CN108441547A - 一种hla基因扩增、基因分型的引物组、试剂盒和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供的用于HLA基因扩增、基因分型的引物组、试剂盒和方法，属于基因检测领域。所述的用于HLA基因扩增的引物组，分别根据HLA‑A基因的8个外显子区、HLA‑B基因的8个外显子区和HLA‑DRB1基因的外显子2和外显子3设计引物，利用所述引物对所述HLA基因进行PCR扩增，得到基因片段长度大于400bp，小于1.5kb的产物；通过上述引物PCR扩增HLA基因，使得扩增产物的基因片段长度大于400bp，小于1.5kb，对模板的完整性要求降低，扩增效率高，扩增反应时间短，成本降低，可以满足大规模样本HLA基因的扩增或基因分型的需求。
Description
技术领域
本发明属于基因检测领域，具体涉及一种基于二代测序技术的HLA基 因扩增、基因分型的引物组、试剂盒和方法。
背景技术
人类白细胞抗原(human leukocyte antigen，简称HLA)，编码基因位 于6号染色体短臂上，全长约4000Kb，是目前所知人类最复杂的遗传多态 性系统，与人类的免疫系统功能密切相关。HLA又被称为移植抗原，是决 定移植排斥反应高低的重要因素。在进行器官移植时，供者和受者之间HLA 相容程度越高，排斥反应的发生率就越低，移植成功率和移植器官患者长 期存活率就越高；反之，就越容易发生排斥反应。因此，对HLA进行高效 准确的分型对器官移植至关重要。
HLA基因分成三类：I类、II类和III类基因。其中，I类包括：HLA-A、 HLA-B、HLA-C基因；II类包括：HLA-DRB1、HLA-DQA1、HLA-DQB1、 HLA-DPA1、HLA-DPB1基因。
HLA系统是目前所知人体最复杂的多态系统。自1958年发现(Jean Dausset)第一个HLA抗原，到20世纪70年代，HLA便成为免疫遗传学、 免疫生物学和生物化学等学科的一个重要新兴研究领域。现在，已基本弄 清其系统的组成、结构和功能，闸明了其理化性质和生物学作用。这些研 究成果不仅具有重要的理论意义，而且具有巨大的生物医学价值。
随着医学的发展，像白血病、地中海贫血等能用最新的基因技术进行 分型检测，再寻找合适的供体进行移植治疗。目前通过HLA高分辨分型的 外周血干细胞移植技术能大大提高配型效果，使患者的康复更快，更有保 征。
HLA分型方法包括血清学分型法、细胞学分型法以及分子生物学分型 法。随着分子生物学技术的飞速发展，传统的血清学和细胞学分型方法已 逐步被分子生物学分型方法所取代。现阶段，HLA分子分型方法主要有： 多聚酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)，多聚酶链反应-序列 特异性引物(PCR-SSP)，多聚酶链反应-序列特异性寡核苷酸反应 (PCR-SSOP)，基因芯片和测序分型(PCR-SBT)等。PCR-SSP需要设计 出一整套基因特异性引物，通过PCR技术获得特异性产物，通过电泳分析 决定HLA基因型别。其缺点不易、不能检测新的等位基因；试剂盒需不断 升级；检测的信号也只说模拟的信号，不直观可靠。PCR-SSOP的原理：设 计HLA基因型别特异的寡核苷酸序列作为探针，对PCR产物进行标记， 以PCR产物与探针进行杂交。通过检测信号判断HLA基因型别。但该方 法的缺点是不能检测新的等位基因，分辨率不高，检测信号为模拟信号。 SBT法是一种通过对扩增后的DNA进行一代测序，从而判断HLA基因型 别的方法。该方法是一种最直观、最准确的方法，可广泛用于HLA基因的 高分辨分型检测，但是该方法对扩增过程的引物序列要求很高，引物序列 直接关系到整个型别的确定，一对好的特异性引物是该方法成功的关键。
因此，为改变目前落后的HLA基因分型方法，需研发一种更加有效， 且在检测通量、数据质量、成本控制等方面，更有优势的方法。以Illumina 和Ion Torrent为代表的第二代测序技术(NGS)基于边合成边测序的原理，与 传统一代测序相比，具有样品制备简单、低成本、高通量、结果更准确等 优势。将二代测序技术应用于HLA分型，将大大降低检测成本，简化操作 步骤，使测序结果直观，能获得高分辨分型数据，还能得到新基因型等位 基因序列和等位基因的单倍体序列。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种HLA(人类白细胞抗原)基因特异 性PCR扩增引物及利用该引物进行HLA分型的方法和试剂盒。本发明提 供的一种基于二代测序技术的HLA基因扩增、高分辨分型的引物组、试剂 盒和方法的HLA分型方法能大大提高配型效果，使患者的治疗更有依据。 由于该方法应用二代测序技术，只需通过一次实验就能够确定HLA分型， 并一次性达到HLA分型的最高分辨率，同时，还可发现新的等位基因，在 检测通量、数据质量、成本控制等方面都有质的飞跃。
为解决上述技术问题，本发明提供了一种用于HLA基因扩增的引物组， 分别根据HLA-A基因的8个外显子区、HLA-B基因的8个外显子区和 HLA-DRB1基因的外显子2和外显子3设计引物，利用所述引物对所述HLA 基因进行PCR扩增，得到基因片段长度大于400bp，小于1.5kb的产物。
所述的用于HLA基因扩增的引物组，所述引物的核苷酸序列如下(1) -(4)中的任意一种：
(1)序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO19所示：或
(2)为(1)中所述的序列中的至少一个序列的5’端和/或3’端增加小 于或等于8个核苷酸的序列；或
(3)为(1)中所述的序列中的至少一个序列的5’端和/或3’端减少小 于或等于3个核苷酸的序列；或
(4)为(1)中所述的序列中的至少一个序列的中部增加、减少和/或 取代小于或等于2个核苷酸的序列。
其中，所述SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.5所示的引物序列用于扩增 HLA-A基因的引物序列；SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.2用于PCR扩增HLA-A 基因的第1个外显子至第3个外显子，扩增的HLA-A基因片段长度为1.1kb； SEQ ID NO.3-5用于PCR扩增HLA-A基因的外显子4-8，扩增HLA-A基 因片段长度为1.4kb。
所述SEQ ID NO.6-SEQ ID NO.9所示的引物序列是用于扩增HLA-B 基因的引物序列；引物序列SEQ ID NO.6-SEQ ID NO.7用于PCR扩增 HLA-B基因第1个外显子至第3个外显子，扩增的HLA-B基因片段长度为 1.2kb；引物序列SEQ ID NO.8-SEQ ID NO.9用于PCR扩增HLA-B基因第 4个外显子至第8个外显子，扩增HLA-B基因片段长度为1.4kb。
所述SEQ ID NO.10-SEQ ID NO.19所示的引物序列是用于扩增 HLA-DRB1基因的引物序列；引物SEQ ID NO.10-SEQ ID NO.17用于PCR 扩增HLA-DRB1基因的外显子2，扩增HLA-DRB1基因片段长度为 400-800bp；引物SEQ ID NO.18-SEQ ID NO.19用于PCR扩增HLA-DRB1 基因的外显子3，扩增HLA-DRB1基因片段长度为400-1000bp。
