CN108796050A - 肝移植中hla-c1/c2基因pcr-ssp快速鉴定方法 - Google Patents
肝移植中hla-c1/c2基因pcr-ssp快速鉴定方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN108796050A CN108796050A CN201810591798.XA CN201810591798A CN108796050A CN 108796050 A CN108796050 A CN 108796050A CN 201810591798 A CN201810591798 A CN 201810591798A CN 108796050 A CN108796050 A CN 108796050A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- hla
- primer
- pcr
- gene
- specific
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 title claims abstract description 31
- 238000012546 transfer Methods 0.000 title claims abstract description 14
- 101150003288 C2 gene Proteins 0.000 title claims abstract description 9
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 33
- 101150061009 C1 gene Proteins 0.000 title claims description 8
- 108010052199 HLA-C Antigens Proteins 0.000 claims abstract description 46
- 102100028971 HLA class I histocompatibility antigen, C alpha chain Human genes 0.000 claims abstract description 39
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims abstract description 26
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 22
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 18
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 18
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 8
- 101150035071 HLA-C gene Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 4
- 206010052779 Transplant rejections Diseases 0.000 abstract description 14
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 abstract description 11
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 abstract description 9
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 abstract description 8
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 abstract description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 7
- 238000013461 design Methods 0.000 abstract description 3
- 238000000137 annealing Methods 0.000 abstract description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 abstract description 2
- 230000001360 synchronised effect Effects 0.000 abstract description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 abstract 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 abstract 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 abstract 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 10
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 7
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 6
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- 108010043610 KIR Receptors Proteins 0.000 description 5
- 102000002698 KIR Receptors Human genes 0.000 description 5
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 5
