CN101381724B

CN101381724B - 基于磁珠探针复合物分离短散在重复序列的方法

Info

Publication number: CN101381724B
Application number: CN2008101973135A
Authority: CN
Inventors: 童超波; 何舜平
Original assignee: Institute of Hydrobiology of CAS
Current assignee: Institute of Hydrobiology of CAS
Priority date: 2008-10-21
Filing date: 2008-10-21
Publication date: 2010-09-01
Anticipated expiration: 2028-10-21
Also published as: CN101381724A

Abstract

本发明公开了一种磁珠探针复合物分离短散在重复序列的方法，本发明包括如下步骤：(1)基因组片段富集库的制备。酶切基因组，回收合适大小片段，T4连接酶加接头，少量接头PCR循环放大酶切后的基因组片段库；(2)探针磁珠复合物的制备。通过引物扩增方法实现生物素标记DNA探针，变性后将生物素标记的单链探针绑定到磁珠上；(3)目的片断群的捕获。将磁珠探针复合物与基因组文库杂交，捕获目的片段并将其分离，克隆及阳性选择。该方法简单、高效、快速，缩短了实验周期，降低了成本消耗，极大的提高了效率，无须特别的实验设备。

Description

基于磁珠探针复合物分离短散在重复序列的方法

技术领域

本发明属于分子生物技术领域，涉及一种从基因组中快速大规模分离短散在重复序列(SINE)的方法。该方法基于磁珠分选系统直接正向分选，将探针绑定于磁珠，在溶液中与放大的酶切基因组片段库杂交，直接捕获大量含有短散在重复序列(SINE)的目的片段。

背景技术

短散在重复序列(SINE)是一种长度在50-500bp，广泛存在于真核生物基因组中的一种反转座子。它的拷贝数一般在10⁴-10⁶左右，散在或丛生于基因组的任何部位。典型的SINE由tRNA相关区，家族特异区和尾部区三部分组成。SINE被认为是用来研究生物类群系统发育关系和群体遗传学的绝好标记。近年来研究表明，SINE插入到基因的附近，能作为增强子或沉默子调节已知基因的表达。

目前用于分离SINE的方法主要是利用含SINE(短重复序列)的探针杂交扫描基因组文库，分离出含有SINE的克隆。整个过程需要首先构建一个基因组文库，然后放射性或生物素荧光标记SINE探针，通过多轮斑点southern杂交的方法来扫描文库，筛选出阳性克隆。这种传统的方法，需要的工作量大，耗时长，成本高，难操作，效率低。

本发明利用磁珠筛选系统实现短散在重复序列(SINE)快速高效的分离，是一种不同于传统文库法的新策略和新方法。近年来，磁珠分离系统被许多研究者开发用于分离许多目标，如特定细胞，特定蛋白，微卫星的分离等，本发明设计实验方案将磁珠分离系统首次应用于短散在重复序列(SINE)的分离。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，本发明的目的是在于提供了一种基于磁珠探针复合物分离短散在重复序列的方法，该方法简单、高效、快速，缩短了实验周期，降低了成本消耗，极大的提高了效率，将磁珠分离系统应用到分离短散在重复序列(SINE)上。该方法基于磁珠分选系统，能直接从酶切后的基因组DNA中钓取含有短散在重复序列(SINE)的片段群。

为实现上述这一目的，本发明采用以下技术措施：

首先需要将含有单拷贝SINE序列的片段生物素标记并使其单链化，然后将此生物素标记的单链探针其绑定到活性磁珠上，在杂交液中与酶切后的基因组DNA杂交，杂交完成后通过磁铁架将磁珠保留，目的片段由于与探针形成双链体被绑定与磁珠上从而得以保留，非目的片段留存在溶液中被丢弃，从而实现了目的片段群和非目的片段群的分离，最后将磁珠上捕获的含有SINE的目的片段洗脱下来，克隆并测序。

本发明的方法具体包括如下步骤：(见附图1)

