CN105039332A - Hla基因的组特异性扩增引物、测序分型方法和试剂盒 - Google Patents
Hla基因的组特异性扩增引物、测序分型方法和试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及生物医学及免疫遗传学,特别是涉及HLA基因的组特异性扩增引物、测序分型方法和试剂盒,所述PCR扩增引物序列选自:SEQ?ID?NO.1-28所示的序列,SEQ?ID?NO.29-64所示的序列和SEQ?ID?NO.65-94所示的序列。本申请通过对HLA基因进行血清分类设计组特异性扩增引物,可对HLA-A、-B和-C所有等位基因进行测序分型;对HLA-A、-B和-C全长序列进行扩增测序,可有效解决模棱两可,达到绝对高分,数据更加准确可靠。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学及免疫遗传学,特别是涉及HLA基因的组特异性扩增引物、测序分型方法和试剂盒。
背景技术
人类白细胞抗原系统(HLA)是人基因组中多样性最高、最重要的免疫遗传系统,它的多样性决定了机体对感染性疾病、自身免疫性疾病、遗传病及各种肿瘤的抵抗能力。在临床应用中,它的基因多态性在供受者之间的匹配程度高低直接决定了造血干细胞移植以及器官移植病患的存活率。
在HLA组织配型产业领域,目前国内外市场中的产品有三大短板问题:首先,大部分产品都只针对HLA基因的部分外显子进行分型,如只对HLA-I类基因(包括HLA-A、-B、-C)的2、3、4三个外显子进行分型检测,而实际上HLA-I类全长基因总共含有七个外显子、七个内含子及两端调控区,绝对高分结果命名数总共有8位,如A*02:01:01:01,而目前的国内外试剂只能判定出前4位结果,因此若HLA单核苷酸多态性位于试剂所检测外显子以外的区域,便很容易产生模棱两可无法判定的结果(Ambiguities)。目前的HLA分型产品模棱两可比例高达40%-60%。其次,目前市场上HLA的分型产品PCR扩增引物设计的都是位点通用性的,即同一位点用同一对扩增引物去扩增所有人群的HLA基因序列,由于HLA基因的等位基因数目繁多,截止到2015年1月,国际上统计的HLA-A、-B、-C等位基因数目分别达2995、3760及2553个(release3.19.0,http://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla),按血清学分类分别达28、60及10个,各血清学家系中包含的等位基因之间序列差别较大,给位点通用扩增引物的设计带来较大麻烦,即使勉强设计出来,也很容易产生部分家系等位基因的漏检(Alleledropout),美国Atria公司也曾经通报过其HLA测序产品存在这一现象。最后,传统的HLA测序分型技术都是对父系母系双倍体进行扩增,由于HLA多样性高,密度极高的杂合子峰增加了软件开发和结果分析的难度和时间。
CN101962676A公开了一种人类白细胞抗原HLA-A、B基因全长序列测定以及HLA基因测序分型方法,HLA-A、-B基因全长序列测定方法包括:a、各由一对引物对HLA-A、B基因约4kb全长序列进行PCR扩增;b、将扩增产物克隆至pGEM-Teasy体中,分别通过正、反双向十条步移测序引物将全长序列测通,共获得HLA-A38种等位基因4.3kb全长序列,HLA-B30种等位基因3.7kb全长序列。还是采用了位点通用性的引物,容易造成部分家系等位基因的漏检。
发明内容
本发明致力于解决上述目前国内外HLA高分辨测序分型技术上的三大短板问题,解决现有HLA测序分型产品的缺陷,达到受检标本的HLA绝对高分,本发明提供一种HLA基因的组特异性扩增引物、测序分型方法和试剂盒。
为达到此发明目的,本发明采用以下技术方案:
第一方面,本发明提供了HLA基因的组特异性扩增引物,所述PCR扩增引物序列选自:SEQIDNO.1-28所示的序列,SEQIDNO.29-64所示的序列和SEQIDNO.65-94所示的序列。
本发明根据HLA-A、-B、-C基因的组特异性分类,分别设计基因全长单倍型组特异性扩增引物对HLA-A、-B、-C基因进行扩增;完成扩增后,为每个基因设计一套通用正反向全长测序引物对HLA基因所有外显子及内含子进行测序。
