CN103270170A - Hla-dqb1基因分型的方法及其相关引物 - Google Patents

Hla-dqb1基因分型的方法及其相关引物 Download PDF

Info

Publication number
CN103270170A
CN103270170A CN2010800708195A CN201080070819A CN103270170A CN 103270170 A CN103270170 A CN 103270170A CN 2010800708195 A CN2010800708195 A CN 2010800708195A CN 201080070819 A CN201080070819 A CN 201080070819A CN 103270170 A CN103270170 A CN 103270170A
Authority
CN
China
Prior art keywords
dqb1
hla
seq
pcr
primer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN2010800708195A
Other languages
English (en)
Other versions
CN103270170B (zh
Inventor
李剑
张现东
刘莹
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BGI Shenzhen Co Ltd
Original Assignee
BGI Shenzhen Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by BGI Shenzhen Co Ltd filed Critical BGI Shenzhen Co Ltd
Publication of CN103270170A publication Critical patent/CN103270170A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN103270170B publication Critical patent/CN103270170B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6881—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for tissue or cell typing, e.g. human leukocyte antigen [HLA] probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/172—Haplotypes

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

提供了用于扩增HLA-DQB1基因的2和/或3号外显子的方法以及所述方法中使用的特异性引物对。还提供了HLA-DQB1基因分型的方法以及所述方法中使用的扩增引物对。