优选的，所述的用于HLA基因扩增的引物组，上述增加、减少和/或取 代的核苷酸选自A、T、C或G。
本发明提供了一种用于HLA基因扩增的试剂盒，包括所述的用于HLA 基因扩增的引物组。
所述用于HLA基因扩增的试剂盒，包括HLA-A基因扩增的PCR反应 体系，以20μL为计，如下：
2×PCR buffer，10μl；
A-F1，5μM，0.8μl
A-R1，5μM，0.8μl
A-F2-1，5μM，1μl
A-F2-2，5μM，1μl
A-R2，5μM，1μl
DNA模板，20-50ng/μl，2μl
Taq酶，5U/μL，0.15μl
余量用纯水补足。
所述用于HLA基因扩增的试剂盒，还包括HLA-B基因扩增的PCR反 应体系，以20μL为计，如下：
2×PCR buffer，10μl；
引物B-F1，5μM，0.8μl；
引物B-R1，5μM，0.8μl；
引物B-F2，5μM，0.8μl；
引物B-R2，5μM，0.8μl；
DNA模板，20-50ng/μl，2μl；
Taq酶，5U/μL，0.15μl；
余量用纯水补足至20μL。
所述用于HLA基因扩增的试剂盒，还可以包括HLA-DRB1基因扩增 的PCR反应体系，以20μL为计，如下：
2×PCR buffer，10μl；
引物DRB1-F2-1，5μM，1.2μl；
引物DRB1-F2-2，5μM，0.7μl；
引物DRB1-F2-3，5μM，0.3μl；
引物DRB1-F2-4，5μM，0.3μl；
引物DRB1-F2-5，5μM，0.2μl；
引物DRB1-F2-6，5μM，0.2μl；
引物DRB1-F2-7，5μM，0.3μl；
引物DRB1-R2，5μM，0.3μl；
引物DRB1-F3，5μM，2.0μl；
引物DRB1-R3，5μM，2.0μl；
DNA模板，20-50ng/μl，2μl
Taq酶，5U/μL，0.15μl；
余量用纯水补足至20μl。
优选的，所述的用于HLA基因扩增的试剂盒，所述HLA基因扩增的 PCR反应体系中，引物用Invitrogen 10X PCR Buffer(-MgCl2)的100倍稀 释液稀释至5μM。
优选的，所述的用于HLA基因扩增的试剂盒，所述HLA-A基因扩增 的PCR反应体系中，2×PCR buffer配制如下，以10μL为计，25mM dNTP 0.16μl、20-30mM MgCl2 2μl、1M DTT0.03μl、100％DMSO 0.27μl、5M Betain 2.16μl、20mg/ml BSA 0.01μl、Thermo 10X TaqBuffer with(NH4)2SO4 2μl，余量以纯水补足。
所述HLA-B基因扩增的PCR反应体系中，2×PCR buffer配方如下， 以10μl为计：dNTP，25mM，0.16μl；MgCl2，20-30mM，1.8μl；DTT， 1M，0.03μl；100％DMSO，0.27μl；Betain，5M，2.16μl；BSA，20mg/ml， 0.01μl；Thermo 10X Taq Buffer with(NH4)2SO4，2μl；余量以纯水补足至 10μL。
所述HLA-DRB1基因扩增的PCR反应体系中，2×PCR buffer配方如 下，以10μl为计：dNTP，25mM，0.16μl；MgCl2，20-30mM，2μl；DTT， 1M，0.03μl；100％DMSO，0.27μl；Betain，5M，2.16μl；BSA，20mg/ml， 0.01μl；ThermoFisher 10X Taq Buffer with KCl，2μl；余量以纯水补足至 10μL。
本发明提供了一种HLA基因扩增的方法，包括利用所述的用于HLA 基因扩增的引物组和/或所述的用于HLA基因扩增的试剂盒PCR扩增HLA 基因。
所述的HLA基因扩增的方法，所述HLA基因扩增的PCR反应程序如 下：96℃预变性2min；96℃保持30Sec(秒)，65℃保持30Sec(秒)， 72℃保持2min，反应5个循环；96℃保持30Sec(秒)，62℃保持30Sec (秒)，72℃保持2min，反应35个循环；10℃保存。
本发明提供了一种HLA基因高分辨分型方法，包括如下步骤：
S1、从人离体的组织或血液中获取待测样品DNA；
S2、利用所述的用于HLA基因扩增的引物组、所述的用于HLA基因 扩增的试剂盒和/或所述的HLA基因扩增的方法PCR扩增HLA基因；
S3、将S2步骤中扩增出的PCR产物进行测序；
S4、将步骤S3中的测序结果与标准HLA基因序列进行比对，确定待 测样本的HLA基因的型别。
所述的HLA基因高分辨分型方法，在S3步骤，采用Illumina二代测 序平台。
所述的HLA基因高分辨分型方法，采用Illumina二代测序平台进行测 序的步骤如下：
1)将PCR产物混合后进行片段化，然后进行纯化；
2)将步骤1)中获得的PCR产物进行接头连接、文库扩增和index添 加；
3)将步骤2)扩增得到的文库等摩尔量混合，进行质量检测，测序。
优选的，在步骤1)中，将同一样本的所有HLA基因的扩增产物各取 2μL混合，然后用纯水稀释8倍后再进行片段化。
优选的，在步骤1)中，采用NEB Next dsDNA Fragmentase酶切的方 法将PCR产物打断，反应体系如下：
DNA，10μL；
10X Fragmentase Reaction Buffer v2，2μL；
dsDNA Fragmentase，2μL；
余量用纯水补足至20μl。
优选的，在步骤1)中，采用NEB Next dsDNA Fragmentase酶切的方 法的反应程序如下：37℃保持6-30min，10℃保存。
优选的，在步骤1)中采用磁珠纯化，进一步优选的，所使用的磁珠为 BeckmanAgencourt AMPure XP。
优选的，在步骤2)中，使用KAPA Hyper Prep Kit、TruSeq DNA Nano 或Ultra Library Prep Kit进行接头连接和文库扩增。
优选的，在步骤2)中，使用KAPA Dual-Indexed Adapter Kit、Multiplex Oligos for Illumina或TruSeq DNA Combinatorial Dual Indexes进行index添加。
优选的，在步骤3)中，取步骤2)中获得的文库等摩尔量混合。样本 数目取决于测序试剂盒的数据量，测序深度至少为1000倍。
优选的，在步骤3)中，文库浓度使用KAPA Library Quantification Kits 和Thermo Fish Qubit检测。
优选的，在步骤3)中，文库DNA片段大小使用Agilent 2100 Bioanalyzer system检测，文库DNA片段大小在300bp-800bp的范围内。
优选的，在步骤3)中，取12pmol质检合格的文库样本用于Illumina Miseq和Hiseq2500测序，具体操作流程详见Miseq和Hiseq2500操作说明 书，测序使用PE250试剂盒。