优选地,所述SEQIDNO.1-28所示的序列是用于扩增HLA-A基因的引物序列。
优选地,所述SEQIDNO.1-2所示的序列是用于扩增HLA-A*和A*36子系的所有等位基因。
优选地,所述SEQIDNO.3-4所示的序列是用于扩增HLA-A*02、A*68、A*69和A*80子系的所有等位基因。
优选地,所述SEQIDNO.5-6所示的序列是用于扩增HLA-A*02和A*69子系的所有等位基因。
优选地,所述SEQIDNO.7-8所示的序列是用于扩增HLA-A*01、A*36、A*68、A*69和A*80子系的所有等位基因。
优选地,所述SEQIDNO.9-10所示的序列是用于扩增HLA-A*23和A*24子系的所有等位基因。
优选地,所述SEQIDNO.11-12所示的序列是用于扩增HLA-A*31和A*33子系的所有等位基因。
优选地,所述SEQIDNO.13-14所示的序列是用于扩增HLA-A*29、A*32和A*74子系的所有等位基因。
优选地,所述SEQIDNO.15-16所示的序列是用于扩增HLA-A*03和A*30子系的所有等位基因。
优选地,所述SEQIDNO.17-18所示的序列是用于扩增HLA-A*01、A*02、A*03、A*11、A*36、A*68、A*69和A*80子系的所有等位基因。
优选地,所述SEQIDNO.19-20所示的序列是用于扩增HLA-A*30子系的所有等位基因。
优选地,所述SEQIDNO.21-22所示的序列是用于扩增HLA-A*11子系的所有等位基因。
优选地,所述SEQIDNO.23-24所示的序列是用于扩增HLA-A*29和A*80子系的所有等位基因。
优选地,所述SEQIDNO.25-26所示的序列是用于扩增HLA-A*25、A*26、A*29、A*31、A*32、A*33、A*34、A*66、A*74和A*43子系的所有等位基因。
优选地,所述SEQIDNO.27-28所示的序列是用于扩增HLA-A所有血清学家系的等位基因,作为阳性对照。。
本发明中,上述的HLA-A基因的组特异性PCR扩增引物序列,如表1所示。
表1
注:引物名称中的“F”和“R”分别表示引物的上游和下游。
优选地,所述SEQIDNO.29-64所示的序列是用于扩增HLA-B基因的引物序列。
优选地,所述SEQIDNO.29-30所示的序列是用于扩增HLA-B*07和B*48子系的所有等位基因。
优选地,所述SEQIDNO.31-32所示的序列是用于扩增HLA-B*08子系的所有等位基因。
优选地,所述SEQIDNO.33-34所示的序列是用于扩增HLA-B*13子系的所有等位基因。
优选地,所述SEQIDNO.35-36所示的序列是用于扩增HLA-B*15和B*46子系的所有等位基因。
优选地,所述SEQIDNO.37-38所示的序列是用于扩增HLA-B*14、B*38、B*39和B*67子系的所有等位基因。
优选地,所述SEQIDNO.39-40所示的序列是用于扩增HLA-B*15、B*51和B*52子系的所有等位基因。
优选地,所述SEQIDNO.41-42所示的序列是用于扩增HLA-B*35和B*73子系的所有等位基因。
优选地,所述SEQIDNO.43-44所示的序列是用于扩增HLA-B*18、B*44、B*73和B*82子系的所有等位基因。
优选地,所述SEQIDNO.45-46所示的序列是用于扩增HLA-B*07、B*40:01和B*81子系的所有等位基因。
优选地,所述SEQIDNO.47-48所示的序列是用于扩增HLA-B*18、B*27、B*37和B*40:02/06子系的所有等位基因。
优选地,所述SEQIDNO.49-50所示的序列是用于扩增HLA-B*41、B*45、B*49和B*50子系的所有等位基因。
优选地,所述SEQIDNO.51-52所示的序列是用于扩增HLA-B*42子系的所有等位基因。
优选地,所述SEQIDNO.53-54所示的序列是用于扩增HLA-B*54、B*55、B*56和B*59子系的所有等位基因。
优选地,所述SEQIDNO.55-56所示的序列是用于扩增HLA-B*57子系的所有等位基因。
优选地,所述SEQIDNO.57-58所示的序列是用于扩增HLA-B*18、B*27、B*35、B*37、B*40、B*41、B*45、B*49、B*50、B*51、B*52、B*53、B*58和B*78子系的所有等位基因。
