CN108728430A - 一种制备含有多个重复单元dna长探针的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及寡核苷酸探针制备，具体涉及一种制备含有多个重复单元DNA长探针的方法。采用平末端内切酶和切刻内切酶同时切割含有多个重复单元DNA双链的质粒，而后利用lambda外切酶的作用原理进行特异性切割，切割后通过电泳分离即得到含有多个重复单元的目的单链DNA。本发明方法适用于制备所有序列成分的DNA探针，尤其是针对难以进行PCR扩增的序列，如含有多个重复单元的，且所制备的探针长度可达800nt，解决了多重复单元DNA长探针制备的技术问题。
Description
技术领域
本发明涉及寡核苷酸探针制备，具体涉及一种制备含有多个重复单元DNA长探针的方法。
背景技术
Lambda核酸外切酶是一个高度持续性从双链DNA 5′-3′端选择性切割磷酸化单链的核酸外切酶。Lambda核酸外切酶的最适底物是5′磷酸化的平末端双链DNA，它以3′端核酸链为模板，从DNA的5′末端开始按顺序进行切割，在两端中央位置形成单链【1】。Lambda核酸外切酶的另一特点是不能从nick(切刻)位点及gap位点的5′端开始切割【2】。
分支DNA信号放大技术(branched-DNA,bDNA)是Chiron公司推出的一种的核酸杂交信号放大技术，该检测方法具有高灵敏度，非扩增等特点【3】。目前主要应用于HPV,HBV,HCV,HIV等病毒的检测，基因表达分析以及肿瘤基因分析等方面。
分支DNA信号放大技术在杂交检测过程中主要用到以下这几种探针： CP(captμreprobe)-固定在微孔板上，用于捕获目的序列；CE(capt μ re extender)-一端与CP所捕获的目标序列结合，另一端与preamplifier 结合；preamplifier-预放大分子，一端与CE结合，其他部分由5-15个重复单元组成，amplifier-结构与preamplifier相似，但序列不同，一端与preamplifier的重复单元结合，其他位点与标记探针结合。通过多级杂交，实现对目的序列的信号放大。
现阶段分支DNA信号放大技术所涉及多重复单元DNA探针，其本质是含有多个约20nt重复单元的单链DNA。
多重复单元序列在进行PCR的过程中会发生错位配对现象，导致扩增产物长短不一，因此，含有PCR扩增过程的探针制备方法均不适用于多重复单元探针的制备。
而且多重复单元的DNA在PCR过程中容易出现错位退火导致无法扩增出目的产物，因此不能使用带有PCR过程的探针制备方法来制备含有重复单元DNA探针。目前制备多重复单元探针的方法主要是通过核酸合成仪合成，但其合成受长度限制，只能合成约100nt的探针，且得率随探针长度增加而降低。一些商业化的生物技术服务公司，如生工生物工程 (上海)股份有限公司http://www.sangon.com，金斯瑞生物科技有限公司http://www.genscript.com，所提供的单链DNA合成服务长度只能达到约130nt。探针长度不足会影响preamplifier和amplifier中重复单元的数目，严重限制了bDNA结构的放大倍数。为了提高preamplifier 和amplifier中重复单元的数目，有文献通过搭桥连接的方法，将3条长度分别为86nt,79nt和73nt的探针拼接在一起，获得了一条239nt的多重复单元探针【4】，但是随着拼接片段的数目增加，连接效率会大大降低，依然受到长度的制约。
1.An Exonuclease Induced by BacteriophageλJOHN W.LITTLE,I.R. LEHMAN,AND A.D.KAISER From the Department of Biochemistry, Stanford UniversitySchool of Medicine,Palo Alto,California 94304.
2.The Role of Exonuclease andβProtein of Phageλin GeneticRecombinationD.MARTIN CARTER AND CHARLES M.RADDING From the Departments ofMediczne,Molecular Biophysics,and Biology,Yale UGversity,New Haven,Connecticut 06510.
