CN102352409A

CN102352409A - 一种人类主要组织相容性复合体ⅰ类分子相关基因a基因测序分型方法及试剂盒

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Publication number: CN102352409A
Application number: CN2011102824214A
Authority: CN
Inventors: 高素青; 邓志辉; 徐筱娉; 杨宝成
Original assignee: SHENZHEN BLOOD CENTER
Current assignee: Beijing bofurui medical laboratory Co., Ltd
Priority date: 2011-09-21
Filing date: 2011-09-21
Publication date: 2012-02-15
Anticipated expiration: 2031-09-21
Also published as: CN102352409B

Abstract

本发明涉及一种人类主要组织相容性复合体I类分子相关基因A基因测序分型方法及试剂盒，本发明的具体方法为：提取样品基因组DNA；设计PCR引物对样品进行基因组DNA的PCR扩增；设计测序引物对所获得的PCR扩增产物进行双向测序，分别对其中第1、2、3、4、5、6外显子进行正、反向双向测序；根据测序结果进行分型。该方法可以解决目前MICA基因进口商品化测序试剂盒仅有单向测序试剂盒，避免单向测序碱基信号强度不一致及不能清晰反应突变存在的缺点，解决MICA模棱两可基因分型结果，获得第1和第6外显子碱基序列。

Description

一种人类主要组织相容性复合体Ⅰ类分子相关基因A基因测序分型方法及试剂盒

【技术领域】

本发明涉及测序分型方法，特别是涉及人类主要组织相容性复合体I类分子相关基因A(major histocompatibility complex class I chainrelated gene A，MICA)的测序分型方法。

【背景技术】

人类主要组织相容性复合体I类分子相关基因A基因(MICA基因)位于人第6号染色体的短臂HLA-III类基因区，属于非经典HLA-I类基因家族的功能基因。

MICA基因全长11722bp(NM_000247)，编码1382bp的转录物。整个基因包括6个外显子(外显子1～6)，外显子1编码L前导肽，外显子2～4分别编码细胞外α1～3结构域，外显子5编码跨膜(TM)区，外显子6编码胞质区。

表1 MICA基因各外显子及内含子长度

目前MICA基因分型方法包括聚合酶链式反应序列特异性引物分析法(sequence specific primer，PCR-SSP)，是根据PCR扩增产物的出现与否，判读结果，该方法也可能因电压的大小及电泳环境的影响，在电泳结果的判读过程中对假阴或假阳条带不确定而导致分型结果不准确；短串连重复序列分型方法(short tandem repeat，STR)只针对MICA基因的第5外显子进行测序分型；聚合酶链式反应特异性寡核苷酸探针分析法(sequencespecific oligonucleotide probe，SSO或SSOP)，PCR-SSOP方法只能对已知的等位基因进行分析，操作繁琐，耗费时间，并且容易出现假阳性结果；这三种方法一是不能直接获得MICA基因的碱基序列，二是不能发现MICA基因的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)，三是不能开展大规模的群体遗传学的调查研究。

现有的MICA进口单向测序分型试剂(商品标识仅用于科研)尚存在以下一些问题：

(1)该试剂盒只针对MICA基因的第2至5外显子做单向测序分型；

(2)单向测序受电泳测序的泳道偏移、测序凝胶分辨力的影响，可能造成错误的读序，且无法避免同一位置碱基信号强度不一致，不能清晰、确正性反应突变及杂合峰存在的可能性。

(3)缺乏第1和第6外显子序列，不能解决模棱两可基因分型结果，不能获得第1和第6外显子碱基序列。

(4)进口试剂盒价格较为昂贵，限制了MICA基因测序分型的大规模应用。

同时，截止到2011年7月14日IMGT/HLA数据库中MICA基因的第2至第5内含子序列数据只有5个MICA等位基因(见图1)，相对于IMGT/HLA数据库中已公布的77个MICA等位基因数据要少的太多，特别是缺乏中国人群MICA基因的cDNA全长序列及非编码区的SNPs数据和信息。

【发明内容】

本发明的目的是提供一种MICA基因双向测序分型方法，该方法可以解决目前MICA基因进口商品化测序试剂盒仅有单向测序试剂盒(仅科研使用)，避免单向测序碱基信号强度不一致及不能清晰反应突变存在的缺点，解决MICA模棱两可基因分型结果，获得第1和第6外显子碱基序列的问题。