优选地,所述SEQIDNO.59-60所示的序列是用于扩增HLA-B*07、B*08、B*15、B*42、B*44和B*47子系的所有等位基因。
优选地,所述SEQIDNO.61-62所示的序列是用于扩增HLA-B*41、B*45、B*49、B*50、B*51、B*52、B*53、B*58和B*78子系的所有等位基因。
优选地,所述SEQIDNO.63-64所示的序列是用于扩增HLA-B*所有血清学家系的等位基因,作为阳性对照。
本发明中,上述的HLA-B基因的组特异性PCR扩增引物序列,如表2所示。
表2
注:引物名称中的“F”和“R”分别表示引物的上游和下游。
优选地,所述SEQIDNO.65-94所示的序列是用于扩增HLA-C基因的引物序列。
优选地,所述SEQIDNO.65-66所示的序列是用于扩增HLA-C*01和C*02子系的所有等位基因。
优选地,所述SEQIDNO.67-68所示的序列是用于扩增HLA-C*01子系的所有等位基因。
优选地,所述SEQIDNO.69-70所示的序列是用于扩增HLA-C*02子系的所有等位基因。
优选地,所述SEQIDNO.71-72所示的序列是用于扩增HLA-C*03子系的所有等位基因。
优选地,所述SEQIDNO.73-74所示的序列是用于扩增HLA-C*03子系的所有等位基因。
优选地,所述SEQIDNO.75-76所示的序列是用于扩增HLA-C*04和C*18子系的所有等位基因。
优选地,所述SEQIDNO.77-78所示的序列是用于扩增HLA-C*05和C*08子系的所有等位基因。
优选地,所述SEQIDNO.79-80所示的序列是用于扩增HLA-C*06和C*12子系的所有等位基因。
优选地,所述SEQIDNO.81-82所示的序列是用于扩增HLA-C*07和C*18子系的所有等位基因。
优选地,所述SEQIDNO.83-84所示的序列是用于扩增HLA-C*07子系的所有等位基因。
优选地,所述SEQIDNO.85-86所示的序列是用于扩增HLA-C*14子系的所有等位基因。
优选地,所述SEQIDNO.87-88所示的序列是用于扩增HLA-C*15子系的所有等位基因。
优选地,所述SEQIDNO.89-90所示的序列是用于扩增HLA-C*16子系的所有等位基因。
优选地,所述SEQIDNO.91-92所示的序列是用于扩增HLA-C*17子系的所有等位基因。
优选地,所述SEQIDNO.93-94所示的序列是用于扩增HLA-C所有血清学家系的等位基因,作为阳性对照。
本发明中,上述的HLA-C基因的组特异性PCR扩增引物序列,如表3所示。
表3
注:引物名称中的“F”和“R”分别表示引物的上游和下游。
优选地,所述的PCR扩增引物进行PCR扩增所得到的产物片段包括相应的HLA-A、-B和-C基因的所有外显子、内含子和所述基因两端调控区。
第二方面,本发明提供一种使用如第一方面所述的PCR扩增引物扩增得到的HLA-A、-B和-C的基因的全长测序引物,其特征在于,所述基因的全长测序引物的序列选自:SEQIDNO.95-108所示的序列,SEQIDNO.109-122所示的序列和SEQIDNO.123-136所示的序列。
优选地,所述SEQIDNO.95-108所示的序列用于测序HLA-A基因的全长。
本发明中,上述的HLA-A基因的全长测序引物序列,如表4所示。
表4
优选地,所述SEQIDNO.109-122所示的序列用于测序HLA-B基因的全长.本发明中,上述的HLA-B基因的外显子测序引物序列,如表5所示。
表5
优选地,所述SEQIDNO.123-136所示的序列用于测序HLA-C基因的全长。本发明中,上述的HLA-C基因的外显子测序引物序列,如表6所示。
表6
第三方面,本发明提供一种HLA基因测序分型方法,所述方法包括如下步骤:
(1)根据样本的血清型,选取相应的、如权利要求1-5任一项所述的组特异性PCR扩增引物,对样本DNA进行PCR扩增,纯化,得到HLA-A、-B和/或-C的基因扩增产物;
(2)利用如第二方面所述的基因全长测序引物,分别对纯化后的HLA-A、-B和-C的基因扩增产物进行测序反应,纯化,得到纯化后的测序扩增产物;
(3)将步骤(2)得到的产物在ABI3730电泳仪中电泳,得到序列峰图,导入序列分析软件进行中分析,以进行HLA基因分型。
