CN110885882B - 一种可同时在dna或rna水平鉴定凡纳滨对虾遗传性别的方法 - Google Patents

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Abstract

对虾的早期遗传性别鉴定不但在生产过程中具有重要意义，在研究性别决定和性别分化的分子机制方面也同样有重要作用。之前所报道的对虾遗传鉴定方法是只能利用个体的DNA进行分子鉴定，目前尚未见有关同时可以用DNA和RNA鉴定性别的方法。本发明提供了一种可同时在DNA和RNA水平鉴定凡纳滨对虾性别的方法，利用在性别相关基因上的3个雌雄差异的SNP标记，通过对这些SNP进行分型，可以实现通过个体的DNA或者RNA进行性别鉴定。本发明突破了之前利用个体RNA无法实现性别鉴定的障碍，提供了一条新的性别鉴定方法和途径，为后续的性别决定和性别分化研究提供了有利的工具。

Description

一种可同时在DNA或RNA水平鉴定凡纳滨对虾遗传性别的方法
技术领域
本发明属于分子生物学和遗传育种领域，具体涉及一种可同时在DNA和RNA水平鉴定凡纳滨对虾性别的方法。
背景技术
性别决定是生命科学的重要生物学过程，研究生物的性别决定机制，对于揭示性别的进化具有重要的作用。同时，由于较多经济动物的雌雄性别个体在生长性状表现出明显的差异，因此研究性别决定对于单性控制和单性品种的培育也具有重要的意义。
凡纳滨对虾是我国主要的海水养殖品种，年产量达150万吨。该品种的雌雄个体在中后期表现出明显的生长差异，雌性个体的生长速度显著高于雄性，因此研究其性别决定和性别调控的机制具有重要的意义。开展性别决定的首要问题是实现遗传性别的准确鉴定，尤其是在发育早期实现遗传性别鉴定对于性别决定和性别分化的解析，以及性别控制方法的建立具有重要作用。
在凡纳滨对虾中，前期已经鉴定获得了凡纳滨对虾的性别标记(李富花，于洋，张晓军，相建海。一种用于凡纳滨对虾遗传性别鉴定的DNA探针序列及获取方法，ZL201510245304.9)，利用该标记可以利用个体的DNA实现性别的准确鉴定。然而，该标记位于基因组的非编码区，其不发生转录，因此在RNA水平无法检测该标记。然而，在研究性别决定和分化时，对所提取个体RNA进行性别鉴定非常重要，该技术的缺乏限制了凡纳滨对虾性别研究工作的开展。
发明内容
本发明旨在提供一种可同时在DNA和RNA水平鉴定凡纳滨对虾遗传性别的方法，该方法既可以通过提取DNA进行性别鉴定，也可以通过提取RNA进行性别鉴定，大大拓宽了性别鉴定的应用范围，在性别决定和性别分化的研究中具有重要作用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种可同时在DNA和RNA水平鉴定凡纳滨对虾遗传性别的方法，提取凡纳滨对虾的DNA或者RNA，对于提取的DNA，对SEQLvDRSM 112bp、118bp和416bp位置的SNP进行分型，若这三个位点分别为TC、TC和AT杂合，则该个体为雌虾，若这三个位点为TT、TT和AA纯合，则该个体为雄虾；对于提取的RNA，首先将RNA反转录成cDNA，之后同样对cDNA中的SEQLvDRSM112bp、118bp和416bp位置的SNP进行分型，若这三个位点为TC、TC和AT杂合，则该个体为雌虾，若这三个位点为TT、TT和AA纯合，则该个体为雄虾。
SEQLvDRSM序列为：
AACGGGAATACTCTCTTCTCCAGACCGCTGCTGCTGATTCCTCTCTCTATATTTATTCCTCATTTTCTTTATCTGAAGATGACTTTGGATTTATACTACGCTGCATCCATCTTCTAATTTTTTGTTTGGAATATACCGTTAGCGAGTGTGAGTTCGGTTTTGGTGAACTATTCTGACAAAAGTAGTGAATGTGCGTTTAACGGTTTGAAAGTTGTTAGTTGCGAAGTAGAAATTGGATGCTTCGGTGCTCTGTGACTTAGCTAGTGCTTCTTGGAACACTTGTGGTTGTTTGTTCTATATATTTTTGAAAGAAGCAAATTTCTACAGTGATAAATGTGAGACAGGCGAGCGAAAAGAGTGAGAAGTAATCGAAAACAAAGCTTAATCACTACAATTTGATACCTCAGCAAGTCTAAAAGATATGGAATAAACAAAGAAAATTCTACGATGAAATATTCACACACTGCTGTACATATTTGAAATGAAATCCGTCTAAAGACTACAACATAGAAGTGAATTGT
本发明还提供了一种用于权利要求1所述SEQLvDRSM 112bp、118bp和416bp位置的SNP分型的方法，具体如下：使用LvDRSMF：AACGGGAATACTCTCTTCTCCAG和LvDRSMR：ACAATTCACTTCTATGTTGTAGTCTTT，对DNA或者RNA反转后的cDNA进行PCR扩增，扩增产物使用LvDRSMF进行测序，根据测序峰图获得SEQLvDRSM 112bp、118bp和416bp位置的SNP信息，若这三个位点为TC、TC和AT杂合，则该个体为雌虾，若这三个位点为TT、TT和AA纯合，则该个体为雄虾。
本发明提供了一种可同时在DNA和RNA水平鉴定凡纳滨对虾性别的方法，利用在性别相关基因上的3个雌雄差异的SNP标记，通过对这些SNP进行分型，可以实现通过个体的DNA或者RNA进行性别鉴定。本发明突破了之前利用个体RNA无法实现性别鉴定的障碍，提供了一条新的性别鉴定方法和途径，为后续的性别决定和性别分化研究提供了有利的工具。
本发明所具有的优点：
(1)本发明所提供的性别鉴定方法，既可以通过提取个体DNA进行性别鉴定，也可以通过提取个体的RNA进行性别鉴定，提高了凡纳滨对虾性别鉴定的适应范围。
(2)本发明提供的性别鉴定方法，操作简单，结果准确可靠，在对虾育种和性别基础研究中具有重要作用。
具体实施方式
实施例1：通过提取组织的DNA来鉴定凡纳滨对虾的遗传性别