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 3
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 3
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000008629 immune suppression Effects 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 102100027314 Beta-2-microglobulin Human genes 0.000 description 1
- 102100028972 HLA class I histocompatibility antigen, A alpha chain Human genes 0.000 description 1
- 108010075704 HLA-A Antigens Proteins 0.000 description 1
- 108010002634 HLA-Bw4 antigen Proteins 0.000 description 1
- 101001027081 Homo sapiens Killer cell immunoglobulin-like receptor 2DL1 Proteins 0.000 description 1
- 101000945371 Homo sapiens Killer cell immunoglobulin-like receptor 2DL2 Proteins 0.000 description 1
- 101000945333 Homo sapiens Killer cell immunoglobulin-like receptor 2DL3 Proteins 0.000 description 1
- 101000945340 Homo sapiens Killer cell immunoglobulin-like receptor 2DS1 Proteins 0.000 description 1
- 101000945339 Homo sapiens Killer cell immunoglobulin-like receptor 2DS2 Proteins 0.000 description 1
- 102100037363 Killer cell immunoglobulin-like receptor 2DL1 Human genes 0.000 description 1
- 102100033599 Killer cell immunoglobulin-like receptor 2DL2 Human genes 0.000 description 1
- 102100033634 Killer cell immunoglobulin-like receptor 2DL3 Human genes 0.000 description 1
- 102100033631 Killer cell immunoglobulin-like receptor 2DS1 Human genes 0.000 description 1
- 102100033630 Killer cell immunoglobulin-like receptor 2DS2 Human genes 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000002924 anti-infective effect Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 108010081355 beta 2-Microglobulin Proteins 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 238000010322 bone marrow transplantation Methods 0.000 description 1
- 230000005859 cell recognition Effects 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 239000012645 endogenous antigen Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000004957 immunoregulator effect Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 239000003147 molecular marker Substances 0.000 description 1
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 238000011017 operating method Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6858—Allele-specific amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Pathology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明基于HLA‑C1/C2基因的序列特征和HLA‑C基因组全长序列的单核苷酸多态性(SNPs)，采用HLA‑C位点特异性PCR引物和HLA‑C1/C2组特异性引物扩增策略，即设计一条共用的HLA‑C基因特异性PCR扩增引物，分别与一条针对HLA‑C1的组特异性PCR引物、一条针对HLA‑C2的组特异性PCR引物进行配组，仅用2个PCR反应分别扩增HLA‑C1、C2基因；由于所用引物具有相近的退火温度，可在同一PCR扩增条件下进行同步扩增；扩增产物经琼脂糖电泳检测，可清晰直观地判定受检者的HLA‑C1/C2基因型，无需大型贵重设备、无需对当前国际上IMGT/HLA数据库已公布的3800余种HLA‑C等位基因进行基因分型；具有实验操作简单、所需时间短、成本低，适合于肝移植前对肝供体进行快速检测，以减少急性排斥、提高移植效果。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学，特别是涉及一种临床肝移植急性排斥相关的人类白细胞抗原HLA-C1/C2的PCR-SSP快速鉴定方法。
