CN116694644B - 一种中华鳖雌性特异Rab35基因及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于中华鳖育种技术领域，尤其涉及一种中华鳖雌性特异Rab35基因及其应用。所述Rab35基因的cDNA序列如SEQ ID NO.1所示。本发明提供的Rab35基因作为雌性特异基因，通过检测中华鳖个体中该基因的有无，可实现在基因层面快速、高效地检测个体性别，有利于实现多样本、大规模群体的性别鉴定，不受样本量和养殖时期的限制，在中华鳖性别鉴定领域具有广阔的应用前景。而且，通过降低该基因的表达或敲除该基因，可以实现中华鳖雌性个体的性别逆转，为有目的地人为决定中华鳖性别提供了新的解决方案，为高效培育雄性个体和实现单性养殖提供了科学依据，具有重要的市场价值和较高的经济效益。

Description

一种中华鳖雌性特异Rab35基因及其应用
技术领域
本发明涉及中华鳖育种技术领域，特别涉及一种中华鳖雌性特异Rab35基因及其应用。
背景技术
中华鳖(Pelodiscus sinensis)属爬行纲(Reptilia)、龟鳖目(Chelonia)、鳖科(Trionychidae)、鳖属(sinensis)，俗称甲鱼、水鱼、团鱼，是我国重要的名特优水产养殖品种，主要分布于我国的长江流域、黄河流域和华南地区。作为深受消费者喜爱的“名特优”水产养殖品种，中华鳖是我国传统的滋补佳品，具有较高的食用和药用价值。中华鳖不同性别和个体间存在着明显的生长差异，雄性个体大，生长速度远远优于雌性，而且裙边宽厚，肌肉中脂肪少，营养价值更高，因此在中华鳖养殖过程中存在“去雌留雄”的普遍现象，实现全雄或高雄繁育的养殖模式可提高养殖产量，增加经济效益。因此，中华鳖的性别控制研究已成为中华鳖育种和养殖的研究热点。
在水产动物中，由性别不同导致的生产性能差异对水产养殖业具有重要的意义，是研究水产动物性别控制的原动力。目前在中华鳖的性别控制研究方面，有温度诱导和外源激素诱导等方法，这些方法均可获得一定比例的性逆转个体。但是前述方法存在很大的不确定性，较难达到彻底的性逆转效果，个体雄性化的比率不高，且高剂量的外源激素极易导致胚胎发育以及性腺发育的不正常，而且通常需要较长的时间实现性逆转，此外，需要实时监控环境温度和每天滴加药物，操作繁琐，生产效益不高。基于此，开发新的性别控制方法刻不容缓。尽管已开展大量关于中华鳖性别控制及单性繁育的相关探索，但未能取得实质性进展，究其根本原因，是中华鳖性别决定机理研究的还非常有限，尚未有明确结论，解析中华鳖性别决定的分子机制是不可或缺的一步，性别特异基因的获得则是阐述其性别决定分子机制及性别控制育种的重要前提。然而，迄今为止有关中华鳖的性别决定基因仍是未知，因此急需挖掘更多的中华鳖性别特异基因。
此外，在中华鳖全雄或高雄育种过程中，准确鉴定性逆转的雄性化个体，对于中华鳖性别控制和全雄苗种培育研究具有重要的意义。目前，并没有有效的鉴定中华鳖性别的方法，常规通过例如核型分析或分析比较基因组杂交图鉴别中华鳖胚胎及稚鳖的性别难度大，花费时间长，且存在一定的错误率；也可以通过组织切片等方式对中华鳖的生理性别进行鉴定，但是需要解剖采集性腺组织，创伤性大，易造成中华鳖的死亡，而且前述方法无法实现大批量、多样本群体材料的高效检测。基于中华鳖性别特异基因开发一种基因层面的鉴定方法为中华鳖个体高效、快速、便捷的性别鉴定难题提供了解决思路。
综上，寻找中华鳖性别特异相关基因、并对中华鳖性别特异基因的功能分析和性别调控应用进行研究，在基因水平探讨中华鳖性别决定机制和性别分化机理对于中华鳖雄性个体快速筛选、鉴定和水产养殖高效选育良种意义重大。
发明内容
针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种中华鳖雌性特异Rab35基因，并提供了该基因的应用，尤其是在中华鳖性别鉴定或性别控制育种中的应用，以解决或至少缓解现有技术中的部分问题。
本发明具体通过以下技术方案实现：
本发明的第一方面提供了一种中华鳖雌性特异Rab35基因，所述Rab35基因的cDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明的第二方面提供了如上所述的中华鳖雌性特异Rab35基因在中华鳖性别鉴定中的应用。
进一步地，利用PCR扩增技术进行中华鳖性别鉴定，包括以下步骤：
S11、以中华鳖待测个体的基因组DNA或者cDNA作为模板，以SEQ ID NO.2-3所示或SEQ ID NO.4-5所示的引物对，通过PCR扩增所述Rab35基因；
S12、检测步骤S11的扩增产物中是否含有所述Rab35基因，若存在所述Rab35基因，则所述待测个体为雌性个体，若不存在所述Rab35基因，则所述待测个体为雄性个体。
进一步地，当以所述待测个体的基因组DNA作为模板时，采用SEQ ID NO.4-5所示的引物对进行扩增；
当以所述待测个体的基因组cDNA作为模板时，采用SEQ ID NO.2-3所示的引物对进行扩增。
进一步地，步骤S11中，PCR扩增反应体系以20μL计，包括：10μL PCR Mix，正向引物和反向引物各1μL，模板1μL，超纯水7μL；PCR扩增程序包括：94℃30s，98℃10s，58℃-60℃30s，72℃60s，35循环，72℃2min，16℃∞。
进一步地，步骤S12中，通过测序技术或者琼脂糖凝胶电泳技术检测步骤S11的扩增产物中是否含有所述Rab35基因。
本发明的第三方面提供了如上所述的中华鳖雌性特异Rab35基因在中华鳖性别控制育种中的应用。
进一步地，利用RNA干扰技术进行中华鳖性别控制育种，包括以下步骤：
S21、设计靶向Rab35基因的干扰RNA，将所述干扰RNA的编码序列插入到出发载体中，构建用于干扰所述Rab35基因表达的干扰载体；其中，所述干扰RNA的编码序列如SEQ IDNO.6所示；
S22、将所述干扰载体转入中华鳖胚胎，孵化所述胚胎，获得所述Rab35基因表达水平降低的转基因中华鳖。
进一步地，步骤S21中，所述出发载体为腺病毒载体pAdEasy-U6-CMV-EGFP。
进一步地，步骤S22中，转入方法包括显微注射法、基因枪法或电击法。
本发明的第四方面提供了一种中华鳖性别鉴定试剂盒，所述性别鉴定试剂盒包括扩增Rab35基因的引物对，所述引物对的序列如SEQ ID NO.2-3或SEQ ID NO.4-5所示，所述Rab35基因的cDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明的第五方面提供了一种中华鳖性别控制育种试剂盒，所述性别控制育种试剂盒包括干扰载体，所述干扰载体插入有靶向所述Rab35基因的干扰RNA的编码序列，用于干扰所述Rab35基因表达，所述干扰RNA的编码序列如SEQ ID NO.6所示，所述Rab35基因的cDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明的优点及积极效果为：
