EA021069B1 - Получение закрытой линейной днк - Google Patents

Получение закрытой линейной днк Download PDF

Info

Publication number
EA021069B1
EA021069B1 EA201101141A EA201101141A EA021069B1 EA 021069 B1 EA021069 B1 EA 021069B1 EA 201101141 A EA201101141 A EA 201101141A EA 201101141 A EA201101141 A EA 201101141A EA 021069 B1 EA021069 B1 EA 021069B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
azr
agd
zeg
tug
dna
Prior art date
Application number
EA201101141A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201101141A1 (ru
Inventor
Ванесса Хилл
Original Assignee
Тачлайт Дженетикс Лимитед
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=40469378&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=EA021069(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Тачлайт Дженетикс Лимитед filed Critical Тачлайт Дженетикс Лимитед
Publication of EA201101141A1 publication Critical patent/EA201101141A1/ru
Publication of EA021069B1 publication Critical patent/EA021069B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0069—Oxidoreductases (1.) acting on single donors with incorporation of molecular oxygen, i.e. oxygenases (1.13)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6853—Nucleic acid amplification reactions using modified primers or templates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/711—Natural deoxyribonucleic acids, i.e. containing only 2'-deoxyriboses attached to adenine, guanine, cytosine or thymine and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A61P39/02—Antidotes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6846—Common amplification features
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y113/00—Oxidoreductases acting on single donors with incorporation of molecular oxygen (oxygenases) (1.13)
    • C12Y113/12—Oxidoreductases acting on single donors with incorporation of molecular oxygen (oxygenases) (1.13) with incorporation of one atom of oxygen (internal monooxygenases or internal mixed function oxidases)(1.13.12)
    • C12Y113/12007—Photinus-luciferin 4-monooxygenase (ATP-hydrolysing) (1.13.12.7), i.e. firefly-luciferase

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

In vitro способ получения закрытой линейной дезоксирибонуклеиновой кислоты ДНК включает в себя: (а) контактирование ДНК-матрицы, содержащей по меньшей мере одну протеломеразную последовательность-мишень, по меньшей мере с одной ДНК-полимеразой в присутствии одного или более праймеров при условиях, способствующих амплификации указанной матрицы; и (b) контактирование амплифицированной ДНК, полученной в (а), по меньшей мере с одной протеломеразой при условиях, способствующих получению закрытой линейной ДНК. В наборе предоставлены компоненты, необходимые для осуществления способа.

Description

Настоящее изобретение относится к ίη νίίτο бесклеточному способу получения закрытой линейной дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК).
Предпосылки изобретения
Традиционные способы крупномасштабной амплификации ДНК с использованием клеток являются затратными. Например, использование бактерий требует их роста в больших объемах в дорогостоящих ферментерах, которые необходимо содержать в стерильных условиях для предупреждения загрязнения культуры. Бактерии также необходимо лизировать для высвобождения амплифицированной ДНК, и ДНК нуждается в очистке от других бактериальных компонентов. В частности, при производстве ДНК-вакцин или других терапевтических ДНК-агентов требуется высокая степень чистоты для удаления эндотоксинов, являющихся токсичными для млекопитающих.
В дополнение к стоимости процесса использование бактерий во многих случаях может затруднять точность амплификации. В комплексном биохимическом окружении бактериальной клетки сложно осуществлять контроль качества и выхода желательного ДНК-продукта. Бактерия может случайно изменить представляющий интерес ген, клонированный в амплифицируемой ДНК, и сделать его бесполезным для заданной цели. Рекомбинация также может вызвать проблемы в точности продукции представляющей интерес ДНК. Бесклеточные ферментативные способы амплификации ДНК позволяют избежать необходимости использовать клетки-хозяева и поэтому являются предпочтительными.
Например, производство ДНК-кассет для медицинского применения практически без исключений основано на их встраивании в бактериальные плазмиды и их амплификации в процессах бактериальной ферментации.
Текущее состояние способов получения ДНК в данной области различным образом ограничивает возможности улучшения производства таких терапевтических средств на основе ДНК. Кроме того, плазмидный продукт является, по существу, неочищенной молекулой ДНК, в том смысле, что он содержит нуклеотидные последовательности, не требуемые для терапевтической функции молекулы ДНК. Соответственно, в области производства ДНК-продуктов, таких как терапевтические средства на основе ДНК, существует необходимость в улучшенных способах амплификации ДНК в больших количествах. В частности, существует необходимость в улучшенных способах амплификации конкретных форм ДНК, таких как закрытая линейная ДНК. Закрытые линейные молекулы ДНК особенно пригодны для применения в терапии благодаря своей более высокой стабильности и лучшей безопасности относительно других форм ДНК.
Краткое изложения сущности изобретения
Настоящее изобретение относится к способу ίη νίίτο бесклеточного получения линейной ковалентно закрытой ДНК (закрытой линейной ДНК). Этот способ позволяет улучшить получение линейной ковалентно закрытой ДНК по сравнению с текущими методиками, включающими в себя клеточные способы и амплификацию в плазмидах. Этот способ значительно увеличивает выход продукта, одновременно снижая стоимость его очистки.
По настоящему изобретению линейную ковалентно закрытую ДНК на основе ДНК-матрицы получают ферментативно в отсутствие клеток-хозяев. ДНК-матрица содержит по меньшей мере одну последовательность-мишень протеломеразы. Матричная ДНК контактирует по меньшей мере с одной ДНКполимеразой в присутствии одного или более праймеров в условиях, способствующих амплификации матрицы. ДНК, амплифицированная с матрицы, контактирует по меньшей мере с одной протеломеразой в условиях, способствующих получению закрытой линейной ДНК.
Соответственно, настоящее изобретение относится к ίη νίίτο бесклеточному способу получения закрытой линейной дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), включающему в себя:
(a) контактирование ДНК-матрицы, содержащей по меньшей мере одну последовательностьмишень протеломеразы, по меньшей мере с одной ДНК-полимеразой в присутствии одного или более праймеров в условиях, способствующих амплификации указанной матрицы; и (b) контактирование амплифицированной ДНК, полученной в (а), по меньшей мере с одной протеломеразой в условиях, способствующих получению закрытой линейной ДНК.
Изобретение дополнительно относится к набору, обеспечивающему компоненты, необходимые в способе по изобретению. Таким образом, изобретение относится к набору, содержащему по меньшей мере одну ДНК-полимеразу и по меньшей мере одну протеломеразу и инструкции по использованию в способе по изобретению.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1 - репликация линейной ковалентно закрытой ДНК в бактериофагах и роль протеломеразы.
A. Изображение внехромосомной линейной ковалентно закрытой ДНК бактериофага; * - центр палиндромной последовательности теломеры; К-последовательность представляет собой инвертированный палиндромный повтор Ь-последовательности.
B. Репликация ДНК бактериофага в хозяине: овал указывает репликацию цепи ДНК; синтез цепи, комплементарной К и Ь, приводит к идентичным двухцепочечным КБ-последовательностям.
C. Продукты, образующиеся в результате действия протеломеразы. Протеломераза связывается с
- 1 021069
КЬ-последовательностью и разрезает и лигирует противоположные цепи в центральной точке палиндромной последовательности, повторно образуя теломеры и завершая репликацию исходной линейной ковалентно закрытой ДНК.
Фиг. 2 - действие протеломеразы фага N15 из ЕксйейсПа сой (ТеШ) на кольцевую двухцепочечную ДНК, содержащую ее сайт-мишень 1е1КЬ. Те1КЬ представляет собой инвертированный палиндром с 28нуклеотидными правым (1е1К) и левым (1е1Ь) плечами, указанными стрелками. Подчеркнутые последовательности указывают несовершенство в палиндроме 1е1КЬ. Центральный 22-нуклеотидный совершенный инвертированный палиндром Те1О необходим для связывания фермента ТеШ. ТеШ расщепляет эту 22нуклеотидную последовательность в центре и соединяет концы комплементарных цепей, образуя ковалентно закрытые концы.
Фиг. 3 - сравнение протеломеразных последовательностей-мишеней, найденных в различных организмах. Последовательности в рамке показывают длину совершенной или несовершенной палиндромной последовательности. Подчеркнуты несовершенства в палиндроме. Выделенные цветом последовательности пар оснований являются общими для всех протеломеразных последовательностей-мишеней, что указывает на их важность для связывания и действия протеломеразы. А. Фаг N15 из ЕксйейсПа сой. В. Фаг РП К02 из К1еЬ81е11а. С. Фаг Ру54 из УегаПа. Ό. Фаг РП НАР из На1отоиа8. Е. Фаг УР882 из УПпо. Р. Плазмида 1рВ31.16 из Вотгейа ЬигдбогГсп. Последовательности в рамке показывают длину совершенной или несовершенной палиндромной последовательности для каждого бактериофага. С. Показана консенсусная инвертированная палиндромная последовательность для связывания и действия протеломеразы бактериофага. Она представляет собой последовательность 22-нуклеотидного совершенного инвертированного повтора (по 11 пар оснований в обе стороны от места расщепления). Консенсусная последовательность выведена из выделенных цветом консервативных остатков, показанных на А-Е. Указаны консервативные пары оснований и их позиции в палиндроме. Тире указывают на гибкость состава последовательности, то есть когда основания могут представлять собой любой нуклеотид N (А, Т, С или С).
Фиг. 4 - конкретный способ ίη уйго амплификации линейной двухцепочечной ковалентно закрытой ДНК с использованием ДНК-полимеразы с активностью вытеснения цепи по типу катящегося кольца (КСА) в комбинации с протеломеразой ТеШ. А. Закрытая линейная ДНК-матрица. К и Ь представляют собой ДНК-последовательности правого или левого плеча последовательности связывания протеломеразы ТеШ. В. Денатурация исходной матрицы с образованием кольцевой одноцепочечной ДНК. С. Связывание праймера. Ό-Е. Амплификация по типу катящегося кольца на одноцепочечной ДНК-матрице с помощью ДНК-полимеразы с активностью вытеснения цепи по типу КСА. Р. Образование длинных конкатемерных двухцепочечных ДНК, содержащих одиночные элементы амплифицированной матрицы, разделенные последовательностями связывания протеломеразы (КЕ). С. Контактирование с протеломеразой ТеШ, специфичной к КЬ-последовательности. Протеломераза расщепляет конкатемерную ДНК по КЬсайту и лигирует комплементарные цепи, давая амплифицированные копии исходной линейной ковалентно закрытой ДНК-матрицы.
Фиг. 5 - вырезание ДНК-кассеты, экспрессирующей представляющий интерес ген, из длинной двухцепочечной молекулы ДНК для создания закрытой линейной ДНК-кассеты. А. Линейная двухцепочечная молекула ДНК, содержащая ДНК-кассету, включающую в себя представляющий интерес ген, фланкированный протеломеразными последовательностями-мишенями. В. Вырезание ДНК-кассеты в качестве линейной ковалентно закрытой молекулы ДНК.
Фиг. 6 - амплификация закрытой линейной ДНК и экспрессия репортерного гена с использованием экспрессионной кассеты в форме собачьей косточки.
A. Подтверждение с помощью электрофореза в агарозном геле расщепления с помощью ТеШ КСАамплифицированных конкатемеров с образованием закрытой линейной ДНК. В дорожках 1-3 показана КСА-амплифицированная плазмида рИС18. Дорожка 1: 3 мкл КСА-амплифицированной нерасщепленной рИС18. Дорожка 2: 2 мкл КСА-амплифицированной плазмиды рИС18, расщепленной РуиТ Дорожка 3: 2 мкл КСА-амплифицированной плазмиды рИС18, обработанной ТеШ (отрицательный контроль). В дорожках 4-6 показана КСА-амплифицированная плазмида риС18-1е1КЬ. Дорожка 4: 3 мкл КСАамплифицированной нерасщепленной риС18-1е1КЕ Дорожка 5: 1 мкл КСА-амплифицированной плазмиды риС18-1е1КЕ, расщепленной РуиТ Дорожка 6: 4 мкл КСА-амплифицированной плазмиды рИС181е1КЕ обработанной ТеШ. Указана закрытая линейная ДНК размером 2,7 т.п.о., образующаяся в результате обработки ТеШ. Фланкирующие дорожки являются маркерами размера ДНК.