背景技术
人类白细胞抗原(HLA)为人类主要组织相容性系统，承担重要的免疫识别、免疫应答和免疫调节的功能，与骨髓和实体器官移植的排斥反应密切相关。HLA-C分子为经典的HLA I类分子，不仅递呈内源性抗原肽给CD8+T细胞识别，介导特异性T细胞的免疫应答反应；而且作为杀伤细胞免疫球蛋白样受体(Killer immunoglobulin-like receptor,KIR)的配体，调节自然杀伤细胞的活性[1]，在移植免疫、肿瘤免疫和机体抗感染中发挥了重要作用。HLA-C分子由一条具有多态性的α多肽链(45kDa)和一条由位于15号染色体基因编码、没有多态性的β2微球蛋白(12kDa)通过非共价键组成异二聚体。编码α链的HLA-C基因共包括8个外显子及7个内含子；其中第1外显子编码引导肽，第2、第3、第4外显子分别编码α1、α2、α3区，第5外显子编码跨膜区，第6～8外显子编码胞浆尾。
HLA-C分子为KIR受体的重要配体，根据IPD-KIR数据库(https://www.ebi.ac.uk/ipd/kir/ligand.html)和HLA-C分子第80位氨基酸残基的差异[2-3]，HLA-C分子可分为HLA-C1组(α1螺旋区第80位氨基酸残基为天冬氨酸)和HLA-C2组(α1螺旋区第80位氨基酸残基为赖氨酸)。所有的HLA-C分子均为KIR的配体，HLA-C1分子特异性识别KIR2DL2、KIR2DL3、KIR2DS2，而HLA-C2特异性识别KIR2DL1及KIR2DS1。
近年来有研究表明HLA-C基因匹配程度对无关供者造血干细胞(骨髓)移植的效果具有显著影响[4-5]，因此HLA-C位点被列入了骨髓库HLA入库数据、临床供-受者骨髓移植HLA配型的常规检测项目。但是肝移植中受肝供体来源短缺等诸多因素影响，难以做到肝移植供-受者HLA完全匹配，通常肝移植前也不进行HLA配型检测，而肝移植急性排斥仍然是肝移植后面临的重要问题。当前，在HLA-KIR基因多态性与肝移植急性排斥的回顾性研究结果表明：HLA-C1/C2及其基因型与急性排斥相关，如Lee等[6]采用PCR-SSO方法对韩国肝移植供者进行HLA-C基因的基因分型，发现供者携带HLA-C2基因时，受者的急性排斥发生率显著升高(P＝0.0423)，并且随着供者HLA-C2基因数量的增加，急性排斥发生率也随之增高，即供者携带HLA-C2是急性排斥的易感因子并出现剂量效应。López-Alvarez等[7]在采用PCR-SSO方法对西班牙肝移植供-受者携带的HLA-C基因进行基因分型，研究HLA-C1/C2基因的多态性与急性排斥的关联研究，发现HLA-C1C1基因型的受者接受HLA-C1C2基因型的供肝时，受者的急性排斥发生率显著降低(P＝0.004)，HLA-C2C2基因型的受者接受HLA-C1C2基因型的供肝时，受者的急性排斥发生率显著升高(P＝0.005)。Bishara等[8]采用血清学及分子生物学方法进行HLA-A、-B、-C分型，发现供-受者HLA-C1/C2配体相匹配时，移植后受者一年内出现急性排斥的发生率显著降低(P＝0.0002)；而供-受者HLA-Bw4匹配程度对移植效果没有影响。
综上可见，HLA-C1/C2与肝移植急性排斥密切相关，因此在肝移植前对供者的HLA-C1/C2基因型进行鉴定，有利于提高供肝及受者的存活率。如在肝移植前检测供者携带HLA-C2，则可提前对接受携带HLA-C2供肝的受者的急性排斥风险进行预测，并制定相应的免疫抑制治疗方案。建立适合于肝移植中HLA-C1/C2基因PCR-SSP快速鉴定方法，是当前一项急迫的任务。
HLA-C基因具有高度的分子遗传多态性，截止到2018年4月，IMGT/HLA数据库(https://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/stats.html，Release3.32)中公布的HLA-C等位基因共计3854种(其中含无效等位基因144种)，编码2644种HLA-C分子。当前区分HLA-C1/C2通常做法是：首先采用序列特异性引物-PCR(PCR-SSP)、基于Luminex流式磁珠仪的反向序列特异性寡核苷酸探针杂交(PCR-rSSO)或基于测序仪的PCR产物直接测序(PCR-SBT)的方法，鉴定并获得受检者的HLA-C基因型；然后再在IMGT/HLA数据库中查看受检者中检出的HLA-C等位基因的第80位密码子的序列及所编码的氨基酸残基，进而判定受检者的HLA-C1/C2基因型。
以往的这种方法鉴定HLA-C1/C2基因型存在的不足包括：(1)HLA-C基因具有高度的分子遗传多态性,当前国际上普遍采用的Sanger测序法(PCR-SBT)及流式磁珠PCR-rSSO法进行HLA-C基因分型[6,7]，实验所需时间长、成本高、实验操作步骤多；易于出现模棱两可的检测结果(须增加其方法进行鉴定)[9]，并且实验过程中需要使用的大型贵重设备——流式磁珠仪或测序仪；(2)采用PCR-SSP法进行HLA-C基因分型，虽不需要使用大型贵重设备，但由于HLA-C等位基因水平的多态性极为丰富，需采用一系列的等位基因特异性引物、特异性扩增HLA-C位点的目的基因，PCR扩增反应的数量多，PCR Set-up(加样)及PCR产物电泳检测所需时间长；(3)无论是PCR-SSP、PCR-rSSO或PCR-SBT法进行HLA-C基因分型，在获得了受检者HLA-C基因型后，还要在IMGT/HLA数据库中查看受检者中检出的HLA-C等位基因的第80位密码子的序列及所编码的氨基酸残基，进而判定受检者的HLA-C1/C2基因型。
发明内容