A.基因组片段富集库的制备。第一步：酶切基因组DNA。100微升的酶切体系中加入约40微克基因组DNA，及20单位的限制性内切酶HaeIII，过夜消化完全酶切。酶切后图谱如图2A，基因组DNA被均匀酶切于4KB以下，回收500bp-2kb片段溶于40微升无菌水中。第二步：加接头。生成接头的两条寡聚核苷酸分别为A：5P‘GGCAGGATCCACTGAATTCGC-3’和B：5’-AGCGAATTCAGTGGATCCTGCC-3’。两条寡核苷酸在终浓度为10μM的无菌水中执行如下过程实现两条链的聚合形成接头：95℃3分钟，65℃2分钟，45℃2分钟，25℃1分钟，4℃保存。形成的双链接头一端被磷酸化标记另一端有一个突出的碱基A，这样能使接头定向连接到片段上且能阻止第二个接头的继续加入。100μl连接体系中包含40μl酶切基因组片段(见第一步)，终浓度为2μM的双链接头，终浓度lx连接缓冲液，20单位T4DNA连接酶，22℃连接过夜。最后将上述连接液过柱回收溶于150μl无菌水。第三步：PCR反应富集片段库。用oligo B做引物，平行进行20个PCR反应，每管50微升反应体系中加入上述连接回收产物1微升作为模板进行PCR反应。PCR程序为72℃，5min；12个循环中95℃45秒，55℃45秒，72℃1分50秒，最后回收溶解于150μL H₂O中。

B.磁珠探针复合物的制备。第一步：生物素标记探针。将已知短散在重复序列(SINE)双链片段的一条链一端生物素标记{通过PCR(聚合酶链式反应)扩增方法实现生物素标记DNA探针}，设计一对引物(A.B)用来PCR扩增探针序列，其中任意一条引物的5末端用生物素标记(这一目标通过PCR两条引物中的任意一条引物的5末端生物素标记实现)，PCR后回收产物成100μL H₂O中，95度变性10分钟，然后迅速插入冰中(生成的双链DNA产物中的一条链的末端即带有生物素标记)。第二步：探针绑定到磁珠上。上述标记的双链DNA经过变性形成单链，其中生物素标记的单链绑定到磁珠上，取200微升磁珠(10mg/ml)，去掉保存液，用缓冲液TEN₁₀₀[10mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)，1mM乙二胺四乙酸(EDTA)，100mM氯化钠(NaCl)，pH7.5]洗涤三次，每次5分钟，最后用300μL TEN₁₀₀悬浮磁珠，然后将上述变性后的生物素标记的探针100μL加入，25℃孵育1小时。

C.目的片段群的捕获。第一步：杂交及洗脱。将磁珠探针复合物和基因组片段富集库于杂交液中杂交，经上述步骤B后，单链探针被绑定到磁珠上，去掉磁珠悬浮液，用200μL杂交液(5×SSC，0.1％SDS)洗一次，再加入150μL10×SSC，0.2％SSC和95度变性后的150微升基因组片段库同时加入悬浮磁珠，55℃杂交2小时，洗脱过程包括：400μL TEN1000[10mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)，1mM乙二胺四乙酸(EDTA)，1000mM氯化钠(NaCl)，pH7.5]洗涤三次，每次5分钟，400μL0.2*SSC，0.1％SDS洗涤三次，每次5分钟，最后TEN1000洗一次，10分钟，95度5分钟，期间不停吹打悬浮磁珠，分离磁珠(目的片段由于与磁珠-探针杂交上形成复合物得以保留，非目的片段被除去)，第二步：接头PCR。通过接头PCR放大捕获后的片段库，平行做4个PCR反应，上一步捕获的片段库1微升作为模板，15个循环95℃45秒，55℃45秒，72℃1分50秒，反应完成后回收成30微升水中。第三步：克隆及阳性选择，通过菌液PCR检测插入片段大小，测序合适大小的阳性克隆。

