CN102301010A - 闭合线状dna的制备 - Google Patents
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Abstract
一种用于制备闭合线状脱氧核糖核酸(DNA)的体外方法，包括：(a)在一种或多种引物存在下，使包含至少一个原核端粒酶(protelomerase，一种噬菌体编码的酶)靶序列的DNA模板与至少一种DNA聚合酶在促进述模板扩增的条件下接触；和(b)使(a)中制备的扩增DNA与至少一种原核端粒酶在促进闭合线状DNA制备的条件下接触。一种试剂盒提供了该方法中必要的组分。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于制备闭合线状脱氧核糖核酸(DNA)的体外、无细胞方法。
背景技术
用于大量扩增DNA的传统的基于细胞的方法成本较高。例如，细菌的使用需要它们在昂贵的发酵罐内大体积生长，发酵罐需要保持在无菌状态以防止培养物的污染。还需要裂解细菌以释放扩增的DNA并且需要将所述DNA从其他细菌组分中清洗并且纯化出来。特别是在制备DNA疫苗或其他治疗性DNA药物时，需要高纯度以除去对哺乳动物具有毒性的内毒素。
除了成本问题之外，细菌的使用在许多情况下为扩增方法的保真度造成困难。在细菌细胞复杂的生物化学环境中，难以控制所需DNA产物的质量和收率。细菌有时会改变克隆在扩增DNA中的所需基因并且使其对于所需目的无用。重组事件还可能会导致感兴趣的DNA的忠实制备中存在问题。用于扩增DNA的无细胞酶法避免了使用宿主细胞，所以是有利的。
例如，制备药用DNA表达盒几乎不例外地依赖于将它们插入细菌质粒并且在细菌发酵过程中进行扩增。
该现有技术方法在许多方面限制了改进此类DNA药物制备的机会。此外，质粒产物主要是粗DNA分子，因为其包含药用功能不需要的核苷酸序列。因此，在制备DNA产物例如DNA药物的领域中，需要提供用于大量扩增DNA的改进方法。特别是需要提供用于扩增特定形式的DNA例如闭合线状DNA的改进方法。由于闭合线状DNA分子与其他形式的DNA相比具有更高的稳定性和安全性，所以在治疗应用中具有特别的用途。
发明内容
本发明涉及体外、无细胞制备线状共价闭合DNA(闭合线状DNA)的方法。该方法与涉及细胞处理和在质粒内扩增的传统方法相比能够增强线状共价闭合DNA的制备。这显著增加了该方法的生产力并同时降低产品纯化的成本。
根据本发明，在无宿主细胞的条件下用酶从DNA模板制备线状共价闭合DNA。该模板DNA包含至少一个原核端粒酶(protelomerase，一种噬菌体编码的酶)靶序列。使该模板DNA与至少一种DNA聚合酶在促进该模板扩增的条件下在一种或多种引物存在下接触。使从该模板扩增的DNA与至少一种原核端粒酶在促进闭合线状DNA制备的条件下接触。
因此，本发明提供用于制备闭合线状脱氧核糖核酸(DNA)的体外无细胞方法，其包括：
(a)使包含至少一个原核端粒酶靶序列的DNA模板与至少一种DNA聚合酶在一种或多种引物存在下在促进所述模板扩增的条件下接触；和
(b)使(a)中制备的扩增DNA与至少一种原核端粒酶在促进闭合线状DNA制备的条件下接触。
本发明还涉及提供对于本发明方法必要的组分的试剂盒。因此，本发明提供包含至少一种DNA聚合酶和至少一种原核端粒酶以及本发明方法的使用说明的试剂盒。
附图说明
图1：噬菌体中线状共价闭合DNA的复制以及原核端粒酶的作用。A.染色体外噬菌体线状共价闭合DNA的示意图。*＝端粒回文序列的中心。R序列是L序列的反转回文重复。B.宿主内噬菌体DNA的复制：泡表示DNA链复制。对于R和L的互补链的合成得到了相同的双链RL序列。C.在原核端粒酶作用下形成的产物。原核端粒酶结合至RL序列并且在回文序列的中心点切割并连接相反链从而重新形成端粒并且完成原始线状共价闭合DNA的复制。
图2.大肠杆菌噬菌体N15原核端粒酶(TelN)对包含其靶位点telRL的环状双链DNA的作用。TelRL是具有由箭头指出的28bp右臂(telR)和左臂(telL)的反转回文序列。下划线示出的序列表示telRL回文序列中的缺陷。中间22bp的完整反转回文序列TelO对于酶TelN的结合是必需的。TelN在其中点裂解该22bp序列并且将互补序列的末端连接形成共价闭合末端。
图3：比较存在于各种生物体中的原核端粒酶靶序列。加框序列表示完整的或不完整的回文序列的范围。下划线表示该回文序列中的缺陷。突出显示的碱基对序列是所有原核端粒酶靶序列共有的，表明它们对于原核端粒酶结合和发挥作用的重要性。A.大肠杆菌噬菌体N15。B.克雷伯氏菌属(Klebsiella)噬菌体Phi KO2。C.耶尔森菌属(Yersinia)噬菌体Py54。D.盐单胞菌属(Halomonas)噬菌体Phi HAP。E.弧菌属(Vibrio)噬菌体VP882。F.伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)质粒lpB31.16。加框序列表示每一种噬菌体的完整或不完整的回文序列的范围。G.示出了用于噬菌体原核端粒酶结合并发挥作用的共有反转回文序列。其为具有22个碱基对的完整反转重复序列(切割位点每一边各11个碱基对)。该共有序列衍生自A-E的突出显示的保守残基。显示出保守碱基对以及它们在回文序列中的位置。短横线表示序列组成中的可变性，即碱基可能为N(A、T、C或G)的情况。
图4：使用RCA链置换DNA聚合酶以及TelN原核端粒酶体外扩增线状双链共价闭合DNA的具体方法。A.闭合线状DNA模板。R和L表示TelN原核端粒酶结合序列的右臂和左臂的DNA序列。B.起始模板变性形成环状单链DNA。C.引物结合。D-E.通过RCA链置换DNA聚合酶从单链DNA模板进行滚环扩增。F.形成长多联体双链DNA，其包含被原核端粒酶结合序列(RL)分离的单个单元的已扩增模板。G.与对RL序列具有特异性的TelN原核端粒酶接触。原核端粒酶在RL位点裂解多联体DNA并且连接互补链以产生原始线状共价闭合DNA模板的扩增拷贝。
图5：从长双链DNA分子切割表达感兴趣的基因的DNA表达盒以产生闭合线状DNA表达盒。A.线状双链DNA分子，其包含的DNA表达盒包含感兴趣的基因，其两侧侧接原核端粒酶靶序列。B.以线状共价闭合DNA分子切割所述DNA表达盒。
图6：扩增闭合线状DNA和用于“狗骨状(doggybone)”表达盒的报告基因表达。
A.通过琼脂糖凝胶电泳验证RCA扩增的多联体的TelN裂解以形成闭合线状DNA。泳道1-3表示RCA扩增的pUC18。泳道1：3微升未消化的RCA扩增的pUC18。泳道2：2微升用Pvul消化的RCA扩增的pUC18。泳道3：2微升用TelN处理的RCA扩增的pUC18(阴性对照)。泳道4-6表示RCA扩增的pUC18telRL。泳道4：3微升未消化的RCA扩增的pUC18telRL。泳道5：1微升用Pvul消化的RCA扩增的pUC18telRL。泳道6：4微升用TelN处理的RCA扩增的pUC18 telRL。示出了用TelN处理生成的2.7kb闭合线状DNA。两侧的泳道为DNA大小标准物。
B.显示闭合线状DNA对热变性的耐性的Lab-On-A-Chip(LOC)分析。泳道1：DNA大小标准物。泳道2和3：100ng PCR DOG。泳道4和5：100ng变性的PCR DOG。泳道6和7：“狗骨状”DNA-用TelN处理的100ng pGL DOG。泳道6和7：“狗骨状DNA”-用TelN处理并且变性的100ngpGL DOG。
C.通过转染验证闭合线状DNA在细胞内的表达。y轴：平均萤火虫/海肾比(Firefly/Renilla ratio)；x-轴：在转染中使用的线状DNA构建体。PCR pGL：来自luc基因中的pGL4.13的开放线状PCR片段。PCR DOG：用侧接telRL位点的引物从pGL DOG扩增的开放线状PCR片段。“狗MP”：分离自用PvuI消化(除去污染性载体DNA)并且用TelN裂解的小量制备DNA的pGL DOG的闭合线状DNA。“狗RCA”：用PvuI消化并且用TelN裂解的通过RCA扩增的pGL DOG的闭合线状DNA。
序列描述
SEQ ID NO：1是杆菌属噬菌体phi29DNA聚合酶的核酸序列。
SEQ ID NO：2是由SEQ ID NO：1编码的杆菌属噬菌体phi29 DNA聚合酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO：3是火球菌属(Pyrococcus sp)Deep Vent DNA聚合酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO：4是嗜热脂肪芽胞杆菌(Bacillus stearothermophilus)DNA聚合酶I的核酸序列。
SEQ ID NO：5是由SEQ ID NO：4编码的嗜热脂肪芽胞杆菌DNA聚合酶I的氨基酸序列。
SEQ ID NO：6是盐单胞菌属(Halomonas)噬菌体phiHAP-1原核端粒酶核酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO：7是由SEQ ID NO：6编码的盐单胞菌属噬菌体phiHAP-1原核端粒酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO：8是耶尔森菌属(Yersinia)噬菌体PY54原核端粒酶的核酸序列。
