CN109112217A

CN109112217A - 一种与猪体长和乳头数显著关联的遗传标记及应用

Info

Publication number: CN109112217A
Application number: CN201710510782.7A
Authority: CN
Inventors: 左波; 聂光伟; 王国水; 徐在言; 毛慧敏; 毛翠
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2017-06-29
Filing date: 2017-06-29
Publication date: 2019-01-01
Anticipated expiration: 2037-06-29
Also published as: CN109112217B

Abstract

本发明属于猪的遗传标记制备技术领域，具体涉及一种与体长、乳头数性状关联的遗传标记及应用，该标记从猪LTBP2基因中筛选得到，其序列如SEQ ID NO.1和图2所示，在该序列203位碱基处发生一个C/T碱基突变，导致MspI‑RFLP多态性。筛选方法为：从猪血液中提取基因组DNA，设计引物，PCR扩增，PCR产物克隆、测序，序列比对分析，SNP检测，标记与生长性状间相关性分析。公开了猪LTBP2基因3'UTR区的SNP分型检测技术，发现该C/T突变位点与达百公斤体重日龄、初生重性状显著相关；与体长、乳头数性状极显著相关。本发明为猪标记辅助选择提供了新的标记资源。

Description

一种与猪体长和乳头数显著关联的遗传标记及应用

技术领域

本发明属于猪的标记辅助选择技术领域，具体涉及一种与猪体长、乳头数性状关联的遗传标记。所述的遗传标记分离自LTBP2基因的3′UTR区域。本发明还包括该遗传标记在猪标记辅助选择关联分析中的应用。

背景技术

猪的育种主要是依据其体型外貌、生产性能和体质类型等进行选择，即从血统、个体和后代表型值进行选留与选育。该种方法无法知道经济性状的遗传背景，因此在遗传进展、效果等方面具有不稳定性。动物育种技术发展至今，其过程可分为三个阶段：表型值育种、估计育种值育种及分子育种。在分子育种中，分子标记辅助选择(molecular marker-assisted selection，MAS)方法具有应用价值大、成本相对低廉、育种群体遗传稳定的优点，而得到大量研究和实际应用。它是通过与重要生产性状座位连锁的DNA标记来评估动物个体的生产潜力。在基因的多种遗传效应中，只有加性效应能够稳定遗传，并且数量性状的基因加性效应值称之为育种值。由于该值不能直接度量得到，实际所得数据是包含育种值在内的各种遗传效应和环境效应共同作用得到的表型值。因此在猪的育种过程中，综合表型值及DNA标记辅助选择将会大大提高选种的准确性。

分子标记是指能反映动物个体或种群间基因组中某种差异的特异性DNA片段。目前所发现的分子标记一共包括四类特征序列：VNTR、STR、SNP、CNV。作为第一代分子标记的可变数目串联重复序列(variable number tandem repeat，VNTR)，即小卫星DNA，是以限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)为技术依托来实现检测的。因此，RFLP是最早应用于分子标记的筛选。将PCR与RFLP结合就形成PCR-RFLP(PCR-restriction fragment length polymorphism)技术，利用该技术方法可以实现对单核苷酸多态性进行基因型分析。其原理是在扩增不同个体同一段DNA序列时，由于单个碱基的突变从而引起限制性内切酶识别位点的得失，经电泳分离产生大小不同的条带，从而实现对基因型的分析。

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)是指基因组DNA序列中由于单个核苷酸(A、T、C或G)的突变而引起的多态性，形式包括单碱基的插入、缺失、转换和颠换等，是继限制性片段长度多态性和微卫星标记之后的第三代遗传标记。因其遗传稳定性高、位点丰富且分布广泛及检测快速易实现自动化分析等显著特点，而得到众多研究和应用。其生物学功能主要是影响基因的表达丰度、转录活性、翻译后修饰等。猪的基因组大小约2.7GB，SNP覆盖密度可达每300-400bp即有一个。因此，对于挖掘具有功能性、紧密连锁的遗传标记，将对猪的育种进程及选育程度有实质性的提升。