所述的HLA-B基因高分辨分型方法，在S4步骤中，HLA分型优选使 用JSI SeqNext-HLA软件。
本发明技术方案，具有如下优点：
1、本发明提供的用于HLA基因扩增的引物组，分别根据HLA-A基因 的8个外显子区、HLA-B基因的8个外显子区和HLA-DRB1基因的外显子 2和外显子3设计引物，利用所述引物对所述HLA基因进行PCR扩增，得 到基因片段长度大于400bp，小于1.5kb的产物；通过上述引物PCR扩增 HLA基因，使得扩增产物的基因片段长度大于400bp，小于1.5kb，对模板 的完整性要求降低，扩增效率高，扩增反应时间短，成本降低，可以满足 大规模样本HLA基因的扩增或基因分型的需求。
2、本发明提供的用于HLA基因扩增的引物组，所述引物组的核苷酸 序列包括如下(1)-(4)序列中的任意一种：(1)序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO19所示：或(2)为(1)中所述的序列中的至少一个序列的5’端和/ 或3’端增加小于或等于8个核苷酸的序列；或(3)为(1)中所述的序列 中的至少一个序列的5’端和/或3’端减少小于或等于3个核苷酸的序列；或 (4)为(1)中所述的序列中的至少一个序列的中部增加、减少和/或取代 小于或等于2个核苷酸的序列；为了能够扩增出与分型结果关系密切HLA 基因的外显子，保证所有HLA基因的等位基因都被扩增，并提高扩增效率， 简化扩增体系，降低扩增成本，上述的引物是按照下述思路进行设计的：
(1)要保证所有HLA的等位基因都被扩增，需要选取保守区序列设 计引物，同时还考虑了HLA基因的多态性，尽量将引物设于无突变位点的 保守区，如果找不到合适的保守区，则采用兼并碱基或增设引物以保证所 有等位基因的有效扩增，避免漏检基因型。
(2)扩增效率最大化，首先控制引物的碱基组成，避免重复序列，控 制GC含量在40％-60％范围内，并且引物两端碱基避免出现A/T。同时， 同一体系内的引物间的溶解温度差异不宜过大。其次，控制扩增产物长度， 扩增产物长度要小于1500bp。
(3)扩增体系最简化，要减少同一扩增体系内目标片段的数目，如果 扩增片段过多，会造成体系内引物条数过多，会增大引物间相互干扰的可 能，并且还增加了试验操作的复杂度。
(4)扩增成本最小化，需要通过两方面实现，首先提高引物的扩增效 率，这样可以避免使用昂贵的特殊的DNA聚合酶。另外，还要控制扩增产 物的长度，如果长度过长，则需要使用价格比较昂贵的长片段扩增专用酶， 从而增加了成本。
(5)通过对HLA基因序列进行分析，综合以上因素，确定最佳扩增 方案如下：将HLA基因的扩增分两个片段进行，HLA-A和HLA-B两个片 段分别是外显子1-3(1100-1200bp)和外显子4-8(1400bp)，HLA-DRB1 两个片段分别是外显子2(400-800bp)和外显子3(400-1000bp)。原因 如下：首先，将HLA基因的扩增分成上述两个片段，不仅在降低扩增片段 长度的同时也考虑对扩增片段数目的限制。如果不分段扩增，则扩增片段 过长(＞3000bp)，造成扩增难度较大。如果按其它方式扩增，可能会导 致扩增片段过长或数目过多，增大扩增难度，降低扩增效率。其次，在HLA-A 和HLA-B的5’NCR、内含子3和3’NCR内存在保守区，该保守区序列符 合上述的引物序列要求，因此可将这两个基因的扩增引物设于这些区域。HLA-DRB1外显子2和外显子3的两端找不到合适的保守区，本发明采用 兼并碱基或增设引物以保证所有DRB1等位基因的有效扩增，避免漏检基 因型。因此，本发明提供10条DRB1的PCR扩增引物，比常规引物多6 条引物，这样更加保证对所有HLA-DRB1等位基因的有效扩增，避免漏检 基因型。因此，通过综合和平衡各种因素，确定用于HLA基因扩增的上述 引物序列。
3、本发明提供的一种用于HLA基因扩增的试剂盒，包括所述的用于 HLA基因扩增的引物组，利用所述引物组对所述HLA基因进行PCR扩增， 得到基因片段长度大于400bp，小于1.5kb的产物；通过上述引物PCR扩增 HLA基因，使得扩增产物的基因片段长度小于1.5kb，对模板的完整性要求 降低，扩增效率高，扩增反应时间短，成本降低，可以满足大规模样本HLA 基因的扩增或基因分型的需求。
4、本发明提供的一种用于HLA基因扩增的试剂盒，包括HLA基因扩 增的PCR反应体系，具体如下，HLA-A基因扩增的PCR反应体系，以20μL 为计，如下，2×PCR buffer，10μl；A-F1，5μM，0.8μl；A-R1，5μM，0.8 μl；A-F2-1，5μM，1μl；A-F2-2，5μM，1μl；A-R2，5μM，1μl；DNA模板，20-50ng/μl，2μl；Taq酶，5U/μL，0.15μl；余量用纯水补足；
HLA-B基因扩增的PCR反应体系，以20μL为计，如下，2×PCR buffer， 10μl；引物B-F1，5μM，0.8μl；引物B-R1，5μM，0.8μl；引物B-F2，5 μM，0.8μl；引物B-R2，5μM，0.8μl；DNA模板，20-50ng/μl，2μl；Taq 酶，5U/μL，0.15μl；余量用纯水补足至20μL；
HLA-DRB1基因扩增的PCR反应体系，以20μL为计：2×PCR buffer， 10μl；引物DRB1-F2-1，5μM，1.2μl；引物DRB1-F2-2，5μM，0.7μl；引 物DRB1-F2-3，5μM，0.3μl；引物DRB1-F2-4，5μM，0.3μl；引物DRB1-F2-5， 5μM，0.2μl；引物DRB1-F2-6，5μM，0.2μl；引物DRB1-F2-7，5μM， 0.3μl；引物DRB1-R2，5μM，0.3μl；引物DRB1-F3，5μM，2.0μl；引物 DRB1-R3，5μM，2.0μl；DNA模板，20-50ng/μl，2μl Taq酶，5U/μL，0.15μl； 余量用纯水补足至20μl；
上述的PCR反应体系中不需要使用长片段扩增专用的昂贵、高热稳定 和高保真性的DNA聚合酶，并且一个反应体系内即可完成两个片段的同时 性扩增，因此在不增加操作步骤的基础上，有效地降低了成本。
5、本发明提供的HLA基因扩增的方法，包括利用所述的用于HLA基 因扩增的引物组或所述的用于HLA基因扩增的试剂盒PCR扩增HLA-B基 因，扩增的产物较短(<1.5kb)，对模板的完整性要求降低，扩增效率高， 扩增反应时间短。
6、本发明提供的HLA基因高分辨分型方法，包括如下步骤：S1、从 人离体的组织或血液中获取待测样品DNA；S2、利用所述的用于HLA基 因扩增的引物组、所述的用于HLA基因扩增的试剂盒和/或所述的HLA基 因扩增的方法PCR扩增HLA基因；S3、将步骤S2中扩增出的PCR产物 测序；S4、将步骤S3中的测序结果与标准HLA基因序列进行比对，确定 待测样本的HLA基因的型别；通过上述方法中的引物组PCR扩增HLA基 因，使得扩增产物的基因片段长度小于1.5kb，对模板的完整性要求降低， 扩增效率高，扩增反应时间短，成本降低，可以满足大规模样本HLA基因 的扩增或基因分型的需求，为临床HLA配型提供更加准确的依据，为患者 提供合适的移植供者，降低移植过程中的排异反应，提高器官移植的成功 率和患者生存率。