SEQ ID NO：9是由SEQ ID NO：8编码的耶尔森菌属噬菌体PY54原核端粒酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO：10是克雷伯氏菌属(Klebsiella)噬菌体phiKO2原核端粒酶的核酸序列。
SEQ ID NO：11是由SEQ ID NO：10编码的克雷伯氏菌属噬菌体phiKO2原核端粒酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO：12是弧菌属(Vibrio)噬菌体VP882原核端粒酶的核酸序列。
SEQ ID NO：13是由SEQ ID NO：12编码的弧菌属噬菌体VP882原核端粒酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO：14是大肠杆菌噬菌体N15原核端粒酶(telN)和二次免疫阻抑物(cA)核酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO：15是由SEQ ID NO：14编码的大肠杆菌噬菌体N15原核端粒酶(telN)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：16是存在于噬菌体原核端粒酶靶序列中的完整反转重复序列的共有核酸序列。
SEQ ID NO：17是来自大肠杆菌噬菌体N15和克雷伯氏菌属噬菌体phiKO2的22碱基完整反转重复核酸序列。
SEQ ID NO：18是来自耶尔森菌属噬菌体PY54的22碱基完整反转重复核酸序列。
SEQ ID NO：19是来自盐单胞菌属噬菌体phiHAP-1的22碱基完整反转重复核酸序列。
SEQ ID NO：20是来自弧菌属噬菌体VP882的22碱基完整反转重复核酸序列。
SEQ ID NO：21是来自伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)质粒lpB31.16的14碱基完整反转重复核酸序列。
SEQ ID NO：22是来自弧菌属噬菌体VP882的24碱基完整反转重复核酸序列。
SEQ ID NO：23是来自耶尔森菌属噬菌体PY54的42碱基完整反转重复核酸序列。
SEQ ID NO：24是来自盐单胞菌属噬菌体phiHAP-1的90碱基完整反转重复核酸序列。
SEQ ID NO：25是包含原核端粒酶靶序列的来自大肠杆菌噬菌体N15的核酸序列。
SEQ ID NO：26是包含原核端粒酶靶序列的来自克雷伯氏菌属噬菌体phiKO2的核酸序列。
SEQ ID NO：27是包含原核端粒酶靶序列的来自耶尔森菌属噬菌体PY54的核酸序列。
SEQ ID NO：28是包含原核端粒酶靶序列的来自弧菌属噬菌体VP882的核酸序列。
SEQ ID NO：29是包含原核端粒酶靶序列的来自伯氏疏螺旋体质粒lpB31.16的核酸序列。
SEQ ID NO：30是用于TelN扩增的经修饰的寡核苷酸引物。
SEQ ID NO：31是用于TelN扩增的经修饰的寡核苷酸引物。
SEQ ID NO：32是包含TelN识别位点telRL的合成寡核苷酸。
SEQ ID NO：33是包含TelN识别位点telRL的合成寡核苷酸。
SEQ ID NO：34是用于PCR DOG扩增的引物序列。
SEQ ID NO：35是用于PCR DOG扩增的引物序列。
具体实施方式
本发明涉及用于制备线状双链共价闭合DNA即闭合线状DNA分子的方法。闭合线状DNA分子通常包括还被描述为发夹环的共价闭合末端，其中互补DNA链之间不存在碱基配对。发夹环连接互补DNA链的末端。这一类型的结构通常形成于染色体的端粒末端，从而通过将末端核苷酸隔离在闭合的结构中防护染色体DNA的丢失或损伤。在本文所述的闭合线状DNA分子的实例中，发夹环侧接互补的碱基配对的DNA链，形成“狗骨”状结构(如图1所示)。
本发明的方法通过并入将扩增的DNA转化成闭合线状DNA的单一加工步骤提供闭合线状DNA分子的高通量制备。此外，本发明的方法在体外、无细胞环境中进行，因此不受限于具有细菌增殖必需的额外序列的DNA模板的使用。如下文所示，本发明方法可因此被用于制备不包含问题载体序列并且特别适用于治疗用途的闭合线状DNA分子。
闭合DNA分子作为治疗药物，即可用于体内表达基因产物的DNA药物，具有特殊的用途。这是因为它们的共价闭合结构可防止诸如核酸外切酶的酶的攻击，导致与具有暴露DNA末端的“开放”DNA分子相比基因表达的稳定性和寿命增强。已证明当引入宿主组织时，线状双链开放末端表达盒就基因表达而言是无效的。这归因于由胞外间隙中的核酸外切酶的作用引起的表达盒的不稳定性。
将DNA末端隔离在共价闭合结构内还具有其他优势。可防止DNA末端整合入基因组DNA，所以闭合线状DNA分子具有提高的安全性。而且，闭合线状结构可防止DNA分子在宿主细胞内的多联体化并且因此能够以更灵敏的方式调节基因产物的表达水平。本发明提供制备闭合线状DNA分子的体外、无细胞方法，其包括模板定向(template-directed)DNA扩增和原核端粒酶对已扩增DNA的特异加工。
典型地，本发明方法可用于在宿主细胞内制备体外表达DNA，特别是DNA疫苗。DNA疫苗通常编码经修饰形式的感染性生物体的DNA。将DNA疫苗给予个体，在个体内它们表达感染性生物体的所选蛋白，引起通常为保护性的对该蛋白质的免疫应答。DNA疫苗还能编码癌症免疫疗法中的肿瘤抗原。
DNA疫苗可包含编码抗原的核酸序列，用于治疗或预防许多病症，包括但不限于癌症、变态反应、毒性和诸如但不限于以下病原体引起的感染：真菌；病毒包括人乳头瘤病毒(HPV)、HIV、HSV2/HSV1、流感病毒(甲型、乙型和丙型)、脊髓灰质炎病毒、RSV病毒、鼻病毒、轮状病毒、甲型肝炎病毒、诺沃克病毒组、肠病毒、星状病毒、麻疹病毒、副流感病毒、腮腺炎病毒、水痘-带状疱疹病毒、细胞巨化病毒、EB病毒、腺病毒、风疹病毒、人T细胞淋巴瘤I型病毒(HTLV-I)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、丁型肝炎病毒、痘病毒、马尔堡病毒以及埃博拉病毒；细菌包括结核分支杆菌、衣原体、淋病奈瑟菌、志贺氏菌、沙门氏菌、霍乱弧菌、梅毒螺旋体、假单胞菌属、百日咳杆菌、布鲁氏菌、土拉弗朗西斯菌、幽门螺旋杆菌、问号钩端螺旋体、嗜肺性军团病杆菌、鼠疫耶尔森菌、链球菌(A型和B型)、肺炎球菌、脑膜炎双球菌、流感嗜血杆菌(b型)、鼠弓形体、弯曲菌、粘膜炎莫拉菌、腹股沟肉芽肿以及放线菌病；真菌病原体包括念珠菌病和曲菌病菌；寄生虫病原体包括绦虫、吸虫、线虫、阿米巴、贾第鞭毛虫、隐孢子虫、血吸虫属、卡氏肺孢子虫、滴虫和旋毛虫。
DNA疫苗可包含编码来自以下成员的抗原的核酸序列：腺病毒科(包括例如人腺病毒)、疱疹病毒科(包括例如HSV-1、HSV-2、EBV、CMV和VZV)、乳多空病毒科(包括例如HPV)、痘病毒科(包括例如天花病毒和牛痘病毒)、微小病毒科(包括例如细小病毒B19)、呼肠孤病毒科(包括例如轮状病毒)、冠状病毒科(包括例如SARS)、黄病毒科(包括例如黄热病、西尼罗病毒、登革热病毒、丙型肝炎病毒和蜱传脑炎病毒)、小核糖核酸病毒科(包括脊髓灰质炎病毒、鼻病毒和甲型肝炎病毒)、披膜病毒科(包括例如风疹病毒)、纤丝病毒科(包括例如马尔堡病毒和埃博拉病毒)、副粘病毒科(包括例如副流感病毒、呼吸道合胞病毒、腮腺炎病毒和麻疹病毒)、弹状病毒科(包括例如狂犬病病毒)、本扬病毒科(包括例如汉坦病毒)、正粘病毒科(包括例如甲型、乙型、丙型流感病毒)、逆转录病毒科(包括例如HIV和HTLV)以及肝脱氧核糖核酸病毒科(包括例如乙型肝炎病毒)。
所述抗原可能来自引起兽病的病原体，特别是可能来自病毒病原体，包括例如呼肠病毒(例如非洲马病病毒或蓝舌病毒)和疱疹病毒(包括马疱疹病毒)。所述抗原可能来自以下病毒之一：口蹄病病毒、蜱传脑炎病毒、登革热病毒、SARS、西尼罗病毒和汉坦病毒。所述抗原可能来自免疫缺陷病毒并且例如可能来自SIV或猫免疫缺陷病毒。
通过本发明方法制备的DNA疫苗还可包含编码肿瘤抗原的核酸序列。肿瘤相关抗原的实例包括但不限于睾丸癌抗原例如MAGE家族成员(MAGE 1、2、3等)、NY-ESO-1和SSX-2，分化抗原例如酪氨酸酶、gp100、PSA、Her-2和CEA，突变的自身抗原以及病毒肿瘤抗原例如来自致癌性HPV型的E6和/或E7。具体肿瘤抗原的其他实例包括MART-1、Melan-A、p97、beta-HCG、GaINAc、MAGE-1、MAGE-2、MAGE-4、MAGE-12、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC18、CEA、DDC、P1A、EpCam、黑素瘤抗原gp75、Hker 8、高分子量黑素瘤抗原、K19、Tyr1、Tyr2、pMel17基因家族成员、c-Met、PSM(前列腺粘蛋白抗原)、PSMA(前列腺特异膜抗原)、前列腺分泌蛋白、甲胎蛋白、CA125、CA19.9、TAG-72、BRCA-1和BRCA-2抗原。
此外，本发明的方法还可制备其他类型的治疗性DNA分子，例如用于基因疗法的那些。例如，当个体患有由基因的功能障碍形式引起的遗传疾病时，此类DNA分子可用于表达功能基因。此类疾病的实例包括进行性假肥大性肌营养不良、纤维囊泡症、高歇病(Gaucher’Disease)和腺苷脱氨酶(ADA)缺陷症。可使用基因疗法的其他疾病包括炎性疾病、自身免疫病、慢性和传染性疾病，包括诸如以下病症：AIDS、癌症、神经性疾病、心血管疾病、高胆固醇血症、各种血液病包括各种贫血、珠蛋白生成障碍性贫血和血友病以及肺气肿。对于实体瘤的治疗，可表达编码毒性肽(即诸如篦麻毒素、白喉毒素和眼镜蛇蛇毒因子的化疗药物)、肿瘤抑制基因例如p53、编码与转化癌基因反义的mRNA序列的基因、抗肿瘤肽例如肿瘤坏死因子(TNF)和其他细胞因子，或转化癌基因的反式显性负突变体。
