CN101177702B - 线粒体病MELAS和MERRF综合征相关mtDNA突变位点检测基因芯片及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及线粒体病MELAS和MERRF综合征相关mtDNA突变位点的检测，公开了一种人类线粒体病MELAS和MERRF综合征相关的mtDNA突变位点检测基因芯片，其中，在基因芯片载体表面点阵固定有可检测人类线粒体病MELAS和MERRF综合征相关的mtDNA突变位点的特异性寡核苷酸探针。本发明还进一步公开了上述基因芯片的制备及使用方法。本发明的基因芯片可用于检测所有与人类线粒体病MELAS和MERRF综合征相关的mtDNA突变位点，且灵敏度高、特异性强和可重复性好；与传统分子生物学方法相比，检测时间大大缩短，达到MELAS和MERRF综合征临床诊断与鉴别诊断的目的。
Description
技术领域
本发明涉及线粒体病MELAS和MERRF综合征相关mtDNA突变位点的检测，特别是一种线粒体病MELAS和MERRF综合征相关mtDNA突变位点检测基因芯片及其制作方法，及利用该芯片对患者临床标本中MELAS和MERRF综合征相关mtDNA突变位点的检测和筛查。
背景技术
现在已经知道线粒体脑肌病伴高乳酸血症和卒中样发作(mitochondrialencephalomyopathy with lactic acidosis and stroke-like episodes，MELAS)和肌阵挛性癫痫伴发不规整红纤维(myoclonic epilepsy with ragged red fibers，MERRF)是两种常见的线粒体病，主要由mtDNA突变引起。MELAS是一组具有高度临床变异性和遗传异质性的mtDNA疾病，大多数MELAS病例是由mt-tRNALeu(UUR)基因上的异质性突变A3243G引起；少数则是由其它mtDNA点突变(如T3271C)或大片段重组突变所致；还有一些可能由核基因突变引发。MERRF是一种母系遗传神经肌肉紊乱综合症，大多数与MERRF有关的mtDNA突变位于tRNALys基因上，其中以A8344G突变最为常见。至今，已有超过20种mtDNA点突变被报道与MELAS有关，有10种左右mtDNA点突变被报道与MERRF有关。这些突变位点在国内外已有相关文献进行报道，总数约31个，其中，MELAS综合征相关mtDNA突变位点有：G583A、G1642A、C3093G、A3243G、G3244A、A3252G、C3256T、T3258C、T3271C、T3291C、G3376A、G3697A、G3946A、T3949C、G4332A、T9957C、A12770G、A13045C、A13084T、G13513A、A13514G、G14453A，MERRF综合征相关mtDNA突变位点有：G611A、G3255A、A8296G、A8344G、T8356C、G8361A、G8363A、A8431T、G12147A。
对线粒体病MELAS和MERRF综合征的诊断以往多依赖临床指征以及病理形态学检测，但由于这两种综合征的早期临床指征并不明显，生物化学与组织化学检测方法特异性不高，因而，应用分子生物学方法对线粒体病MELAS和MERRF综合征相关mtDNA突变位点进行筛查，有助于了解疾病的确切性质，从而为患者的治疗和遗传学咨询提供确凿证据。目前虽然建立了不少mtDNA突变体检测方法，如限制性酶切片段长度多态性(RFLP)、单链构象多态性(SSCP)、特异引物序列分析(SSP)、构象敏感电泳(CSGE)、瞬时温度梯度电泳(TTGE)、 变性梯度凝胶电泳(DGGE)和变性高效液相色谱(DHPLC)等，但在实际运用方面仍有许多局限性，如RFLP花费高、工作量大且有些重要突变位点因不在所使用限制性内切核酸酶的识别范围而不能被检测到，其他方法相对于RFLP要复杂。更重要的是，这些方法大多只能针对一个或几个突变位点进行检测，不能高通量对基因不同的突变体同时进行筛选，一些方法的结果仍需依赖分子测序加以验证。
基因芯片是近年来迅速发展起来的集物理学、化学、材料科学和生命科学于一体的高新技术，利用微电子芯片技术的集约化和平行处理原理，将大量具有生物学意义的特殊序列的生物样品有序地固化在玻璃片和硅片等基质表面，并利用微量反应体积，一次杂交就可以对许多基因表达水平、突变和多态性进行特异、快速、精确检测，已经在基因表达、基因突变、基因多态性研究和基因诊断等领域获得成功应用。由于基因芯片具有这些独特的优点使其在线粒体基因检测方面得到一定的运用，如利用表达谱微阵列对线粒体基因的表达状况进行检测，来探讨线粒体病的发病机制，或利用寡核苷酸微阵列上的引物延伸反应或直接核酸杂交检测线粒体单核苷酸多肽性(SNP)等。
考虑到线粒体病MELAS和MERRF综合征早期的临床特征并不典型，有些症状可以相互重叠。有时候，患者可以同时表现MERRF和MELAS综合征的临床症状，形成所谓MERRF/MELAS重叠综合征(MERRF/MELAS overlap syndrome)，例如，mt-A3243G、T8356C和G12147A点突变可以分别引起MERRF/MELAS重叠综合征。文献报道与这两种综合征相关mtDNA突变位点超过30个，因而，开发一种新的集成基因芯片，用于对线粒体病MELAS和MERRF综合征相关mtDNA突变位点的检测和筛查，具有重要的社会效益和临床价值。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种用于线粒体病MELAS和MERRF综合征相关mtDNA突变位点集成检测基因芯片及其制作方法。
本发明的另一个目的在于提供一种检测线粒体病MELAS和MERRF综合征相关mtDNA突变位点的方法。
本发明的构思如下：
根据文献报道的31种线粒体病MELAS和MERRF综合征相关mtDNA突变位点和修正版剑桥mtDNA参考序列(revised Cambridge Reference Sequence，rCRS)，再利用特异性探针可以鉴定突变体的原理，共设计了62个探针(31对，每对探针针对一个MELAS或MERRF综 合征相关突变位点)和9对PCR引物(分成两组进行多重不对称PCR扩增，能特异性地扩增出包含上述31个MELAS、MERRF综合征相关mtDNA突变位点的目的DNA片段)。在一张芯片上固定MELAS和MERRF综合征相关mtDNA突变位点检测探针，只用PCR和杂交反应，就可以在6-8小时及时准确地确认被检者是否存在上述突变，能为治疗和遗传学咨询提供确凿证据，并可以进一步阐明这些突变体在中国人群中的分布及其对病因、发病机理、临床治疗及预后的影响。
本发明一方面公开了一种人类线粒体病MELAS和MERRF综合征相关的mtDNA突变位点检测基因芯片，在基因芯片载体表面点阵固定有人类线粒体病MELAS和MERRF综合征相关的mtDNA突变位点的特异性寡核苷酸探针。
上述特异性寡核苷酸探针的设计原则为：根据文献报道的31种MELAS和MERRF相关mtDNA突变位点和修正版剑桥mtDNA参考序列(revised Cambridge Reference Sequence，rCRS)，使不同探针的Tm值尽量位于(45±5)℃，使探针长度位于14-19bp，使每对探针所检测的突变位点位于探针序列中部或其附近，使探针与相应单链靶基因的结合部位尽量靠近单链靶基因的5’端至中部区域之间以保障杂交效率。特异性寡核苷酸探针可特异性识别人类线粒体病MELAS和MERRF综合征相关的mtDNA突变位点。
上述特异性寡核苷酸探针选自序列为SEQ ID NO.1～62的寡核苷酸探针中的一个或多个。
较佳的，基因芯片载体表面点阵固定有序列为SEQ ID NO.1～44的寡核苷酸探针，该芯片可用于特异检测MELAS综合征相关的所有已知突变。
