BR112012014466B1 - método para detectar uma mutação usando um microarranjo de dna apresentando uma pluralidade de sondas de polinucleotídeo imobilizadas no mesmo - Google Patents
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Abstract
MÉTODO PARA PROJETAR SONDA EM MICROARRANJO DE DNA, E MICROARRANJO DE DNA PROVIDO COM SONDA PROJETADA DESTE MODO. A presente invenção refere-se a uma sonda a ser usada em um microarranjo de DNA tendo uma excelente taxa de detecção de um polimorfismo tal como SNP contido em DNA genômico. Um método para projetar uma sonda de acordo com a invenção inclui as etapas de: especificar uma ou mais regiões que cobrem pelo menos uma parte de fragmentos flanqueados pelos locais de reconhecimento da enzima de restrição reconhecidos por uma enzima de restrição, contida em DNA genômico derivado de um organismo a ser testado; e projetar uma sonda para a especificada uma ou mais regiões para detecção do fragmento no organismo a ser testado.
Description
A presente invenção se refere a um método para projetar uma sonda usada em um microarranjo de DNA para detectar, por exemplo, uma mutação em DNA genômico, o microarranjo de DNA tendo uma sonda projetada pelo método, e um método para detectar uma mutação usando os microarranjos de DNA.
Dos polimorfismos representados por um único polimorfismo de nucleotídeo (SNP), existe um polimorfismo que pode ser usado como uma mutação caracterizando uma variação de um organismo homogêneo. Mais especificamente, uma variação pré-determinada em um organismo homogêneo pode ser distinguida de outras variações detectando e identificando uma mutação específica, como um polimorfismo em DNA genômico. Além disso, uma variação de um organismo a ser testado pode ser especificada detectando e identificando a mutação.
Como um método para detectar tal mutação em DNA genômico, um método de diretamente determinar uma sequência de um sítio de mutação site, um método de usar um polimorfismo de comprimento de fragmento de enzima de restrição (RFLP), um método de usar um polimorfismo de comprimento de fragmento de amplificação (AFLP) e similares são conhecidos. Além disso, um método de analisar uma variação baseada em identificação de um polimorfismo usando um Microarranjo de DNA chamado um método de DArT (Tecnologia de Matriz de Diversidade) (Nucleic Acids Research, 2001, Volumes 29, No. 4, e 25) é conhecido.
Um método para preparar um Microarranjos de DNA para uso no método de DArT é mostrado na figura 9. Primeiro, o DNA genômico é extraído de uma espécie de organismo pré-determinada e fracionado com enzima de restrição A e enzima de restrição B. Em seguida, para ambas as extremidades de cada fragmento de DNA genômico obtido pelo tratamento de enzima de restrição, um adaptador é conectado e cada um dos fragmentos do DNA genômico é clonado em um vetor. Em seguida, usando um iniciador capaz de hibridar com o adaptador, os fragmentos de DNA genômico são ampliados por PCR. Depois, os fragmentos de DNA genômico ampliados são marcados em um substrato como uma sonda para preparar um microarranjo de DNA.
Usando o microarranjo de DNA dessa maneira preparado, uma variação de uma espécie de organismo a ser testada pode ser analisada. Primeiro, o DNA genômico é extraído de um organismo para ser testado, e fracionado com a enzima de restrição A e a enzima de restrição B que são usadas para preparar o microarranjo de DNA. Para os fragmentos de DNA genômico, um adaptador é conectado similarmente na preparação do microarranjo de DNA e os fragmentos resultantes são ampliados por PCR. Os fragmentos de DNA genômico ampliados são marcados com um rótulo fluorescente etc. e hibridizados com a sonda identificada no microarranjo de DNA. Baseado na presença ou ausência de hibridização do fragmento de DNA genômico rotulado com a sonda detectada, uma diferença entre as espécies de organismo pré-determinadas usadas na preparação do microarranjo de DNA e a espécie de organismo a ser testada podem ser analisadas.
De acordo com o método de DArT, a diversidade de uma espécie de organismo pode ser determinada em um nível de genótipo no DNA genômico usando o microarranjo de DNA preparado como mencionado acima. Entretanto, o microarranjo de DNA preparado como mencionado acima tem um problema pelo fato de que a capacidade de detecção de uma sonda, que é definida como uma região flanqueada pelos sítios de reconhecimento de enzima de restrição, não é suficiente. Mais especificamente, mesmo se um fragmento de DNA genômico derivado de uma espécie de organismo a ser testado contém uma pequena mutação como SNP, o fragmento de DNA genômico pode muitas vezes hibridar com a sonda do microarranjos de DNA. Em outras palavras, o método de DArT tem um limite de detecção, isto é, a detecção não pode ser feita a não ser que uma mutação, como um polimorfismo, esteja presente em uma sítio de reconhecimento de enzima de restrição ou deleção de diversas centenas de pares de base esteja presente.
Então, nas circunstâncias mencionadas acima, a presente invenção é dirigida para prover um método para projetar uma sonda de um microarranjo de DNA tendo uma excelente taxa de detecção de um polimorfismo como SNP contido no DNA genômico, um microarranjo de DNA tendo uma sonda projetada pelo método e um método para detectar uma mutação usando o microarranjo de DNA.
Nas circunstâncias mencionadas acima, os presentes inventores fizeram estudos intensivos e conceberam um método para projetar uma sonda capaz de detectar até uma pequena mutação como SNP no DNA genômico com uma sensibilidade excelente, e um método de detectar uma mutação usando um microarranjo de DNA tendo a sonda imobilizada para esse fim.
A presente invenção inclui os seguintes.
Mais especificamente, o método para projetar uma sonda de acordo com a presente invenção incluindo as etapas de: especificar uma ou mais regiões tendo um comprimento de nucleotídeo mais curto do que os fragmentos flanqueados pelos sítios de reconhecimento de enzima de restrição reconhecido por uma enzima de restrição, contida no DNA genômico derivado de um organismo alvo, e cobrindo pelo menos uma porção dos fragmentos de DNA genômico; e projetar a uma ou mais regiões especificadas como uma sonda para detectar o fragmento em um organismo a ser testado.
A uma ou mais regiões podem ser especificadas realizando as etapas a seguir: (1a) extrair o DNA genômico; (1b) digerir o DNA genômico extraído com a enzima de restrição; (1c) conectar um adaptador aos fragmentos de DNA genômico obtendo a etapa (1b); (1d) amplificar os fragmentos de DNA genômico usando um iniciador capaz de hibridar para o adaptador; (1e) sequenciar o fragmento de DNA genômico ampliado; e (1f) determinar a uma ou mais regiões baseado na sequência de nucleotídeos.
Na etapa (1b) aqui no presente, o DNA genômico pode ser digerido com uma ou mais enzimas de restrição. Além disso, na etapa (1c), o adaptador usado preferivelmente tem uma sequência complementar para uma extremidade projetando-se dos fragmentos de DNA genômico obtidos na etapa (1b). Além do mais, a região a ser determinada na etapa (1f) tem, por exemplo, um nucleotídeo de 20 a 10.000 de comprimento, preferivelmente, um nucleotídeo de a 100 a 8.000 de comprimento e mais preferivelmente, um nucleotídeo de 200 a 6.000 de comprimento.