还设想通过本发明方法制备其他类型的治疗性DNA分子。例如，可根据本发明方法制备转录成活性RNA形式例如小干扰RNA(siRNA)的DNA分子。
在涉及制备具有治疗用途的DNA分子的实施方式中，DNA模板通常包括包含一个或多个启动子或增强子元件和编码感兴趣的mRNA或蛋白质的基因或其他编码序列的表达盒。在涉及生成DNA疫苗分子或用于基因疗法的DNA分子的具体实施方式中，所述DNA模板包含由与编码感兴趣的蛋白质的序列可操作地连接的真核启动子以及可选的增强子和/或真核转录终止序列组成的表达盒。通常，所述DNA模板为通常用于容纳基因的载体形式，例如染色体外遗传元件例如质粒。
“启动子”为起始并调节多聚核苷酸转录的核苷酸序列。启动子包括诱导型启动子(与该启动子可操作地连接的多聚核苷酸序列的表达受到分析物、辅因子、调节蛋白等的诱导)、阻抑启动子(与该启动子可操作地连接的多聚核苷酸序列的表达受到分析物、辅因子、调节蛋白等的阻抑)和组成型启动子。术语“启动子”或“控制元件”意图包括全长启动子区和这些区的功能性(例如控制转录或翻译)片段。
“可操作地连接”指元件的一种排列，其中如此描述的组分被设置成能够执行它们的正常功能。因此，与核酸序列可操作地连接的特定启动子在适合的酶存在下能够引起该序列的表达。只要能够引导序列的表达，启动子不一定与该序列毗连。因此，例如，在启动子序列和核酸序列之间可以存在间插的不翻译但是却可以被转录的序列，并且仍然认为该启动子序列与编码序列“可操作地连接”。因此，术语“可操作地连接”意图包括在转录复合物识别启动子元件之后，能够起始(引发)感兴趣的DNA序列的转录的启动子元件和感兴趣的DNA序列的任意间隔或方向性。
根据本发明，通过原核端粒酶对从包含至少一个原核端粒酶靶序列的DNA模板扩增的DNA的作用生成闭合线状DNA分子。原核端粒酶靶序列是存在于DNA模板中使得能够通过原核端粒酶的酶活性将其转化成闭合线状DNA的任何DNA序列。换言之，原核端粒酶靶序列对于通过原核端粒酶裂解并再连接双链DNA以形成共价闭合线状DNA是必需的。
典型地，原核端粒酶靶序列包括任何完整回文序列，即任何具有双重旋转对称的双链DNA序列，在本文中还被称作完整反转重复序列。如图3所示，来自各种常温噬菌体以及细菌质粒的原核端粒酶靶序列均具有包含完整反转重复序列的共有特征。完整反转重复序列的长度视具体生物体而不同。在伯氏疏螺旋体中，完整反转重复序列的长度为14个碱基对。在各种常温噬菌体中，完整反转重复序列的长度为22个碱基对或更长。此外，在一些情况下，例如大肠杆菌N15，中心完整反转回文序列侧接反转重复顺序，即形成了更大的不完整反转回文序列的一部分(见图2和3；具有下划线的碱基表明该反转重复序列的对称被中断)。
如本发明中所使用的原核端粒酶靶序列优选包含长度至少为14个碱基对的双链回文(完整反转重复)序列。优选的完整反转重复序列包括SEQ ID NOs：16-21的序列及其变异体。SEQ ID NO：16(NCATNNTANNCGNNTANNATGN)为常温噬菌体完整反转重复序列的22碱基共有序列。如图3所示，不同噬菌体之间的完整反转重复序列的碱基对在某些位点是保守的，而在其他位点可能存在序列可变性。因此，SEQID NO：16是与本发明方法中的噬菌体原核端粒酶一起使用的完整反转重复序列的最小共有序列。
由SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17(CCATTATACGCGCGTATAATGG)确定的共有序列内存在与大肠杆菌噬菌体N15(SEQ ID NO：15)和克雷伯氏菌属噬菌体Phi KO2(SEQ ID NO：11)原核端粒酶一起使用的特别优选的反转重复序列。而且由SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18-20：
SEQ ID NO：18(GCATACTACGCGCGTAGTATGC)，
SEQ ID NO：19(CCATACTATACGTATAGTATGG)，
SEQ ID NO：20(GCATACTATACGTATAGTATGC)，
确定的共有序列中存在与来自耶尔森菌属噬菌体PY54(SEQ ID NO：9)、盐单胞菌属噬菌体phiHAP-1(SEQ ID NO：7)和弧菌属噬菌体VP882(SEQID NO：13)一起使用的特别优选的完整反转重复序列。SEQ ID NO：21(ATTATATATATAAT)是与伯氏疏螺旋体原核端粒酶一起使用的特别优选的完整反转重复序列。该完整反转重复序列来自包含于伯氏疏螺旋体内的线状共价闭合质粒lpB31.16。该14碱基序列短于噬菌体(SEQ ID NO：16)的22bp共有完整反转重复序列，表明细菌原核端粒酶与噬菌体原核端粒酶在具体靶序列要求上存在差异。然而，所有的原核端粒酶靶序列均具有完整反转重复序列的共有结构基序。
所述完整反转重复序列的长度可大于22bp，视用于本发明方法中的具体原核端粒酶的要求而定。因此，在一些实施方式中，所述完整反转重复序列的长度为至少30、至少40、至少60、至少80或至少100个碱基对。此类完整反转重复序列的实例包括SEQ ID NO：22-24及其变异体。
SEQ ID NO：22(GGCATACTATACGTATAGTATGCC)
SEQ ID NO：23
(ACCTATTTCAGCATACTACGCGCGTAGTATGCTGAAATAGGT)
SEQ ID NO：24
(CCTATATTGGGCCACCTATGTATGCACAGTTCGCCCATACTATACGTATAGTATGGGCGAACTGTGCATACATAGGTGGCCCAATATAGG)
SEQ ID NO：22-24及其变异体特别优选分别与来自弧菌属噬菌体VP882(SEQ ID NO：13)、耶尔森菌属噬菌体PY54(SEQ ID NO：9)和盐单胞菌属噬菌体phi HAP-1(SEQ ID NO：7)的原核端粒酶一起使用。
完整反转重复序列侧接另外的反转重复序列。该侧接的反转重复序列可为完整的或不完整的重复序列，即可为完全对称或部分对称。该侧接的反转重复序列可与中心回文序列毗连或不毗连。原核端粒酶靶序列可包括包含长度至少为14个碱基对的完整反转重复序列的不完整反转重复序列。一个实例为SEQ ID NO：29。所述不完整反转重复序列可包含长度至少为22个碱基对的完整反转重复序列。一个实例为SEQ ID NO：25。
特别优选的原核端粒酶靶序列包括SEQ ID NO：25-29的序列及其变异体。
SEQ ID NO：25
(TATCAGCACACAATTGCCCATTATACGCGCGTATAATGGACTATTGTGTGCTGATA)
SEQ ID NO：26
(ATGCGCGCATCCATTATACGCGCGTATAATGGCGATAATACA)
SEQ ID NO：27
(TAGTCACCTATTTCAGCATACTACGCGCGTAGTATGCTGAAATAGGTTACTG)
SEQ ID NO：28
(GGGATCCCGTTCCATACATACATGTATCCATGTGGCATACTATACGTATAGTATGCCGATGTTACATATGGTATCATTCGGGATCCCGTT)
SEQ ID NO：29
(TACTAAATAAATATTATATATATAATTTTTTATTAGTA)
SEQ ID NO：25-29的序列包含如上文所述的完整反转重复序列并且另包含来自相关生物体的侧接序列。包含SEQ ID NO：25的序列及其变异体的原核端粒酶靶序列优选与SEQ ID NO：15的大肠杆菌N15 TelN原核端粒酶及其变异体组合使用。包含SEQ ID NO：26的序列或其变异体的原核端粒酶靶序列优选与SEQ ID NO：11的克雷伯氏菌属噬菌体Phi K02原核端粒酶及其变异体组合使用。包含SEQ ID NO：27的序列或其变异体的原核端粒酶靶序列优选与SEQ ID NO：9的耶尔森菌属噬菌体PY54原核端粒酶及其变异体组合使用。包含SEQ ID NO：28的序列或其变异体的原核端粒酶靶序列优选与SEQ ID NO：13的弧菌属噬菌体VP882原核端粒酶及其变异体组合使用。包含SEQ ID NO：29的序列或其变异体的原核端粒酶靶序列优选与伯氏疏螺旋体原核端粒酶组合使用。
上文所述任何回文序列或原核端粒酶靶序列的变异体包括其同源物或突变体。突变体包括相对于天然序列的截短、置换或缺失。变异体序列是存在于DNA模板中使得能够通过原核端粒酶的酶活性将其转化成闭合线状DNA的任何序列。这可通过使用用于闭合线状DNA形成的适当的测定法容易地确定。可使用本领域描述的任何适合的测定法。适合的测定法的实例描述于Deneke等人，PNAS(2000)97，7721-7726。优选地，所述变异体能够使原核端粒酶结合并且具有与所观察到的天然序列的活性可比的活性。本文所述回文序列的优选变异体的实例包括保留了完整重复结构并且仍然能够促使形成闭合线状DNA的截短的回文序列。然而，只要能够充当原核端粒酶活性的底物，可修饰变异体原核端粒酶靶序列从而使得它们不再保留完整的回文序列。