同样较佳的，基因芯片载体表面点阵固定有序列为SEQ ID NO.45～62的寡核苷酸探针，该芯片可用于特异检测MERRF综合征相关的所有已知突变。
更佳的，基因芯片载体表面点阵固定有序列为SEQ ID NO.1～62的寡核苷酸探针，该芯片可只用一次PCR和一次杂交反应，同时检测人类线粒体病MELAS和MERRF综合征相关的所有已知mtDNA突变位点，效率更高。
优选的，上述寡核苷酸探针的5’端有氨基修饰基团，以便与醛基修饰芯片相结合，探针5’端加上一段15聚的Poly T，以减少杂交时的空间位阻。
上述基因芯片载体可以为载玻片，优选醛基修饰的载玻片。
本发明第二方面，公开了上述人类线粒体病MELAS和MERRF综合征相关的mtDNA突变位点检测基因芯片的制备方法，包括下列步骤：
将选自序列为SEQ ID NO.1～62的寡核苷酸探针5’端加上一段15聚的Poly T，并对 5’端进行氨基修饰，用去离子水将各探针分别稀释，并分别与点样液等体积混合，获得终浓度为12.5～50uM的寡核苷酸探针溶液，采用常规的方法将寡核苷酸探针溶液与阴性对照和阳性对照一起点阵于载玻片表面，并固定48～72小时。载玻片优选醛基修饰的载玻片。上述点样液的作用在于优化芯片制作的质量，可选用各种市售或自行配置的点样液。上述阴性对照为点样液。阳性对照为所选的各寡核苷酸探针的等量混合液。
较佳的，上述寡核苷酸探针的终浓度为12.5uM。固定的条件为将点样好的芯片置于70％湿度下固定的时间以48小时。
优选的，在上述步骤中，将序列为SEQ ID NO.1～44或SEQ ID NO.45～62的寡核苷酸探针点样于芯片上。更优选的，将序列为SEQ ID NO.1～62的寡核苷酸探针点全部点样于芯片上。
本发明的第三方面，公开了一种检测人类线粒体病MELAS和MERRF综合征相关的mtDNA突变位点的方法，包括下列步骤：
1)抽取样本DNA；
2)样本DNA的PCR扩增和标记：以样本DNA为模板，选择合适引物PCR扩增并标记待测的突变相关序列；
3)采用前述基因芯片于样本PCR产物变性后进行杂交检测：将样本PCR扩增产物与杂交液以1∶2～1∶1的体积比混合获得混合液，混合液中PCR扩增产物变性后将混合液点于芯片上上进行杂交，杂交后用洗液洗涤，再通过检测标记信号的强度判断是否发生相应突变。
上述杂交液为常规用于核酸杂交反应的杂交液，可选用各种市售或自行配置的杂交液。
上述混合液中PCR扩增产物变性可采用常规的变性方法，如95℃变性。
洗液用于将未完全匹配的PCR扩增产物从芯片上除去，可选用本领域常规的用于核酸杂交的洗液。
较佳的，上述步骤3中，杂交温度为35-40℃；杂交时间为30-60分钟。
洗液洗涤时，先用一次洗液洗5-15分钟，再用二次洗液洗5-15分钟。优选的，一次洗液为2xSSC+0.1％SDS；二次洗液为0.2xSSC+0.1％xSDS；二次洗脱条件为30℃洗涤5分钟。
改进的，上述步骤2中的引物选自序列为SEQ ID NO.63～80的核苷酸序列。每对正反引物中，至少有一个被标记，标记可采用常规的标记，如荧光标记等，本发明实施例中使用了Cy5荧光分子标记，并使用激光共聚集扫描仪扫描荧光信号强度。
更佳的，上述步骤2中的PCR扩增为多重不对称PCR扩增：将序列为ID NO.63～72的 核苷酸序列作为一组五重不对称PCR的引物，序列为ID NO.73～80的核苷酸序列作为一组四重不对称PCR的引物，分别以样本DNA为模板进行PCR扩增。
多重不对称PCR扩增即为PCR扩增时，不同引物对之间浓度不等，同一引物对，正向引物与反向引物的浓度也不同。
本发明的基因芯片可用于检测所有与人类线粒体病MELAS和MERRF综合征相关的mtDNA突变位点，优选方案可一次同时检测所有的mtDNA突变位点。本发明的基因芯片从样本制备到PCR扩增，得到检测结果，可在6-8小时内完成，大大缩短了对患者的诊断时间，可以对临床上疑似MELAS或MERRF患者的mtDNA进行初步筛查，以确定有无已知突变体，从而为疾病的治疗或遗传学咨询提供一定的线索，具有较好的临床推广价值。此外，本发明的基因芯片还具有很高的灵敏度、特异性和可重复性；与传统分子生物学方法相比，检测时间大大缩短，达到MELAS和MERRF综合征临床诊断与鉴别诊断的目的。而本发明构建的芯片平台还可能用于其他人类遗传疾病的临床诊断。
附图说明
图1线粒体病MELAS和MERRF综合征相关mtDNA突变位点集成检测基因芯片的点阵图
图中方块内的阿拉伯数字为检测探针编号(每一种探针重复点3个点)，英文字母‘P’为阳性对照探针(各种探针的混合物)，‘N’为阴性对照探针(点样液)。对于每个人类线粒体DNA样本来说，阳性对照探针都应该有较强的信号，阴性对照探针都应该没有信号或有很微弱的信号，否则意味着PCR扩增或杂交失败。
图2：探针浓度对荧光强度的影响
图3：包被时间对荧光强度的影响
图4：杂交温度对荧光强度的影响
图5：杂交时间对荧光强度的
图6：洗脱缓冲液对荧光强度的影响
图7：洗脱时间对荧光强度的影响
图8：洗脱温度对荧光强度的影响
图9：重复性实验检测图
图10：灵敏度实验检测图
图11多重不对称PCR产物电泳图
图中M为100bp DNA ladder(从下往上分别为100bp-1000bp的条带，每个条带间隔 100bp)；5x为第一组五重不对称PCR；4x为第二组四重不对称PCR。
图12：健康人样本与患者样本芯片扫描图示例。黑色箭头指向处为发生突变的位点。
a：健康对照(N1)
b：MELAS患者(P1)(mt-A3243G异质性突变)
c：MERRF患者(P2)(mt-A8344G均质性突变)
d：MERRF患者(P3)(mt-T8356C异质性突变)
图13：3种MELAS和MERRF相关mtDNA突变位点的野生型与突变型样本的测序图。
a：mtDNA-3243位点野生型(N1)与A＞G异质性突变体(P1)测序图
b：mtDNA-8344位点野生型(N1)与A＞G均质性突变体(P2)测序图
c：mtDNA-8356位点野生型(N1)与T＞C异质性突变体(P3)测序图
具体实施方式
下面结合实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而非限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：试验手册(New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的条件或者制造商建议的条件进行或配置。
实施例1 探针设计和芯片的制备
(1)芯片上探针的设计：
根据文献报道的31种MELAS和MERRF综合征相关mtDNA点突变和修正版剑桥mtDNA参考序列(revised Cambridge Reference Sequence，rCRS)，用Oligo 6.0软件设计62条寡核苷酸探针，使不同探针的Tm值尽量位于(45±5)℃，使探针长度位于14-19bp，使每对探针所检测的突变位点位于探针序列中部或其附近，使探针与相应单链靶基因的结合部位尽量靠近单链靶基因的5’端到中部区域之间以保障杂交效率。探针的5’端有氨基修饰基团，以便与醛基修饰芯片相结合；不同探针的综合参数(探针长度、GC％及Tm值)尽量接近，为了减少杂交时的空间位阻，合成时，在62条探针的寡核苷酸5’端加上一段15聚的Poly T(连接臂)。阳性对照探针选取各个探针的等量混合物，阴性对照探针选取点样液(TeleChem Internation)。62条探针如下表所列：
| 探针名称 | 序列编号 SEQ ID NO. | 所在链 | 序列(5’-NH2-(T)15-xxx xxx xxx xxx xxx-3’) |