3.Rapid and Precise Quantification of HIV-1RNA in Plasma Using aBranched DNA Signal Amplification Assay,Nucleic Acid Systems,ChironCorporation,Emeryville,California,U.S.A.
4.An Enhanced-Sensitivity Branched-DNA Assay for Quantification ofHuman Immunodeficiency Virus Type 1RNA in Plasma Chiron Corporation,Emeryville,California 94608-2916,1and Agouron Pharmaceuticals, Inc.,La Jolla,California 92037-1020.
发明内容
为了解决上述问题，本发明旨在提供一种制备较长的含多重复单元 DNA探针的方法。
为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
一种制备含有多个重复单元DNA长探针的方法，用平末端内切酶和切刻内切酶同时切割含有多个重复单元DNA双链的质粒，而后利用lambda 外切酶的作用原理进行特异性切割，切割后通过电泳分离即得到含有多个重复单元的目的单链DNA。
上述平末端内切酶可为EcoRV,SmaI,ScaI,SspI,StuI等；切刻内切酶可为Nb.BbvCI，Nt.BbvCI，Nb.BssSI，Nt.BstNBI，Nt.BspQI等。
所述含有多个重复单元DNA双链的质粒中，目的DNA序列两端分别含有平末端内切酶酶切位点和切刻内切酶酶切位点；并且，切刻内切酶酶切位点在目的单链DNA序列的5′端。
所述用平末端内切酶和切刻内切酶在37℃同时切割含有目的DNA 双链的质粒，而后于65-85℃热失活5-20min。
所述再经过lambda的特异性切割后于37℃下纯化,纯化后再于 65-85℃,热失活5-20min。
本发明原理是利用lambda外切酶只能从双链DNA 5’端开始切割, 但不能从DNA切刻位点开始切割的特点，使用平末端内切酶EcoRV和切刻内切酶Nb.BbvCI同时切割含有目的DNA双链的质粒后，lambda外切酶进行切割后，切刻位点3’端的序列得以保留，最后经过电泳分离并进行胶回收获得目标单链DNA。由于目的序列保存于质粒中，易于扩增，具有原料易得的优点，成本较低。
本发明所具有的优点：
本发明所采用lambda外切酶法制备探针，此过程中不受探针长度及重复单元限制；具体：
本发明结合lambda外切酶的特点，利用EcoRV和Nb.BbvCI制备特异底物，在lambda外切酶切割产物中分离出目的多重复单元DNA长探针。解决了多重复单元DNA长探针制备过程中受核酸合成仪长度制约及受原料成本高的问题。用该方法制备preamplifier和amplifier可含有更多的重复单元，可以大幅度的提高bDNA杂交信号放大的倍数，增加检测的灵敏度。
附图说明
图1为本发明实施例提供的lambda外切酶法制备多重复单元探针方法示意图。
图2为为本发明实施例提供的琼脂糖凝胶电泳图，其中，泳道1： lambda外切酶处理前，泳道2-6：lambda外切酶处理后，泳道M:marker DL2000+15000。
图3为本发明实施例提供的lambda外切酶法制备多重复单元探针方法示意图。
图4本发明实施例提供的lambda外切酶法制备多重复单元探针方法示意图。
具体实施方式：
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
本发明采用了lambda外切酶法，利用lambda外切酶不能从切刻位点启动的特点，用平末端内切酶EcoRV和切刻内切酶Nb.BbvCI同时切割含有目的DNA双链的质粒，获得带切刻位点的线性化质粒，再经过lambda 的特异性切割，通过电泳分离获得目的单链DNA。该方法适用于制备所有序列成分的DNA探针，尤其是针对难以进行PCR扩增的序列，且所制备的探针长度可达800nt，解决了多重复单元DNA长探针制备的技术问题。
实施例1
制备800nt，20个重复单元DNA长探针
(一)含有20个重复单元序列的质粒制备，具体步骤如下：
1.设计20个重复单元序列(序列R，参见序列表1)，两端含有酶切位点EcoRV和Nb.BbvCI。
由生工生物工程有限公司合成并连入pUC57，获得含有序列R的新质粒pR20(附图1),并保存于大肠杆菌中。
2.将含有pR20的大肠杆菌接种于3ml Amp LB培养基中，37℃ 200r/min培养16h.