B. ЬОС-анализ (ЬаЬ-Оп-А-СНр, анализ с использованием микрочипа), показывающий устойчивость закрытой линейной ДНК к температурной денатурации. Дорожка 1: маркер размеров ДНК. Дорожки 2 и 3: 100 нг продукта РСК ООС. Дорожки 4 и 5: 100 нг денатурированного продукта РСК ООС. Дорожки 6 и 7: ДНК в форме собачьей косточки - 100 нг рСЬ ООС, обработанной ТеШ. Дорожки 6 и 7: ДНК в форме собачьей косточки - 100 нг рСЬ ООС, обработанной ТеШ и денатурированной.
C. Подтверждение экспрессии закрытой линейной ДНК в клетках с помощью трансфекции. Ось у: среднее соотношение интенсивности люминесценции люциферазы из светлячка (Рйейу) и люциферазы из кораллового полипа (Кеш11а); ось х: линейные конструкции ДНК, используемые в трансфекции. РСК рСЬ: открытый линейный ПЦР-фрагмент из плазмиды рСЬ4.13, захватывающий ген 1ис (люциферазы).
- 2 021069
РСК ΌΘΟ: открытый линейный ПЦР-фрагмент, амплифицированный на матрице рСЬ ΌΘΟ с использованием праймеров, фланкирующих сайты 1е1КЬ. Собачья косточка, мини-преп: закрытая линейная ДНК из плазмиды рСЬ ΌΘΟ, выделенная с помощью набора для мини-выделений ДНК (мини-препа), расщепленная Руи1 (для удаления контаминирующей векторной ДНК) и расщепленная ТеШ. Собачья косточка, КСА: закрытая линейная ДНК из плазмиды рСЬ ЭОС. амплифицированная с помощью КСА, расщепленная Руи1 и расщепленная ТеШ.
Описание последовательностей
8ЕС ГО N0: 1 представляет собой нуклеотидную последовательность ДНК-полимеразы бактериофага рШ29 из ВасШик.
8ЕС ГО N0: 2 представляет собой аминокислотную последовательность ДНК-полимеразы бактериофага рШ29 из ВасШик, кодируемую 8ЕС ГО N0: 1.
8ЕС ГО N0: 3 представляет собой аминокислотную последовательность ДНК-полимеразы Эеер Уеп1 из Ругососсик кр.
8ЕС ГО N0: 4 представляет собой нуклеотидную последовательность ДНК-полимеразы I из ВасШик к1еатоШегторШ1ик.
8ЕС ГО N0: 5 представляет собой аминокислотную последовательность ДНК-полимеразы I из ВасШик к1еатоШегторййик, кодируемую 8ЕС ГО N0: 4.
8ЕС ГО N0: 6 представляет собой нуклеотидную последовательность протеломеразы фага рШНАР1 из На1отопак.
8ЕС ГО N0: 7 представляет собой аминокислотную последовательность протеломеразы фага рШНАР-1 из На1отопак, кодируемую 8ЕС ГО N0: 6.
8ЕС ГО N0: 8 представляет собой нуклеотидную последовательность протеломеразы фага РУ54 из Уегкииа.
8ЕС ГО N0: 9 представляет собой аминокислотную последовательность протеломеразы фага РУ54 из Уегкииа, кодируемую 8ЕС ГО N0: 8.
8ЕС ГО N0: 10 представляет собой нуклеотидную последовательность протеломеразы фага рШК02 из К1еЬк1е11а.
8ЕС ГО N0: 11 представляет собой аминокислотную последовательность протеломеразы фага рШК02 из К1еЬк1е11а, кодируемую 8ЕС ГО N0: 10.
8ЕС ГО N0: 12 представляет собой нуклеотидную последовательность протеломеразы фага УР882 из УШтю.
8ЕС ГО N0: 13 представляет собой аминокислотную последовательность протеломеразы фага УР882 из УШтю, кодируемую 8ЕС ГО N0: 12.
8ЕС ГО N0: 14 представляет собой нуклеотидную последовательность протеломеразы бактериофага N15 из ЕксНепсЫа сой (1еШ) и нуклеотидную последовательность вторичного иммунного репрессора (сА).
8ЕС ГО N0: 15 представляет собой аминокислотную последовательность протеломеразы бактериофага N15 из ЕксйепсШа сой (1еШ), кодируемую 8ЕС ГО N0: 14.
8ЕС ГО N0: 16 представляет собой консенсусную нуклеотидную последовательность совершенного инвертированного повтора, присутствующего в последовательности-мишени протеломеразы бактериофага.
8ЕС ГО N0: 17 представляет собой 22-нуклеотидную последовательность совершенного инвертированного повтора из фага N15 из Е. сой и фага рШК02 из К1еЬые11а.
8ЕС ГО N0: 18 представляет собой 22-нуклеотидную последовательность совершенного инвертированного повтора из фага РУ54 из Уегкииа.
8ЕС ГО N0: 19 представляет собой 22-нуклеотидную последовательность совершенного инвертированного повтора из фага рШНАР-1 из На1отопак.
8ЕС ГО N0: 20 представляет собой 22-нуклеотидную последовательность совершенного инвертированного повтора из фага УР882 из УШтю.
8ЕС ГО N0: 21 представляет собой 14-нуклеотидную последовательность совершенного инвертированного повтора из плазмиды 1рВ31.16 из Воттейа ЬитдДогГегЕ
8ЕС ГО N0: 22 представляет собой 24-нуклеотидную последовательность совершенного инвертированного повтора из фага УР882 из УШтю.
8ЕС ГО N0: 23 представляет собой 42-нуклеотидную последовательность совершенного инвертированного повтора из фага РУ54 из Уегкииа.
8ЕС ΕΌ N0: 24 представляет собой 90-нуклеотидную последовательность совершенного инвертированного повтора из фага рШНАР-1 из На1отопак.
8ЕС ГО N0: 25 представляет собой нуклеотидную последовательность из фага N15 из Е. сой, содержащую протеломеразную последовательность-мишень.
8ЕС ГО N0: 26 представляет собой нуклеотидную последовательность из фага рШК02 из К1еЬк1е11а, содержащую протеломеразную последовательность-мишень.
8ЕС ГО N0: 27 представляет собой нуклеотидную последовательность из фага РУ54 из Уегкииа, со- 3 021069 держащую протеломеразную последовательность-мишень.
8ЕЦ ГО N0: 28 представляет собой нуклеотидную последовательность из фага УР882 из УФпо. содержащую протеломеразную последовательность-мишень.
8ЕЦ ГО N0: 29 представляет собой нуклеотидную последовательность из плазмиды 1рВ31.16 из ВотгеНа ЪигдбогГегц содержащую протеломеразную последовательность-мишень.
8ЕЦ ГО N0: 30 представляет собой модифицированный олигонуклеотидный праймер, используемый в амплификации ТеШ.
8ЕЦ ГО N0: 31 представляет собой модифицированный олигонуклеотидный праймер, используемый в амплификации ТеШ.
8ЕЦ ГО N0: 32 представляет собой синтетический олигонуклеотид, содержащий сайт узнавания ТеШ, 1е1КЬ.
8ЕЦ ГО N0: 33 представляет собой синтетический олигонуклеотид, содержащий сайт узнавания ТеШ, 1е1КЬ.
8ЕЦ ГО N0: 34 представляет собой последовательность праймера, используемого в амплификации фрагмента РСК Ό00.
8ЕЦ ГО N0: 35 представляет собой последовательность праймера, используемого в амплификации фрагмента РСК Ό00.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение относится к способам получения линейной двухцепочечной ковалентно закрытой ДНК, то есть закрытых линейных молекул ДНК. Закрытые линейные молекулы ДНК обычно содержат ковалентно соединенные концы, также описываемые как шпилечные петли, в которых отсутствует образование пар между основаниями комплементарных цепей ДНК. Шпилечные петли соединяют концы комплементарных цепей ДНК. Структуры этого типа обычно образуются на теломерных концах хромосом для защиты от утери или повреждения хромосомной ДНК путем соединения концевых нуклеотидов в закрытую структуру. В примерах закрытых линейных молекул ДНК, описанных в настоящем документе, шпилечные петли фланкируют комплементарные спаренные цепи ДНК, образуя структуру в форме собачьей косточки (показанной на фиг. 1).
Способы по настоящему изобретению относятся к высокопроизводительному получению закрытых линейных молекул ДНК путем включения отдельной стадии обработки, превращающей амплифицированную ДНК в закрытую линейную ДНК. В дополнение способы по настоящему изобретению проводят ίη νίίτο в бесклеточной среде, и как таковые они не ограничены использованием ДНК-матриц с дополнительными последовательностями, необходимыми для размножения бактерий. Поэтому, как указано ниже, способ по изобретению можно использовать для получения закрытых линейных молекул ДНК, которые не имеют векторных последовательностей, вызывающих проблемы, и особенно подходят для терапевтического применения.
Закрытые молекулы ДНК особенно применимы в качестве терапевтических агентов, то есть лекарственных средств на основе ДНК, которые можно использовать для ίη νίνο экспрессии продукта гена. Это обусловлено тем, что их ковалентно закрытая структура предупреждает атаку ферментами, такими как экзонуклеазы, приводя к повышению стабильности и продолжительности экспрессии гена по сравнению с открытыми молекулами ДНК с экспонированными концами ДНК. Было продемонстрировано, что линейные двухцепочечные кассеты с открытыми концами не эффективны в отношении экспрессии генов при введении этих кассет в ткани-хозяева. Полагают, что причиной является нестабильность кассеты вследствие действия экзонуклеаз во внеклеточном пространстве.
Изолирование концов ДНК в ковалентно закрытых структурах также имеет другие преимущества. Предупреждается интеграция концов ДНК в геномную ДНК, так что закрытые линейные молекулы ДНК имеют большую безопасность. Также закрытая линейная структура предупреждает конкатемеризацию молекул ДНК в клетках-хозяевах, и поэтому уровень экспрессии продукта гена можно регулировать более точно. Настоящее изобретение относится к ίη νίίτο бесклеточному способу получения закрытых линейных молекул ДНК, который включает в себя ДНК-амплификацию на матрице и специфичную обработку амплифицированной ДНК протеломеразой.
Обычно способ по изобретению можно использовать для получения ДНК для ίη νίίτο экспрессии в клетке-хозяине, в частности в ДНК-вакцинах. ДНК-вакцины обычно кодируют модифицированную форму ДНК инфекционного организма. ДНК-вакцины вводят субъекту, в котором они затем экспрессируют конкретный белок инфекционного организма, вызывая иммунный ответ против белка, который обычно является защитным. ДНК-вакцины могут также кодировать опухолевый антиген в противораковой иммунотерапии.