为解决上述问题，本发明提供一种人类主要组织相容性复合体I类分子相关基因A基因测序分型的方法，其特征在于，所述测序为双向测序，并还可以包括第1和第6外显子的测序。

具体方法为：

提取样品基因组DNA；

设计PCR引物对样品进行基因组DNA的PCR扩增；

设计测序引物对所获得的PCR扩增产物进行双向测序，分别对其中第1、2、3、4、5、6外显子进行正、反向双向测序；或者先对第2至第5外显子基因序列测序，根据结果再决定对第1至第6外显子测序；

根据测序结果进行分型。

本发明的步骤可以根据需要，先获得MICA基因多态性丰富的第2至第5外显子基因序列，然后对模棱两可基因分型结果及发现的疑似新的SNP位点做进一步的测序或克隆测序，即第1至第6外显子的克隆和测序，根据结果进行更准确的分型及确认该新的SNP位点。

本发明所述PCR扩增中用到了三对PCR扩增引物，其中第一对PCR扩增引物为第1外显子PCR扩增引物，其上游引物位于MICA基因的5′-启动子区域，包含了部分5’-启动子区，下游引物位于MICA基因的第1内含子区域；优选为：扩增第一外显子的上游引物MICA-PCR-1-F1和下游引物MICA-PCR-1-R1，具体序列为：SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2；

第二对PCR扩增引物为第2至第5外显子的PCR扩增引物，其上游引物位于MICA基因的第1内含区域，下游引物位于MICA基因的第5内含子区域；优选为：扩增第2至第5外显子的上游引物MICA-PCR-2345-F10和下游引物MICA-PCR-2345-R10，具体序列为：SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4；

第三对PCR扩增引物为第6外显子的PCR扩增引物，其上游引物位于MICA基因的第5内含子区域，下游引物位于MICA基因的3′-非翻译区UTR。优选为：扩增第6外显子的上游引物MICA-PCR-6-F4和下游引物MICA-PCR-6-R4，具体序列为：SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6。

所述PCR扩增反应体系为：

所述PCR扩增反应体系还可以为：

所述PCR扩增反应程序为

根据上述条件，第1外显子的PCR扩增片断长度为475bp，第2至第5外显子的PCR扩增片断长度为2249bp，第6外显子的PCR扩增片断长为570bp时。如果片段不在预期位置或者没有出现扩增片断，则视为扩增失败。

本发明扩增区域涵盖了第1、2、3、4、5外显子，还包含了部分5′-启动子区、第1外显子、部分第1内含子、第2内含子、第3内含子、第4内含子、部分第5、6内含子序列以及部分3′UTR区域的序列，并可同时扩增在引物结合区有单核苷酸多态性(SNPs)的多种等位基因。

本发明所述PCR测序中用到的测序引物包括：

第一外显子正向测序引物MICA-Seq-1-F，其序列为：SEQID NO：7，反向测序引物MICA-Seq-1-R，其序列为：SEQ ID NO：8；

第二外显子正向测序引物MICA-Seq-2-F，其序列为：SEQID NO：9，反向测序引物MICA-Seq-2-R，其序列为：SEQ ID NO：10；

第三外显子正向测序引物MICA-Seq-3-F，其序列为：SEQ ID NO：11，反向测序引物MICA-Seq-3-R，其序列为：SEQ ID NO：12；

第四外显子正向测序引物MICA-Seq-4-F，其序列为：SEQ ID NO：13，反向测序引物MICA-Seq-4-R，其序列为：SEQ ID NO：14；

第五外显子反向测序引物MICA-Seq-5-R，其序列为：SEQ ID NO：15，反向测序引物MICA-Seq-5-R，其序列为：SEQ ID NO：16；

第六外显子正向测序引物MICA-Seq-6-F，其序列为：SEQ ID NO：17。反向测序引物MICA-Seq-6-R，其序列为：SEQ ID NO：18。

所述测序反应体系为：

所述测序反应程序为：

本发明还涉及了具有SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：18任一项所示序列的核甘酸。

本发明还涉及了所述测序分型方法的试剂盒，包括EQ ID NO：1和SEQID NO：2，和或SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4，和或SEQ ID NO：5和SEQ IDNO：6的序列，以及一种或多种选自SEQ ID NO：7至SEQ ID NO：18的测序引物。