| 583 w 583 m 1642 w 1642 m 3093 w 3093 m 3243 w 3243 m 3244 w 3244 m 3252 w 3252 m 3256 w 3256 m 3258 w 3258 m 3271 w 3271 m 3291 w 3291 m 3376 w 3376 m 3697 w 3697 m 3946 w 3946 m 3949 w | 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 | L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L H H L L L | GGT AAG CTA CAT AAA CTG GGT AAG CTA TAT AAA CTG TGA AAT CTC CTA AGT GT TGA AAT CTT CTA AGT GT AGA AAC CGA CCT GG AGA AAC CCA CCT GG ACC GGG CTC TGC CAT ACC GGG CCC TGC CA ACC GGG CTC TGC CAT ACC GGG TTC TGC CA TTA TGC GAT TAC CG TTA TGC GAC TAC CG GTT TTA TGC GAT TAC C GTT TTA TAC GAT TAC CG GTT TTA TGC GAT TAC C AGT TTT GTG CGA TTA C CTG ACT GTA AAG TTT TAA G GAC TGT AAG GTT TTA AGT GAA GAG GAA TTG AAC C AGA AGA GGG ATT GAA C TTC GTT CGG TAA GC TTT CGT TTG GTA AGC CCT GAT CGG CGC AC CCT GAT CAG CGC AC GGC GTA TTC GAT GTT GCG TAT TTG ATG TTG GGC GTA TTC GAT GTT |
| 8363 w 8363 m 8431 w 8431 m 12147 w 12147 m | 57 58 59 60 61 62 | L L L L H H | GGC ATT TCA CTG TAA GGG CAT TTT ACT GT GGT GAT GAG GAA TAG T GGG TGA TAA GGA ATA G GTA AAT ATA GTT TAA CCA A GTA AAT ATA ATT TAA CCA A |
探针名称’栏中的数字代表mtDNA突变位点，w代表野生型探针，m代表突变型探针；‘编号’栏中的数字1-44为MELAS探针，45-62为MERRF探针；‘所在链’栏中，H表示探针位于mtDNA分子重链上，L表示探针位于mtDNA分子轻链上；‘序列栏’每个探针序列中部或中部附近的下画线指示突变位点所在部位。
(2)芯片的制备：
点样液：为Micro-Spotting Solution(2×)，购自TeleChem Internation公司，室温保存。
探针由Takara公司负责合成，用去离子水将探针稀释，并与点样液等体积混合，使探针终浓度为12.5uM，通过Cartesian Tech.，PROSYS 5510A芯片制作系统点阵于醛基修饰的载玻片表面，置于70％的相对湿度、室温条件下48-72小时进行固定。取出后于沸水浴中30秒，空气中充分干燥，4℃保存，即制成了具有62条探针的线粒体病MELAS和MERRF综合征相关mtDNA突变位点集成检测基因芯片，见图1。
实施例2 芯片检测条件的摸索与优化
靶分子与在片寡核苷酸探针的杂交效率和热稳定性与探针的序列和反应条件的严格控制有很大关系。比如探针序列的长度，G+C含量，Tm值；探针和靶分子的浓度，间隔臂的长度，杂交与洗涤的温度、时间、pH及盐离子浓度等。本发明重点对探针的点样浓度、探针的包被时间、杂交温度和时间、及洗脱条件(包括洗脱缓冲液的浓度、洗脱温度和洗脱时间)等方面进行了摸索和优化，现叙述如下：
芯片的制备：
杂交液：为DIG Easy Hyb，购自Roche公司
a.探针浓度的优化
选择MERRF相关mtDNA比较有代表性且较常见的突变位点T8344C的野生型探针(SEQ IDNO.51)作为芯片的探针，用去离子水将探针稀释，并与点样液(TeleChem Internation) 等体积混合，使探针终浓度为0-50uM，通过Cartesian Tech.，PROSYS 5510A芯片制作系统点阵于醛基修饰的载玻片表面，在同一张芯片上用不同浓度的探针分别点上20个点，置于70％的相对湿度、室温条件下48小时进行固定。取出后于沸水浴中30秒，空气中充分干燥，4℃保存。
取5ul PCR产物(引物为SEQ ID NO.67和68，DNA模板为健康人N1)与10ul杂交液混合点于芯片上，37℃杂交30min，30℃2xSSC+0.1％SDS洗10min，0.2xSSC+0.1％SDS洗5min，用激光共聚集扫描仪(GenePix 4000B，Axon Instruments，Inc.)在635nm处扫描上述杂交芯片；通过圈点过滤背景信号，提取各点平均荧光信号强度值。制作探针浓度与荧光强度的坐标图(图2)。
结果表明，探针浓度在12.5uM时可以获得最佳的探针浓度与荧光强度比。
b.包被时间的优化
选择MERRF相关mtDNA比较有代表性且较常见的突变位点T8344C的野生型和突变型探针(SEQ ID NO.51和52)来作为芯片的探针，探针点样浓度为12.5uM。通过Cartesian Tech.，PROSYS 5510A芯片制作系统点阵于醛基修饰的载玻片表面，每张芯片上每种探针分别点上20个点，置于70％的相对湿度、室温条件下分别固定不同的时间。取出后于沸水浴中30秒，空气中充分干燥，4℃保存。
取5ul PCR产物(引物为SEQ ID NO.67和68，DNA模板为健康人N1)与10ul杂交液混合，95℃变性10分钟，后立即冰浴3～5分钟。将混合液点于芯片上，37℃杂交30min，30℃2xSSC+0.1％SDS洗10min，0.2xSSC+0.1％SDS洗5min，用激光共聚集扫描仪(GenePix4000B，Axon Instruments，Inc.)在635nm处扫描上述杂交芯片；通过圈点过滤背景信号，提取各点平均荧光信号强度值。制作包被时间与荧光强度的坐标图(图3)。
结果表明，点样好的芯片置于70％湿度下固定时间以48小时最好，时间过短或过长都会导致荧光强度的降低。
c.杂交温度和时间的优化
选择MERRF相关mtDNA比较有代表性且较常见的突变位点T8344C的野生型和突变型探针(SEQ ID NO.51和52)来作为芯片的探针，探针点样浓度为12.5uM。通过Cartesian Tech.，PROSYS 5510A芯片制作系统点阵于醛基修饰的载玻片表面，每张芯片上每种探针分别点上20个点，置于70％的相对湿度、室温条件下48小时进行固定。取出后于沸水浴中30秒，空气中充分干燥，4℃保存。
取5ul PCR产物(引物为SEQ ID NO.67和68，DNA模板为健康人N1)与10ul杂交液 混合点于芯片上，不同温度下分别杂交30min，30℃ 2xSSC+0.1％SDS洗10min，0.2xSSC+0.1％SDS洗5min，用激光共聚集扫描仪(GenePix 4000B，AxonInstruments，Inc.)在635nm处扫描上述杂交芯片；通过圈点过滤背景信号，提取各点平均荧光信号强度值。制作杂交温度与荧光强度的坐标图(图4)。
