【发明内容】
本发明旨在解决上述问题,而提供一种测定中国汉族个体人类白细胞抗原HLA-A、-B基因全长序列的测定方法,以便为中国群体HLA-A、-B全长序列多态性及分子进化研究、基因的表达调控、疾病关联研究等领域提供广泛的应用基础。
本发明的目的还在于提供一种适合于中国人群的HLA-A、-B、-DQB1、-DRB1基因的测序分型方法。以便系统地对HLA-A、-B基因的编码区进行测序分型,对HLA-DQB1、DRB1的第二、三外显子采用组特异性引物进行测序分型,以解决HLA测序分型中出现的模棱两可的结果问题。
为实现上述目的,本发明提供一种人类白细胞抗原HLA-A、-B基因全长序列测定方法,该方法包括:
a、各由一对位点特异性PCR扩增引物对HLA-A基因的4.3kb全长序列,HLA-B基因的3.7kb全长序列进行PCR扩增,扩增采用高保真的聚合酶(Pfuultra II Fusion HS DNA polymerase),扩增区域包含两个基因的5’-启动子序列,所有外显子,所有内含子,以及3’-UTR序列;
b、将HLA-A 4.3kb扩增产物以及HLA-B 3.7kb扩增产物进行末端加碱基‘A’反应并克隆至pGEM-Teasy载体当中,挑选阳性克隆、提取质粒、分别通过载体两端引物以及正、反双向十条保守步移测序引物将两个基因的全长序列测通,共获得中国汉族个体HLA-A 38种等位基因的4.3kb全长序列,HLA-B 30种等位基因的3.7kb全长序列。
步骤a中,扩增HLA-A 4.3kb全长序列的PCR引物包括上游引物A-genome-F和下游引物A-genome-R,其中,上游引物A-genome-F的序列为:5′-ACTCAGAGCTAWGGAATGATG-3′,下游引物A-genome-R的序列为:5′-ACC5′-ATGGAGCAGCAAAGATGAC-3′;扩增HLA-B 3.7kb全长序列的PCR引物包括上游引物B-genome-F和下游引物B-genome-R,其中,上游引物B-genome-F的序列为:
5′-CCAGTTCARGGACAGGGATTC-3′,下游引物B-genome-R的序列为:5′-AACAGACTCAGCACAGCRAAC-3′。
所述HLA-A 4.3kb全长序列的PCR扩增引物以及HLA-B 3.7kb全长序列的扩增引物,扩增区域包含两个基因的5’-启动子序列,所有外显子,所有内含子,以及3’-UTR序列;上游扩增引物A-Genome-F及B-Genome-F分别位于HLA-A、-B基因的5’-启动子上游,下游扩增引物A-Genome-R及B-Genome-R分别位于HLA-A、-B基因的3’-UTR下游,将有多态性的碱基设计为简并碱基,可同时扩增HLA-A、-B基因所有不同子系的等位基因全长序列。
步骤a中,所述测序引物除载体两端通用测序引物(T7、SP6)外,包括的HLA-A基因全长正、反双向步移测序引物序列及其在基因组中的核苷酸位置(以基因的起始密码子‘ATG’中的‘A’为nt1)如下:
A-Genome-SF1:5′-CCCAGGCGTGGCTCTCAG-3′,NT-266~NT-249;
A-Genome-SF2:5′-CTACTACAACCAGAGCGA-3′,NT451~NT468;
A-Genome-SF3:5′-CCTCCCTCTGGTCCTGAG-3′,NT1091~NT1108;
A-Genome-SF4:5′-CCAGACCCAGGACACGGA-3′,NT1691~NT1708;
A-Genome-SF5:5′-AGCAGTCACAAGTCACAG-3′,NT2288~NT2305;
A-Genome-SR1:5′-TAAACAGCCCATCGCATG-3′,NT2840~NT2823;
A-Genome-SR2:5′-AGGTGCTTTACAAAAGAG-3′,NT2230~NT2213;
A-Genome-SR3:5′-GCCAGGTCAGTGTGATCT-3′,NT1674~NT1657;
A-Genome-SR4:5′-AATTGTCTCCCCTCCTTG-3′,NT1068~NT1051;
A-Genome-SR5:5′-GKCCTCGCTCTGGTTGTA-3′,NT472~NT455。
HLA-B基因全长正、反双向步移测序引物序列及其在基因组中的核苷酸位置如下:
B-Genome-SF1:5’-GCCCTGACCGAGACCTG-3’,NT52~NT68;