本发明建立了MICA基因分子克隆及双向测序分型方法，首次在中国人群中发现MICA基因第4内含区域存在新的SNP位点，并获得了MICA*010等位基因cDNA全长序列及多态性区域的内含子序列，数据已提交国际GenBank数据库，GenBank记录号为JN393908(等位基因长度：2115bp)。已获世界卫生组织(WHO)HLA因子命名委员会命名的MICA新等位基因MICA*065(GenBank记录号：JN043370，等位基因的长度：957bp，IMGT/HLA数据库的收录号：HWS10013775，已收到WHO HLA因子命名委员会的信函和认可)，等位基因MICA*066(GenBank记录号：JN381038，等位基因的长度：957bp，IMGT/HLA数据库的收录号：HWS10014233，已收到WHO HLA因子命名委员会的信函和认可)。

本发明建立的中国人群MICA基因分子克隆及双向测序分型方法，适合中国群体的MICA基因测序分型，为获得中国人群MICA基因cDNA全长序列及多态性区域中内含子的SNPs信息提供了重要依据。

本发明旨在基于中国人群MICA基因序列的SNPs资料，创建一种适合于中国人群的MI CA基因双向测序分型的方法。该方法可以解决目前MICA基因进口商品化测序试剂盒仅有单向测序试剂盒(仅科研使用)，避免单向测序碱基信号强度不一致及不能清晰反应突变存在的缺点，解决MICA模棱两可基因分型结果，获得第1和第6外显子碱基序列。本发明可用于MICA基因的临床移植组织配型、肿瘤学、群体遗传学、人类学及进化学等应用和基础研究。

本发明创建了一种用于MICA基因双向测序分型的方法。本发明的贡献在于，它有效解决了MICA进口商品化试剂盒(商品标识仅限科研使用)只做单向基因测序，避免了单向测序碱基信号强度不一致及不能清晰反应突变存在等缺点，解决了测序分型中出现的大量模棱两可的结果问题，MICA基因所有外显子不同步扩增及测序分型问题，本发明创建了MICA基因第1至6外显子基因测序方法，可直接获得中国人群第1至6外显子cDNA全长序列。本发明通过三对PCR扩增引物和18条测序引物，以及探索最佳退火温度和调节Mg²⁺离子和引物浓度等条件，可对MICA基因进行PCR特异性扩增及测序分型。所获得的序列中无背景信号和杂峰，易于识别和结果判读。由于引物设计时，充分考虑了引物结合区的MICA等位基因单核苷酸多态性(SNPs)，特别是针对中国人群出现的常见MICA等位基因多态性，因而可有效地解决序列特异性引物分析法(sequence specific primer，SSP)MICA分型时结果不能精确判读的缺点及不能检出或确定的MICA*017等位基因，避免了应用特异性寡核苷酸探针分析法(sequence specificoligonucleotide probe，SSO或SSOP)方法只能对已知的等位基因进行分析，且容易出现假阳性结果的现象。

本研究方法除了可进行MICA基因第2、3、4、5外显子常规测序分型外，还可获得中国人群MICA等位基因的第2、3、4内含子序列，还可进行第1和6外显子多态性检测，减少模棱两可的结果；该方法适合于中国人群MICA基因的直接测序分型，以及MICA基因的疾病相关性研究、肿瘤学、临床移植组织配型、群体遗传学、人类学及进化学等应用和基础研究工作。

本发明基于中国人群MICA基因的分子生物学基础，提供了一种MICA基因双向测序分型方法，通过设计MICA基因PCR扩增引物和各外显子的测序引物，探索PCR扩增最佳退火温度及调节Mg²⁺离子和引物浓度等条件，可以对MICA基因进行基因测序水平分型。

【附图说明】

图1是国际IMGT/HLA数据库2011年7月14日公布的仅有的5个MICA等位基因第3内含子部分序列图。

图2是应用本发明实施8个随机样本同步扩增第1至第6外显子扩增效果图。M为marker，第一行和第三行的marker为DL2000，第二行的marker为DL5000。1-8为样品。

图3是应用本发明实施随机样本第2至第5外显子测序图。A为外显子3反向测序效果图，B为外显子3正向测序效果图，C为外显子3正向测序效果图，D为外显子3反向测序效果图。