Além disso, a uma ou mais regiões podem ser especificadas usando dados de sequência de nucleotídeo sobre o DNA genômico realizando as etapas a seguir: (2a) pesquisar os dados da sequência de nucleotídeo no DNA genômico para a sequência de reconhecimento de enzima de restrição para especificar a sequência de nucleotídeo dos fragmentos de DNA genômico obtidos pela fragmentação do DNA genômico com a enzima de restrição; e (2b) determinar a uma ou mais regiões baseado na sequência de nucleotídeos especificada.
Aqui no presente, a região determinada na etapa (2b) tem, por exemplo, um comprimento de nucleotídeo de 20 a 10.000, preferivelmente, um comprimento de nucleotídeo de 100 a 8.000, e mais preferivelmente um comprimento de nucleotídeo de 200 a 6.000.
Além do mais, a uma ou mais regiões podem ser determinadas realizando as etapas a seguir: (3a) extrair o DNA genômico; (3b) fragmentar o DNA genômico extraído com a enzima de restrição; (3c) conectar um adaptador aos fragmentos de DNA genômico obtidos na etapa (3b); (3d) ampliar os fragmentos de DNA genômico usando um iniciador capaz de hibridar para o adaptador; (3e) fragmentar o fragmento de DNA genômico ampliado com outra enzima de restrição; e (3f) separar os fragmentos de DNA obtidos por fragmentação na etapa (3e) como sondas.
Além do mais, no método para projetar uma sonda de acordo com a presente invenção, um fragmento flanqueado pelos sítios de reconhecimento de enzima de restrição pode ser um fragmenta flanqueado por mais de uma enzima de restrição tendo sequências de reconhecimento diferentes.
Na etapa (3b) aqui no presente, o DNA genômico pode ser fragmentado com uma ou mais enzimas de restrição. Além do mais, na etapa (3c), o adaptador usado tem preferivelmente uma sequência complementar para uma extremidade se projetando do fragmento de DNA genômico obtido na etapa (1b).
Por outro lado, o microarranjo de DNA, de acordo com a presente invenção, é preparado imobilizando uma sonda projetada pelo método mencionado acima para projetar uma sonda de acordo com a presente invenção em um veículo. Particularmente, no microarranjo de DNA, de acordo com a presente invenção, a sonda é preferivelmente sintetizada em um veículo com base nos dados de sequência.
Por outro lado, um método para detectar uma mutação usando o microarranjo de DNA, de acordo com a presente invenção, é um método de detectar uma mutação em um DNA genômico derivado de um organismo alvo a ser testado usando o microarranjo de DNA mencionado acima, de acordo com a presente invenção. Particularmente, um método de detecção de mutação usando o microarranjo de DNA de acordo com a presente invenção inclui as etapas a seguir:extrair um DNA genômico derivado de um organismo alvo a ser testado;fragmentar o DNA genômico com uma enzima de restrição tendo a mesma sequência de reconhecimento como a enzima de restrição usada no método para projetar uma sonda de acordo com a presente invenção;conectar um adaptador aos fragmentos de DNA genômico obtidos pelo tratamento da enzima de restrição;ampliar os fragmentos de DNA genômico usando um iniciador capaz de hibridização para o adaptador; e detectar um híbrido do fragmento de DNA genômico com a sonda colocando o fragmento de DNA genômico ampliado em contato com o microarranjo de DNA de acordo com a presente invenção.
Aqui no presente, na etapa de fragmentar o DNA genômico com a enzima de restrição, o DNA genômico pode ser fragmentado com uma ou mais enzimas de restrição similarmente ao método para projetar uma sonda. Além do mais, na etapa de conectar o adaptador, como o adaptador, um tendo uma sequência complementar à extremidade se projetando do fragmento de DNA genômico obtido na etapa de fragmentar o DNA genômico com a enzima de restrição é preferivelmente usado. Além do mais, a etapa de ampliar o fragmento de DNA genômico pode ainda ter uma etapa de adicionar uma molécula de rotular para um fragmento de DNA genômico ampliado, ou pode ter uma etapa de deixar o fragmento de DNA genômico incorporar uma molécula de rotular quando o fragmento de DNA genômico é ampliado.
O relatório descritivo da presente invenção incorpora o conteúdo descrito no relatório descritivo e/ou desenhos do Pedido JP No. 2009-283430 A, com base em que a prioridade do presente pedido é reivindicada.
De acordo com a presente invenção, é possível prover um método para projetar uma sonda tendo uma taxa excelente de detecção de um polimorfismo como SNP contido no DNA genômico, para uso em um microarranjo de DNA. Além do mais, de acordo com a presente invenção, é possível prover um microarranjo de DNA tendo uma excelente taxa de detecção de um polimorfismo como um SNP contido em um DNA genômico, e um método para detectar uma mutação através do uso do microarranjo de DNA.
A aplicação da presente invenção permite analisar, isto é, determinar e identificar, uma espécie de organismo com base em um genótipo, embora tenha sido difícil detectá-la através de um método convencional.
[figura 1] A figura 1 é um fluxograma mostrando esquematicamente um método para projetar uma sonda à qual a presente invenção é aplicada. [figura 2] A figura 2 é um fluxograma mostrando esquematicamente outro método para projetar uma sonda à qual a presente invenção é aplicada. [figura 3] A figura 3 é um fluxograma mostrando esquematicamente ainda outro método para projetar uma sonda à qual e presente invenção é aplicada. [figura 4] A figura 4 é um fluxograma mostrando esquematicamente uma etapa de detectar uma mutação usando um microarranjo de DNA tendo uma sonda projetada aplicando a presente invenção. [figura 5] A figura 5 é uma vista característica mostrando alinhamento de A_1 e A_2 e o sítio da sonda projetada. [figura 6] A figura 6 é uma vista característica mostrando alinha- mento de B_1 a B_2 e o sítio da sonda projetada. [figura 7] A figura 7 é um gráfico característico mostrando a relação entre a taxa de mutação introduzida em uma sonda e a intensidade de um sinal detectado. [figura 8] A figura 8 é um gráfico característico mostrando a relação entre a proporção da sonda do sítio de mutação preparada no Exemplo 3 e a proporção dos dados de sequência em que uma mutação foi detectada. [figura 9] A figura 9 é uma vista característica mostrando esquematicamente uma etapa de preparação de um microarranjos de DNA usada em um método DArT convencional.
Agora, o método para projetar uma sonda para uso no Microarranjo de DNA, de acordo com a presente invenção, um microarranjo de DNA tendo uma sonda projetada pelo método de projetar uma sonda, e um método de detectar uma mutação através do uso do Microarranjo de DNA, será mais especificamente descrito, referindo aos desenhos.
A sonda a ser projetada na presente invenção é preferivelmente aplicada a, particularmente, um assim chamado microarranjo de oligonucleotídeo. O microarranjo de oligonucleotídeo é um microarranjo, que é preparado sintetizando um oligonucleotídeo tendo uma sequência de nucleotídeo desejada em um veículo, e usando o oligonucleotídeo como uma sonda. O oligonucleotídeo sintetizado usado como uma sonda tem, por exemplo, um comprimento de 20 a 100 nucleotídeos, preferivelmente um comprimento de 30 a 90 nucleotídeos, e mais preferivelmente um comprimento de 50 a 75 nucleotídeos.