取5ul PCR产物(引物为SEQ ID NO.67和68，DNA模板为健康人N1)与10ul杂交液混合点于芯片上，37℃杂交不同的时间，30℃2xSSC+0.1％SDS洗10min，0.2xSSC+0.1％SDS洗5min，用激光共聚集扫描仪(GenePix 4000B，Axon Instruments，Inc.)在635nm处扫描上述杂交芯片；通过圈点过滤背景信号，提取各点平均荧光信号强度值。制作杂交时间与荧光强度的坐标图(图5)。
结果表明，在35-40℃杂交30-60分钟的情况下，可以获得较高的野生型与突变型比，更易于分辨特异性的杂交信号。
d.洗脱条件的优化
选择MERRF相关mtDNA比较有代表性且较常见的突变位点T8344C的野生型和突变型探针(SEQ ID NO.51和52)来作为芯片的探针，探针点样浓度为12.5uM。通过Cartesian Tech.，PROSYS 5510A芯片制作系统点阵于醛基修饰的载玻片表面，每张芯片上每种探针分别点上20个点，置于70％的相对湿度、室温条件下48小时进行固定。取出后于沸水浴中30秒，空气中充分干燥，4℃保存。
取5ul PCR产物(引物为SEQ ID NO.67和68，DNA模板为健康人N1)与10ul杂交液混合点于芯片上，37℃杂交30min，30℃2xSSC+0.1％SDS洗10min，再用不同浓度的二次洗液洗5min，用激光共聚集扫描仪(GenePix 4000B，Axon Instruments，Inc.)在635nm处扫描上述杂交芯片；通过圈点过滤背景信号，提取各点平均荧光信号强度值。制作二次洗脱缓冲液浓度与荧光强度的坐标图(图6)。结果表明，随着SSC浓度的增加，荧光强度也增强，但是同时也降低了芯片信号的特异性，因此，选取了两者综合指数均较高的0.2xSSC+0.1％xSDS溶液作为二次洗涤的缓冲液。
取5ul PCR产物(引物为SEQ ID NO.67和68，DNA模板为健康人N1)与10ul杂交液混合点于芯片上，37℃杂交30min，不同温度下2xSSC+0.1％SDS洗10min，0.2xSSC+0.1％SDS洗5min，用激光共聚集扫描仪(GenePix 4000B，Axon Instruments，Inc.)在635nm处扫描上述杂交芯片；通过圈点过滤背景信号，提取各点平均荧光信号强度值。制作洗脱温度与荧光强度的坐标图(图7)。
取5ul PCR产物(引物为SEQ ID NO.67和68，DNA模板为健康人N1)与10ul杂交液 混合点于芯片上，37℃杂交30min，30℃2xSSC+0.1％SDS洗10min，0.2xSSC+0.1％SDS洗不同的时间，用激光共聚集扫描仪(GenePix 4000B，Axon Instruments，Inc.)在635nm处扫描上述杂交芯片；通过圈点过滤背景信号，提取各点平均荧光信号强度值。制作洗脱时间与荧光强度的坐标图(图8)。
结果表明，30℃下，2xSSC+0.1％SDS洗10min，0.2xSSC+0.1％SDS洗5min是较佳的洗脱条件，因为在这个条件下我们可以在保证有较高信号强度的同时，更完全地洗脱掉非特异结合的靶分子。
实施例3 重复性实验
芯片灵敏度实验：选择MERRF相关mtDNA比较有代表性且较常见的突变位点T8344C的野生型和突变型探针(SEQ ID NO.51和52)来作为芯片重复性实验的探针，探针点样浓度为12.5uM。通过Cartesian Tech.，PROSYS 5510A芯片制作系统点阵于醛基修饰的载玻片表面，每张芯片上每种探针分别点上20个点，置于70％的相对湿度、室温条件下48小时进行固定。取出后于沸水浴中30秒，空气中充分干燥，4℃保存。
以五天中的同一时间，取5ul相同浓度的PCR产物(引物为SEQ ID NO.67和68，DNA模板为健康人N1)与10ul杂交液混合点于芯片上，37℃杂交30min，30℃2xSSC+0.1％SDS洗10min，0.2xSSC+0.1％SDS洗5min，用激光共聚集扫描仪(GenePix 4000B，AxonInstruments，Inc.)在635nm处扫描上述杂交芯片；通过圈点过滤背景信号，提取各点平均荧光信号强度值。制作不同天数与荧光强度的坐标图(图9)。结果表明，同一批次点样芯片在五天内杂交，结果差异不明显，重复性较好，可以满足MERRF和MELAS相关mtDNA突变体检测芯片的要求。
实施例4 灵敏度实验
芯片灵敏度实验：选择MERRF相关mtDNA比较有代表性且较常见的突变位点T8344C的野生型探针(SEQ ID NO.51)来作为芯片灵敏度实验的探针，探针点样浓度为12.5uM。通过Cartesian Tech.，PROSYS 5510A芯片制作系统点阵于醛基修饰的载玻片表面，每张芯片点上20个点，置于70％的相对湿度、室温条件下48小时进行固定。取出后于沸水浴中30秒，空气中充分干燥，4℃保存。
取5ul不同浓度的PCR产物(引物为SEQ ID NO.67和68，DNA模板为健康人N1)与10ul杂交液混合点于芯片上，37℃杂交30min，30℃2xSSC+0.1％SDS洗10min，0.2xSSC+0.1％SDS洗 5min，用激光共聚集扫描仪(GenePix 4000B，Axon Instruments，Inc.)在635nm处扫描上述杂交芯片；通过圈点过滤背景信号，提取各点平均荧光信号强度值。制作靶分子量与荧光强度的坐标图(图10a)。
电泳灵敏度实验：取5ul不同浓度的PCR产物分别与1ul的6xloading buffer混合，用2％琼脂糖凝胶电泳，得到电泳图谱(图10b)，并利用凝胶成像系统的分析软件计算出图1b中各条带的灰度值，制作靶分子量与荧光强度的坐标图(图10c)。
结果表明，芯片的灵敏度在0.11ng，为pg级；琼脂糖电泳的灵敏度在2.84ng，为ng级。芯片检测比电泳检测具有更高的灵敏度。
实施例5 样本的突变检测
1.样本来源：
健康对照(外周静脉血)20例：来自于安徽医科大学在校学生，体检无相关线粒体DNA疾病病史；
MELAS和MERRF患者(肌肉活体组织或外周静脉血)11例：其中，6例为MELAS-mt-A3243G异质性突变体，4例为MERRF-mt-A8344G均质性突变体，1例为MERRF-mt-T8356C异质性突变体，均由安徽医科大学第一附属医院神经内科提供。
2.样本的处理和标记：
将上述组织标本(肌肉活体组织或外周血)用Qiagen公司DNA抽提试剂盒提取线粒体DNA，备用。
样本的PCR扩增和标记处理：通过两组多重不对称PCR来扩增9条靶基因(目的DNA片段)，这9条靶基因涵盖与MELAS和MERRF综合征相关的31个mtDNA突变位点，引物由Takara公司合成，其中，12条引物的5’端用cy5荧光分子标记，6条引物为普通引物。PCR引物如下所列：
| 第一组多重不对称PCR引物： | 序列编号SEQ ID NO. | |
| 名称 | 序列 | |
| P1-F | 5’-Cy5-TTG GCG GTA TGC ACT TTT AAC-3’ | 63 |
| P1-R | 5’-TGT TTA TGG GGT GAT GTG AGC-3’ | 64 |
| P2-F | 5’-Cy5-CAG CCG CTA TTA AAG GTT CGT-3’ | 65 |
| P2-R | 5’-Cy5-TGG CAG GAG TAA TCA GAG GTG-3’ | 66 |
| P3-F | 5’-Cy5-CTG AAA TCT GTG GAG CAA ACC-3’ | 67 |
| P3-R | 5’-GCA ATG AAT GAA GCG AAC AG-3’ | 68 |
| P4-F | 5’-TCT TCA ATC AGC CAC ATA GCC-3’ | 69 |
| P4-R | 5’-Cy5-TCT CGG TAA ATA AGG GGT CGT-3’ | 70 |