ДНК-вакцина может включать в себя нуклеотидную последовательность, кодирующую антиген, для лечения или предупреждения ряда патологических состояний, в том числе, но не ограниченных этим, рак, аллергические реакции, токсическое действие и инфекцию патогенов, таких как, но не ограниченных этим, грибки, вирусы, в том числе вирус папилломы человека (НРУ), Н1У, Н8У2/Н8У1, вирус гриппа (типы А, В и С), полиовирус, респираторный синцитиальный вирус, риновирусы, ротавирусы, вирус гепатита А, группа вирусов Норволк, энтеровирусы, астровирусы, вирус кори, вирус парагриппа, вирус
- 4 021069 паротита, вирус ветряной оспы, цитомегаловирус, вирус Эпштейна-Барра, аденовирусы, вирус краснухи, вирус Т-клеточной лимфомы 1-го типа (НТЬУ-Ι), вирус гепатита В (ИВУ), вирус гепатита С (НСУ), вирус гепатита Ό, поксвирус, вирусы Марбург и Эбола, бактерии, включая
МусоЪааеггит (иЬегси1оз13, СЫатусИа,
Ν«ΐ$3&ϊα %опоггкоеае, ЗШдеИа, 5а1топе]1а, УИНо ско/егае, Тгеропета раШЛит,
Рзеийошопав, Вог4е(е11а регГиззй, ВгисеИа, РгапазсеИа 1и1агепз1з, НеИсоЬас1ег ру1ог1, Лер1озр1га т1егго£апз, Ье&апеИа рпеиторЬИа, УегзййарезИз, ЗйерЮсоссиз (типы А и В), Рпеитососсиз, Мептдососсиз, НаеторкИиз йфиепга (®ип ь»,
Тохор1азта £оп(Ш, Сатру1оЬас1епо515, МогахеИа са(аггкаНз, бактерии, вызывающие донованоз (К1еЬче11а дгапи1отаИв) и актиномицеты; грибковые патогены, включая вызывающие кандидоз и аспергиллез; паразитарные патогены, включая ленточных червей, сосальщиков, круглых червей, возбудителя амебиаза, возбудителя гиардиаза, СгурЮвропйшт. ЗсЫвЮвота, РпеитосуЧй сапии, возбудителя трихомониаза и трихинеллеза.
ДНК-вакцины могут содержать нуклеотидные последовательности, кодирующие антиген вируса из семейства аденовирусов (включая, например, аденовирус человека), герпесвирусов (включая, например, Н8У-1, Н8У-2, ЕВУ, СМУ и У2У), паповавирусов (включая, например, НРУ), поксвирусов (включая, например, вирус оспы и вакциния вирус), парвовирусов (включая, например, парвовирус В19), реовирусов (включая, например, ротавирус), коронавирусов (включая, например, вирус 8АР8), флавивирусов (включая, например, вирус желтой лихорадки, вирус Западного Нила, вирус лихорадки денге, вирус гепатита С и вирус клещевого энцефалита), пикорнавирусов (включая полиовирус, риновирус и вирус гепатита А), тогавирусов (включая, например, вирус краснухи), филовирусов (включая, например, вирус Марбург и Эбола), парамиксовирусов (включая, например, вирус парагриппа, респираторный синцитиальный вирус, вирусы паротита и кори), рабдовирусов (включая, например, вирус бешенства), буньявирусов (включая, например, вирус Ганта), ортомиксовирусов (включая, например, вирусы гриппа А, В и С), ретровирусов (включая, например, Н1У и НТЬУ) и гепаднавирусов (включая, например, вирус гепатита В).
Антиген может относиться к патогену, ответственному за ветеринарное заболевание, и, в частности, относится к вирусному патогену, включая, например, реовирус (такой как вирус африканской болезни лошадей или вирус инфекционной катаральной лихорадки овец) и герпесвирусы (включая вирус герпеса лошадей). Антигеном может быть антиген вируса болезни ног и рта, вируса клещевого энцефалита, вируса лихорадки денге, вируса 8АК.8, вируса лихорадки Западного Нила и вируса Хантаан. Антиген может относиться к вирусу иммунодефицита и может быть, например, из 81У или вируса кошачьего иммунодефицита.
ДНК-вакцины, получаемые способом по изобретению, могут также содержать нуклеотидную последовательность, кодирующую опухолевые антигены. Примеры антигенов, ассоциированных с опухолями, включают, но не ограничены, антигены рака яичек, такие как члены МАСЕ-семейства (МАСЕ 1, 2, 3 и т.д.), ΝΥ-Ε8Θ-1 и 88Х-2, антигены дифференцировки, такие как тирозиназа, др100, Р8А, Нег-2 и СЕА, мутированные собственные антигены и вирусные опухолевые антигены, такие как Е6 и/или Е7 из онкогенных типов НРУ. Дополнительные примеры конкретных опухолевых антигенов включают ΜΆΡΤΗ Ме1ап-А, р97, бета-НСС, СаШАс, МАСЕ-1, МАСЕ-2, МАСЕ-4, МАСЕ-12, МИС1, МИС2, МИС3, МиС4, МИС18, СЕА, НЭС, Р1А, ЕрСат, меланомный антиген др75, Нкег 8, высокомолекулярный меланомный антиген, К19, Туг1, Туг2, члены семейства генов рМе1 17, с-Ме1, Р8М (муциновый антиген простаты), Р8МА (специфичный для простаты мембранный антиген), секреторный белок простаты, альфафетопротеин, СА125, СА19.9, ТАС-72, антигены ВРСА-1 и ВРСА-2.
Также с помощью способа по изобретению можно получать другие типы терапевтических молекул ДНК, например, используемых в генной терапии. Например, такие молекулы ДНК можно использовать для экспрессии функционального гена в случае, когда субъект имеет генетическое нарушение, вызванное нефункциональной версией этого гена. Примеры таких заболеваний включают мышечную дистрофию Дюшенна, кистозный фиброз, болезнь Гоше и недостаточность аденозиндезаминазы (АЭА). Другие заболевания, при которых может применяться генная терапия, включают воспалительные заболевания, аутоиммунные, хронические и инфекционные заболевания, включая такие заболевания, как СПИД, рак, неврологические заболевания, сердечно-сосудистые заболевания, гиперхолестеринемию, различные заболевания крови, включая различные анемии, талассемию и гемофилию, и эмфизему. Для лечения солидных опухолей можно экспрессировать гены, кодирующие токсические пептиды (например, химиотерапевтические агенты, такие как рицин, дифтерийный токсин и фактор из яда кобры), гены опухолевых супрессоров, таких как р53, гены, кодирующие последовательности мРНК, являющихся антисмысловыми к трансформирующим онкогенам, антинеопластические пептиды, такие как фактор некроза опухолей (ΤNΡ) и другие цитокины, или трансдоминантно-негативные мутанты трансформирующих онкогенов.
Также предусмотрено получение способом по изобретению других типов терапевтических молекул
- 5 021069
ДНК. Например, по способу по изобретению можно получать молекулы ДНК, которые транскрибируются в активные формы РНК, например малые интерферирующие РНК (миРНК).
В вариантах осуществления изобретения, направленных на получение молекул ДНК, имеющих терапевтическое применение, ДНК-матрица будет обычно включать в себя экспрессионную кассету, содержащую один или более промоторных или энхансерных элементов и ген или другую кодирующую последовательность, которые кодируют представляющие интерес РНК или белок. В конкретных вариантах осуществления изобретения, направленных на создание молекул ДНК-вакцины или молекул ДНК для генной терапии, ДНК-матрица включает в себя экспрессионную кассету, состоящую из эукариотического промотора, функционально соединенного с последовательностью, кодирующей представляющий интерес белок, и, необязательно, с энхансерной последовательностью и/или эукариотической последовательностью терминации транскрипции. Обычно ДНК-матрица может находиться в форме вектора, обычно используемого для содержания гена, например, внехромосомного генетического элемента, такого как плазмида.
Промотор представляет собой нуклеотидную последовательность, которая инициирует и регулирует транскрипцию полинуклеотида. Промоторы могут включать в себя индуцируемые промоторы (когда экспрессия полинуклеотидной последовательности, функционально связанной с промотором, индуцируется веществом, определяемым при анализе, кофактором, регуляторным белком и т.д.), репрессируемые промоторы (когда экспрессия полинуклеотидной последовательности, функционально связанной с промотором, подавляется (репрессируется) химическим соединением, кофактором, регуляторным белком и т.д.) и конститутивные промоторы. Предполагается, что термин промотор или контролирующий элемент включает полноразмерные промоторные области и функциональные сегменты этих областей (например, которые контролируют транскрипцию или трансляцию).
Функционально соединенный относится к расположению элементов, при котором описываемые компоненты скомпонованы для выполнения своих обычных функций. Таким образом, данный промотор, функционально соединенный с нуклеотидной последовательностью, способен осуществлять экспрессию этой последовательности в присутствии соответствующих ферментов. Промотор не обязательно должен быть соединен непосредственно с последовательностью, при условии что он осуществляет его экспрессию. Поэтому, например, возможно присутствие промежуточных нетранслируемых, но транскрибируемых последовательностей между промоторной последовательностью и нуклеотидной последовательностью, и промоторную последовательность все еще можно считать функционально соединенной с кодирующей последовательностью. Поэтому предполагается, что термин функционально соединенные охватывает любое пространственное расположение или ориентацию промоторного элемента и представляющей интерес последовательности ДНК, которые позволяют инициировать транскрипцию представляющей интерес последовательности ДНК после узнавания промоторного элемента транскрипционным комплексом.
По настоящему изобретению закрытые линейные молекулы ДНК получают в результате действия протеломеразы на ДНК, амплифицированную на ДНК-матрице, содержащей по меньшей мере одну последовательность-мишень протеломеразы.
Последовательность-мишень протеломеразы представляет собой последовательность ДНК, присутствие которой в матрице ДНК позволяет ее превращение в закрытую линейную ДНК в результате ферментативной активности протеломеразы. Другими словами, последовательность-мишень протеломеразы необходима для расщепления и последующего лигирования двухцепочечной ДНК протеломеразой с образованием ковалентно закрытой линейной ДНК.
Обычно последовательность-мишень протеломеразы содержит любые совершенные палиндромные последовательности, то есть любую последовательность двухцепочечной ДНК, имеющую осевую симметрию вращения 2-го порядка, также описываемую в настоящем документе, как совершенный инвертированный повтор. Как показано на фиг. 3, все последовательности-мишени протеломераз из различных мезофильных бактериофагов и бактериальных плазмид имеют общий признак - присутствие совершенного инвертированного повтора. Длина совершенного инвертированного повтора отличается в зависимости от конкретного организма. У Вотгейа ЬигдбогГсп совершенный инвертированный повтор имеет длину 14 пар оснований. У различных мезофильных бактериофагов совершенный инвертированный повтор имеет длину 22 пары оснований или больше. Также в некоторых случаях, например в случае бактериофага N15 из Е. сой, центральный совершенный инвертированный палиндром фланкирован последовательностями инвертированных повторов, то есть представляет собой центральную часть более крупного несовершенного инвертированного палиндрома (см. фиг. 2 и 3; подчеркнутые основания указывают места, в которых нарушена симметрия инвертированных повторов).
Последовательность-мишень протеломеразы, используемая в изобретении, предпочтительно содержит двухцепочечную палиндромную последовательность (совершенный инвертированный повтор) длиной по меньшей мере 14 пар оснований. Предпочтительные последовательности совершенных инвертированных повторов включают последовательности 8Е0 ГО N0: 16-21 и их варианты. 8Е0 ГО N0: 16 (ΝΟΑΤΝΝΤΑΝΝΟΟΝΝΤΑΝΝΑΤΟΝ) представляет собой 22-нуклеотидную консенсусную последовательность совершенного инвертированного повтора из мезофильного бактериофага. Как показано на фиг.
- 6 021069
3, определенные нуклеотидные позиции совершенного инвертированного повтора консервативны между различными бактериофагами, в то время как в других позициях последовательность может отличаться. Таким образом, §Еф ГО N0: 16 представляет собой минимальную консенсусную последовательность совершенного инвертированного повтора для использования с протеломеразой бактериофага в способе по настоящему изобретению.