Note que, a sonda projetada na presente invenção pode ser aplicada a um microarranjo, que é preparado marcando um oligonucleotídeo sintetizado tendo os comprimentos de nucleotídeos mencionados acima em um veículo, similarmente ao assim chamado microarranjo do tipo Stanford.
Mais especificamente, a sonda projetada na presente invenção pode ser aplicada em qualquer microarranjo desde que ele seja convencionalmente conhecido. Desta maneira, a sonda projetada na presente invenção pode ser aplicada a um microarranjo usando um substrato plano formado de vidro e silicone etc., como um veículo e, para um arranjo de esferas, usando microesferas como um veículo.
Mais especificamente, no método para projetar uma sonda de acordo com a presente invenção, primeiro, o DNA genômico é extraído de um organismo pré-determinado, como mostrado na figura 1 (Etapa 1a). Como o organismo, qualquer um de microorganismo, como uma bactéria e um fungo, um inseto, uma planta e um animal podem ser usados. Note que, o método para projetar uma sonda, mostrado na figura 1, é preferivelmente aplicado para o caso de usar um organismo cujos dados de sequência de nucleotídeos de DNA genômico não foram ainda bem elucidados. Além do mais, um método de extrair DNA genômico, que não é particularmente limitado a um método conhecido na técnica, pode ser usado.
Em seguida, o DNA genômico extraído é fragmentado com uma ou mais enzimas de restrição (Etapa 1b). No exemplo mostrado na figura 1, o DNA genômico é fragmentado com dois tipos de enzimas de restrição, enzima de restrição A e enzima de restrição B, que são sequencialmente usadas nesta ordem. As enzimas de restrição usadas aqui no presente não são particularmente limitadas. Por exemplo, Pstl, EcoRI, Hindlll, BstNI, Hpall e HaelII podem ser usadas. Particularmente, a enzima de restrição pode ser apropriadamente selecionada em consideração de uma frequência de aparência de uma sequência de reconhecimento de tal maneira que o DNA genômico é completamente fragmentado nos fragmentos de DNA genômicos tendo um comprimento de 20 a 10.000 nucleotídeos. Além do mais, no caso em que mais de uma enzima de restrição é usado, é preferido que depois de todas as enzimas de restrição serem aplicadas, os fragmentos de DNA genômico, de um comprimento de 200 a 6.000 nucleotídeos, permaneça. Além do mais, quando mais de uma enzima de restrição é usada, a ordem de suprimento de enzimas de restrição para tratamento não é particularmente limitada. Além do mais, quando condições de tratamento comum (composição da solução, temperatura etc.,) são usadas, mais de uma enzima de restrição pode ser usada no mesmo sistema de reação. Para descrever mais especificamente, no exemplo mostrado na figura 1, o DNA genômico é fragmentado usando enzima de restrição A e enzima de restrição B nesta ordem; entretanto, enzima de restrição A e enzima de restrição B podem ser simultaneamente usadas em um mesmo sistema de reação para fragmentar DNA genômico. Alternativamente, enzima de restrição B e enzima de restrição A podem ser usadas nesta ordem para fragmentar DNA genômico. Além do mais, o número de enzimas de restrição a ser usado pode ser 3 ou mais.
Em seguida, fragmentos de DNA genômico tratados pela enzima de restrição são conectados a um adaptador (Etapa 1c). O adaptador aqui não é particularmente limitado desde que ele possa conectar para ambas as extremidades dos fragmentos de DNA genômico obtidos pelo tratamento de enzimas de restrição mencionadas acima. Como o adaptador, por exemplo, um tendo uma única cepa complementar à extremidade que se projeta (extremidade pegajosa) formada em ambas as extremidades dos fragmentos de DNA genômico, através do tratamento de enzima de restrição, e tendo uma sequência de ligação de iniciador à qual um iniciador a ser usado no tratamento de amplificação (especificamente descrito mais tarde) pode hibridar, pode ser usado. Além do mais, como o adaptador, um tendo uma única cepa complementar para a extremidade se projetando (extremidade pegajosa) e tendo um sítio de reconhecimento de enzima de restrição para uso em clonagem em um vetor.
Além do mais, na fragmentação do DNA genômico com mais de uma enzima de restrição, mais de um adaptador pode ser preparado para uso correspondendo às enzimas de restrição. Mais especificamente, na fragmentação do DNA genômico com mais de uma enzima de restrição, mais de uma extremidade se projetando é gerada. Para corresponder a mais de uma extremidade se projetando, mais de um adaptador tendo uma única cepa complementar da mesma pode ser usado. Neste momento, o mais de um adaptador correspondendo a mais de uma enzima de restrição pode ter uma sequência de iniciador comum de tal maneira que um iniciador comum pode hibridar, ou pode ter sequências de ligação de iniciador diferentes de tal maneira que iniciadores diferentes podem hibridar.
Além do mais, na fragmentação de DNA genômico com mais de uma enzima de restrição, um adaptador pode ser preparado para uso correspondendo a uma enzima de restrição selecionada de mais de uma enzima de restrição usada ou correspondendo a uma parte das enzimas de restrição usadas.
Em seguida, um fragmento de DNA genômico, tendo um adaptador adicionado a ambas as extremidades, é ampliado (Etapa 1d). Quando o adaptador tendo um sequência de ligação do iniciador é usado, o fragmento de DNA genômico pode ser ampliado através do uso de um iniciador capaz de hibridar com a sequência de ligação de iniciador. Alternativamente, o fragmento de DNA genômico tendo um adaptador adicionado para esse fim é clonado em um vetor através do uso da sequencia do adaptador. Neste caso, o fragmento de DNA genômico pode ser ampliado através do uso de um iniciador capaz de hibridar uma região pré-determinada do vetor. Note que, como uma reação de ampliação de um fragmento de DNA genômico, através do uso de um iniciador, por exemplo, PCR pode ser usado.
Além do mais, no caso em que o DNA genômico é fragmentado com mais de uma enzima de restrição e mais de um adaptador correspondendo às enzimas de restrição são conectados ao fragmento de DNA genômico, os adaptadores serão conectados a todos os fragmentos de DNA genômico obtidos pelo tratamento usando mais de uma enzima de restrição. Neste caso, todos os Fragmentos de DNA genômico obtidos podem ser ampliados através de uma reação de ampliação de ácido nucleico usando uma sequência de ligação de iniciador contida em cada uma dos adaptadores.
Alternativamente, na fragmentação do DNA genômico com mais de uma enzima de restrição e a conexão ao Fragmento de DNA genômico, um adaptador correspondendo a uma enzima de restrição selecionada de mais de uma enzima de restrição usada, ou correspondendo a uma parte das enzimas de restrição usadas, somente um fragmento de DNA genômico, dos fragmento de DNA genômico obtidos, tendo uma sequência de reconhecimento da enzima de restrição selecionada em ambas as extremidades pode ser ampliado.
