CN114438225A - 一种与山羊低氧适应相关的结构变异分子标记及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于遗传生物学技术领域，具体涉及一种与山羊低氧适应相关的结构变异分子标记及应用。所述结构变异分子标记位于山羊第26号染色体第42098934位碱基处的245bp插入/缺失，具体为如SEQ ID No.1所示核苷酸序列的第98bp处的插入缺失，插入/缺失的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明还提供了用于检测该结构变异分子标记的特异性引物对和检测方法，所述特异性引物对的序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示。本发明所述结构变异分子标记不受山羊年龄、性别等因素的限制，可用于山羊高原低氧适应性引种和品种选育。

Description

一种与山羊低氧适应相关的结构变异分子标记及应用

技术领域

本发明属于遗传生物学技术领域，具体涉及一种与山羊低氧适应相关的结构变异分子标记及应用。

背景技术

山羊被认为是最早驯化的家养动物之一，可追溯到约10000年前，伴随着人类迁移逐渐扩散到世界各个地方。为适应高原的极端环境条件，山羊形成了独特的生理和遗传特征。高原环境是指海拔大于2500m的高原地区，此环境对当地居民和家养动物都具有挑战性。安第斯人、埃塞俄比亚人、藏人及这些地方生存的家畜是高海拔环境的主要定居者，其通过克服低氧和高紫外线辐射形成了独特的生理和遗传适应性。研究这种环境适应调节机制能够促进对当地适应和气候变化的解析。

变异是导致基因组差异的重要因素，根据碱基对变换的数量和类型可分为单个碱基对的变异、小的插入或缺失(InDels≤50bp)和结构变异(SVs>50bp)。结构变异的类型较多，根据结构变异的不同类型分为插入、缺失、反转、染色体易位、染色体间异位及拷贝数变异等。结构变异是造成动物表型差异的一个重要原因，模式动物果蝇的缺刻翅和棒眼性状便是由于其染色体部分缺失和重复造成的。在生物体与环境的长期适应性进化过程中，某些高频率结构变异在种间受到强烈的正向选择，表现出独特的生理特性和极强的环境适应能力，对农业生产种质资源的开发和保护具有重要意义。通过比对短绒和长毛绵羊的基因组序列，定位到25号染色体上IRF2BP2基因3’UTR区域存在asEIF2S2基因的片段插入，影响IRF2BP2基因的转录表达进而控制短绒性状。FGF5基因与羊绒生长密切相关，研究人员发现绒山羊FGF5基因座中505bp的片段插入可作为转录因子结合位点的增强子促进其在非绒山羊的转录表达，为绒山羊育种中羊绒生长提供分子标记。

3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸合成酶2(3’-phosphoadenosine-5’-phosphosul-fatesynthetase 2，PAPSS2)基因是生物体内催化合成活性硫酸根供体的重要酶类基因，广泛参与细胞外基质蛋白聚糖硫代谢相关酶，在ATP的分解代谢过程中具有重要作用。

现有技术存在的问题是，缺乏一种与山羊低氧适应相关的分子标记。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种与山羊低氧适应相关的结构变异分子标记。

本发明的第一个目的是提供一种与山羊低氧适应相关的结构变异分子标记，所述结构变异分子标记是山羊第26号染色体的第42098934位碱基后插入或缺失245bp的DNA片段，所述DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

优选的，所述结构变异分子标记位于如SEQ ID No.1所示核苷酸序列的第98bp处(即在SEQ ID No.1的98bp位点之后添加245个SEQ ID No.2所示核苷酸片段)。