应理解技术人员根据上文所列结构原理能够容易地鉴定用于本发明的适合的原核端粒酶靶序列。可使用上文所述测定法筛选候选原核端粒酶靶序列促进形成闭合线状DNA的能力。
所述DNA模板可包含多于一个原核端粒酶靶序列，例如两个、三个、四个、五个、十个或更多个原核端粒酶靶序列。使用多个原核端粒酶靶序列使得能够从较大的DNA分子剪切包含感兴趣的序列的短闭合线状DNA。具体而言，可将原核端粒酶靶序列侧接到DNA模板中的一个或多个感兴趣的序列的任一侧(即5’和3’)。两个侧接原核端粒酶序列可接着在原核端粒酶的作用下(如图5所示)介导从已扩增的DNA以闭合线状DNA剪切各感兴趣的短序列。所述DNA模板可包含一个或多个在任一侧侧接原核端粒酶靶序列的感兴趣的序列(优选表达盒)。所述DNA模板可包含两个、三个、四个、五个或更多个如上文所述侧接原核端粒酶靶序列的感兴趣的序列。
在优选的实施方式中，本发明的方法使用包含在任一侧侧接原核端粒酶靶序列的表达盒的DNA模板。该表达盒优选包含与感兴趣的编码序列可操作地连接的真核启动子和可选地真核转录终止序列。在该实施方式中，根据本发明扩增模板DNA并且与原核端粒酶接触后，以闭合线状DNA从扩增的模板释放表达盒。结果同时从产物中去除了模板DNA中的不必要序列。
这些不必要的或额外的序列(还被称作细菌或载体序列)包括细菌的复制起点、细菌的选择标记(例如抗生素抗性基因)以及未甲基化的CpG二核苷酸。这些序列的缺失产生了不包含额外遗传物质的“最小的”表达盒。此外，该类型的细菌序列会在一些治疗方法中引起问题。例如，在哺乳动物细胞中，细菌/质粒DNA会引起克隆基因关闭使得不能实现感兴趣的蛋白质的持续表达。而且，用于细菌增殖中的抗生素抗性基因可引起对人类健康的威胁。另外，细菌质粒/载体DNA会触发不利的非特异的免疫应答。细菌DNA序列的一个特异性质即通常被称作CpG基序的未甲基化的胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸的存在还可能导致不期望的免疫应答。
在一些实施方式中，特别是闭合线状DNA产物为DNA疫苗时，可在产物序列中保留CpG基序。这是因为它们对编码蛋白质的免疫应答具有有益的辅助作用。
因此，本发明提供制备闭合线状表达盒DNA的体外方法。该方法包括：a)使包含至少一个在任一侧侧接原核端粒酶靶序列的表达盒的DNA模板与至少一种DNA聚合酶在促进所述模板扩增的条件下在一种或多种引物存在下接触；和b)使a)中制备的已扩增的DNA与至少一种原核端粒酶在促进闭合线状表达盒DNA形成的条件下接触。所述闭合线状表达盒DNA产物可包含与感兴趣的编码序列可操作地连接的真核启动子和可选地真核转录终止序列，或由它们组成或基本由它们组成。所述闭合线状表达盒DNA产物可另外缺少一个或多个细菌或载体序列，其通常选自：(i)细菌复制起点；(ii)细菌选择标记(通常为抗生素抗性基因)和(iii)未甲基化的CpG基序。
如上文所述，可根据本发明方法扩增任何包含至少一种原核端粒酶靶序列的DNA模板。因此，尽管优选DNA疫苗产物和其他治疗性DNA分子的制备，但是本发明方法可用于制备任何类型的闭合线状DNA。所述DNA模板可为双链(ds)或单链(ss)DNA。双链DNA模板可为开放环状双链DNA、闭合环状双链DNA、开放线状双链DNA或闭合线状双链DNA。优选地，所述模板为闭合环状双链DNA。特别优选与RCA DNA聚合酶一起使用闭合环状dsDNA模板。环状dsDNA模板可为通常用于容纳用于细菌增殖基因的质粒或其他载体形式。因此，本发明方法可用于扩增任何商购质粒或其他载体，例如商购DNA药物并且接着将扩增的载体DNA转化成闭合线状DNA。
当DNA聚合酶是能够起始从带切口DNA链的扩增的链置换聚合酶时，可将开放环状dsDNA用作模板。在该实施方式中，预先将所述模板与一种或多种在一个或多个位点切割该模板内的DNA链的酶温育。还可将闭合线状dsDNA用作模板。该闭合线状dsDNA模板(起始物质)可与闭合线状DNA产物相同。当将闭合线状DNA用作模板时，可将其在变性条件下温育以在促进所述模板DNA扩增的条件之前或之中形成单链环状DNA。
如上所述，DNA模板通常包含如上文所述的表达盒，即包含与编码感兴趣的蛋白质的序列可操作地连接的真核启动子和可选地真核转录终止序列，或由它们组成或基本由它们组成。可选地所述表达盒为如上文定义的最小表达盒，即缺失一个或多个细菌或载体序列，其通常选自：(i)细菌复制起点；(ii)细菌选择标记(通常为抗生素抗性基因)和(iii)未甲基化的CpG基序。
可通过本领域已知的任何方法提供足够用于本方法的量的DNA模板。例如，可通过聚合酶链式反应(PCR)制备所述DNA模板。当DNA模板是dsDNA时，通过预先在至少94摄氏度的温度下温育以提供用于扩增步骤的变性单链。因此，本发明方法优选包括将dsDNA模板变性以提供单链DNA的步骤。或者，可以双链形式提供所述dsDNA模板。可在该反应中扩增完整的DNA模板或其所选部分。
使DNA模板与至少一种DNA聚合酶在促进所述模板扩增的条件下接触。可使用任何DNA聚合酶。任何商购DNA聚合酶均适用于本发明方法。可使用两种、三种、四种、五种或更多种不同的DNA聚合酶，例如具有校正功能者和一种或多种不具有该功能的其他DNA聚合酶。可使用具有不同作用机制的DNA聚合酶，例如链置换型聚合酶和通过其他方法复制DNA的DNA聚合酶。不具有链置换活性的DNA聚合酶的适合的实例为T4 DNA聚合酶。
优选DNA聚合酶是高度稳定的，从而使得处理条件下的长时间温育基本不会降低其活性。因此，该酶优选在包括但不限于温度和pH的多种处理条件下具有长半衰期。还优选DNA聚合酶具有一种或多种适合制备方法的特性。该DNA聚合酶优选具有高保真度，例如具有校正活性。此外，优选DNA聚合酶表现出高核苷酸掺入效率、高链置换活性以及对dNTP和DNA的低Km。DNA聚合酶能够利用环状和/或线状DNA作为模板。DNA聚合酶能够利用dsDNA或ssdNA作为模板。优选DNA聚合酶不表现出非特异的外切核酸酶活性。
技术人员可通过与商购DNA聚合酶所表现出的特性进行比较以确定特定的DNA聚合酶是否表现出如上文所定义的特性，所述商购DNA聚合酶是例如phi29、
和嗜热脂肪芽胞杆菌(Bst)DNA聚合酶I，分别为SEQ ID NOs：2、3和5。Bst DNA聚合酶I可商购自New EnglandBiolabs，Inc。当提及高核苷酸掺入效率时，这通常表示每一次与模板结合/分离时，DNA聚合酶加入核苷酸的平均数量，即一次结合事件获得的引物延长的长度。
优选链置换型聚合酶。优选的链置换型聚合酶是Phi 29(SEQ ID NO：2)、Deep
(SEQ ID NO：3)和Bst DNA聚合酶I(SEQ ID NO：5)或任何一种的变异体。SEQ ID NO：2、3和5的变异体如下文相对于原核端粒酶进行定义。术语“链置换”在本文中用于描述在DNA合成中遇到双链DNA区时DNA聚合酶置换互补链的能力。应理解链置换扩增法与基于PCR的方法的差异在于变性循环对于有效的DNA扩增不是必需的，因为双链DNA不会阻碍新DNA链的持续合成。相反，PCR法在扩增过程中需要变性循环(即将温度升高至94摄氏度或更高)以熔化双链DNA并提供新的单链模板。
用于本发明方法中的链置换DNA聚合酶优选具有至少20kb、更优选至少30kb、至少50kb或至少70kb或更大的核苷酸掺入率(引物延伸长度)。在特别优选的实施方式中，链置换DNA聚合酶具有与phi29聚合酶可比的或更大的核苷酸掺入效率。
优选的链置换复制方法是滚环扩增(RCA)。术语RCA描述RCA-型DNA聚合酶(在本文中还称作RCA聚合酶)持续沿着环状DNA模板向前移位同时延伸杂交引物的能力。这导致形成具有已扩增DNA的多个重复的线状单链产物。这些线状单链产物充当多次杂交、引物延伸和链置换事件的基础，导致形成多联体双链DNA产物，其再次包含扩增DNA的多个重复。因此在多联体双链DNA产物中存在每一个已扩增的“单个单元”DNA的多个拷贝。
特别优选将RCA聚合酶用于本发明的方法中。RCA-型链置换复制过程的产物通常需要进行复杂的加工以释放单个单元DNA。有利的是，根据本发明，使用原核端粒酶催化功能使得能够在单一步骤中进行该加工。使用原核端粒酶还可直接生成所需的闭合线状DNA结构而不需要另外的加工步骤以形成具有这一结构的分子。
为了能够根据本发明进行扩增，优选使DNA模板与一种或多种引物接触。所述引物可为非特异性的(即序列是随机的)或对包含于DNA模板内的一个或多个序列具有特异性。优选所述引物为随机序列从而能够在DNA模板上的任何位点进行非特异起始。这使得能够通过多次起始反应从每一条模板链进行高效率扩增。随机引物的实例为六聚体、七聚体、八聚体、九聚体、十聚体或长度更长例如12、15、18、20或30个核苷酸的序列。随机引物的长度可为6-30、8-30或12-30个核苷酸。通常以代表例如DNA模板中的六聚体、七聚体、八聚体或九聚体的所有可能组合的寡核苷酸混合物提供随机引物。
在其他实施方式中，所述引物是特异性的。这意味着它们具有与需要从其起始扩增的DNA模板中的序列互补的序列。在该实施方式中，可使用一对引物特异扩增位于两个引物结合位点之间的一部分DNA模板。引物可为非标记的或包含一个或多个标记，例如放射性核素或荧光染料。引物还可包含化学修饰的核苷酸。通常基于温度考虑选择引物长度/序列，即在用于扩增步骤的温度下能够结合模板。