转化生长因子β结合蛋白2(latent transforming growth factor beta bindingprotein 2，LTBP2)是一种细胞外基质(Extracellular matrix，ECM)糖蛋白，属于LTBPs/fibrillins超家族，在肺、肝、脾、心脏均有表达。在胚胎发生、动脉损伤修复、细胞粘附和弹性纤维聚集过程中发挥重要作用(2012)。LTBPs通常包含两个结构域，一个是表皮生长因子样结构域，另一个由8个半胱氨酸重复结构组成，在蛋白互作中具有重要作用(2000)。LTBPs与转化生长因子β(TGFβ)家族成员相互作用，促进配体的分泌并将潜在复合物靶向细胞外基质(2005)。LTBP2能够抑制proGdf11的细胞外加工过程，进而调节生长分化因子的活性，在Gdf11基因敲除小鼠中，导致小鼠肋骨数显著增加(2011)。Zhang等以大白猪和民猪杂交F2代为样本，通过全基因组关联分析(Genome wide association study，GWAS)定位到猪7号染色体2.38Mb区域与肋骨数关联的QTL，鉴定出一个显著关联的SNP ASGA0035536，解释了16.51％的表型变异，并筛选出影响猪肋骨数的候选基因LTBP2。这些研究结果表明，LTBP2基因对于肋骨的形成及机体的生长发育具有重要作用。因此，在猪育种进程中如果其肋骨数能够增加，那么体长、乳头数等经济性状也将显著增加，这将使猪的生长性状大为改善，从而带来可观的经济效益。本研究克隆了大白猪LTBP2基因的3′UTR序列，并鉴定出一个SNP位点。通过关联分析发现，该位点与达百公斤体重日龄、初生重显著相关(P<0.05)，与体长、乳头数性状极显著相关(P<0.01)。推测该SNP位点有可能与猪的体长、乳头数性状具有一定的关联性。

发明内容

本发明的目的是筛选一种与猪生长性状关联的遗传标记。通过克隆猪LTBP2基因的3′UTR序列，运用直接测序法寻找SNP位点，并建立了相应的SNP检测方法，分析其与猪生长性状的关联性。从而为猪的生长性状建立新的标记辅助选择位点。

本发明通过以下技术方案实现：

本发明获得了大白猪LTBP2基因包括第三十四内含子和3′UTR序列在内片段，片段长度为503bp，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1(大白猪，见图2)所述，通过在NCBI网站对上述序列进行blast比对，在该扩增片段内发现一处核苷酸多态性(SNP)位点，该SNP位点如图2所示。其突变位点具体在翻译终止密码子TAG之后第109bp处，即3′UTR起始第109bp(在该序列的第203位碱基处，发生一个等位基因的突变)。申请人将该突变的位点命名为C109T。

选择大白猪为试验材料，从猪血液中提取基因组DNA，根据NCBI数据库公布的猪LTBP2基因序列设计引物对，该引物对的序列如下所示：

正向引物F：5'-TCACTGCGAGAACACGG-3'

反向引物R：5'-TGGATCATGGCTGGAAA-3'

利用该引物对进行PCR扩增、PCR产物的纯化、克隆测序和序列比对分析。

筛选得到一种与猪生长性状关联的遗传标记，该遗传标记的直观的核苷酸序列如下所示：

TCACTGCGAGAACACGGAGGGCTCCTACCGCTGCCACTGCCCCCCAGGTTATGTGGCTGAAGCAGGTCCCCCACACTGCACTGCCAAGGAGTAGACGTGAGGGGTCAGTATGAGCAGTTAGCTGGAAGTGGACCCCCGCCACAGGCGGGGCCTTGAGGAAGCCTTCCTAGCTGGGGAGGCACCATGAAGCCATCTGAAGACAR(C/T)CGGGCAGGGGGCCCTGCAGCCCAGCTCCCAGCCAGCCTCGCCTGCTCTTCATCTCCCCCAGCTTCAGCTCTGGCTGGGAGCCTCTGTCACCGCCTCCACAGCGCCATGCCCTTGCTTGGCTCAAACACCACCAATTGCTTTAATGCTTCAGCCACTGGCCATGAGGCCCAGTCTGCCATCTGCCCTGGCCTTGCTGTGGGCTGCCTACCAAAGGATGGCCGTCAACCAGCCCTACAAGCTGTGCAGACATGCCAGGCCCTTCGCCTGACACTGCACGCCCCCCTTTCCAGCCATGATCCA