Description

HLA-DQB1基因分型的方法及其相关引物 技术领域 本发明涉及分子生物学领域， 具体而言， 本发明涉及用于 HLA-DQB1基因分型的方法， 以及所述方法中使用的特异性引物。 背景技术 人类白细胞抗原， 即 HLA(human leukocyte antigen, HLA), 是 迄今为止发现的多态性最高的基因系统之一， 它是调控人体特异性 免疫应答和决定疾病易感性个体差异的主要基因系统， 与同种异体 器官移植的排斥反应密切相关。 根据 HLA基因结构和分布的特点， 分为 HLA- I、 HLA- Π和 HLA-m等三类分子， 其中 HLA- I类分子 和 HLA- Π类分子功能主要与免疫排斥相关， HLA-m类分子功能主 要与免疫相关的部分补体系统以及炎症相关因子等的合成相关。 研 究发现， 移植时， 供受双方的 HLA相关基因匹配程度越高， 分辨率 越高， 移植物的存活时间越长。
HLA-DQB1属于 HLA- Π类分子， 其基因长度 6800bp左右， 由 5个内含子和 6个外显子组成。 1996年， 就发现供受双方的
HLA-DQB1基因型别相配与否对移植物的成活率有影响， 近年来， 研究发现 DQB1位点与扩张性心肌症， 病毒性乙型肝炎， 糖尿病， 银屑病等多种疾病的罹患率及预后相关。
目前国际标准的 HLA分型技术包括 PCR-SSP (序列特异引物聚 合酶链式反应）， PCR-SSO (聚合酶链式反应寡核苷酸探针杂交)和 PCR-SBT (聚合酶链式反应产物直接测序分型）。
HLA-SSP的原理是设计出一整套等位基因组特异性引物， 借助 PCR技术获得 HLA型别特异的扩增产物， 通过电泳分析决定 HLA 型别。 HLA-SSO的原理是设计 HLA型别特异的寡核苷酸序列作为 探针， 把 PCR产物标记， 以 PCR产物 （待检测基因 DNA ) 与探针 杂交。通过检测荧光信号判断 HLA型别。 HLA-SSP和 HLA-SSO的 检测信号均是模拟信号， 分辨率只能到达中低水平且都不能检测新 的等位基因。 HLA-SBT ( Sequence-based typing )分型技术是通过对 HLA相 关基因序列测序， 从而判断 HLA基因型别的高分辨分型方法， 具有 直观、 高分辨且能检测新的等位基因的特点。 但现有的 HLA-SBT 是采用 Sanger法测序 （毛细管微电泳） ， 整个实验流程复杂、 通量 低和实验成本高等缺点使其很难应用于大规模 HLA高分辨分型项 目。
基于以 Illumina Solexa和 Roche 454为代表的第二代测序技术 (以下简称新测序技术） 的 HLA-SBT也是一种通过对 PCR扩增后 的 DNA产物直接测定核酸序列， 从而判断 HLA基因型别的高分辨 分型方法， 其除了原有直观、 高分辨且能检测新等位基因的特点外， 还具有单分子测序、 实验流程筒单、 高通量和低成本的特点。 但与 第一代测序技术（以 Sanger法测序原理为基础的测序技术）相比， 能用于新测序技术测序文库制备的 DNA 长度不能太长 （ 当前 Illumina Solexa的最大适用长度为 700bp )， 且新测序技术读长普遍 偏短， 当前 Illumia GA双向读长最大能达到 300bp。
鉴于新测序技术的特点， PCR产物的长度不宜超过 700bp, 原 基于 Sanger法测序方法的 HLA-SBT的 PCR引物不再适用。 因此， 有必要设计一套保守性和特异性良好且 PCR产物长度满足新测序技术 要求的引物。 发明内容 为了将第二代测序技术用于 HLA-DQB1基因分型，本发明提供了 用于扩增 HLA-DQB1的 2和 /或 3号外显子的 PCR引物， 它们是表 1中显示的 SEQ ID NO: 1-4。 所述 PCR引物具有良好的保守性和 特异性， 并且可覆盖 HLA-DQB1位点 2、 3号外显子全长序列， PCR 产物长度均小于 700bp， 满足正常 Illumina Solexa测序要求。 另外， 本发明的引物还适用于 Sanger法测序。
表 1. 用于扩增 HLA-DQB1相应外显子的 PCR引物:
SEQ ID 引物 引物序列 HLA-DQB1 扩增产 NO: 编号 外显子 长度物
1 Q-F2 GATTCCYCGCAGAGGATTTCG
2号 311bp
2 Q-R2 AGGGGCRACSACGCTCACCTC
3 Q-F3 CCTGTCTGTTACTGCCCTCAGT
3号 339bp
4 Q-R3 GGCCCATAGTAACAGAAACTCAATA 本发明还提供了一种新的 HLA-DQB1的 2和 /或 3号外显子扩增 方法， 其特征在于使用本发明的扩增引物对进行 PCR扩增， 所述扩增 引物对的序列示于表 1。
由于能够通过 PCR反应扩增出 HLA-DQB1的 2和 /或 3号外显子， 因此， 本发明的方法特别有利地可用于进行 HLA-DQB1基因分型。 与 现有的 0LA-DQB1基因分型方法相比， 由于使用本发明的方法和扩增 引物的产物被控制在 300-400bp之间， 因此在进行进一步分型时， 可以 利用基于 Illumina Solexa测序技术的 HLA-SBT。
在本发明的第三方面中， 提供了一种对样品中的 HLA-DQB1的 2和 /或 3号外显子进行测序的方法， 其包括步骤：
1 ) 提供一个样品并提取该样品的 DNA;
2 ) 将表 1中的 PCR引物用于扩增所述 DNA从而得到 PCR产 物， 优选对 PCR产物进行纯化；
3 ) 对所述 PCR产物进行测序，测序方法可以是第二代测序法， 例如 Illumina Solexa或 Roche454„
在本发明的第四方面中， 本发明提供了一种改进的 HLA-DQB1 基因分型方法， 所述方法包括：
1) 使用本发明的 PCR扩增引物对扩增待测的 HLA-DQB1的 2 和 /或 3号外显子，
2)对扩增出的外显子进行测序， 并将测序结果与数据库中的标准 序列进行比较， 从而确定基因分型结果。 其中测序方法可以是 Sanger 测序法， 或者可以是第二代测序法， 所述第二代测序方法例如
Illumina Solexa或 Roche 454.
另一方面， 本发明还提供了一种用于进行 HLA-DQB1基因分型的 试剂盒， 所述试剂盒中包含本发明的 PCR扩增引物对。 在一个实施方 案中， 所述试剂盒还包含其他试剂， 例如用于 DNA扩增、 DNA纯化和 /或 DNA测序的试剂。
应用本发明提供的扩增引物对和基因分型方法， 能够在扩增
HLA-DQB1的 2和 /或 3号外显子的基础上进行基因分型。 相对于现 有技术而言， 该分型方法利用了 Illumina Solexa测序技术， 该技术具 有可高通量、 低成本地获得高分辨的 HLA分型结果的特点。 附图说明 图 1为 94个样本 HLA-DQB1 2+3外显子 PCR产物电泳结果， 从 电泳图上看， PCR产物片段大小为位于 250bp-500bp之间的单一条带， 其中泳道 M是 DNA标准分子量参照物 （DL 2000, Takara公司） ， 泳 道 PI-1至 PI-94为 94个样本的 HLA-DQB1 2+3外显子 PCR扩增产物， 阴性对照 （N )无扩增条带。
图 2显示对 HLA-Q-Mix打断后 DNA电泳凝胶割胶的情况， 割 胶区域为 350-550bp区域。 其中泳道 M是 DNA标准分子量参照物 ( EB-50bp DNA Ladder ) , 泳道 1示出割胶前 HLA-Q-Mix的胶 图， 泳道 2示出割胶后 HLA-Q-Mix的胶图。
图 3示出 7号样本一致性（consensus )序列构建程序部分截图， 示例性说明了数据分析的主要流程。 首先， 该样本的 DQB1位点的 测序序列通过 BWA软件比对到参考序列上，构建出该样本 DQB1 2,3 外显子的一致性序列，再根据 SNP之间的连锁关系来确定 DQB1 2,3 外显子单体型序列。如图所示：在 7号样本 DQB1基因序列 2322-2412 区域含有 6个杂合 SNP, 由 readl可确定 SNP1-SNP5的连锁关系为 T-G-T-C-C，由 read2 可确定另一组 SNP1-SNP5 的连锁关系为 C-C-A-G-T, 由 read3可确定 SNP3-SNP6的连锁关系为 A-G-T-G，由 read4 可确定另一组 SNP3-SNP6 的连锁关系为 T-C-C-A,通过上述 SNP的连锁关系可确定 readl与 read4连锁， read2与 read3连锁， 在此区域完整的 SNP组合为： T-G-T-C-C-A和 C-C-A-G-T-G, 其序 列对应 DQB1*0303和 DQB1*0602型别序列的阴影部分。 其它区域 的连锁关系的判定与此类似。