| P5-F | 5’-Cy5-ACC AAT CCT ACC TCC ATC G-3’ | 71 |
| P5-R | 5’-CCA AGG AGT GAG CCG AAG T-3’ | 72 |
| 第二组多重不对称PCR引物： | ||
| 名称 | 序列 | |
| P6-F | 5’-Cy5-AGT CGT AAC ATG GTA AGT G-3’ | 73 |
| P6-R | 5’-GTT GTC TGG TAG TAA GGT G-3’ | 74 |
| P7-F | 5’-Cy5-TCA TCT TCC TAA TTA CCA T-3’ | 75 |
| P7-R | 5’-Cy5-AGA ATT ATT CGA GTG CTA T-3’ | 76 |
| P8-F | 5’-Cy5-ACT AAT AAG TGG CTC CTT T-3’ | 77 |
| P8-R | 5’-Cy5-ATG GTA GAG TAG ATG ACG G-3’ | 78 |
| P9-F | 5’-Cy5-CAC TTT ACA TCC AAA CAT C-3’ | 79 |
| P9-R | 5’-GTT GTG GTA GTC AAA ATG T-3’ | 80 |
注：F表示正向引物，R表示反向引物；Cy5表示一种荧光分子。
其中第一组为一个五重不对称PCR，在25ul PCR反应体系中(扩增体系包括2.5ul10*PCR buffer，各200uM的dATP、dGTP、dCTP、dTTP，1.5mM MgCl2，1.5U DNA TagE(Takara)，和介于0.04-0.4uM之间不等的引物P1F、P1R、P2F、P2R、P3F、P3R、P4F、P4R、P5F、P5R)，加入100-300ng样本DNA，通过以下热循环过程制备5条荧光标记的样本DNA目的片段：首先在94℃变性5min，以94℃，35s，61℃，45s，72℃，2min循环40次，最后在72℃延伸10min。
第二组为一个四重不对称PCR，在25ul PCR反应体系中(扩增体系包括2.5ul 10*PCRbuffer，各200uM dATP、dGTP、dCTP、dTTP，1.5mM MgCl2，1.5U DNA TagE(Takara)，和介于0.04-0.4uM之间不等的引物P6F、P6R、P7F、P7R、P8F、P8R、P9F、P9R、P10F、P10R)，加入100-300ng同一样本DNA，通过以下热循环过程制备5条荧光标记的样本DNA目的片段： 首先在94℃变性5min，以94℃，35s，50℃，45s，72℃，2min循环40次，最后在72℃延伸10min。
通过2％琼脂糖凝胶电泳得到健康对照或患者样本DNA的多重不对称PCR电泳图谱(图11)。从图11可以看出，PCR产物所对应的条带均清晰可辨，无非特异性扩增产生。
3.PCR产物序列测定：
样本DNA PCR产物送与上海基康生物技术有限公司(GeneCore)进行测序。
4.芯片检测
取同一样本经两组多重不对称PCR扩增并标记的目的DNA片段溶液等体积混匀，取7ul靶基因混合液与等体积杂交液(DIG Easy Hyb，Roche)混匀，95℃变性10min，迅速冰浴3-5min，然后取10ul杂交混合液滴于用实施例1制备的线粒体病MELAS和MERRF综合征相关mtDNA突变位点集成检测基因芯片表面的点阵区域，盖上盖玻片，置于37℃湿盒中杂交45min，然后30℃于洗液1(2×SSC，0.1％SDS)中荡洗10min，再于洗液2(0.2×SSC，0.1％SDS)中荡洗5min，氮气吹干。用激光共聚集扫描仪(GenePix 4000B，AxonInstruments，Inc.)在635nm处扫描上述第(3)步杂交芯片，扫描强度设为700(最大为920)；通过圈点过滤背景信号，提取各点平均荧光信号强度值。配合其配套软件分析，最终获得芯片检测结果。以诊断比值(野生型探针信号强度平均值与相应位点突变型探针信号强度平均值的比值)作为分析突变是否存在的标准，如果诊断比值在3以上为野生型，在0.3以下为均质性突变，介于0.3和3之间为异质性突变。(比值衡量标准参考Du W，Marsac C，Kruschina M，Ortigao F，Florentz C.Functionalized self-assembledmonolayer on gold for detection of human mitochondrial tRNA gene mutations.AnalBiochem，2003，322(1)：14-25获得)
用实施例1制备的线粒体病MELAS和MERRF综合征相关mtDNA突变位点集成检测基因芯片分别对各样本按上述方法进行检测：20份健康对照所有位点诊断比值均大于3；11例含MELAS/MERRF相关mtDNA突变位点的患者发生突变的位点处诊断比值＜3(其中均质性突变诊断比值＜0.3，异质性突变诊断比值介于0.3和3之间)，正常位点诊断比值大于3。芯片检测结果与PCR产物测序结果符合率为100％。
1例健康对照和3例患者样本的芯片扫描图示例如图12，野生型与相应突变体的测序结果如图13所示，对应位点的芯片诊断比值如下表所列：
| mtDNA突变位点 | N1(w/m) | P1(w/m) | P2(w/m) | P3(w/m) |
| 583(G＞A) | 16.2 | 100 | 238 | 54.2 |
| 1642(G＞A) | 66.4 | 42.8 | 61.2 | 123 |
| 3093(C＞G) | 28.7 | 67.0 | 71.5 | 50.8 |
| 3243(A＞G) | 22.0 | 0.557 | 12.4 | 13.4 |
| 3244(G＞A) | 39.6 | 57.5 | 94.8 | 32.9 |
| 3251(A＞G) | 36.7 | 49.7 | 179 | 51.4 |
| 3256(C＞T) | 12.8 | 22.1 | 13.5 | 26.0 |
| 3258(T＞C) | 18.0 | 24.3 | 27.3 | 27.0 |
| 3271(T＞C) | 17.1 | 33.5 | 31.9 | 34.9 |
| 3291(T＞C) | 12.2 | 28.6 | 27.8 | 24.0 |
| 3376(G＞A) | 11.1 | 29.0 | 27.4 | 36.2 |
| 3697(G＞A) | 22.5 | 217 | 47.5 | 57.5 |
| 3946(G＞A) | 5.91 | 23.2 | 10.6 | 16.3 |
| 3949(T＞C) | 7.93 | 21.6 | 16.1 | 16.8 |
| 4332(G＞A) | 10.1 | 38.8 | 53.2 | 52.7 |
| 9957(T＞C) | 28.6 | 55.5 | 72.1 | 65.2 |
| 12770(A＞G) | 42.3 | 46.5 | 78.5 | 42.7 |
| 13045(A＞C) | 18.0 | 10.3 | 26.2 | 21.8 |
| 13084(A＞T) | 29.0 | 9.03 | 30.2 | 23.9 |
| 13513(G＞A) | 46.5 | 40.8 | 54.9 | 51.8 |
| 13514(A＞G) | 28.1 | 29.7 | 34.8 | 27.4 |
| 14453(G＞A) | 29.1 | 35.8 | 43.0 | 27.4 |
| 611(G＞A) | 10.7 | 44.2 | 44.6 | 32.4 |
| 3255(G＞A) | 72.9 | 111 | 91.3 | 63.6 |
| 8296(A＞G) | 832 | 331 | 424 | 172 |