第四方面,本发明提供一种HLA基因分型的试剂盒包括:如第一方面所述的组特异性PCR扩增引物和/或如第二方面所述的基因全长测序引物。
与现有技术相比,本发明具有的有益效果:
本申请通过对HLA基因进行血清分类设计组特异性扩增引物,可对HLA所有等位基因进行测序分型;对HLA基因全长序列进行扩增测序,可有效解决模棱两可,达到绝对高分;根据血清学家系设计的组特异性扩增引物可避免发生漏检;单倍型扩增测序结果,单峰一目了然,分析方便快捷。
附图说明
图1是使用本发明的HLA-A、-B和-C基因的组特异性扩增引物进行扩增及使用相应的全长测序引物进行测序的策略示意图;
其中,图中短箭头表示通用测序引物;图中长箭头表示组特异性扩增引物;
图2是使用MSC301-F\MSC302-R(SEQIDNO.65-66)扩增得到的产物的电泳图;
图3是使用MSC301-F\MSC302-R(SEQIDNO.65-66)扩增得到的产物,并用SEQIDNO.123-136测序得到的峰图。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果,以下结合本发明的优选实施例来进一步说明本发明的技术方案,但本发明并非局限在实施例范围内。
实施例中未注明具体技术或条件者,按照本领域内的文献所描述的技术或条件,或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
使用本发明的HLA-A、-B和-C基因的组特异性扩增引物进行扩增、并使用相应的全长测序引物对所得扩增产物进行测序的示意图见图1,图1中短箭头表示通用测序引物,长箭头表示组特异性扩增引物。
实施例1
本实施例给出对300例深圳需行造血干细胞移植的患者及其供者标本进行HLA-A、-B、-C绝对高分辨测序分型的实例。
选择了300例HLA-A、-B、-C血清型已知的样本,用本发明中的相对应的组特异性PCR扩增引物和测序引物进行测序分型,来验证本发明的实施效果。
对于每例标本,首先,分别根据其HLA血清学选取相应的、如本申请第一方面所述的组特异性PCR扩增引物对样本的HLA-A、-B、-C全长序列进行PCR扩增反应,扩增反应条件:所有扩增反应均设置同一种反应体系,组成如下:
设置好PCR反应体系后,所有反应均在同一个ABI9700型PCR仪中用同一种扩增条件进行同步扩增,循环参数如下:
扩增反应结束后,HLA-A、-B、-C基因所有的全长序列组特异性扩增产物分别通过14条正、反向步移测序引物进行测序反应,测出基因全长。测序反应体系如下:
测序反应程序为:
测序反应完成后,在ABI3730测序仪中电泳;并且,将测序结果导入序列分析软件中,以判定HLA-A、-B、-C;使用该方法,可以得到清晰的判定HLA-A、-B、-C的绝对高分结果。
图2是使用MSC301-F\MSC302-R(SEQIDNO.65-66)扩增得到的产物电泳图,图3是使用SEQIDNO.123-136测序得到的峰图,从图2可以看出,图中所示为血清学分型为C*01的标本,选取本发明中MSC301-F\MSC302-R扩增(SEQIDNO.65-66)扩增得到的产物条带清晰,从图3可以看出,用本发明中SEQIDNO.123-136测序后单峰清晰,无背景杂峰,导入序列分析软件中可得到清晰的HLA-C绝对高分结果。
通过本发明中的扩增及测序引物对300例样本进行测序分型实验,最后都得到了清晰的HLA-A、-B、-C绝对高分辨基因型(HLA八位数命名)。
申请人声明,本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法,但本发明并不局限于上述详细方法,即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了,对本发明的任何改进,对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等,均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (9)
1.HLA基因的组特异性扩增引物,其特征在于,所述PCR扩增引物的序列选自:SEQIDNO.1-28所示的序列,SEQIDNO.29-64所示的序列和SEQIDNO.65-94所示的序列。
