知核苷酸序列的单链核酸，其具有与目标核酸基本上互补的核苷酸序列结构，可以与“目标核酸”形成双链。所述的“探针”可以携带标记物。例如，标记物可以连接在探针的5’末端或3’末端。

本发明人在研究中发现，应用PCR检测Y染色体微缺失时，利用一般的引物进行PCR扩增时特异性较差，易于发生非特异性结合，灵敏度降低。因此，需要设计和筛选特异性且灵敏度好的检测试剂。基于此本发明人设计了高度特异的引物来扩增出不同的目的片段，并用相应的探针来识别。

所述的探针连接有适合于不同检测通道的荧光基团。探针的前端标记有荧光基团，另一端标记有该荧光基团相应的淬灭基团，其中淬灭基团可淬灭荧光基团发出的荧光。当PCR扩增反应进行时，利用聚合酶的正向外切活性将带有荧光基团的碱基切离，游离后的荧光基团不再受淬灭基团的影响，在激发光的作用下可发射一定波长的荧光信号。随着PCR产物的不断积累，荧光信号不断地增强，从而可以检测到序列片段的存在。

本发明的检测试剂被置于试剂盒中，从而便于人们应用。除了引物和探针，试剂盒中还可包含：PCR反应液，质控品，阴性对照和/或使用说明书。

作为本发明的优选方式，所述的试剂盒设计为适用于采用两管多重PCR扩增技术的试剂盒。所述的两管多重PCR扩增具体为：以四个通道(如FAM/VIC/ROX/Cy5)荧光检测的方法，判断Y染色体AZFa，AZFb，AZFc三个区域六个序列标签位点(Sequence Tag Site，STS)的微缺失，同时设置两个内对照基因：男性性别决定基因(Sex-determining region ofthe Y chromosome，SRY)和编码锌指蛋白基因ZFX/ZFY(Zinc finger protein，X-linked，ZFX；Zinc finger protein，Y-linked，ZFY)，对样品采集、抽提、PCR整个过程进行质控。

检测时，首先抽提标本DNA，然后，以抽提标本为模板进行多重PCR扩增，当存在靶标序列时，引物退火，并在DNA聚合酶(如Taq酶)作用下进行延伸，DNA聚合酶水解荧光探针，使得荧光探针上的荧光报告基团远离淬灭基团而发出荧光信号，游离的报告基团数目与对应PCR扩增产物正相关。通过监测荧光信号，来判断是否存在相应检测指标。相关原理示意图如图1。

因为反应体系中引物条数较多，并且检测时，是四个通道检测指标同时扩增的，为了减少基因组非特异扩增，降低不同通道检测指标之间扩增效率的差异，本发明人还优化了PCR检测，期间尝试了多种PCR条件的优化，最终确定采用不对称PCR和单向共用引物(Unitag引物)的方案，优化反应体系，降低引物浓度，从而降低非特异性扩增，尽量缩小不同检测STS之间的扩增差异。

在PCR扩增过程中，特异性上游引物PF和下游引物PR分别与模板结合，特异性延伸，因为，在反应体系中Unitag引物浓度较高，PF较少，在整个PCR反应体系中Unitag相应扩增延伸的PCR产物更易优势扩增，这样更加容易形成Unitag延伸的单链，探针更加容易结合到对应互补的PCR产物(Unitag延伸链)单链上，引物退火延伸水解探针效率提高。

本发明的方法自动化程度好，操作简单，不需要电泳检测和杂交等步骤；检测通量高，UNG酶防污染体系设计，有效地减少污染所导致的假阳性结果；实时荧光监测，灵敏度高，并可对基因进行定量分析。为一种简便高效的核酸检测方法，适合临床推广。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、两管法检测方案及引物探针设计

