CN101550434B - 一种条斑紫菜微卫星标记的筛选方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子生物学DNA标记技术与应用领域，具体涉及一种条斑紫菜微卫星标记的筛选方法，及利用这些标记进行种质资源遗传多样性分析的方法，从而为条斑紫菜的遗传结构分析、种质资源保护及分子标记辅助育种奠定基础。

Description

一种条斑紫菜微卫星标记的筛选方法及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学DNA标记技术与应用领域，具体涉及海洋经济藻类条斑紫菜(Porphyra yezoensis)微卫星标记的筛选方法和应用。

背景技术

条斑紫菜属于红藻门(Rphdophyta)原红藻纲(Protoflorideophyceae)红毛菜目(Bangiales)红毛菜科(Bangiaceae)紫菜属(Porphyra)，是我国紫菜主要养殖品种之一，主要分布北方沿海，具有极高的营养价值和经济价值。目前紫菜育种技术采用的仍然是传统的选择育种、诱变育种等方法，使得紫菜养殖品种的遗传基础日益狭隘，加之水环境的不断恶化，导致紫菜养殖过程中产量、品质、耐高温性、抗病性均下降，限制了我国紫菜养殖业的发展。因此加强对紫菜野生群体和栽培群体中遗传结构的研究对于了解紫菜种质的遗传多样性、监测育种过程中的遗传变异具有重要意义。同时，一个物种遗传结构的多样性也是遗传育种的基础，因此遗传结构分析将为保护和管理紫菜种质资源及遗传育种奠定基础。微卫星序列(microsatellitesequences)，又称简单重复序列(simple sequence repeats，SSRs)，是指基因组中由2～6个核苷酸基本单位重复多次构成的一段DNA序列。微卫星标记具有共显性、可靠性、高信息量和高多态性，广泛分布于基因组不同位置等特点，成为第二代分子标记，在遗传多样性分析、遗传连锁图谱的构建及分子标记辅助育种被广泛应用。近些年来海水养殖业的迅速发展，分子标记辅助育种技术在海洋经济物种也相继使用，但在紫菜养殖和育种中却很少应用。因此开发大量的紫菜微卫星标记对于研究紫菜种质资源的遗传结构及加强分子标记辅助育种具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种条斑紫菜微卫星标记的筛选方法，及利用这些标记进行种质资源遗传多样性分析的方法，从而为条斑紫菜的遗传结构分析、种质资源保护及分子标记辅助育种奠定基础。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术方案：

采取常规方法提取条斑紫菜丝状体基因组DNA，利用限制性内切酶Hae III和Afa I对基因组DNA进行酶切，电泳检测回收500-1500bp大小的片段。将所述的片段与5’端磷酸化的接头(接头序列为第一链5’TAGTCCGAATTCAAGCAAGAGCACA3’；第二链5’CTCTTGCTTGAATTCGGACTA3’)连接，以上述连接产物为模板，以接头中的短链(序列为5’CTCTTGCTTGAATTCGGACTA3’)为引物，利用PCR方法进行富集。

利用生物素标记的(GA)₁₅为探针与上述PCR富集产物进行杂交，在离心管内用平衡过的Streptavidin Magnesphere磁珠对上述杂交混合物进行吸附，吸附后将离心管置于磁力架上，去除杂交液，对磁珠进行洗涤，洗脱未结合到磁珠上的DNA片段。洗涤包括松弛性洗涤和严谨性洗涤。将松弛性和严谨性洗涤后的磁珠悬浮于TE溶液中，于94-96℃变性，使含有微卫星序列的DNA片段脱离磁珠，迅速收集上清，离心得到含有微卫星序列的DNA片段。以离心得到的DNA片段为模板，以上述接头中的短链为引物，通过PCR方法进行富集，构建含有微卫星序列的富集文库。

以含有15次GA重复的寡核苷酸序列为探针，采用菌落原位杂交的方法筛选阳性克隆。将菌落原位杂交获得的阳性克隆进行测序，筛选微卫星序列，原则为两碱基重复7次以上，三碱基重复5次以上，四碱基重复4次以上，或者五碱基、六碱基重复3次以上。对含有重复单元的序列进行分析，设计引物序列，获得微卫星标记。

