CN101487044B - Hla-dqb1基因分型dna微阵列芯片试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种临床检测用途的基因检测试剂盒，尤其是涉及DNA微阵列芯片检测试剂盒，该试剂盒能够高通量、高效率、高特异性对人类白细胞抗原DQB1(HLA-DQB1)基因进行分型检测。
Description
所属技术领域
本发明涉及一种临床检测用途的基因检测试剂盒，尤其是涉及DNA微阵列芯片试剂盒，该试剂盒能够高通量、高效率、高特异性对人类白细胞抗原DQB1(HLA-DQB1)基因进行分型检测。
背景技术
HLA(Human leukocyte antigen，人类白细胞抗原)是人类主要组织相容性系统。组织相容性是指不同个体间进行组织或器官移植时，供者和受者双方接受的程度。供受者组织不相容引起的反应，被证实是一种免疫反应，它是由细胞表面同种异型抗原诱导的，这个代表个体特异性的抗原称移植抗原或组织相容性抗原，其中起主要作用的抗原称主要组织相容性系统(MHS)，HLA(人类白细胞抗原)就是人类的主要组织相容性系统。HLA基因复合体位于人类第6号染色体6p21.3区域，具有高度单核苷酸多态性(SNPs)。HLA存在多个基因座位，每个基因座位有可以分为多种型别、亚型和等位基因。
HLA的生物学和医学意义包括免疫学反应、器官移植排除反应和疾病关联性等等。在疾病关联性方面，研究发现HLA-DQB1的某些亚型与多种疾病存在密切的关联性，HLA-DQB1*0602的基因频率在Graves病合并2型糖尿病患者组中较健康对照组明显增加，有很强的相关性，是Graves病合并2型糖尿病患者的易感基因；DQB1*020x等位基因频率在I型银屑病患者中显著增高，DQB1*020x等位基因与银屑病的家族遗传史及早发型银屑病相关；DQB1*03032和DQB1*0602型儿童，幽门螺杆菌感染发展为慢性胃炎概率显著低于其它基因型别，提示遗传保护因素的作用；DQB1*0602基因为中国发作性睡病人群的易感基因，DQB1*0401-0402基因为中国发作性睡病人群的保护基因，等等。
HLA-DQB1基因分型方法是从90年代开始发展起来的，目前主要包括PCR-SSP(PCR-序列特异性引物法)、PCR-SSOP(PCR-序列特异性寡核苷酸探针法)、SBT(测序法)、FCM(流式法)方法。这些方法目前被西方国家的少数企业垄断，我国处于空白状态，完全依赖进口。同时，这些方法也存在一些技术问题，比如引物过多造成检测错误、探针杂交单一温度造成特异性降低、检测通量过小等等。
DNA微阵列法是近几年发展起来的新型基因分型法，相比其它分型方法，具有高通量、集约化、低成本、高准确性等特点，是融微电子学、生物学、物理学、化学、计算机科学为一体的高度交叉的新技术，具有重大的基础研究价值，又具有明显的产业化前景。由于该技术可以将极其大量的探针同时固定于支持物上，所以一次可以对大量的生物分子进行检测分析，从而解决了传统核酸印迹杂交技术复杂、自动化程度低、检测目的分子数量少、低通量等不足。而且，通过设计不同的探针阵列、使用特定的分析方法可使该技术具有多种不同的应用价值，如基因表达谱测定、突变检测、多态性分析、基因组文库作图及杂交测序(Sequencing by hybridization，SBH)等，为“后基因组计划”时期基因功能研究及现代医学科学、医学诊断学的发展提供了强有力的工具。
本发明解决了我国目前HLA-DQB1*分型检测试剂依赖进口以及目前检测方法上的弊端，具有技术和价格双重优势，实际应用以后会产生经济和社会双重效益。
发明内容
本发明的目的是将DNA微阵列技术应用于HLA-DRQ1基因座位的基因分型检测，开发了一种新型的基因分型检测试剂盒。
本发明所采用的技术方案是：针对HLA-DRQ1座位的第二外显子，设计一套特异性寡核苷酸探针(表1)，采用自动点样机器人，将探针印制在一张玻片的特定区域，每张玻片印制10个微阵列矩阵，这样就制成DNA微阵列芯片，一张芯片可以检测10个样本，再配以其它必要的组份，如PCR引物(表2)，组成完整的试剂盒。实际检测时，取10份人基因组DNA溶液，采用CY3标记引物和不对称PCR方法，扩增出人基因组HLA-DRQ1基因的第二外显子单链CY3标记片段。取DNA微阵列芯片一张，在10个杂交区分别加入10种PCR产物2ul和杂交液8ul。将芯片放在自动杂交洗涤仪的杂交槽内，杂交温度设定为52℃，杂交时间30分钟，自动洗涤吹干。取出玻片，放入GenePix 4100A扫描仪进行扫描，使用分析软件对扫描图像信号进行图像数据转换处理，经过分析产生样本基因型别结果。
本试剂盒采用DNA微阵列技术，可以大大提高检测通量，每张玻片可以制备用于检测10个样本的DNA微阵列，是现有一般检测技术的10倍以上。本发明可用于HLA-DQB1基因分型检测以及相关联疾病的筛查和辅助诊断。
表1寡核苷酸探针序列
| 名称 | 序列(5’-3’) | 碱基数 |
| Q1Q2Q3Q4Q5 | AACGGGACAGAGCGCGTGCGTGCGGGGTGTGACTGCGTCTTGTAACCAGAGCGTGCGTCTTGTGAGCGCGTGCGTTATGTGACC | 1717171717 |