(1)材料来源
利用实验室收集的已知性别的6种不同种质资源的材料，每个种质材料16尾个体，共96个个体，雌雄比例1：1。使用天根植物基因组提取试剂盒提取个体DNA，DNA使用Nanodrop1000分光光度计进行浓度测定，通过琼脂糖凝胶电泳检测条带完整性。
(2)PCR扩增和测序分析
针对上述96个个体，使用天根Golden easy PCR mix(天根，中国北京)进行扩增，扩增体系如下：2μl DNA模板，0.5μl LvDRSMF和0.5μl LvDRSMR，12.5μl PCR mix，9.5μl灭菌水，体系共计25ul。PCR反应程序为：94℃预变性3min,(94℃30s,55℃30s,72℃30s)共计35个循环,72℃延伸10min。
LvDRSMF：AACGGGAATACTCTCTTCTCCAG；
LvDRSMR：ACAATTCACTTCTATGTTGTAGTCTTT；
(3)PCR产物测序和SNP分型
上述PCR产物经琼脂糖电泳后使用天根胶回收试剂盒进行产物回收，使用LvDRSMF引物进行一代测序，获得测序的序列，查看SEQLvDRSM 112bp、118bp和416bp位置的碱基对，若这三个位点分别为TC、TC和AT杂合，则该个体为雌虾，若这三个位点为TT、TT和AA纯合，则该个体为雄虾。
(4)鉴定准确率分析
将通过该方法鉴定的遗传性别与已知个体的性别进行分析，结果显示通过该方法鉴定的遗传性别与个体的外观性别(已知性别)完全一致，利用该方法鉴定的准确率为100％。
实施例2：利用组织RNA鉴定凡纳滨对虾的遗传性别
(1)材料来源
检测的材料来源于中国科学院海洋所水族楼养殖的对虾，雌雄个体各取6尾个体，取样后置于液氮中冻存，之后保存于-80度冰箱。
(2)RNA提取
个体在液氮中研磨，取适量组织粉末50-100mg，加入1ml RNAiso plus(TaKaRa)，加磁珠震荡15s重复1～2次至充分混匀，室温静置5min；12000g，4℃离心5min后将上清液(约900ul)转入新1.5ml离心管；加入1/5上述RNAiso plus体积的氯仿(200μl)剧烈震荡混匀10s；12000g，4℃离心15min，将上清液转入新离心管中(400μl)，加入与上清液等体积异丙醇，轻柔混匀；室温静置10min或-20℃放20min以上；12000g，4℃离心10min，可见沉淀；吸出液体，加1ml体积浓度75％乙醇(DEPC水配制)洗沉淀后离心干燥，用DEPC水溶解获得RNA。
(3)RNA反转成cDNA
测定RNA浓度，稀释至1000ng/μl，使用TAKARA反转录试剂盒对提取的RNA进行反转录，首先去除体系中的基因组DNA，反应体系如下所示：2μl 5×gDNA Eraser Buffer，1μlgDNA Eraser，7ul的RNA(1ug)+DEPC水，温度设置为42摄氏度2min。之后向上一步10ul溶液中加入4μl的5×prime saript buffer2，1μl的prime script RT Enzyme Mix，1μl的RTprimer Mix，4μl DEPC水，反应温度为：37℃，15min；85℃，5s；4℃，10min。反转录后的cDNA保存于-80度，将逆转录好的cDNA稀释10倍作为模板使用。
(4)PCR扩增和测序分析
以上述雌雄各6位个体RNA反转录形成的cDNA为模板，使用天根Golden easy PCRmix进行扩增，扩增体系如下：2μl DNA模板，0.5μl LvDRSMF和0.5μl LvDRSMR，12.5μl PCRmix，9.5μl灭菌水，体系共计25ul。PCR反应程序为：94℃预变性3min,(94℃30s,55℃30s,72℃30s)共计35个循环,72℃延伸10min。
(5)PCR产物测序和SNP分型
上述PCR产物经琼脂糖电泳后使用天根胶回收试剂盒进行产物回收，使用LvDRSMF引物进行一代测序，获得测序的序列，查看SEQLvDRSM 112bp、118bp和416bp位置的碱基信息，结果显示所有的6尾雌性个体这三个位点分别为TC、TC和AT杂合，所有的6尾雄性个体这三个位点为TT、TT和AA纯合，与表型鉴定结果完全一致。
序列表
<110> 中国科学院海洋研究所
<120> 一种可同时在DNA 或RNA水平鉴定凡纳滨对虾遗传性别的方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 521
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aacgggaata ctctcttctc cagaccgctg ctgctgattc ctctctctat atttattcct 60
cattttcttt atctgaagat gactttggat ttatactacg ctgcatccat cttctaattt 120
tttgtttgga atataccgtt agcgagtgtg agttcggttt tggtgaacta ttctgacaaa 180
agtagtgaat gtgcgtttaa cggtttgaaa gttgttagtt gcgaagtaga aattggatgc 240
ttcggtgctc tgtgacttag ctagtgcttc ttggaacact tgtggttgtt tgttctatat 300
atttttgaaa gaagcaaatt tctacagtga taaatgtgag acaggcgagc gaaaagagtg 360
agaagtaatc gaaaacaaag cttaatcact acaatttgat acctcagcaa gtctaaaaga 420
tatggaataa acaaagaaaa ttctacgatg aaatattcac acactgctgt acatatttga 480
aatgaaatcc gtctaaagac tacaacatag aagtgaattg t 521