本发明提供的Rab35基因作为雌性特异基因，通过检测中华鳖个体中该基因的有无，可实现在基因层面快速、高效地检测个体性别，有利于实现多样本、大规模群体的性别鉴定，不受样本量和养殖时期的限制，在中华鳖性别鉴定领域具有广阔的应用前景。而且，通过降低该基因的表达或敲除该基因，可以实现中华鳖雌性个体的性别逆转，为有目的地人为决定中华鳖性别提供了新的解决方案，为高效培育雄性个体和实现单性养殖提供了科学依据，具有重要的市场价值和较高的经济效益。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例Rab35基因在不同时期中华鳖雌雄性腺中转录组测序表达谱；
图2为本发明实施例中华鳖Rab35基因cDNA序列及推导氨基酸序列；其中，*号表示终止密码子，下划线部分表示F1/R1引物对配对区域，灰色阴影部分表示F2/R2引物对配对区域；
图3为本发明实施例Rab35基因在中华鳖雌性成体各组织中的扩增情况图；其中，H表示心脏(Heart)，L表示肝脏(Liver)，S表示脾脏(Spleen)，K表示肾脏(Kidney)，B表示大脑(Brain)，M表示肌肉(Muscle)，O表示卵巢(Ovary)，T表示精巢(Testes)。
图4为本发明实施例中华鳖Rab35基因在雌雄成体各组织中的相对表达量分布图；其中，H表示心脏(Heart)，L表示肝脏(Liver)，S表示脾脏(Spleen)，K表示肾脏(Kidney)，B表示大脑(Brain)，M表示肌肉(Muscle)，O表示卵巢(Ovary)，T表示精巢(Testes)。
图5为本发明实施例利用引物对F1/R1扩增中华鳖雌雄成体性腺组织基因组cDNA中Rab35基因的扩增情况图；
图6为本发明实施例利用引物对F2/R2扩增中华鳖雌雄成体性腺组织基因组DNA中Rab5基因的扩增情况图；
图7为本发明实施例腺病毒Rab35-RNAi干扰载体的图谱；
图8为本发明实施例注射腺病毒后第二天中华鳖胚胎(图c)和性腺(图d)中绿色荧光信号分布图；
图9为本发明实施例注射干扰载体后，孵化出壳的雌性中华鳖性腺中Rab35基因相对表达量变化图；
图10为本发明实施例自然孵化出壳的中华鳖稚鳖的组织H&E染色图，其中，图A-C分别表示对照组、Rab35敲降组和雄性性腺切片H&E染色图，图A’-C’分别表示图A-C的局部放大图；
图11为本发明实施例Rab35基因敲降后中华鳖稚鳖性腺组织中性别相关基因相对表达量变化图，其中，图A-D分别表示Foxl2、Cyp19a、Dmrt1和Amh相对表达量，*表示P<0.05。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。此处所描述的实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
根据本发明包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。
为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本发明中所用的表示用量、百分比的所有数字以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。术语“大约”具有其通常的含义，用于表示一个值包括用于确定该值的设备或方法的误差的固有变化，或包含接近所述值的值，例如在所述值(或值的范围)的10％之内。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。
另外，需要说明的是，除非另外定义，在本发明的上下文中，使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
术语“包括”、“包含”、“含有”、“具有”等类似词语的含义是非限制性的，即可加入不影响结果的其它步骤和其它成分。术语“和/或”应被视对在具有或不具有另一者的情况下两种指定特征或组分中的每一种的具体公开。例如，“A和/或B”将被视为包含以下情形：(i)A、(ii)B、以及(iii)A和B。
术语“基因”是产生一条多肽链或功能RNA所需的全部核苷酸序列。因此，基因的表达包括转录和衍生自基因的编码RNA(mRNA)或功能RNA的稳定积聚，也可指将mRNA翻译成多肽或蛋白。基因可以包含数种可操作地连接的核酸片段，例如5’非编码区、编码区和包含聚腺苷酸化位点的3’非编码区。一般非编码区是指不能够转录mRNA的区域，具有基因表达的调控功能，如启动子和终止子。编码区是指能够转录成mRNA的部分，包括外显子和内含子，外显子具有必要的密码子或蛋白质合成所需的信息。内含子是基因内的非编码序列，在mRNA成熟期间通过RNA剪接去除。
术语“信使RNA(mRNA)”指可以由生物体翻译成蛋白质的RNA，成熟mRNA的主体序列是编码序列(编码区)，在其上游5’侧和下游3'侧有非编码区(Untranslated Regions，UTR)。
术语“cDNA”是指经过逆转录后与RNA分子(如mRNA)反向互补的DNA分子(第一链cDNA)或具有与RNA分子相同的序列除了U是T的DNA分子(第二链cDNA)。cDNA没有内含子而只有外显子的序列。
术语“载体”是指将外源基因转移至宿主生物体如(例如本发明的中华鳖)内的一种能自我复制的DNA分子，并且常常是环状双链DNA分子的形式，含有外源基因的载体即为重组载体。典型载体包括质粒、病毒、噬菌体、黏粒和微型染色体。质粒是最常见的载体形式，因此，在本发明的上下文中，质粒和载体可以互换使用。
术语“导入”或“转入”指外源基因(如靶向Rab35基因的干扰RNA的编码序列)向宿主生物体内的转移，导致基因稳定的遗传。导入的基因可以是宿主生物体中保留的质粒形式，或者一些导入的基因可以被整合进宿主生物体基因组中。可以通过“转染”、“转化”或“转导”等方式将目的基因和载体转入宿主生物体中。含有导入基因的宿主生物体被称为“转基因”或“重组”或“转化”生物体或“工程”生物体。载体导入宿主生物体可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为中华鳖时，转化可用显微注射、电击法、基因枪等方法。
