CN108410996A

CN108410996A - 与山羊产绒性状相关的InDel分子标记及其应用

Info

Publication number: CN108410996A
Application number: CN201810106763.2A
Authority: CN
Inventors: 蒋琳; 宋伸; 李业芳; 浦亚斌; 刘雪雪; 张艳丽; 马月辉
Original assignee: Institute of Animal Science of CAAS
Current assignee: Institute of Animal Science of CAAS
Priority date: 2018-02-02
Filing date: 2018-02-02
Publication date: 2018-08-17

Abstract

本发明涉及与山羊产绒性状相关的InDel分子标记及其应用，该标记位于山羊第6号染色体第95454685‑95455189bp之间，其多态性为‑/插入片段，插入片段的序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还提供了用于检测该INDEL标记的特异性引物和方法，所述特异性引物对的序列如SEQ ID NO.2‑3所示。利用本发明提供的特异性引物对，基于PCR和琼脂糖凝胶电泳获得的电泳条带，以及Sanger测序进行分析和统计，根据InDel位点上的产绒山羊等位基因和非产绒山羊等位基因类型，鉴别山羊品种的产绒或者非产绒特性。本发明需用检测样品量少，方法简便快捷，鉴定结果准确，具有良好的推广应用前景。

Description

与山羊产绒性状相关的InDel分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及与中国山羊产绒性状相关的InDel分子标记、以及检测产绒山羊和非产绒山羊的方法。

背景技术

插入缺失(InDel)多态性是指基因组中一种特殊类型的二等位基因遗传标记，表现为基因组中插入或者缺失了不同大小的DNA片段，兼具STR和SNP的优点。InDel的检测方法，目前常用的包括，琼脂糖凝胶电泳、sanger测序、以及最新的高通量二代测序等技术。通过检测InDel多态性来检测基因型是近些年兴起的一种方法。InDel分子标记作为遗传标记已经广泛地应用于法医鉴定、遗传育种以及遗传多样性等研究领域。分子标记在动物育种中的应用已有一段时间，相比传统育种方法，分子育种大大加快了选育效率，节省了育种时间，使得育种学家可以在分子水平上不断探索并选育更优良的家畜品种。

山羊大约在一万年以前的新月沃土地区被驯化，为人类文明的发展作出了重大贡献。经过长期的自然选择与人工选择，形成了多种多样，各具特色的品种，在毛色、体型、繁殖力、绒毛等方面的表型差异很大。中国是世界上山羊存栏量最多的国家，而绒山羊是中国北方和西藏地区最为主要的山羊品种，产自绒山羊的羊绒通常被用来制作最为优质的纯天然纺织产品。一直以来，与产绒性状相关的分子标记并未充分被挖掘。近年来，借助高通量技术寻找影响表型性状的特定基因或基因组区域已成为动物遗传学领域研究的热点，也为我们挖掘与产绒性状相关的分子标记提供了新的可能。

成纤维细胞生长因子5(Fibroblast growth factor-5,FGF5)，在中枢神经系统和皮肤中表达，在皮肤中抑制毛囊由兴盛期向休止期转化，FGF5基因敲除绒山羊的毛长和绒长明显长于对照。其他动物如狗、猫和兔子的研究也表明FGF5的变异与被毛的长短有关。因此FGF5基因以及该基因附近的突变可能会影响山羊的产绒性状。

由于产绒山羊和非产绒山羊在产绒性状上有很大的差异，在产绒山羊与非产绒山羊混杂的地方，产绒山羊与非产绒山羊品种之间存在着遗传渗入，导致一些杂合类型的出现。因此，为了能在分子水平进行准确鉴定产绒山羊的基因型，培育优质、纯合、稳定遗传的绒山羊群体。本发明利用从全基因组扫描定位得到的InDel分子标记，在不同山羊品种内对FGF5基因座位的多态性进行鉴定，为培育优质绒山羊以及绒山羊品种选育提供理论基础。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种精确和快速区分鉴定产绒山羊和非产绒山羊的方法。

本发明的另一个目的是提供与山羊产绒性状相关的InDel分子标记及其应用。

本发明的第三个目的在于提供检测与山羊产绒性状相关的InDel标记的引物及含有该引物的试剂盒。

本发明提出鉴定产绒山羊和非产绒山羊的方法，是一种利用插入或缺失(InDel)分子标记鉴定山羊品种的方法。具体来说是利用产绒山羊与非产绒山羊之间DNA序列的特异性差异片段，设计扩增引物，对产绒山羊与非产绒山羊的等位基因型进行计算。所述InDel标记位于山羊第6号染色体第95454685-95455189bp处，该InDel分子标记的多态性为-/插入序列，所述插入序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