本发明旨在基于HLA-C1/C2基因的序列特征和HLA-C基因组全长序列的单核苷酸多态性(SNPs)，创建一种HLA-C1/C2基因PCR-SSP快速鉴定的方法，以应用于临床肝移植急性排斥相关的快速检测、KIR-HLA与疾病关联、群体遗传学等基础和应用研究领域。
为实现上述目的，本发明提供一种HLA-C1/C2PCR-SSP基因分型的方法，该方法包括：
采用一条HLA-C基因特异性PCR扩增引物，分别与一条针对HLA-C1的组特异性PCR引物、一条针对HLA-C2的组特异性PCR引物配组，在同一PCR扩增条件下分别特异性扩增HLA-C1及HLA-C2基因；其中HLA-C基因特异性PCR扩增引物与业已公布的全部HLA-C等位基因的序列相匹配，HLA-C1的组特异性引物只能特异性扩增HLA-C1相关的目的序列，而HLA-C2组特异性PCR引物只能扩增HLA-C2相关的目的序列。
HLA-C1基因特异性PCR扩增引物包括：上游引物HLA-C-F2和下游引物HLA-C1-RD，其中，上游引物HLA-C-F2的序列为：5'-CCAATCAGCGTCTMCGCAGTC-3'，位于5’-启动子区域(在HLA-C基因组全长序列中的位置为：nt-77～nt-57)；下游引物HLA-C1-RD的序列为：5'-TCTGGTTGTAGTAGCCGCGCAGG-3'，位于第2外显子(在HLA-C基因组全长序列中的位置为：nt442～nt464)。HLA-C2基因特异性PCR扩增引物包括上游引物HLA-C-F2和下游引物HLA-C2-RB，其中，上游引物HLA-C-F2的序列为：5'-CCAATCAGCGTCTMCGCAGTC-3'，位于5’-启动子区域(在HLA-C基因组全长序列中的位置为：nt-77～nt-57)；下游引物HLA-C2-RB的序列为：5'-TCTGGTTGTAGTAGCCGCGCAGT-3'，位于第2外显子(在HLA-C基因组全长序列中的位置为：nt442～nt464)。
HLA-C1基因的特异性PCR扩增产物涵盖了部分5’-启动子区、第1外显子、第1内含子以及部分第2外显子序列，目的片段长度为541bp。HLA-C2基因的特异性PCR扩增产物涵盖了部分5’-启动子区、第1外显子、第1内含子以及部分第2外显子，目的片段长度为541bp。
HLA-C1及HLA-C2的PCR扩增反应体系均为：
PCR扩增条件均为(以利于同步扩增)：
扩增结束后，取5μL PCR扩增产物，经核酸染料染色，于2％琼脂糖凝胶中电泳；对照DNA分子标记，在凝胶成像系统中观察特异性PCR产物条带。根据HLA-C1/C2基因特异性扩增条带的有无，直观地判定HLA-C1/C2基因型。
本发明的贡献和技术特征在于：无需对高度多态性的HLA-C基因进行PCR-SSP、PCR-rSSO、PCR-SBT基因分型，本发明设计采用HLA-C位点特异性引物和HLA-C1或C2组特异性引物扩增策略，即设计一条共用的HLA-C基因特异性PCR扩增引物，分别与一条针对HLA-C1的组特异性PCR引物、一条针对HLA-C2的组特异性PCR引物进行配组，仅用2个PCR扩增反应特异性扩增HLA-C1及HLA-C2基因；由于所用引物具有相近的退火温度，可在同一PCR扩增条件下进行同步扩增；扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，可清晰地判定受检者的HLA-C1/C2基因型，无需对国际上IMGT/HLA数据库当前业已公布的3854种HLA-C等位基因进行基因分型。具有实验操作简单、特异性扩增产物电泳条带清晰、结果判读简单直观、实验成本低、无需大型贵重设备、且实验所需时间短(2小时内完成)等技术特征；有效解决了以往区分HLA-C1/C2基因的方法不足，适合于临床肝移植急性排斥相关的检测、KIR-HLA与疾病关联、群体遗传学等基础和应用研究领域。
本发明的贡献和价值还体现在其临床意义上：由于供-受者的HLA-C1/C2基因型与肝移植急性排斥密切相关，因此在肝移植前鉴定HLA-C1/C2基因型，有利于预测肝移植后受者出现急性排斥的风险，有利于开展个体化免疫抑制治疗，避免过度免疫抑制治疗导致的感染和肿瘤复发，提高供肝及受者的存活率。本发明适合于临床肝移植急性排斥相关的快速检测、KIR-HLA与疾病关联、群体遗传学等基础和应用研究等领域。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。
图1为“实施例1”的三例HLA-C1/C2基因型已知的样本，采用本发明专利的PCR-SSP法的鉴定效果图。
注：样本1经HLA-C测序分型的结果为HLA-C*01:02,03:02；在IMGT/HLA数据库(https://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/)中查找检出的C*01:02、C*03:02这两个等位基因第80位密码子序列及所编码的氨基酸残基，判定为HLA-C1C1基因型；采用本发明专利的PCR-SSP方法，PCR产物电泳仅见清晰的HLA-C1特异性扩增产物条带，判定结果为HLA-C1C1；
样本2：经HLA-C测序分型的结果为HLA-C*07:02,15:05；在IMGT/HLA数据库中查找检出的C*07:02、C*15:05这两个等位基因第80位密码子序列及所编码的氨基酸残基，判定为HLA-C1C2基因型；采用本发明专利的PCR-SSP方法，PCR扩增产物电泳均见清晰的HLA-C1及HLA-C2特异性扩增产物条带，判定结果为HLA-C1C2；
样本3：经HLA-C测序分型的结果为HLA-C*04:01,06:02；在IMGT/HLA数据库中查找检出的C*04:01、C*06:02这两个等位基因第80位密码子序列及所编码的氨基酸残基，判定为HLA-C2C2基因型；采用本发明专利的PCR-SSP方法，PCR产物电泳仅见清晰的HLA-C2特异性扩增产物条带，判定结果为HLA-C2C2。
图2为“实施例2”的287例南方汉族健康无关个体中，随机的16例样本的HLA-C1/C2PCR-SSP法扩增产物电泳图，均可清晰、直观地判定受检者的HLA-C1/C2基因型。