本发明相对于其他传统分离SINE方法具有如下优点和效果：

1.相对于传统的文库扫描方法，基于磁珠筛选法极大的缩短了实验周期，降低了成本消耗，极大的提高了效率并且操作简便工作量小。传统的文库扫描法需要构建一个基因组文库及后续多轮文库克隆斑点southern杂交扫描，本方法能在一个星期左右得到几百个阳性克隆包含SINE插入位点，一次实验足够满足后续的研究。另外，本实验的消耗仅为传统文库法的十分之一，并且不需要特别的实验平台和仪器，操作简单，容易控制，PCR或者克隆等常规分子生物学技术就是实验的核心。

2.基于磁珠杂交方法的杂交过程是在溶液当中进行的。与传统方法在固体介质尼龙膜上进行，溶液中杂交极大的方便和加速了探针和目标序列的杂交，提高了杂交效率。

3.最后克隆进入载体是一群目的序列，效率通常在50％以上，因此极大的提高了后续实验效率。

4.通过PCR方法实现生物素标记单链探针，能有效防止磁珠互相铰链凝结的发生。

附图说明

图1.2.3.基于磁珠探针大规模分离短散在重复序列(SINE)的方法流程示意图

其中图1为一种基因组片段富集库的制备示意图

其中图2为一种探针磁珠复合物的制备示意图

其中图3为一种目的片断群的捕获示意图

图4.该方法流程中一些重要步骤的电泳监测。1.酶切基因组DNA。HaeIII过夜完全酶切鳙鱼基因组DNA，可见被均匀的切至4Kb以下。2.PCR反应富集片段。可见通过少量PCR循环放大后的酶切后基因组片段库，形成均一弥散的条带，大部分集中在500-2000bp.3.接头PCR。最后捕获的片段大部分集中在1000-1500bp左右。

图5.鲢鱼中捕获的短散在重复序列(SINE)。这些SINE序列具有典型的结构：由tRNA相关区(tRNA-related region)，中间的tRNA非相关区，和LINE相关区(LINE-related region)。每条SINE两端的正向重复序列用下划线标记。

具体实施方式

下面结合附图对发明做进一步详细说明。

实施例1：在鳙鱼实例中举例说明整个过程。

A.根据图1可知，基因组片段富集库的制备。第一步：酶切基因组DNA。100微升的酶切体系中加入约40微克基因组DNA，及20单位的限制性内切酶HaeIII，过夜消化完全酶切。酶切后图谱如图2A，基因组DNA被均匀酶切于4KB以下，回收500bp-2kb片段溶于40微升无菌水中。第二步：加接头。生成接头的两条寡聚核苷酸分别为A：5P‘GGCAGGATCCACTGAATTCGC-3’和B：5’-AGCGAATTCAGTGGATCCTGCC-3’。两条寡核苷酸在终浓度为10μM的无菌水中执行如下过程实现两条链的聚合形成接头：95℃3分钟，65℃2分钟，45℃2分钟，25℃1分钟，4℃保存。形成的双链接头一端被磷酸化标记另一端有一个突出的碱基A，这样能使接头定向连接到片段上且能阻止第二个接头的继续加入。100μl连接体系中包含40μl酶切基因组片段(见第一步)，终浓度为2μM的双链接头，终浓度lx连接缓冲液，20单位T4DNA连接酶，22℃连接过夜。最后将连接液过柱回收溶于150μl无菌水。第三步：PCR反应富集片段库。用oligo B做引物，平行进行20个PCR反应，每管50微升反应体系中加入上述连接回收产物1微升作为模板，其他成分按照标准添加。PCR程序为72℃，5min；12个循环中95℃45秒，55℃45秒，72℃1分50秒，最后回收溶解于150μL H₂O中。

B.根据图2可知，，探针磁珠复合物的制备。第一步：生物素标记探针。设计一对引物(A.B)用来PCR扩增探针序列，其中任意一条引物的5末端用生物素标记，PCR后回收产物成100μL H₂O中，95度变性10分钟，然后迅速插入冰中。第二步：探针绑定到磁珠上。取200微升磁珠(10mg/ml)，去掉保存液，用缓冲液TEN₁₀₀[10mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)，1mM乙二胺四乙酸(EDTA)，100mM氯化钠(NaCl)，pH7.5]洗涤三次，每次5分钟，最后用300μLTEN₁₀₀悬浮磁珠，然后将上述变性后的生物素标记的探针100μL加入，25℃孵育1小时。