利用上述获得的微卫星标记，对群体内个体间进行遗传多样性的分析。

有益效果：

1.本发明利用磁珠吸附法构建微卫星富集文库、采用菌落原位杂交筛选含有微卫星序列的阳性克隆，通过两种杂交方法增加了阳性克隆的得率，提高了微卫星序列获得的可靠性。

2.本发明所得到的条斑紫菜微卫星序列来自于基因组DNA，含有的微卫星序列丰富，一次实验可以得到丰富的标记，将为条斑紫菜种质资源鉴定和遗传多样性分析提供大量的候选标记。

3.利用微卫星标记进行条斑紫菜的遗传多样性分析，方法简单、稳定性高、重复性强，具有广泛的应用空间。

附图说明

图1：引物PYM2在同一群体个体间的扩增情况(每个群体20个个体)；

图2：引物PYM6在同一群体个体间的扩增情况(每个群体20个个体)；

SEQ ID NO：1为P1

SEQ ID NO：2为P2

SEQ ID NO：3为P3

SEQ ID NO：4为P4

SEQ ID NO：5为P5

SEQ ID NO：6为P6

SEQ ID NO：7为P7

SEQ ID NO：8为P8

SEQ ID NO：9为P9

SEQ ID NO：10为P10

具体实施方式

1利用磁珠吸附法构建微卫星富集文库

采取常规方法提取条斑紫菜丝状体基因组DNA，取10μg，利用限制性内切酶Hae III和Afa I对基因组DNA进行酶切，在温度37℃条件下酶切12小时，电泳检测回收500-1500bp大小的片段。加上接头进行连接，条件为50ng 5’端磷酸化的接头(接头序列为第一链5’TAGTCCGAATTCAAGCAAGAGCACA3’；第二链5’CTCTTGCTTGAATTCGGACTA3’)、1μg酶切片段、20U T₄ligase(New England BioLab，Inc.)、2μl ligase buffer(New England BioLab，Inc.)，16℃连接14小时。以上述连接产物为模板，以接头中的短链(序列为5’CTCTTGCTTGAATTCGGACTA3’)为引物，利用PCR方法进行富集，PCR反应体系为20μl，10mM Tris-HCl，50mM KCl，2.0mM Mg²⁺，0.15mM dNTP，15ng引物，1U Taq DNA聚合酶。反应程序为94℃预变性1min，后94℃40s，55℃45s，72℃45s，25个循环，最后72℃延伸5min。将全部PCR产物加入2倍体积无水乙醇沉淀富集，溶于20μl无菌水中。

利用生物素标记的(GA)₁₅为探针(生物素标记的含有15次GA重复的寡核苷酸，购自上海博尚生物公司)与上述PCR富集产物进行杂交，100μl杂交体系含有1μg PCR产物，50pmol(GA)₁₅探针，21μl 20x SSC(在800ml水中溶解175.3g NaCl和88.2g柠檬酸钠，调节pH值为7.0，加水定容至1L，高压灭菌)，0.7μl 10％(W/V)SDS(900ml水中溶解100gSDS，调节pH值为7.2，定容至1L)；杂交条件为95℃5min后，降至58℃15min。利用Streptavidin Magnesphere磁珠(购自Promega公司，Z5481/2)进行微卫星序列的吸附，在吸附前首先按下述方法对磁珠进行平衡，200μg磁珠用1ml TEN100溶液(含100mM Tris-Cl，1mM EDTA和100mM NaCl，pH值为7.5)洗涤三次，后悬浮于40μl TEN100中，并加入100ng鱼DNA。将平衡过的40μl磁珠对上述100μl杂交混合物于离心管内进行吸附，并加入300μl TEN100，室温下温育30分钟。温育结束后，将离心管置于磁力架(购自Promega公司，Z5331)上，去除杂交液，对磁珠进行洗涤，洗脱未结合到磁珠上的DNA片段。洗涤包含松弛性洗涤和严谨性洗涤，先松弛性洗涤再严谨性洗涤，松弛性洗涤利用400μl TEN100室温下洗涤3次，每次5分钟；严谨性洗涤利用400μl洗脱液(含0.2×SSC和0.1％SDS)室温下洗涤3次，每次5分钟。将松弛性和严谨性洗涤后的磁珠悬浮于50μl TE溶液(含10mM Tris-Cl和1mM EDTA，pH8.0)中，于95℃变性5min，使含有微卫星序列的DNA片段脱离磁珠，迅速收集上清；加入0.15M NaOH 12μl，20-30min后取上清，加入1.8μl 1M HCl，最后加入TE溶液至终体积50μl。将50μl产物中加2μl DNAmate(购自Takara公司，D605A)、50μl 4M NH₄AC、100μl异丙醇，-20℃放置过夜，离心得到含有微卫星序列的DNA片段。以离心得到的DNA片段为模板，通过PCR方法进行富集，扩增体系为25μl，10mM Tris-HCl，50mM KCl，2.0mM Mg²⁺，0.2mM dNTP，15ng接头引物(序列为5’CTCTTGCTTGAATTCGGACTA3’)，1U Taq DNA聚合酶。反应程序为94℃30s，55℃30s，72℃45s，25个循环，最后72℃延伸30min.

