CN114686597B - 一种银龙鱼性别鉴定snp分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种银龙鱼性别鉴定SNP分子标记及其应用，碱基序列为：SEQ ID NO.1；所述SNP分子标记为SEQ ID NO.1中第66位、第102位、第119位和/或第229位。通过基因组高通量测序对比以获取银龙鱼雌雄个体之间存在差异且能表征雌雄性别的单核苷酸多肽性位点(SNP)，并结合引物扩增以获得包含SNP位点的扩增序列，在此基础上，通过引物实现待测样本的PCR扩增和测序，获得样本SNP位点信息，从而鉴别待测样本的性别。利用本发明的SNP位点，能在不剖解银龙鱼的前提下实现准确、快速的性别鉴定，且当该SNP位点应用于银龙鱼养殖时，便于实现成熟的人工养殖银龙鱼技术，以实现大量生产。

Description

一种银龙鱼性别鉴定SNP分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及鱼类性别鉴定技术领域，更具体地，涉及一种银龙鱼性别鉴定SNP分子标记及其应用。

背景技术

银龙鱼又称双须骨舌鱼，是一种古老的“活化石”鱼类，作为名贵的观赏鱼具有十分重要的经济价值。目前，国内绝大多数的银龙鱼都是依赖进口，银龙鱼难以实现本土的大量养殖；因为目前银龙鱼繁殖技术受限，难以实现人工大量养殖。而限制繁殖技术的主要原因就体现于银龙鱼雌雄性别区分上的困难。

银龙鱼不具有两性特异性特征，在外部形态上不能区分，即使是在生殖季节，雌雄性鱼的特征也不明显。而且由于银龙鱼具有坚硬厚实的鳞片，通过B超，CT等手段也无法穿透鳞片而判定性别。目前，只能通过解剖观测性腺进行鉴定，无法实现简单、准确而又不需解剖即能鉴定的方法。正是由于没有准确判定性别的手段，才对该鱼的人工繁殖造成了很大的困扰；因为性别难以区分，大多数养殖场只能采用半自然的方法进行繁殖，而不能采用较高效可控的人工繁殖方式，例如雌雄鱼分塘暂养，注射催情剂和催产剂等，大大限制了繁殖效率和成功率。为了打破我国银龙鱼全部依赖进口的局面，银龙鱼的人工繁殖就成了急需解决的问题。

所以，亟需一种有效的银龙鱼性别鉴定方法或标记以区分银龙鱼雌雄性别，从而克服上述问题。

发明内容

本发明旨在克服上述现有技术的至少一种不足，提供一种银龙鱼性别鉴定SNP分子标记及其应用，通过本发明的SNP位点能够在不剖解银龙鱼的前提下实现准确、快速的性别鉴定，从而不影响银龙鱼的正常生长、繁殖，当该SNP位点应用于银龙鱼的养殖时，便于提供性别鉴定而促进养殖技术的成熟和发展，提高繁殖率和成功率。

本发明提供了一种用于银龙鱼性别鉴定的SNP分子标记，碱基序列为：SEQ IDNO.1，长度为659bp；所述SNP分子标记为SEQ ID NO.1中第66位、第102位、第119位和/或第229位。

进一步地，当第66位碱基为T/T时，样品为雄性，为T/C杂合时，样品为雌性；当第102位碱基为A/A时，样品为雄性，为T/A杂合时，样品为雌性；当第119位碱基为T/T时，样品为雄性，为T/C杂合时，样品为雌性；当第229位碱基为C/C时，样品为雄性，为C/G杂合时，样品为雌性。SEQ ID NO.1仅为展示上述变化之一的代表性序列，对应其他包含上述变化的序列也应被保护。

本发明还提供一种用于鉴定或辅助鉴定银龙鱼性别的引物对，包括上游引物F和下游引物R，所述上游引物F的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述下游引物R的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明还提供一种用于鉴定或辅助鉴定银龙鱼性别的试剂盒，含有上述的引物对、dNTP以及DNA聚合酶。

本发明还提供一种银龙鱼性别鉴定方法，包括以下步骤：

(1)提取待测银龙鱼的基因组DNA；

(2)以待测银龙鱼的基因组DNA为模板，利用上游引物F和下游引物R，进行PCR扩增反应；

(3)反应完成后进行分析，确定样品基因型，鉴定性别。

该方法能在不剖解的前提下实现银龙鱼的鉴别，且借助于包括本发明的多种测序方法或测序平台能够实现批量的测序，在此基础上，更有利于应用至银龙鱼的养殖、研究上，从而快速区分银龙鱼的性别，提高鉴别、养殖效率。该鉴定方法不仅快速、简单，且在本发明的一个以上实施例中也有所表明，鉴定结果准确。