Em seguida, o fragmento de DNA genômico ampliado é sequenciado (Etapa 1e), uma ou mais regiões tendo um comprimento de nucleotídeo mais curto do que os fragmentos de DNA genômico e cobrindo pelo menos uma parte dos fragmentos de DNA genômico são especificados; e uma sonda para a uma ou mais regiões especificadas é projetada para detectar o fragmento de DNA genômico ampliado de um organismo a ser testado (Etapa 1f). Um método para sequenciar um fragmento de DNA genômico não é particularmente limitado. Um método conhecido na técnica empregando o método de Sanger etc. e uma sequenciador de DNA pode ser usado.
Nas etapas (Etapas 1e e 1f), uma ou mais regiões tendo um comprimento de nucleotídeo mais curto do que os fragmentos de DNA genômico ampliados são projetadas como uma(s) sonda(s) para detectar o fragmento de DNA genômico. Aqui no presente, no caso em que mais de uma região de um fragmento de DNA genômico pré-determinado são usados para projetar, a detecção do fragmento de DNA genômico usando mais de uma sonda é previsto. Além do mais, uma única região pode ser selecionada de um fragmento de DNA genômico e projetada, enquanto que um número pré-determinado (duas ou mais) de regiões podem ser selecionadas de outro fragmento de DNA genômico e projetadas. Resumindo, o número de regiões a ser projetadas pode diferir de um fragmento de DNA genômico para outro. Como as regiões a serem projetadas aqui no presente, aquelas tendo, por exemplo, um comprimento de 20 a 10.000 nucleotídeos, preferivelmente, um comprimento de 100 a 8.000 nucleotídeos, e mais preferivelmente um comprimento de 200 a 6.000 nucleotídeos são usadas, como mencionado acima. Além do mais, no caso em que mais de uma região é projetada, as regiões adjacentes podem ser sobrepostas uma com a outra ou podem ter um intervalo de diversos nucleotídeos entre elas.
Particularmente, mais de uma região é preferivelmente estabelecida de maneira a cobrir a região inteira do fragmento de DNA genômico sequenciado. Neste caso, mais de uma sonda responde a um fragmento de DNA genômico obtido por um tratamento de enzima de restrição do DNA genômico derivado de um organismo pré-determinado para detectar o fragmento de DNA genômico por essas mais de uma sonda.
Neste meio tempo, o método para projetar uma sonda de acordo com a presente invenção não é limitado a um método incluindo uma etapa de fragmentação de DNA genômico com uma(s) enzima(s) de restrição como mencionado acima, e os dados genômicos de um organismo-alvo, como mostrado na figura 2 podem ser usados.
No método mostrado na figura 2, primeiro, dados da sequência de nucleotídeos no genoma derivado de um organismo alvo são obtidos (Etapa 2a). Os dados da sequência de nucleotídeos no genoma podem ser obtidos de vários tipos de bancos de dados conhecidos na técnica. A base de dados não está particularmente limitada; entretanto, a base de dados DDBJ provida pela Base de dados de DNA do Japão, base de dados EMBL provida pelo Instituto de Bioinformática da Europa, base de dados Genbank provida pelo Centro Nacional para Informações de Biotecnologia, a base de dados KEGG provida pela Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (Kioto Enciclopédia de Genes e Genomas) ou a base de dados integrada dessas bases de dados podem ser apropriadamente usadas.
Neste método, em seguida, os dados da sequência de nucleotídeos no DNA genômico obtido é pesquisado para a sequência de reconhecimento da(s) enzima(s) de restrição como mencionado acima (Etapa 2a). As sequências de nucleotídeos de fragmentos de DNA genômico que serão obtidas pelas fragmentações do DNA genômico mencionadas acima com a(s) enzima(s) de restrição são especificadas. A sequência de reconhecimento a ser pesquisado aqui no presente é uma enzima de restrição correspondente à(s) enzima(s) de restrição usadas no método mostrado na figura 1. Mais especificamente, nesta etapa, sequências de reconhecimento de uma ou mais enzimas de restrição são pesquisadas.
Em seguida, com base na sequência de nucleotídeos do fragmento de DNA genômico determinado, uma ou mais regiões cobrindo pelo menos uma parte do fragmento de DNA genômico são determinadas (Etapa 2b). Na etapa (Etapa 2b), uma ou mais regiões tendo um comprimento de nucleotídeo mais curto do que os fragmentos de DNA genômico sequenciados são projetadas como uma sonda para detectar o fragmento de DNA genômico. Aqui, se mais de uma região é projetada para um fragmento de DNA genômico pré-determinado, a detecção do fragmento de DNA genômico usando more de uma sonda é prevista. Além do mais, uma única região pode ser selecionada de um fragmento de DNA genômico e projetada, enquanto que um número pré-determinado (2 ou mais) de regiões pode ser selecionado de um outro fragmento de DNA genômico e projetado. Resumindo, o número de regiões a ser projetadas pode diferir de um fragmento de DNA genômico para outro. Como a região a ser projetada aqui, aquelas tendo, por exemplo, um comprimento de 20 a 100 nucleotídeos, preferivelmente um comprimento de 30 a 90 nucleotídeos, e mais preferivelmente um comprimento de 50 a 75 nucleotídeos são usadas, como mencionado.
Além do mais, mais de uma região é preferivelmente estabelecida de maneira a cobrir a região inteira do fragmento de DNA genômico sequenciado. Neste caso, mais de uma sonda responde aos fragmentos de DNA genômico obtidos por um tratamento de enzima de restrição de DNA genômico derivado de um organismo pré-determinado para detectar o frag- mento de DNA genômico por essas mais de uma sonda.
No meio tempo, o método para projetar uma sonda de acordo com a presente invenção pode ser um método não tendo uma etapa de sequenciamento nem uma etapa de obtenção de dados de sequência de nucleotídeos, usando um banco de dados e incluindo uma etapa de fragmentar o fragmento de DNA genômico com uma enzima de restrição ainda diferente, como mostrado na figura 3. Para descrever mais especificamente, no método mostrado na figura 3, primeiro, etapa 1a a etapa 1d do método mostrado na figura 1 são realizadas para ampliar um fragmento de DNA genômico tendo um adaptador acoplado à ambas as extremidades (Etapa 3a até 3d). Depois, o fragmento de DNA genômico ampliado é fragmentado com uma enzima de restrição (daqui em diante, enzima de restrição C) tendo a sequência de reconhecimento diferente das enzimas de restrição usadas na etapa 3b (Etapa 3e). Devido a esta etapa, o fragmento de PCR ampliado na etapa 3d é fragmentado em fragmentos ainda menores.
Desta maneira, mais de uma região cobrindo pelo menos uma parte dos fragmentos de DNA genômico obtidos pela fragmentação de DNA genômico com enzima de restrição A e enzima de restrição B podem ser especificadas por mais de um fragmento de DNA sem sequenciar. Como a região a ser especificada, aquelas tendo, por exemplo, um comprimento de 20 a 100 nucleotídeos, preferivelmente um comprimento de 30 a 90 nucleotídeos, e mais preferivelmente, um comprimento de 50 a 75 nucleotídeos são mencionadas, como mencionado acima. Em outras palavras, como a enzima de restrição C, uma capaz de dividir um fragmento de DNA genômico obtido pela fragmentação do DNA genômico com enzima de restrição A e enzima de restrição B em fragmentos de DNA tendo, por exemplo, um comprimento de 20 a 100 nucleotídeos, preferivelmente um comprimento de 30 a 90 nucleotídeos, e mais preferivelmente um comprimento de 50 a 75 nucleotídeos pode ser usada.