该InDel分子标记可通过序列如SEQ ID NO.2-3所述的特异性引物对扩增得到。

发明人对来自不同国家地区的山羊进行了大量的基因型与产绒相关性研究，发现本发明所提供的InDel分子标记在不同品种的山羊群体中基因频率差异显著。缺失基因型在产绒山羊品种中的频率高达93.3％，而在非产绒山羊中该等位基因频率均在5.3％以下，这对于通过基因型区分和筛选不同产绒性状的山羊具有较大的指导意义。当山羊的FGF5基因座基因型为缺失纯合时，该山羊偏向于具有产绒性状，当山羊的基因型为带有插入序列时，可以判定山羊偏向于非产绒性状。

本发明还提供了用于检测本发明所述分子标记的特异性引物对，包括：

正向引物：5’-GGTGATAAGCCACACGTTCAAA-3’(SEQ ID NO.2)

反向引物：5’-TGGCTGTGATCAAACTTACAACC-3’(SEQ ID NO.3)。

本发明所述的特异性引物还可以与其他用于中国地方山羊产绒表型检测的特异性引物相结合用于山羊分类和育种研究。

本发明提供了含有上述特异性引物对的试剂盒。

优选的，所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反应缓冲液中的一种或多种。

优选的，所述试剂盒还包括标准阳性模板。

进一步，本发明提供了上述试剂盒在山羊育种中的应用。

本发明提供了上述试剂盒在鉴定山羊产绒性状中的应用。

本发明提供了所述InDel分子标记或检测该分子标记的特异性引物对在山羊育种中的应用。

本发明提供了与山羊产绒性状相关的InDel分子标记或检测该分子标记的特异性引物对在产绒山羊分子标记辅助育种中的应用。

本发明提供了与山羊产绒性状相关的InDel分子标记或检测该分子标记的特异性引物对在检测山羊FGF5基因座基因型中的应用

本发明提供了所述InDel分子标记或检测该分子标记的特异性引物对在鉴定产绒山羊中的应用。

本发明提供一种检测产绒山羊和非产绒山羊的方法，包括以下步骤：

(1)提取待测山羊基因组DNA，以其为模板，利用特异性引物进行PCR扩增反应，获得扩增产物片段；

(2)检测扩增产物片段的第192bp处的碱基种类，若此处有505bp的插入片段，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，则待测山羊不产绒，其为非产绒山羊，若此处碱基种类为没有插入上述SEQ ID NO.1所示的片段，则判定待测山羊产绒，为产绒山羊；

所述特异性引物包括：

正向引物：5’-GGTGATAAGCCACACGTTCAAA-3’；

反向引物：5’-TGGCTGTGATCAAACTTACAACC-3’。

其中，步骤(1)中PCR扩增反应使用的扩增体系以25μl计为：50-100ng/μl模板DNA2μl，10pmol/μl正向引物和反向引物各0.4μl，2×Taq PCR MasterMix 12.5μl，余量为双蒸水。

其中，步骤(1)中PCR扩增反应的条件为：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，62℃退火30秒，72℃延伸45秒，共35个循环；72℃后延伸5分钟。

本发明对于检测PCR扩增产物片段的方法没有特别的限制，可以利用本领域常规的检测方法进行，可以利用琼脂糖凝胶电泳和Sanger测序等方法来检测待测山羊品种的基因型。

本发明的与山羊产绒性状相关的InDel分子标记及其应用具有如下优点：

(1)本发明提供的分子标记不受山羊品种、年龄等限制，可用于山羊产绒性状的早期选育，甚至刚出生即可进行准确地筛选，可显著促进绒山羊品种的育种进程。

(2)检出中国山羊品种FGF5基因座InDel多态性的方法准确可靠，操作简便。

(3)中国山羊品种FGF5基因座的InDel位点的检出，为山羊产绒性状的标记辅助选择提供了科学依据。

附图说明

图1为两种基因型琼脂糖凝胶电泳图；其中，cash为产绒山羊；Noncash为非产绒山羊。所用的Marker为DL2000marker。

图2为绒山羊与非绒山羊FGF5基因座位sanger测序结果图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1产绒山羊与非产绒山羊全基因组选择信号分析

对中巴基斯坦、尼泊尔、中国共66份非产绒山羊以及51份来自中国的产绒山羊的全基因组重测序数据进行产绒-非产绒的全基选择信号分析，发现位于山羊第6号染色体FGF5基因座位与产绒-非产绒性状最为密切相关。进一步进行数据挖掘，筛选到位于山羊第6号染色体第95454685-95455189bp处的InDel分子标记与产绒性状最为密切相关。该InDel分子标记的多态性为-/插入序列，所述插入序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