图 4示例性显示了两对 PCR引物分别单独扩增 HLA-DQB1位 点 2和 3号外显子和同时扩增 2和 3号外显子产物电泳图， 图中显 示来自 7个 DNA模板的三組 PCR产物，所有 PCR产物长度均小于 500bp, 且电泳条带单一， 无明显的非特异性条带。 阴性对照 （N ) 无扩增条带，泳道 M是 DNA标准分子量参照物 （DL 2000， Takara 公司 ) 。
图 5示例性显示了 HLA-DQB1扩增 7 号模板 2和 3号外显子的 PCR 产物的测序峰图经 uType 软件分析的结果， 左侧结果输出栏中显示 DQB1*03:03 DQB1*06:02的结果， 与 7号模板原已知结果相同。 具体实施方式 下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。 本领域技 术人员应理解， 下列实施例仅用于说明本发明， 而不应视为限定本发 明的范围。
本发明采用如下方法设计扩增 HLA-DQB1的 2和 /或 3号外显子 的 PCR引物对，从 IMGT/HLA因特网站点下载所有最新 HLA-DQB1 基因序列， 然后保存到本地磁盘中做为 HLA-DQB1数据集； 同时下栽 所有最新非 HLA-DQB1的 HLA-II类基因序列做为比较数据集。 将两 数据集进行比较， 在 2， 3号外显子两端和内部寻找各基因位点保守和 特异序列，并将设计的 PCR引物序列与人类全基因组序列进行同源性 比较。 在设计 PCR引物时尽量保证引物 3，末端特异， 确保引物扩增 HLA-DQB1基因的特异性。 同时使 PCR产物的长度小于 700bp, 且正 反引物的退火温度基本保持一致。
将满足设计要求的多对候选 HLA-DQB1引物用于扩增少数具有 HLA-DQB1常见血清型的模板 DNA,从中筛选出保守性和特异性最好 的， 分别用于扩增 2和 3号外显子的 2对 HLA-DQB1的 PCR引物。
本发明中涉及的 DNA扩增方法、 从样品提取 DNA的方法、 DNA 述方法可以由本领域技术人员'根据^具体情况进行选择。 DNA测序 的方法， 本领域技术人员可以根据常规的方法进行， 或者根据测序仪 器的使用说明书进行。
例如， 在利用二代测序技术进行测序过程中， 可以使用 5，末端添加 引物标签（ primer index )序列的标签引物进行， 可以将扩增后的 PCR 产物进行打断， 并且打断后产物进行末端修复并在其 3，端连接脱氧腺苷 ( A ) ， 然后连接不同的 PCR-free接头。
在扩增引物前端连接一段标签序列是为了实现同时对多个样品进行 测序。 具体而言， 可以结合 PCR-index/barcode技术， 通过在 PCR引物 的 5，末端添加引物标签（ primer index )序列合成标签引物， 在 PCR过 程中对每个样本引入独特的引物标签。这样，在利用第二代 DNA测序技 术检测过程中， 除 PCR环节必须逐个样本处理外， 其它实验环节可把多 个样本混在一起同时处理， 最终每个样本的检测结果可以通过其独特的 引物标签序列找回。引物标签的设计根据所应用的实验平台不同而不同， 考虑 Illumina GA测序平台本身的特点， 本发明在设计引物标签时主要 考虑了以下几点： 1: 引物标签序列中避免 3个以上（包括 3个）单碱基 重复序列， 2: 所有引物标签的同一位点中碱基 A和碱基 C的总含量占 所有碱基含量的 30%-70%之间， 3: 引物标签序列本身的 GC含量在
40-60%之间， 4: 引物标签之间序列差异度大于 4个碱基， 5: 引物标签 序列中避免出现与 Illumina GA测序引物相似度高的序列， 6: 减少引物 标签序列添加到 PCR引物上后，对 PCR引物造成的严重发卡（ hairpin )， 二聚体（dimer ) 情况的出现。
术语" PCR-Free文库接头（adapter ) "是指经设计的一段碱基， 其主 要作用是辅助固定 DNA分子在测序芯片上以及提供通用测序引物的结 合位点， PCR-Free文库接头可以通过 DNA连接酶将其直接连接至测序 文库中的 DNA片段两端，接头的导入过程因为没有 PCR的参与， 因此称 作 PCR-Free文库接头。 "接头（ adapter ) "或"文库接头（ library adapter )" 标签技术是指通过对多个测序文库添加不同文库接头 （不同文库接头的 组成序列不同， 序列不同的部分称为接头标签（adapter index ) ) ， 构 建标签测序文库， 从而可实现多个不同标签测序文库混合测序， 且最终 各个标签测序文库的测序结果可相互区分的一种文库标签技术。 例如， 本发明实施例中使用 PCR-FREE文库接头来自 ILLUMIA。
在如下的实施例中，用筛选出的 2对 PCR引物，对 94例已知 HLA 常见基因型别的血样进行 HLA-DQB1位点 PCR扩增， 扩增产物经
Sanger法和第二代测序方法进行测序。 将测序结果用于 HLA-DQB1 分型， 并通过与原分型结果比较来验证 PCR引物的保守性和特异性。
实施例 1: 用第二代测序技术（ Illumina Solexa )进行 HLA-DQB1 因分型
1. 样本提取
使用 KingFisher自动提取仪（美国 Thermo公司） 从 94份已知 HLA-SBT分型结果的血样（中国造血干细胞捐献者资料库，也称为 "中 华骨髓库"） 中提取 DNA。 主要步骤如下： 取出 6个 Kingfisher自动 提取仪配套的深孔板及 1个浅孔板， 根据说明书分别加入一定量配套 的试剂并做好标记，将所有已加好试剂的孔板按要求置于相应的位置， 选定程序" Bioeasy_200 l Blood DNA_KF.msz，，程序，按下" star"执行该 程序进行核酸提取。 程序结束后收集 plate Elution中的 100 μΐ左右的 洗脱产物即为提取的 DNA。 2. PCR扩增
通过合成在 5，末端具有不同引物标签的 PCR引物制作不同的 PCR标签引物， 这样不同的 PCR标签引物可以用于不同的样本， 所 述 PCR引物是针对 HLA-DQB1的 2和 3号外显子的 PCR扩增引物。 其后通过 PCR反应在 PCR产物两端引入引物标签， 从而特异地标记 了来自不同样本的 PCR产物。
以 94套 PCR标签引物来分别扩增 94份 DNA样本，每套 PCR标 签引物由用于扩增 HLA-DQB1的 2或 3号外显子的 PCR引物（表 1 ) 和一对双向引物标签（表 2 )组成， 其中每个正向 PCR引物的 5，末端 上连接一对引物标签的正向引物标签，而反向 PCR引物的 5，末端上连 接一对引物标签的反向引物标签。 引物标签在引物合成时直接添加在 PCR引物的 5，末端， 引物由上海英潍捷基（ Invitrogen )公司合成。
把样本提取步骤中所得的 94份 DNA， 依次编号 1-94， PCR反应 在 96孔板中进行， 每个样本的 DQB1 2，3外显子在同一个反应孔中进 行扩增。 板内设置两个不添加模板的阴性对照， 阴性对照所用引物对 应标签号为 PI-95和 PI-96。 实验的同时， 记录下每对引物标签对应的 样本编号信息。
表 2. 引物标签的相关信息:
引物标 对应 96
正向引物标签 反向引物标签 对应模板 签编号 孔板位置
PI-1 TCGCAGACATCA TGACACGATGCT A1 1
PI-2 TACATCGCACTA TACAGATGCTGA A2 2
PI-3 CTCGATGAGTAC ACGTCTAGACAC A3 3
PI-4 TCTGTATACTCA TGCTGTAGTGAC A4 4
PI-5 TATCTGCTCATA AGATATCGAGCT A5 5
PI-6 TACATGCTGAGC ACGTGTCTATCA A6 6
PI-7 TCATATCGCGAT AGATCGTATAGC A7 7
PI-8 ACAGATGCACGC ATCTCGTGACAG A8 8
PI-9 TAGATCGTACAT ACTAGTACACGC A9 9