Em seguida, os fragmentos de DNA obtidos pela fragmentação com enzima de restrição C são separados do tipo para o tipo para obter sondas (Etapa 3f). Nesta etapa, os fragmentos de DNA obtidos pela fragmentação com enzima de restrição C podem ser separados por eletroforese, seguida por corte. Além do mais, o fragmento de DNA separado pode ainda ser clonado em um vetor e usado como uma sonda, ou depois da clonagem, pode ser ainda ampliado e usado como uma sonda. Também neste método, mais de uma sonda responde aos fragmentos de DNA genômico obtidos na etapa 3d do DNA genômico derivado de um organismo predeterminado.
O microarranjo de DNA tendo uma sonda projetada como mencionado acima pode ser preparado por um método conhecido na técnica. Por exemplo, um microarranjo de DNA tendo uma sonda projetada pelo método mostrado na figura 1 ou figura 2 pode ser preparado pela sintetização de um oligonucleotídeo tendo uma sequência de nucleotídeo desejada sobre um veículo com base na sequência de nucleotídeo de cada sonda projetada pelo método mostrado na figura 1 ou figura 2. Aqui a seguir, o método para a sintetização de um oligonucleotídeo não é particularmente limitado e um método conhecido na técnica pode ser aplicado. Por exemplo, um método de sintetização de um oligonucleotídeo sobre um veículo por uma tecnologia fotolitográfica em combinação com uma técnica de quimiossíntese de irradiação de luz pode ser aplicado. Como um outro método que pode ser aplicado, um oligonucleotídeo tendo uma molécula ligante, que tem uma alta afinidade por uma superfície do veículo, em uma extremidade pode ser separadamente sintetizado com base nos dados da sequência de nucleotídeo de cada sonda projetada pelo método mostrado na figura 1 ou figura 2, e depois disso imobilizado em uma posição predeterminada sobre uma superfície do veículo.
Além disso, a sonda projetada e preparada pelo método mostrado na figura 3 é imobilizada em um veículo para preparar um microarranjo de DNA tendo uma sonda projetada pelo método mostrado na figura 3. Neste caso, por exemplo, a sonda projetada pelo método mostrado na figura 3 é marcada em um veículo por um arranjo do tipo pino (pin type arrayer) e um arranjo do tipo bocal (nozzle type arrayer) para preparar um microarranjo de DNA.
O microarranjo de DNA preparado como descrito acima tem uma ou mais sondas tendo um comprimento de nucleotídeo mais curto do que o fragmento de DNA genômico, que é obtido por um tratamento de DNA genômico com enzima de restrição derivada de um organismo predeterminado. Mais especificamente, o microarranjo de DNA preparado como descrito acima é usado na detecção de um fragmento de DNA genômico predeterminado por uma ou mais sondas tendo um comprimento de nucleotídeo mais curto do que o fragmento de DNA genômico. Particularmente, o microarranjo de DNA preferivelmente tem mais do que uma sonda para um fragmento de DNA genômico predeterminado para detector o fragmento de DNA genômico por mais do que uma sonda.
Nota-se que, como o microarranjo de DNA, qualquer tipo de microarranjo pode ser usado tal como um microarranjo usando um substrato de superfície plana formado de, por exemplo, vidro ou silicone como um veículo, um arranjo de contas usando microcontas como um veículo ou um microarranjo tridimensional tendo uma sonda imobilizada sobre a superfície interna de uma fibra oca.
Uma mutação presente no DNA genômico pode ser detectada pelo uso do microarranjo de DNA preparado como descrito acima. A mutação aqui a seguir se refere a um polimorfismo tal como um polimorfismo único presente entre os organismos homogêneos, uma variação de uma sequência de nucleotídeo presente entre espécies relacionadas ou uma mutação introduzida artificialmente em um organismo predeterminado.
Mais especificamente, primeiro um DNA genômico é extraído de um organismo a ser testado, como mostrado na figura 4. O organismo a ser testado aqui a seguir é um organismo a ser comparado ao organismo usado na preparação do microarranjo de DNA. A seguir, o DNA genômico extraído é digerido com a enzima de restrição usada na preparação do microarranjo de DNA para preparar mais do que um fragmento de DNA genômico. Subsequentemente, os fragmentos de DNA genômicos obtidos são conectados ao adaptador usado na preparação do microarranjo de DNA. A seguir, o fragmento de DNA genômico tendo um adaptador ligado a ambas as extremidades é amplificado pelo uso de um iniciador usado na preparação do microarranjo de DNA. Dessa maneira, o DNA genômico derivado de um organismo a ser testado, que corresponde ao fragmento de DNA genômico amplificado na etapa 1d para a preparação do microarranjo de DNA, o fragmento de DNA genômico cuja sequência de nucleotídeo é especificada na etapa 2a, e o fragmento de DNA genômico amplificado na etapa 3d, pode ser amplificado.
Nesta etapa, dos fragmentos de DNA genômicos tendo um adaptador adicionado aos mesmos, um fragmento de DNA genômico predeterminado pode ser seletivamente amplificado. Por exemplo, no caso onde ,mais do que um adaptador é usado de modo a corresponder a mais do que uma enzima de restrição, o fragmento de DNA genômico tendo um adaptador específico adicionado ao mesmo pode ser seletivamente amplificado. Além disso, dos fragmentos de DNA genômicos obtidos pela digestão do DNA genômico com mais do que uma enzima de restrição, apenas a um fragmento de DNA genômico tendo uma extremidade saliente correspondendo a uma enzima de restrição predeterminada, um adaptador é adicionado. Desta maneira, um fragmento de DNA genômico tendo o adaptador adicionado ao mesmo pode ser seletivamente amplificado. Da mesma forma, um fragmento de DNA genômico predeterminado pode ser concentrado ao amplificá-lo seletivamente.
A seguir, um marcador é adicionado ao fragmento de DNA genômico amplificado. Como um marcador, qualquer substância pode ser usada desde que seja conhecido na técnica. Como o marcador, por exemplo, uma molécula fluorescente, uma molécula de pigmento e uma molécula radioativa podem ser usadas. Note que esta etapa pode ser omitida pela realização da etapa de amplificação de um fragmento de DNA genômico pelo uso de nucleotídeos tendo um marcador. Isto é porque um fragmento de DNA amplificado é marcado pela amplificação do fragmento de DNA genômico pelo uso de um nucleotídeo tendo um marcador na etapa acima.
A seguir, o fragmento de DNA genômico tendo um marcador é colocado em contato com um microarranjo de DNA sob condições predeterminadas para hibridar a sonda imobilizada para o microarranjo de DNA com o fragmento de DNA genômico tendo um marcador. Neste momento, a sonda hibridiza parcialmente com o fragmento de DNA genômico sob condições altamente estringentes sob as quais a sonda não hibridiza se uma incompatibilidade de nucleotídeo único estiver presente, mas apenas hibridiza se os nucleotídeos forem totalmente compatíveis uns com os outros. Sob tais condições altamente estringentes assim pregadas, uma pequena mutação tal como um único polimorfismo pode ser detectado.