本发明的第二个目的是提供一种结构变异分子标记的应用，所述结构变异分子标记与山羊的低氧适应性相关。

优选的，缺失所述结构变异分子标记的山羊具有低氧适应性，插入所述结构变异分子标记的山羊不具有低氧适应性。

优选的，所述结构变异分子标记用于山羊分子标记辅助育种。

本发明的第三个目的是提供一种用于检测所述的与山羊低氧适应相关的结构变异分子标记的特异性引物，所述特异性引物的核苷酸序列如下：

正向引物F：5’-ATTTGCCTCCTGTTTTGAATTCCT-3’；

反向引物R：5’-AGATGGTAATGATAACCCTATATGCG-3’。

所述的特异性引物既可以用于鉴定山羊低氧适应性品种，还可以与其他用于山羊表型检测的特异性引物结合使用，进行山羊分类和育种研究。

优选的，鉴定山羊低氧适应性品种的方法如下：

(1)提取待测山羊的基因组DNA；

(2)以待测山羊基因组DNA为模板，使用正向引物F和反向引物R进行PCR扩增反应，获得扩增产物；

(3)检测所述扩增产物片段第98bp处结构变异的类型，若结构变异的类型为缺失SEQ ID No.2所示核苷酸序列，则判定待测山羊具有低氧适应的特征；若结构变异的类型为插入SEQ ID No.2所示核苷酸序列，则判定待测山羊不具有低氧适应的特征。

优选的，(2)的PCR扩增反应中，扩增体系为25μL，其中包含50-100ng/μL待测山羊基因组DNA模板1μL，10μM正向引物F和反向引物R各1μL，2×Rapid Taq Master Mix 12.5μL，ddH₂O 9.5μL。

扩增反应程序为：95℃预变性3min，95℃变性15sec，68℃退火15sec，72℃延伸10sec，10个循环，-1℃/cycle；95℃变性15sec，58℃退火15sec，72℃延伸10sec，30个循环，-0.1℃/cycle；72℃延伸5min，4℃保存。

本发明对于检测PCR扩增产物片段的方法没有特别的限制，可以利用本领域常规的检测方法进行，优选的，可以利用琼脂糖凝胶电泳联合Sanger测序的方法检测待测山羊的基因型。

本发明的第四个目的是提供一种包括上述特异性引物(正向引物F、反向引物R)的试剂盒，所述试剂盒用于鉴定山羊的低氧适应性。

优选的，所述试剂盒还包括DNA聚合酶、dNTPs、PCR反应缓冲液中的一种或多种。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、本发明利对不同海拔地区山羊的基因组扫描和GWAS检测基因组的受选择区域，发现PAPSS2基因的结构变异(山羊第26号染色体42098934位处)在山羊的低氧适应性中达到全基因显著水平，可作为低氧适应育种的分子标记，为山羊低氧适应的分子标记辅助选择奠定基础。

2、本发明提供的结构变异分子标记不受山羊品种、年龄及性别等因素的限制，可用于山羊低氧适应特性的早期鉴定和选育，为高原地区山羊品种的引进提供参考依据，并显著促进高原地区山羊品种的育种进程。该结构变异分子标记有助于筛选低氧适应性相对较强的山羊的胚胎、杂交个体及品种(系)，为山羊低氧适应性性优良品种选育、建立优秀种质资源提供基础。

3、本发明检测山羊基因组中第26号染色体42098934位处结构变异分子标记的方法准确可靠，操作简单。

附图说明

图1为本发明提供的结构变异的插入缺失两种类型的测序峰图，其中(a)为缺失型，(b)为插入型。

图2为PAPSS2基因座结构变异位点245bp缺失的示意图。

图3为本发明PCR反应扩增出的三种类型结构变异产物的琼脂糖凝胶电泳结果，其中HomDel为纯合缺失型，Non-Del为纯合插入型，HetDel为杂合型，M为marker。

具体实施方式

为了使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案能予以实施，下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明。

在本发明的描述中，如未特殊说明，所用试剂均为市售，所用方法均为本领域常规技术。

实施例1山羊不同基因型与低氧适应性的全基因组分析

对86只东亚高海拔山羊(14只尼玛县山羊，24只措勤县山羊，10只林芝山羊，11只日土县山羊，9只山南山羊，5只那曲山羊和13只其他地区山羊)和80只东亚低海拔山羊(29只内蒙古白绒山羊、15只成都麻羊、9只金堂黑山羊、5只辽宁绒山羊、5只雷州山羊、5只马头山羊和12只其他山羊)进行全基因组扫描分析，发现位于山羊第26号染色体的第42098934位碱基处(山羊参考基因组为GCF_001704415.1)的插入或缺失结构变异分子标记与山羊的低氧适应最为密切关联(费雪检验P<0.01)。