PI-10 ACTACACGTCTC ATAGTCACGCGT A10 10
PI-11 AGACTCGCGTAT TACTAGCTGACG All 11
PI-12 ATACTAGTGCTC TGTATCGTGCTC A12 12
PI-13 CACGATGACATC TAGTGAGCGCAC B1 13
PI-14 TGCTGTCTCGAG CATAGCAGTGTC B2 14
PI-15 TGTGCTCGAGTC TCTGATCGAGCA B3 15
PI-16 CACTCGTACATC AGCGATGCTCAT B4 16
PI-17 CGACGTGCTCGC CGCGTACTGCAG B5 17
PI-18 ACGCATCTATAC CTAGTATCGCAG B6 18
PI-19 CGAGATGACTCT TGTATACACGAT B7 19
PI-20 ACTGTCTCGAGC ACGTAGCGCACA B8 20 69 6Λ VX3XDV3VXOV3 69-Id
89 XV3XDOXOX3V3 03X31V0XVX0X 89-W
L9 £Λ 3X301VDVX9DX V 3V0X0XV3VX L9 ld
99 9Λ 丄:) 丄 X3010DX3V3VX 99-W
S9 Sd VXVOIOI3IOD1 X3X VXVOVJV1 S9"Id t9 d V03XVXV3I3V3 IV3I30V03V3V fr9 Id
£9 £Λ V3D3XV1V3X3V £9-ld
Z9 ΖΛ V0X0VXVX03VD 3VOXODX3VX31 Z9-ld
19 ΙΛ 3I01VDVIV3V1 X3XVXOX3VXV3 T9-U
09 ΖΪΉ V0X3V3IVI30I 03V0XDI03I3V 09-Id
6S ΙΤ3 VXVDI0V03D3V OYDIDDY OIDY 6S Id
8S 0X3 VOV3V03XOX03 8S-Id m 6Ή 039VX3DJV 31 IS Id
83 VOXVO OVIVX OVDDXVXV3X03 9S-W ίΆ 3VXVX0303V0X ：) 丄 SS-Id
93 VXDVXDVOIV3X 3VX3D313V03V
es S3 0V0XVI03VJVX DVDJXVXV30VI es-id zs Ά VX03V0X30VX3 OVXVXOVOXVD zs-id
IS £3 VOi lVi :)iV丄：)丄 IS-Id
OS ΖΆ X3XVXVOVDOXV 工：) J^VIVIODVO OS Id
6P \Ά VOV3VXVOXD3X ： LVI3V丄 VOiDV:)
SP VDVXDXOVXODX
LP ιια IV丄 OODVlV i):) 工:) liDVIDVIV L -ld
9t οτα 3XV3VODX3XDI V3V13V3X3DD1
SP 6α DVX3VOVIV3X3 Sf ld ft βα VDXVXOVXVOX3 DXOVOX3X3VOV tt-ld i L XVXV0I30V0DV £t-ld
ZP 9α 3XVOV3VOXD3X 130丄:) 3丄 丄 Zf-ld
It s 303DVDVIV30X 丄:) Xfr-Id
Of α VDDV9V3013V3 3VXV3IVX30V3 Ο -ld
6£ εα 3I30X0V0V30V 93XVOVOXVXV3 6£Id
8£ ζα 丄 VOVIDOV V310VXDX3V3V 8£-IJ
L£ τα 3V9DXVX3X3V3 L£-ld
9ε ZID V3VXDOXVXVOX D030VX0X0V3V 9£Id
S£ U3 VD3XOVXVX3V1 VXDX3V9VX303 se-id
OTD ODV3X3VOXV3V 3XVX30X03X0X
εε 63 VX03V3X3VXV3 OVX3VXVXODOV ££-Id
83 ：) 丄 丄 VOIOVOV ZilA
L3 DVOVOXVODDVX 03V3XV3V0J03 τε-id οε 93 IVIODXDIVDVI οε-id
6Ζ S3 DVOV X3VXV3V V1 i)Vi)丄：) 6ZIJ
SZ PD JOVJL )丄 OVOODV D3VOX3VXOVX3 Slid
LZ £3 3V3VOVXVOIOX VXV3XV13VXOX LZ-ld
91 ZD XV1DXOVXDOX3 9Z-IA
SZ 13 XVOV1V3V3DV3 XVX3XDI3VJVI
ΡΖ zia ) V:>丄 f)i:>i)Vf)Vl X30I03XV3I3V Z-ld
£Ζ iia 3V0XVX30I3XV VXDV3VXV0V01 £Z-ld ζζ oie XV0X3V30XVI3 V0V13X3V303V IZ-\A ιζ 6a VOIV3XDOVX3X 工 VI OJ^IVO MIASTZ00/010ZN3/X3d 90SC80/ZT0Z OAV PI-70 CATACTATCACG TCGTGTCACTAC F10 70
PI-71 CACTATACAGAT CGACACGTACTA Fll 71
PI-72 ATATCGTAGCAT TCGTGATCACTA F12 72
PI-73 TAGTCTATACAT AGACGCTGTCGA Gl 73
PI-74 TGTCACAGTGAC TCATATGATCGA G2 74
PI-75 ATCGACTATGCT CGATCATATGAG G3 75
PI-76 ATACTAGCATCA TCATGCTGACGA G4 76
PI-77 CACTGACGCTCA CACTACATCGCT G5 77
PI-78 TCGCTCATCTAT TAGTACAGAGCT G6 78
PI-79 TGTATCACGAGC ATGATCGTATAC G7 79
PI-80 TACTGCTATCTC CGCTGCATAGCG G8 80
PI-81 CGCGAGCTCGTC ACTCGATGAGCT G9 81
PI-82 TAGAGTCTGTAT TGTCTATCACAT G10 82
PI-83 TACTATCGCTCT TATGTGACATAC Gil 83
PI-84 TAGATGACGCTC TACTCGTAGCGC G12 84
PI-85 TCGCGTGACATC ATCTACTGACGT HI 85
PI-86 ACACGCTCTACT ACAGTAGCGCAC H2 86
PI-87 TACATAGTCTCG CTAGTATCATGA H3 87
PI-88 TGAGTAGCACGC TCGATCATGCAG H4 88
PI-89 TAGATGCTATAC TACATGCACTCA H5 89
PI-90 ATCGATGTCACG CAGCTCGACTAC H6 90
PI-91 ATCATATGTAGC CTCTACAGTCAC H7 91
PI-92 TAGCATCGATAT AGATAGCACATC H8 92
PI-93 TGATCGACGCTC CTAGATATCGTC H9 93
PI-94 TGCAGCTCATAG TACAGACTGCAC H10 94
PI-95 CGACGTAGAGTC CAGTAGCACTAC Hll 阴性对照
PI-96 CACTGTATAGCT CGACTAGTACTA H12 阴性对照
HLA-DQBl的 PCR程序如下：
96 °C 2分钟； 95°C 30秒 30秒" >72°C 20秒 (32个循环）; °C∞。
HLA-DQBl的 PCR反应体系如下：
其中 PInf-Q-F2/3表示引物 5，末端带有第 n号正向引物标签序列 (表 1 ) 的 HLA-DQB1的 F引物， PInf-Q-R 2/3表示引物 5，末端带 有第 n号反向引物标签序列的 HLA-DQB1的 R引物 （此处 n≤96 ) ， 其它依次类推。 且每个样本对应特定的一套 PCR引物。
PCR反应在 Bio-Rad公司的 PTC-200 PCR仪上运行。 PCR完成 后， 取 2 l PCR产物经 1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测。 图 1显示了 94 个样本 HLA-DQB1 2+3外显子 PCR产物电泳结果， DNA标准分子量 参照物 （M ) 为 DL 2000 ( Takara公司） 。
3. PCR产物混合和纯化