本实施例中，试剂盒采用两管多重不对称共用引物PCR扩增，四个通道(FAM/VIC/ROX/Cy5)荧光检测的方法，判断AZFa，AZFb，AZFc三个区域六个STS位点的微缺失，同时设置两个内对照基因，对样品采集、抽提、PCR整个过程进行质控。自动化程度好，操作简单，不需要电泳检测和杂交等步骤；检测通量高，UNG酶防污染体系设计，有效地减少污染所导致的假阳性结果。相应的A管和B管的检测位点信息如表1所示。

表1、检测位点信息

1～4为A组(置于PCR管1中)检测位点信息，5～8为B组(置于PCR管2中)检测位点信息。

同时，本发明人优化了引物与探针序列以及引物加入的比例以提高检测的灵敏度、减少非特异性。优化后的序列信息如表2所示。

表2、引物探针序列表

实施例2、样本制备、PCR扩增程序及结果判断方法

1)样本制备

采用商业化试剂盒：BloodGen Mini Kit(0.1-1ml)血液基因组柱式小量提取试剂盒，直接从人外周血液中抽提人基因组DNA，人外周血DNA抽提步骤如下：

(a)样品处理：提取200ul人外周血样本于1.5ml离心管中。

(b)以上溶液中加入20ul蛋白酶，混匀。

(c)加入200ul Buffer GL，颠倒混匀15次，剧烈震荡至少1分钟。

(d)56℃孵育10分钟，其间颠倒混匀数次。

(e)加入200ul无水乙醇，颠倒混匀10次，剧烈震荡。短暂离心，使管壁和壁盖上的液体集中到管底。

(f)将步骤(e)所得溶液全部加入到已装入收集管(Collection Tube)的吸附柱(Spin Column DM)中，若一次不能加完溶液，可分多次转入。10,000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

(g)向吸附柱中加入500ul Buffer GW1，10,000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

(h)向吸附柱中加入500ul Buffer GW2，10,000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

(i)10,000rpm离心2分钟，倒掉收集管中的废液。将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干。

(j)将吸附柱置于一个新的离心管中，向吸附柱的中间部位悬空加入100ulBuffer GE或灭菌水，室温放置2-5分钟，10,000rpm离心1分钟，收集DNA溶液，-20℃保存DNA。

2)PCR扩增

质控品采用：采用正常生育的男性全血，参照样本制备步骤，抽提基因组DNA。

阴性对照采用：ddH₂O。

双管法的分组：如表1所示针对不同检测位点分别将相应引物和探针分配于A组(PCR管1)和B组(PCR管2)中，每一PCR管为一个独立的PCR反应体系。

实时荧光定量PCR反应体系中包括1×PCR Buffer，Mg²⁺，dATP、dCTP、dGTP、dUTP，各引物及各通道检测探针，热启动酶和UNG酶，10ng～30ng人基因组DNA(检测标本或质控品或阴性对照)。

实时荧光定量PCR反应在ABI 7500上进行，按照以下条件进行扩增检测(图2)：

第一阶段：50℃2分钟，1个循环；

第二阶段：95℃5分钟，1个循环；

第三阶段：95℃15秒，60℃30秒，72℃30秒，38个循环；

第四阶段：72℃5分钟，1个循环。

信号收集：在第三阶段60℃时收集FAM/VIC/ROX/Cy5信号，并保存相关文件。

结果判断标准

质控品每个检测通道都有扩增曲线，并且Ct起跳在第32个循环之前。

阴性对照的四个通道检测应无曲线起跳，任何一组任何一个通道检测有信号起跳，则此次结果无效。

实验结果：四个检测通道的相应检测指标及判断，如表3所示。

表3、仪器检测通道设置(FAM/VIC/ROX/Cy5)

注：每一份标本做两管PCR反应，SRY、sY84、sY127、sY255为A组(PCR管1)，ZFX/ZFY、sY86、sY134、sY254为B组(PCR管2)。

实施例3、针对sY255位点考察不同引物浓度设计的PCR扩增效果

实验目的：考察不同引物浓度对PCR扩增效果的影响。

1、实验材料

采用特异性Y染色体STS的引物，以正常男性标本10^6拷贝/ul，10^5拷贝/ul，10^4拷贝/ul，10^3拷贝/ul，10^2拷贝/ul，10^1拷贝/ul为模板，考察不同引物配比，荧光探针检测信号结果。