对来自不同地区和品种的山羊进行了大量的基因组变异与低氧适应性相关性研究，发现一个与山羊低氧适应性显著关联(P＝2.76×10^-11)的结构变异，该标记位于山羊第26号染色体的第42098934位碱基后一段245bp DNA片段的插入缺失，属于PAPSS2基因第7和第8外显子间的内含子区域。结构变异缺失型在高原低氧地区山羊中的频率在88.3％以上，在非高原地区山羊中该结构变异缺失型的频率仅为21.3％。因此，可通过检测结构变异分子标记预测个体的低氧适应性，在高原地区山羊的引种和选育中发挥重要作用。当山羊的结构变异为缺失型时可以判定该山羊低氧适应性较强，当山羊的结构变异为插入型时可以判定该山羊低氧适应性差，不适于高原地区的品种选育和引种，进而加速高原地区山羊的育种进程。

实施例2.山羊PAPSS2基因结构变异多态性鉴定

1.提取待测山羊的基因组DNA

采集来自中国各地方的29只高原地区生活的山羊和44只非高原地区生活的山羊的血样，详细信息见表1，采用血液基因组DNA柱式小量提取试剂盒(CW2087M)提取血液中的基因组DNA。

表1样品采集表

样品	样本数量(只)	海拔高度	类型
				西藏山南多布章	10	3700m	高原
山南藏羊	10	>3000m	高原
				班玛县藏羊	9	1800–4000m	高原
喀什绒山羊	10	500–1200m	非高原
				新疆萨瓦甫齐山羊	10	1100m	非高原
呼伦贝尔绒山羊	14	1000–1200m	非高原
				新疆博格达绒山羊	10	450–800m	非高原

注：生活在高原的山羊均默认具有低氧适应性。

2.扩增含有结构变异分子标记的核苷酸片段

针对实施例1中筛选到的PAPSS2基因的结构变异分子标记，根据NCBI数据中记录的PAPSS2基因序列(Gene ID：102187555)设计引物，包括：

正向引物F：5’-ATTTGCCTCCTGTTTTGAATTCCT-3’，SEQ ID No.3；

反向引物R：5’-AGATGGTAATGATAACCCTATATGCG-3’，SEQ ID No.4。

以“1”中的基因组DNA为模板，扩增待测样品含有结构变异分子标记的核苷酸片段并检测结构变异类型该结构变异位点位于如SEQ ID No.1所示PCR扩增产物片段的98bp处，该位点的结构变异类型为插入或缺失。

SEQ ID No.1的核苷酸序列如下：

ATTTGCCTCCTGTTTTGAATTCCTAAGTTTGTAATGGGAAAGAACACCTCTCACTCCATATTTCCATATTTGATCTGTTTCTTTAACTTTTGTATTCTTTTTTTTTAAATTTTTTTAAAAATTTTAAAATCTTTAATTCTTACATGCGTTCCCAAACATGAACCCCCCTCCCACCTCCCTCCCCATAACATCTCTCTGGGTCATCCCCATGCACCAGCTCCAAGCATGCTGTATCCTGCATCAGACATAGACTGGTGATTCAATTCTTACATGATAGTATACATGTTAGAATGTCATTCTCCCAGATCACCCCACCCTCTCCCTCTCCCTCCTTTTGTATTCTATTGCTTTTTAAAAATTTATTTATTTTAGTTGGAGGCTAAATACTTTACAATATTGTAGTGGTTTTTGCCATATGCTGACATGAATCAGCCATGGGTGTACAAGTGTTCCCCATCCTGAACCCCCCTCCCACCTCCTTCCCCATCCCATCTCTCTGAGTCATCCCAGTGCACCAGCCCTGAGCACCCTGTCTCATGCATCGAACCTGGATTGGCGATCTGTTTCACATATGATAATATACATGTTTCAATGCTATTCTCTCAGATCATCCCACCCTCGCCTTCTCCCACAGAGTCCAAAAGACTGTTCTATACATCTGTGTCTCATTTTCTGTCTCGCATATAGGGTTATCATTACCATCT

其中，PCR扩增反应中，扩增体系为25μL，其中包含50-100ng/μL(该范围内的任意数值均可，不影响最终的扩增结果)待测山羊基因组DNA模板1μL，10μM正向引物F和反向引物R各1μL，2×Rapid Taq Master Mix 12.5μL，ddH₂O9.5μL。