Для консенсусной последовательности, определенной §Еф ГО N0: 16, §Еф ГО N0: 17 (ССАТТАТАСОСОСОТАТААТОО) представляет собой особенно предпочтительную последовательность совершенного инвертированного повтора для использования с протеломеразами фага N15 из Е. сой (§Еф ГО N0: 15) и фага РЫК02 из 1<1еЬые11а (§Еф ГО N0: 11). Также для консенсуса, определенного §Еф ГО N0: 16, последовательности §Еф ГО N0: 18-20
ЗЕф ГО N0: 18 (ОСАТАСТАСОСОССТАОТАТОС),
ЗЕф ГО ΝΟ: 19 (ССАТАСТАТАССТАТАОТАТСО),
ЗЕф ГО ΝΟ: 20 (ОСАТАСТАТАСОТАТАОТАТОС), являются особенно предпочтительными последовательностями совершенных инвертированных повторов для использования, соответственно, с протеломеразами фага ΡΥ54 из Усгкииа (§Еф ГО N0: 9), фага рЫНАР-1 из На1отопак (8Еф ГО N0: 7) и фага УР882 из УЛпо (8Еф ΙΌ N0: 13). 8Еф ΙΌ N0: 21 (АТТАТАТАТАТААТ) представляет собой особенно предпочтительную последовательность совершенного инвертированного повтора для использования с протеломеразой из Вотгейа ЬигдйогГсп. Эта последовательность совершенного инвертированного повтора находится в линейной ковалентно закрытой плазмиде 1рВ31.16, содержащейся в Вотгейа ЬигдйогГеп. Эта 14-нуклеотидная последовательность короче 22нуклеотидного консенсусного совершенного инвертированного повтора для бактериофагов (8Еф ГО N0: 16), что указывает на то, что бактериальные протеломеразы могут отличаться по специфичным последовательностям-мишеням от бактериальных протеломераз. Однако все последовательности-мишени протеломераз несут общий структурный мотив совершенного инвертированного повтора.
Последовательность совершенного инвертированного повтора может иметь длину больше 22 нуклеотидов в зависимости от требований конкретной протеломеразы, используемой в способе по изобретению. Поэтому в некоторых вариантах осуществления изобретения длина совершенного инвертированного повтора может составлять по меньшей мере 30, по меньшей мере 40, по меньшей мере 60, по меньшей мере 80 или по меньшей мере 100 пар оснований. Примеры таких последовательностей совершенных инвертированных повторов включают 8Еф ГО N0: 22-24 и их варианты.
ЗЕф ГО N0: 22 (ОССАТАСТАТАСОТАТАОТАТССС)
ЗЕфГОЫО: 23 (АССТАТТТСАОСАТАСТАСОСОСОТАОТАТОСТОАААТАООТ)
ЗЕф ГО ΝΟ: 24 (ССТАТАТТОООССАССТАТОТАТОСАСАОТТСОСССАТАСТАТАСОТ
АТАОТАТОООСОААСТОТОСАТАСАТАООТООСССААТАТАСО)
8Еф ГО N0: 22-24 и их варианты особенно предпочтительны для использования, соответственно, с протеломеразами фага УР882 из У1Ьпо (8Еф ГО N0: 13), фага ΡΥ54 из Уегыша (8Еф ГО N0: 9) и фага рЫНАР-1 из На1отопак (8Еф ГО N0: 7).
Совершенный инвертированный повтор может фланкироваться дополнительными последовательностями инвертированных повторов. Фланкирующие инвертированные повторы могут представлять собой совершенные или несовершенные повторы, то есть могут быть полностью симметричными или частично симметричными.
Фланкирующие инвертированные повторы могут примыкать непосредственно к центральному палиндрому или могут быть отделены от него. Протеломеразная последовательность-мишень может включать в себя последовательность несовершенного инвертированного повтора, которая содержит последовательность совершенного инвертированного повтора длиной по меньшей мере 14 пар оснований. Примером является 8Еф ГО N0: 29. Последовательность несовершенного инвертированного повтора может содержать последовательность совершенного инвертированного повтора длиной по меньшей мере 22 пары оснований. Примером является 8Еф ГО N0: 25.
Особенно предпочтительные протеломеразные последовательности-мишени включают в себя последовательности 8Еф ГО N0: 25-29 или их варианты.
- 7 021069
5Е<? Ю N0:25:
(ТАТСАОСАСАСААТТОСССАТТАТАССССССТАТААТОСАСТАТТО
ТОТОСТОАТА)
5Е<3 ГО ΝΟ: 26 (АТССОСССАТССАТТАТАСОСОССТАТААТССССАТААТАСА)
5Е0 ГО ΝΟ: 27 (ТАОТСАССТАТТТСАОСАТАСТАСОСОССТАОТАТССТОАААТАОО
ТТАСТС)
5Ε(}ΙΟΝΟ:28:
(ОСОАТСССОТТССАТАСАТАСАТОТАТССАТСТСССАТАСТАТАСО
ТАТАОТАТССССАТОТТАСАТАТООТАТСАТТССССАТСССОТТ)
8Εζ> ГО ΝΟ: 29 (ТАСТАААТАААТАТТАТАТАТАТААТТТТТТАТТАСТА)
Последовательности δΕΟ ГО N0: 25-29 содержат последовательности совершенных инвертированных повторов, описанных выше, и дополнительно содержат фланкирующие последовательности из соответствующих организмов.
Последовательность-мишень протеломеразы, содержащая последовательность δΕΟ ГО N0: 25 или ее вариант, предпочтительна для использования совместно с протеломеразой ТеШ (фаг N15 из Е. сой) с последовательностью δΕΟ ГО N0: 15 или ее вариантами. Последовательность-мишень протеломеразы, содержащая последовательность δΕΟ ГО N0: 26 или ее вариант, предпочтительна для использования совместно с протеломеразой фага РЫК02 из К1еЬ51е11а с последовательностью δΕΟ ΙΌ N0: 11 или ее вариантами. Последовательность-мишень протеломеразы, содержащая последовательность δΕΟ ГО N0: 27 или ее вариант, предпочтительна для использования совместно с протеломеразой фага ΡΥ54 из Υе^5^η^а с последовательностью δΕΟ ГО N0: 9 или ее вариантами. Последовательность-мишень протеломеразы, содержащая последовательность δΕΟ ГО N0: 28 или ее вариант, предпочтительна для использования совместно с протеломеразой фага УР882 из У1Ьпо с последовательностью δΕΟ ΙΌ N0: 13 или ее вариантами. Последовательность-мишень протеломеразы, содержащая последовательность δΕΟ ГО N0: 29 или ее вариант, предпочтительна для использования совместно с протеломеразой ВоттеНа ЬигдНогГсп.
Варианты любой палиндромной последовательности или последовательности-мишени протеломеразы, описанных выше, включают их гомологи и мутанты. Мутанты включают укороченные последовательности, замены или делеции в последовательности относительно нативной последовательности. Вариант последовательности представляет собой любую последовательность, присутствие которой в ДНКматрице позволяет ее превращение в закрытую линейную ДНК в результате ферментативной активности протеломеразы. Это легко можно определить, используя соответствующий метод анализа образования закрытой линейной ДНК. Можно использовать любой подходящий метод анализа, описанный в данной области. Пример подходящего метода анализа описан в Эепеке е1 а1., ΡNΑδ (2000) 97, 7721-7726. Предпочтительно указанный вариант обеспечивает связывание и активность протеломеразы, которые сравнимы со свойствами и активностью, наблюдаемыми в случае нативной последовательности. Примеры предпочтительных вариантов палиндромных последовательностей, описанных в настоящем документе, включают в себя укороченные палиндромные последовательности, в которых сохранена структура совершенного повтора и которые сохраняют способность обеспечивать образование закрытой линейной ДНК.
Однако варианты последовательностей-мишеней протеломеразы могут быть модифицированы таким образом, что они не сохраняют структуру совершенного палиндрома при условии, что они способны действовать в качестве субстратов для действия протеломеразы.
Следует понимать, что опытный специалист легко определит подходящие последовательностимишени протеломеразы для использования в изобретении, исходя из структурных принципов, указанных выше. Потенциальные последовательности-мишени протеломеразы можно скринировать на их способность обеспечивать образование закрытой линейной ДНК, используя описанные выше методы анализа.
ДНК-матрица может содержать больше одной протеломеразной последовательности-мишени, например две, три, четыре, пять, десять или больше протеломеразных последовательностей-мишеней. Использование множества протеломеразных последовательностей-мишеней может позволить вырезать короткие закрытые линейные ДНК, содержащие представляющие интерес последовательности, из более крупной молекулы ДНК. В частности, одна или более представляющих интерес последовательностей в матрице ДНК могут фланкироваться с двух сторон (то есть с 5' и 3') последовательностью-мишенью протеломеразы. Две фланкирующие последовательности-мишени протеломеразы могут затем опосредовать вырезание каждой короткой представляющей интерес последовательности из амплифицированной ДНК в качестве закрытой линейной ДНК, объекта действия протеломеразы (как показано на фиг. 5). ДНКматрица может содержать одну или более представляющих интерес последовательностей (предпочти- 8 021069 тельно экспрессионных кассет), фланкированных с двух сторон последовательностями-мишенями протеломеразы. ДНК-матрица может включать в себя две, три, четыре, пять или более представляющих интерес последовательностей, фланкированных протеломеразными последовательностями-мишенями, описанными выше.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения в способе по изобретению используют матрицу ДНК, содержащую экспрессионную кассету, фланкированную с двух сторон последовательностью-мишенью протеломеразы. Предпочтительно, чтобы экспрессионная кассета содержала эукариотический промотор, функционально соединенный с представляющей интерес кодирующей последовательностью и, необязательно, с эукариотической последовательность терминации транскрипции. В этом варианте осуществления изобретения после амплификации матрицы ДНК и контактирования с протеломеразой по изобретению экспрессионная кассета высвобождается из амплифицированной матрицы в качестве закрытой линейной ДНК. Как результат, из продукта одновременно удаляются излишние последовательности в матрице ДНК.
Такие излишние или дополнительные последовательности (также описываемые как бактериальные или векторные последовательности) могут включать в себя бактериальную точку инициации репликации, бактериальные селективные маркеры (например, гены устойчивости к антибиотикам) и неметилированные СрО-динуклеотиды. Удаление таких последовательностей создает минимальную экспрессионную кассету, которая не содержит дополнительного генетического материала. Также вышеописанные бактериальные последовательности могут быть проблематичными для некоторых терапевтических подходов. Например, в клетках млекопитающих бактериальная/плазмидная ДНК может вызывать выключение экспрессии клонированного гена, что делает невозможным получение продолжительной экспрессии представляющего интерес белка. Также используемые при размножении бактерий гены устойчивости к антибиотикам могут представлять собой фактор риска для здоровья человека. Кроме того, бактериальная плазмидная/векторная ДНК может запустить нежелательный неспецифичный иммунный ответ. Определенные характеристики последовательностей бактериальной ДНК, присутствие неметилированных цитозин-гуаниновых динуклеотидов, обычно известных как СрО-мотивы, также может привести к нежелательным иммунным ответам.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, особенно, если продукт - закрытая линейная ДНК - представляет собой ДНК-вакцину, СрО-мотивы можно сохранить в последовательности продукта. Это обусловлено тем, что они обеспечивают выгодный адъювантный эффект на иммунный ответ на кодируемый белок.