DNA模板与DNA聚合酶以及一种或多种引物接触发生在促进引物与DNA模板复性的条件下。该条件包括存在使引物能够杂交的单链DNA。所述条件还包括使引物能够与模板复性的温度和缓冲液。可根据引物性质选择合适的复性/杂交条件。用于本发明的优选的复性条件的实例是缓冲液30mM Tris-HCl pH 7.5、20mM KCl、8mM MgCl2。可在变性之后通过逐渐冷却至所需反应温度进行复性。
一旦DNA模板与DNA聚合酶以及一种或多种引物接触，接下来是在促进所述模板扩增的条件下的温育步骤。优选地，所述条件通过另一条链的链置换复制来置换被复制链从而促进所述模板的扩增。所述条件包括使用允许DNA扩增的任何温度，通常为20-90摄氏度。优选的温度范围为约20-约40摄氏度或约25-约35摄氏度。
通常，基于具体DNA聚合酶具有最佳活性的温度选择适合的温度。这一信息容易获得并且为技术人员公知的部分。例如，当使用phi29 DNA聚合酶时，适合的温度范围是约25-约35摄氏度，优选约30摄氏度。技术人员通常能够确定根据本发明方法进行有效扩增的适合的温度。例如，可在一定的温度范围内进行该方法并且可监测扩增DNA的产率以确定给定DNA聚合酶的最佳温度范围。
促进DNA模板扩增的其他条件包括存在DNA聚合酶以及一种或多种引物。所述条件还包括存在所有四种dNTP即ATP、TTP、CTP和GTP、适合的缓冲剂/pH以及酶性能或稳定性所要求的其他因素。适合的条件包括本领域已知的用于提供DNA聚合酶活性的任何条件。
例如，pH可在3-10，优选5-8的范围内或约为7，例如约为7.5。通过使用一种或多种缓冲剂将pH维持在这一范围内。此类缓冲剂包括但不限于MES、Bis-Tris、ADA、ACES、PIPES、MOBS、MOPS、MOPSO、Bis-Tris丙烷、BES、TES、HEPES、DIPSO、TAPSO、Trizma、HEPPSO、POPSO、TEA、EPPS、Tricine、Gly-Gly、Bicine、HEPBS、TAPS、AMPD、TABS、AMPSO、CHES、CAPSO、AMP、CAPS、CABS、磷酸盐、柠檬酸-磷酸氢钠、柠檬酸-柠檬酸钠、醋酸钠-醋酸、咪唑以及碳酸钠-碳酸氢钠。该反应还可包含二价金属盐例如但不限于镁(Mg2+)和锰(Mn2+)盐，包括氯化物、醋酸盐和硫酸盐。还可包含一价金属盐，例如钠盐和钾盐，例如氯化钾。还可包含其他盐例如铵盐特别是硫酸铵。
还可包含去污剂。适合的去污剂的实例包括Triton X-100、Tween 20以及每一种的衍生物。还可在该反应中包含稳定剂。可使用任何适合的稳定剂，特别是牛血清白蛋白(BSA)和其他稳定化蛋白质。还可通过加入松弛DNA并且使模板变性更容易的物质改进反应条件。此类物质包括例如二甲基亚砜(DMSO)、甲酰胺、甘油和甜菜碱。
应理解技术人员能够基于他们的公知常识修饰并且优化用于本发明方法的扩增和温育条件。同样可基于本领域已有的实例选择特定物质的具体浓度并且基于公知常识进一步优化。用于本领域中基于RCA的方法的适合的反应缓冲液的实例为50mM Tris HCl pH 7.5、10mM MgCl2、20mM(NH4)2SO4、5％甘油、0.2mM BSA、1mM dNTPs。用于本发明的RCA扩增中的优选反应缓冲液为35mM Tris-HCl、50mM KCl、14mM MgCl2、10mM(NH4)2SO4、4mM DTT、1mM dNTP。该缓冲液特别适合与phi29 RCA聚合酶一起使用。
所述反应条件还可包括使用一种或多种另外的蛋白质。可在至少一种焦磷酸酶例如酵母无机焦磷酸酶存在下扩增DNA模板。可使用两种、三种、四种、五种或更多种不同的焦磷酸酶。这些酶能够在链复制过程中降解由DNA聚合酶从dNTP生成的焦磷酸。反应中焦磷酸盐的积累会引起对DNA聚合酶的抑制并且降低DNA扩增的速度和效率。焦磷酸酶能够将焦磷酸盐降解成非抑制性的磷酸盐。用于本发明方法中的适合的焦磷酸酶的实例为酿酒酵母焦磷酸酶，可商购自New England Biolabs，Inc。
可将任何单链结合蛋白(SSBP)用于本发明方法中以稳定单链DNA。SSBP是活细胞中的必要组分并且参与涉及ssDNA的所有过程，例如DNA复制、修复和重组。在这些过程中，SSBP结合至暂时形成的ssDNA并且辅助稳定ssDNA结构。用于本发明方法中适合的SSBP的实例为T4基因32蛋白，可商购自New England Biolabs，Inc。
除了扩增步骤之外，本发明方法还包括制备闭合线状DNA的加工步骤。使扩增的DNA与至少一种原核端粒酶在促进闭合线状DNA制备的条件下接触。该基于原核端粒酶的单一加工步骤优于用于制备闭合线状DNA分子的其他方法。可同时或并行进行扩增和加工步骤。然而，优选按次序进行扩增和加工步骤，在扩增步骤之后进行加工步骤(即对扩增的DNA进行加工)。
用于本发明的原核端粒酶为能够裂解并且再连接包含原核端粒酶靶位点以制备共价闭合线状DNA分子的任何多肽。因此，所述原核端粒酶具有DNA裂解和连接功能。具有原核端粒酶-型活性的酶还被描述为端粒解离酶(例如在伯氏疏螺旋体中)。原核端粒酶的典型底物为环状双链DNA。如果该DNA包含原核端粒酶靶位点，该酶能够在该位点切割该DNA并且连接末端形成线状双链共价闭合DNA分子。对原核端粒酶靶位点的要求如上文所述。还如上文所述，可使用本领域记载的任何适合的测定法测定特定多肽催化从包含原核端粒酶靶位点的模板生成闭合线状DNA的能力。
已记载了噬菌体中的原核端粒酶。在一些溶原性细菌中，噬菌体以染色体外DNA存在，其包含具有共价闭合末端的线状双链。该DNA的复制以及共价闭合末端(或端粒末端)的维持依赖于原核端粒酶的活性。原核端粒酶在病毒DNA复制中的作用显示于图1。该催化活性的一个实例为来自感染大肠杆菌的N15噬菌体的酶TelN。TelN识别环状双链DNA中的特异核苷酸序列。该序列是被称作telRL的略微不完整的反转回文结构，其包含telR和telN两个一半，侧接22碱基对反转完整重复序列(telO)(见图2)。通过作用于线状原噬菌体DNA的特异DNA聚合酶的初始活性在环状双链DNA中形成两个telRL位点。TelN将该环状DNA转化成两个相同的线状原噬菌体DNA分子，完成了复制循环。telR和telL包括线状原噬菌体DNA的闭合末端，使得能够进一步以相同的方式复制DNA。
本发明方法要求使用至少一种原核端粒酶。本发明方法可包括使用多于一种原核端粒酶，例如两种、三种、四种、五种或更多种不同的原核端粒酶。适合的原核端粒酶的实例包括来自噬菌体的那些，例如来自海水盐单胞菌的phiHAP-1(SEQ ID NO：7)、来自小肠炎耶尔森菌属(Yersiniaenterolytica)的PY54(SEQ ID NO：9)、来自催产克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)的phiKO2(SEQ ID NO：11)、来自弧菌属的VP882(SEQ ID NO：13)以及来自大肠杆菌的N15(SEQ ID NO：15)，或任何一种的变异体。特别优选使用噬菌体N15原核端粒酶(SEQ ID NO：15)或其变异体。
SEQ ID NO：7、9、11、13和15的变异体包括它们的同源物或突变体。突变体包括相对于天然序列的截短、置换或缺失。变异体必需能够从包含如上所述的原核端粒酶靶位点的模板制备闭合线状DNA。
本文提及的任何同源物通常为功能性同源物并且通常与天然蛋白质的相关区域具有至少40％的同源性。例如UWGCG软件包提供了可用于计算同源性(例如使用其默认设置)的BESTFIT程序(Devereux等人，(1984)Nucleic Acids Research 12，387-395)。PILEUP和BLAST算法可用于计算同源性或比对序列(通常使用它们的默认设置)，如Altschul S.F.(1993)J MolEvol 36：290-300；Altschul，S，F等人，(1990)J Mol Biol 215：403-10中所记载。进行BLAST分析的软件可通过美国国家生物技术信息中心(NationalCenter Biotechnology Information)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公开获得。
BLAST算法进行两个序列之间相似性的统计学分析；参见，例如，Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5787。BLAST提供的相似性的一个量度为最小相加概率(P(N))，其指明两条核苷酸或氨基酸序列之间匹配的概率。例如，当第一条序列与第二条序列的最小相加概率小于1，优选小于约0.1，更优选小于约0.01，并且最优选小于约0.001时，认为一序列与另一序列相似。
变异体多肽包含(或由其组成)与天然蛋白质具有至少40％一致性的序列。在优选的实施方式中，变异体序列在至少20、优选至少30例如至少40、60、100、200、300、400或更多个连续氨基酸或甚至该变异体的全部序列上与原始蛋白质具有至少55％、65％、70％、75％、80％、85％、90％并且更优选至少95％、97％或99％同源性。或者，变异体序列与全长天然蛋白质具有至少55％、65％、70％、75％、80％、85％、90％并且更优选至少95％、97％或99％同源性。通常变异体序列与天然蛋白质的相关区域的差异至少为或小于2、5、10、20、40、50或60处突变(每一处均可为置换、插入或缺失)。本发明的变异体序列与全长天然蛋白质的具体区域的一致性百分数可能与上文所提及的任何序列长度内的任何具体的同源性百分数数值相同(即其具有至少40％、55％、80％或90％并且更优选至少95％、97％或99％一致性)。