| 8344(A＞G) | 13.8 | 27.7 | 0.045 | 34.0 |
| 8356(T＞C) | 95.9 | 82.6 | 201 | 1.27 |
| 8361(G＞A) | 24.7 | 23.3 | 44.2 | 33.4 |
| 8363(G＞A) | 17.2 | 15.3 | 25.5 | 13.2 |
| 8431(A＞T) | 10.9 | 11.6 | 27.7 | 5.28 |
| 12147(G＞A) | 30.1 | 55.9 | 71.7 | 54.4 |
w/m指野生型探针荧光信号强度平均值与相应位点突变型探针荧光信号强度平均值的比值
结果表明：芯片的检测结果与DNA测序结果很好地吻合，本发明的芯片可以用于高效地检测线粒体病MELAS和MERRF综合征相关mtDNA突变位点。
序列表
<110>安徽医科大学
中国科学院上海微系统与信息技术研究所
<120>线粒体病MELAS和MERRF综合征相关mtDNA突变位点检测基因芯片及检测方法
<130>PCNWX071126
<160>80
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>18
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>探针
<400>1
ggtaagctac ataaactg 18
<210>2
<211>18
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>探针
<400>2
ggtaagctat ataaactg 18
<210>3
<211>17
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>探针
<400>3
tgaaatctcc taagtgt 17
<210>4
<211>17
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>探针
<400>4
tgaaatcttc taagtgt 17
<210>5
<211>14
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>探针
<400>5
agaaaccgac ctgg 14
<210>6
<211>14
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>探针
<400>6
agaaacccac ctgg 14
<210>7
<211>15
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>探针
<400>7
accgggctct gccat 15
<210>8
<211>14
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>探针
<400>8
accgggccct gcca 14
<210>9
<211>15
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>探针
<400>9
accgggctct gccat 15
<210>10
<211>14
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>探针
<400>10
accgggttct gcca 14
<210>11
<211>14
<212>DNA
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<220>
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<400>11
ttatgcgatt accg 14
<210>12
<211>14
<212>DNA
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<220>
<223>探针
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ttatgcgact accg 14
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<211>16
<212>DNA
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<220>
<223>探针
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gttttatgcg attacc 16
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<211>17
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>探针
<400>14
gttttatacg attaccg 17
<210>15
<211>16
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>探针
<400>15
gttttatgcg attacc 16
<210>16
<211>16
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
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<400>16
agttttgtgc gattac 16
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<211>19
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>探针
<400>17
ctgactgtaa agttttaag 19
<210>18
<211>18
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>探针
<400>18
gactgtaagg ttttaagt 18
<210>19
<211>16
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>探针
<400>19
gaagaggaat tgaacc 16
<210>20
<211>16
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>探针
<400>20
agaagaggga ttgaac 16
<210>21
<211>14
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>探针
<400>21
ttcgttcggt aagc 14
<210>22
<211>15
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>探针
<400>22
tttcgtttgg taagc 15
<210>23
<211>14
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>探针
<400>23
cctgatcggc gcac 14
<210>24
<211>14
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>探针
<400>24
cctgatcagc gcac 14