进一步地，步骤(2)中PCR扩增反应时采用的反应体系为40μl，包括2*TaqMasterMix(Dye)20μl、PrimerF1.6μl、PrimerR1.6μl、ddH2O15.8μl、基因组DNA 1μl。

进一步地，步骤(2)中PCR扩增反应时PCR扩增程序为：94℃2min；然后进行35个循环，包括94℃30s，56℃30s，72℃30s；然后72℃保持5min结束。

进一步地，步骤(3)中结合Sanger测序进行分析，确定样品基因型，鉴定性别。

本发明还提供了上述用于银龙鱼性别鉴定的SNP分子标记、上述引物对、上述试剂盒和/或上述方法在银龙鱼性别鉴定和/或银龙鱼养殖中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：通过基因组高通量测序对比以获取银龙鱼雌雄个体之间存在差异且能表征雌雄性别的单核苷酸多肽性位点(SNP)，并结合引物扩增以获得包含SNP位点的扩增序列，在此基础上，通过引物实现待测样本的PCR扩增，获得样本SNP位点信息，从而依据SNP位点基因型鉴别待测样本的性别。且本发明通过PCR扩增和Sanger测序即能完成性别的鉴定，较于其他操作繁琐、耗时长的分子鉴定方法，本发明更适用于对大批量样本进行快速鉴定。更重要的是，依据本发明的SNP位点能够简单、准确、快速的鉴别银龙鱼的性别，且不需要进行银龙鱼的解剖，基本不影响被测样本的健康状况，便于实现在银龙鱼养殖技术上的应用，实现银龙鱼的性别配对，大大提高银龙鱼的繁殖效率、繁殖成功率和后代的数量，解决银龙鱼繁育的重大产业问题，具有重要的经济价值和社会价值。且由于银龙鱼为古老鱼类，对其性别分化和性别决定机制的研究，对解释整个鱼类的性别进化、性别决定机制具有重要的科研意义，所以，基于本发明提供的SNP分子标记以及相应的引物、试剂盒、鉴别方法，除了上述有益效果外，还能为鱼类进化、性别决定机制等研究提供基础，促进该研究方向的发展。

附图说明

图1为待测样本PCR产物的电泳结果代表图；

图2为Sanger测序代表图，SNP标记位点1(位置66)的测序峰图，上图为雄性(基因型TT)，下图为雌性(基因型CT)；

图3为Sanger测序代表图，SNP标记位点2(位置102)的测序峰图，上图为雄性(基因型AA)，下图为雌性(基因型AT)；

图4为Sanger测序代表图，SNP标记位点3(位置119)的测序峰图，上图为雄性(基因型TT)，下图为雌性(基因型TC)；

图5为Sanger测序代表图，SNP标记位点4(位置229)的测序峰图，上图为雄性(基因型CC)，下图为雌性(基因型CG)。

具体实施方式

本发明附图仅用于示例性说明，不能理解为对本发明的限制。

实施例1

本实施例中，采用高通量测序策略，选择5例雌性龙鱼样品和5例雄鱼样品进行DNA的提取，根据Illumina文库构建流程要求，构建插入片段大小为500bp的双末端基因组DNA文库。然后采用IlluminaNovaSeq测序平台对基因组进行高通量测序，每样品测序量为30Gb，测序策略为Pair-End 150bp。

采用高通量测序序列比对策略，检测测序的雌性样品的单核苷酸多态性位点(SNP)和雄性样品的单核苷酸多态性位点(SNP)，并筛选雌性样品之间完全相同，雄性样品之间完全相同，且雌雄样品不同的SNP位点作为性别鉴定分子标记。

根据高通量测序对雌性样品和雄性样品进行特异DNA分子标记筛选，发现其基因序列含有区分性别的SNP分子标记。在此基础上，依据高通量测序数据结合引物进行扩增，以获得包含SNP位点且能用于PCR、Sanger测序而鉴定银龙鱼雌雄性别的序列，具体的，引物包括序列如SEQ ID NO.2所示的上游引物F和序列如SEQ ID NO.3所示的下游引物R，获得的包含SNP位点的序列如SEQ ID NO.1所示。且所述SNP分子标记为SEQ ID NO.1中第66位、第102位、第119位和/或第229位。