2.根据权利要求1所述的PCR扩增引物,其特征在于,所述SEQIDNO.1-28所示的序列是用于扩增HLA-A基因的引物序列;
优选地,所述SEQIDNO.1-2所示的序列是用于扩增HLA-A*和A*36子系的所有等位基因;
优选地,所述SEQIDNO.3-4所示的序列是用于扩增HLA-A*02、A*68、A*69和A*80子系的所有等位基因;
优选地,所述SEQIDNO.5-6所示的序列是用于扩增HLA-A*02和A*69子系的所有等位基因;
优选地,所述SEQIDNO.7-8所示的序列是用于扩增HLA-A*01、A*36、A*68、A*69和A*80子系的所有等位基因;
优选地,所述SEQIDNO.9-10所示的序列是用于扩增HLA-A*23和A*24子系的所有等位基因;
优选地,所述SEQIDNO.11-12所示的序列是用于扩增HLA-A*31和A*33子系的所有等位基因;
优选地,所述SEQIDNO.13-14所示的序列是用于扩增HLA-A*29、A*32和A*74子系的所有等位基因;
优选地,所述SEQIDNO.15-16所示的序列是用于扩增HLA-A*03和A*30子系的所有等位基因;
优选地,所述SEQIDNO.17-18所示的序列是用于扩增HLA-A*01、A*02、A*03、A*11、A*36、A*68、A*69和A*80子系的所有等位基因;
优选地,所述SEQIDNO.19-20所示的序列是用于扩增HLA-A*30子系的所有等位基因;
优选地,所述SEQIDNO.21-22所示的序列是用于扩增HLA-A*11子系的所有等位基因;
优选地,所述SEQIDNO.23-24所示的序列是用于扩增HLA-A*29和A*80子系的所有等位基因;
优选地,所述SEQIDNO.25-26所示的序列是用于扩增HLA-A*25、A*26、A*29、A*31、A*32、A*33、A*34、A*66、A*74和A*43子系的所有等位基因;
优选地,所述SEQIDNO.27-28所示的序列是用于扩增HLA-A所有血清学家系的等位基因。
3.根据权利要求1或2所述的PCR扩增引物,其特征在于,所述SEQIDNO.29-64所示的序列是用于扩增HLA-B基因的引物序列;
优选地,所述SEQIDNO.29-30所示的序列是用于扩增HLA-B*07和B*48子系的所有等位基因;
优选地,所述SEQIDNO.31-32所示的序列是用于扩增HLA-B*08子系的所有等位基因;
优选地,所述SEQIDNO.33-34所示的序列是用于扩增HLA-B*13子系的所有等位基因;
优选地,所述SEQIDNO.35-36所示的序列是用于扩增HLA-B*15和B*46子系的所有等位基因;
优选地,所述SEQIDNO.37-38所示的序列是用于扩增HLA-B*14、B*38、B*39和B*67子系的所有等位基因;
优选地,所述SEQIDNO.39-40所示的序列是用于扩增HLA-B*15、B*51和B*52子系的所有等位基因;
优选地,所述SEQIDNO.41-42所示的序列是用于扩增HLA-B*35和B*73子系的所有等位基因;
优选地,所述SEQIDNO.43-44所示的序列是用于扩增HLA-B*18、B*44、B*73和B*82子系的所有等位基因;
优选地,所述SEQIDNO.45-46所示的序列是用于扩增HLA-B*07、B*40:01和B*81子系的所有等位基因;
优选地,所述SEQIDNO.47-48所示的序列是用于扩增HLA-B*18、B*27、B*37和B*40:02/06子系的所有等位基因;
优选地,所述SEQIDNO.49-50所示的序列是用于扩增HLA-B*41、B*45、B*49和B*50子系的所有等位基因;
优选地,所述SEQIDNO.51-52所示的序列是用于扩增HLA-B*42子系的所有等位基因;
优选地,所述SEQIDNO.53-54所示的序列是用于扩增HLA-B*54、B*55、B*56和B*59子系的所有等位基因;
优选地,所述SEQIDNO.55-56所示的序列是用于扩增HLA-B*57子系的所有等位基因;
优选地,所述SEQIDNO.57-58所示的序列是用于扩增HLA-B*18、B*27、B*35、B*37、B*40、B*41、B*45、B*49、B*50、B*51、B*52、B*53、B*58和B*78子系的所有等位基因;