3.用Axygen公司的质粒小提试剂盒(AP-MN-P-50)进行质粒提取。 (步骤与试剂盒提供一致)
4.EcoRV(NEB R0195S)，Nb.BbvCI(NEB R0631S)双酶切pR20，具体体系为：
反应条件为:37℃,2h；80℃，10min.
5.用Axygen公司的PCR Cleanup试剂盒(AP-PCR-50G)对上述配切处理后的DNA进行纯化(步骤与试剂盒提供一致)
6.lambda外切酶(NEB M0262S)切割上述纯化产物，反应体系为：
反应条件为：37℃,20min；75℃,10min
7.1.5％琼脂糖凝胶电泳分离，恒压120V，30min,结果如附图2，所用染料为DNA单链染料SYBR II.
8.用Axygen公司的琼脂糖凝胶试剂盒(AP-GX-50)回收目的片段回收(步骤与试剂盒提供一致)
9.回收片段sanger测序验证(测序服务由生工生物工程有限公司提供)
验证一：所用引物为目的单链3’序列10117c的互补序列 10117:CGTGCCAATCTGCCCGTATGGTCTA,测序结果为目的单链的反向互补序列，说明所回收产物与目的单链一致。
验证二：为证明回收产物中不存在目的单链的互补链，对回收产物以目的产物5‘端序列1454c：TTGTAACTCACGCTCCATTATCAC进行测序,测序结果没有信号，说明回收产物中不存在与1454c结合的位点，不存在目的单链的互补链。
参见序列表1，单链序列(5’-3’):
GCTGAGG(Nb.BbvCI)
TTGTAACTCACGCTCCATTATCAC(1454c)
AAAGGCAGGCTAGAACCAACGAGCTTT
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CTATAG(EcoRV)
实施例2
制备400nt，10个重复单元DNA长探针
(一)含有10个重复单元序列的质粒制备，具体步骤如下：
1.设计10个重复单元序列(序列T，参见序列表2)，两端酶切位点分别为SmaI和Nt.BbvCI，由生工生物工程有限公司合成并连入pUC57。获得含有序列T的新质粒pT10(附图3),并保存于大肠杆菌中。
2.将含有pT10的大肠杆菌接种于3ml Amp LB培养基中，37℃ 200r/min培养16h.
3.用Axygen公司的质粒小提试剂盒(AP-MN-P-50)进行质粒提取。 (步骤与试剂盒提供一致)
4.SmaI(NEB R0141V)，Nt.BbvCI(NEB R0632S)双酶切pT10，具体体系为：
反应条件为:30℃,2h；80℃，10min.
5.用Axygen公司的PCR Cleanup试剂盒(AP-PCR-50G)对上述配切处理后的DNA进行纯化(步骤与试剂盒提供一致)
6.lambda外切酶(NEB M0262S)切割上述纯化产物，反应体系为：
反应条件为：37℃,20min；75℃,10min
7.1.5％琼脂糖凝胶电泳分离，恒压120V，30min,结果如附图2，所用染料为DNA单链染料SYBR II.