B-Genome-SF2:5’-CGGTTTCATTTTCAGTTG-3’,NT625~NT642;
B-Genome-SF3:5’-CCCTCTTCTCTCTAGGAC-3’,NT1146~NT1163;
B-Genome-SF4:5’-CAGACCAGCAGGAGATAG-3’,NT1720~NT1737;
B-Genome-SF5:5’-ATGAGTCAGGGGAAGGTC-3’,NT2296~NT2313;
B-Genome-SR1:5’-GGATTTTGGCCTCAACTG-3’,NT2711~NT2694;
B-Genome-SR2:5’-GGACTGTCTTCCCCTCCA-3’,NT2209~NT2192;
B-Genome-SR3:5’-TGGTCTGGTCTCCACAAG-3’,NT1726~NT1709;
B-Genome-SR4:5’-GTGCTGGCACACAGGGTC-3’,NT1208~NT1191;
B-Genome-SR5:5’-AGACCCCAAGAATCTCAC-3’,NT654~NT637。
步骤a中,所述38种HLA-A等位基因完整的4.3kb基因组全长序列,序列从基因的5’-启动子上游nt-819至3’-UTR下游nt 3435处(以基因的起始密码子‘ATG’中的‘A’为nt1),全部延伸了国际IMGT/HLA数据库中(http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla/)释放的该基因最长序列NT-300~NT3203,其中新等位基因全长序列7个,将已有等位基因的编码区、5’-启动子区、3’-非翻译区及所有内含子序列补充完整的等位基因31个;所述30个HLA-B等位基因完整的3.7kb基因组全长序列,序列从基因的5’-启动子上游nt-410至3’-UTR下游nt3298处,全部延伸了国际IMGT/HLA数据库中释放的该基因最长序列NT-284~NT3039,其中新等位基因全长序列3个,将已有等位基因的编码区、5’-启动子区、3’-非翻译区及所有内含子序列补充完整的等位基因27个。
由本发明的方法所获得的HLA-A、-B基因全长序列命名、获得的GenBank登录号以及与IMGT/HLA已有相同或相近等位基因序列比较特征见表1及表2。表1为38条HLA-A4.3kb全长序列登录号及其特征。
表1
表2为30条HLA-B 3.7kb全长序列登录号及其特征。
表2
所述HLA-A、-B全长序列PCR扩增反应体系为:
10×Pfu Buffer 2.5μL
dNTP(25mM) 2.0μL
PCR引物(10μM) 各1μL
基因组DNA 100ng
Pfu酶(5U/μL) 0.5μL
加ddH2O至 25μL。
HLA-A、-B全长序列扩增反应体系中,其循环参数为:
95℃ 2min
95℃ 30Sec
58℃ 30Sec
72℃ 3min,35个循环
72℃ 15min
4℃ Infinite。
本发明还提供了HLA基因测序分型方法该方法包括:
a、HLA-A、-B的测序分型方法为:
将HLA-A、-B均分别由两对位点特异性PCR扩增引物对分型目的区域进行PCR扩增,其中,第一对PCR引物的扩增产物涵盖第1外显子至第4外显子,第二对PCR引物的扩增产物第5外显子至第8外显子;两个基因分别通过十四条正向和反向测序引物对扩增产物进行测序反应,其中,分别对HLA-A、-B基因的第1、2、3、4、5、6、以及7外显子进行正、反向双向测序;
b、HLA-DRB1、-DQB1的测序分型方法为:
采用八条5’端等位基因组特异性引物分别与一条3’端通用位点特异性引物扩增DRB1的第2外显子至第3外显子的序列,DRB1的第2外显子采用八条5’端等位基因组特异性引物与一条位点特异性通用测序引物进行正、反双向测序,DRB1的第3外显子采用一对位点特异性通用测序引物进行正、反双向测序。采用一条5’端通用位点特异性引物分别与三条3’端等位基因组特异性引物对DQB1第2外显子进行PCR扩增,一对位点特异性引物对第3外显子进行PCR扩增,通过4条测序引物分别对第2外显子扩增产物和第3外显子扩增产物进行正、反双向测序。