从 96孔板 HLA-P-DQB1剩余的 PCR产物中 （阴性对照除外）各 取 20 μΐ混合在一个 3 ml的 ΕΡ管中，标记为 HLA-Q-Mix并混合均匀。 从 HLA-Q-Mi 中取 500 μΐ DNA混合物经 Qiagen DNA Purification kit 过柱纯化 （具体纯化步骤详见说明书） ， 纯化所得的 200 μ1 ϋΝΑ， 经 Nanodrop 8000(Thermo Fisher Scientific公司）测定 HLA-Q-Mix DNA 浓度为 48 iig/ l。
4. PCR产物的打断以及 Illumina GA PCR-Free测序文库的构建 1 ) DNA打断
从纯化后的 HLA-Q-Mix中取总量 5 的 DNA 用 Covaris microTube with AFA fiber and Snap - Cap在 Covaris S2(Covaris公司 ) 上打断。 打断条件如下：
频率扫描 ( frequency sweeping )
2 )打断后纯化
将 HLA-Q-Mix的所有打断产物用 QIAquick PCR Purification Kit 回收純化， 分别溶于 37.5 μΐ的 EB ( QIAGEN Elution Buffer ) 中；
3 )末端修复反应
对纯化的产物进行 DNA末端修复反应， 体系如下 （试剂均购自 Enzymatics公司 ) ：
上一步骤纯化的产物 37.5 μΐ lOx多核苷酸激酶緩冲液（Β904 ) 5 μΐ
dNTP混合物 （每种 10 mM ) 2 μΐ
T4 DNA聚合酶 2.5 μΐ
Klenow片段 0.5 μΐ
T4多聚核苷酸激酶 2.5 μΐ 总体积 50 μΐ
反应条件为： 在 20 Ό下， 在 Thermomixer(Eppendorf公司）中温 浴 30分钟。
反应产物经 QIAquick PCR Purification Kit回收纯化， 溶于 34 μΐ 的 ΕΒ ( QIAGEN Elution Buffer ) 中。
4 ) 3，末端加 A反应
上一步回收 DNA的 3，末端加 A反应， 体系如下 （试剂均购自 Enzymatics公司 ) ：
反应条件为： 在 37°C下， 在 Thermomixer中温浴 30分钟。
反应产物经 MiniElute PCR Purification Kit ( QIAGEN公司） 回 收纯化， 溶于 13 μΐ的 ΕΒ溶液（ QIAGEN Elution Buffer ) 中。
5 )连接 Illumina G A PCR-Free文库接头 （adaptor )
加 A后的产物连接 Illumina GA PCR-Free文库接头，体系如下（试 剂均购自 Illumina公司） ：
反应条件为： 在 16°C下， 在 Thermomixer中温浴过夜。
反应产物经 Ampure Beads(Beckman Coulter Genomics)纯化后溶 于 50 μΐ去离子水， 经荧光定量 PCR ( QPCR )检测到 DNA浓度结果 如下:
6 )割胶回收
取 30 μΐ HLA-Mi 用 2%低熔点琼脂糖胶进行回收。 电泳条件为 100V, 100分钟。 DNA标准分子量参照物为 NEB公司的 50 bp DNA ladder. 割胶回收 350-550 bp长度范围的 DNA片段（图 2 ) 。 胶回收 产物经 QIAquick PCR Purification Kit ( QIAGEN公司） 回收纯化， 纯化后体积为 32 μ1， 经荧光定量 PCR ( QPCR )检测到 DNA浓度结 果为 18.83 nM。
5. Illumina GA测序
根据 QPCR检测结果，取 10 pmol DNA用 Illumina GA PE-100程 序测序， 具体操作流程详见 Illumina GA操作说明书 （Illumina GA H x ) 。
6. 结果分析
Illumina GA产出的测序结果是一系列 DNA序列， 通过查找测序 结果中的正反引物标签序列和引物序列， 建立各个引物标签对应样本 HLA-DQB1各外显子 PCR产物测序结果的数据库； 通过 BWA (Burrows-Wheeler Aligner)把各外显子的测序结果定位在相应外显子 的参考序列上 （参考序列来源： http：〃 www.ebi.ac.uk/imgt/hla/ ) , 并 构建各个数据库的一致性（consensus )序列； 结合碱基测序质量值和 测序序列与 consensus序列的差异度，对测序序列进行筛选和测序错误 校正； 以及校正后的 DNA序列通过序列重叠 （overlap )和连锁
( Pair-End连锁） 关系可组装成 HLA-DQB1 2,3外显子相应的序列。 图 3的截图示例性说明了对 7号样品的 HLA-DQB1位点的 2号外显子 一致性序列进行构建的过程。
将所测序的 HLA-DQB1 2,3外显子的 DNA序列与 IMGT HLA专 业数据库中 HLA-DQB1相应外显子的序列数据库比对，序列比对结果 100%匹配的即为对应样本的 HLA-DQB1基因型别。
所有 94个样本， 得到的分型结果与原已知分型结果完全相符， 其 中 1-32号样本的具体结果下表 3中。
表 3. 1-32号样本的分型结果： 样本编号 原 DQB1基因型别 本次 DQB1检测结果 是否相同
1 DQB1*02:02 DQB1*03:01 DQB1*02:02 DQB1*03:01 是
2 DQB1*02:02 DQB1*04:01 DQB1*02:02 DQB1*04:01 是
3 DQB1*05:02 DQB1*02:02 DQB1*05:02 DQB1*02:02 是
4 DQB1*02:02 DQB1*06:03 DQB1*02:02 DQB1*06:03 是
5 DQB1*03:03 DQB1*04:02 DQB1*03:03 DQB1*04:02 是
6 DQB1*05:02 DQB1*03:17 DQB1*05:02 DQB1*03:17 是
7 DQB1*03:03 DQB1*06:02 DQB1*03:03 DQB1*06:02 是
8 DQB1*05:03 DQB1*04:02 DQB1*05:03 DQB1*04:02 是
9 DQB1*04:02 DQB1*06:01 DQB1*04:02 DQB1*06:01 是
10 DQB1*05:01 DQB1*06:10 DQB1*05:01 DQB1*06:10 是
11 DQB1*03:01 DQB1*03:03 DQB1*03:01 DQB1*03:03 是
12 DQB1*05:01 DQB1*05:01 DQB1*05:01 DQB1*05:01 是
13 DQB1*02:02 DQB1*04:02 DQB1*02:02 DQB1*04:02 是
14 DQB1*05:02 DQB1*02:01 DQB1*05:02 DQB1*02:01 是
15 DQB1*02:01 DQB1*06:02 DQB1*02:01 DQB1*06:02 是
16 DQB1*03:03 DQB1*04:01 DQB1*03:03 DQB1*04:01 是
17 DQB1*05:01 DQB1*03:02 DQB1*05:01 DQB1*03:02 是
18 DQB1*03:03 DQB1*06:01 DQB1*03:03 DQB1*06:01 是
19 DQB1*03:03 DQB1*06:10 DQB1*03:03 DQB1*06:10 是
20 DQB1*05:03 DQB1*04:01 DQB1*05:03 DQB1*04:01 是
21 DQB1*05:02 DQB1*04:01 DQB1*05:02 DQB1*04:01 是
22 DQB1*03:01 DQB1*03:03 DQB1*03:01 DQB1*03:03 是
23 DQB1*05:02 DQB1*05:03 DQB1*05:02 DQB1*05:03 是
24 DQB1*05:02 DQB1*03:02 DQB1*05:02 DQB1*03:02 是
25 DQB1*03:03 DQB1*06:01 DQB1*03:03 DQB1*06:01 是
26 DQB1*05:02 DQB1*06:09 DQB1*05:02 DQB1*06:09 是
27 DQB1*02:02 DQB1*06:02 DQB1*02:02 DQB1*06:02 是
28 DQB1*05:02 DQB1*03:01 DQB1*05:02 DQB1*03:01 是