| Q6Q7Q8Q9Q10Q11Q12Q13Q14Q15Q16Q17Q18QNQP | GAGTACGCACGCTTCGAGAGTACGCGCGCTTCGACTGTACCGCGCGGTGACGCGGTGACGCCGCTGGGGCGGCCTGACGCCGAGTACGGCCTAGCGCCGAGTACTGCCTGCCGCCGAGTACGGCCTGATGCCGAGTAGGTGGCGTTCCGCGGGACGAGGTGGGGTACCGCGCGGGACCGAGCTCGTGCCGGGACCGAGCGCGTGCCGGGCGGAGTTGGACACGCTTCGACAGCGACGTGGCTTCGCCATCGACGTG | 171717171717171717171717171717 |
QN，QP分别为阴性和阳性控制探针
表2引物序列
| 名称 | 序列(5’-3’) | 碱基数 |
| P1P2-1P2-2 | GGGCCTGTGCTACTTCACCAATCTCCTCTGCAGGATCCCGCGTCGCCGCTGCAAGGTCGTGCG | 212121 |
以下结合附图说明本发明的具体实施。
附图说明
图1 HLA-DQB1基因分型DNA微阵列杂交区和探针微阵列示意图
1芯片整体外观
2杂交区以及探针微阵列
具体实施方式
本发明用下列实施例进行解释，目的只是为了解释而不是以任何方式限制本发明。
实施例一：
方法1：HLA-DQB1基因分型DNA微阵列PCR引物和寡核苷酸探针的设计和合成
为了采用特异性PCR扩增HLA-DQB1基因座位的第2外显子，分别在第2外显子两端设计特异性5’引物P1和3’引物P2-1，P2-1，P2-1，P2-1用CY3荧光标记。引物序列见表2。
针对HLA-DQB1第2外显子基因序列的多态性，设计18种分型探针，见表1。
方法2：HLA-DRQ1基因分型DNA微阵列的制备
采用基因芯片自动点样仪，将18种分型探针和两种对照探针点制到玻片的特定区域，制成DNA微阵列。
(1) 点样探针溶液：将探针稀释到5×SSC、0.05％SDS溶液中，终浓度为30uM；
(2) 点样矩阵：(如图1)将探针点制在玻片上，每个探针横向重复3点点制在杂交区内；杂交区分成10个。
实施例一：采用HLA-DQB1基因分型用DNA微阵列芯片检测样本型别
取10份已知基因型别的DNA样本，采用CY3标记的PCR引物，上下游引物1∶30(分子数比)不对称PCR方法，PCR循环参数为：94℃5’；94℃30”，58℃30”，72℃30”，40个循环；72℃5’。
取一张微阵列玻片，分别取10种PCR产物各2ul加到芯片的10孔，再在各孔加入杂交液(5×SSC)8ul，芯片放到自动杂交洗涤仪的槽内，设定杂交温度52℃，杂交时间40分钟。杂交后自动洗涤和风干。
采用GnenPix4100A扫描仪，扫描杂交信号，得到杂交结果扫描图，并将图像转换成数据。
采用分析软件，将以上数据自动分析转换成为各个样本的基因型别，检测结果与样本原基因型别完全相符。见表3。
表3 本次检测结果与样本原有基因型别的比较
| 样本编号 | 原基因型别(HLA-DRQ1*) | 本次试验结果(HLA-DRQ1*) | 是否相符 |
| 0102030405 | 0301，060202，030202，04030604，03030602，0302 | 0301，060202，030202，04030604，03030602，0302 | 是是是是是 |
| 0607080910 | 0401，050301，030205，030306，0202，06 | 0401，050301，030205，030306，0202，06 | 是是是是是 |
实施例说明了本发明产品在检测通量方面的优势(一次检测10个样本)和检测准确性方面的可靠性(检测结果与原样本结果完全相符)。
序列表
<110>中山人学达安基因股份有限公司
<120>HLA-DQB1基因分型DNA微阵列芯片试剂盒
<140>
<141>
<160>23
<210>1
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作芯片杂交反应探针。
<400>1
AACGGGACAGAGCGCGT
<210>2
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作芯片杂交反应探针。
<400>2
GCGTGCGGGGTGTGAC
<210>3
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作芯片杂交反应探针。
<400>3
TGCGTCTTGTAACCAGA
<210>4
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作芯片杂交反应探针。
<400>4
GCGTGCGTCTTGTGAGC
<210>5
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作芯片杂交反应探针。
<400>5
GCGTGCGTTATGTGACC
<210>6
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作芯片杂交反应探针。
<400>6
GAGTACGCACGCTTCGA
<210>7
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作芯片杂交反应探针。
<400>7
GAGTACGCGCGCTTCGAC
<210>8
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作芯片杂交反应探针。
<400>8
TGTACCGCGCGGTGACG
<210>9