Nota-se que as condições estringentes podem ser controladas por uma temperatura de reação e uma concentração de sal. Mais especificamente, condições estringentes ainda mais altas podem ser obtidas pelo aumento da temperatura e condições estringentes ainda mais altas podem ser obtidas pela redução de uma concentração de sal. Por exemplo, quando uma sonda tendo um comprimento de nucleotídeo de 50 to 75 é usada, condições estringentes ainda mais altas são preparadas se as condições de 40 a 44°C, 0,21 SDS, 6 x SSC forem empregadas.
Além disso, a hibridação entre a sonda e o fragmento de DNA genômico tendo um marcador pode ser detectada com base no marcador. Mais especificamente após uma reação de hibridação entre o fragmento de DNA genômico mencionado acima tendo um marcador e uma sonda, fragmentos de DNA genômicos não reagidos etc. foram lavados. Depois disso, o marcador do fragmento de DNA genômico especificamente hibridizado com a sonda é observado. Por exemplo, no caso onde o marcador é uma substância fluorescente, o comprimento de onda fluorescente é detectado. No caso onde o marcador é uma molécula de pigmento, o comprimento de onda do pigmento é detectado. Mais especificamente, um aparelho de detecção fluorescente e um analisador de imagem, etc., geralmente usado para a análise do microarranjo de DNA, podem ser usados.
Particularmente, se o microarranjo de DNA mencionado acima for usado, o fragmento de DNA genômico derivado de um organismo a ser testado é detectado por uma ou mais sondas tendo um comprimento de nucleotídeo mais curto do que os fragmentos de DNA genômicos. Em um método de DArT convencional (figura 9), visto que um fragmento de DNA genômico derivado de um organismo predeterminado é amplificado por PCR e usado como uma sonda, mesmo se um fragmento de DNA genômico derivado de um organismo a ser testado tendo uma incompatibilidade de várias dezenas de nucleotídeos, a sonda frequentemente hibridizada com eles (reação pseudopositiva). No entanto, no microarranjo de DNA mencionado acima, visto que a detecção foi feita pelo uso de uma ou mais sondas tendo um comprimento de nucleotídeo mais curto do que os fragmentos de DNA genômicos, um episódio provavelmente de tal reação pseudopositiva pode ser reduzido, com o resultado de que um fragmento de DNA genômico derivado de um organismo a ser testado pode ser detectado de forma altamente precisa. Particularmente, quando um fragmento de DNA genômico derivado de um organismo a ser testado é detectado por mais do que uma sonda, uma pequena mutação contida em um fragmento de DNA genômico derivado de um organismo a ser testado pode ser detectada pela detecção da presença ou ausência de hibridação em mais do que uma sonda.
Além disso, no microarranjo de DNA mencionado acima, uma mutação desconhecida pode ser detectada. Em um microarranjo de DNA convencional usando um oligonucleotídeo sintetizado em um veículo como uma sonda para detecção da mutação, um alvo de detecção é apenas uma mutação conhecida tendo dados de sequência conhecidos. No entanto, de acordo com o método mencionado acima para a detecção de uma sonda, mesmo se um fragmento de DNA genômico contiver uma mutação cuja sequência ainda não foi encontrada, tal mutação desconhecida pode ser um alvo de detecção. Em outras palavras, uma mutação desconhecida pode ser encontrada pelo uso do microarranjo de DNA tendo a sonda mencionada acima.
Como descrito anteriormente, de acordo com o microarranjo de DNA da presente invenção, visto que uma mutação contida no DNA genômico de um organismo a ser testado pode ser detectada em comparação com aquela de um organismo predeterminado usado na preparação do microarranjo de DNA, por exemplo, a diversidade em organismos homogêneos pode ser analisada em um nível de gene. Além disso, se um microarranjo de DNA de acordo com a presente invenção for preparado com relação a vários tipos de variantes contidos no organismo homogêneo, a cuja variante um organismo a ser testado pertence pode ser analisado em um nível de gene.
Agora, a presente invenção será mais especificamente descrita por meio de exemplos. A faixa técnica da presente invenção não é limitada pelos exemplos a seguir.
Neste Exemplo, foi mostrado que uma mutação presente em um alelo de cada uma dentre as variedades de cana-de-açúcar NiF8 e Ni9 pode ser detectada ao projetar uma sonda de acordo com o procedimento mostrado na figura 1 sem usar os dados de sequência totais ou os dados de mutação. (1) Material As variedades de cana-de-açúcar NiF8 e Ni9 foram usadas. (2) Tratamento com a enzima de restrição O DNA genômico foi extraído separadamente das variedades de cana-de-açúcar NiF8 e Ni9 de acordo com um método costumeiro. O DNA aròfcfe genômico (750 ng) foi tratado com a enzima de restrição Pstl (NEB Inc. 25 unidade) a 37°C por 2 horas, seguido da enzima de restrição BstNI (NEB Inc., 25 unidades) a 60°C por 2 horas. (3) Ligação do adaptador Ao fragmento de DNA genômico (120 ng) tratado na etapa (2), adaptadores de sequência Pstl (5'-CACGATGGATCCAGTGCA-3' (SEQ ID NO: 1), 5'-CTGGATCCATCGTGCA-3' (SEQ ID NO: 2)) e T4 DNA Ligase (NEB Inc., 800 unidades) foram adicionados e um tratamento foi realizado a 16°C, toda noite e todo dia. Desta maneira, o adaptador foi adicionado seletivamente ao fragmento de DNA genômico tendo uma sequência de reconhecimento de Pstl em ambas as extremidades, dentre aquelas tratadas na etapa (2). (4) Amplificação de PCR Aos fragmentos de DNA genômicos (15 ng) tendo um adaptador obtido na etapa (3), um iniciador de reconhecimento do adaptador de sequência de Pstl (5'-GATGGATCCAGTGCAG-3' (SEQ ID NO: 3)) e Taq polimerase (companhia TAKALA, PrimeSTAR, 1,25 unidades) foram adicionados e fragmentos de DNA genômicos foram amplificados por PCR (um ciclo consistindo em 10 segundos a 98°C, 15 segundos a 55°C, e 1 minuto a 72°C foi repetido 30 vezes e a amostra de PCR foi tratada a 72°C por 3 minutos e armazenada a 4°C). (5) Aquisição da sequência genômica O fragmento de DNA genômico amplificado por PCR na etapa (4) foi analisado pelo método Sanger para sequenciamento. Como um resultado, 2 tipos de dados da sequência genômica (A_1 (SEQ ID NO: 4) e B_1 (SEQ ID NO: 5)) derivada de NiF8 foram obtidos. Além disso, dados