7、本发明提供的HLA基因高分辨分型方法，在S3步骤中，采用Illumina 二代法测序平台进行测序。所述Illumina二代法测序平台进行测序具有以下 优点：一、PCR扩增之后，可以将同一个样本的不同基因的扩增产物合并 后建库。二、另外将不同index序列分别引入到不同样本之后，可以将高 通量的样本合并上机测序。三、由于测序引物为通用引物，所以不需要针 对各个基因设计测序引物。四、由于二代测序技术为单链边合成边测序技术，因此能够分析HLA基因的单倍体型，显著提高了HLA基因分型的精 确度。本发明提供的HLA基因高分辨分型方法不仅简化了操作流程，而且 降低了检测成本，具有高效、快速等优点，非常适合高通量样本检测。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下 面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍， 显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普 通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获 得其他的附图。
图1为本发明实施例1中引物组扩增HLA-A区域示意图；
其中E，Exon外显子；In，intron内含子；F，fragment，扩增片段；
图2为本发明实施例1中引物组扩增HLA-B区域示意图；
其中E，Exon外显子；In，intron内含子；F，fragment，扩增片段；
图3为本发明实施例1中引物组扩增HLA-DRB1区域示意图；
其中E，Exon外显子；In，intron内含子；F，fragment，扩增片段；
图4为本发明实施例1中8个样本HLA-A基因1-8号外显子多重PCR 产物电泳检测结果；
图5为本发明实施例1中8个样本HLA-B基因1-8号外显子多重PCR 产物电泳检测结果；
图6为本发明实施例1中8个样本HLA-DRB1基因外显子2和3多重 PCR产物电泳检测结果；
附图标记说明：
E-外显子；In-内含子；F-扩增片段。
具体实施方式
实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述 的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商 者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。下述实施例中所涉及的引物 由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
实施例1HLA基因的扩增
1.样本DNA提取
使用QlAamp血液提取试剂盒(QIAGEN)对96份已知HLA基因型别的 血液样本提取DNA。采用紫外分光光度计对提取的DNA样品进行浓度测 定，将提取得到DNA样品浓度调整至20-50ng/μl。
2.设计HLA基因扩增引物
根据IMGT/HLA数据库(http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla/)中最新的HLA 基因序列，如图1-图3所示，HLA-A和HLA-B基因有8个外显子， HLA-DRB1基因有6个外显子，寻找多组(每组两个)合适的保守区域， 并且保证每组保守区域能够覆盖目标区域(HLA-A和HLA-B基因外显子 1-8，HLA-DRB1外显子2-3)。在找到的多组保守区域内，分别设计合适 的扩增引物。如果没有保守区域可选，则采用简并碱基或增设等位基因组 特异性扩增引物。最重要的是，保证设计出的每组候选引物具有相似的物 理特性和反应动力学，以便能在同一条件下进行扩增反应。经过筛选确定 六组引物：HLA-A的第一组扩增引物为A-F1和A-R1，核心序列分别如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.2所示；第二组扩增引物为A-F2-1、A-F2-2和A-R2， 核心序列分别如SEQ ID NO.3-SEQ ID NO.5所示，SEQ ID NO.3(引物 A-F2-1)序列中存在的S是表示核苷酸C或G。HLA-B的第一组扩增引物 为B-F1和B-R1，核心序列分别如SEQ IDNO.6-SEQ ID NO.7所示，SEQ ID NO.7(引物B-R1)序列中存在的S是表示核苷酸C或G，第二组扩增引 物为B-F2和B-R2，核心序列分别如SEQ ID NO.8-SEQ ID NO.9所示； HLA-DRB1的第一组扩增引物为DRB1-F2-1、DRB1-F2-2、DRB1-F2-3、 DRB1-F2-4、DRB1-F2-5、DRB1-F2-6、DRB1-F2-7和DRB1-R2(DRB1-R2 序列中存在Y和K，Y代表碱基C或T，K代表碱基G或T)，序列分别 如SEQ ID NO.10-SEQ ID NO.17所示，利用该引物组能够扩增出 HLA-DRB1基因的外显子2，第二组引物为DRB1-F3、DRB1-R3，序列如 SEQ ID NO.9-SEQ ID NO.10所示，利用该引物组能够扩增出HLA-DRB1 基因的外显子3。
3.HLA基因PCR扩增
(1)向标记好的离心管加入表1所示的PCR反应混合液。首先将2×PCR buffer和扩增引物配制成PCR扩增预混液，然后将稀释好的DNA样品、PCR 扩增预混液和Taq酶配成PCR反应液。表1、3、5中的引物用Invitrogen 10X PCR Buffer(-MgCl2)的100倍稀释液稀释至5μM。其中，引物A-F2-1的 稀释液中包括2种等量的A-F2-1引物，即第一种为序列SEQ IDNO.3中的 S为碱基C；第二种为序列SEQ ID NO.3中的S为碱基G；引物B-R1的稀 释液中包括2种等量的B-R1引物，即第一种为序列SEQ ID NO.7中的S 为碱基C；第二种为序列SEQ IDNO.7中的S为碱基G。引物DRB1-R2 的稀释液中包括4种等量的DRB1-R2引物，即第一种为序列SEQ ID NO.17 中的Y为碱基C，K为碱基G；第二种为序列SEQ ID NO.17中的Y为碱 基C，K为碱基T；第三种为序列SEQ ID NO.17中的Y为碱基T，K为碱 基G；第四种为序列SEQ IDNO.17中的Y为碱基T，K为碱基T。
表1：HLA-A的PCR扩增反应体系
| 试剂名称 | 体积 |
| 2×PCR buffer | 10μl |
| A-F1(5μM) | 0.8μl |
| A-R1(5μM) | 0.8μl |
| A-F2-1(5μM) | 1μl |
| A-F2-2(5μM) | 1μl |
| A-R2(5μM) | 1μl |
| DNA模板(20-50ng/μl) | 2μl |
| Taq酶 | 0.15μl |
| ddH2O | 4.65μl |
| 总体积 | 20μL |
上述的表1中的2×PCR buffer配方如下表2，
表2：HLA-A的2×PCR buffer配方
表3：HLA-B的PCR扩增反应体系
| 试剂名称 | 体积 |
| 2×PCR buffer | 10μl |