术语“RNA干扰(RNA interference，RNAi)”是指在宿主生物体内引入与靶基因序列相同的外源双链RNA而导致的靶基因表达水平下降的现象，在本发明的上下文中，“敲降”、“敲低”“干扰”等类似语具有相同含义。
比较Ct值法是研究基因表达水平常用的方法，定量结果由目的基因和内参基因Ct值之间的差值(△Ct或△△Ct)来反映目的基因的相对表达量。术语“Ct”或“Ct值”是指每个反应管内的荧光信号到达设定域值时所经历的循环数。每个样品模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更为明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施例做详细说明。
本发明实施例提供了一种中华鳖雌性特异Rab35基因，所述Rab35基因的cDNA序列如SEQ ID NO.1所示。分析结果显示，中华鳖Rab35基因cDNA序列全长3220bp，包括150bp的5'-非翻译区(5'-UTR)，2464bp的3'非翻译区(3'-UTR)，和编码201个氨基酸的606bp开放阅读框(ORF)。
Rab35蛋白(Ras-related protein Rab-35)作为Rab GTPase家族成员之一，是一种可结合GTP并将其水解的小G蛋白(small G-protein or small GTPase)，广泛表达于各种真核生物中。研究表明Rab35蛋白是一个重要的内吞过程的分子开关，调节多种细胞内部过程，包括细胞分裂、细胞迁移和神经轴突的生长。然而目前鲜见关于Rab35基因在中华鳖上的研究报道。
本发明通过比较雌雄中华鳖胚胎性腺转录组数据，发现中华鳖Rab35基因在各时期雌性性腺中特异高表达，即，该基因在雌性个体的性腺组织中表达量较高，在雄性个体中不表达，并通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)进一步验证了该结果；由此表明Rab35基因为雌性特异性基因。根据Rab35的cDNA序列以及基因组DNA序列分别设计特异性扩增引物，仅在雌性性腺和个体中扩增出条带，而雄性无扩增，证实其可作为中华鳖性别鉴别的分子标记。
通过RNA干扰技术研究Rab35基因的作用机理，根据中华鳖Rab35基因cDNA序列设计干扰RNA，之后利用载体转入雌性胚胎中，观察性腺组织形态发现，抑制或降低中华鳖雌性个体中Rab35基因的表达，雌性性腺将出现雄性化特征，而且，qRT-PCR检测发现，敲降雌性Rab35，雌性性腺中特异基因Foxl2显著下调，雄性特异基因Dmrt1显著上调，这极大影响了雌性性腺正常发育。由此可以证实，Rab35基因的表达与中华鳖性别分化密切相关，在中华鳖性别控制中发挥着关键性作用，表明本发明提供的雌性特异基因Rab35除了作为性别鉴别的分子标记，还能够作为育种改造的靶标基因，该基因的挖掘为中华鳖性别决定和分化机制研究提供了更多基础数据，为种质创新和性别控制育种提供了有效手段。
总的来说，本发明提供的Rab35基因作为雌性特异基因，通过检测中华鳖个体中该基因的有无，可实现在基因层面快速、高效地检测个体性别，有利于实现多样本、大规模群体的性别鉴定，不受样本量和养殖时期的限制，在中华鳖性别鉴定领域具有广阔的应用前景。而且，通过降低该基因的表达或敲除该基因，可以实现中华鳖雌性个体的性别逆转，为有目的地人为决定中华鳖性别提供了新的解决方案，为高效培育雄性个体和实现单性养殖提供了科学依据，具有重要的市场价值和较高的经济效益。
本发明又一实施例提供了如上所述的中华鳖雌性特异Rab35基因在中华鳖性别鉴定中的应用。
通过检测中华鳖性别个体中有无Rab35基因，如存在该基因，则待检个体为雌性个体，若不存在该基因，则待检个体为雄性个体，由此将性别鉴定转化为基因层面的检测，可以通过例如PCR扩增技术等实现群体样本的程序化检测，而且检测结果的重现性高，准确性好，不同养殖时间段具有良好的可比性，大大节省了性别鉴定的时间，简化了操作难度，显著提升华鳖性别鉴定效率，促进雄性育种或选育进程。
可选地，利用PCR扩增技术进行中华鳖性别鉴定，包括以下步骤：
S11、以中华鳖待测个体的基因组DNA或者cDNA作为模板，以SEQ ID NO.2-3所示(引物对F1/R1)或SEQ ID NO.4-5所示的引物对(引物对F2/R2)，通过PCR扩增所述Rab35基因；
S12、检测步骤S11的扩增产物中是否含有所述Rab35基因，若存在所述Rab35基因，则所述待测个体为雌性个体，若不存在所述Rab35基因，则所述待测个体为雄性个体。
利用上述特异性靶向Rab35基因的引物对、以待测个体基因组(DNA或者cDNA)作为模板进行PCR扩增反应，检测反应完成的体系中有无Rab35基因片段，具体而言，仅能在雌性性腺cDNA和雌性DNA中扩增出特异性片段，由此可快速有效地判断待测个体的性别。
在较佳的实施方式中，当以中华鳖待测个体的基因组DNA作为模板时，采用SEQ IDNO.4-5所示的引物对进行扩增；基因组DNA的提取可以采用中华鳖个体任意组织。
当以中华鳖待测个体的基因组cDNA作为模板时，采用SEQ ID NO.2-3所示的引物对进行扩增。需要注意的是，由于Rab35基因为性腺组织特异性表达，因此，以cDNA为模板时，需选择中华鳖性腺组织为检测样本。
可选地，步骤S11中，PCR扩增反应体系以20μL计，包括：10μL PCR Mix，正向引物和反向引物各1μL，模板1μL，超纯水7μL。PCR扩增程序包括：94℃30s，98℃10s，58℃-60℃30s，72℃60s，35循环，72℃2min，16℃∞。
可选地，步骤S12中，可以通过测序技术直观确定是否含有Rab35基因的特异性片段，或者通过琼脂糖凝胶电泳技术确认是否含有特定大小扩增片段。例如，引物对F1/R1靶向Rab35基因的开放阅读框序列(编码区)，扩增产物大小195bp，引物对F2/R2靶向Rab35基因的3'-UTR区，扩增产物大小254bp。
本发明另一实施例提供了如上所述的中华鳖雌性特异Rab35基因在中华鳖性别控制育种中的应用。
本发明研究发现通过降低雌性个体Rab35基因的表达量或者抑制该基因的表达，能使雌性性腺中雌性特异基因Foxl2的表达水平显著下降，雌性特异基因Cyp19a1表达量也呈现下降趋势，而雌性性腺中的雄性特异性基因Dmrt1表达量显著上升，雄性特异性基因Amh的表达水平也呈现上调趋势，宏观上表现为雌性个体性腺雄性化，呈现一定的性逆转现象。因此，以Rab35基因为靶点，在中华鳖雌性个体中降低该基因的表达水平即可实现快速性逆转，有利于提高雄性单性育种的工作效率。