步骤a中,扩增HLA-A第1至4外显子的PCR引物包括上游引物A-SBT-F1和下游引物A-SBT-R1,其中,上游引物A-SBT-F1的序列及核苷酸位置为:5′-GAGAAGCCAATCAGTGTCKTC-3′(nt-84~nt-64),下游引物A-SBT-R1的序列及核苷酸位置为:5’-GCTTTCCSTAARAGACATGAC-3’(nt1866~nt1886);扩增HLA-A第5至8外显子的PCR引物包括上游引物A-SBT-F2和下游引物A-SBT-R2,其中,上游引物A-SBT-F2的序列及核苷酸位置为:5’-AAGGAGGGAGAYGGGGGTGTC-3’(NT1848~NT1868),下游引物A-SBT-R2的序列核苷酸位置为:5′-TGCCTYTCAGTCCCACACAAG-3′(nt2913~nt2933),扩增HLA-B第1至4外显子的PCR引物包括上游引物B-SBT-F1和下游引物B-SBT-R1,其中,上游引物B-SBT-F1的序列及核苷酸位置为:5′-CTAGAGAAGCCAATCAGYGTC-3′(NT-86~NT-66),下游引物B-SBT-R1的序列及核苷酸位置为5′-CCCGCCCTGAGAASAGATATG-3′(NT1865-NT1881,5’端加CCCG);扩增HLA-B第5至8外显子的PCR引物包括上游引物B-SBT-F2和下游引物B-SBT-R2,其中,上游引物B-SBT-F2的序列及核苷酸位置为:5’-AGGGGGATGAGGGGTCATATC-3’(NT1849~NT1869),下游引物B-SBT-R2的序列及核苷酸位置为:5’-AGACACATTCAGGTGCCTTTG-3’(NT2953~NT2973)。
所述HLA-A、-B基因的第1至第4外显子的PCR扩增引物的上游引物A-SBT-F1及B-SBT-F1分别位于HLA-A、-B基因的5’-启动子区域,下游引物A-SBT-R1及B-SBT-R1分别位于HLA-A、-B基因的第4内含子区域,扩增区域涵盖了两个基因分型常规检测区域第2、3、4外显子,还包含了部分5’-启动子区、第1外显子、第1内含子、第2内含子、第3内含子以及部分第4内含子序列,HLA-A、-B基因第1至第4外显子的PCR扩增引物的扩增片断长约为1970bp;所述HLA-A、-B基因的第5至第8外显子的PCR扩增引物的上游引物A-SBT-F2及B-SBT-F2分别位于HLA-A、-B基因的第4内含子区域,下游引物A-SBT-R2及B-SBT-R2分别位于HLA-A、-B基因的3’-UTR区,扩增区域涵盖了两个基因第5、6、7、8外显子,并包括部分第4内含子、第5内含子、第6内含子、第7内含子及部分3’UTR区域的序列,HLA-A、-B基因第5至第8外显子的PCR扩增引物扩增片段长度约为1100bp;上述八条引物设计时参考了IMGT/HLA数据库中释放的所有HLA-A、-B基因全长序列,以及上述的38条HLA-A全长序列与30条HLA-B全长序列,选择了具有位点特异性的保守区域或者单核苷酸多态性清晰的区域设计引物,既保证了扩增产物的特异性,又保证了扩增产物的广泛性(可同时扩增同一基因所有子系的等位基因)。
步骤a中,HLA-A基因分型测序引物及核苷酸位置如下:
第一外显子正向测序引物A1F:5′-ACCGGGACTCAGATTCTC-3′,nt-32~nt-15,
第一外显子反向测序引物A1R:5′-MCGACCCCGCACTCAC-3′,nt 74~nt89;
第二外显子正向测序引物A2F:5′-CCTCTGYGGGGAGAAG-3′,nt101~nt116,
第二外显子反向测序引物A2R:5′-CGGACCCGGAGACTGTG-3′,nt 539~nt 555;
第三外显子正向测序引物A3F:5′-CGGTTTCATTTTCAGTTTAG-3′,nt621~nt640,
第三外显子反向测序引物A3R:5′-TGTCTCCCCTCCTTGTG-3′,nt1049~nt1065;
第四外显子正向测序引物A4F:5′-GAGTGTCCCATKACAGATG-3′,nt1517~nt1535,
第四外显子反向测序引物A4R:5’-TTCCSTAARAGACATGAC-3’,NT1866~NT1883;
第五外显子正向测序引物A5F:5′-TTCCCCTCTTTTCCCAG-3′,NT1931~NT1947,
第五外显子反向测序引物A5R:5′-TSTTCCTCCTCCACMTC-3′,NT2042~NT2058;
第六外显子正向测序引物A6F:5′-TCTCACAGGACATTTTCTTC-3′,NT2481~NT2500,
第六外显子反向测序引物A6R:5′-GCTCCCAAACACAATATC-3′,NT2576~NT2593;
第七外显子正向测序引物A7F:5′-CACAATTCCTCCTCTAG-3′,NT2616~NT2632,