上述序列的203位碱基处的R是C或T，该突变导致MspI-RFLP多态性。

本发明提供了一种筛选猪体长、乳头数性状相关联的遗传标记方法，包括以下步骤：

从猪血液中提取全基因组DNA，根据猪LTBP2基因序列设计引物对，该引物对的序列如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示，用该引物对在猪基因组DNA中进行PCR扩增，将所得的PCR扩增片段用限制性内切酶MspI酶切分型，得到MspI-RFLP多态性核苷酸序列(大白猪：SEQ ID NO：1)，在所述的SEQ ID NO：1序列的第203个碱基位点处存在一个C/T的碱基突变，利用该突变位点可以作为遗传标记对猪的生长性状进行关联分析。

本发明提供了检测上述序列C109T变异的MspI-RFLP基因型分型方法。

本发明进一步提供了利用MspI-RFLP方法确定不同基因型个体与生长性状之间关联分析的应用。

更详细的技术方案见《具体实施方式》所述。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是大白猪LTBP2基因的核苷酸序列，即作为本发明遗传标记的核苷酸序列。其中在该序列的第203个碱基处，存在一个等位基因的突变位点，即由“C”突变为“T”。

序列表SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3是扩增LTBP2基因的引物对序列，该引物对序列也是检测本发明遗传标记的引物。

图1：本发明的技术流程图。

图2：大白猪LTBP2基因的核苷酸序列。在所示序列的第203位碱基处的C/T突变位点是导致MspI-RFLP多态性的特异性位点。

图3：本发明对LTBP2基因MspI-RFLP的检测结果。琼脂糖凝胶浓度为2﹪。附图标记说明：图中泳道：M为DL2000Maker；泳道1和泳道2为TT基因型，503bp；泳道3和泳道4为CC基因型，203bp，300bp；泳道5和泳道6为TC基因型，503bp，203bp，300bp。

具体实施方式

实施例1：猪LTBP2基因3′UTR区域DNA片段的获得及SNP检测方法的建立

试验选择外国血缘猪种“大白猪”，以美系和法系两种类型猪种为材料，根据猪LTBP2基因组序列(登陆号Gene ID：100514300)设计如下引物对，具体序列如下：

正向引物F：5'-TCACTGCGAGAACACGG-3'

反向引物R：5'-TGGATCATGGCTGGAAA-3'

利用上述引物对在“大白猪”基因组DNA中进行PCR扩增。

PCR反应体系见表1所示。

表1 PCR反应体系

PCR反应条件见表2所示。

表2 PCR反应条件

将所得的PCR产物进行纯化和克隆后进行序列测定，测序工作由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。经blast比对分析，发现在该序列中第203位碱基处存在一个C/T碱基突变(转换)，该突变引起限制性内切酶MspI酶切位点多态性。

取10ul PCR产物加入0.5ul限制性内切酶MspI(20U/ul)、2ul 10×buffer和7.5ulddH2O，37℃酶切1小时，酶切产物经2％的琼脂糖凝胶电泳检测，在凝胶成像系统下观察并记录酶切结果。当此突变处碱基都为C时存在酶切位点，酶切结果检测到两条带记为CC基因型(203bp+300bp)；当此突变处碱基都为T时不识别该位点，酶切结果检测到一条带记为TT基因型(503bp)；当C和T都存在时，酶切结果为三条带记为TC基因型(203bp+300bp+503bp)。结果如图3所示。