Поэтому изобретение относится к ίη νίίτο способу получения закрытой линейной экспрессионной ДНК-кассеты. Этот способ включает в себя: а) контактирование матрицы ДНК, содержащей по меньшей мере одну экспрессионную кассету, фланкированную с двух сторон последовательностью-мишенью протеломеразы, по меньшей мере с одной ДНК-полимеразой в присутствии одного или более праймеров в условиях, способствующих амплификации указанной матрицы; и Ь) контактирование амплифицированной ДНК, полученной в а), по меньшей мере с одной протеломеразой в условиях, способствующих образованию закрытой линейной экспрессионной ДНК-кассеты. Продукт - закрытая линейная экспрессионная ДНК-кассета - может содержать, состоять из или состоять, по существу, из эукариотического промотора, функционально соединенного с представляющей интерес кодирующей последовательностью и, необязательно, с эукариотической последовательностью терминации транскрипции. В продукте - закрытой линейной экспрессионной ДНК-кассете - дополнительно могут отсутствовать одна или более бактериальных или векторных последовательностей, обычно выбранных из группы, состоящей из:
(ί) бактериальной точки инициации репликации; (ίί) бактериальных селективных маркеров (обычно генов устойчивости к антибиотикам) и (ίίί) неметилированных СрО-мотивов.
Как указано выше, любую ДНК-матрицу, содержащую по меньшей мере одну последовательностьмишень протеломеразы, можно амплифицировать по способу по изобретению. Поэтому, хотя предпочтительным является продукция ДНК-вакцин и других терапевтических молекул ДНК, способ по изобретению можно использовать для получения любого типа закрытой линейной ДНК. ДНК-матрица может быть двухцепочечной (дц) или одноцепочечной (оц) ДНК. Двухцепочечная ДНК-матрица может быть открытой кольцевой двухцепочечной ДНК, закрытой кольцевой двухцепочечной ДНК, открытой линейной двухцепочечной ДНК или закрытой линейной двухцепочечной ДНК. Предпочтительно, чтобы матрица была закрытой кольцевой двухцепочечной ДНК. Закрытые кольцевые дцДНК-матрицы особенно предпочтительны для использования с КСЛ-ДНК-полимеразами. Кольцевая дцДНК-матрица может представлять собой плазмиду или другой вектор, обычно используемый для содержания гена при размножении бактерий. Поэтому способ по изобретению можно использовать для амплификации любой доступной в продаже плазмиды или другого вектора, таких как доступное в продаже лекарственное средство на основе ДНК, и затем для превращения амплифицированной векторной ДНК в закрытую линейную ДНК.
Открытую кольцевую дцДНК можно использовать в качестве матрицы, когда ДНК-полимераза представляет собой полимеразу с активностью вытеснения цепи, которая может инициировать амплификацию с цепи ДНК, имеющей разрыв. В этом варианте осуществления изобретения матрицу можно пред- 9 021069 варительно инкубировать с одним или более ферментами, которые вносят одноцепочечные разрывы в цепь ДНК в матрице в одном или более местах. Закрытую линейную дцДНК также можно использовать в качестве матрицы. Закрытая линейная дцДНК-матрица (стартовый материал) может быть идентична продукту закрытой линейной ДНК. При использовании в качестве матрицы закрытой линейной ДНК ее можно инкубировать при денатурирующих условиях для образования одноцепочечной кольцевой ДНК перед внесением в условия или в условиях, способствующих амплификации матричной ДНК.
Как указано выше, ДНК-матрица обычно включает в себя экспрессионную кассету, описанную выше, то есть содержит, состоит из или, по существу, состоит из эукариотического промотора, функционально связанного с последовательностью, кодирующей представляющий интерес белок, и, необязательно, с эукариотической последовательностью терминации транскрипции. Необязательно, экспрессионная кассета может представлять собой минимальную экспрессионную кассету, определенную выше, то есть в которой отсутствуют одна или более бактериальных или векторных последовательностей, обычно выбранных из группы, состоящей из: (ί) бактериальной точки инициации репликации; (ίί) бактериальных селективных маркеров (обычно генов устойчивости к антибиотикам) и (ίίί) неметилированных СрСмотивов.
ДНК-матрица может быть предоставлена в количестве, достаточном для использования в процессе по любому способу, известному в данной области. Например, ДНК-матрицу можно получить с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Если ДНК-матрица является дцДНК, то в амплификации ее используют в виде денатурированной одноцепочечной ДНК, получаемой предварительной инкубацией при температуре по меньшей мере 94°С. Поэтому способ по изобретению предпочтительно включает в себя стадию денатурации дцДНК-матрицы для получения одноцепочечной ДНК. В качестве альтернативы дцДНК может быть предоставлена в двухцепочечной форме. В реакции может амплифицироваться вся ДНК-матрица или ее избранный участок.
Осуществляют контакт ДНК-матрицы по меньшей мере с одной ДНК-полимеразой в условиях, способствующих амплификации указанной матрицы. Можно использовать любую ДНК-полимеразу. Любая доступная в продаже ДНК-полимераза подходит для использования в способе по изобретению. Можно использовать две, три, четыре, пять или более различных ДНК-полимераз, например одну, которая обеспечивает корректирующую функцию, и одну или более других, которые не имеют корректирующей функции. Можно использовать ДНК-полимеразы с различными механизмами действия, например полимеразы с активностью вытеснения цепи, и ДНК-полимеразы, реплицирующие ДНК другими способами. Подходящим примером ДНК-полимеразы, которая не имеет активности вытеснения цепи, является ДНКполимераза фага Т4.
Предпочтительной является высокая стабильность ДНК-полимеразы, чтобы ее активность значительно не снижалась в результате продолжительной инкубации в условиях проведения способа. Поэтому предпочтительно, чтобы фермент имел большое время полужизни в диапазоне условий проведения способа, включающих в себя, но не ограниченных этим, температуру и рН. Также предпочтительно, чтобы ДНК-полимераза имела одну или более характеристик, подходящих для способа изготовления. Предпочтительно, чтобы ДНК-полимераза имела высокую точность, например, благодаря корректирующей активности. Кроме того, предпочтительна высокая процессивность ДНК-полимеразы, высокая активность вытеснения цепи и низкие величины Кт для 6ΝΤΡ и ΌΝΆ. ДНК-полимераза способна использовать в качестве матрицы кольцевую и/или линейную ДНК. ДНК-полимераза способна использовать в качестве матрицы дцДНК или оцДНК. Предпочтительно, чтобы ДНК-полимераза не проявляла неспецифичной экзонуклеазной активности.
Опытный специалист может определить, имеет ли данная ДНК-полимераза характеристики, описанные выше, путем сравнения со свойствами, проявляемыми коммерчески доступными ДНКполимеразами, например, рЫ29, Эсер УсЩ® и ДНК-полимеразой I из ВасШик ЧсагоШсгторНПик (ΒδΙ). последовательности которых приведены в §ЕЦ ГО N0: 2, 3 и 5 соответственно. Вч ДНК-полимераза I доступна в продаже от компании Νθ№ Еп§1апб Вю1аЪ8, 1пс. Высокая процессивность обычно относится к среднему числу нуклеотидов, добавляемых ферментом ДНК-полимеразой на ассоциацию/диссоциацию с матрицей, то есть длине фрагмента, синтезируемого с праймера, получаемой в одном событии ассоциации.
Предпочтительны полимеразы с активностью вытеснения цепи. Предпочтительными полимеразами с активностью вытеснения цепи являются Ρ1ιί29 (8ЕЦ ΙΌ N0: 2), Эсер Усп1® (8ЕЦ ГО N0: 3) и Вч ДНКполимераза I (8ЕЦ ГО N0: 5) или варианты любой из них. Варианты последовательностей §ЕЦ ГО N0: 2, 3 и 5 могут представлять собой варианты, которые описаны ниже для протеломеразных ферментов. Термин вытеснение цепи используют в настоящем документе для описания способности ДНК-полимеразы замещать комплементарные цепи при встрече с областью двухцепочечной ДНК в ходе синтеза ДНК. Следует понимать, что способы амплификации с вытеснением цепи отличаются от способов на основе ПЦР тем, что для эффективной амплификации ДНК не требуются циклы денатурации, поскольку двухцепочечная ДНК не является препятствием для непрерывного синтеза новых цепей ДНК. В отличие от этого, ПЦР требует циклов денатурации в ходе процесса амплификации (то есть повышения температу- 10 021069 ры до 94°С или выше) для расплавления двухцепочечной ДНК и получения новых одноцепочечных матриц.
Предпочтительно, чтобы ДНК-полимераза с активностью вытеснения цепи, используемая в способе по изобретению, имела процессивность (длину фрагмента, синтезируемого с праймера) по меньшей мере 20 т.п.о., более предпочтительно по меньшей мере 30 т.п.о., по меньшей мере 50 т.п.о. или по меньшей мере 70 т.п.о. или больше. В особенно предпочтительных вариантах осуществления изобретения ДНКполимераза с активностью вытеснения цепи имеет процессивность, сравнимую с процессивностью ДНКполимеразы рН29, или более высокую процессивность.
Предпочтительным способом репликации с вытеснением цепи является амплификация по типу катящегося кольца (КСА). Термин КСА описывает способность ДНК-полимераз КСА-типа (также именуемых в настоящем описании КСА-полимеразами) непрерывно продвигаться по кольцевой цепи ДНКматрицы, одновременно удлиняя гибридизованный праймер. Это приводит к образованию линейных одноцепочечных продуктов с множественными повторами амплифицированной ДНК. Эти линейные одноцепочечные продукты служат в качестве основания для множественных событий гибридизации, удлинения праймера и вытеснения цепи, приводя к образованию продуктов конкатемерных двухцепочечных ДНК, также содержащих множественные повторы амплифицированной ДНК. Таким образом, в продуктах конкатемерных двухцепочечных ДНК присутствуют множественные копии каждого амплифицированного одиночного элемента ДНК.
КСА-полимеразы особенно предпочтительны для использования в способе по настоящему изобретению. Продукты способов репликации с вытеснением цепи по типу КСЛ обычно требуют сложной обработки для высвобождения одиночных элементов ДНК. Настоящее изобретение выгодно тем, что использование каталитических функций протеломеразы позволяет провести эту обработку в одну стадию. Использование протеломеразы также напрямую генерирует желательную закрытую структуру ДНК без необходимости в дополнительных стадиях обработки для образования молекул, имеющих эту структуру.
Для проведения амплификации по изобретению предпочтительно, чтобы ДНК-матрица также контактировала с одним или более праймерами. Праймеры могут быть неспецифичными (например, со случайной последовательностью) или могут быть специфичными к одной или более последовательностям, содержащимся в ДНК-матрице. Предпочтительно, чтобы праймеры имели случайную последовательность для возможности неспецифической инициации в любом участке ДНК-матрицы. Это дает высокую эффективность амплификации в результате множественных реакций инициации с каждой матричной цепи. Примерами праймеров со случайной последовательностью являются гексамеры, гептамеры, октамеры, нонамеры, декамеры или последовательности большей длины, например 12, 15, 18, 20 или 30 нуклеотидов в длину. Праймер со случайной последовательностью может быть от 6 до 30, от 8 до 30 или от 12 до 30 нуклеотидов в длину. Праймеры со случайной последовательностью обычно поставляются в виде смеси олигонуклеотидов, которые представляют собой все возможные комбинации, например, гексамеров, гептамеров, октамеров или нонамеров в матрице ДНК.
В других вариантах осуществления изобретения праймеры являются специфичными. Это означает, что они имеют последовательность, комплементарную последовательности ДНК-матрицы, с которой желательно инициировать амплификацию. В этом варианте осуществления изобретения пару праймеров можно использовать для специфичной амплификации участка ДНК-матрицы, который является внутренним относительно участков связывания двух праймеров. Праймеры могут быть немеченными или могут включать в себя одну или более меток, например радионуклидов или флуоресцентных красителей. Праймеры могут также содержать химически модифицированные нуклеотиды. Длину и последовательность праймеров обычно можно выбрать, исходя из температуры отжига, то есть способности связывать матрицу при температуре, используемой на стадии амплификации.