以pMD18-T克隆载体试剂盒(购自Takara公司，D101C)为载体构建含有微卫星序列的富集文库，连接体系为1μl PCR产物、1μl pMD18-T载体、5μl连接液(试剂盒自带)、3μl H₂O，16℃连接过夜。将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态，37℃培养得到含有微卫星序列的富集文库。

2菌落原位杂交法筛选含有微卫星序列阳性的克隆

采用菌落原位杂交的方法筛选阳性克隆。具体如下：

菌落转膜：将上述转化后的菌落重新点阵排列于新的LB平板上，接种密度为300个克隆/平板。将NC膜(Hybond-N，Amersham Pharmacia Biotech)剪成略小于平板内径的圆形，将其覆盖在长有菌落的平板上，每个平板影印一张杂交膜，等膜完全湿润后，将膜取出，空气中干燥10min备用。将平板放入37℃继续培养至重新长出菌落。将干燥好的膜用裂解液(含1.5MNaCl和0.5MNaOH)裂解7min，室温干燥10min后，用中和液(含1.5M NaCl，0.5MTris/HCl和1M EDTA)处理5min，取出室温干燥10min后，再用中和液浸泡5min，取出晾干，于80℃中烘烤2h以固定探针。

杂交：

探针(含有15次GA重复的寡核苷酸)的标记采用Amersham公司的Gene Images 3′-Oligolabelling Module试剂盒。80μl的反应体系中包含以下成分，100μmol探针，1×cacodylatebuffer 1μl，32U末端转移酶，Fluorescent-11-dNTPs 5μl，37℃温浴70分钟。

将烘烤好的NC膜放入杂交液[5×SSC(在800ml水中溶解43.8gNaCl和22.0g柠檬酸钠，调节pH值为7.0，加水定容至1L，高压灭菌)，0.1％(W/V)SDS(900ml水中溶解10gSDS，调节pH值为7.2，定容至1L)，稀释20倍的液体封阻(Liquid Block，试剂盒提供)，0.5％(W/V)分子量为500,000的多聚硫酸葡聚糖(Dextran Sulphate，MW 500,000，试剂盒提供)]中37℃预杂交半小时以上；然后将杂交液去除，重新加入杂交液和标记好的探针，杂交液按照NC膜面积的大小以0.125-0.25ml/cm²的量加入，探针的浓度为5-10ng/mL，37℃振荡过夜。

洗膜：

将NC膜放在洗脱液(5×SSC，0.5％(W/V)SDS)中室温振荡洗脱2次，每次5分钟。然后在含有1×SSC(在800ml水中溶解8.8g NaCl和4.4g柠檬酸钠，调节pH值为7.0，加水定容至1L，高压灭菌)，0.5％SDS的洗脱液中37℃水浴振荡洗脱15分钟，含有1×SSC，0.5％SDS的洗脱液中42℃水浴振荡洗脱15分钟。