实施例2：本发明的遗传标记与猪生长性状的关联分析及应用

为了确定猪LTBP2基因3′UTR区域内的SNP与猪表型差异是否相关，选择美系大白猪(485头)和法系大白猪(954头)为试验材料，样本采集及其数据收集于浙江开盛生态农业发展有限公司。采用常规MspI-RFLP方法进行多态性检测，并分析猪LTBP2基因3′UTR区域不同基因型与猪生长性状的相关性。采用SAS统计软件中的混合线性模型(Mixed)进行基因型和表型值之间的关联分析，分析模型为：

Y_ijkl＝u+G_i+M_j+X_k+S_l+e

式中，Y_ijkl为性状观察值；u为性状总平均值；G_i为基因型效应(包括基因加性效应和显性效应；加性效应用-1，0和1分别代表TT、TC和CC基因型；显性效应用-1代表TC基因型，1代表TT和CC基因型)；M_j为年-季度效应；X_k为性别效应及固定效应；S_l为父本效应及随机效应；e为随机误差，假定服从(0，σ²)分布。

对大白猪LTBP2基因3′UTR区域C109T位点的多态性检测，在这两个群体中均检测到三种基因型，基因型频率及分布情况如表3所示。

表3大白猪LTBP2基因MspI-RFLP基因型频率和等位基因频率

注：表括号2外的为个体数，括号内的为基因型频率。

从表3中可以看出，在两个群体中T等位基因频率要明显大于C等位基因频率。T等位基因对于增加体长又具有比较大的加性效应，因此T等位基因频率的增加对于猪体长性状的改良，具有重要意义。

表4美系大白猪LTBP2基因C109T位点的多态性与生长性状的关联分析

表5法系大白猪LTBP2基因C109T位点的多态性与生长性状的关联分析

注：1)以上数值为最小二乘均值±标准误；同行含有相同字母表示差异不显著，字母不同时，小写字母表示差异显著(P<0.05)，大写字母表示差异极显著(P<0.01)，未标注者表示差异不显著(P>0.05)。

2)加性效应a＝(TT-CC)/2；显性效应d＝TC-(TT+CC)/2。

结合表4和表5可以得出，LTBP2基因3′UTR区域C109T位点的多态性在美系大白猪中与达百公斤体重日龄、初生重具有显著相关性(P<0.05)，与体长、乳头数具有极显著相关性(P<0.01)，且都具有明显的加性效应值。TT基因型达到百公斤体重日龄的天数要比CC基因型少了接近两天的差值，这就说明在后期的生长速度方面要快于CC基因型(因TT基因型的初生重要比CC基因型少了0.08kg)，并且体长超过CC基因型近3cm。同时该位点在法系大白猪中与体长、乳头数均具有极显著相关性(P<0.01)，其中TT基因型比CC基因型的体长平均多出6.3cm。从遗传稳定性和遗传进展方面来讲，TT基因型对于增加体长、乳头数性状具有明显优势。综合以上结果，推测该位点可作为增加大白猪体长及乳头数性状的潜在遗传标记。

主要参考文献

[1]白媛媛.转化生长因子结合蛋白2做为心力衰竭标志物的初步研究[D].北京协和医学院,2012.

[2]Shipley JM,Mecham RP,Maus E,Bonadio J,Rosenbloom J,McCarthy RT,Baumann ML,Frankfater C,Segade F,Shapiro SD(2000).Developmental expression oflatent transforming growth factorβbinding protein 2 and its requirement earlyin mouse development.Mol Cell Biol 20:4879–4887.

[3]Rifkin DB(2005).Latent transforming growth factor-β(TGF-β)bindingproteins:orchestrators of TGF-βavailability.J Biol Chem280:7409–7412.

[4]Sun X,Essalmani R,Susan-Resiga D,Prat A,Seidah NG(2011)Latenttransforming growth factor beta-binding proteins-2and-3inhibit the proproteinconvertase 5/6A.J Biol Chem286:29063–29073.