实施例2中国山羊FGF5基因座InDel多态性位点的鉴定

1、提取待测巴基斯坦、尼泊尔和中国山羊品种的基因组DNA

其中非产绒山羊共146只(包括来自巴基斯坦非产绒山羊27只来自湖南的湘东黑山羊7只、来自海南的海南黑山羊17只、来自尼泊尔平原地区的山羊25只、来自江西上饶的广丰山羊34只、崂山奶山羊7只、土根堡奶山羊10只、云岭黑山羊19只)；产绒山羊共153只(包括来自西藏地区的产班戈绒山羊10只、日土绒山羊10只；来自内蒙的阿尔巴斯绒山羊25只、阿拉善型绒山羊4只、罕山绒山羊10只；来自辽宁的辽宁绒山羊25只；来自山东的济宁青山羊18只，来自新疆南疆的南疆绒山羊30只；来自尼泊尔高海拔地区的产绒山羊21只)，采用常规的方法提取血液中的基因组DNA。

2、扩增含SNP位点的核苷酸片段

针对实施例1中筛选到的FGF5基因座位的InDel位点，根据NCBI数据库收录的山羊FGF5基因座位的序列设计引物，包括正向引物F：5’-GGTGATAAGCCACACGTTCAAA-3’和反向引物R：5’-TGGCTGTGATCAAACTTACAACC-3’，以山羊基因组DNA为模板，扩增出待测InDel所在的核苷酸片段，如SEQ ID NO.1所示。该InDel位点位于PCR扩增片段的192bp处，此处存在一个505bp的插入序列。

其中PCR反应使用的扩增体系以25μl计为：50-100ng/μl模板DNA1μl，10pmol/μl正向引物和反向引物各0.4μl，2×Taq PCR MasterMix 12.5μl，余量为双蒸水。

其中PCR反应的条件为：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，62℃退火30秒，72℃延伸45秒，共35个循环；72℃后延伸10分钟。3、检测PCR扩增片段，获得InDel标记

对PCR扩增产物进行Sanger测序检测，如果扩增产物序列中第192bp处存在505bp的缺失，则待测山羊属于绒山羊，其扩增产物的序列如SEQ ID NO.5所示；如果扩增产物序列中第192bp处存在505bp(SEQ ID NO.1所示)，则待测山羊属于非绒山羊，其扩增产物的序列如SEQ ID NO.4所示。山羊DNA样品2种基因型的琼脂糖凝胶电泳图如图1所示。产绒山羊与非产绒山羊基因型的sanger测序分型结果如图2所示。

实施例3对299山羊的FGF5基因座位的多态性位点进行扩大群体分析

按照实施例1提取153只产绒山羊和146只非产绒山羊的基因组DNA样品采用实施例1的特异性引物进行PCR检测，再进行琼脂糖凝胶电泳，以及基于Sanger测序的基因型分型检测。153只产绒山羊分别是西藏班戈绒山羊、西藏日土绒山羊、内蒙古阿拉善绒山羊、内蒙古阿尔巴斯绒山羊，内蒙古罕山绒山羊、辽宁绒山羊、南疆绒山羊、济宁青山羊、尼泊尔高海拔地区山羊；146只非产绒山羊，分别是巴基斯坦山羊、尼泊尔平原地区山羊、云岭黑山羊、海南黑山羊、广丰山羊、湘东黑山羊、崂山奶山羊、土根堡奶山羊。FGF5基因如SEQ IDNO.1所示序列的FGF5基因座位的基因型分型结果如表1所示。该InDel位点在产绒山羊中的等位基因DNA缺失的频率达到93.3％以上。非产绒山羊中该等位基因DNA缺失的频率低于5.3％(如表1所示)。运用R软件的卡方检验进行分析，等位基因插入等位基因在产绒山羊中的频率显著高于在非产绒山羊中的频率。表明了该InDel位点的等位基因缺失与山羊产绒性状的相关性。

表1 FGF5基因座的InDel位点在山羊品种中的基因型频率

上述来源于不同地方的中国地方山羊基因型-表型鉴定结果表明:山羊产绒性状判定可以通过本发明发现的FGF5基因座位505bp DNA片段的插入/缺失多态性(InDel分子标记)判定实现。利用该分子标记的检测可以确定山羊产绒表型，以加快选育具有产绒性状的山羊，节省了育种时间，使得快速获得具有纯合产绒基因型的优良山羊种质资源成为可能。

上文虽然已对本发明以及其实施方式做了详尽的描述，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以对相应的条件等做一些改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所