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作芯片杂交反应探针。
<400>9
CGGTGACGCCGCTGGGG
<210>10
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作芯片杂交反应探针。
<400>10
CGGCCTGACGCCGAGTA
<210>11
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作芯片杂交反应探针。
<400>11
CGGCCTAGCGCCGAGTA
<210>12
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作芯片杂交反应探针。
<400>12
CTGCCTGCCGCCGAGTA
<210>13
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作芯片杂交反应探针。
<400>13
CGGCCTGATGCCGAGTA
<210>14
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作芯片杂交反应探针。
<400>14
GGTGGCGTTCCGCGGGA
<210>15
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作芯片杂交反应探针。
<400>15
CGAGGTGGGGTACCGCG
<210>16
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作芯片杂交反应探针。
<400>16
CGGGACCGAGCTCGTGC
<210>17
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作芯片杂交反应探针。
<400>17
CGGGACCGAGCGCGTGC
<210>18
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作芯片杂交反应探针。
<400>18
CGGGCGGAGTTGGACAC
<210>19
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作芯片杂交反应探针。
<400>19
GCTTCGACAGCGACGTG
<210>20
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作芯片杂交反应探针。
<400>20
GCTTCGCCATCGACGTG
<210>21
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增引物。
<400>21
GGGCCTGTGCTACTTCACCAA
<210>22
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增引物。
<400>22
TCTCCTCTGCAGGATCCCGCG
<210>23
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增引物。
<400>23
TCGCCGCTGCAAGGTCGTGCG
Claims (3)
1.一种DNA微阵列芯片检测试剂盒，用于对HLA-DQB1基因进行分型检测，该试剂盒将18种寡核苷酸探针，点制在玻片上，制成DNA微阵列芯片，配以3种引物以及其它组分，其特征在于所用的寡核苷酸探针序列分别为：
Q1：5’-AACGGGACAGAGCGCGT-3’
Q2：5’-GCGTGCGGGGTGTGAC-3’
Q3：5’-TGCGTCTTGTAACCAGA-3’
Q4：5’-GCGTGCGTCTTGTGAGC-3’
Q5：5’-GCGTGCGTTATGTGACC-3’
Q6：5’-GAGTACGCACGCTTCGA-3’
Q7：5’-GAGTACGCGCGCTTCGAC-3’
Q8：5’-TGTACCGCGCGGTGACG-3’
Q9：5’-CGGTGACGCCGCTGGGG-3’
Q10：5’-CGGCCTGACGCCGAGTA-3’
Q11：5’-CGGCCTAGCGCCGAGTA-3’
Q12：5’-CTGCCTGCCGCCGAGTA-3’
Q13：5’-CGGCCTGATGCCGAGTA-3’
Q14：5’-GGTGGCGTTCCGCGGGA-3’
Q15：5’-CGAGGTGGGGTACCGCG-3’
Q16：5’-CGGGACCGAGCTCGTGC-3’
Q17：5’-CGGGACCGAGCGCGTGC-3’
Q18：5’-CGGGCGGAGTTGGACAC-3’，
3种引物序列分别为：
P1：5’-GGGCCTGTGCTACTTCACCAA-3’
P2-1：5’-TCTCCTCTGCAGGATCCCGCG-3’
P2-2：5’-TCGCCGCTGCAAGGTCGTGCG-3’。
2.根据权利要求1所述的DNA微阵列芯片检测试剂盒，其特征还在于采用18种寡核苷酸探针，点制在玻片上，制成DNA微阵列，用于与样本PCR产物的杂交反应。
3.根据权利要求1所述的DNA微阵列芯片检测试剂盒，其特征还在于试剂盒用于与HLA-DQB1基因具有关联性的疾病筛查和辅助诊断检测。
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