da sequência genômica (A_2 (SEQ ID NO: 6) e B_2 (SEQ ID NO: 7)) da região de locusdo alelo Ni9 foram obtidos pelo uso dos dados da sequência da sequência genômica A_1 e B_1. Com base nos dados da sequência genômica (A_1, B_1) da etapa (5), 5 e 6 sondas de 50 a 70 bp foram separadamente projetadas. Mais especificamente, neste exemplo, uma sonda da variedade de cana-deaçúcar NiF8 foi projetada. Alinhamentos A_1 e A_2 e a posição da sonda projetada são mostrados na figura 5. Além disso, os alinhamentos B_1 e B__2 e a posição da sonda projetada são mostrados na figura 6. (7) Preparação do arranjo Com base nos dados da sequência de nucleotídeo das sondas projetadas, os microarranjos de DNA tendo estas sondas foram preparados (terceirizado para Roche). (8) Preparação da Amostra Fragmentos de variedades de cana-de-açúcar NiF8 e Ni9 foram separadamente amplificados por PCR de acordo com os métodos mencionados acima (2) a (4). Fragmentos de PCR amplificados foram purificados por uma coluna (companhia, Qiagen), e depois disso, 9mers marcados por Cy3 (TriLink Inc., 1O.D.) foram adicionados. A mistura foi tratada a 98°C por 10 minutos e deixada descansar em gelo por 10 minutos. Depois disso, Klenow (NEB Inc., 100 unidades) foi adicionado. A mistura foi tratada a 37°C por 2 horas e a seguir precipitada com etanol para preparar uma amostra marcada. (9) Detecção do sinal de hibridação Hibridação foi realizada usando o microarranjo de DNA preparado na etapa (7) e usando a amostra marcada da etapa (8) de acordo com o Guia do usuário de NimbleGen Array para detectar um sinal derivado do marcador. (10) Cálculo da taxa de mutação A taxa de mutação foi calculada com base na homologia da sequência de genoma das regiões de locidos alelos NiF8 e Ni9 dentro das respectivas sondas. (11) Cálculo da proporção da intensidade do sinal A proporção da intensidade do sinal é obtida pela divisão da intensidade do sinal de arranjo usando NiF8 como uma amostra pela intensidade do sinal do arranjo usando Ni9 como uma amostra. (12) Resultados e Discussão
Os resultados de medição da intensidade do sinal e a proporção da intensidade do sinal calculados a partir dos resultados são mostrados na 5 Tabela 1 e Tabela 2.
A partir da figura 5, foi verificado que uma inserção úni-ca/mutação por deleção de 101 bp e três mutações de 1 a várias bases de 10 mutação estão presentes entre A_1 e A_2. A partir da tabela 1, foi verificado que em uma sonda (PA_3 e PA_5, taxa de mutação 0%) tendo na mutação entre NiF8 e Ni9, alta intensidade do sinal foi detectada em cada um dentre NiF8 e Ni9. Isto significa que as sequências A_1 e A_2 que correspondem aos dados da sequência estão presentes respectivamente nas amostras de 15 NiF8 e Ni9. Além disso, visto que a proporção da intensidade do sinal de ambas as amostras é tão baixa quanto 1.1 a 1.4, a proporção da intensidade do sinal de uma sonda tendo nenhuma mutação era baixa.
Por outro lado, a medida que uma taxa de mutação aumenta, a proporção da intensidade do sinal de ambas as amostras aumenta (1.9 (PA_4) a 10.2 (PA_1)). Isto é porque a sequência A_2 está presente na amostra Ni9, mas uma mutação está presente na sequência A_2, a qual corresponde a sondas PA_1, PA_2, e PA_4, com o resultado que a resistência à hibridação diminui e o sinal de Ni9 diminui.
Similarmente, a partir da figura 6, é verificado que três mutações de inserção / deleção e 14 SNPs estão presentes entre B_1 e B_2. Também com relação a B_1 e B_2, uma proporção da intensidade do sinal aumenta à medida que a taxa de mutação aumenta (1.1 (PB_6) a 12.5 (PB_2)) como é aparente a partir da tabela 2.
A partir dos resultados acima, foi demonstrado que a mutação do DNA de um nível de vários bp pode ser detectada e o local de uma mutação de várias dezenas de nucleotídeos pode ser especificado usando uma sonda tendo um comprimento de nucleotídeo mais curto do que um fragmento de DNA genômico servindo como uma amostra.
Neste exemplo, na sonda derivada de NiF8 preparada no exemplo 1, uma mutação foi artificialmente introduzida. Com base na taxa de introdução da mutação e na proporção da intensidade do sinal da mesma em relação à sonda original, a capacidade de detecção da mutação foi avaliada. (1) Material A variedade da cana-de-açúcar NiF8 foi usada. (2) Aquisição dos dados da sequência básicos da sonda A amplificação do fragmento de PCR de NiF8 foi preparada de acordo com as etapas (2) a (4) do exemplo 1 e da sequência genômica foi determinada pelo método de Sanger. Com base nos dados da sequência genômica independentes, 6 sondas básicas tendo 50 a 75 bp foram preparadas (Tabela 3).
(3) Preparação da sonda de mutação Sondas foram preparadas ao inserir, deletar e substituir separa-damente com 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20 e 25 nucleotídeos dentro, a partir de e para as sondas básicas da etapa (2). (4) Detecção do sinal por preparação, marcação, hibrídação do arranjo Um microarranjo de DNA foi preparado da mesma maneira que nas etapas (7) a (9) do exemplo 1. Uma amostra foi preparada e uma reação de hibridação e a detecção do sinal seguinte foram realizadas. (5) Cálculo da proporção da intensidade do sinal O valor da proporção da intensidade do sinal foi obtido dividindo a intensidade do sinal de uma sonda de mutação pela intensidade do sinal da sonda básica. Um gráfico e uma curva de aproximação foram preparados por Excel 2007. (6) Resultados e Discussão
A relação entre a taxa de mutação introduzida dentro de uma sonda e a intensidade do sinal detectada é mostrada na figura 7. Como mostrado na figura 7, a taxa de mutação de uma sonda e a proporção da intensidade do sinal são altamente correlacionadas (y = 0,0804x 0,518, R2 = 0,8068). A partir da correlação, foi verificado que uma proporção da intensidade do sinal tende a reduzir a 50% ou menos em uma taxa de mutação de 3% ou mais. Mesmo se existir uma mutação de 1 bp, a proporção da intensidade do sinal diminui até menos do que 50% dependendo da sonda. A partir dos resultados acima, foi demonstrado que a mutação de um único a vários nucleotídeos ou mais pode ser detectada de maneira altamente precisa por uma sonda tendo um comprimento de nucleotídeo mais curto do que o fragmento de DNA genômico.