| B-F1(5μM) | 0.8μl |
| B-R1(5μM) | 0.8μl |
| B-F2(5μM) | 0.8μl |
| B-R2(5μM) | 0.8μl |
| DNA模板(20-50ng/μl) | 2μl |
| Taq酶(5U/μL) | 0.15μl |
| ddH2O | 4.65μl |
| 总体积 | 20μL |
上述的表3中的2×PCR buffer配方如下表4，
表4：HLA-B的2×PCR buffer配方
表5：HLA-DRB1的PCR扩增反应体系
上述的表5中的2×PCR buffer配方如下表6，
表6：DRB1的2×PCR buffer配方
(2)将步骤(1)中的PCR反应液放到GeneAmp PCR system 9700仪 上进行PCR反应，扩增条件如下:
(3)将步骤(2)得到的PCR反应产物取5μl进行1.6％的琼脂糖凝胶 电泳检测。图4-图6显示了其中8个样品的HLA基因PCR扩增条带：HLA-A 基因每一个样品均有两条特异性扩增条带，下方条带长度为1.1kb，表示第 1外显子至第3外显子的长度；上方条带长度为1.4kb，表示第4外显子至 第8外显子的长度。HLA-B基因每一个样品均有两条特异性扩增条带，下 方条带长度为1.2kb，表示第1外显子至第3外显子的长度；上方条带长度 为1.4kb，表示第4外显子至第8外显子的长度。HLA-DRB1每一个样品 均有1-2条特异性扩增条带，长度为400-1000bp。其他样品的结果与此相 同。
上述结果表明六组扩增引物能够分别对目标区域(HLA-A和HLA-B 基因外显子1-8，HLA-DRB1外显子2-3)特异性扩增，同时同一个基因的 两个反应可在同一个反应体系内进行，因此大大缩短了扩增时间，简化了 反应步骤，有效地降低了成本。
实施例2HLA基因的扩增
本实施例与实施例1基本相同，区别仅在于第一组扩增引物为B-F1和 B-R1的5’端和/或3’端增加小于或等于8个核苷酸的序列，在本实施例中为 分别在B-F1和B-R1的5’端和3’端各增加8个核苷酸，所述核苷酸可选自 A(腺嘌呤)、T(胸腺嘧啶)、C(胞嘧啶)或G(鸟嘌呤)，在本实施 例中5’端的5’→3’增加GGCTACAT，3’端的5’→3’增加TTTGAACC，利 用第一组扩增引物能够扩增出HLA-B基因的外显子1-3，第二组扩增引物 为B-F2和B-R2的5’端和/或3’端增加小于或等于8个核苷酸的序列，在本 实施例中为分别在B-F2和B-R2的5’端和3’端增加1个核苷酸的序列，在 本实施例中5’端的5’→3’增加G，3’端的5’→3’增加C，利用第二组扩增引 物能够扩增出HLA-B基因的外显子4-8。采用上述引物进行基因扩增的结果与实施例1中的扩增结果一致。
实施例3HLA基因的扩增
本实施例与实施例1基本相同，区别仅在于第一组扩增引物为B-F1和 B-R1的5’端和/或3’端增加小于或等于8个核苷酸的序列，在本实施例中为 分别在B-F1和B-R1的5’端和3’端增加1个核苷酸，所述核苷酸可选自A (腺嘌呤)、T(胸腺嘧啶)、C(胞嘧啶)或G(鸟嘌呤)，在本实施例 中5’端增加C，3’端增加G，利用第一组扩增引物能够扩增出HLA-B基因 的外显子1-3，第二组扩增引物为B-F2和B-R2的5’端和/或3’端增加小于 或等于8个核苷酸的序列，在本实施例中为分别在B-F2和B-R2的5’端和 3’端增加8个核苷酸的序列，在本实施例中5’端的5’→3’增加CACAGTGT， 3’端的5’→3’增加CCCAGAAG，利用第二组扩增引物能够扩增出HLA-B 基因的外显子4-8。采用上述引物进行基因扩增的结果与实施例1中的扩增结果一致。
实施例4HLA基因的扩增
本实施例与实施例1基本相同，区别仅在于第一组扩增引物为B-F1和 B-R1的5’端和/或3’端减少小于或等于3个核苷酸的序列，在本实施例中为 分别在B-F1和B-R1的5’端和3’端减少3个核苷酸，利用第一组扩增引物 能够扩增出HLA-B基因的外显子1-3，第二组扩增引物为B-F2和B-R2的 5’端和3’端减少小于或等于3个核苷酸的序列，在本实施例中为分别在B-F2 和B-R2的5’端和3’端减少1个核苷酸的序列，利用第二组扩增引物能够 扩增出HLA-B基因的外显子4-8。采用上述引物进行基因扩增的结果与实 施例1中的扩增结果一致。
实施例5HLA基因的扩增
本实施例与实施例1基本相同，区别仅在于第一组扩增引物为B-F1和 B-R1的中间增加、减少和/或取代小于或等于2个核苷酸的序列，在本实施 例中为分别在B-F1和B-R1的中间增加2个核苷酸所述核苷酸可选自A(腺 嘌呤)、T(胸腺嘧啶)、C(胞嘧啶)或G(鸟嘌呤)，利用第一组扩增 引物能够扩增出HLA-B基因的外显子1-3，第二组扩增引物为B-F2和B-R2的中间减少和/或取代小于或等于2个核苷酸的序列，在本实施例中为分别 在B-F2和B-R2的中间减少1个核苷酸的序列，利用第二组扩增引物能够 扩增出HLA-B基因的外显子4-8。采用上述引物进行基因扩增的结果与实 施例1中的扩增结果一致。
实施例6HLA基因的扩增
本实施例与实施例1基本相同，区别仅在于第一组扩增引物为B-F1和 B-R1的中间增加、减少和/或取代小于或等于2个核苷酸的序列，在本实施 例中为分别在B-F1和B-R1的中间减少1个核苷酸，利用第一组扩增引物 能够扩增出HLA-B基因的外显子1-3，第二组扩增引物为B-F2和B-R2的 中间减少和/或取代小于或等于2个核苷酸的序列，在本实施例中为分别在 B-F2和B-R2的中间增加1个核苷酸的序列，在本实施例中两引物中间均 增加T，利用第二组扩增引物能够扩增出HLA-B基因的外显子4-8。采用 上述引物进行基因扩增的结果与实施例1中的扩增结果一致。
实施例7HLA基因的扩增
本实施例与实施例1基本相同，区别仅在于第一组扩增引物为B-F1和 B-R1的中间增加、减少和/或取代小于或等于2个核苷酸的序列，在本实施 例中为分别在B-F1和B-R1的中间取代1个核苷酸，利用第一组扩增引物 能够扩增出HLA-B基因的外显子1-3，第二组扩增引物为B-F2和B-R2的 中间减少和/或取代小于或等于2个核苷酸的序列，在本实施例中为分别在 B-F2和B-R2的中间取代2个核苷酸的序列，利用第二组扩增引物能够扩 增出HLA-B基因的外显子4-8。采用上述引物进行基因扩增的结果与实施 例1中的扩增结果一致。
实施例8HLA基因的扩增
本实施例与实施例1基本相同，区别仅在于第一组扩增引物的5’端和/ 或3’端增加小于或等于8个核苷酸的序列，在本实施例中为分别在 DRB1-F2-1、DRB1-F2-2、DRB1-F2-3、DRB1-F2-4、DRB1-F2-5、DRB1-F2-6、 DRB1-F2-7和DRB1-2R的5’端和3’端各增加8个核苷酸，所述核苷酸可选 自A(腺嘌呤)、T(胸腺嘧啶)、C(胞嘧啶)或G(鸟嘌呤)，在本实 施例中5’端的5’→3’增加GGCTACAG，3’端的5’→3’增加TTTGAACC， 利用第一组扩增引物能够扩增出HLA-DRB1基因的外显子2，第二组扩增 引物的5’端和/或3’端增加小于或等于8个核苷酸的序列，在本实施例中为 分别在DRB1-F3和DRB1-R3的5’端和3’端增加1个核苷酸的序列，在本 实施例中5’端的5’→3’增加G，3’端的5’→3’增加C，利用第二组扩增引物 能够扩增出HLA-DRB1基因的外显子3。采用上述引物进行基因扩增的结 果与实施例1中的扩增结果一致。