阳性信号的获得：

将膜放入到Detection Buffer I(0.15MNaCl，0.1M Tris，pH值为7.5)中1分钟，迅速取出，放入上述含有稀释20倍的液体封阻中封阻30分钟，将膜转入到抗体液中反应30分钟，抗体液含有稀释1000倍的抗体(试剂盒提供)，0.5％(W/V)小牛血清，0.4M NaCl，0.1M Tirs-HCl(pH值为7.5)。取出膜在Detection Buffer II(0.15M NaCl，0.1M Tris，pH值为7.5)中洗3次，每次5分钟。

处理完NC膜后，将膜放入等量混合的Detection Buffer I和II中浸泡1分钟，在暗室中压上X-胶片，放入暗盒感光1h。黑暗中将感光的光片取出，在显影液(Koda)中浸泡10分钟进行显影，在定影液(Koda)中定影10分钟。用清水冲洗光片半个小时，室温晾干。

将X-胶片、硝酸纤维素膜、平板三者进行对照，在对应位置上挑出阳性克隆，将阳性菌落挑起，37℃摇菌培养8小时。

3条斑紫菜微卫星序列的分析

将菌落原位杂交获得的阳性克隆用ABI3730测序仪进行测序。利用常用的工具软件进行分析，如在线工具SSRIT-Simple Sequence Repeat Identification Tool(http://www.gramene.org/db/searches/ssrtool)进行微卫星序列筛选，原则为两碱基重复7次以上(包括7次)，三碱基重复5次以上(包括5次)，四碱基重复4次以上(包括4次)，五碱基及六碱基重复3次以上(包括3次)。分析发现其中10条含有重复序列次数载10次以上的序列，依次编号为P1-P10。

4条斑紫菜微卫星标记引物的设计与优化

对上述10条含有重复单元的序列进行分析，利用引物设计软件Primer Premier 5.0和DNAStar(常用软件)设计引物，采用以下严谨度：1)引物长度为18～25mer；2)GC含量40％～60％；3)Tm值大于50℃；4)预期PCR产物长度为100～300bp。引物由上海英骏公司(Invitrogen)合成(表1)。

引物退火温度的优化采用温度梯度PCR方法，反应体系为20μl，1×PCR缓冲液(10mMTris-HCl，50mM KCl，2.0mM Mg²⁺)，dNTP各200μM，1.2mM的Mg²⁺，微卫星正向引物和反向引物各0.2μM，模板DNA 20～40ng，1U Taq DNA聚合酶，用水补足到20μL。PCR反应在Thermo Electron公司的P×2^TM PCR仪上进行，94℃预变性5min，94℃变性30s，退火30s，退火温度依引物而异，72℃延伸50s，30个循环，最后72℃延伸5min。

表1

5利用微卫星标记分析条斑紫菜同一群体不同个体间的遗传多样性

选用上述扩增带型清楚地的引物对同一群体20个个体进行遗传多样性的分析，本具体实施方式以PYM2和PYM6为例。PCR反应体系为20μl，1×PCR缓冲液，dNTP各200μM，1.2mM的Mg²⁺，微卫星正向引物和反向引物各0.2μM，模板DNA 20～40ng，1U Taq DNA聚合酶，用水补足到20μL。PCR反应在Thermo Electron公司的P×2^TMPCR仪上进行，94℃预变性5min，94℃变性30s，退火30s，退火温度依引物而异，72℃延伸50s，30个循环，最后72℃延伸5min。PCR产物利用10％聚丙烯酰胺凝胶电泳-EB染色系统进行检测，在凝胶成像系统下观察记录成像结果(图1，2)。利用常用的软件进行分析，如STATISTICA/w 5.0(StatSoft Software，Inc.，USA)软件分析个体间遗传多样性。

本发明获得的10个微卫星标记(表1)，均可以在不同个体中进行扩增，结果稳定可靠，可以用于群体遗传多样性分析。这充分证明本发明可以高效筛选条斑紫菜微卫星序列，从而获得大量微卫星标记。