优选地,所述SEQIDNO.59-60所示的序列是用于扩增HLA-B*07、B*08、B*15、B*42、B*44和B*47子系的所有等位基因;
优选地,所述SEQIDNO.61-62所示的序列是用于扩增HLA-B*41、B*45、B*49、B*50、B*51、B*52、B*53、B*58和B*78子系的所有等位基因;
优选地,所述SEQIDNO.63-64所示的序列是用于扩增HLA-B*所有血清学家系的等位基因。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的PCR扩增引物,其特征在于,所述SEQIDNO.65-94所示的序列是用于扩增HLA-C基因的引物序列;
优选地,所述SEQIDNO.65-66所示的序列是用于扩增HLA-C*01和C*02子系的所有等位基因;
优选地,所述SEQIDNO.67-68所示的序列是用于扩增HLA-C*01子系的所有等位基因;
优选地,所述SEQIDNO.69-70所示的序列是用于扩增HLA-C*02子系的所有等位基因;
优选地,所述SEQIDNO.71-72所示的序列是用于扩增HLA-C*03子系的所有等位基因;
优选地,所述SEQIDNO.73-74所示的序列是用于扩增HLA-C*03子系的所有等位基因;
优选地,所述SEQIDNO.75-76所示的序列是用于扩增HLA-C*04和C*18子系的所有等位基因;
优选地,所述SEQIDNO.77-78所示的序列是用于扩增HLA-C*05和C*08子系的所有等位基因;
优选地,所述SEQIDNO.79-80所示的序列是用于扩增HLA-C*06和C*12子系的所有等位基因;
优选地,所述SEQIDNO.81-82所示的序列是用于扩增HLA-C*07和C*18子系的所有等位基因;
优选地,所述SEQIDNO.83-84所示的序列是用于扩增HLA-C*07子系的所有等位基因;
优选地,所述SEQIDNO.85-86所示的序列是用于扩增HLA-C*14子系的所有等位基因;
优选地,所述SEQIDNO.87-88所示的序列是用于扩增HLA-C*15子系的所有等位基因;
优选地,所述SEQIDNO.89-90所示的序列是用于扩增HLA-C*16子系的所有等位基因;
优选地,所述SEQIDNO.91-92所示的序列是用于扩增HLA-C*17子系的所有等位基因;
优选地,所述SEQIDNO.93-94所示的序列是用于扩增HLA-C所有血清学家系的等位基因。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的PCR扩增引物,其特征在于,使用所述PCR扩增引物进行PCR扩增所得到的产物片段包括相应的HLA-A、-B和-C基因的所有外显子、内含子和所述基因两端调控区。
6.使用如权利要求1-5中任一项所述的PCR扩增引物扩增得到的HLA-A、-B和-C基因的全长测序引物,其特征在于,所述基因的全长测序引物的序列选自:SEQIDNO.95-108所示的序列,SEQIDNO.109-122所示的序列和SEQIDNO.123-136所示的序列。
7.根据权利要求6所述的基因全长测序引物,其特征在于,所述SEQIDNO.95-108所示的序列用于测序HLA-A基因的全长;
优选地,所述SEQIDNO.109-122所示的序列用于测序HLA-B基因的全长;
优选地,所述SEQIDNO.123-136所示的序列用于测序HLA-C基因的全长。
8.一种HLA基因测序分型方法,其特征在于,所述方法包括如下步骤:
(1)根据样本的血清型,选取相应的、如权利要求1-5任一项所述的组特异性PCR扩增引物,对样本DNA进行PCR扩增,纯化,得到HLA-A、-B和/或-C的基因扩增产物;
(2)利用如权利要求6或7所述的基因全长测序引物,分别对纯化后的HLA-A、-B和-C的基因扩增产物进行测序反应,纯化,得到纯化后的测序扩增产物;
(3)将步骤(2)得到的测序产物在ABI3730电泳仪中电泳,得到序列峰图,导入序列分析软件中进行分析,以进行HLA基因分型。
9.一种HLA基因分型的试剂盒,其特征在于,包括:如权利要求1-5任一项所述的组特异性PCR扩增引物和/或如权利要求6或7所述的基因全长测序引物。
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