可选地，利用RNA干扰技术进行中华鳖性别控制育种，包括以下步骤：
S21、设计靶向Rab35基因的干扰RNA，将所述干扰RNA的编码序列插入到出发载体中，构建用于干扰所述Rab35基因表达的干扰载体；其中，所述干扰RNA的编码序列如SEQ IDNO.6所示，具体如下：
干扰RNA编码序列(5'-3')：GGTGGAGACAGAAGATGCCTATAAA(见SEQ ID NO.6)，干扰位点位于SEQ ID NO.1所示序列的第536位至560位碱基处。
S22、将所述干扰载体转入中华鳖胚胎，孵化所述胚胎，获得所述Rab35基因表达水平降低的转基因中华鳖。
可选地，步骤S21中，所述出发载体为腺病毒载体pAdEasy-U6-CMV-EGFP。
可选地，步骤S22中，转入方法包括显微注射法、基因枪法、电击法等。
基于上述相同的发明构思，本发明另一实施例提供了一种中华鳖性别鉴定试剂盒，所述性别鉴定试剂盒包括扩增Rab35基因的引物对，所述引物对的序列如SEQ ID NO.2-3或SEQ ID NO.4-5所示。
所述中华鳖性别鉴定试剂盒与如上所述的中华鳖雌性特异Rab35基因在中华鳖性别鉴定中的应用相对于现有技术所具有的优势相同，在此不再赘述。
基于上述相同的发明构思，本发明实施例还提供了一种中华鳖性别控制育种试剂盒，所述性别控制育种试剂盒包括用于干扰Rab35基因表达的干扰载体，所述干扰载体插入有靶向所述Rab35基因的干扰RNA的编码序列，所述干扰RNA的编码序列如SEQ ID NO.6所示。
所述中华鳖性别控制育种试剂盒相与如上所述的中华鳖雌性特异Rab35基因在中华鳖性别控制育种中的应用相对于现有技术所具有的优势相同，在此不再赘述。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如冷泉港实验室出版的《分子克隆实验指南(第四版)》中所述的条件，或者通常按照制造厂商所建议的条件。
实施例
1、Rab35基因的发现
样品准备及采集：在31℃，75％湿度条件下，采集胚胎孵化第9到43天胚胎性腺。首先小心地打开受精卵壳，剥下胚胎置于PBS缓冲液中。在解剖显微镜下使用镊子将性腺-中肾复合体从胚胎上快速分离，用无酶纸吸干水分后，将其放入无酶冷冻管里，快速扔进液氮中保存，用于后期RNA提取及转录组测序。在第9d、13d、14d、15d、16d、20d、22d、26d、37d，共9个时间节点，选取雌雄胚胎性腺-中肾复合体各3个，总共54个样品送至广州百迈克生物公司(百迈克，广州)进行转录组测序。
RNA提取及文库建立：根据Super总RNA提取试剂盒(购自普洛麦格，中国，货号0000484334)说明书对54个胚胎性腺-中肾复合体样品分别进行总RNA提取，使用NanoDrop 2000Spectrophotometer(Thermo Fisher Scientific，Wilmington，DE)检验总RNA的浓度和纯度(OD260/280比值)，再使用1.5％的琼脂糖凝胶和Agilent Bioanalyzer 2100系统(Agilent Technologies,CA,USA)联合分析RNA的完整性。按照诺唯赞RNA建库试剂盒VAHTS Universal V8RNA-seq Library Prep Kit for Illumina(购自诺唯赞，中国，货号NR605-01)说明书构建cDNA文库，具体操作包括：使用VAHTSTM DNA Clean Beads纯化磁珠结合总RNA进行纯化，富集mRNA，根据mRNA的质量加入Fragmentation Buffer把mRNA随机打断。以mRNA为模板，用六碱基随机引物(random hexamers)合成第一条cDNA链，然后加入缓冲液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase I合成第二条cDNA链，利用AMPure XP beads纯化cDNA。对纯化双链cDNA进行末端修复及3’-末端加A，然后用AMPure XP beads进行片段大小选择，建立cDNA文库。使用Q-PCR方法对文库的有效浓度(文库有效浓度＞2nM)进行准确性定量，最后使用Illumina novaseq 6000平台对文库测序。
分析转录组结果：分析上述雌雄中华鳖胚胎性腺转录组测序结果，发现从胚胎第9天到第37天，Rab35基因始终在雌性性腺中高表达，而在雄性胚胎性腺中几乎检测不到(见图1)，其中F1、F2和F3分别表示3个雌性性腺平行样本，M1、M2和M3分别表示3个雄性性腺平行样本。
根据雌雄中华鳖胚胎性腺转录组测序获得Rab35基因的cDNA序列，进行序列分析。结果显示，中华鳖Rab35基因cDNA序列全长3220bp，包括150bp的5'-非翻译区(5'-UTR)、2464bp的3'非翻译区(3'-UTR)和编码201个氨基酸的606bp开放阅读框(ORF)，其序列结构和推导的氨基酸序列如图2所示。本实施例获得的Rab35基因的cDNA序列如下所示：
gaggtggtgcgcgtgcgcagggtgggcacttgggggtgttgctgtcgctgtcagttccggctgtttgttcgggaagtggatccagtccggagccaccgctgccgtctgaagagaccctacctctcccgtcgcctccgctctccactggccatggccagggactacgatcacctcttcaagctgctcatcattggcgacagcggtgttggtaaaagcagtttgctgttacgcttcgcagataatacattctcaggcagctacattaccacgattggagtggattttaaaatccggacagttgagattaacggggagaaggtgaagttacaaatatgggacacagctggacaagaacgtttccggactatcacatcaacgtattacagagggacgcatggggtcattgttgtctatgatgtcaccagtgcagaatcctttgtgaatgtaaagcggtggttacatgaaattaaccaaaactgtgatgatgtctgccggatactggtgggaaataagaatgatgacccagagaggaaagtggtggagacagaagatgcctataaatttgctgggcagatgggaatccaactgtttgagaccagtgccaaagaaaacattaacgtggaagagatgtttaattgcattacagagctggttctgcgagcaaagaaagaaaacttagcaaagcagcaacagcagcaacagaatgacttggtgaagctaactaagaacagtaaacggaagaagcggtgctgctaacactctttccttgttgcagagagactgctctgactgattagcccctcctagacttgggctacttcactggggcaggctttgggaggactctcagttttgtgccattatttaaagatttttctccatgttttctatcaagaggcactggcaccttaccatgttagtgccaagaaagtatcggatggacacttgctccctttcttctcccctgctcactccagtgcgccttgtaggccatgtcctttcttgtctaccaagtggactgattaatccaagagtttgtatataatgtatattgctttaaccagccgctcctccctcttgtcactttggcttatgacttcttaatgtcaatcaatcatgaactgcagttacctttttaaagatagaatacaaagttcctaactctagtaggctccaggctagcatcaattgttgctgagggtttgggctccgggctggtgcccctgggtcctttggtttcactttgagttccaggctgttactggggctttggcttaatttttctaggtcccagggttgctgctggagcctggggtttcacttcaccaacccctgggctagcggctggtgctgggtttcactttgtcatgctccaggtttgtggtcaggaccttgggtttcacctttgctttgtggtgcagcccagctgtacatgtgctctttagtttgtattgagagatttaaaactaaacctgcaaaaattggatttatttggatttaaactttttggttatttaaaaaaaaaatgaaactgaactcctgtgacatcagcttctgggtttgctggttgttccaggcaagggtccagactcttcttgagcgtaacaagatagtgtgaatctgccaaaaaaaagctcctcatgttgccttatcaagtagatctgaactcaaatgtgaatgctggtggcaaagcaatgctttccagagagatgaaacatatggctgtgaatccagctctttgggttggcttttggatccaacagttgctgcagcatcattcccaggagtctcctgtcacagtggaggacagctctctctaatgtaaagaaatggaaagttattgctcacattatgtggtgatggttgtgggtagcgttgtctttgttcagcctaatgagaccagagtatgttaccaaacagcattcccctggccttcacttgtgggaaaataaggactcagttcatcaatccctgaaatagatatgtttgggctgctgagtaacacatgttcatcaactgattatctaagcaaaaaagaaattctcctgaaatactgactggaaaggggtgggggctgtggctgctggcccactcttgacctttaggacacagcacttggatatcagcatgtggtc ctcaagaatcactagccataggtttggtagagcatgtcccactgacattcatgagctagaaatcatcctagccacatcccaggaaaggctaaattgaaatcagactcatttatttttgcccatctttttagcttcatatggtttgtgttaaaagccctgatcatacaatcacatcacagatcagtctgacttgaagtgttttttttttttccccttcatgcaaaccatgaatgtgtaactggtttttaaccagtgcaggtgttggaagtgtatagcagctgccttttcccatcctccatctctcttctgcacatatctgtccacagctttcattggtaacccaagagtaaaaatgagctgggggggatagtggggtgatactgctagagcgagcactgcatgagtgacaagacatgcattggttgcttttggaagtggcaggagaaattataccaggcatctaccctatgtgcttccagtgtggaatatagcatatgtaccagcaaggagctctgtcaaccttcctattgaaatggagctggcgtgtgccacccgtcactgctctgtagcctcaaccggaattatgttgatgaggttgtgtgctaaagagtttgcagatctcaataagggtgaagggaataggcaaaagtaaaggaaaactctgaagttgttggaactgatgtagtaaattgaggaaacggtgcacctgatctagagtgttttgatgtgggaaggttagtcattgtgccaccaaatcctggactcgggtgcgagctttgccaatccagcagtcccaacttcctggcttgaagggttgtgtgtttttgtgtgtgtgtttttgttttgttttttaattctgactctactggctgtagaggagcagctgtctacctgctgctgccactgagtattaaactgtaagagggtggggagtggagactgcctctccagtggtgctgatgtgaagtttcctaatgttaagtgatggaatgtctaactggtttgctaggattatttctgtattgacagtttctaattatgctttttaacttttaaaaaactaaaaataaagatttacaagctgc(见SEQ ID NO.1)。
2、基于Rab35基因的性别鉴定
2.1、引物设计
使用软件Primer 6.0，根据中华鳖Rab35基因开放阅读框序列设计引物对F1/R1，根据3'-UTR区设计引物对F2/R2，对Rab35基因进行扩增。各引物DNA序列如下：
F1(上游引物，5'-3')：CGCTTCGCAGATAATACATT(见SEQ ID NO.2)；
R1(下游引物，5'-3')：TGGTGACATCATAGACAACA(见SEQ ID NO.3)；
F2(上游引物，5'-3')：AGCGTTGTCTTTGTTCAGCC(见SEQ ID NO.4)；
R2(下游引物，5'-3')：TGATATCCAAGTGCTGTGT(见SEQ ID NO.5)。