图4是进口MI CA单向测序试剂盒第2至5外显子测序图。

图5是应用本发明实施MICA*004和MICA*017等位基因分型的部分正反向序列效果图。E为正向测序部分序列图，F为反向测序部分序列图。

图6是应用进口MICA单向测序试剂盒与本发明的测序方法所得序列杂合峰对比示意图。G是进口单向测序试剂盒所得的杂合峰，H和I是本发明正反向测序。

图7是含MICA*010等位基因第1至6外显子测序图。

【具体实施方式】

下列实施例是对本发明进一步解释和说明，对本发明不构成任何限制。

按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

本发明的引物序列均委托大连宝生物公司合成。扩增酶采用Stratagene公司生产的Pfu高保真酶，保证序列的准确性。

实施例1对240例MICA第2至第5外显子测序分型，并对其中6例含MICA*010等位基因样本做MICA第1至第6外显子测序分型

本实施例给出了对240例深圳市骨髓随机志愿捐献者登记样本进行MICA直接测序分型的实例。通过本发明的一对PCR引物扩增MICA基因多态性较丰富的第2至5外显子，获得中国人群常见MICA等位基因分布格局。

第一步：使用Gentra DNA提取试剂(美国，Gentra公司)制备基因组DNA，DNA浓度调至35～70ng/μL，纯度(A260/280)为1.70～1.80。

第二步：取本发明的第二对PCR扩增引物(MICA-PCR-2345-F10和MICA-PCR-2345-R10)扩增第2至第5外显子的序列，具体序列为：

上游引物MICA-PCR-2345-F10为：5′-CATCTTCATTCCCCCTTCTT-3′(SEQID NO：3)，

下游引物MICA-PCR-2345-R10为：5′-GGGTGTAGATGGAGATGCTG-3′(SEQID NO：4)，

扩增于ABI 9700型PCR仪进行，扩增反应体系组成为：

扩增程序为：

第三步：取5μLPCR产物，经EB染色，于1％琼脂糖凝胶中电泳；对照DL5000DNA分子标记，在凝胶成像系统中观察到特异性PCR产物条带位于所述分子标记的2000bp至3000bp之间。如图2中的第二行为第2至第5外显子扩增效果图，观察到特异性PCR产物条带位于DL5000DNA分子标记的2000bp至3000bp之间，约为2249bp。PCR产物条带清晰、特异性强(若片段不在预期位置或者没有出现扩增片断，则视为扩增失败)。

第四步：纯化PCR产物，取15μLPCR扩增产物中加入3μL ExoSAP-IT酶，在ABI公司的9700型PCR扩增仪上进行处理，循环参数为37℃30min，80℃15min后4℃保存待用。

第五步：以2μL纯化后的PCR产物作为测序反应的模板，取本发明的SEQID NO：9-16测序引物序列，其中

MICA-Seq-2-F(SEQ ID NO：9)序列为5′-CCTGTGTGTTAAACATCAAT-3′

MICA-Seq-2-R(SEQ ID NO：10)序列为5′-TCTCTGCCCCTAACTTTTCT-3′

MICA-Seq-3-F(SEQ ID NO：11)序列为5′-GAAAAGTTAGGGGCAGAGAG-3′

MICA-Seq-3-R(SEQ ID NO：12)序列为5′-CTAACAATAGAGGAAAATCAG-3′

MICA-Seq-4-F(SEQ ID NO：13)序列为5′-TGAGAACAGTGAAGAGAAAC-3′

MICA-Seq-4-R(SEQ ID NO：14)序列为5′-AGGGACTTGTTATACACTGG-3′

MICA-Seq-5-F(SEQ ID NO：15)序列为5′-GCTCTCTGCCCAGTGTATAA-3′

MICA-Seq-5-R(SEQ ID NO：16)序列为5′-GGGTGTAGATGGAGATGCTG-3′

按以下测序反应体系进行双向测序：

通过ABI公司的9700型PCR扩增仪进行，其循环参数为：

第六步：采用醋酸钠/乙醇法纯化测序PCR产物，纯化产物后上ABI PRISM3730测序仪进行PAGE电泳，采用Assign 3.5SBT(Conexio Genomics，WesternAustralia)分析软件指定等位基因型。