29 DQB1*02:01 DQB1*03:01 DQB1*02:01 DQB1*03:01 是
30 DQB1*06:03 DQB1*06:09 DQB1*06:03 DQB1*06:09 是
31 DQB1*05:02 DQB1*02:02 DQB1*05:02 DQB1*02:02 是
32 DQB1*05:01 DQB1*06:01 DQB1*05:01 DQB1*06:01 是 实施例 2. 用 Sanger法测序进行 HLA-DQB1基因分型
1. 样品 DNA提取
如实施例 1中所述相似， 以 KingFisher自动提取仪提取的 94例 样本中的 20例已知 HLA基因型别的 DNA。
2. PCR扩增
以上述 KingFisher自动提取仪提取的 DNA为模板， 以 Q-F2和 Q-R2、 Q-F3和 Q-R3共 2对 PCR引物分别单管 PCR扩增， 各对引物 PCR程序如下： 96°C 2分钟； 95。C 30秒 56°C 30秒 72。C 20秒 (35 循环）； 15 °C∞。
HLA-Q的 PCR反应体系如下:
PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后， 准备纯化。
3. PCR产物纯化
利用 millipore纯化板进行 PCR产物纯化。 基本步骤是： 用记号 笔在 96孔 PCR产物纯化板上标记需要使用的孔， 并向需要使用的孔 中加入 50 μΐ超纯水， 剩余孔粘贴封口膜， 室温静置 15分钟或连接到 抽滤系统上， -10帕， 5分钟取下， 每次从抽滤系统上取下纯化板时都 要在吸水纸上吸干残留在纯化板底部排液口的液体。
待纯化 PCR产物离心， 4000 rpm, 1分钟； 打开待纯化 PCR产物 的盖子或硅胶垫，每个 PCR反应体系中加入 100 μΐ超纯水。 然后把加 入待纯化 PCR产物的纯化板连接到抽滤系统上，调节真空度至气压表 显示 -10 Pa，抽滤至純化板底部的微孔再生纤维膜上无液体，光照下观 察， 无完整液面反射光泽。
向有待纯化 PCR产物的孔中加 50 μΐ超纯水或 ΤΕ到微孔再生纤 维膜上； 室温下使用微量振荡器中档振荡纯化板 5分钟， 转移相应孔 内全部液体至新的 96孔 PCR板对应的孔中。
4. 进行测序反应并纯化测序反应产物
以上述纯化后的 PCR产物为模板做测序反应， 测序反应条件是： 96 "C 2分钟； 96°C 10秒 55 °C 5秒 60 °C 2分钟 （25个 循环）； 15°C ∞。
测序反应的体系是：
5*Buffer 0.85 μΐ
水 1.85 μΐ
总体积 5 μΐ
通过以下步骤纯化测序反应产物：取下测序反应板配平，离心 3000 g, 1分钟。 96孔板每 5 μΐ反应体系加 0.125 mol/L EDTA-Na2溶液 2 μΐ, 85%乙醇 33 μ1， 盖上硅胶垫， 充分振荡 3分钟， 在 4*Ό下以 3000 g离 心 30分钟。 离心结束后取出测序板， 打开硅胶垫， 将测序反应板倒置 吸水纸上，倒离心至离心力达到 185 g时立即停止。 96孔板每孔加 70% 乙醇 50 μ1， 盖上硅胶垫， 振荡 1.5分钟， 在 4。C下以 3000 g离心 15分 钟。 测序反应板置避光通风处 30分钟， 风干至无乙醇气味。 96孔板 每孔加 ΙΟ μΙ ( 384孔板每孔加 8 μ1 ) HI-DI甲酰胺， 盖封口膜， 振荡 5 秒后离心至 1000 rpm。
5. 测序和结果分析
纯化后的测序反应产物在 ABI 3730XL上进行毛细管电泳测序， 测序峰图经过 uType软件 (Invitrogen)分析（图 5)，得到 HLA分型结果。 全部检测结果与原有检测结果相同 （表 4 ) 。
表 4. 本次分型结果与样本原来分型结果对比:
对于本领域技术人员显而易见的是， 在不背离本发明的范围和精 神的前提下可对本发明进行各种修改和变动。 通过考虑本发明在此所 公开的说明书和实例， 本发明的其他实施方案对本领域技术人员来说 是显而易见的。 本说明书和实施例应仅看作示例性用途， 本发明真正 的范围和精神在所附的权利要求书中说明。
参考文献
[1], http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla/stats.html.
[2]. Tiercy J M. Molecular basis of HLA polymorphism:
implications in clinical transplantation. Transpl Immunol, 2002, 9:
173-180.
[3]. C.Antoine, S.Muller, A.Cant, et al. Long-term survival and transplantation of haemopoietic stem cells for immunodenciencies:
report of the European experience. 1968-99. The Lancet,
2003,9357:553-560.
[4]. H. A. Erlich, G. Opelz, J. Hansen, et al. HLA DNA Typing and
Transplantation. Immunity, 2001,14:347-356.
[5]. Lillo R， Balas A, Vicario JL, et al. Two new HLA class allele, DPB1*02014, by sequence-based typing. Tissue Antigens, 2002, 59:
47-48.
[6]. WU， D. L. et al. Comparative analysis of serologic typing and
HLA-II typing by micro-PCR-SSP. Di Yi Jun Yi Da Xue Xue Bao, 2002 22:247-249.
[7]. Al- Hussein K A, Rama N R, Butt A I， et al. HLA class II sequence based typing in normal Saudi individuals. Tissue Antigens, 2002， 60: 259- 261.
[8]. Elaine R. Mardis. The impact of next-generation sequencing technology on genetics. Trends in Genetics.2008,24: 133-141.
[9]. D. C. Sayer, D. M. Goodridge. Pilot study: assessment of interlaboratory variability of sequencing-based typing DNA sequence data quality. Tissue Antigens, 2007， 69 Suppl: 66-68.
[10]. Horton V, Stratton I， Bottazzo G. F. et al. Genetic
heterogeneity of autoimmune diabetes: age of presentation in adults is influenced by HLA DRB1 and DQB1 genotypes. Diabetologia, 1999， 42:608-616.
[11]. C.E.M. Voorter, M.C. Kikl, E.M. van den Berg-Loonen et al. High-resolution HLA typing for the DQBl gene by sequence-based typing. Tissue Antigens, 2008, 51:80-87.
[12]. G. Bentley, R. Higuchi, B. Hoglund et al. High-resolution, high-throughput HLA genotyping by next-generation sequencing.
Tissue Antigens, 2009， 74: 393-403.