2.2、样品采集
实验所用已确定性别的8只雄性中华鳖和8只雌性成体中华鳖均来自广东省惠州市财兴养殖有限公司，采集雌雄中华鳖心、肝、脾、肾、脑、肌和性腺各组织，用作RNA和DNA的提取。
2.3、RNA提取及引物对F1/R1扩增
使用Super总RNA提取试剂盒(购自Promega，上海，货号：LS1040)提取雌雄中华鳖各组织RNA，以RNA为模板，使用GorScriptTM Reverse Transcription Mix试剂盒(购自Promega，美国，货号：A2791)对雌雄中华鳖各体组织RNA进行反转录，合成cDNA，作为后续扩增模板。在冰上配置20μL的反转录反应体系：超纯水4μL，Oligo(dT)4μL，Enzyme Mix2μL，RNA模板nμL(1-5μg)，超纯水补齐至20μL。将20μL的反转录反应体系放入PCR仪进行反转录反应，反应条件：25℃5min，42℃60min，70℃15min，4℃∞。
将反转录得到的cDNA稀释5倍，随后使用内参引物EF1α扩增所有cDNA，扩增反应体积为20uL，包括：10μL PCR Mix，正向引物EF1α-F/反向引物EF1α-R各1μL，cDNA模板1μL，超纯水7μL。PCR反应程序为：94℃30s，98℃10s，60℃30s，72℃60s，35循环，72℃2min，16℃∞，并用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，确保cDNA的质量。内参引物EF1α扩增所有组织cDNA，凝胶电泳图显示每个组织cDNA均扩增出条带，说明cDNA质量可靠。
随后使用引物对F1和R1对雌雄中华鳖各组织cDNA进行PCR扩增，PCR扩增反应体积为20uL，包括：10μL PCR Mix，正向和反向引物各1μL，cDNA模板1μL，超纯水7μL。PCR扩增程序为：94℃30s，98℃10s，60℃30s，72℃60s，35循环，72℃2min，16℃∞。反应结束后，用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，结果见图3，其中，H表示心脏(Heart)，L表示肝脏(Liver)，S表示脾脏(Spleen)，K表示肾脏(Kidney)，B表示大脑(Brain)，M表示肌肉(Muscle)，O表示卵巢(Ovary)，T表示精巢(Testes)。
从图3中可以看出，雌性中华鳖性腺组织卵巢扩增出一条特异性条带，而其他组织几乎没有条带。说明Rab35基因在性腺组织中特异性表达。
按照iTaq Universal SYBR Supermix(购自BIO-RAD，USA，货号：1725124)的说明书，使用引物对F1/R1，通过实时荧光定量技术(qRT-PCR)检测雌雄中华鳖各体组织中Rab35的相对表达量，qRT-PCR反应体系包括：SYBR Supermix 10μL，F1/R1 1μL，cDNA模板1μL，超纯水7μL。扩增程序包括：95℃10min；95℃15s，60℃15s，72℃15s，循环40次；熔解曲线分析为95℃15s、60℃30s、95℃15s。各组织Rab35基因相对表达水平采用2-ΔΔCt法进行分析，其中：ΔCtRab35＝CtRab35-CtEF1α和ΔΔCtRab35＝ΔCtRab35-CtEF1α；其中CtRab35表示Rab35基因扩增的荧光信号到达设定域值时所经历的循环数，CtEF1α表示EF1α基因扩增的荧光信号到达设定域值时所经历的循环数。使用SPSS软件，采用单因素方差分析法(One-way ANOVA)进行差异表达分析，结果见图4，其中，H表示心脏(Heart)，L表示肝脏(Liver)，S表示脾脏(Spleen)，K表示肾脏(Kidney)，B表示大脑(Brain)，M表示肌肉(Muscle)，O表示卵巢(Ovary)，T表示精巢(Testes)。
从图4中可以看出，Rab35基因在雌性中华鳖性腺组织中特异高表达，在雄性各组织中不表达或几乎不表达。以上说明本发明的Rab35基因是性别特异基因，可以作为检测靶点，用于性别鉴定。
将上述性腺组织中扩增产物送至生物公司测序，获得位于SEQ ID NO.1所示序列的第229至第423位碱基处的195bp碱基序列，引物对F1/R1扩增片段(195bp，5'-3')具体如下：
GCTTCGCAGATAATACATTCTCAGGCAGCTACATTACCACGATTGGAGTGGATTTTAAAATCCGGACAGTTGAGATTAACGGGGAGAAGGTGAAGTTACAAATATGGGACACAGCTGGACAAGAACGTTTCCGGACTATCACATCAACGTATTACAGAGGGACGCATGGGGTCATTGTTGTCTATGATGTCACCA；注，下划线所示为引物靶向区域。
利用引物对F1/R1，进一步对雌雄中华鳖各8个性腺组织cDNA进行PCR扩增，反应结束后，用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，结果见图5。结果发现8个雌性性腺cDNA样品均扩增出特异性条带，而雄性性腺中没有扩增出任何条带，这也进一步证实了性别特异基因Rab35作为性别鉴定靶向基因的可行性。
2.4、DNA提取及引物对F2/R2扩增
使用MicroElute Genomic DNA Kit(购自OMEGA，美国，货号D3096)提取雌雄中华鳖DNA，将DNA进行凝胶电泳确定质量合格后，使用引物对F2和R2进行PCR扩增，PCR扩增反应体积为20uL，包括：10μL PCR Mix，正向引物F1和反向引物R1各1μL，DNA模板1μL，超纯水7μL。PCR反应程序包括：94℃30s，98℃10s，58℃30s，72℃60s，35循环，72℃2min，16℃∞。反应结束后，用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，结果见图6。
DNA凝胶电泳结果显示，8雌8雄中华鳖DNA提取质量效果良好，使用引物对F2/R2扩增DNA后，所有雌性中华鳖DNA扩增出一条特异性条带，而雄性中华鳖DNA没有扩增出条带，同样表明了性别特异基因Rab35作为性别鉴定靶向基因的可行性。
将雌性DNA扩增产物送至公司测序，获得位于SEQ ID NO.1所示序列的1871-2124位的254bp碱基序列，引物对F2/R2扩增片段：(254bp，5'-3')具体如下：