通过Assign 3.5SBT(Conexio Genomics，Western Australia)分析软件，本研究检出MICA*004、010、017、019、045、002:01、007:01、007:02、008:01、008:02、009:01、009:02、012:01、018:01子系等位基因，240份样本的测序分型结果详见表2和表3。

实验结果表明用本发明中的PCR引物和测序引物进行测序分型，验证了本发明的实施效果，对大样本量的MICA基因分型可以得到稳定的测序结果，见图3和图5，同时本实施例采用进口MICA单向测序试剂盒，对该240例MICA基因进行测序，测序结果见图4，比较结果见图6。

具体图3是一次性96人份的第2至第5外显子测序图。A为外显子3反向测序效果图，B为外显子3正向测序效果图，C为外显子3正向测序效果图，D为外显子3反向测序效果图。

本发现实施效果验证了双向测序可以避免或减少了电泳测序时的泳道偏移、测序凝胶分辨力的影响而可能造成错误的读序，特别是单向测序且无法避免同一位置碱基信号强度不一致，不能清晰、确正性反应突变及杂合峰存在的可能性。

图4所示，第109位碱基的红色的T峰远远高于黑色的G峰，G峰是否是背景峰无法得到确认。

图5中，E为正向测序序列，F为反向测序序列。在100054号样本的MICA*004和MICA*017等位基因第341碱基位置的杂合峰，反向序列绿色的A峰显然远远高于黑色的G峰，如果只依据这个单向序列判断结果，这个小G峰很有可能被当作背景峰或噪音峰而被屏蔽掉或忽略掉，那么就得不到MICA*017等位基因结果，本实施加上正向测序序列，A峰和G峰有同等高度的序列信号，使样本第341碱基位置的杂合峰得到确正性的实验。在本发明之前的MICA研究文章中均未发现有MICA*017等位基因的检出，推测该位置碱基杂合峰得不到很好的确认，而造成MICA*017等位基因较少报到。

图6是应用进口MICA单向测序试剂盒与本发明的测序方法所得序列杂合峰对比示意图。G是进口单向测序试剂盒所得的杂合峰，H和I是本发明正反向测序杂合峰。本发明实施效果的正向测序与进口单向测序试剂盒同一位置杂合峰比较图6中清楚地显示出双向测序对MICA基因分型结果判断重要性。

第七步：对6个含MICA*010等位基因的杂合子样本，进一步做第1和第6外显子分型。

鉴于最近一版的2011年7月14日IMGT/HLA数据库中已公布的全长序列缺乏中国人群MICA*010等位基因，申请人应用本发明建立的MICA基因双向测序方法，继续以下实验。

第八步：对含MICA*010等位基因的6个样本，取本发明的第一对扩增引物，其中上游引物MICA-PCR-1-F1(SEQ ID NO：1)的序列为：5′-GGTCCCGCCTTCTAAATCTC-3′，下游引物MICA-PCR-1-R1(SEQ ID NO：2)的序列为：5′-ACCCGAGGAGGACTGAAAAG-3′；第二对扩增引物同本实施的第二步；第三对扩增引物，其中，上游引物MI CA-PCR-6-F4(SEQ ID NO：5)的序列为：5′-CTCTTGGGTCTTGTCCTTTAGTCT-3′，下游引物MICA-PCR-6-R4(SEQ ID NO：6)的序列为：5′-CCAGGTTCAAGTGATTTTCC-3′。扩增反应体系及扩增循环参数同第二步。扩增产物电泳结果见图2，图2的第一行为第1外显子扩增效果图，观察到特异性PCR产物条带位于DL2000DNA分子标记的250-500bp之间，约为475bp。第三行为第6外显子扩增效果图，观察到特异性PCR产物条带位于DL2000DNA分子标记的500-750bp之间，约为570bp，PCR产物条带清晰、特异性强(如果片段不在预期位置或者没有出现扩增片断，则视为扩增失败)。

第九步：对PCR扩增产物进行分子克隆分子克隆步骤如下

(1)分别对其产物进行末端加‘A’反应，该反应体系及程序如下：PCR纯化产物14.5ul，dNTP(25mM)2ul，10×Taq Buffer 2ul，Taq酶1ul，加ddH2O至总体积20ul，于72℃延伸30min。加‘A’反应后利用EDTA/醋酸钠以及乙醇进行第二步纯化，以去除多余的缓冲液、酶以及dNTP。