本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例给出了3例业已经HLA-C基因测序分型、但HLA-C1/C2基因型各不相同的样本，包括HLA-C1C1、-C1C2及-C2C2基因型各一例，采用本发明对这3例样本进行PCR-SSP法鉴定HLA-C1/C2基因型，以验证本发明的实施效果。
首先，采用本发明中的上游引物HLA-C-F2和下游引物HLA-C1-RD，扩增HLA-C1组基因；采用上游引物HLA-C-F2和下游引物HLA-C2-RB，扩增HLA-C2组基因；扩增于ABI 9700型PCR仪进行，扩增反应体系组成均为：
PCR扩增条件均为：
扩增结束后，取5μL PCR扩增产物，经核酸染料染色，于2％琼脂糖凝胶中电泳；对照Takara DL2000DNA分子标记，在凝胶成像系统中观察特异性PCR产物条带。PCR产物条带清晰、特异，电泳效果见图1。
本实施例中，三例样本的PCR-SSP法鉴定HLA-C1/C2基因型，与测序分型已知的结果完全相符合。
实施例2
本实施例给出了经HLA-C基因测序分型、HLA-C1/C2基因型已知的287例南方汉族健康无关个体，采用本发明对这287例样本进行PCR-SSP法鉴定HLA-C1/C2基因型，进一步验证本发明的实施效果。
首先，采用本发明中的上游引物HLA-C-F2和下游引物HLA-C1-RD，扩增HLA-C1组基因；采用上游引物HLA-C-F2和下游引物HLA-C2-RB，扩增HLA-C2组基因；扩增于ABI 9700型PCR仪进行，扩增反应体系组成均为：
PCR扩增条件均为：
扩增结束后，取5μL PCR扩增产物，经核酸染料染色，于2％琼脂糖凝胶中电泳；对照Takara DL2000DNA分子标记，在凝胶成像系统中观察特异性PCR产物条带。随机的16例样本用PCR-SSP法扩增HLA-C1/C2基因，PCR扩增产物电泳效果图，见图2。
本实施例中，采用本发明对287例样本进行PCR-SSP法鉴定HLA-C1/C2基因型，结果与PCR-SBT测序分型判定的HLA-C1/C2基因型的结果完全一致，见表1。
表1 287例样本采用本发明的PCR-SSP法鉴定HLA-C1/C2基因型结果与PCR-SBT测序分型判定的HLA-C1/C2基因型的结果对比
以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的发明构思下，利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围内。
参考文献：
[1]Colonna M,Brooks EG,Falco M,et al.Generation of allospecificnatural killer cells by stimulation across a polymorphism of HLA-C.Science.1993；260:1121-1124.
[2]Single RM,Martin MP,Gao X,et al.Global diversity and evidence forcoevolution of KIR and HLA.Nat Genet.2007；39(9):1114-1119.
[3]Mehta RS,Rezvani K.Can we make a better match or mismatch with KIRgenotyping？Hematology Am Soc Hematol Educ Program.2016Dec 2；2016(1):106-118.
[4]Flomenberg N,Baxter-Lowe LA,Confer D,et al.Impact of HLA class Iand class II high-resolution matching on outcomes of unrelated donor bonemarrow transplantation:HLA-C mismatching is associated with a strong adverseeffect on transplantation outcome.Blood.2004,104:1923-1930.
[5]Kawase T,Morishima Y,Matsuo K,et al；Japan Marrow DonorProgram.High-risk HLA allele mismatch combinations responsible for severeacute graft-versus-host disease and implication for its molecularmechanism.Blood.2007；110:2235-2241.
[6]Lee H,Park KH,Park HS,et al.Human Leukocyte Antigen-C Genotype andKiller Immunoglobulin-like Receptor-Ligand Matching in Korean Living DonorLiver Transplantation.Ann Lab Med.2017,37(1):45-52.
[7]López-Alvarez MR,Moya-Quiles MR,Minguela A,et al.HLA-C matchingand liver transplants:donor-recipient genotypes influence early outcome andCD8+KIR2D+T-cells recuperation.Transplantation.2009,88(3Suppl):S54-61.
[8]Bishara A,Brautbar C,Zamir G,et al.Impact of HLA-C and Bw epitopesdisparityon liver transplantation outcome.Hum Immunol.2005,66(11):1099-1105.
[9]王大明，何柳媚，邹红岩，高素青，邓志辉.HLA测序分型中模棱两可结果的分析及其解决策略.中华医学遗传学杂志.2015，32(1)：44-48.