AGCGTTGTCTTTGTTCAGCCTAATGAGACCAGAGTATGTTACCAAACAGCATTCCCCTGGCCTTCACTTGTGGGAAAATAAGGACTCAGTTCATCAATCCCTGAAATAGATATGTTTGGGCTGCTGAGTAACACATGTTCATCAACTGATTATCTAAGCAAAAAAGAAATTCTCCTGAAATACTGACTGGAAAGGGGTGGGGGCTGTGGCTGCTGGCCCACTCTTGACCTTTAGGACACAGCACTTGGATATCA；注，下划线所示为引物靶向区域。
3、Rab35基因腺病毒干扰载体构建及敲降有效性分析
根据中华鳖Rab35基因cDNA序列，取其编码区委托上海汉恒生物科技有限公司设计特异性干扰RNA序列，其编码序列为：GGTGGAGACAGAAGATGCCTATAAA(见SEQ ID NO.6)，选择载体pAdEasy-U6-CMV-EGFP(购自汉恒生物工程(上海)有限公司，货号：GC20210801AZLLQ-AD01)，构建腺病毒Rab35-RNAi干扰载体，干扰载体图谱如图7所示。
通过显微注射方法，对31℃、75％湿度条件下孵化第12天的中华鳖胚胎注射Rab35-RNAi干扰载体，敲降Rab35基因。首先使用酒精棉球擦拭胚胎表面进行消毒，随后使用医用微型钻孔器在胚胎附近钻孔，注意勿破坏胚胎及其四周血网，随即使用微量注射器向胚胎中注射7μL腺病毒液(3.16×1011PFU/mL)。注射完成后，立刻使用酒精棉球擦拭注射口，再使用医用凡士林对注射孔进行封口处理，最后放回孵化箱继续孵化。由于病毒载体携带绿色荧光蛋白GFP编码序列，绿色荧光信号是判断病毒感染胚胎成功与否标准。病毒注射第二天，对胚胎进行解剖，通过绿色荧光信号判断胚胎感染病毒情况，其余胚胎继续放回孵化箱内，直至胚胎孵化出壳。利用qRT-PCR检测孵化出壳雌性中华鳖性腺里Rab35基因表达量，确保雌性中华鳖性腺中Rab35被成功敲降。
图8示出了注射腺病毒后第二天中华鳖胚胎(图c)和性腺(图d)中绿色荧光信号分布情况，可以看到胚胎和性腺中都出现较强且分布均匀的绿色荧光信号，这说明中华鳖胚胎和性腺组织被腺病毒介导的敲降载体成功感染。
图9示出了qRT-PCR检测孵化出壳的雌性中华鳖性腺中Rab35基因相对表达量变化，*表示P<0.05，**表示P<0.01，可以发现敲降组(AD-Rab35-shRNA)中Rab35的相对表达量极显著(P<0.01)的低于对照组(Control)及腺病毒空载组(AD-NC-shRNA)，再一次确认雌性Rab35基因被成功敲降。
4、干扰Rab35基因的表达对中华鳖性别分化的影响
4.1、中华鳖雌性性腺结构分析
为进一步验证Rab35基因对中华鳖性腺分化及发育功能作用，通过石蜡包埋切片和H&E染色技术对自然孵化出壳的稚鳖进行组织形态学观察分析，结果见图10，其中图A-C分别表示雌性对照组(Female)、Rab35敲降组(Female+Rab35-shRNA)和雄性对照组(Male)性腺切片H&E染色图，图A’-C’分别表示图A-C中黑框所示位置的局部放大图，图中，Cor表示皮质区，Med表示髓质区，sc表示sertoli细胞，pre-sc表示Sertoli细胞前体，pf表示原始卵泡，gc表示生殖细胞；图中标尺为50μm。
从图中可以看出未敲降Rab35的雌性性腺中，皮质区高度发达，可见原始卵泡及大量生殖细胞，而髓质区退化，出现较大的空洞结构。在干扰Rab35的表达后，自然出壳的雌性性腺中，没有发现原始卵泡，并且皮质区退化，髓质区发育出现类似性索结构的现象，大量生殖细胞分布在皮质区和髓质区，性腺同时呈现了雌雄性腺的组织形态特征，出现了Sertoli细胞前体，有雄性化的趋势。
4.2、中华鳖性别相关基因表达分析
利用qRT-PCR验证Foxl2、Cyp19a1、Dmrt1和Amh在雌雄对照组性腺和Rab35敲降组雌性性腺中的相对表达情况，结果见图11，其中图A-D分别表示Foxl2、Cyp19a、Dmrt1和Amh相对表达量，*表示P<0.05。
结果显示，与对照组雌性相比，干扰Rab35后，雌性性腺中雌性特异基因Foxl2的表达水平显著下降(P<0.05)，但仍高于雄性对照组。且干扰Rab35后，雌性特异基因Cyp19a1表达量也呈现下降趋势。与雌性对照组相比，干扰Rab35后，雌性性腺中的雄性特异性基因Dmrt1表达量显著上升(P<0.05)，但是仍然低于雄性对照组中的表达。且与雌性对照组相比，干扰Rab35后雌性性腺中Amh的表达水平也呈现上调趋势。表明当抑制或降低雌性Rab35的表达后，其性腺组织中雌性特异基因的表达量将降低，而雄性特异基因的表达量转而上升，使得呈现出一定的性逆转，雌性性腺呈现出雄性化的发展，该研究结果为有目的地人为决定中华鳖性别提供了科学指引。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1. 中华鳖(Pelodiscus sinensis)雌性特异Rab35基因在中华鳖性别控制育种中的应用，其特征在于，所述Rab35基因的cDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的中华鳖雌性特异Rab35基因在中华鳖性别控制育种中的应用，其特征在于，利用RNA干扰技术进行中华鳖性别控制育种，包括以下步骤：
S21、设计靶向Rab35基因的干扰RNA，将所述干扰RNA的编码序列插入到出发载体中，构建用于干扰所述Rab35基因表达的干扰载体；
其中，所述干扰RNA的编码序列如SEQ ID NO.6所示；
S22、将所述干扰载体转入中华鳖胚胎，孵化所述胚胎，获得所述Rab35基因表达水平降低的转基因中华鳖。
3.根据权利要求2所述的中华鳖雌性特异Rab35基因在中华鳖性别控制育种中的应用，其特征在于，步骤S21中，所述出发载体为腺病毒载体pAdEasy-U6-CMV-EGFP；
步骤S22中，转入方法包括显微注射法、基因枪法或电击法。
4. 一种中华鳖性别控制育种试剂盒，其特征在于，包括干扰载体，所述干扰载体插入有靶向所述Rab35基因的干扰RNA的编码序列，用于干扰所述Rab35基因表达，所述干扰RNA的编码序列如SEQ ID NO.6所示，所述Rab35基因的cDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108588237A (zh) * 2018-05-31 2018-09-28 浙江大学 中华鳖性别鉴定引物组、位点及方法
CN108841945A (zh) * 2018-06-28 2018-11-20 中国水产科学研究院珠江水产研究所 一种快速鉴定中华鳖遗传性别的pcr扩增引物、方法及试剂盒