Контактирование ДНК-матрицы с ДНК-полимеразой и одним или более праймерами происходит в условиях, способствующих отжигу праймеров на ДНК-матрице. Условия включают присутствие одноцепочечной ДНК, позволяющее гибридизацию праймеров. Условия также включают температуру и буфер, позволяющие отжиг праймера на матрице. Соответствующие условия отжига/гибридизации можно выбрать в зависимости от природы праймера. Пример предпочтительных условий отжига, используемых в настоящем изобретении, включает буфер: 30 мМ Тп5-НС1. рН 7,5, 20 мМ КС1, 8 мМ М§С12. Отжиг можно проводит после денатурации постепенным охлаждением до желаемой температуры реакции.
После контакта ДНК-матрицы с ДНК-полимеразой и одним или более праймерами следует стадия инкубации в условиях, способствующих амплификации указанной матрицы. Предпочтительно, чтобы условия способствовали амплификации указанной матрицы путем вытеснения реплицированных цепей посредством репликации другой цепи по типу вытеснения цепи. Условия включают использование любой температуры, позволяющей амплификацию ДНК, обычно в пределах от 20 до 90°С. Предпочтительный температурный диапазон может составлять от примерно 20 до примерно 40 или от примерно 25 до примерно 35°С.
Обычно соответствующую температуру выбирают исходя из температуры, при которой конкретная ДНК-полимераза имеет оптимальную активность. Эта информация обычно известна и входит в объем общих знаний опытного специалиста. Например, при использовании ДНК-полимеразы р!й29 подходя- 11 021069 щий температурный диапазон будет составлять от примерно 25 до примерно 35°С, предпочтительно примерно 30°С. Опытному специалисту будет просто определить подходящую температуру для эффективной амплификации по способу по изобретению. Например, способ можно проводить в диапазоне температур и контролировать выход амплифицированной ДНК для идентификации оптимального температурного диапазона для данной ДНК-полимеразы.
Другие условия, способствующие амплификации ДНК-матрицы, включают в себя присутствие ДНК-полимеразы и одного или более праймеров. Условия также включают в себя присутствие всех четырех дезоксирибонуклеотидов (άΝΤΡ), АТР, ТТР, СТР и ОТР, соответствующие буферные агенты/рН и другие факторы, которые требуются для работы фермента или стабильности. Подходящие условия включают любые условия, обеспечивающие активность ДНК-полимераз, известных в данной области.
Например, рН может находиться в диапазоне от 3 до 10, предпочтительно от 5 до 8 или составлять примерно 7, например примерно 7,5. рН можно поддерживать в этом диапазоне, используя один или более буферный агент. Такие буферы включают, но не ограничены этим, МЕ8, В18-ТГ18, АЭА, АСЕ8, Р1РЕ8, МОВ8, МОР8, МОР8О, В18-Тг18 Ргорапе, ВЕ8, ТЕ8, НЕРЕ8, ΌΙΡ8Ο, ТАР8О, Тп/та, НЕРР8О, РОР8О, ТЕА, ЕРР8, Тпсше, О1у-О1у, Вюше, НЕРВ8, ТАР8, АМРО, ТАВ8, АМР8О, СНЕ8, САР8О, АМР, САР8, САВ8, фосфатный буфер, буфер лимонная кислота-гидрофосфат натрия, буфер уксусная кислотацитрат натрия, буфер ацетат натрия-уксусная кислота, имидазольный буфер и буфер карбонат натриябикарбонат натрия. Реакция может также содержать соли двухвалентных металлов, таких как, но не ограниченных ими, соли магния (Мд2') и марганца (Мп2'), включая хлориды, ацетаты и сульфаты. Также можно включать соли одновалентных металлов, таких как соли натрия и соли калия, например хлорид калия. Другими солями, которые могут быть включены, являются соли аммония, в частности сульфат аммония.
Также могут быть включены детергенты. Примеры подходящих детергентов включают Тгйоп X100, Т\\ееп 20 и производные любого из них. В реакцию можно также включить стабилизирующие агенты. Можно использовать любой стабилизирующий агент, в частности бычий сывороточный альбумин (БСА), и другие стабилизирующие белки. Реакционные условия также можно улучшить добавлением агентов, раскручивающих спираль ДНК и делающих более легкой денатурацию матрицы. Такие агенты включают, например, диметилсульфоксид (ДМСО), формамид, глицерин и бетаин.
Следует понимать, что опытный специалист способен модифицировать и оптимизировать условия амплификации и инкубации для способа по изобретению, исходя из своих общих знаний. Аналогичным образом, определенные концентрации конкретных агентов можно выбрать на основе предшествующих примеров в данной области и дополнительно оптимизировать их, исходя из общих сведений. Например, подходящим реакционным буфером в способах на основе КСА в данной области является буфер: 50 мМ ТЙ8-НС1, рН 7,5, 10 мМ МдС12, 20 мМ (NН4)28Ο4, 5% глицерина, 0,2 мМ БСА, 1 мМ άΝΊΚ Предпочтительным реакционным буфером, используемым в КСА-амплификации по изобретению, является буфер: 35 мМ ТГ18-НС1, 50 мМ КС1, 14 мМ МдС12, 10 мМ ^4)28О4, 4 мМ ОТТ, 1 мМ ЙЭТР. Этот буфер особенно подходит для использования с КСА-полимеразой рЫ29.
Реакционные условия могут также включать в себя использование одного или более дополнительных белков. ДНК-матрицу можно амплифицировать в присутствии по меньшей мере одной пирофосфатазы, такой как дрожжевая неорганическая пирофосфатаза. Можно использовать две, три, четыре, пять или более различных пирофосфатаз. Эти ферменты способны разрушать пирофосфат, образуемый ДНКполимеразой из ДКТР в процессе репликации цепи. Накопление пирофосфата в реакции может ингибировать ДНК-полимеразу и снижать скорость и эффективность ДНК-амплификации. Пирофосфатазы могут расщеплять пирофосфат до неингибирующего фосфата. Примером подходящей пирофосфатазы для использования в способе по настоящему изобретению является пирофосфатаза из 8ассйаготусе8 сегеν^8^ае, доступная в продаже от компании №ν Епд1апД Вю1аЬ8, 1пс.
В способе по изобретению для стабилизации одноцепочечной ДНК можно использовать любой белок, связывающий одноцепочечную ДНК (88ВР). Белки 88ВР являются необходимыми компонентами живых клеток и участвуют во всех процессах, включающих оцДНК, таких как репликация, восстановление и рекомбинация ДНК. В этих процессах 88ВР связывают временно образующуюся оцДНК и могут способствовать стабилизации структуры оцДНК. Примером подходящего 88ВР для использования в процессе по настоящему изобретению является белок гена 32 фага Т4, доступный в продаже от №ν Епд1апД Вю1аЬ8, 1пс.
В дополнение к стадии амплификации способ по изобретению также включает в себя стадию продукции закрытой линейной ДНК. Амплифицированная ДНК контактирует по меньшей мере с одной протеломеразой в условиях, способствующих продукции закрытой линейной ДНК. Эта простая стадия обработки, основанная на свойствах протеломеразы, дает преимущество относительно других способов, используемых для продукции молекул закрытой линейной ДНК. Стадии амплификации и обработки можно проводить одновременно или последовательно. Однако предпочтительно последовательное проведение стадий амплификации и обработки, причем стадию обработки проводят после стадии амплификации (то есть на амплифицированной ДНК).
Используемой в изобретении протеломеразой является любой полипептид, способный расщеплять
- 12 021069 и повторно соединять матрицу, содержащую сайт-мишень протеломеразы, для получения молекулы ковалентно закрытой линейной ДНК. Таким образом, протеломераза имеет функции расщепления и лигирования ДНК. Ферменты, имеющие протеломеразную активность, также были описаны как теломеррезолвазы (например, в Вотгейа ЬигдйогГеп). Типичным субстратом протеломеразы является кольцевая двухцепочечная ДНК. Если такая ДНК содержит сайт-мишень протеломеразы, то фермент может разрезать ДНК по этому сайту и лигировать концы, создавая линейную двухцепочечную ковалентно закрытую молекулу ДНК. Требования к сайтам-мишеням протеломеразы описаны выше. Также, как указано выше, способность данного полипептида катализировать продукцию закрытой линейной ДНК из матрицы, содержащей сайт-мишень протеломеразы, можно определить с помощью любого соответствующего метода анализа, описанного в данной области.
Протеломеразы также описаны у бактериофагов. В некоторых лизогенных бактериях бактериофаги существуют в качестве внехромосомной ДНК, представляющей собой линейные двухцепочечные молекулы с ковалентно закрытыми концами. Репликация этой ДНК и сохранение ковалентно закрытых концов (или теломерных концов) зависят от активности фермента протеломеразы. Роль протеломеразы в репликации вирусной ДНК проиллюстрирована на фиг. 1. Примером этой каталитической активности является активность фермента Те1Ы из бактериофага N15, который инфицирует ЕксйепсЫа со11. ТеШ распознает определенную нуклеотидную последовательность в кольцевой двухцепочечной ДНК. Эта последовательность представляет собой немного несовершенную инвертированную палиндромную структуру, называемую 1е1РЬ, содержащую две половины, 1е1Р и 1е1Ь, фланкирующие 22-нуклеотидный инвертированный совершенный повтор (1е1О) (см. фиг. 2). Два сайта 1е1РЬ образуются в кольцевой двухцепочечной ДНК в результате исходной активности специфичной ДНК-полимеразы, действующей на линейной ДНК профага. ТеШ превращает эту кольцевую ДНК в две идентичные линейные молекулы ДНК профага, завершая цикл репликации. 1е1Р и 1е1Ь содержат закрытые концы линейной ДНК профага, давая возможность дальнейшей репликации ДНК аналогичным образом.
Способ по изобретению требует использования по меньшей мере одной протеломеразы. Способ по изобретению может включать в себя использование более одной протеломеразы, например двух, трех, четырех, пяти или более различных протеломераз. Примеры подходящих протеломераз включают протеломеразы из бактериофагов, таких как рЫНЛР-1 из На1отопак асщатаппа (§ЕЦ ГО N0: 7), ΡΥ54 из Υσ51та еп1его1у11са (§ЕЦ ГО N0: 9), рЫК02 из К1еЬк1е11а охуЮса (§ЕЦ ГО N0: 11) и УР882 из УФпо кр. (§ЕЦ ГО N0: 13) и N15 из ЕксйепсЫа сой (§ЕЦ ГО N0: 15) или варианты любой из них. Особенно предпочтительно использование протеломеразы бактериофага N15 (§ЕЦ ГО N0: 15) или ее варианта. Варианты 8Е0 ГО N0: 7, 9, 11, 13 и 15 включают их гомологи и мутанты. Мутанты включают укороченные последовательности, замены или делеции в последовательности относительно нативной последовательности. Вариант должен продуцировать закрытую линейную ДНК из матрицы, содержащей сайт-мишень протеломеразы, описанный выше.
Любые упоминаемые в настоящем документе гомологи обычно являются функциональными гомологами и обычно имеют гомологию по меньшей мере 40% с соответствующей областью нативного белка. Гомологию можно определить с помощью известных способов. Например, в пакете программ ИАОСО Раскаде находится программа ВЕ8ТР1Т, которую можно использовать для вычисления гомологии (например, используя ее настройки по умолчанию) (Эеуегеих е! а1. (1984) №с1ею Ас1йк Рекеагсй 12, 387395). Алгоритмы РГОЕИР и ВЬА§Т можно использовать для вычисления гомологии или выравнивания последовательностей (обычно с их настройками по умолчанию), например, как описано в Айксйи1 8.Р. (1993) 1. Мо1. Еуо1. 36:290-300; Айксйи1, 8.Р. е! а1. (1990) 1. Мо1. Вю1. 215:403-10. Программное обеспечение для проведения анализа последовательностей с помощью алгоритма ВЬА§Т общедоступно в Национальном Центре Биотехнологической информации (Ы1р://\у\у\УЛ1сЫ.п1тлпйдо\7).