具体的，表现于序列中如下所示：

GCTCGCACAACGCATACAGAagatgagcggtcatgtggaaatgactgtttagggggtcaaagagc[T/C]gcggcaggggcacggtccagccgggagccacgggg[A/T]ttgcgtcccatcacca[T/C]tcggtcaccggctgtcaacccgttctacgcggctcagatatgacccgctgaccccgcccacgcttcccttcagctctgtcacctgcaggagtcggagcagggtccgtca[C/G]acgtcctgcagctccgtcctgcctgcccacatctcatcgacttctggcctttctgtattcaaagtgtggcgctttgatgaggagagcggagataatcgccgcctgtgattaatgaatgcggggtcctgcgattcattactggcctgagattcattataagcctccgctggttccgcttgataagatctcctgcagttcgagcgtttcaacgtgacgtgatgcgttggcgttccctgtctatccgctgtttgatgcgtccttattcttcccggtcgcctgtttcacatgaagtcgttcatctgatgcttttctccaatgaaacttgcagtgtaatgcagtttagtgatttttttttttttttttaactgttgtacagctgggtaatttcactctgttggttcagtcacatgCGTTGGTAAGGGTTGCTACA。为方便表示，以大写字母突出特殊位点，上述序列中，大写字母为引物序列或SNP位点。

引物信息如下表所示：

且在上述包含SNP位点的序列中，SNP位点与雌雄的对应关系如下表所示：

由此，所述SNP分子标记能用于区分银龙鱼的雌雄性别。

实施例2

为了验证SNP位点鉴别银龙鱼性别的准确性，本实施例则进行了实施例1中SNP分子标记的验证，通过PCR及Sanger测序的方法验证银龙鱼检测的分子标记是否准确。具体的，从非高通量测序样本中，提取基因组DNA，通过PCR和Sanger测序的方式验证引物的特异性，并与银龙鱼样本的生理学性别相互对照，确认实施例1中的SNP分子标记、引物是否能够用于银龙鱼性别鉴定。

1、样本准备

选择银龙鱼样本60份，含30份雌性样品和30份雄性样品，进行验证，下表为样品信息：

实验验证样品

2、基因组DNA提取

采用通用型柱式基因组DNA提取试剂盒进行提取，所述DNA提取试剂盒购自北京康为世纪科技有限公司，货号：CW2298M，提取过程参照试剂盒说明书进行。

3、PCR扩增

1)试剂耗材

DNA聚合酶：2*TaqMasterMix(Dye)(购自北京康为世纪科技有限公司,货号:CW0682L)；步骤2中提取的待测样本基因组DNA；Primer：包括PrimerF和PrimerR，PrimerF、PrimerR核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示，由华大基因合成；ddH₂O。

2)PCR反应体系(如下表所示)

3)PCR反应条件(如下表所示)

4、琼脂糖凝胶图

检测PCR扩增是否成功，进行琼脂糖凝胶电泳。具体的，条件包括：胶浓度1％、电压180V、时间20min；Marker：M为DM2000，购自北京康为世纪科技有限公司，货号：CW0632M。PCR产物的电泳结果如图1所示。

5、Sanger测序鉴定结果

在PCR扩增后，进行Sanger测序分析。结果如下表所示，依据SNP位点反应的雌雄性别信息与生理学解剖而确认的性别信息一致。即能通过上述引物F、R以及包含SNP位点的序列能实现准确的银龙鱼雌雄性别鉴定，且相较于传统的雌雄鉴别，不需要进行生物剖解。

样品测序基因型性别判定与解剖基因型性别判定结果对照

实施例3

本实施例提供了一种银龙鱼性别鉴定方法，包括以下步骤：

(1)提取待测银龙鱼的基因组DNA；

(2)以待测银龙鱼的基因组DNA为模板，利用序列分别如SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.3所示的上游引物F和下游引物R，进行PCR扩增反应；