实施例9HLA基因的扩增
本实施例与实施例1基本相同，区别仅在于第一组扩增引物的5’端和/ 或3’端增加小于或等于8个核苷酸的序列，在本实施例中为分别在 DRB1-F2-1、DRB1-F2-2、DRB1-F2-3、DRB1-F2-4、DRB1-F2-5、DRB1-F2-6、DRB1-F2-7和DRB1-2R的5’端和3’端增加1个核苷酸，所述核苷酸可选自 A(腺嘌呤)、T(胸腺嘧啶)、C(胞嘧啶)或G(鸟嘌呤)，在本实施 例中5’端增加C，3’端增加G，利用第一组扩增引物能够扩增出HLA-DRB1 基因的外显子2，第二组扩增引物的5’端和/或3’端增加小于或等于8个核 苷酸的序列，在本实施例中为分别在DRB1-F3和DRB1-R3的5’端和3’端 增加8个核苷酸的序列，在本实施例中5’端的5’→3’增加CACAGTGT，3’ 端的5’→3’增加CCCAGAAC，利用第二组扩增引物能够扩增出 HLA-DRB1基因的外显子3。采用上述引物进行基因扩增的结果与实施例1 中的扩增结果一致。
实施例10HLA基因的扩增
本实施例与实施例1基本相同，区别仅在于第一组扩增引物的5’端和/ 或3’端减少小于或等于3个核苷酸的序列，在本实施例中为分别在 DRB1-F2-1、DRB1-F2-2、DRB1-F2-3、DRB1-F2-4、DRB1-F2-5、DRB1-F2-6、 DRB1-F2-7和DRB1-2R的5’端和3’端减少3个核苷酸，利用第一组扩增引 物能够扩增出HLA-DRB1基因的外显子2，第二组扩增引物的5’端和3’端减少小于或等于3个核苷酸的序列，在本实施例中为分别在DRB1-F3和 DRB1-R3的5’端和3’端减少1个核苷酸的序列，利用第二组扩增引物能够 扩增出HLA-DRB1基因的外显子3。采用上述引物进行基因扩增的结果与 实施例1中的扩增结果一致。
实施例11HLA基因的扩增
本实施例与实施例1基本相同，区别仅在于第一组扩增引物的中部增 加、减少和/或取代小于或等于2个核苷酸的序列，在本实施例中为分别在 DRB1-F2-1、DRB1-F2-2、DRB1-F2-3、DRB1-F2-4、DRB1-F2-5、DRB1-F2-6、 DRB1-F2-7和DRB1-2R的中部增加2个核苷酸所述核苷酸可选自A(腺嘌 呤)、T(胸腺嘧啶)、C(胞嘧啶)或G(鸟嘌呤)，利用第一组扩增引 物能够扩增出HLA-DRB1基因的外显子2，第二组扩增引物的中部减少和/ 或取代小于或等于2个核苷酸的序列，在本实施例中为分别在DRB1-F3和 DRB1-R3的中部减少1个核苷酸的序列，利用第二组扩增引物能够扩增出 HLA-DRB1基因的外显子3。采用上述引物进行基因扩增的结果与实施例1 中的扩增结果一致。
实施例12HLA基因的扩增
本实施例与实施例1基本相同，区别仅在于第一组扩增引物的中部增 加、减少和/或取代小于或等于2个核苷酸的序列，在本实施例中为分别在 DRB1-F2-1、DRB1-F2-2、DRB1-F2-3、DRB1-F2-4、DRB1-F2-5、DRB1-F2-6、 DRB1-F2-7和DRB1-2R的中部减少1个核苷酸，利用第一组扩增引物能够 扩增出HLA-DRB1基因的外显子2，第二组扩增引物为B-F2和B-R2的中 部减少和/或取代小于或等于2个核苷酸的序列，在本实施例中为分别在 DRB1-F3和DRB1-R3的中部增加1个核苷酸的序列，在本实施例中两引物 中部均增加T，利用第二组扩增引物能够扩增出HLA-DRB1基因的外显子 3。采用上述引物进行基因扩增的结果与实施例1中的扩增结果一致。
实施例13HLA基因的扩增
本实施例与实施例1基本相同，区别仅在于第一组扩增引物的中部增 加、减少和/或取代小于或等于2个核苷酸的序列，在本实施例中为分别在 DRB1-F2-1、DRB1-F2-2、DRB1-F2-3、DRB1-F2-4、DRB1-F2-5、DRB1-F2-6、 DRB1-F2-7和DRB1-2R的中部取代1个核苷酸，利用第一组扩增引物能够 扩增出HLA-DRB1基因的外显子2，第二组扩增引物的中部减少和/或取代 小于或等于2个核苷酸的序列，在本实施例中为分别在DRB1-F3和 DRB1-R3的中部取代2个核苷酸的序列，利用第二组扩增引物能够扩增出 HLA-DRB1基因的外显子3。采用上述引物进行基因扩增的结果与实施例1 中的扩增结果一致。
实施例14HLA基因的扩增
本实施例与实施例1基本相同，区别仅在于第一组扩增引物为A-F1和 A-R1的5’端和/或3’端增加小于或等于8个核苷酸的序列，在本实施例中 为分别在A-F1和A-R1的5’端和3’端各增加8个核苷酸，所述核苷酸可选 自A(腺嘌呤)、T(胸腺嘧啶)、C(胞嘧啶)或G(鸟嘌呤)，在本实 施例中5’端的5’→3’增加GGCTACAT，3’端的5’→3’增加TTTGAACC， 利用第一组扩增引物能够扩增出HLA-A基因的外显子1-3，第二组扩增引 物为A-F2-1、A-F2-2和A-R2的5’端和/或3’端增加小于或等于8个核苷酸 的序列，在本实施例中为分别在A-F2-1、A-F2-2和A-R2的5’端和3’端增 加1个核苷酸的序列，在本实施例中5’端的5’→3’增加G，3’端的5’→3’ 增加C，利用第二组扩增引物能够扩增出HLA-A基因的外显子4-8。采用 上述引物进行基因扩增的结果与实施例1中的扩增结果一致。
实施例15HLA基因的扩增
本实施例与实施例1基本相同，区别仅在于第一组扩增引物为A-F1和 A-R1的5’端和/或3’端增加小于或等于8个核苷酸的序列，在本实施例中 为分别在A-F1和A-R1的5’端和3’端增加1个核苷酸，所述核苷酸可选自 A(腺嘌呤)、T(胸腺嘧啶)、C(胞嘧啶)或G(鸟嘌呤)，在本实施 例中5’端增加C，3’端增加G，利用第一组扩增引物能够扩增出HLA-A基 因的外显子1-3，第二组扩增引物为A-F2-1、A-F2-2和A-R2的5’端和/或3’ 端增加小于或等于8个核苷酸的序列，在本实施例中为分别在A-F2-1、 A-F2-2和A-R2的5’端和3’端增加8个核苷酸的序列，在本实施例中5’端 的5’→3’增加CACAGTGT，3’端的5’→3’增加CCCAGAAG，利用第二组 扩增引物能够扩增出HLA-A基因的外显子4-8。采用上述引物进行基因扩 增的结果与实施例1中的扩增结果一致。
实施例16HLA基因的扩增
本实施例与实施例1基本相同，区别仅在于第一组扩增引物为A-F1和 A-R1的5’端和/或3’端减少小于或等于3个核苷酸的序列，在本实施例中 为分别在A-F1和A-R1的5’端和3’端减少3个核苷酸，利用第一组扩增引 物能够扩增出HLA-A基因的外显子1-3，第二组扩增引物为A-F2-1、A-F2-2 和A-R2的5’端和3’端减少小于或等于3个核苷酸的序列，在本实施例中为 分别在A-F2-1、A-F2-2和A-R2的5’端和3’端减少1个核苷酸的序列，利 用第二组扩增引物能够扩增出HLA-A基因的外显子4-8。采用上述引物进 行基因扩增的结果与实施例1中的扩增结果一致。