C.根据图目3可知，目的片段群的捕获。第一步：杂交及洗脱。经上述步骤B后，单链探针被绑定到磁珠上，去掉磁珠悬浮液，用200μL杂交液(5×SSC，0.1％SDS)洗一次，再加入150μL10×SSC，0.2％SSC和95度变性后的150微升基因组片段库同时加入悬浮磁珠，55℃杂交2小时，洗脱过程包括：400μLTEN₁₀₀₀[10mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)，1mM乙二胺四乙酸(EDTA)，1000mM氯化钠(NaCl)，pH7.5]洗涤三次，每次5分钟，400μL0.2*SSC，0.1％SDS洗涤三次，每次5分钟，最后TEN₁₀₀₀洗一次，10分钟，95度5分钟，期间不停吹打悬浮磁珠，分离磁珠，第二步：接头PCR。平行做4个PCR反应，上一步捕获的片段库1微升作为模板，15个循环95℃45秒，55℃45秒，72℃1分50秒，反应完成后回收成30微升水中。第三步：克隆及阳性选择，通过菌液PCR检测插入片段大小。

Claims

1.一种磁珠探针复合物分离短散在重复序列的方法，其步骤是：

(1)基因组片段富集库的制备：酶切基因组后回收片段，T4连接酶加接头，接头PCR循环放大酶切后的基因组片段库，选用HaeIII作为酶切基因组的限制性内切酶，用来生成接头的两条引物分别引物为：A：5P‘GGCAGGATCCACTGAATTCGC-3’和B：5’-AGCGAATTCAGTGGATCCTGCC-3’，其中引物A的5端磷酸化处理，两条寡核苷酸在终浓度为10μM的无菌水中执行如下过程实现两条链的聚合形成接头：95℃3分钟，65℃2分钟，45℃2分钟，25℃1分钟，4℃保存，形成的双链接头一端被磷酸化标记另一端有一个碱基A，使接头定向连接到片段上且阻止第二个接头的继续加入，PCR富集放大酶切后的基因组片段库的使用的循环数为12，并行使用20个PCR反应；

(2)探针磁珠复合物的制备：通过将已知短散在重复序列(SINE)双链片段的一条链一端生物素标记实现生物素标记DNA探针，变性后将生物素标记的单链探针绑定到磁珠上，单链磁珠探针的制作包括，首先把步骤(1)中两条引物中的一条引物生物素标记，PCR扩增探针DNA片段回收产物成100μL H₂O中，然后95度变性10分钟，插入冰中，然后取200微升磁珠10mg/ml，去掉保存液，用缓冲液TEN100 ，TEN100：10mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，1mM乙二胺四乙酸，100mM氯化钠，pH 7.5，洗涤三次，每次5分钟，洗脱未与磁珠结合的生物素探针与生物标记探针互补的DNA链，最后用300μL TEN100悬浮磁珠，将上述变性后的生物素标记的探针100μL加入，室温孵育1小时；

(3)目的片断群的捕获：将磁珠探针复合物和基因组片段富集库于杂交液中杂交，经上述步骤(2)后，单链探针被绑定到磁珠上，去掉磁珠悬浮液，用200μL杂交液洗一次，再加入150μL 10×SSC，0.2％SSC和95度变性后的150微升基因组片段库同时加入悬浮磁珠，55℃杂交2小时，洗脱过程包括：400μL TEN1000：10mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，1mM乙二胺四乙酸，1000mM氯化钠，pH7.5，洗涤三次，每次5分钟，400μL 0.2×SSC，0.1％SDS洗涤三次，每次5分钟，最后TEN1000洗一次，10分钟，95度5分钟，期间吹打悬浮磁珠，分离磁珠，接头PCR，通过接头PCR捕获后的片段库，平行做4个PCR反应，捕获的片段库1微升作为模板，15个循环95℃45秒，55℃45秒，72℃1分50秒，反应完成后回收成30微升水中，克隆及阳性选择，通过菌液PCR检测插入片段大小。