序列表

<110>中国海洋大学

<120>一种条斑紫菜微卫星标记的筛选方法及其应用

<130>A

<160>10

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>600

<212>DNA

<213>条斑紫菜

<400>1

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<210>2

<211>540

<212>DNA

<213>条斑紫菜

<400>2

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<210>3

<211>480

<212>DNA

<213>条斑紫菜

<400>3

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<210>4

<211>400

<212>DNA

<213>条斑紫菜

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<210>5

<211>400

<212>DNA

<213>条斑紫菜

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<210>6

<211>550

<212>DNA

<213>条斑紫菜

<400>6

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<210>7

<211>550

<212>DNA

<213>条斑紫菜

<400>7

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<210>8

<211>401

<212>DNA

<213>条斑紫菜

<400>8

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<210>9

<211>668

<212>DNA

<213>条斑紫菜

<400>9

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tttgtctcca gagtcacgaa gggctgcgac tccgacagga gcgacactgg cagcggtcag    540

ctctcgagag gacctgagca ctaggagggg atgggagggg gcacaaggtg gcgtatgaag    600

ggactaaggg tagagtgaag gtgatcagca tctgggcgca tgcaggtagt cccgaattca    660

agcaagag                                                             668

<210>10

<211>600

<212>DNA

<213>条斑紫菜

<400>10

gcacgccaag gtcacatatc gctgtgctga cggcgtccgc cccacagtcc gcacatgtat     60

cgttgcctag caaccaaaat gtgcattgtt tgtacaagtg gagaagagag gaacaataca    120

gaaacttgac tcacctggtg tgtagaaaac gctgttcatg aaattgtcca tttccgacaa    180

cacaggctaa aatcgacaag atcgtgagga gcgtgaaaat acaaaatgca tgcatgcatg    240

cagtgcagtg agacatggaa cgacagaaga acgcaggagt gagcgagaga gagagagaga    300

aaagccaaga gaagtgaaag tatagtgaaa cagcgaaaag aagggaaata aaaaagaaac    360

gagagaggaa aaagagaaaa gagaaagaga gtccgagacc agcgaagaga gagagagaaa    420

gagaaagagg gtcgtacctc gtcatcaggc acgcgaaggg acgcacttgc tgacgaatgt    480

cgggatgcag tcccggggtt aagcgtgtca atgtcccgag agtatcgctc acactcaaac    540

acctgacaaa ctttgagttc acacaggtcc cttgtgttct atctctgcct ctttctcttt    600

Claims (2)

1.一种条斑紫菜微卫星标记的筛选方法，包括以下步骤：

(1)提取条斑紫菜丝状体基因组DNA，利用限制性内切酶Hae III和Afa I对基因组DNA进行酶切，电泳检测回收500-1500bp大小的片段；将所述的片段与5’端磷酸化的接头连接，以上述连接产物为模板，以接头中的短链为引物，利用PCR方法进行富集；

所述的接头序列第一链为5’TAGTCCGAATTCAAGCAAGAGCACA3’，第二链为5’CTCTTGCTTGAATTCGGACTA3’；

所述的短链序列为5’CTCTTGCTTGAATTCGGACTA3’；

(2)利用生物素标记的(GA)₁₅为探针与上述PCR富集产物进行杂交，在离心管内用平衡过的Streptavidin Magnesphere磁珠对上述杂交混合物进行吸附，吸附后将离心管置于磁力架上，去除杂交液，对磁珠进行洗涤，洗脱未结合到磁珠上的DNA片段；将洗涤后的磁珠悬浮于TE溶液中，于94-96℃变性，使含有微卫星序列的DNA片段脱离磁珠，迅速收集上清，离心得到含有微卫星序列的DNA片段；以离心得到的DNA片段为模板，以上述接头中的短链为引物，通过PCR方法进行富集，构建含有微卫星序列的富集文库；

(3)以含有15次GA重复的寡核苷酸序列为探针，采用菌落原位杂交的方法筛选阳性克隆；将菌落原位杂交获得的阳性克隆进行测序，筛选微卫星序列，对含有重复单元的序列进行分析，设计引物序列，获得微卫星标记；

所述的含有重复单元的序列如SEQ ID NO：2所示。

2.一种用于条斑紫菜微卫星标记的含有重复单元的核酸分子，其序列如SEQ ID NO：2所示。

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