天然蛋白质的变异体还包括截短形式。可使用任何截短形式只要该变异体仍能够产生如上文所述的闭合线状DNA。通常制备截短形式以除去对于催化活性不必要的和/或不影响已折叠蛋白质构象特别是活性位点折叠的序列。还可选择截短形式以提高原核端粒酶多肽的溶解性。可通过从N端或C端系统性截短不同长度的序列常规鉴定适合的截短形式。
天然蛋白质的变异体还包括相对于天然蛋白质的具体区域具有一个或多个例如2、3、4、5-10、10-20、20-40或更多个氨基酸插入、置换或缺失的变异体。优选在催化结构域之外进行缺失和插入。通常在衍生自天然蛋白质的序列的N-或C-端进行插入，例如用于重组表达。还通常在对于催化活性不必要和/或不影响已折叠蛋白质构象的区域进行置换。可进行此类置换以提高酶的稳定性或其他特性。尽管在一般情况下不是优选的，还可在活性位点或在中心外围(second sphere)即影响或接触活性位点内的一个或多个氨基酸的位置或方向的残基上进行置换。可进行这些置换以提高催化性质。
置换优选引入一个或多个保守变化，用具有相似的化学结构、相似的化学性质或相似的侧链体积的其他氨基酸替换氨基酸。被引入的氨基酸与它们所取代的氨基酸具有相似的的极性、亲水性、疏水性、碱性、酸性、中性或电荷。或者，所述保守变化可在原本为芳香族或脂肪族氨基酸的位置引入另一芳香族或脂肪族氨基酸。保守氨基酸变化为本领域熟知并且可根据表A中定义的20种氨基酸的性质进行选择。
表A-氨基酸的化学性质
特别优选所述变异体能够以与天然蛋白质可比或相同的效率产生如上文所述的闭合线状DNA。
如上文所述，优选通过链置换DNA聚合酶，更优选RCADNA聚合酶实现根据本发明方法的DNA扩增。在体外无细胞方法中组合使用RCADNA聚合酶和原核端粒酶使得闭合线状DNA的制备具有令人惊奇的效率和简单性。
如上文所述，首先在链置换反应中形成长的线状单链DNA分子，其接着充当新的模板从而使得形成双链分子(图4)。该双链分子包含通过链置换聚合酶的核苷酸掺入作用形成的扩增DNA的一系列连续的串联单位(多联体)。这些多联体DNA产物包括已扩增模板DNA的多个重复。因此在本发明方法中生成的多联体包含多个单位的从DNA模板扩增的序列。所述多联体可包含10、20、50、100、200、500或1000或更多个单位的扩增序列，视被扩增的单个单元的长度而定。多联体的大小可为至少5kb、至少10kb、至少20kb、更优选至少30kb、至少50kb或至少70kb或更大。
在许多实施方式中，例如在DNA药物的制备中，需要以单个单元使用扩增的DNA。因此，需要将此类多联体进行加工以释放单个单元的扩增DNA。为了将该多联体DNA转化成单个单元的扩增DNA，需要将其准确地切割并且需要延长配对链的末端。通常，这可通过在DNA模板中掺入限制性内切酶位点实现。因此，可将限制性核酸内切酶与多联体温育以在它们的识别位点进行裂解并且释放单个单元。可接着将通过限制性内切核酸酶的作用形成的开放线状双链DNA与DNA连接酶温育以共价闭合单个单元DNA。
根据本发明，通过使用一种酶即原核端粒酶实现将多联体DNA加工成闭合线状单个单元DNA。这代表了生成闭合线状DNA分子方法中的有利的简单性和经济性。首先，通过与单一的酶温育实现单个单元的裂解和再连接。第二，以具有所需闭合线状结构的形式释放单个单元，因此不需要另外的步骤用于生成该结构(即形成共价闭合环状单个单元DNA)。
将从DNA模板扩增的DNA与至少一种原核端粒酶在促进闭合线状DNA制备的条件下温育。换言之，所述条件促进包含原核端粒酶靶序列的双链DNA的裂解和再连接以形成具有发夹末端的共价闭合线状DNA。促进闭合线状DNA制备的条件包括使用允许制备闭合线状DNA的任何温度，通常在20-90摄氏度的范围内。温度优选在25-40摄氏度的范围内，例如约25-约35摄氏度，或约30摄氏度。可根据上文所列与DNA聚合酶的温度条件相关的原理选择具体原核端粒酶的适当温度。与SEQ ID NO：15的大肠杆菌噬菌体TelN原核端粒酶一起使用的适合的温度是约25-约35摄氏度，例如约30摄氏度。
促进闭合线状DNA制备的条件还包括存在原核端粒酶和适合的缓冲剂/pH以及对酶的性能和稳定性必需的其他因素。适合的条件包括本领域已知的用于提供原核端粒酶活性的任何条件。例如，当使用大肠杆菌噬菌体TelN原核端粒酶时，适合的缓冲剂为20mM TrisHCl，pH 7.6；5mMCaCl2；50mM谷氨酸钾；0.1mM EDTA；1mM二硫苏糖醇(DTT)。还可选择针对DNA聚合酶所列的那些选择用于维持最佳活性和稳定性的试剂和条件。
在一些实施方式中，可能使用与用于DNA扩增的相同的条件提供原核端粒酶活性。具体而言，已记载当同时或并行进行DNA扩增和原核端粒酶加工时使用相同的条件。在其他实施方式中，当所使用的提供最佳DNA聚合酶活性的条件导致次最佳的原核端粒酶活性时有必要改变反应条件。可通过过滤、透析和本领域已知的其他方法实现除去特定试剂和改变反应条件。技术人员应能够容易地鉴定提供最佳DNA聚合酶活性和/或原核端粒酶活性的条件。
在特别优选的实施方式中，通过RCA DNA聚合酶优选phi29扩增DNA，进行DNA扩增的缓冲条件与以下条件基本相同或基本由其组成：35mM Tris-HCl、50mM KCl、14mM MgCl2、10mM(NH4)2SO4、4mM DTT、1mM dNTP，温度为25-35摄氏度例如约30摄氏度。接着优选用TelN和/或优选在与以下条件基本相同或基本由其组成的缓冲条件下实现用原核端粒酶进行的加工步骤：20mM TrisHCl，pH 7.6；5mM CaCl2；50mM谷氨酸钾；0.1mM EDTA；1mM二硫苏糖醇(DTT)，温度为25-35摄氏度例如约30摄氏度。
所有用于本发明方法的酶和蛋白质可为例如在细菌中重组制备。可使用技术人员已知的能够重组表达的任何方法。可将包含编码感兴趣的蛋白质的核酸序列的质粒或其他形式的表达载体引入细菌中，从而使得它们表达所编码的蛋白质。例如，对于SEQ ID NO：2、5、7、9、11、13或15的表达，所述载体可分别包含SEQ ID NO：1、4、6、8、10、12或14的序列。然后通常通过例如使用亲和标记以纯化足够量的表达蛋白质并且以适合用于本发明方法中的形式提供。技术人员根据它们的公知常识可常规性获得用于重组蛋白质制备的此类方法。以上论述适用于提供本文所述任何蛋白质。
可在与原核端粒酶接触前纯化通过使DNA模板与DNA聚合酶接触获得的扩增DNA。因此，本发明方法还包括纯化从DNA模板扩增的DNA的步骤。但是，在优选的实施方式中，实施该方法而未在与原核端粒酶接触前纯化已扩增的DNA。这意味着通常可在相同的容器或溶液中连续进行扩增和加工步骤。在一些此类实施方式中，该方法涉及加入提供原核端粒酶活性的缓冲剂，即提供促进形成闭合线状DNA的条件。
通过原核端粒酶的作用产生闭合线状DNA之后，本发明方法还包括纯化线状共价闭合DNA产物的步骤。通常进行上文所述的纯化用于除去任何不需要的产物。可通过本领域已知的任何适合的方法进行纯化。例如，对扩增DNA或线状共价闭合DNA的加工可包括酚/氯仿核酸纯化或使用选择性结合核酸的柱子例如可从Qiagen商购的那些。技术人员可常规地确定用于分离扩增DNA的适合的纯化技术。
一旦生成了线状共价闭合DNA并且纯化了足够的量，该方法还包括将其制成DNA组合物，例如治疗性DNA组合物。治疗性DNA组合物包含上文所述类型的治疗性DNA分子。此类组合物包含为适合通过所需途径给药的形式的治疗有效量的DNA，所述形式是例如气雾剂、注射剂组合物或适合口腔、粘膜或局部给药的制剂。
可使用本领域技术人员可获得的标准药物制剂化学和方法以常规药物制剂制备DNA制剂。可使用任何药学可接受的载体或赋形剂。诸如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等的辅助性物质可存在于赋形剂或溶媒中。这些赋形剂、溶媒和辅助性物质通常为制药级物质，可将它们给药而不引起异常毒性并且在疫苗组合物的情况中不会在接受该组合物的个体中诱导免疫应答。适合的载体可为脂质体。
药学可接受的赋形剂包括但不限于液体例如水、盐水、聚乙烯二醇、透明质酸、甘油和乙醇。还可在其中包含药学可接受的盐，例如矿物酸盐例如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐等；以及有机酸的盐，例如醋酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐等。尽管不是必要的，当所述组合物中包含肽、蛋白质或其他类似分子时还优选所述制剂包含充当特别是用于这些分子的稳定剂的药学可接受的赋形剂。还可充当肽稳定剂的适合的载体的实例包括但不限于制药级的右旋糖、蔗糖、乳糖、海藻糖、甘露醇、山梨醇、肌醇、葡聚糖等。其他适合的载体包括但不限于淀粉、纤维素、磷酸钠或磷酸钙、柠檬酸、酒石酸、甘氨酸、高分子量聚乙二醇(PEG)及其组合。对药学可接受的赋形剂、溶媒和辅助性物质的全面论述可参见REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES(Mack Pub.Co.，N.J.1991)，其通过引用并入本文。