2、实验分组

引物浓度组一：上游引物PF和下游引物PR都为正常加入比例，在PCR反应体系中终浓度为0.2uM；Unitag引物量0.04uM；探针终浓度0.08uM。

引物浓度组二：上游引物和下游引物同等比降低为终浓度0.04uM，增加Unitag引物量0.4uM；探针终浓度0.08uM。

3、引物及PCR产物序列信息

255_PF：5’-GAGTTACAGGATTCGGCGTG-3’(SEQ ID NO:26)；

255_PR_N：5’-AACAAAAGTTATGTGCTCGTCAT-3’(SEQ ID NO:27)；

255_PR：5’-GAGTCGGTCTGAGATTGCTGAACAAAAGTTATGTGCTCGTCAT-3’(SEQ ID NO:28)；

Unitag：5’-GAGTCGGTCTGAGATTGCTG-3’(SEQ ID NO:29)；

PCR产物长度140bp。

4、PCR反应体系配置

PCR反应体系配制

5、PCR扩增

参见前面实施例2的PCR扩增程序(图2)。

6、实验结果

实时荧光定量图形截图如表4和图3。可见，采用组2方式比组1的方式检测结果，Ct值更小，曲线的起跳更加靠前(即灵敏度高)，扩增检测效率更高，S型曲线也更加明显(图3A)，不同模板DNA浓度的Ct值曲线如图3B。

表4(包括如下三张分表)

实时荧光定量曲线截图如图3C。

综上，可得出如下结果：

(1)采用组2方式比组1的方式检测结果，Ct值更小，起跳更加靠前，在10^3拷贝/ul的情况下，组2比组1起跳靠前约0.5Ct，扩增检测效率更高。

(2)结合S型曲线观察，与组1相比较，组2的S型曲线更加明显。

实施例4、多重PCR扩增实验

实验目的：采用基于两管法(两组法)的多重PCR扩增方式，采用前述优化的引物、探针及其浓度(表2，实施例3中组2)，考察不同标本类型的检测结果。

1、实验材料

以正常已经婚育男性样本，正常女性标本，AZFa区域缺失样本，AZFb区域缺失样本，AZFc区域缺失样本，AZFb+c缺失样本，AZFa+b+c缺失样本(这些样本来自临床合作单位，参照样本制备步骤抽提基因组DNA，浓度分别在20～50ng/ul之间)，阴性对照为模板，采用Y染色体微缺失检测试剂盒进行PCR扩增检测。