CN109680076A (zh) * 2019-01-24 2019-04-26 中国水产科学研究院长江水产研究所 一种用于中华鳖遗传性别鉴定的分子标记及方法
WO2022134451A1 (zh) * 2020-12-25 2022-06-30 中国水产科学研究院珠江水产研究所 银龙鱼性别鉴定的snp分子标记及其应用

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9624549B2 (en) * 2012-01-27 2017-04-18 Cytognomix Inc. Stable gene targets in breast cancer and use thereof for optimizing therapy
AU2016274988A1 (en) * 2015-06-12 2017-12-21 Indiana University Research & Technology Corporation Predicting suicidality using a combined genomic and clinical risk assessment
CA3056085A1 (en) * 2017-02-10 2018-08-16 Universite Laval Erythrocyte-derived extracellular vesicles and proteins associated with such vesicles as biomarkers for parkinson's disease
EP3735468A4 (en) * 2018-01-04 2021-10-13 Ramot at Tel-Aviv University Ltd. TRANSGENIC EUKARYOTIC ORGANISMS AND METHODS OF GENDER SELECTION

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108588237A (zh) * 2018-05-31 2018-09-28 浙江大学 中华鳖性别鉴定引物组、位点及方法
CN108841945A (zh) * 2018-06-28 2018-11-20 中国水产科学研究院珠江水产研究所 一种快速鉴定中华鳖遗传性别的pcr扩增引物、方法及试剂盒
CN109680076A (zh) * 2019-01-24 2019-04-26 中国水产科学研究院长江水产研究所 一种用于中华鳖遗传性别鉴定的分子标记及方法
WO2022134451A1 (zh) * 2020-12-25 2022-06-30 中国水产科学研究院珠江水产研究所 银龙鱼性别鉴定的snp分子标记及其应用

Non-Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Delivery of ceramide phosphoethanolamine lipids to the cleavage furrow through the endocytic pathway is essential for male meiotic cytokinesis;Kunduri G 等;《PLoS Biol》;第20卷(第9期);第1-44页 *
Dennd1a, a susceptibility gene for polycystic ovary syndrome, is essential for mouse embryogenesis;Shi J 等;《Dev Dyn》;第248卷(第5期);第351-362页 *
Li W等.Pelodiscus sinensis isolate sample1 RAB35 (Rab35) mRNA, complete cds.《GenBank Database》.2023,Accession：OQ436049.1. *
Pelodiscus sinensis isolate sample1 RAB35 (Rab35) mRNA, complete cds;Li W等;《GenBank Database》;Accession：OQ436049.1 *
Rab3A, Rab27A, and Rab35 regulate different events during mouse oocyte meiotic maturation and activation;Wang H 等;《Histochem Cell Biol》;第145卷(第6期);第647-657页 *
Sexual dimorphic expression and release of transcription factors in bovine embryos exposed to oxidative stress;Taqi M 等;《Mol Reprod Dev》;第86卷(第12期);第2005-2019页 *
Transcriptome analysis reveals key genes and pathways related to sex differentiation in the Chinese soft-shelled turtle (Pelodiscus sinensis);Lei L等;《Comp Biochem Physiol Part D Genomics Proteomics》;第42卷;第2页第2.5节，第6页第3.6节，第3页表2，第8页图7 *
Whole-Transcriptome Analysis Identifies Gender Dimorphic Expressions of Mrnas and Non-Coding Rnas in Chinese Soft-Shell Turtle (Pelodiscus sinensis);Zhu J 等;《Biology (Basel)》;第11卷(第6期);第1-14页 *
中华鳖性别关键基因筛选与外源激素对性别分化的影响研究;陈贞年;《中国硕士学位论文全文数据库（电子期刊）农业科技辑》(第5期);D052-21 *
基于转录组测序的中华鳖SSR和SNP特征分析及性别标记筛选;雷骆 等;《广东海洋大学学报》;第43卷(第1期);第25-32页 *
小GTP酶Rab23和Rab10对卵母细胞成熟的调控与机制探究;王洪晖;《中国博士学位论文全文数据库（电子期刊）基础科学辑》(第8期);A006-17 *

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