第七外显子反向测序引物A7R:5′-GAAACCCCATAGCACAG-3′,NT2786~NT2802。
HLA-B基因分型测序引物及核苷酸位置如下:
第一外显子正向测序引物B1F:5′-CGCACCCACCCGGACTC-3′,NT-38~NT-22,
第一外显子反向测序引物B1R:5′-TCACCGGCCCAGGTCTC-3′,NT61~NT77;
第二外显子正向测序引物B2F:5’-AGGCTCCCACTCCATG-3’,NT200~NT215,
第二外显子反向测序引物B2R:5’-CCTCGCTCTGGTTGTAG-3’,NT451~NT468;
第三外显子正向测序引物B3F:5’-RGGCCAGGGTCTCACA-3’,nt710~nt725,
第三外显子反向测序引物B3R:5’-GGAGATGGGGAAGGCTC-3’,NT1010~NT1026;
第四外显子正向测序引物B4F:5’-CATTCTCAGGCTGGTCAC-3’,nt1483~nt1500,
第四外显子反向测序引物B4R:5’-CCCTCATCCCCCTCCTTAC-3’,nt1841~nt1861;
第五外显子正向测序引物B5F:5’-AGCCCTTCAGCAGGGTC-3’,NT1889~NT1905,
第五外显子反向测序引物B5R:5’-GCTTGAAACCCCCAGTG-3’,NT2094~NT2110;
第六外显子正向测序引物B6F:5’-GGAGGTTCCTCTAAGATC-3’,NT2425~NT2442,
第六外显子反向测序引物B6R:5’-GAGACGTKGGACAGGAG-3’,NT2576~NT2592;
第七外显子正向测序引物B7F:5′-GGCTCTGACCAGGTCCT-3′,NT2598~NT2614,
第七外显子反向测序引物B7R:5′-CCACTCTAGACCCCAAG-3′,NT2689~NT2705。
步骤b中,所述HLA-DRB1基因测序分型方法中,八条5’端等位基因组特异性扩增及测序引物均位于DRB1第二外显子5’端,引物序列及组特异性如下:
HLA-DRB1*01正向扩增引物5’DR1:5’-TTCTTGTGGCAGCTTAAGTT-3’,
HLA-DRB1*02,15,16正向扩增引物5’DR2/15/16:5’-TTCCTGTGGCAGCCTAAGAGG-3’,
HLA-DRB1*03,11,13,14正向扩增引物5’DR3/11/13/14:5’-GTTTCTTGGAGTACTCTACGTC-3’,
HLA-DRB1*04正向扩增引物5’DR4:5’-GTTTCTTGGAGCAGGTTAAAC-3’,
HLA-DRB1*07正向扩增引物5’DR7:5’-CACGTTTCCTGTGGCAGGG-3’,
HLA-DRB1*08,12正向扩增引物5’DR8/12:5’-GTTTCTTGGAGTACTCTACGGG-3’,
HLA-DRB1*09正向扩增引物5’DR9:5’-GTTTCTTGAAGCAGGATAAGT-3’,
HLA-DRB1*10正向扩增引物5’DR10:5’-CGGTTGCTGGAAAGACGCG-3’。
DRB1的第2至3外显子通用反向扩增引物3’DR-generic位于DRB1的第3外显子末端及第3内含子的交界处,引物序列为:5’-AAGCTGCTCACTCCATTC-3’。八条5’端等位基因组特异性引物分别与3’DR-generic扩增DRB1的第2外显子到第3外显子的序列,序列涵盖DRB1的第2外显子、第2内含子及第3外显子,序列长约2800bp。DRB1的第2外显子正向测序引物为上述八条5’端等位基因组特异性引物,反向通用测序引物DRB2Rseq位于第2外显子3’末端,引物序列为:5’-CCGCTGCACYGTGAAG-3’。DRB1的第3外显子正向测序引物DRB3Fseq位于第3外显子5’端,引物序列为:5’-CCTRAGGTGACTGTRTATC-3’;反向测序引物DRB3Rseq位于第3外显子3’末端,引物序列为:5’-TCCATTCCACTGTGAGAG-3’。
步骤b中,所述HLA-DQB1基因测序分型方法中,第2外显子的5’端通用正向扩增引物5’DQex2-generic序列如下:5’-TGTAAAACGACGGCCAGTTCCTCGCAGAGGATTTC-3’,其中该引物的3’端17个碱基‘TCCTCGCAGAGGATTTC’位于DQB1的第1内含子3’末端及第2外显子5’端的交界处,该引物的5’端18个碱基‘TGTAAAACGACGGCCAGT’为M13F的序列。DQB1第2外显子的三条3’端等位基因组特异性反向扩增引物序列、组特异性及位置如下:
HLA-DQB1*02,03,04反向扩增引物3’DQex2-2/3/4:5’-CTCGCCGCTGCAAGGTCGT-3’,DQB1第2外显子3’末端;
HLA-DQB1-*05,06反向扩增引物:3’DQex2-5/6CAG:5’-GGCTCACTCTCCTCTGCAG-3’,第2外显子3’末端及第2内含子5’端交界处;
HLA-DQB1-部分*06反向扩增引物:3’DQex2-P6CAA:5’-GGCTCACTCTCCTCTGCAA-3’,第2外显子3’末端及第2内含子5’端交界处;
一条5’端通用正向扩增引物分别与三条3’端等位基因组特异性反向扩增引物扩增DQB1的第2外显子序列,序列长约300bp;
DQB1第3外显子的正向扩增引物5’DQex3位于第3外显子的5’端,序列为:5’-GAGCCCACAGTGACCATCTC-3’;第3外显子的反向扩增引物3’DQex3位于第3外显子的3’末端及第3内含子5’端交界处,序列为:5’-TACGCCACTCCRCGRTGATG-3’。该两条引物扩增第3外显子序列长约280bp。
DQB1第2外显子及第3外显子的测序引物及位置如下:
第2外显子正向测序引物DQB2Fseq:5’-CTCGCAGAGGATTTCGTG-3’,第2外显子5’端;
第2外显子反向测序引物DQB2Rseq:5’-CTSGTRGTTGTGTCTGCA-3’,第2外显子3’端;
第3外显子正向测序引物DQB3Fseq:5’-AGTGACCATCTCCCCATC-3’,第3外显子5’端;
第3外显子反向测序引物DQB3Rseq:5’-ATGGGGYTCTGGAGGCT-3’,第3外显子3’端。
八条5’端等位基因组特异性引物分别与3’DR-generic扩增DRB1的第2外显子到第3外显子的序列,均可采用的扩增反应体系为:
10×Buffer 12.5μL
MgCl2(25mM) 1.5μL
dNTP(25mM) 2.0μL
PCR引物(10μM) 各1μL
基因组DNA 100ng
Clontech LA酶(5U/μL) 0.5μL
加ddH2O至 25μL。
所述HLA-A、-B基因第1至第4外显子及第5至8外显子、HLA-DQB1的第2外显子、HLA-DQB1的第3外显子均可采用的PCR扩增反应体系为:
2×GC Buffer 12.5μL
dNTP(25mM) 2.0μL
PCR引物(10μM) 各1μL
基因组DNA 100ng
Clontech LA酶(5U/μL) 0.5μL
加ddH2O至 25μL。
所述HLA-A、-B基因第1至第4外显子以及第5至8外显子、HLA-DQB1的第2外显子、HLA-DQB1的第3外显子及HLA-DRB1的第2至3外显子均可采用的PCR扩增反应程序为:
95℃ 2min
95℃ 15Sec
65℃ 15Sec
72℃ 2min,5个循环
95℃ 15Sec
60℃ 15Sec
72℃ 2min,26个循环
95℃ 5Sec
55℃ 1min
72℃ 3min,4个循环
72℃ 15min
4℃ Infinite。
所述HLA-A、-B、-DQB1、-DRB1测序分型方法中所有的测序反应均可采用以下体系:
测序引物(10μM) 0.2μL
测序模板DNA 2.0μL
ABI PRISM BigDye Terminator 1.1 0.25μl
5×BigDye Buffer 1.8μl
加ddH2O至 10μL。
本发明的贡献在于,其测定了中国汉族个体人类白细胞抗原HLA-A、-B基因全长序列并系统地开发适合于中国人群的HLA-A、-B、-DQB1、-DRB1)基因的测序分型方法。本发明所获得的HLA-A、-B基因全长序列为HLA-A、-B基因的表达、进化、疾病相关性、移植配型等研究提供宝贵数据。HLA-A、-B基因的测序分型方法检测覆盖面广,该方法除了可进行HLA-A、-B基因第2、3、4外显子常规测序分型外,还可进行第1、5、6、7外显子多态性检测,它有效解决了两个基因测序分型中出现的模棱两可的结果问题。由于所有的HLA-A、-B扩增及测序引物设计时,充分考虑了全长序列的单核苷酸多态性(SNPs),因而可长期有效地应用于检测工作当中。对于HLA-DRB1、-DQB1测序分型的方法,本发明中分别利用组特异性引物对DRB1及DQB1的第2及第3外显子进行扩增,既可有效保证特异性扩增同时解决了模棱两可结果的问题。本发明中HLA-A、-B、-DRB1、及-DQB1的扩增反应程序以及测序反应条件均一致,实现了HLA基因测序分型的同步操作。本发明适合于中国人群HLA-A、-B、-DQB1、及DRB1基因的高分辨水平基因分型,以及HLA-A、-B、-DRB1及-DQB1基因的临床移植组织配型、群体遗传学、人类学及进化学等应用和基础研究工作。
【具体实施方式】
下列实施例是对本发明的进一步解释和说明,对本发明不构成任何限制。
本发明提供了一种HLA-A、-B基因全长序列的测定方法,并提供了用该方法测得的中国汉族人群38条HLA-A 4.3kb全长序列和30条HLA-B 3.7kb全长序列。本发明同时提供了HLA-A、-B基因测序分型的方法,该两种基因测序分型所用的PCR扩增引物及各外显子的测序引物,均基于本发明中获得的68条全长序列并同时参考了国际IMGT/HLA数据库提供的全长序列所设计。本发明还提供了HLA-DQB1、-DRB1基因测序分型的方法,该两种基因均采用组特异性引物扩增分型区域,既保证特异性扩增又有效地解决了模棱两可结果的问题。通过反复筛选扩增、测序引物、探索最佳退火温度及调节Mg2+离子和引物浓度等条件,本发明提供的引物和方法可稳定地对HLA-A、-B、-DQB1、-DRB1基因进行高分辨水平测序分型。
本发明中DNA引物序列共64条,委托大连宝生物公司合成。HLA-A、-B基因全长扩增酶采用Stratagene公司生产的Pfu高保真酶,保证序列的准确性。HLA-A、-B、-DQB1、-DRB1基因测序分型扩增酶均采用Clontech酶。
实施例1
本实施例给出了获得38条HLA-A 4.3kb全长等位基因、30条HLA-B 3.7kb全长序列的整套方案。
首先,从1000份已进行HLA-A、-B基因高分辨测序分型、结果已知的深圳造血干细胞捐献者的血样中选择45份包含HLA-A所有子系中常见等位基因的样本,38份包含HLA-B所有子系中常见等位基因的样本进行本发明的基因序列测定。取本发明中的HLA-A基因全长扩增引物A-Genome-F以及A-Genome-R,对45份标本进行HLA-A基因全长扩增,取HLA-B基因全长扩增引物B-Genome-F以及B-Genome-R,对38份标本进行HLA-B基因全长扩增,扩增于ABI 9700型PCR仪进行,扩增反应体系组成为:
10×Pfu Buffer 2.5μL
dNTP(25mM) 2.0μL
PCR引物(10μM) 各1μL
基因组DNA 100ng
Pfu酶(5U/μL) 0.5μL
加ddH2O至 25μL。
扩增循环参数为:
95℃ 3min
95℃ 30Sec
58℃ 30Sec
72℃ 2min,30个循环
72℃ 15min
4℃ Infinite。
取5μL PCR产物,经cyber-greenI染色,于1%琼脂糖凝胶中电泳;对照TakaraDL5000DNA分子标记,在凝胶成像系统中观察特异性PCR产物条带。PCR产物条带清晰、特异,见图1。图1-a为HLA-A 4.3kb产物,图1-b为HLA-B 3.7kb产物。
HLA-A、-B基因全长扩增成功后,序列测定采用的是克隆测序的方法。PCR产物克隆前需进行两步纯化。第一步纯化的目的是去除长距离PCR过程中产生的非特异性产物,采用切胶回收法。由于Stratagene Pfu酶扩增的产物末端不加碱基‘A’无法与载体进行‘TA’连接,故应对回收后的产物先进行末端加‘A’反应,该反应体系及程序如下:PCR纯化产物17ul,dATP(25mM)0.5ul,10×Taq Buffer 2ul,Taq酶0.5ul,总体积20ul,于70℃反应15-30min。加‘A’反应后利用EDTA/醋酸钠以及乙醇进行第二步纯化去除多余的缓冲液、酶以及dATP,纯化后进行连接反应。连接反应体系为10ul,内含pGEM T easy vector 15ng,2×连接Buffer 5ul,T4连接酶1.5U,纯化的HLA-A、B基因PCR目的片段45-120ng。