(2)纯化后进行连接反应，连入pGEM-Teasy载体(美国Promega公司)。

(3)连接反应于4℃过夜后，转化入JM109感受态细胞，抗氨苄培养基37℃过夜培养后，每份样本随机挑取5-6个克隆子，在抗氨苄LB液体培养基中，37℃扩大培养。

(4)24小时后，用质粒小量提取试剂盒(美国Axygen公司)提取质粒，经双酶切后，电泳检测鉴定阳性克隆。

第十步以质粒作为测序反应的模板，取Pgem-Teasy载体试剂盒中所包括的T7、SP6通用测序引物和本发明的测序引物：

第一外显子正向测序引物MICA-Seq-1-F，其序列为：5’-CTCGTGATTGGCCCTAAGTT-3’(SEQID NO：7)，第一外显子反向测序引物MICA-Seq-1-R，其序列为：5-ACTGAAAAGTGACGGGGAAG-3’(SEQ ID NO：8)；

第五步所用的第2至5外显子测序引物；

第六外显子正向测序引物MI CA-Seq-6-F(SEQ ID NO：17)，其序列为：5′-TGATGGGAGGGAACTGGC-3′。反向测序引物MICA-Seq-6-R(SEQ ID NO：18)，其序列为：5′-CCAGGTTCAAGTGATTTTCC-3′。

如第五、六步所述的测序反应体系和结果分析。

将所获得的序列导入Assign 3.5SBT分析软件，如图7所示，成功得到第1-6外显子分析图，根据图中每个碱基峰图，确认6个样本碱基序列。

获得了中国人群中常见的MICA*010等位基因cDNA全长序列及多态性区域的内含子序列，应用ht tp://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/网站的Blas t比较，发现IMGT/HLA数据库中仅有的MICA*001、004、ICA*008:01:01、MICA*008:01:02、MICA*008:04等位基因的第2、3、4内含子序列，如图1，本实施首次发现了在第8083位碱基处有新的SNP(单碱基多态性)位点，本实施提交了MICA*010等位基因cDNA全长序列及第1、2、3、4内含子序列，GenBank记录号为JN393908(序列长度：2115bp)。

实施例2本实施例给出了中华骨髓库中两例MICA基因配型实例。两例样品的HLA-A、B、DRB1、DQB1等位基因均相合。

第一步：使用Gentra DNA提取试剂(美国，Gent ra公司)制备基因组DNA，DNA浓度调至35～70ng/μL，纯度(A260/280)为1.70～1.80。

第二步：取本发明的第二对PCR引物扩增第2至第5外显子的序列，其中上游引物MICA-PCR-2345-F10(SEQ ID NO：3)的序列为：5′-CATCTTCATTCCCCCTTCTT-3′，下游引物MICA-PCR-2345-R10(SEQ IDNO：4)的序列为：5′-GGGTGTAGATGGAGATGCTG-3′，扩增于ABI 9700型PCR仪进行，扩增反应体系组成为：

扩增其循环参数为：

第三步：取5μL PCR产物，经EB染色，于1％琼脂糖凝胶中电泳；对照DL5000DNA分子标记，在凝胶成像系统中观察到特异性PCR产物条带位于DL5000DNA分子标记的2000bp至3000bp之间。PCR产物条带清晰、特异性强，见图2。(如果片段不在预期位置或者没有出现扩增片断，则视为扩增失败)。

第四步：纯化PCR产物，取15μL PCR扩增产物中加入3μL ExoSAP-IT酶(美国USB公司)，在ABI公司的9700型PCR扩增仪上进行处理，循环参数为37℃ 30min，80℃ 15min后4℃保存待用。

第五步：以2μL纯化后的PCR产物作为测序反应的模板，取本发明的MICA-Seq-2-F、MICA-Seq-2-R、MICA-Seq-3-F、MICA-Seq-3-R、MICA-Seq-4-F、MICA-Seq-4-R、MICA-Seq-5-F、MICA-Seq-5-R、测序引物，按以下测序反应体系进行双向测序：