扩增反应程序为：95℃预变性3min，95℃变性15sec，68℃退火15sec，72℃延伸10sec，10个循环，-1℃/cycle；95℃变性15sec，58℃退火15sec，72℃延伸10sec，30个循环，-0.1℃/cycle；72℃延伸5min，4℃保存。

3.待测山羊目标位点结构变异类型分析

将“2”中的PCR扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果如图3所示，由图3可知，根据待测山羊个体的PCR扩增产物条带可以明显判定待测山羊个体的结构变异类型。根据PCR扩增产物条带大小，结构变异类型可分为插入型、杂合型和缺失型。

对“2”中的PCR扩增产物进行Sanger测序，并利用SnapGene软件分析扩增产物第98bp处的结构变异类型。若第98bp处的结构变异类型为缺失，则待测山羊是适应高原低氧环境的优势品种；若第98bp处的结构变异类型为插入，则判定待测山羊不是适应高原低氧环境的优势品种。两种多态性的测序峰图如图1所示，图1中(a)为缺失型，(b)为插入型。图2为PAPSS2基因座结构变异位点245bp缺失的示意图。

当山羊的结构变异类型为缺失SEQ ID No.2所示核苷酸序列(即扩增产物不具有SEQ ID No.2所示核苷酸序列)时可以判定山羊具有低氧适应性，当山羊的结构变异类型为插入SEQ ID No.2所示核苷酸序列(即扩增产物中具有一个SEQ ID No.2所示核苷酸序列)时可以判定山羊不具备低氧适应性，本发明的方法可以提高山羊低氧适应性筛选的准确性和效率。

实施例3.对216只山羊的PAPSS2基因的多态性位点进行扩大群体分析

按照实施例2的方法对59只高原低氧环境生活的山羊和157只非高原环境生活的山羊进行PAPSS2基因进行结构变异检测，上述结构变异(位于SEQ ID No.1所示序列的第98bp处，即山羊第26号染色体第42098934位置，插入/缺失的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，多态性为插入/杂合/缺失，当多态性为杂合时测序峰图为乱峰，没有实际意义)在高原低氧环境生活的山羊中缺失型的频率显著高于在非高原环境生活的山羊(费雪检验P＝2.2×10^-16)。进一步验证了该处结构变异分子标记的插入缺失在山羊的低氧适应性的相关性(如表2所示)。

表2 PAPSS2基因的结构变异在两种不同生活环境中的基因型数目

生活地区	缺失(只)	杂合(只)	插入(只)
				高原地区	52	7	0
非高原地区	35	73	49

SEQ ID No.2的核苷酸序列如下：

TTTTTTTTAAATTTTTTTAAAAATTTTAAAATCTTTAATTCTTACATGCGTTCCCAAACATGAACCCCCCTCCCACCTCCCTCCCCATAACATCTCTCTGGGTCATCCCCATGCACCAGCTCCAAGCATGCTGTATCCTGCATCAGACATAGACTGGTGATTCAATTCTTACATGATAGTATACATGTTAGAATGTCATTCTCCCAGATCACCCCACCCTCTCCCTCTCCCTCCTTTTGTATTCT

上述来源不同地方的高原地区及非高原地区生活的山羊品种及所述结构变异的基因型分析结果表明，山羊的低氧适应性判定可以通过chr26:42098934位碱基后结构变异的多态性判定实现。利用该结构变异分子标记检测确定山羊的低氧适应性可以为高原地区的山羊引种提供科学依据，同时加快高原地区山羊的育种进程，节省育种时间。

需要说明的是，本发明中涉及数值范围时，应理解为每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用，由于采用的步骤方法与实施例相同，为了防止赘述，本发明描述了优选的实施例。尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

序列表

<110> 西北农林科技大学

<120> 一种与山羊低氧适应相关的结构变异分子标记及应用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 704