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳市血液中心
<120> 肝移植中HLA-C1/C2基因PCR-SSP快速鉴定方法
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ccaatcagcg tctmcgcagt c 21
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tctggttgta gtagccgcgc agg 23
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
caatcagcgt ctmcgcagtc 20
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tctggttgta gtagccgcgc agt 23
Claims (4)
1.肝移植中HLA-C1/C2基因PCR-SSP快速鉴定方法，其特征在于：采用一条HLA-C基因特异性PCR扩增引物，分别与一条针对HLA-C1的组特异性PCR引物、一条针对HLA-C2的组特异性PCR引物配组，在同一PCR扩增条件下分别特异性扩增HLA-C1及HLA-C2基因；
所述HLA-C1基因特异性PCR扩增引物包括：上游引物HLA-C-F2和下游引物HLA-C1-RD，其中，所述上游引物HLA-C-F2的序列为：5'-CCAATCAGCGTCTMCGCAGTC-3'，位于5’-启动子区域，在HLA-C基因组全长序列中的位置为：nt-77～nt-57；所述下游引物HLA-C1-RD的序列为：5'-TCTGGTTGTAGTAGCCGCGCAGG-3'，位于第2外显子，在HLA-C基因组全长序列中的位置为：nt442～nt464；
所述HLA-C2基因特异性PCR扩增引物包括上游引物HLA-C-F2和下游引物HLA-C2-RB，其中，所述上游引物HLA-C-F2的序列为：5'-CCAATCAGCGTCTMCGCAGTC-3'，位于5’-启动子区域，在HLA-C基因组全长序列中的位置为：nt-77～nt-57；所述下游引物HLA-C2-RB的序列为：5'-TCTGGTTGTAGTAGCCGCGCAGT-3'，位于第2外显子，在HLA-C基因组全长序列中的位置为：nt442～nt464。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述HLA-C1基因的特异性PCR扩增产物涵盖了部分5’-启动子区、第1外显子、第1内含子以及部分第2外显子序列，目的片段长度为541bp；
所述HLA-C2基因的特异性PCR扩增产物涵盖了部分5’-启动子区、第1外显子、第1内含子以及部分第2外显子，目的片段长度为541bp。
3.如权利要求1、2所述的方法，其特征在于，所述HLA-C1及HLA-C2的PCR扩增反应体系均为：
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，PCR扩增条件均为：
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810591798.XA CN108796050A (zh) | 2018-06-08 | 2018-06-08 | 肝移植中hla-c1/c2基因pcr-ssp快速鉴定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810591798.XA CN108796050A (zh) | 2018-06-08 | 2018-06-08 | 肝移植中hla-c1/c2基因pcr-ssp快速鉴定方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN108796050A true CN108796050A (zh) | 2018-11-13 |
Family
ID=64088146
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201810591798.XA Pending CN108796050A (zh) | 2018-06-08 | 2018-06-08 | 肝移植中hla-c1/c2基因pcr-ssp快速鉴定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN108796050A (zh) |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101928770A (zh) * | 2009-09-18 | 2010-12-29 | 深圳市血液中心 | 人类白细胞抗原HLA-Cw基因测序分型的方法 |
| CN101962676A (zh) * | 2010-08-31 | 2011-02-02 | 深圳市血液中心 | 人类白细胞抗原hla-a、b基因全长序列测定以及hla基因测序分型方法 |
| CN102352409A (zh) * | 2011-09-21 | 2012-02-15 | 深圳市血液中心 | 一种人类主要组织相容性复合体ⅰ类分子相关基因a基因测序分型方法及试剂盒 |
| CN105039332A (zh) * | 2015-08-19 | 2015-11-11 | 苏静 | Hla基因的组特异性扩增引物、测序分型方法和试剂盒 |
| CN105296618A (zh) * | 2015-10-14 | 2016-02-03 | 深圳市血液中心 | 人类白细胞抗原基因分型的方法及其试剂 |
-
2018
- 2018-06-08 CN CN201810591798.XA patent/CN108796050A/zh active Pending
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101928770A (zh) * | 2009-09-18 | 2010-12-29 | 深圳市血液中心 | 人类白细胞抗原HLA-Cw基因测序分型的方法 |
| CN101962676A (zh) * | 2010-08-31 | 2011-02-02 | 深圳市血液中心 | 人类白细胞抗原hla-a、b基因全长序列测定以及hla基因测序分型方法 |