Claims (1)

  1. 权 利 要 求 书
    1. 具有 SEQ ID NO: 1至 SEQ ID NO: 4任一项所示序列的多核 苷酸。
    2. 一种 HLA-DQB1的 2和 /或 3号外显子扩增方法， 其特征在 于使用 SEQ ID NO: 1和 SEQ ID NO: 2; 以及 /或者 SEQ ID NO: 3和 SEQ ID NO: 4的引物对进行 PCR扩增。
    3. 一种对样品中 HLA-DQB1的 2和 /或 3号外显子进行测序的 方法， 其包括步骤：
    1 ) 提供一个样品并提取该样品的 DNA;
    2 ) 将 SEQ ID NO: 1和 SEQ ID NO: 2; 以及 /或者 SEQ ID NO: 3和 SEQ ID NO: 4的引物对用于扩增所述 DNA从而得到 PCR产物， 优选对 PCR产物进行纯化；
    3 ) 对所述 PCR产物进行测序。
    4. 权利要求 3的方法， 其中所述样品是血样。
    5. 权利要求 4的方法， 其中所述血样来自哺乳动物或人。
    6. 一种 HLA-DQB1基因分型方法， 所述方法包括：
    1)使用 SEQ ID NO: 1和 SEQ ID NO: 2; 以及 /或者 SEQ ID NO: 3和 SEQ ID NO: 4的引物对进行 PCR扩增， 扩增待测样本的
    HLA-DQB1的 2和 /或 3号外显子；
    2)对扩增出的外显子进行测序， 并将测序结果与数据库中的标准 序列进行比较， 从而确定基因分型结果。
    7. 权利要求 3或 6的方法， 其中所述测序是通过 Sanger测序法 或第二代测序法。
    8. 权利要求 7的方法， 其中所述第二代测序方法是 Illumina Solexa或 Roche454。
    9. 一种用于进行 HLA-DQB1基因分型的试剂盒， 所述试剂盒中 包括 SEQ ID NO: 1和 SEQ ID NO: 2; 以及 /或者 SEQ ID NO: 3和 SEQ ID NO: 4的引物对，所述试剂盒优选还包含用于 DNA扩增、 DNA 纯化和 /或 DNA测序的试剂。
    10. 权利要求 1的多核苷酸、 权利要求 6的方法或权利要求 9的试 剂盒用于 HLA- DQB1基因分型的用途。
CN201080070819.5A 2010-12-24 2010-12-24 Hla-dqb1基因分型的方法及其相关引物 Active CN103270170B (zh)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/CN2010/002150 WO2012083506A1 (zh) 2010-12-24 2010-12-24 Hla-dqb1基因分型的方法及其相关引物