Алгоритм ВЬА§Т выполняет статистический анализ подобия между двумя последовательностями; см., например, Катйи апй Айксйи1 (1993) Ргос. №И. Асай. §сЕ И8А 90: 5873-5787. Одним из параметров подобия, обеспечиваемых алгоритмом ВЬА§Т, является наименьшая вероятность суммы (Р(Ц)), которая указывает вероятность, с которой совпадение между двумя нуклеотидными или аминокислотными последовательностями произойдет случайно. Например, последовательность считается подобной другой последовательности, если наименьшая вероятность суммы в сравнении первой последовательности со второй последовательностью меньше примерно 1, предпочтительно меньше примерно 0,1, более предпочтительно меньше примерно 0,01 и наиболее предпочтительно меньше примерно 0,001.
Вариант полипептида содержит последовательность (или состоит из последовательности), которая имеет по меньшей мере 40% идентичности с нативным белком. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения вариант последовательности может иметь по меньшей мере 55, 65, 70, 75, 80, 85, 90% и более предпочтительно по меньшей мере 95, 97 или 99% гомологии с конкретной областью нативного белка на протяжении по меньшей мере 20, предпочтительно по меньшей мере 30, например, по меньшей мере 40, 60, 100, 200, 300, 400 или больше непрерывных аминокислот или даже на протяжении всей последовательности варианта. В качестве альтернативы вариант последовательности может иметь по меньшей мере 55, 65, 70, 75, 80, 85, 90% и более предпочтительно по меньшей мере 95, 97 или 99%
- 13 021069 гомологии с полноразмерным нативным белком. Обычно вариант последовательности отличается от значимой области нативного белка по меньшей мере или не более чем 2, 5, 10, 20, 40, 50 или 60 мутациями (каждая из которых может быть заменой, вставкой или делецией). Вариант последовательности по изобретению может иметь процент идентичности с конкретной областью полноразмерного нативного белка, который совпадает с любым из определенных процентных значений гомологии (то есть он может иметь по меньшей мере 40, 55, 80 или 90% и более предпочтительно по меньшей мере 95, 97 или 99% идентичности) по любой длине последовательности, описанной выше.
Варианты нативного белка также включают укорачивание последовательности. Можно использовать любое укорачивание последовательности при условии, что вариант все еще способен продуцировать закрытую линейную ДНК, описанную выше. Укорачивание последовательности обычно осуществляют для удаления последовательностей, которые не являются необходимыми для каталитической активности и/или не влияют на конформацию свернутого белка, в частности на сворачивание активного сайта. Укорачивание последовательности также выбирают для улучшения растворимости полипептида протеломеразы. Подходящие укороченные последовательности можно легко идентифицировать систематическим удалением последовательностей разной длины с Ν- или С-конца.
Варианты нативного белка дополнительно включают мутанты, которые имеют одну или более, например 2, 3, 4, 5-10, 10-20, 20-40 или больше аминокислотных вставок, замен или делеций относительно конкретной области нативного белка. Делеции и вставки предпочтительно проводить вне каталитического домена. Вставки обычно проводят на Ν- или С-концах последовательности, полученной из нативного белка, например, для рекомбинантной экспрессии. Замены также обычно проводят в областях, которые не являются необходимыми для каталитической активности и/или не влияют на конформацию свернутого белка. Такие замены можно осуществить для улучшения растворимости или других характеристик фермента. Хотя обычно это не является предпочтительным, также можно осуществить замены в активном сайте или во второй сфере, то есть осуществить замены остатков, которые влияют или контактируют с позицией или ориентацией одной или более аминокислот в активном сайте. Эти замены могут проводиться для улучшения каталитических свойств.
Замены предпочтительно вводят в одно или более консервативных изменений, при которых аминокислоты замещают другими аминокислотами с аналогичной химической структурой, аналогичными химическими свойствами или аналогичными боковыми цепями. Введенные аминокислоты могут иметь полярность, гидрофильность, гидрофобность, основность, кислотность, нейтральность или заряд, аналогичные аминокислотам, которые они замещают. В качестве альтернативы консервативная замена может вводить другую аминокислоту, которая является ароматической или алифатической, вместо ранее присутствующей ароматической или алифатической аминокислоты. Консервативные аминокислотные замены хорошо известны в данной области и их можно подобрать в соответствии со свойствами 20 основных аминокислот, описанных в табл. А.
Таблица А
Химические свойства аминокислот
А1а Алифатическая, гидрофобная, нейтральная МеД Гидрофобная, нейтральная
Суз Полярная, гидрофобная, нейтральная Азп Полярная, гидрофильная, нейтральная
Агр Полярная, гидрофильная, заряженная {-) Рго Гидрофобная, нейтральная
31и Полярная, гидрофильная, заряженная (-) С1п Полярная, гидрофильная, нейтральная
РНе Ароматическая, гидрофобная, нейтральная Агд Полярная, гидрофильная, заряженная (+)
61у Алифатическая, нейтральная Зег Полярная, гидрофильная, нейтральная
ΗΪ3 Ароматическая, полярная, гидрофильная, заряженная ( + ) ТЬг Полярная, гидрофильная, нейтральная
- 14 021069
Не Алифатическая, гидрофобная, нейтральная Уа1 Алифатическая, гидрофобная, нейтральная
Ьуз Полярная, гидрофильная, заряженная {+) Тгр Ароматическая, гидрофобная, нейтральная
Ьеи Алифатическая, гидрофобная, нейтральная Туг Ароматическая, полярная, гидрофобная
Особенно предпочтительно, чтобы вариант был способен продуцировать закрытую линейную ДНК, описанную выше, с эффективностью, сравнимой или одинаковой с нативным белком.
Как указано выше, предпочтительно, чтобы амплификация ДНК по способу по изобретению проводилась ДНК-полимеразой с активностью вытеснения цепи, более предпочтительно с К.СЛ-ДНКполимеразой. Комбинация КСЛ-ДНК-полимеразы и протеломеразы в ίη νίΐτο бесклеточном способе обеспечивает удивительную эффективность и простоту получения закрытой линейной ДНК.
Как отмечалось выше, длинные линейные одноцепочечные молекулы ДНК исходно образуются в реакциях вытеснения цепи, которые затем служат в качестве новых матриц, в результате чего образуются двухцепочечные молекулы (фиг. 4). Двухцепочечные молекулы содержат непрерывные серии тандемных единиц амплифицированной ДНК, образуемой в результате процессивного действия полимераз с активностью вытеснения цепи (конкатемер). Эти конкатемерные ДНК-продукты содержат многочисленные повторы амплифицированной матричной ДНК. Конкатемер, генерируемый в способе по изобретению, поэтому содержит множество единиц последовательности, амплифицированной с ДНК-матрицы. Конкатемер может содержать 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000 или больше единиц амплифицированной последовательности в зависимости от длины одной амплифицируемой единицы. Размер конкатемера может составлять по меньшей мере 5 т.п.о., по меньшей мере 10 т.п.о., по меньшей мере 20 т.п.о., более предпочтительно по меньшей мере 30 т.п.о., по меньшей мере 50 т.п.о., по меньшей мере 70 т.п.о. или больше.
Во многих вариантах осуществления изобретения, например в производстве лекарственных средств на основе ДНК, требуется использование одиночных элементов амплифицированной ДНК. Поэтому для высвобождения одиночных элементов амплифицированной ДНК необходима обработка таких конкатемеров. Для превращения этой конкатемерной ДНК в одиночные элементы амплифицированной ДНК ее необходимо разрезать в определенной позиции, а концы парных цепей необходимо повторно лигировать. Обычно это можно осуществить, включая сайты эндонуклеаз рестрикции в матрицу ДНК. Таким образом, для расщепления сайтов узнавания рестрикционных эндонуклеаз и высвобождения одиночных элементов можно инкубировать рестрикционные эндонуклеазы с конкатемером. Образующуюся в результате действия рестрикционных эндонуклеаз открытую линейную двухцепочечную ДНК затем можно инкубировать с ферментом ДНК-лигазой для того, чтобы ковалентно соединить (закрыть) одиночные элементы ДНК.
В соответствии с настоящим изобретением превращение конкатемерной ДНК в закрытые линейные одиночные элементы ДНК достигается использованием всего одного фермента протеломеразы. Это обеспечивает предпочтительные простоту и экономичность способа получения закрытых линейных молекул ДНК. Во-первых, расщепление и последующее лигирование одиночных элементов достигается в результате инкубации с единственным ферментом. Во-вторых, одиночные элементы также высвобождаются, имея желаемую закрытую линейную структуру, и, таким образом, не требуются дополнительные стадии обработки для получения этой структуры (то есть из ковалентно закрытого кольцевого одиночного элемента ДНК).
ДНК, амплифицированную на матрице ДНК, инкубируют по меньшей мере с одной протеломеразой в условиях, способствующих продукции закрытой линейной ДНК. Другими словами, условия способствуют расщеплению и последующему лигированию двухцепочечной ДНК, содержащей последовательность-мишень протеломеразы, с образованием ковалентно закрытой линейной ДНК с концами в форме шпильки. Условия, способствующие продукции закрытой линейной ДНК, включают в себя использование любой температуры, позволяющей продукцию закрытой линейной ДНК, обычно в диапазоне от 20 до 90°С. Предпочтительно температура может находиться в диапазоне от 25 до 40°С, например от примерно 25 до примерно 35°С, или составлять примерно 30°С. Соответствующую температуру для конкретной протеломеразы можно выбрать, исходя из указанных выше принципов относительно температурных условий для ДНК-полимераз. Подходящая температура для использования протеломеразы ΤΟΝ из бактериофага Е. сой (последовательность 8ЕО ГО ΝΟ: 15) составляет от примерно 25 до примерно 35°С, например около 30°С.
Условия, способствующие получению закрытой линейной ДНК, также включают в себя присутствие протеломеразы и соответствующих буферных агентов/рН и других факторов, которые необходимы для работы фермента и его стабильности. Подходящие условия включают любые условия, используемые для обеспечения активности протеломеразных ферментов, известных в данной области. Например, при использовании протеломеразы ΤΟΝ бактериофага N15 из Е. сой подходящим буфером может быть: 20
- 15 021069 мМ ТП8-НС1, рН 7,6; 5 мМ СаС12; 50 мМ глутамат калия; 0,1 мМ ЕЭТА; 1 мМ дитиотреитол (ЭТТ). Агенты и условия для поддержания оптимальной активности и стабильности можно также выбрать из условий, приведенных для ДНК-полимераз.
В некоторых вариантах осуществления изобретения возможно использовать условия, обеспечивающие активность протеломеразы, одинаковые с условиями, используемыми для амплификации ДНК. В частности, использование одинаковых условий описано для случая, когда амплификация ДНК и обработка протеломеразой проводятся одновременно или последовательно. В других вариантах осуществления изобретения может быть необходимо изменение реакционных условий, если условия, используемые для обеспечения оптимальной активности ДНК-полимеразы, приводят к субоптимальной активности протеломеразы. Удаление конкретных агентов и изменение реакционных условий можно осуществить с помощью фильтрации, диализа и других способов, известных в данной области. Опытному специалисту будет легко определить условия, дающие оптимальную активность ДНК-полимеразы и/или активность протеломеразы.