实施例17HLA基因的扩增
本实施例与实施例1基本相同，区别仅在于第一组扩增引物为A-F1和 A-R1的中间增加、减少和/或取代小于或等于2个核苷酸的序列，在本实施 例中为分别在A-F1和A-R1的中间增加2个核苷酸所述核苷酸可选自A(腺 嘌呤)、T(胸腺嘧啶)、C(胞嘧啶)或G(鸟嘌呤)，利用第一组扩增 引物能够扩增出HLA-A基因的外显子1-3，第二组扩增引物为A-F2-1、 A-F2-2和A-R2的中间减少和/或取代小于或等于2个核苷酸的序列，在本 实施例中为分别在A-F2-1、A-F2-2和A-R2的中间减少1个核苷酸的序列， 利用第二组扩增引物能够扩增出HLA-A基因的外显子4-8。采用上述引物 进行基因扩增的结果与实施例1中的扩增结果一致。
实施例18HLA基因的扩增
本实施例与实施例1基本相同，区别仅在于第一组扩增引物为A-F1和 A-R1的中间增加、减少和/或取代小于或等于2个核苷酸的序列，在本实施 例中为分别在A-F1和A-R1的中间减少1个核苷酸，利用第一组扩增引物 能够扩增出HLA-A基因的外显子1-3，第二组扩增引物为A-F2-1、A-F2-2 和A-R2的中间减少和/或取代小于或等于2个核苷酸的序列，在本实施例 中为分别在A-F2-1、A-F2-2和A-R2的中间增加1个核苷酸的序列，在本 实施例中两引物中间均增加T，利用第二组扩增引物能够扩增出HLA-A基 因的外显子4-8。采用上述引物进行基因扩增的结果与实施例1中的扩增结 果一致。
实施例19HLA基因的扩增
本实施例与实施例1基本相同，区别仅在于第一组扩增引物为A-F1和 A-R1的中间增加、减少和/或取代小于或等于2个核苷酸的序列，在本实施 例中为分别在A-F1和A-R1的中间取代1个核苷酸，利用第一组扩增引物 能够扩增出HLA-A基因的外显子1-3，第二组扩增引物为A-F2-1、A-F2-2 和A-R2的中间减少和/或取代小于或等于2个核苷酸的序列，在本实施例 中为分别在A-F2-1、A-F2-2和A-R2的中间取代2个核苷酸的序列，利用 第二组扩增引物能够扩增出HLA-A基因的外显子4-8。采用上述引物进行 基因扩增的结果与实施例1中的扩增结果一致。
实施例20基于二代(Illumina法)测序技术的HLA基因测序
1)将实施例1的PCR扩增产物混合，即将同一样本的所有基因的扩增 产物各取2μL混合，然后用纯水稀释8倍后再进行片段化。
2)将步骤1)中的PCR产物片段化，在本实施例中采用NEB Next dsDNAFragmentase酶切的方法将PCR产物打断，反应体系如下：
DNA，10μL；
10X Fragmentase Reaction Buffer v2，2μL；
dsDNA Fragmentase，2μL；
余量用纯水补足至20μl。
反应程序：37℃保持6-30min，10℃保存。
3)磁珠纯化，使用磁珠为Beckman Agencourt AMPure XP对步骤2) 中的DNA片段纯化，操作流程详见试剂说明书。
4)将步骤3)中获得的PCR产物进行接头连接、文库扩增和index添 加，接头连接和文库扩增使用KAPA Hyper Prep Kit，Index添加使用KAPA Dual-Indexed Adapter Kit，具体操作详见试剂盒说明书。
5)将步骤4)扩增得到的文库等摩尔量混合进行合库，将400-6000个 样本的文库等量混合，样本数目取决于测序试剂盒的数据量，要求测序深 度为1000倍。
6)将步骤5)获得的文库进行质量检测，文库浓度使用KAPA LibraryQuantification Kits和Thermo Fish Qubit检测，文库DNA片段大小使用 Agilent2100Bioanalyzer system检测，文库DNA片段大小在300bp-800bp 的范围内为合格。
7)将步骤6)中质检合格的文库进行上机测序，取12pmol库检合格样 本用于Illumina Miseq测序，具体操作流程详见Miseq操作说明书，测序使 用PE250试剂盒。
实施例21结果分析
使用专业分型软件JSI Seq Next-HLA对实例20的测序结果进行分析比 对，得到HLA基因的分型结果，如表7所示。本实施的所有96个样本的 分型结果均达到了高分辨分型结果标准，且与已知的样本HLA分型结果完 全一致。
表7：96个样本的HLA基因高分辨分型的结果
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方 式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可 以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予 以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保 护范围之中。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京诺诗康瀛基因技术股份有限公司
<120> 一种用于HLA基因扩增、基因分型的引物组、试剂盒和方法
<130> HA201800745
<160> 19
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成（A-F1）
<400> 1
ggatactcac gacgcggac 19
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成（A-R1）
<400> 2
ccaattgtct cccctccttg tg 22
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成（A-F2-1）
<400> 3
ggtgtsctgt ccattctcaa gata 24
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成（A-F2-2）
<400> 4
ggtgtcctgt ccattctcaa gatg 24
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成（A-R2）
<400> 5
cacaaaggga agggcaggaa caa 23
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成（B-F1）
<400> 6
ggtcccagtt ctaaagtccc cacg 24
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成（B-R1）
<400> 7
tccattcaas ggagggcgac 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成（B-F2）
<400> 8
tgttccccgc tcagagactc 20
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成（B-R2）
<400> 9
cacacgcgaa acatcccaat c 21