<120> 与山羊产绒性状相关的InDel分子标记及其应用

<130> KHP181110425.3

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 505

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gtagagggca aaggaaaggg cactttagga aaaatgacac atatttttag cagaaattat 60

gaccactcat gtcatccaat aaaaaatatg tctcatctac ataatggctt catgcttact 120

attgtgctaa ttgaactatg tacttttgat gcattctcta ttcatgtgaa agtgtgggta 180

acaagtgata aaagtcaaca gtcacggcaa ttggacacac tgaaaatctt tcttccatga 240

ctctgagtca gtctcctccg tggattacta aacacattcc agaaatctca taagttacta 300

ctggtctaaa aatggatata attaaagatg agtaaaccta ccgcagagct tgatgtaatc 360

ttttagggta attaacccaa actatttaca atggattttt attccacttt tctaaagatt 420

gcatatatgt tattacaagt tcatatatct ttccattaca aaagcaactc ccccccacac 480

cccccaccgc cccaacatag tcaca 505

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggtgataagc cacacgttca aa 22

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tggctgtgat caaacttaca acc 23

<210> 4

<211> 772

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggtgataagc cacacgttca aatagtgagg tattcattca gacagcgtgt gatcttttct 60

ctgagagagc tgagattcat ttcccacata tcttgagtgg gagaaatgag aacactattg 120

ttatcaacaa caacaaaatg agtggatggc tgaattctac aaaagatggt ctgttttgtc 180

ttcaaaatac agtagagggc aaaggaaagg gcactttagg aaaaatgaca catattttta 240

gcagaaatta tgaccactca tgtcatccaa taaaaaatat gtctcatcta cataatggct 300

tcatgcttac tattgtgcta attgaactat gtacttttga tgcattctct attcatgtga 360

aagtgtgggt aacaagtgat aaaagtcaac agtcacggca attggacaca ctgaaaatct 420

ttcttccatg actctgagtc agtctcctcc gtggattact aaacacattc cagaaatctc 480

ataagttact actggtctaa aaatggatat aattaaagat gagtaaacct accgcagagc 540

ttgatgtaat cttttagggt aattaaccca aactatttac aatggatttt tattccactt 600

ttctaaagat tgcatatatg ttattacaag ttcatatatc tttccattac aaaagcaact 660

cccccccaca ccccccaccg ccccaacata gtcacaaagc agaggtatct gcattgtaac 720

agttttagag gacataatcc agtaaacatg gttgtaagtt tgatcacagc ca 772

<210> 5

<211> 267

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggtgataagc cacacgttca aatagtgagg tattcattca gacagcgtgt gatcttttct 60

ctgagagagc tgagattcat ttcccacata tcttgagtgg gagaaatgag aacactattg 120

ttatcaacaa caacaaaatg agtggatggc tgaattctac aaaagatggt ctgttttgtc 180

ttcaaaatac aaagcagagg tatctgcatt gtaacagttt tagaggacat aatccagtaa 240

acatggttgt aagtttgatc acagcca 267

Claims

1.与山羊产绒性状相关的InDel分子标记，其特征在于，位于山羊第6号染色体第95454685-95455189bp之间，该InDel分子标记的多态性为-/插入序列，所述插入序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述的InDel分子标记，其特征在于，其通过以下特异性引物对扩增得到：

正向引物：5’-GGTGATAAGCCACACGTTCAAA-3’；

反向引物：5’-TGGCTGTGATCAAACTTACAACC-3’。

3.一种用于检测权利要求1所述的InDel分子标记的特异性引物对，其特征在于，

正向引物：5’-GGTGATAAGCCACACGTTCAAA-3’；

反向引物：5’-TGGCTGTGATCAAACTTACAACC-3’。

4.含有权利要求3所述特异性引物对的试剂盒。

5.权利要求1或2所述InDel分子标记或权利要求3所述的特异性引物对或权利要求4所述的试剂盒在山羊育种中的应用。

6.权利要求1或2所述InDel分子标记或权利要求3所述的特异性引物对或权利要求4所述的试剂盒在检测山羊FGF5基因座基因型中的应用。

7.权利要求1或2所述InDel分子标记或权利要求3所述的特异性引物对或权利要求4所述的试剂盒在鉴定产绒山羊中的应用。

8.一种检测产绒山羊和非产绒山羊的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(2)检测扩增产物片段的第192bp处的碱基种类0若此处有505bp的插入片段，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，则待测山羊不产绒，其为非产绒山羊，若此处碱基种类为没有插入上述SEQ ID NO.1所示的片段，则判定待测山羊产绒，为产绒山羊；

所述特异性引物包括：

正向引物：5’-GGTGATAAGCCACACGTTCAAA-3’；

反向引物：5’-TGGCTGTGATCAAACTTACAACC-3’。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(1)中PCR扩增反应使用的扩增体系以25μl计为：50-100ng/μl模板DNA 2μl，10pmol/μl正向引物和反向引物各0.4μl，2×Taq PCRMasterMix 12.5μl，余量为双蒸水。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，步骤(1)中PCR扩增反应的条件为：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，62℃退火30秒，72℃延伸45秒，共35个循环；72℃后延伸5分钟。