[5]Zhang L C,Yue J W,Pu L,Wang L G,Liu X,Liang J,Yan H,Zhao K B,Li N,Shi H B,Zhang Y B,Wang L X.Genome-wide study refines the quantitative traitlocus for number of ribs in a Large White×Minzhu intercross pig populationand reveals a new candidate gene.[J].Molecular Genetics and Genomics,2016,291(5):1885。

SEQUENCE LISTING

<110> 华中农业大学

<120> 一种与猪体长和乳头数显著关联的遗传标记及应用

<130>

<141> 2017-06-28

<160> 3

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 503

<212> DNA

<213> 猪（Sus scrofa）

<220>

<221> gene

<222> (1)..(503)

<223>

<220>

<221> mutation

<222> (203)..(203)

<223>

<400> 1

tcactgcgag aacacggagg gctcctaccg ctgccactgc cccccaggtt atgtggctga 60

agcaggtccc ccacactgca ctgccaagga gtagacgtga ggggtcagta tgagcagtta 120

gctggaagtg gacccccgcc acaggcgggg ccttgaggaa gccttcctag ctggggaggc 180

accatgaagc catctgaaga catcgggcag ggggccctgc agcccagctc ccagccagcc 240

tcgcctgctc ttcatctccc ccagcttcag ctctggctgg gagcctctgt caccgcctcc 300

acagcgccat gcccttgctt ggctcaaaca ccaccaattg ctttaatgct tcagccactg 360

gccatgaggc ccagtctgcc atctgccctg gccttgctgt gggctgccta ccaaaggatg 420

gccgtcaacc agccctacaa gctgtgcaga catgccaggc ccttcgcctg acactgcacg 480

cccccctttc cagccatgat cca 503

<210> 2

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(17)

<223>

<400> 2

tcactgcgag aacacgg 17

<210> 3

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(17)

<223>

<400> 3

tggatcatgg ctggaaa 17

Claims

1.一种筛选的与猪体长和乳头数性状显著关联的遗传标记，其特征在于它的核苷酸序列如下所示：

TCACTGCGAGAACACGGAGGGCTCCTACCGCTGCCACTGCCCCCCAGGTTATGTGGCTGAAGCAGGTCCCCCACACTGCACTGCCAAGGAGTAGACGTGAGGGGTCAGTATGAGCAGTTAGCTGGAAGTGGACCCCCGCCACAGGCGGGGCCTTGAGGAAGCCTTCCTAGCTGGGGAGGCACCATGAAGCCATCTGAAGACARCGGGCAGGGGGCCCTGCAGCCCAGCTCCCAGCCAGCCTCGCCTGCTCTTCATCTCCCCCAGCTTCAGCTCTGGCTGGGAGCCTCTGTCACCGCCTCCACAGCGCCATGCCCTTGCTTGGCTCAAACACCACCAATTGCTTTAATGCTTCAGCCACTGGCCATGAGGCCCAGTCTGCCATCTGCCCTGGCCTTGCTGTGGGCTGCCTACCAAAGGATGGCCGTCAACCAGCCCTACAAGCTGTGCAGACATGCCAGGCCCTTCGCCTGACACTGCACGCCCCCCTTTCCAGCCATGATCCA

上述序列中的R是C或T，导致MspI-RFLP多态性。

2.扩增如权利要求1所述的遗传标记的引物对，其核苷酸序列如下所述：

正向引物：TCACTGCGAGAACACGG，

反向引物：TGGATCATGGCTGGAAA。

3.一种筛选与猪体长、乳头数性状关联的遗传标记的方法，其特征在于，包括以下步骤：

从猪血液中提取基因组DNA，根据猪LTBP2基因基因组序列设计引物，该引物的序列如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示，用所述的引物对在猪基因组DNA中进行PCR扩增，对PCR扩增的片段进行MspI酶切分型，得到导致MspI-RFLP多态性的核苷酸序列，所述的多态性的核苷酸序列SEQ ID：1所示，在该序列的203bp处存在一个C/T的等位基因突变，利用所述的突变位点作为遗传标记对猪猪体长和乳头数性状得关联分析。

4.权利要求1所述的遗传标记在猪体长、乳头数性状辅助选择中的应用。

5.权利要求2所述的引物对在猪体长、乳头数性状辅助选择中的应用。