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成（DRB1-F2-1）
<400> 10
ccaaaagcct ggggatcaga c 21
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成（DRB1-F2-2）
<400> 11
aaggaagtgt tcacagggtg aag 23
<210> 12
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工合成（DRB1-F2-3）
<400> 12
ggcgttgcgg gtgggcg 17
<210> 13
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工合成（DRB1-F2-4）
<400> 13
cgggctgcgg tgctgga 17
<210> 14
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工合成（DRB1-F2-5）
<400> 14
caggctgcgg tgctgga 17
<210> 15
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成（DRB1-F2-6）
<400> 15
gcaggctgcg gtgctgga 18
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成（DRB1-F2-7）
<400> 16
cggtgggtgc tgttgaaggt 20
<210> 17
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工合成（DRB1-R2）
<400> 17
tgtaaaacga cggccagtgc tyacctcgcc kctgcac 37
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成（DRB1-F3）
<400> 18
aggagactta ctctgtcttc 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成（DRB1-R3）
<400> 19
agtgacctgt gctgatggag 20
Claims (11)
1.一种用于HLA基因扩增的引物组，其特征在于，分别根据HLA-A基因的8个外显子区、HLA-B基因的8个外显子区和HLA-DRB1基因的外显子2和外显子3设计引物，利用所述引物对所述HLA基因进行PCR扩增，得到基因片段长度大于400bp，小于1.5kb的产物。
2.根据权利要求1所述的用于HLA基因扩增的引物组，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如下(1)-(4)中的任意一种：
(1)序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO19所示：或
(2)为(1)中所述的序列中的至少一个序列的5’端和/或3’端增加小于或等于8个核苷酸的序列；或
(3)为(1)中所述的序列中的至少一个序列的5’端和/或3’端减少小于或等于3个核苷酸的序列；或
(4)为(1)中所述的序列中的至少一个序列的中部增加、减少和/或取代小于或等于2个核苷酸的序列。
3.一种用于HLA基因扩增的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-2任一项所述的用于HLA基因扩增的引物组。
4.根据权利要求3所述的用于HLA基因扩增的试剂盒，其特征在于，包括HLA-A基因扩增的PCR反应体系以20μL为计，如下：
2×PCR buffer，10μl；
A-F1，5μM，0.8μl
A-R1，5μM，0.8μl
A-F2-1，5μM，1μl
A-F2-2，5μM，1μl
A-R2，5μM，1μl
DNA模板，20-50ng/μl，2μl
Taq酶，5U/μL，0.15μl
余量用纯水补足。
5.根据权利要求3或4所述的用于HLA基因扩增的试剂盒，其特征在于，包括HLA-B基因扩增的PCR反应体系，以20μL为计，如下：
2×PCR buffer，10μl；
引物B-F1，5μM，0.8μl；
引物B-R1，5μM，0.8μl；
引物B-F2，5μM，0.8μl；
引物B-R2，5μM，0.8μl；
DNA模板，20-50ng/μl，2μl；
Taq酶，5U/μL，0.15μl；
余量用纯水补足至20μL。
6.根据权利要求3-5任一项所述的用于HLA基因扩增的试剂盒，其特征在于，包括HLA-DRB1基因扩增的PCR反应体系，以20μL为计，如下：
2×PCR buffer，10μl；
引物DRB1-F2-1，5μM，1.2μl；
引物DRB1-F2-2，5μM，0.7μl；
引物DRB1-F2-3，5μM，0.3μl；
引物DRB1-F2-4，5μM，0.3μl；
引物DRB1-F2-5，5μM，0.2μl；
引物DRB1-F2-6，5μM，0.2μl；
引物DRB1-F2-7，5μM，0.3μl；
引物DRB1-R2，5μM，0.3μl；
引物DRB1-F3，5μM，2.0μl；
引物DRB1-R3，5μM，2.0μl；
DNA模板，20-50ng/μl，2μl
Taq酶，5U/μL，0.15μl；
余量用纯水补足至20μl。
7.一种HLA基因扩增的方法，其特征在于，包括利用权利要求1-2所述的用于HLA基因扩增的引物组和/或权利要求3-6任一项所述的用于HLA基因扩增的试剂盒。
8.根据权利要求7所述的HLA基因扩增的方法，其特征在于，所述HLA基因扩增的PCR反应程序如下：96℃预变性2min；96℃保持30Sec，65℃保持30Sec，72℃保持2min，反应5个循环；96℃保持30Sec，62℃保持30Sec，72℃保持2min，反应35个循环；10℃保存。
9.一种HLA基因高分辨分型方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、从人离体的组织或血液中获取待测样品DNA；
S2、利用所述的用于HLA基因扩增的引物组、所述的用于HLA基因扩增的试剂盒和/或所述的HLA基因扩增的方法PCR扩增HLA基因；
S3、将S2步骤中扩增出的PCR产物进行测序；
S4、将步骤S3中的测序结果与标准HLA基因序列进行比对，确定待测样本的HLA基因的型别。
10.根据权利要求9所述的HLA基因高分辨分型方法，其特征在于，在S3步骤，采用Illumina二代测序平台进行测序。
11.根据权利要求10所述的HLA基因高分辨分型方法，其特征在于，采用Illumina二代测序平台进行测序的步骤如下：
1)将PCR产物混合后进行片段化，然后进行纯化；
2)将步骤1)中获得的PCR产物进行接头连接、文库扩增和index添加；
3)将步骤2)扩增得到的文库等摩尔量混合，进行质量检测，测序。
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