Claims (2)

1.一种可同时在DNA 或RNA水平鉴定凡纳滨对虾遗传性别的方法，其特征在于：提取凡纳滨对虾的DNA或者RNA；
对于利用个体的DNA进行分子鉴定，利用SEQLvDRSM 序列的第112bp、118bp和416bp位置的SNP进行分型，若这三个位点分别为TC、TC和AT杂合，则该个体为雌虾；若这三个位点为TT、TT和AA纯合，则该个体为雄虾；
或，对于利用个体的RNA进行分子鉴定，首先将RNA反转录成cDNA，之后同样对cDNA中的SEQLvDRSM 序列的第112bp、118bp和416bp位置的SNP进行分型，若这三个位点为TC、TC和AT杂合，则该个体为雌虾，若这三个位点为TT、TT和AA纯合，则该个体为雄虾；所述的SEQLvDRSM 序列为：
AACGGGAATACTCTCTTCTCCAGACCGCTGCTGCTGATTCCTCTCTCTATATTTATTCCTCATTTTCTTTATCTGAAGATGACTTTGGATTTATACTACGCTGCATCCATCTTCTAATTTTTTGTTTGGAATATACCGTTAGCGAGTGTGAGTTCGGTTTTGGTGAACTATTCTGACAAAAGTAGTGAATGTGCGTTTAACGGTTTGAAAGTTGTTAGTTGCGAAGTAGAAATTGGATGCTTCGGTGCTCTGTGACTTAGCTAGTGCTTCTTGGAACACTTGTGGTTGTTTGTTCTATATATTTTTGAAAGAAGCAAATTTCTACAGTGATAAATGTGAGACAGGCGAGCGAAAAGAGTGAGAAGTAATCGAAAACAAAGCTTAATCACTACAATTTGATACCTCAGCAAGTCTAAAAGATATGGAATAAACAAAGAAAATTCTACGATGAAATATTCACACACTGCTGTACATATTTGAAATGAAATCCGTCTAAAGACTACAACATAGAAGTGAATTGT。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的SNP分型的方法，包括但是不限于如下方法：使用LvDRSMF：AACGGGAATACTCTCTTCTCCAG和LvDRSMR：ACAATTCACTTCTATGTTGTAGTCTTT，对DNA或者RNA反转后的cDNA进行PCR扩增，扩增产物使用LvDRSMF进行测序，根据测序峰图获得SEQLvDRSM序列的第112bp、118bp和416bp位置的SNP信息，若这三个位点为TC、TC和AT杂合，则该个体为雌虾，若这三个位点为TT、TT和AA纯合，则该个体为雄虾。
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朱春华 ; 冉维亮 ; 邓思平 ; 李广丽 ; .环境因子对凡纳滨对虾性别分化的影响.水生生物学报.2011,(第03期),第414-422页. *

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