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN103270170A true CN103270170A (zh) 2013-08-28
CN103270170B CN103270170B (zh) 2015-07-29

Family

ID=46313007

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201080070819.5A Active CN103270170B (zh) 2010-12-24 2010-12-24 Hla-dqb1基因分型的方法及其相关引物

Country Status (4)

Country Link
CN (1) CN103270170B (zh)
HK (1) HK1185115A1 (zh)
TW (1) TW201300528A (zh)
WO (1) WO2012083506A1 (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109371114A (zh) * 2018-12-26 2019-02-22 银丰基因科技有限公司 Hla-dqb1基因分型试剂盒
CN111560430A (zh) * 2020-06-17 2020-08-21 中南大学湘雅二医院 检测rs1766位点多态性的试剂及其应用

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106795650B (zh) * 2014-09-26 2021-03-09 深圳华大基因股份有限公司 Pf快速建库方法及其应用
CN106978484A (zh) * 2017-03-16 2017-07-25 北京博奥晶典生物技术有限公司 通过pcr添加剂解决等位基因扩增不平衡的方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100261189A1 (en) * 2008-10-03 2010-10-14 Roche Molecular Systems, Inc. System and method for detection of HLA Variants
CN101921842A (zh) * 2010-06-30 2010-12-22 深圳华大基因科技有限公司 Hla-a,b基因分型用pcr引物及其使用方法
CN101962676A (zh) * 2010-08-31 2011-02-02 深圳市血液中心 人类白细胞抗原hla-a、b基因全长序列测定以及hla基因测序分型方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2101083T3 (es) * 1990-12-21 1997-07-01 Hoffmann La Roche Tipado del dna hla dqbeta.
CN101654691B (zh) * 2009-09-23 2013-12-04 深圳华大基因健康科技有限公司 Hla基因扩增和基因分型方法及其相关引物
CN101921841B (zh) * 2010-06-30 2014-03-12 深圳华大基因科技有限公司 基于Illumina GA测序技术的HLA基因高分辨率分型方法
CN101921840B (zh) * 2010-06-30 2014-06-25 深圳华大基因科技有限公司 一种基于dna分子标签技术和dna不完全打断策略的pcr测序方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100261189A1 (en) * 2008-10-03 2010-10-14 Roche Molecular Systems, Inc. System and method for detection of HLA Variants
CN101921842A (zh) * 2010-06-30 2010-12-22 深圳华大基因科技有限公司 Hla-a,b基因分型用pcr引物及其使用方法
CN101962676A (zh) * 2010-08-31 2011-02-02 深圳市血液中心 人类白细胞抗原hla-a、b基因全长序列测定以及hla基因测序分型方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
《Human Immunology》 19990930 Myoung Hee Park et al. "High resolution HLA-DQB1 typing by combination of PCR-RFLP and PCR-SSCP" 第60卷, 第9期 *
MYOUNG HEE PARK ET AL.: ""High resolution HLA-DQB1 typing by combination of PCR-RFLP and PCR-SSCP"", 《HUMAN IMMUNOLOGY》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109371114A (zh) * 2018-12-26 2019-02-22 银丰基因科技有限公司 Hla-dqb1基因分型试剂盒
CN111560430A (zh) * 2020-06-17 2020-08-21 中南大学湘雅二医院 检测rs1766位点多态性的试剂及其应用
CN111560430B (zh) * 2020-06-17 2023-05-23 中南大学湘雅二医院 检测rs1766位点多态性的试剂及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
TWI461532B (zh) 2014-11-21
CN103270170B (zh) 2015-07-29
HK1185115A1 (zh) 2014-02-07
WO2012083506A1 (zh) 2012-06-28
TW201300528A (zh) 2013-01-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2011274090B2 (en) New PCR sequencing method and use thereof in HLA genotyping
CN101921840B (zh) 一种基于dna分子标签技术和dna不完全打断策略的pcr测序方法
CN101921842B (zh) Hla-a,b基因分型用pcr引物及其使用方法
CN103270170A (zh) Hla-dqb1基因分型的方法及其相关引物
JP3384806B2 (ja) Ｈｌａ−ｄｒ型別判定の実施を可能にするプローブ系および該プローブを用いる型別判定法
AU772175B2 (en) Method for analysing a patient's genetic predisposition to at least a disease and amplification adapted to such a method
Latham et al. An overview of HLA typing for hematopoietic stem cell transplantation
Dunn Novel approaches and technologies in molecular HLA typing
JP2016516449A (ja) Ｈｌａマーカーを使用する母体血液中の胎児ｄｎａ分率の決定方法
CN108441547B (zh) 一种hla基因扩增、基因分型的引物组、试剂盒和方法
EP2186911A1 (en) A method for determining the Histocompatibility Locus Antigen Class II
CN103261438B (zh) Hla-c基因分型的方法及其相关引物
EP0887423A1 (en) A method for determining the Histocompatibility locus antigen class II
Han et al. Multiplex single nucleotide extension: a robust and high throughput method for HLA-A locus typing
Kuhn et al. Use of capillary array electrophoresis single-strand conformational polymorphism analysis to estimate genetic diversity of candidate genes in germplasm collections
US20040038258A1 (en) Methods for detecting DNA polymorphisms
CN116574791A (zh) 一种快速hla测序分型组合试剂盒及分析方法
CN113957141A (zh) 检测与高血压相关基因scnn1b突变的寡核苷酸和其应用
CN115354072A (zh) 一种用于hla-dqa1基因分型的引物组和分析方法
JP2011050377A (ja) 新規ｈｌａ−ｄｒｂ１遺伝子およびその用途

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
ASS Succession or assignment of patent right

Owner name: SHENZHEN BEIJING GENOMICS INSTITUTE HEALTH TECHNOL

Free format text: FORMER OWNER: BGI-SHENZHEN CO., LTD.

Effective date: 20130903

C10 Entry into substantive examination
C41 Transfer of patent application or patent right or utility model
SE01 Entry into force of request for substantive examination
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20130903

Address after: Yantian District of Shenzhen City, Guangdong province 518083 North Road No. 146 North Industrial Zone 11, floor 3, 2

Applicant after: Shenzhen Huada Gene Health Technology Co., Ltd.

Address before: 11, 8 floor, Beishan Industrial Zone, Yantian District, Guangdong, Shenzhen 518083, China

Applicant before: BGI-Shenzhen Co., Ltd.

REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1185115

Country of ref document: HK

C53 Correction of patent of invention or patent application
CB02 Change of applicant information

Address after: Yantian District of Shenzhen City, Guangdong province 518083 North Road No. 146 North Industrial Zone 11, floor 3, 2

Applicant after: Shenzhen BGI Medicine Co., Ltd.

Address before: Yantian District of Shenzhen City, Guangdong province 518083 North Road No. 146 North Industrial Zone 11, floor 3, 2

Applicant before: Shenzhen Huada Gene Health Technology Co., Ltd.

COR Change of bibliographic data

Free format text: CORRECT: APPLICANT; FROM: SHENZHEN BEIJING GENOMICS INSTITUTE HEALTH TECHNOLOGY CO., LTD. TO: SHENZHEN BGI MEDICINE CO., LTD.

C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
ASS Succession or assignment of patent right

Owner name: SHENZHEN BGI CORPORATION

Free format text: FORMER OWNER: SHENZHEN BGI MEDICINE CO., LTD.

Effective date: 20150729

C41 Transfer of patent application or patent right or utility model
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20150729

Address after: Yantian District of Shenzhen City, Guangdong province 518083 Hongan street No. 21 China Comprehensive Park 7 Building 7 layer -14 layer

Patentee after: BGI SHENZHEN CO LTD

Address before: Yantian District of Shenzhen City, Guangdong province 518083 North Road No. 146 North Industrial Zone 11, floor 3, 2

Patentee before: Shenzhen BGI Medicine Co., Ltd.

REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: GR

Ref document number: 1185115

Country of ref document: HK