Neste exemplo, usando dados da sequência genômica das variedades de cana-de-açúcar NiF8 e Ni9 (5,848 nucleotídeos), 5 a 15 sondas consistindo em várias dezenas de bps foram preparadas para cada dado de sequência genômica e detecção de uma mutação entre ambas as amostras foi realizada. (1) Material Variedades de cana-de-açúcar NiF8 e Ni9 foram usadas. (2) Aquisição de dados da sequência genômica Fragmentos de NiF8 e Ni9 foram amplificados por PCR de acordo com as etapas (2) a (4) de exemplo 1 e analisados pelo método de Sanger para obter os dados da sequência genômica. Mais especificamente, dados da sequência genômica de 5.848 fragmentos de amplificação de PCR foram obtidos. (3) Preparação de sonda Cinco a quinze sondas cada uma tendo 50 a 75 bp foram projetadas com base nos dados da sequência genômica obtidos na etapa (2). Mais especificamente, com base nos dados da sequência genômica (dados 5.848), sondas 59.462 foram projetadas. (4) Detecção do sinal por preparação, marcação, hibridação Um microarranjo de DNA foi preparado de acordo com as etapas (7) a (9) do exemplo 1. Uma amostra foi preparada e uma reação de hibridação e a detecção de sinal seguinte foram realizadas. (5) Detecção da sonda de local da mutação
Quando a proporção da intensidade do sinal de um arranjo usando Ni9 como uma amostra a um arranjo usando NiF8 como uma amostra é duas vezes ou mais ou 1/2 ou menos, a sonda foi determinada como uma sonda de local de mutação.
Um valor obtido pela divisão do número de sondas de local da mutação por dado de sequência pelo número de sondas preparadas por dado de sequência foi usado. (7) Resultados e discussão 59.462 sondas foram projetadas de 5.848 dados da sequência genômica. Dentre eles, o número de sondas no caso onde a proporção da intensidade do sinal era além de 2 foi 5.596. Dados da sequência tendo pelo menos uma tal sonda foram 1.497. Destes dados da sequência, o número de dados que provê uma proporção da intensidade do sinal de 2 ou mais em todas as sondas foi 189, o que era 12,6% do total (figura 8). Foi considerado que a mutação dentro dos dados da sequência é causada por uma ampla inserção / deleção de vários kbp dentro de uma sequência de reconhecimento da enzima de restrição. Por outro lado, os dados da sequência nos quais uma mutação foi detectada em uma parte de sondas foram de 87,4% de todos os dados. Isto é devido a uma capacidade de detectar uma mutação ser melhorada ao projetar mais do que uma sonda de várias dezenas de bps no interior. A partir dos resultados, em todas as sondas, os dados da sequência nos quais uma mutação deste momento foi detectada são de 7,9 vezes tão grandes quanto os dados da sequência que proveem uma proporção da intensidade do sinal de 2 vezes ou mais. Assim, foi claramente demonstrado que a capacidade de detectar uma mutação melhora ao projetar mais do que uma sonda tendo várias dezenas de bps, a qual é mais curta do que um fragmento de DNA genômico servindo como uma amostra.
Neste exemplo, para validar a disponibilidade de um microarranjo de DNA tendo uma sonda projetada com base nos dados da sequência conhecidos de outro organismo, um microarranjo de DNA tendo uma sonda projetada com base nos dados da sequência totais de sorgo foi preparado e uma mutação de DNA genômico de cana-de-açúcar foi detectada. (1) Material Variedades de cana-de-açúcar NiF8 e Ni9 foram usadas. (2) Aquisição de dados da sequência genômica de sorgo de genoma DB A partir do sorgo dados da sequência genômica totais de genoma DB (Grameno: http://www.gramene.org/), dados da sequência entre sequência de reconhecimento de Pstls foram obtidos. (3) Preparação de sonda Com base nos dados da sequência da etapa (2), uma sonda tendo 50 a 75 bp foi projetada. (4) Detecção do sinal por preparação, marcação, hibridação do arranjo Um microarranjo de DNA foi preparado de acordo com as etapas (7) a (9) do exemplo 1. Uma amostra foi preparada e uma reação de hibridação e a detecção de sinal seguinte foram realizadas. (5) Cálculo do número de sondas de local da mutação Quando uma proporção da intensidade do sinal de um arranjo usando Ni9 como uma amostra a um arranjo usando NiF8 como uma amostra é duas vezes ou mais ou 1/2 ou menos, a sonda foi determinada como uma sonda de local da mutação. (6) Resultados e discussão
Neste exemplo, 1,744,104 sondas foram projetadas com base nos dados da sequência genômica de sorgo, como mostrado na Tabela 4.
Dentre eles, o número de dados da sequência tendo uma sonda que provê uma intensidade do sinal de 1.000 ou mais foi de 95.420. A proporção deste número de dados da sequência usada foi de 4,2% a 7.0% por cromossoma de sorgo. No total, foi de 5,5%. A partir destes resultados, foi considerado que uma região homóloga a estas sequências de sonda está presente cada uma em cana-de-açúcar NiF8 e Ni9. Além disso, destas sondas, o número de sondas no caso onde uma proporção da intensidade do sinal era além de 2, em NiF8 e Ni9, foi de 25,747. Foi 1.2% a 1.8% por cromossoma das sondas de teste. No total, foi 1.5%. Na região de uma sonda que provê uma proporção da intensidade do sinal que excede 2, é considerado que uma mutação está presente entre NIF8 e Ni9. A partir destes resultados anteriormente, é claramente demonstrado que ao projetar uma sonda pelo uso de informações de genoma outro organismo pode ser usado para analisar a mutação de gene em um organismo predeterminado.
Todas as publicações e pedidos de patente citados no relatório descritivo são incorporados por referência em sua totalidade.
Claims (5)
1. Método para detectar uma mutação usando um microarranjo de DNA apresentando uma pluralidade de sondas de polinucleotídeo imobilizadas no mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: extração de um DNA genômico derivado de um organismo a ser testado; digestão do DNA genômico com uma enzima de restrição apresentando a mesma sequência de reconhecimento que a enzima de restrição usada para projetar as sondas imobilizadas no microarranjo de DNA; conexão de um adaptador aos fragmentos de DNA genômicos obtidos pelo tratamento com a enzima de restrição; amplificação dos fragmentos de DNA genômicos usando um iniciador capaz de hibridizar ao adaptador; e detecção de um híbrido do fragmento de DNA genômico contendo a mutação com a sonda capaz de detectar a mutação, ao colocar em contato o fragmento de DNA genômico amplificado com o microarranjo de DNA; em que o referido microarranjo de DNA compreende uma pluralidade de sondas e um carreador no qual as sondas são imobilizadas, em que a referida pluralidade de sondas é capaz de detectar uma mutação contida em um fragmento de DNA genômico obtido pela referida digestão, em que a pluralidade de sondas de polinucleotídeo compreende sondas cobrindo diferentes porções do fragmento de DNA genômico, em que a pluralidade de sondas de polinucleotídeo cobre toda a região do fragmento de DNA genômico, e em que as sondas na referida pluralidade de sondas de polinucleotídeo são menores em comprimento do que o fragmento de DNA genômico.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que, na etapa de digestão do DNA genômico, o DNA genômico é digerido com uma pluralidade de enzimas de restrição.
3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que, na etapa de conexão, um adaptador é conectado que corresponde a uma enzima de restrição a partir da referida pluralidade de enzimas de restrição, ou que corresponde a várias das enzimas de restrição na referida pluralidade de enzimas de restrição.
4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o adaptador apresenta uma sequência complementar a uma extremidade protuberante dos fragmentos de DNA genômicos obtidos na etapa de digestão do DNA genômico com uma enzima de restrição.
5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o organismo a ser testado é diferente do organismo usado na preparação do microarranjo de DNA.
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