本发明方法在体外无细胞环境中进行。因此，该方法在无宿主细胞存在下进行并且通常包括使用纯化的酶组分。因此，模板DNA的扩增和通过原核端粒酶的加工通常通过在适合的容器内使溶液中的反应组分接触进行。可选地地，可以固定形式例如结合至固体载体提供特定组分。
应理解可以任何规模实施本发明的方法。然而，优选以商业或工业规模实施该方法用于扩增DNA，即以毫克或更大的量生成扩增DNA。优选所述方法生成至少一毫克、至少10毫克、至少20毫克、至少50毫克或至少100毫克扩增DNA。还优选以毫克或更大的量生成衍生自扩增DNA的最终闭合线状DNA产物。优选所述方法生成至少一毫克、至少2毫克、至少5毫克、至少10毫克、至少20毫克、至少50毫克或至少100毫克闭合线状DNA。
本发明还提供包含实施本发明方法所需要的组分的试剂盒。该试剂盒包含至少一种DNA聚合酶和至少一种原核端粒酶以及可选地本文所述方法的使用说明。所述试剂盒可包含两种、三种、四种、五种或更多种不同的DNA聚合酶。优选地，所述试剂盒包含至少一种链置换型DNA聚合酶，还更优选RCA DNA聚合酶。特别优选所述试剂盒包含phi29 DNA聚合酶(SEQ ID NO：2)、DeepDNA聚合酶(SEQ ID NO：3)或Bst 1DNA聚合酶(SEQ ID NO：5)或任何一种变异体。在一些实施方式中，还可包含以其他方法复制DNA的DNA聚合酶。所述试剂盒包含至少一种原核端粒酶。所述试剂盒可包含两种、三种、四种或更多种不同的原核端粒酶。所述原核端粒酶可选自SEQ ID NO：5、7、9、11、13或15中的任何一种或任何一种的变异体。特别优选所述试剂盒包含大肠杆菌N15 TelN(SEQ ID NO：15)或其变异体。
所述试剂盒还包含至少一种单链结合蛋白(SSBP)。优选的SSBP为可商购自New England Biolabs，Inc的T4基因32蛋白。可在试剂盒中包含两种、三种、四种或更多种不同的SSBP。该试剂盒可能还包含焦磷酸酶。优选的焦磷酸酶为可商购自New England Biolabs，Inc的酿酒酵母焦磷酸酶。在一些实施方式中，可包含两种、三种、四种、五种或更多种焦磷酸酶。所述试剂盒还可能包含本文所述的任何DNA聚合酶、原核端粒酶、SSBP或焦磷酸酶。所述试剂盒还可能包含dNTP、适合的缓冲剂以及如上文所述DNA聚合酶和/或原核端粒酶的酶性能或稳定性所需的其他因素。
实施例
实施例1-表达TelN并且生成包含原核端粒酶靶序列的载体构建体使用经修饰的寡核苷酸引物：
PT1F 5’ATGAGCAAGGTAAAAATCGGTG 3’(SEQ ID NO：30)
PT1R 5’TTAGCTGTAGTACGTTTCCCAT 3’(SEQ ID NO：31)
从商购克隆载体pJAZZ(Lucigen)PCR扩增TelN用于定向框内克隆至商购pQE-30载体(Qiagen)内。该系统使得能够从lac启动子诱导表达6X N-端His标记蛋白质同时提供来自lacI-表达质粒pREP4的反向强抑制。已在大肠杆菌M15中鉴定出许多推定的重组克隆并且通过测序进行验证以证明TelN的框内插入。在小规模诱导实验中进一步表征了六个克隆。所有克隆均表达了分子量对应于重组TelN原核端粒酶的74.5kDa蛋白质。
通过用IPTG诱导pQE-30的蛋白质表达从大肠杆菌M15pREP4表达TelN并且将诱导的细胞进行超声处理(100％爆破6次，每次30秒)并离心(25000g，30min)，以从细胞裂解物获得可溶性和不溶性组分。凝胶分析显示TelN存在于可溶性组分中。使用Akta Prime系统(GE Healthcare)并且以0-100％(0.5M)咪唑梯度洗脱，在HisTrap柱上纯化TelN。将已纯化的TelN透析以除去咪唑并且保存在由10mM Tris HCl pH 7.4、75mMNaCl、1mM DTT、0.1mM EDTA和50％甘油组成的缓冲液中。
通过将包含TelN识别位点telRL：
RL1
5’AGCTTTATCAGCACACAATTGCCCATTATACGCGCGTATAATGGACTATTGTGTGCTGATAG 3’(SEQ ID NO：32)
RL2
5’GATCCTATCAGCACACAATAGTCCATTATACGCGCGTATAATGGGCAATTGTGTGCTGATAA 3’(SEQ ID NO：33)
的合成寡核苷酸定向克隆至质粒pUC18和pBR329的BamHI和HindIII位点内生成能够验证TelN活性的载体构建体。pUC18的Genbank登录号为L09136并且可商购自Fermentas Cat no.SD0051；pBR329的Genbank登录号为J01753并且可商购自DSMZ Cat no.5590。
此外，用于转染试验，将两个拷贝的telRL识别位点克隆至荧光素酶表达质粒pGL4.13(Promega)中侧接萤火虫荧光酶基因表达盒的独特的SacI和BamHI限制性位点。在telRL合成寡核苷酸与SacI突出端复性后将第一个telRL位点克隆至SV40启动子上游的独特的SacI位点。使用具有BamH1突出端的telRL合成寡核苷酸将第二个telRL位点克隆至SV40多腺苷酸化信号下游的独特的BamH1位点内。将所得构建体表示为pGLDOG，因为它使得能够形成编码表达于哺乳动物细胞中的荧光素酶的共价闭合线状(狗骨状)DNA。
实施例2-验证TelN裂解
验证TelN对超螺旋、环状pUC18 telRL和pGL DOG载体构建体的裂解。将100ng各底物与4.5pmol TelN在30摄氏度温育1小时40分钟。在TelN缓冲液[10mM Tris HCl pH 7.6、5mM CaCl2、50mM谷氨酸钾、0.1mMEDTA、1mM DTT]中进行该反应。
通过非变性琼脂糖凝胶电泳使裂解产物可视化。超螺旋、环状pUC18telRL与TelN温育释放了表明裂解的2.7kb线状片段。超螺旋、环状pGLDOG与TelN温育释放了表明在两个telRL位点裂解的两个2.4kb片段。
此外，通过限制性消化将pUC18 telRL和pGL DOG线性化，然后与TelN温育以进一步验证在telRL位点的特异裂解。用Xmn1将100ngpUC18 telRL线性化，然后与TelN温育。这释放了预期的1.9kb和0.8kb片段。用Pvul将100ng pGL DOG线性化，然后与TelN温育。这释放了预期的2.4kb、1.6kb和0.7kb片段。相似地，用Pst1线性化pGL DOG然后与TelN温育释放了预期的2.4kb、1.1kb和另一1.1kb片段。这证明了TelN对包含原核端粒酶靶序列的环状和线状DNA底物的核酸内切酶活性。
在对裂解活性的初期评价中，发现3.4pmol的过量TelN可在1小时内切割至少200ng pUC18 telRL。在时段试验中，在约10分钟内切割相同量的DNA。
实施例3-验证TelN的再连接活性和闭合线状DNA的形成
用变性凝胶电泳验证TelN裂解产物的闭合线状DNA结构。如实施例3将pGL DOG与TelN温育。将对应于包含在狗骨状(doggybone)内的区域但是具有开放DNA末端的合成PCR产物(PCR DOG)作为对照。使用侧接telRL位点的引物从pGL DOG扩增PCR DOG线性片段：
Sac pGL 5’GTGCAAGTGCAGGTGCCAGAAC 3’(SEQ ID NO：34)；
Bam pGL 5’GATAAAGAAGACAGTCATAAGTGCGGC 3’(SEQ IDNO：35)
在非变性琼脂糖凝胶上[TAE缓冲液(40mM Tris-醋酸盐，1mMEDTA)中0.8％琼脂糖]，通过将100ng pGL DOG与TelN温育获得的2.4kb裂解产物迁移至与PCR DOG(2.7kb)相似的大小，因为两种产物仍然是双链的。
然而，当进行能够将双链DNA变性并且分离成为单链DNA的变性琼脂糖凝胶[在H2O中1％琼脂糖，50mM NaOH、0.1mM EDTA中电泳并且电泳后在1M Tris HCl pH 7.6、1.5M NaCl内中和]时，TelN“狗骨状”片段与开放末端PCR对照或用XmnI线性化的pUC18 telRL(均为2.7kb)相比以更高的分子量[ca.5kb]迁移。
该迁移差异表明通过TelN形成了闭合线状“狗骨状”结构。将“狗骨状”结构变性会产生单链开放环，其在凝胶中比变性开放末端线状PCR产物释放的线状单链迁移得更慢。
还可在通过Lab-On-a-Chip(LOC)毛细管电泳进行的热变性分析中显示对通过TelN形成的产物的闭合线状结构的验证。LOC分析代表了用于快速分离生物分子的毛细管电泳平台。具有DNA7500芯片的AgilentBioanalyzer(Agilent，UK)可用于分离并且近似分选长达7000bp的DNA片段。
该芯片系统不能检测单链DNA。在低盐条件下例如在H2O中将常规双链DNA热变性(95℃，5mins)并且以1℃/s快速(＜1℃/s)冷却得到了不能在LOC系统上可视化的单链DNA。然而，“狗骨状”DNA(通过TelN裂解获得)中共价连接的DNA末端不能在变性后分离并且因此复性形成仍然可视的双链DNA。因此比较被快速冷却的热变性DNA使得区分共价闭合线状(ccl)狗骨状DNA和常规开放线状(ol)双链DNA。
在热循环仪(Biorad I-cycler，Biorad，UK)中的薄壁PCR管内将H2O中的DNA样品(100ng)变性(95℃，5mins)并快速(＜1℃/s)冷却至4℃。对于与TelN裂解的比较，首先在1 X Tel N缓冲液中将样品与1微升纯化的原核端粒酶于30℃温育10min。以相同的但不包含酶的方法处理对照样品。根据使用说明使用具有DNA 7500芯片的Agilent Bioanalyser分析样品(1微升)。