<212> DNA

<213> 山羊

<400> 1

atttgcctcc tgttttgaat tcctaagttt gtaatgggaa agaacacctc tcactccata 60

tttccatatt tgatctgttt ctttaacttt tgtattcttt ttttttaaat ttttttaaaa 120

attttaaaat ctttaattct tacatgcgtt cccaaacatg aacccccctc ccacctccct 180

ccccataaca tctctctggg tcatccccat gcaccagctc caagcatgct gtatcctgca 240

tcagacatag actggtgatt caattcttac atgatagtat acatgttaga atgtcattct 300

cccagatcac cccaccctct ccctctccct ccttttgtat tctattgctt tttaaaaatt 360

tatttatttt agttggaggc taaatacttt acaatattgt agtggttttt gccatatgct 420

gacatgaatc agccatgggt gtacaagtgt tccccatcct gaacccccct cccacctcct 480

tccccatccc atctctctga gtcatcccag tgcaccagcc ctgagcaccc tgtctcatgc 540

atcgaacctg gattggcgat ctgtttcaca tatgataata tacatgtttc aatgctattc 600

tctcagatca tcccaccctc gccttctccc acagagtcca aaagactgtt ctatacatct 660

gtgtctcatt ttctgtctcg catatagggt tatcattacc atct 704

<210> 2

<211> 245

<212> DNA

<213> 山羊

<400> 2

ttttttttaa atttttttaa aaattttaaa atctttaatt cttacatgcg ttcccaaaca 60

tgaacccccc tcccacctcc ctccccataa catctctctg ggtcatcccc atgcaccagc 120

tccaagcatg ctgtatcctg catcagacat agactggtga ttcaattctt acatgatagt 180

atacatgtta gaatgtcatt ctcccagatc accccaccct ctccctctcc ctccttttgt 240

attct 245

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atttgcctcc tgttttgaat tcct 24

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

agatggtaat gataacccta tatgcg 26

Claims (10)

1.一种与山羊低氧适应相关的结构变异分子标记，其特征在于，所述结构变异分子标记是山羊第26号染色体的第42098934位碱基后插入或缺失245bp的DNA片段，所述DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

2.根据权利要求1所述的一种与山羊低氧适应相关的结构变异分子标记，其特征在于，所述结构变异分子标记位于如SEQ ID No.1所示核苷酸序列的第98bp处。

3.一种权利要求1或2所述的结构变异分子标记的应用，其特征在于，所述结构变异分子标记与山羊的低氧适应性相关。

4.根据权利要求3所述的一种结构变异分子标记的应用，其特征在于，缺失所述结构变异分子标记的山羊具有低氧适应性，插入所述结构变异分子标记的山羊不具有低氧适应性。

5.根据权利要求3所述的一种结构变异分子标记的应用，其特征在于，所述结构变异分子标记用于山羊分子标记辅助育种。

6.一种用于检测权利要求1或2所述的与山羊低氧适应相关的结构变异分子标记的特异性引物，其特征在于，所述特异性引物的核苷酸序列如下：

正向引物F：5’-ATTTGCCTCCTGTTTTGAATTCCT-3’；

反向引物R：5’-AGATGGTAATGATAACCCTATATGCG-3’。

7.一种权利要求6所述的特异性引物在鉴定山羊低氧适应性品种中的应用。

8.根据权利要求7所述的一种特异性引物在鉴定山羊低氧适应性品种中的应用，其特征在于，鉴定山羊低氧适应性品种的方法如下：

(1)提取待测山羊的基因组DNA；

(2)以待测山羊基因组DNA为模板，使用正向引物F和反向引物R进行PCR扩增反应，获得扩增产物；

(3)检测所述扩增产物片段第98bp处结构变异的类型，若结构变异的类型为缺失SEQID No.2所示核苷酸序列，则判定待测山羊具有低氧适应的特征；若结构变异的类型为插入SEQ ID No.2所示核苷酸序列，则判定待测山羊不具有低氧适应的特征。

9.根据权利要求8所述的特异性引物在鉴定山羊低氧适应性品种中的应用，其特征在于，(2)的PCR扩增反应中，扩增体系为25μL，其中包含50-100ng/μL待测山羊基因组DNA模板1μL，10μM正向引物F和反向引物R各1μL，2×Rapid Taq Master Mix 12.5μL，ddH₂O 9.5μL。

扩增反应程序为：95℃预变性3min，95℃变性15sec，68℃退火15sec，72℃延伸10sec，10个循环，-1℃/cycle；95℃变性15sec，58℃退火15sec，72℃延伸10sec，30个循环，-0.1℃/cycle；72℃延伸5min，4℃保存。

10.一种包括权利要求6所述的特异性引物的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于鉴定山羊的低氧适应性。

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