通过ABI公司的9700型PCR扩增仪进行，其循环参数为：

第六步：采用醋酸钠/乙醇法纯化测序PCR产物，纯化产物后上ABI PRISM3730测序仪进行PAGE电泳，采用Assign 3.5SBT分析软件指定等位基因型。

第七步：对PCR扩增产物进行分子克隆和单倍体测序，方法步骤同实施例1的第九步。

第八步：序列分析结果发现一个样品的MICA等位基因为MICA*010，MICA*010，另外一个样品的MICA等位基因其中一个也是MICA*010，另一个MICA等位基因与最近的MICA*010等位基因序列相比，在第四外显子的nt830位有一个碱基突变，A＞C，导致第254位核苷酸由谷氨酸突变成丙氨酸，该等位基因已收到WHO HLA因子命名委员会的信函和认可信，被命名为MICA*066(GenBank记录号：JN381038，等位基因的长度：957bp，MGT/HLA数据库的收录号：HWS10014233)。表明两例样品的MICA等位基因不匹配。

表2：120人份MICA基因第2-5外显子测序结果

表3：120人份MICA基因第2-5外显子测序结果

Claims

1.一种人类主要组织相容性复合体I类分子相关基因A基因测序分型的方法，其特征在于，所述测序为双向测序，并还可以包括第1和第6外显子的测序。

2.权利要求1所述的方法，其步骤为：

提取样品基因组DNA；

设计PCR引物对样品进行基因组DNA的PCR扩增；

根据测序结果进行分型。

3.权利要求2所述的方法，其特征在于：所述PCR扩增中用到了三对PCR扩增引物，其中第一对PCR扩增引物为第1外显子PCR扩增引物，其上游引物位于人类主要组织相容性复合体I类分子相关基因A基因的5′-启动子区域，包含了部分5’-启动子区，下游引物位于人类主要组织相容性复合体I类分子相关基因A基因的第1内含子区域；

第二对PCR扩增引物为第2至第5外显子的PCR扩增引物，其上游引物位于第1内含区域，下游引物位于第5内含子区域；

第三对PCR扩增引物为第6外显子的PCR扩增引物，其上游引物位于第5内含子区域，下游引物位于3′-非翻译区UTR。

4.权利要求3所述的方法，其特征在于：所述PCR扩增中用到的引物序列分别为：扩增第一外显子的上游引物MICA-PCR-1-F1和下游引物MICA-PCR-1-R1，具体序列为：SEQID NO：1和SEQ ID NO：2；

扩增第2至第5外显子的上游引物MICA-PCR-2345-F10和下游引物MICA-PCR-2345-R10，具体序列为：SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4；

扩增第6外显子的上游引物MICA-PCR-6-F4和下游引物MICA-PCR-6-R4，，具体序列为：SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6。

5.权利要求3或4所述的方法，其特征在于：所述PCR扩增反应体系为：

或所述PCR扩增反应体系为：

所述PCR扩增反应程序为

6.权利要求4或5任一所述的方法，其特征在于：第1外显子的PCR扩增片断长度为475bp，第2至第5外显子的PCR扩增片断长度为2249bp，第6外显子的PCR扩增片断长为570bp。

7.权利要求2所述的方法，其特征在于：所述PCR测序扩增中用到的测序引物包括：

第一外显子正向测序引物MICA-Seq-1-F，其序列为：SEQ ID NO：7，反向测序引物MICA-Seq-1-R，其序列为：SEQ ID NO：8；

第二外显子正向测序引物MICA-Seq-2-F，其序列为：SEQ ID NO：9，反向测序引物MICA-Seq-2-R，其序列为：SEQ ID NO：10；

第三外显子正向测序引物MICA-Seq-3-F，其序列为：SEQID NO：11，反向测序引物MICA-Seq-3-R，其序列为：SEQ ID NO：12；

第四外显子正向测序引物MICA-Seq-4-F，其序列为：SEQ ID NO：13，反向测序引物MICA-Seq-4-R，其序列为：SEQ ID NO：714；

8.权利要求7所述的方法，其特征在于：所述测序反应体系为：

所述测序反应程序为：

9.具有SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：18任一项所示序列的核甘酸。

10.一种用于权利要求1所述方法的试剂盒，包括SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：2，和或SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4，和或SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6的序列，以及一种或多种选自SEQ ID NO：7至SEQ ID NO：18的测序引物。