<210>25
<211>15
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>探针
<400>25
ggcgtattcg atgtt 15
<210>26
<211>15
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>探针
<400>26
gcgtatttga tgttg 15
<210>27
<211>15
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>探针
<400>27
ggcgtattcg atgtt 15
<210>28
<211>14
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>探针
<400>28
ggcgtgttcg atgt 14
<210>29
<211>19
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>探针
<400>29
ttatttctag gactatgag 19
<210>30
<211>19
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>探针
<400>30
ttatttctaa gactatgag 19
<210>31
<211>18
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>探针
<400>31
catacagaaa tagtcaaa 18
<210>32
<211>18
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>探针
<400>32
catacagaag tagtcaaa 18
<210>33
<211>14
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>探针
<400>33
ctacgccctc tcag 14
<210>34
<211>14
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>探针
<400>34
ctacgccccc tcag 14
<210>35
<211>15
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>探针
<400>35
cttctatggc tgagg 15
<210>36
<211>14
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>探针
<400>36
ccttctaggg ctga 14
<210>37
<211>17
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>探针
<400>37
tatagtgctt gagtgga 17
<210>38
<211>17
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>探针
<400>38
tatagtgcat gagtgga 17
<210>39
<211>16
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>探针
<400>39
ctccaaagac cacatc 16
<210>40
<211>15
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>探针
<400>40
ctccaaaaac cacat 15
<210>41
<211>16
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>探针
<400>41
ctccaaagac cacatc 16
<210>42
<211>15
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>探针
<400>42
tccaaaggcc acatc 15
<210>43
<211>14
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>探针
<400>43
gcgatggcta ttga 14
<210>44
<211>14
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>探针
<400>44
gcgatggtta ttga 14
<210>45
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>探针
<400>45
aaacattttc agtgtattgc 20
<210>46
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>探针
<400>46
taaacatttt tagtgtattg 20
<210>47
<211>16
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>探针
<400>47
gttttatgcg attacc 16
<210>48
<211>16
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>探针
<400>48
ttttatgtga ttaccg 16
<210>49
<211>15
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>探针
<400>49
ttacagtggg ctcta 15
<210>50
<211>14
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>探针
<400>50
tttacagcgg gctc 14
<210>51
<211>15
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>探针
<400>51
ggtgttggtt ctctt 15
<210>52
<211>14
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>探针
<400>52
ggtgttggct ctct 14
<210>53
<211>16
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>探针
<400>53
ttcactgtaa agaggt 16
<210>54
<211>16
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>探针
<400>54
tttcactgta gagagg 16
<210> 55
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> 探针
<400> 55
ggcatttcac tgtaa 15
<210> 56
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> 探针
<400> 56
ggcatttcat tgtaa 15
<210>57
<211>15
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>探针