连接反应于4℃过夜后,转化入JM109感受态细胞,抗氨苄培养基中37℃培养过夜。每份样本随机挑选12个克隆子,于2YT培养基中扩大培养16-20小时后,提取质粒,凝胶电泳法鉴定阳性克隆。阳性克隆鉴定见图2,采用本发明中介绍的HLA-A、-B基因全长正、反方向测序引物,加上pGEM-Tea sy载体两端通用测序引物T7、SP6,进行HLA-A,-B各等位基因全长序列的双向测序。每一个阳性克隆所测出的7条序列,用DNASTAR软件包中的Seqman模块进行拼接(Lasergene version 5;DNA Star,Inc.,Madison,WI),人工核查拼接的准确性。拼接后的4kb序列由Seqman输出后用Clustal软件包中的alignment程序进行比对。每种等位基因3个阳性克隆序列4kb序列若一致则确认为该条等位基因的序列。最后得到的所有准确序列输入到Bioedit(http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdi t/bioedit.html)以及Dnasp4.0软件中进行核苷酸定位及多态性分析。获得的全部准确序列均向国际NCBI网站数据库及IMGT/HLA数据库提交并获得正式登录号及命名号(见表1、表2)。获得的全部序列及比对见图3(HLA-A)及图4(HLA-B)。
实施例2
本实施例给出对384例深圳造血干细胞志愿捐献者样本进行HLA-A、-B高分辨测序分型的实例。
申请人从深圳的造血干细胞志愿捐献者中随机选择了384例HLA-A、-B等位基因型已知的样本,用本发明中的PCR引物和测序引物进行测序分型,来验证本发明的实施效果。用本发明中的扩增及测序引物对上述样本进行测序分型实验,最后都得到了清晰的HLA-A、-B基因型且能够解决所选样本中出现的模棱两可结果。
首先分别通过两对PCR扩增引物对样本的HLA-A、-B进行PCR扩增反应,其中,第一对扩增引物扩增两个基因的第1外显子到第4外显子的序列,第二对扩增引物扩增两个基因的第5外显子到第8外显子的序列,两个基因的两对扩增反应结果见图5。
扩增反应条件:所有扩增反应均设置同一种反应体系,组成如下:
2×GC Buffer 12.5μL
dNTP(25mM) 2.0μL
PCR引物(10μM) 各1μL
基因组DNA 100ng
Clontech LA酶(5U/μL) 0.5μL
加ddH2O至 25μL。
设置好PCR反应体系后,所有反应均在同一个ABI 9700型PCR仪中用同一种扩增条件进行同步扩增,循环参数如下:
95℃ 2min
95℃ 15Sec
65℃ 15Sec
72℃ 2min,5个循环
95℃ 15Sec
60℃ 15Sec
72℃ 2min,26个循环
95℃ 5Sec
55℃ 1min
72℃ 3min,4个循环
72℃ 15min
4℃ Infinite。
扩增反应结束后,HLA-A、-B基因各用14条测序引物,即第一外显子正、反向测序引物A1F、A1R、B1F、B1R;第二外显子正、反向测序引物A2F、A2R、B2F、B2R;第三外显子正、反向测序引物A3F、A3R、B3F、B3R;第四外显子正、反向测序引物A4F、A4R、B4F、B4R;第五外显子正、反向测序引物A5F、A5R、B5F、B5R;第六外显子正、反向测序引物A6F、A6R、B6F、B6R;第七外显子正、反向测序引物A7F、A7R、B7F、B7R对相应的PCR模板进行测序反应,测序反应体系如下:
测序引物(10μM) 0.2μL
测序模板DNA 2.0μL
ABI PRISM BigDye Terminator 1.1 0.25μl
5×BigDye Buffer 1.8μl
加ddH2O至 10μL。
测序反应程序为:
98℃ 2min
96℃ 10Sec
50℃ 5Sec
60℃ 4min,30个循环
4℃ Infinite。
测序反应完成后,在ABI 3730测序仪中电泳。
由图6(HLA-A)、图7(HLA-B)可以看出HLA-A、-B基因第1、2、3、4、5、6、7外显子正向和/或反向测序的碱基信号峰较高,序列中无背景信号和杂峰。
测序结果显示,384份样本出现完全匹配(full match)的结果。
当某一份样本测得的所有HLA-A、-B序列导入Assign 3.5SBT(Conexio Genomics,Western Australia)软件中,可清晰地判读出受检者的等位基因型,如图8、9所示。
实施例3
为了验证HLA-DRB1组特异性引物的有效性,本实施例从384份DRB1等位基因型已知的深圳造血干细胞志愿捐献者样本中选出8例分别含有8种组特异性等位基因(DR01,DR02/15/16,DR03/11/13/14,DR04,DR07,DR08/12,DR09,DR10)的标本,分别用与8例样本所含等位基因相对应的5’端组特异性引物与3’DR-generic扩增DRB1的第2外显子到第3外显子的序列,采用的扩增反应体系为:
10×Buffer 12.5μL
MgCl2(25mM) 1.5μL
dNTP(25mM) 2.0μL
PCR引物(10μM ) 各1μL
基因组DNA 100ng
Clontech LA酶(5U/μL) 0.5μL
加ddH2O至 25μL。
采用的扩增反应程序为:
95℃ 2min
95℃ 15Sec
65℃ 15Sec
72℃ 2min,5个循环
95℃ 15Sec
60℃ 15Sec
72℃ 2min,26个循环
95℃ 5Sec
55℃ 1min
72℃ 3min,4个循环
72℃ 15min
4℃I nfinite。
取5μL PCR产物,经cyber-greenI染色,于1%琼脂糖凝胶中电泳;对照TakaraDL5000DNA分子标记,在凝胶成像系统中观察特异性PCR产物条带。如图10所示,8例样本用其特异的5’扩增引物扩增出的PCR产物条带均清晰、特异。
为了验证HLA-DRB1扩增引物的组特异性,从384份DRB1等位基因型已知的深圳造血干细胞志愿捐献者样本中随机选出8例样本,每1例均用8条5’端等位基因组特异性引物分别与3’DR-generic扩增DRB1的第2外显子到第3外显子的序列,如图11所示,8例样本均只有用其等位基因特异的5’端扩增引物能扩增出目的条带。对其中一个随机样本的阳性孔进行DRB1的第2外显子(正向测序引物为该阳性孔5’端扩增引物,反向测序引物为DRB2Rseq)和第3外显子(正向引物为DRB3Fseq,反向引物DRB3Rseq)测序,序列导入Assign 3.5SBT(Conexio Genomics,Western Australia)软件中,可清晰地判读出受检者的DRB1基因型,如图12所示。
实施例4
本实施例给出对HLA-DQB1的测序分型方法的验证。本实施例从192份移植配型标本中随机选出8例已用进口试剂盒Atria AlleleSEQR HLA-DQB1plus进行分型结果已知的标本,分别用发明中的第2外显子5’端通用测序引物(5’DQex2-generic)与三条3’端等位基因组特异性引物(3’DQex2-2/3/4,3’DQex2-5/6CAG,3’DQex2-p6CAA)进行第2外显子的扩增,扩增采用体系及程序与HLA-A、-B测序分型方法一致,扩增反应体系如下:
2×GC Buffer 12.5μL
dNTP(25mM) 2.0μL
PCR引物(10μM) 各1μL
基因组DNA 100ng
Clontech LA酶(5U/μL) 0.5μL
加ddH2O至 25μL。
设置好PCR反应体系后,所有反应均在同一个ABI 9700型PCR仪中用同一种扩增条件进行同步扩增,循环参数如下:
95℃ 2min
95℃ 15Sec
65℃ 15Sec
72℃ 2min Sec,5个循环
95℃ 15Sec
60℃ 15Sec
72℃ 2min Sec,26个循环
95℃ 5Sec
55℃ 1min
72℃ 3min,4个循环
72℃ 15min
4℃ Infinite。
取5μL PCR产物,经cyber-greenI染色,于2%琼脂糖凝胶中电泳;对照TakaraDL2000DNA分子标记,在凝胶成像系统中观察特异性PCR产物条带。如图13所示,8例样本均只有用其等位基因特异的3’端扩增引物能扩增出目的条带.且阳性孔组合与分型结果一致。
当HLA-DQB1模棱两可结果出现在第3外显子时,采用本发明提供的一对第3外显子扩增引物(5’DQex3与3’DQex3)对DQB1的第3外显子进行扩增,扩增反应体系及程序与第2外显子一致,如图14所示,8例样本第三外显子的PCR产物条带均清晰、特异。利用上述文献提供的第2外显子和第3外显子对扩增产物进行正反双向测序引物(见表3),测序条件HLA-A、-B、-DRB1测序条件一致,测序反应体系如下:
测序引物(10μM) 0.2μL
测序模板DNA 2.0μL
ABI PRISM BigDye Terminator 1.1 0.25μl
5×BigDye Buffer 1.8μl
加ddH2O至 10μL。
测序反应程序为:
98℃ 2min
96℃ 10Sec
50℃ 5Sec
60℃ 4min,30个循环
4℃ Infinite。
测序反应完成后,在ABI 3730测序仪中电泳。
如图15所示,序列导入Assign 3.5SBT(Conexio Genomics,Western Australia)软件中,可清晰地判读出受检者的DQB1基因型。