8.用Axygen公司的琼脂糖凝胶试剂盒(AP-GX-50)回收目的片段回收(步骤与试剂盒提供一致)
参见序列表2(序列T):
CCCGGG(SmaI)
CGTGCCAATCTGCCCGTATGGTCT
TTTTTTTTTAATGCTCGTTGGTTCTAGCCTGCCT
TTTTTTTTTAATGCTCGTTGGTTCTAGCCTGCCT
TTTTTTTTTAATGCTCGTTGGTTCTAGCCTGCCT
TTTTTTTTTAATGCTCGTTGGTTCTAGCCTGCCT
TTTTTTTTTAATGCTCGTTGGTTCTAGCCTGCCT
TTTTTTTTTAATGCTCGTTGGTTCTAGCCTGCCT
TTTTTTTTTAATGCTCGTTGGTTCTAGCCTGCCT
TTTTTTTTTAATGCTCGTTGGTTCTAGCCTGCCT
TTTTTTTTTAATGCTCGTTGGTTCTAGCCTGCCT
TTTTTTTTTAATGCTCGTTGGTTCTAGCCTGCCT
AATCAGAGACTGCGCGGACTTACCCTT
CGACTCC(Nt.BbvCI)
实施例3
制备200nt，5个重复单元DNA长探针
(一)含有5个重复单元序列的质粒制备，具体步骤如下：
1.设计5个重复单元序列(序列F，参见序列表3)，两端酶切位点分别为EcoRV和Nt.BbvCI，由生工生物工程有限公司合成并连入pUC57。获得含有序列F的新质粒pF5(附图4),并保存于大肠杆菌中。
2.将含有pT10的大肠杆菌接种于3ml Amp LB培养基中，37℃ 200r/min培养16h.
3.用Axygen公司的质粒小提试剂盒(AP-MN-P-50)进行质粒提取。 (步骤与试剂盒提供一致)
4.EcoRV(NEB R0195S)，Nt.BbvCI(NEB R0632S)双酶切pF5，具体体系为：
反应条件为:37℃,2h；80℃，10min.
5.用Axygen公司的PCR Cleanup试剂盒(AP-PCR-50G)对上述配切处理后的DNA进行纯化(步骤与试剂盒提供一致)
6.lambda外切酶(NEB M0262S)切割上述纯化产物，反应体系为：
反应条件为：37℃,20min；75℃,10min
7.1.5％琼脂糖凝胶电泳分离，恒压120V，30min,结果如附图2，所用染料为DNA单链染料SYBR II.
8.用Axygen公司的琼脂糖凝胶试剂盒(AP-GX-50)回收目的片段回收(步骤与试剂盒提供一致)
参见序列表3(序列F):
CGACTCC(Nt.BbvCI)
TTGTAACTCACGCTCCATTATCAC
AAAAAAAAAAGACCATACGGGCAGATTGGCACG
AAAAAAAAAAGACCATACGGGCAGATTGGCACG
AAAAAAAAAAGACCATACGGGCAGATTGGCACG
AAAAAAAAAAGACCATACGGGCAGATTGGCACG
AAAAAAAAAAGACCATACGGGCAGATTGGCACG
AAGGGTAAGTCCGCGCAGTCTCTGATT
CTATAG(EcoRV)
由上述各实施例可见，采用本发明方法能够合成800nt以下的含有重复序列的单链DNA序列，具有合成长度长、成本低、产率高的优点，为bDNA技术的实现提供方便。
本发明内容仅仅举例说明了要求保护的一些具体实施方案，其中一个或多个技术方案中所记载的技术特征可以与任意的一个或多个技术方案相组合，这些经组合而得到的技术方案也在本申请保护范围内，就像这些经组合而得到的技术方案已经在本发明公开内容中具体记载一样，当然也适用于本发明。
Claims (4)
1.一种制备含有多个重复单元DNA长探针的方法，其特征在于：采用平末端内切酶和切刻内切酶同时切割含有多个重复单元DNA双链的质粒，而后利用lambda外切酶的作用原理进行特异性切割，切割后通过电泳分离即得到含有多个重复单元的目的单链DNA。
2.权利要求1所述的制备含有多个重复单元DNA长探针的方法，其特征在于：所述含有多个重复单元DNA双链的质粒中，目的DNA序列两端分别含有平末端内切酶酶切位点和切刻内切酶酶切位点；并且，切刻内切酶酶切位点在目的单链DNA序列的5′端。
3.按权利要求1所述的制备含有多个重复单元DNA长探针的方法，其特征在于：所述用平末端内切酶和切刻内切酶在37℃同时切割含有目的DNA双链的质粒，而后于65-85℃热失活5-20min。
4.按权利要求1所述的制备含有多个重复单元DNA长探针的方法，其特征在于：所述再经过lambda的特异性切割后于37℃下纯化,纯化后再于65-85℃,热失活5-20min。
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