结果显示于图6B。这些结果表明通过将pGL DOG和TelN温育获得的闭合线状“狗骨状”DNA与相当的常规开放线状DNA(PCR DOG)相比对热变性具有抗性。使用由RCA扩增和TelN裂解获得的RCA扩增狗骨状DNA也获得了相同的对热变性的抗性。
在其他实验中，在开放末端PCR DOG上进行TelN裂解。这引起形成2.8kb的热稳定裂解产物“狗骨状”DNA，以及0.09和0.14kb的热稳定“狗骨状”末端。
在LOC分析中，与预测2.4kb和2.7kb近似大小的序列数据相比，“狗骨”和PCR DOG的估算大小分别为2.8kb-3.0kb和3.1-3.5kb。这反映了出现在非变性LOC分析中基于构象的迁移差异。
实施例4-从通过RCA(滚环扩增)形成的多联体DNA形成闭合线状DNA
实施用于扩增DNA模板并将该扩增的DNA转化成闭合线状“狗骨状”DNA的体外无细胞方法。在各种条件下通过使用来自枯草芽孢杆菌噬菌体phi29的phi29酶和作为引物的随机六聚体的RCA扩增具有和不具有telRL位点的共价闭合质粒模板。这导致通过phi29的核苷酸掺入链置换活性扩增多联体DNA。根据使用说明使用TempliPhi试剂盒(GEHealthcare)进行最初的研究。但是之后用内部方法(使用由NEB提供的phi29)取代该试剂盒，得到纯度增加的更高的产物收率。
在10微升复性/变性缓冲液(30mM Tris-HCl pH 7.5、20mM KCl、8mMMgCl2、20微摩尔随机六聚体)中进行40pg-200ng闭合环状模板的变性和引物的退火。通过加热至95℃1分钟然后经30min冷却至室温进行变性和退火。
然后向10微升退火的DNA/引物反应液中加入10微升反应缓冲液[35mM Tris-HCl、50mM KCl、14mM MgCl2、10mM(NH4)2SO4、4mM DTT、10U phi29、0.002U PPi(酵母无机焦磷酸酶)、1mM dNTP]。
将20微升反应液于30℃温育18小时。将样品在凝胶上电泳以检验多联体的形成，然后用限制性酶或TelN消化反应混合物以检验产物。
然后将通过RCA扩增的多联体DNA与TelN温育。通常，将RCA扩增的DNA底物在水和10x TelN缓冲液中稀释至20微升的终体积。pUC18 telRL的结果显示于图6A中。
从泳道1的凝胶可以看出，未消化的多联体扩增DNA形成不能进入凝胶的网状物。然而，TelN能够裂解RCA物质引起2.7kb狗骨状片段(泳道6)的释放。通过用Pvu1限制性消化(泳道2和5)实现了验证由RCA扩增的DNA是用于该反应中的起始模板。pUC18(无telRL)充当TelN活性的阴性对照(泳道3)。
相似地，在其他实验中，也用TelN裂解RCA生成的pGL DOG多联体。因此，证明本发明方法可以有效地从起始模板扩增闭合线状DNA。另外，有可能在连续步骤中使用RCA聚合酶和原核端粒酶以简单的方式扩增闭合线状DNA而不需要间插扩增DNA的纯化。
实施例5-表达扩增的闭合线状DNA
用Hela细胞进行转染试验以研究根据本发明生成的闭合线状“狗骨状”DNA的荧光素酶报告基因的表达。将共价闭合线状DNA和线状PCRDOG对照作为对照。
在20mm直径孔内在RPMI中于60％汇合度时进行转染，并且根据使用说明使用
(Promega)。每一次转染使用400ng构建体DNA。通过在每一次转染中包括40ng海肾(Renilla)荧光素酶表达质粒pGL4.73(包含来自海肾的hRluc基因)作为内对照，将实验内和实验之间的转染频率标准化。使用
Reporter(DLRTM)AssaySystem(Promega)依次测量萤火虫荧光素酶(来自萤火虫的发光)和海肾荧光素酶活性。使用GloMax Multi光度计(Promega)测量相对光单位并且将结果表示为萤火虫荧光素酶/海肾荧光素酶比。所有试验均一式三份进行。
在转染中检测的构建体为：
pGL4.13 luc对照DNA
pGL4.73 hRluc
PCR DOG
PCR对照(来自pGL4.13跨越luc基因的片段)
pGL DOG(包含2个telRL位点的pGL4.13)
“狗骨状”MP(分离自用PvuI消化(以除去污染性载体DNA)然后用TelN裂解的小量制备DNA的pGL DOG)。
“狗骨状”RCA(用PvuI消化然后用TelN裂解的通过RCA扩增的pGL DOG)。
RCA pGL DOG-在pGL DOG的初始RCA扩增中生成的多联体DNA。
结果示于图6C。证明包括通过RCA扩增的那些在内的闭合线状DNA比开放线状PCR构建物表达更高水平的荧光素酶。这证明当引入哺乳动物细胞时，根据本发明制备的闭合线状DNA可用于成功表达荧光素酶。
本发明的序列
表A
表B
表C
表D
表E
表F
表G
表H
Claims (20)
1.一种用于制备闭合线状脱氧核糖核酸(DNA)的体外无细胞方法，包括：
(a)在一种或多种引物存在下，使包含至少一个原核端粒酶靶序列的DNA模板与至少一种DNA聚合酶在促进所述模板扩增的条件下接触；和
(b)使(a)中制备的扩增DNA与至少一种原核端粒酶在促进闭合线状DNA制备的条件下接触。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，将所述DNA模板在通过另一条链的链置换复制来置换被复制链以促进所述模板扩增的条件下孵育。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，通过滚环扩增(RCA)来实施所述模板的扩增。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述引物是随机引物。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述DNA聚合酶是SEQ ID NO：2的phi29或其变异体和/或所述原核端粒酶是SEQ IDNO：15的噬菌体N15 TelN或其变异体。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，在(a)中制备的扩增DNA包括包含从所述DNA模板扩增的DNA序列的串联单元的多联体。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，通过所述原核端粒酶将所述多联体分离成扩增DNA序列的单个单元。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述至少一个原核端粒酶靶序列包含完整反转的重复DNA序列。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述DNA模板是闭合环状DNA。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述DNA模板是闭合线状DNA，优选其中所述DNA模板在变性条件下孵育以形成闭合环状DNA。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述DNA模板包括包含与感兴趣的编码序列可操作地连接的真核启动子和可选的真核转录终止序列的表达盒；其中所述感兴趣的编码序列可选地为人编码序列或来自感染人的病原体的编码序列。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述表达盒在任一侧侧接原核端粒酶靶序列。
13.根据权利要求12所述的方法，用于制备闭合线状表达盒DNA。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，进一步包括纯化在(b)中制备的闭合线状DNA。
15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，包括：
(a)在约25至约35摄氏度的温度下，使具有用SEQ ID NO：15的TelN裂解并再连接的原核端粒酶靶序列的单链化的所述DNA模板与SEQ ID NO：2的phi29 DNA聚合酶或其变异体，在促进所述DNA聚合酶扩增所述模板的条件下接触；和
(b)在约25至约35摄氏度的温度下，使步骤(a)中制备的多联体与所述原核端粒酶TelN或其变异体在促进所述原核端粒酶的活性的条件下接触。
16.根据权利要求15所述的方法，其中，所述原核端粒酶靶序列包含SEQ ID NO 25的序列或其变异体。
17.一种试剂盒，包含至少一种DNA聚合酶和至少一种原核端粒酶以及可选的在根据前述权利要求中任一项所述的方法中使用的说明书。
18.一种在宿主中诱导针对抗原的免疫应答的方法，所述方法包括：
-使用编码所述抗原的所述DNA模板实施根据权利要求1至16中任一项所述的方法，和
-将所得的编码所述抗原的闭合线状DNA给予所述宿主，以使所述抗原在所述宿主内表达并且诱导对所述抗原的免疫应答。
19.一种用于制备包含闭合线状DNA分子的药物组合物的方法，所述方法包括实施根据权利要求1-16中任一项所述的方法，并且将所得的闭合线状DNA与药学可接受的载体或赋形剂配制在一起。
20.闭合线状DNA分子在制备用于通过疗法治疗人或动物身体的药物中的应用，其中所述制备包括实施根据权利要求1-16中任一项所述的方法。
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