2、引物序列信息

参见实施例1中表2。

3、PCR反应体系配置

4、PCR扩增

参见实施例2中PCR扩增程序。

5、实验结果图谱

(1)正常男性样本

	FAM	VIC	ROX	Cy5
					A组	21.20	19.78	20.28	21.47
B组	22.02	21.02	21.61	20.54

结果如图4A(A组)和图4B(B组)。

(2)AZFa区域缺失样本

结果如图5A(A组)和图5B(B组)。

(3)AZFb区域缺失样本

	FAM	VIC	ROX	Cy5
					A组	21.17	19.75	No Ct	21.52
B组	22.08	21.01	No Ct	20.55

结果如图6A(A组)和图6B(B组)。

(4)AZFc区域缺失样本

	FAM	VIC	ROX	Cy5
					A组	21.17	19.80	20.26	No Ct
B组	22.04	21.04	21.66	No Ct

结果如图7A(A组)和图7B(B组)。

(5)AZFb+c缺失样本

	FAM	VIC	ROX	Cy5
					A组	21.20	19.93	No Ct	No Ct
B组	22.02	21.74	No Ct	No Ct

结果如图8A(A组)和图8B(B组)。

(6)AZFa+b+c缺失样本

	FAM	VIC	ROX	Cy5
					A组	22.15	No Ct	No Ct	No Ct
B组	22.38	No Ct	No Ct	No Ct

结果如图9A(A组)和图9B(B组)。

(7)正常女性样本

结果如图10A(A组)和图10B(B组)。

(8)阴性对照

	FAM	VIC	ROX	Cy5
					A组	No Ct	No Ct	No Ct	No Ct
B组	No Ct	No Ct	No Ct	No Ct

结果如图11A(A组)和图11B(B组)。

由上可见，采用两组多重不对称PCR共用引物的组合模式进行扩增，可以很好地区分各种缺失类型AZFa，AZFb，AZFc，AZFb+c，AZFa+b+c缺失及女性标本，曲线起跳明显。

综上所述，采用实时荧光定量PCR平台，根据EAA/EMQN标准设计，试剂盒采用两管多重PCR扩增，四个通道(FAM/VIC/ROX/Cy5)荧光检测的方法，判断AZFa，AZFb，AZFc三个区域六个STS位点的微缺失，同时设置两个内对照基因，对样品采集、抽提、PCR整个过程进行质控。自动化程度好，操作简单，不需要电泳检测和杂交等步骤；检测通量高，UNG酶防污染体系设计，有效地减少污染所导致的假阳性结果；实时荧光监测，灵敏度高，并可对基因进行定量分析。不失为一种简便高效的核酸检测方法，适合临床推广，具有广阔的应用前景。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种检测Y染色体微缺失试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中含有扩增引物和对应的检测探针，所述的引物和探针序列如下：

(6)特异性扩增AZFc区sY254的上游引物SEQ ID NO:22，下游引物SEQ ID NO:23，及识别探针SEQ ID NO:24；

(7)特异性扩增SRY的上游引物SEQ ID NO:1，下游引物SEQ ID NO:2，及识别探针SEQID NO:3；

(8)特异性扩增ZFX/ZFY的上游引物SEQ ID NO:13，下游引物SEQ ID NO:14，及识别探针SEQ ID NO:15；

其中还包括Unitag引物SEQ ID NO:25；且，上游引物终浓度0.04uM，下游引物终浓度0.04uM，Unitag引物终浓度0.4uM；

所述的试剂盒设置2个试剂组：试剂组1包括：(1)、(2)、(3)及(7)；试剂组2包括：(4)、(5)、(6)及(8)。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，试剂组1中，以VIC作为(1)中的探针的荧光基团；以ROX作为(2)中的探针的荧光基团；以Cy5作为(3)中的探针的荧光基团，以FAM作为(7)中的探针的荧光基团；

试剂组2中，以VIC作为(4)中的探针的荧光基团；以ROX作为(5)中的探针的荧光基团；以Cy5作为(6)中的探针的荧光基团，以FAM作为(8)中的探针的荧光基团。

3.如权利要求1-2任一所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还包括：PCR缓冲液，DNA聚合酶和/或使用说明书。

4.权利要求1-3任一所述的试剂盒的用途，用于非诊断性地检测Y染色体微缺失。

5.一种非诊断性地检测Y染色体微缺失的方法，其特征在于，所述的方法包括：

利用权利要求1-3任一所述的试剂盒中的试剂对待测样品进行荧光PCR检测，从而确定待测样品是否存在Y染色体微缺失；且，PCR扩增体系中，上游引物的终浓度为0.04uM，下游引物的终浓度为0.04uM，还加入Unitag引物且终浓度0.4uM。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的试剂盒设置2个试剂组：试剂组1包括：(1)、(2)、(3)及(7)；且以VIC作为(1)中的探针的荧光基团；以ROX作为(2)中的探针的荧光基团；以Cy5作为(3)中的探针的荧光基团，以FAM作为(7)中的探针的荧光基团；

试剂组2包括：(4)、(5)、(6)及(8)；且以VIC作为(4)中的探针的荧光基团；以ROX作为(5)中的探针的荧光基团；以Cy5作为(6)中的探针的荧光基团，以FAM作为(8)中的探针的荧光基团；