<400>57
ggcatttcac tgtaa 15
<210>58
<211>14
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>探针
<400>58
gggcatttta ctgt 14
<210>59
<211>16
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>探针
<400>59
ggtgatgagg aatagt 16
<210>60
<211>16
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>探针
<400>60
gggtgataag gaatag 16
<210>61
<211>19
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>探针
<400>61
gtaaatatag tttaaccaa 19
<210>62
<211>19
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>探针
<400>62
gtaaatataa tttaaccaa 19
<210>63
<211>21
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>引物
<400>63
ttggcggtat gcacttttaa c 21
<210>64
<211>21
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>引物
<400>64
tgtttatggg gtgatgtgag c 21
<210>65
<211>21
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>引物
<400>65
cagccgctat taaaggttcg t 21
<210>66
<211>21
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>引物
<400>66
tggcaggagt aatcagaggt g 21
<210>67
<211>21
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>引物
<400>67
ctgaaatctg tggagcaaac c 21
<210>68
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>引物
<400>68
gcaatgaatg aagcgaacag 20
<210>69
<211>21
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>引物
<400>69
tcttcaatca gccacatagc c 21
<210>70
<211>21
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>引物
<400>70
tctcggtaaa taaggggtcg t 21
<210>71
<211>19
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>引物
<400>71
accaatccta cctccatcg 19
<210>72
<211>19
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>引物
<400>72
ccaaggagtg agccgaagt 19
<210>73
<211>19
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>引物
<400>73
agtcgtaaca tggtaagtg 19
<210>74
<211>19
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>引物
<400>74
gttgtctggt agtaaggtg 19
<210>75
<211>19
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>引物
<400>75
tcatcttcct aattaccat 19
<210>76
<211>19
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>引物
<400>76
agaattattc gagtgctat 19
<210>77
<211>19
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>引物
<400>77
actaataagt ggctccttt 19
<210>78
<211>19
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>引物
<400>78
atggtagagt agatgacgg 19
<210>79
<211>19
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>引物
<400>79
cactttacat ccaaacatc 19
<210>80
<211>19
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>引物
<400>80
gttgtggtag tcaaaatgt 19
Claims (7)
1.一种人类线粒体病MELAS和MERRF综合征相关的mtDNA突变位点检测基因芯片，其特征在于，在基因芯片载体表面点阵固定有序列为SEQ ID NO.1～44的寡核苷酸探针和序列为SEQ ID NO.45～62的寡核苷酸探针。
2.如权利要求1所述人类线粒体病MELAS和MERRF综合征相关的mtDNA突变位点检测基因芯片，其特征在于，所述寡核苷酸探针的5’端有氨基修饰基团，且寡核苷酸探针5’端有一段15聚的Poly T。
3.如权利要求1-2中任一权利要求所述人类线粒体病MELAS和MERRF综合征相关的mtDNA突变位点检测基因芯片，其特征在于，所述基因芯片载体为载玻片。
4.如权利要求3所述人类线粒体病MELAS和MERRF综合征相关的mtDNA突变位点检测基因芯片，其特征在于，所述基因芯片载体为醛基修饰的载玻片。
5.一种权利要求1～4中任一权利要求所述人类线粒体病MELAS和MERRF综合征相关的mtDNA突变位点检测基因芯片的制备方法，包括下列步骤：
将序列为SEQ ID NO.1～62的寡核苷酸探针5’端加上一段15聚的Poly T，并对5’端进行氨基修饰，用去离子水将各探针分别稀释，并分别与点样液等体积混合，获得终浓度为12.5～50uM的寡核苷酸探针溶液，采用常规的方法将寡核苷酸探针溶液与阴性对照和阳性对照一起点阵于载玻片表面，并固定。
6.如权利要求5所述人类线粒体病MELAS和MERRF综合征相关的mtDNA突变位点检测基因芯片的制备方法，其特征在于，所述固定的条件为将点样好的芯片置于70％湿度下固定48-72小时。
7.如权利要求5所述人类线粒体病MELAS和MERRF综合征相关的mtDNA突变位点检测基因芯片的制备方法，其特征在于，所述载玻片表面点样有序列为SEQ ID NO.1～44的寡核苷酸探针和序列为SEQ ID NO.45～62的寡核苷酸探针。
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