| CN102352409A (zh) * | 2011-09-21 | 2012-02-15 | 深圳市血液中心 | 一种人类主要组织相容性复合体ⅰ类分子相关基因a基因测序分型方法及试剂盒 |
| CN105039332A (zh) * | 2015-08-19 | 2015-11-11 | 苏静 | Hla基因的组特异性扩增引物、测序分型方法和试剂盒 |
| CN105296618A (zh) * | 2015-10-14 | 2016-02-03 | 深圳市血液中心 | 人类白细胞抗原基因分型的方法及其试剂 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| 冯明亮等: "PCR-SSP分型检测上海汉族人群HLA-Cw位点血清学和非血清学鉴定的等位基因", 《遗传学报》 * |
| 蒋立新等: "江苏汉族人群杀伤细胞免疫球蛋白样受体及其特异性配体HLA分析", 《细胞与分子免疫学杂志》 * |
| 邓志辉等: "维吾尔族人群HLA-Cw等位基因遗传多态性研究", 《中国输血杂志》 * |
| 鲍自谦等: "无关供者骨髓移植中HLA-C_W基因与急性GVHD相关性的初探", 《江西医学检验》 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN105339508B (zh) | Hla基因的多重dna分型方法和试剂盒 | |
| US8883418B2 (en) | Measurement of the immunological diversity and evaluation of the effects of a treatment through studying V(D)J diversity | |
| CN103045591B (zh) | Hla基因特异性pcr扩增引物及hla分型的方法和试剂盒 | |
| EP3075863B1 (en) | Simple method and kit for dna profiling of hla genes by high-throughput massively parallel sequencer | |
| Ponti et al. | TCRγ-chain gene rearrangement by PCR-based GeneScan: diagnostic accuracy improvement and clonal heterogeneity analysis in multiple cutaneous T-cell lymphoma samples | |
| CN101928776B (zh) | 一种hla基因分型的pcr-sbt方法所用的试剂 | |
| CN101892317A (zh) | Hla高分辨基因测序试剂盒 | |
| CN110317880A (zh) | 与猪饲料转化率相关的分子标记、鉴定及其应用 | |
| CN108913787A (zh) | 与绵羊多羔相关的snp分子标记及其应用 | |
| CN101671736B (zh) | 一种用于检测细胞嵌合状态或个体识别的基因检测试剂盒 | |
| Otting et al. | Allelic diversity of Mhc‐DRB alleles in rhesus macaques | |
| Radko et al. | Genetic differentiation among 6 populations of red deer (Cervus elaphus L.) in Poland based on microsatellite DNA polymorphism | |
| CN109055578B (zh) | 一种plag1基因snp标记辅助快速检测黄牛生长性状的方法及其应用 | |
| CN105002271B (zh) | 一种绵羊低氧适应性的快速筛选方法及其应用 | |
| CN108796050A (zh) | 肝移植中hla-c1/c2基因pcr-ssp快速鉴定方法 | |
| Bai et al. | Polymorphism analysis of Chinese yellow quail using microsatellite markers | |
| ES2445709T3 (es) | Método para la identificación por técnicas moleculares de variantes genéticas que no codifican antígeno D (D-) y codifican antígeno C alterado (C+W) | |
| CN111269990A (zh) | 多胎绵羊的标志物、检测多胎绵羊的产品及检测方法 | |
| CN105316424B (zh) | 一种与高邮鸭体重、胸腿肌重和胸肌肌纤维性状相关的分子标记、其获取方法及应用 | |
| CN108441547A (zh) | 一种hla基因扩增、基因分型的引物组、试剂盒和方法 | |
| CN108531568B (zh) | 一种用于hla-b基因扩增、基因分型的引物组、试剂盒和方法 | |
| Jaramillo et al. | The human leukocyte antigen system: nomenclature and DNA-based typing for transplantation | |
| Muleya et al. | Sequence Diversity of Tp1 and Tp2 Antigens and Population Genetic Analysis of Theileria parva in Unvaccinated Cattle in Zambia’s Chongwe and Chisamba Districts. Pathogens 2022, 11, 114 | |
| Sellami et al. | Evidence that erythrocyte DARC-positive phenotype can affect the GVHD occurrence after HLA-identical sibling HSCT | |
| CN109355366A (zh) | Hla-b高分辨基因测序试剂盒 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20181113 |