(3)反应完成后结合Sanger测序进行分析，确定样品基因型，依据序列SEQ IDNO.1中第66、102、119和/或229位鉴定性别。

具体的，步骤(2)PCR扩增反应时采用的反应体系、扩增程序与实施例2中相同。

实施例4

本实施例中，提供序列如SEQ ID NO.1所示SNP分子标记、序列分别如SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.3所示的上游引物F和下游引物R、包含引物F、R的试剂盒和/或实施例3的鉴定方法在银龙鱼性别鉴定和/或银龙鱼养殖中的应用。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明技术方案所作的举例，而并非是对本发明的具体实施方式的限定。凡在本发明权利要求书的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国水产科学研究院珠江水产研究所

<120> 一种银龙鱼性别鉴定SNP分子标记及其应用

<130>

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 659

<212> DNA

<213> 未知

<400> 1

gctcgcacaa cgcatacaga agatgagcgg tcatgtggaa atgactgttt agggggtcaa 60

agagctgcgg caggggcacg gtccagccgg gagccacggg gattgcgtcc catcaccatt 120

cggtcaccgg ctgtcaaccc gttctacgcg gctcagatat gacccgctga ccccgcccac 180

gcttcccttc agctctgtca cctgcaggag tcggagcagg gtccgtcaca cgtcctgcag 240

ctccgtcctg cctgcccaca tctcatcgac ttctggcctt tctgtattca aagtgtggcg 300

ctttgatgag gagagcggag ataatcgccg cctgtgatta atgaatgcgg ggtcctgcga 360

ttcattactg gcctgagatt cattataagc ctccgctggt tccgcttgat aagatctcct 420

gcagttcgag cgtttcaacg tgacgtgatg cgttggcgtt ccctgtctat ccgctgtttg 480

atgcgtcctt attcttcccg gtcgcctgtt tcacatgaag tcgttcatct gatgcttttc 540

tccaatgaaa cttgcagtgt aatgcagttt agtgattttt tttttttttt ttaactgttg 600

tacagctggg taatttcact ctgttggttc agtcacatgc gttggtaagg gttgctaca 659

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 未知

<400> 2

gctcgcacaa cgcatacaga 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 未知

<400> 3

tgtagcaacc cttaccaacg 20

Claims (9)

1.一种银龙鱼性别鉴定SNP分子标记，其特征在于，所述分子标记的核苷酸序列如SEQID NO.1所示，其中该序列第66位为T或C，第102位为A或T，第119位为T或C，第229位为C或G。

2.根据权利要求1所述的银龙鱼性别鉴定SNP分子标记，其特征在于，当第66位碱基为T/T时，样品为雄性，为T/C杂合时，样品为雌性；当第102位碱基为A/A时，样品为雄性，为T/A杂合时，样品为雌性；当第119位碱基为T/T时，样品为雄性，为T/C杂合时，样品为雌性；当第229位碱基为C/C时，样品为雄性，为C/G杂合时，样品为雌性。

3.一种用于鉴定或辅助鉴定银龙鱼性别的引物对，其特征在于，包括上游引物F和下游引物R，所述上游引物F的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述下游引物R的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

4.一种用于鉴定或辅助鉴定银龙鱼性别的试剂盒，其特征在于，含有权利要求3所述的引物对、dNTP以及DNA聚合酶。

5.一种银龙鱼性别鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）提取待测银龙鱼的基因组DNA；

（2）以待测银龙鱼的基因组DNA为模板，利用权利要求3所述上游引物F和下游引物R，进行PCR扩增反应；

（3）反应完成后进行分析，确定样品基因型，鉴定性别。

6.根据权利要求5所述的银龙鱼性别鉴定方法，其特征在于，步骤（2）中PCR扩增反应时采用的反应体系为40μl，包括2*TaqMasterMix(Dye) 20μl、PrimerF 1.6μl、PrimerR 1.6μl、ddH₂O15.8μl、基因组DNA 1μl。

7.根据权利要求5所述的银龙鱼性别鉴定方法，其特征在于，步骤（2）中PCR扩增反应时PCR扩增程序为：94℃ 2min；然后进行35个循环，包括94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 30s；然后72℃保持5min结束。

8.根据权利要求5所述的银龙鱼性别鉴定方法，其特征在于，步骤（3）中结合Sanger测序进行分析，确定样品基因型，鉴定性别。

9.权利要求1~2任一项所述用于银龙鱼性别鉴定的SNP分子标记、权利要求3所述引物对、权利要求4所述试剂盒和/或权利要求5~8任一项所述方法在银龙鱼性别鉴定和/或银龙鱼养殖中的应用。

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