В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения при использовании в амплификации ДНК КСА-ДНК-полимеразы, предпочтительно рЫ29, амплификацию ДНК проводят в буфере, по существу, идентичном или, по существу, состоящем из 35 мМ ТЙ8-НС1, 50 мМ КС1, 14 мМ М§С12, 10 мМ (НН4)2§04, 4 мМ ОТТ, 1 мМ 6ЫТР; при температуре от 25 до 35°С, например около 30°С. Стадию обработки протеломеразой можно затем выполнить, предпочтительно используя ТеШ, и/или предпочтительно в буферных условиях, по существу, идентичных или, по существу, состоящих из 20 мМ ТгЕ-НС'к рН 7,6; 5 мМ СаС12; 50 мМ глутамата калия; 0,1 мМ ЕЭТА; 1 мМ дитиотреитола (ОТТ); при температуре от 25 до 35°С, например около 30°С.
Все ферменты и белки для использования в способе по изобретению можно получать рекомбинантно, например, в бактериях. Можно использовать все способы рекомбинантной экспрессии, известные опытному специалисту. Плазмиду или другую форму рекомбинантного вектора, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую представляющий интерес белок, можно ввести в бактерии, чтобы они экспрессировали кодируемый белок. Например, для экспрессии последовательностей §ЕЦ ГО N0: 2, 5, 7, 9, 11, 13 или 15 вектор, соответственно, может содержать последовательности §ЕЦ ГО N0: 1, 4, 6, 8, 10, 12 или 14. Затем экспрессированный белок обычно очищают, например, используя аффинную метку, в достаточном количестве и переводят в форму, подходящую для использования в способе по изобретению. Методики получения рекомбинантных белков входят в общий объем знаний опытного специалиста. Вышеописанное распространяется на любой белок, описанный в настоящем документе.
Амплифицированную ДНК, полученную в результате контактирования ДНК-матрицы с ДНКполимеразой, можно очистить перед контактом с протеломеразой. Таким образом, способ по изобретению может дополнительно включать в себя стадию очистки ДНК, амплифицированной на ДНК-матрице. Однако в предпочтительном варианте осуществления изобретения способ проводят без очистки амплифицированной ДНК перед контактированием с протеломеразой. Это означает, что стадии амплификации и обработки можно проводить последовательно, обычно в одной емкости или растворе. В некоторых таких вариантах осуществления изобретения способ включает в себя добавление буфера, обеспечивающего активность протеломеразы, то есть обеспечивающего условия, способствующие образованию закрытой линейной ДНК.
После получения закрытой линейной ДНК в результате действия протеломеразы способ по изобретению может дополнительно включать в себя стадию очистки линейного ковалентно закрытого ДНКпродукта. Вышеупомянутую очистку обычно проводят для удаления нежелательных продуктов. Очистку можно проводить любыми средствами, известными в данной области. Например, обработка амплифицированной ДНК или линейной ковалентно закрытой ДНК может включать в себя фенол/хлороформную очистку нуклеиновых кислот или использование колонок, селективно связывающих нуклеиновые кислоты, таких как доступные в продаже от компании Οίη^η. Опытный специалист может легко определить подходящие методики очистки для использования при выделении амплифицированной ДНК.
После получения и очистки линейной ковалентно закрытой ДНК в достаточном количестве способ может дополнительно включать в себя ее введение в ДНК-композицию (композицию, содержащую ДНК), например в терапевтическую ДНК-композицию.
Терапевтической ДНК-композицией будет упомянутый выше тип терапевтической молекулы ДНК. Такая композиция будет содержать терапевтически эффективное количество ДНК в форме, подходящей для введения желаемым путем, например, в виде аэрозоля, в виде композиции для инъекций или состава, подходящего для перорального введения, введение через слизистые или местного введения.
Введение ДНК в стандартный фармацевтический препарат можно осуществить, используя стандартные химические методы и методики для изготовления фармацевтических составов, которые известны опытному специалисту в данной области. Можно использовать любой фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент.
Вспомогательные материалы, такие как увлажняющие или эмульгирующие агенты, рН-буферные вещества и т.п., могут присутствовать в эксципиенте или носителе. Эти эксципиенты, носители и вспомогательные материалы, в общем, представляют собой фармацевтические агенты, которые можно вво- 16 021069 дить без неспецифической токсичности и которые в случае вакцинных композиций не будут вызывать иммунный ответ у индивидуума, получающего композицию. Подходящим носителем может быть липосома.
Фармацевтически приемлемые эксципиенты включают, но не ограничены этим, жидкости, такие как вода, солевой раствор, полиэтиленгликоль, гиалуроновая кислота, глицерин и этанол. Также в настоящую композицию могут быть включены фармацевтически приемлемые соли, например соли неорганических кислот, такие как гидрохлориды, гидробромиды, фосфаты, сульфаты и т.п., и соли органических кислот, такие как ацетаты, пропионаты, малонаты, бензоаты и т.п. Также предпочтительно, хотя и не обязательно, чтобы препарат содержал фармацевтически приемлемое эксципиент, который служит стабилизатором, в частности, для пептида, белка или других подобных молекул, если они должны быть включены в композицию. Примеры подходящих носителей, которые действуют также в качестве стабилизаторов для пептидов, включают, без ограничения, фармацевтического качества декстрозу, сахарозу, лактозу, трегалозу, маннит, сорбит, инозит, декстран и т.п. Другие подходящие носители включают, без ограничения, крахмал, целлюлозу, фосфаты натрия или кальция, лимонную кислоту, винную кислоту, глицин, высокомолекулярные полиэтиленгликоли (ПЭГ) и их комбинации. Исчерпывающее описание фармацевтически приемлемых эксципиентов, носителей и вспомогательных материалов находится в издании ΚΞΜΙΝΟΤΟΝΛ РНЛНМЛСЕЕТ1СЛЕ 8С1ЕХС1Л (Маск РиЬ. Со., Ν.Ι 1991), которое включено в настоящее описание путем ссылки.
Способ по изобретению проводят ίη νίίΓο в бесклеточном окружении. Поэтому способ проводят в отсутствии клеток-хозяев, и он обычно включает в себя использование очищенных ферментативных компонентов. Соответственно, амплификацию матричной ДНК и обработку протеломеразой обычно проводят посредством контактирования компонентов реакции в растворе в подходящей емкости. Необязательно, отдельные компоненты могут находиться в иммобилизованной форме, например могут быть присоединены к твердой подложке.
Следует понимать, что способ по изобретению можно проводить в любом масштабе. Однако предпочтительно проведение способа амплификации ДНК в коммерческом или промышленном масштабе, то есть получение амплифицированной ДНК в миллиграммах или в большем количестве. Предпочтительно, чтобы с помощью способа можно было получить по меньшей мере 1 мг, по меньшей мере 10 мг, по меньшей мере 20 мг, по меньшей мере 50 мг или по меньшей мере 100 мг амплифицированной ДНК. Также предпочтительно получение конечного продукта, закрытой линейной ДНК, из амплифицированной ДНК в миллиграммовых или больших количествах. Предпочтительно, чтобы с помощью способа можно было получить по меньшей мере 1 мг, по меньшей мере 2 мг, по меньшей мере 5 мг, по меньшей мере 10 мг, по меньшей мере 20 мг, по меньшей мере 50 мг или по меньшей мере 100 мг закрытой линейной ДНК.
Изобретение дополнительно относится к набору, содержащему компоненты, требуемые для проведения способа по изобретению Этот набор включает в себя по меньшей мере одну ДНК-полимеразу, по меньшей мере одну протеломеразу и, необязательно, инструкции по использованию их в способе, описанном в настоящем документе. Набор может содержат две, три, четыре, пять или более различных ДНКполимераз.
Предпочтительно, чтобы набор содержал по меньшей мере одну ДНК-полимеразу с активностью вытеснения цепи, еще более предпочтительно ΚСΑ-ДНК-полимеразу. Особенно предпочтительно, чтобы набор содержал ДНК-полимеразу р1й29 (ЛЕС ΙΌ ΝΟ: 2), ДНК-полимеразу Веер УеШ® (ЛЕС ГО ΝΟ: 3) или ДНК-полимеразу Ββί 1 (ЛЕС ГО ΝΟ: 5) или вариант любой из них. В некоторых вариантах осуществления изобретения также могут быть включены ДНК-полимеразы, которые реплицируют ДНК другими способами. Набор включает в себя по меньшей мере одну протеломеразу. Набор может включать в себя две, три, четыре или более различных протеломераз. Протеломеразы можно выбрать из любой из 8ЕС ГО ΝΟ: 5, 7, 9, 11, 13 или 15, или их вариантов. Особенно предпочтительно, чтобы набор включал протеломеразу Τе1N бактериофага Ν15 из Е. сой (ЛЕС ГО ΝΟ: 15) или ее вариант.
Набор может также включать в себя по меньшей мере один белок, связывающий одноцепочечную ДНК (88ВР). Предпочтительным 88ВР является белок гена 32 фага Т4, доступный в продаже от №\ν Еп§1апй Вю1аЬ5, 1пс. В набор могут быть включены два, три, четыре или более различных 88ВР. Набор может дополнительно включать в себя пирофосфатазу. Предпочтительной пирофосфатазой является пирофосфатаза из 8. се1^151ае, доступная в продаже от №ν Епд1апй Вю1аЬв, 1пс. В набор могут быть включены две, три, четыре, пять или более различных пирофосфатаз. Набор может включать в себя любые ДНК-полимеразу, протеломеразу, 88ВР или пирофосфатазу, описанные в настоящем документе. Набор может также включать в себя й№ГР, соответствующие буферы и другие факторы, которые необходимы для активности или стабильности ДНК-полимеразы и/или протеломеразы, описанных выше.
Примеры
Пример 1. Экспрессия Τе1N и создание векторных конструкций, содержащих последовательностимишени протеломеразы.
Τе1N амплифицировали из доступного в продаже вектора для клонирования, ρίΑΖΖ (Ьис1деп), с использованием модифицированных олигонуклеотидных праймеров
- 17 021069
РТ1Р 5’ АТОАССААООТАААААТСООТО 3’ (ЗЕф ГО ΝΟ: 30)
РТ1К 5’ ТТАОСТОТАОТАССТТТСССАТ 3’ (ЗЕ<5 ГО ΝΟ: 31) для направленного клонирования с сохранением рамки считывания в доступный в продаже вектор, рОЕ30 (01адеп). Эта система дает возможность индуцируемой экспрессии белков с 6 остатками Ηίδ на Νконце под контролем 1ас-промотора, одновременно обеспечивая сильную транс-репрессию с плазмиды рКЕР4, экспрессирующей ген 1ас1. Ряд возможных рекомбинантных клонов был идентифицирован в штамме М15 Е. соН. и с помощью секвенирования подтверждено встраивание ΤβΙΝ с сохранением рамки считывания. Шесть клонов были дополнительно охарактеризованы в мелкомасштабных экспериментах по индукции экспрессии. Все клоны экспрессировали белок с весом 74,5 кД, который соответствовал молекулярному весу рекомбинантной протеломеразы Τβ1Ν.
Τβ1Ν экспрессировали в штамме М15 Е. соП/рВЕР4, индуцируя экспрессию белка с плазмиды рОЕ30 с помощью ΙΡΤΟ; а клетки после индукции обрабатывали ультразвуком (6 пульсов по 30 с на 100% мощности) и центрифугировали (30 мин при 25000д), что давало нерастворимую и растворимую фракцию клеточного лизата. Анализ с помощью электрофореза в геле показал присутствие Το1Ν в растворимой фракции. Очистку Το1Ν проводили на колонке Шк^ар, используя хроматографическую систему Ак1а Ргнне (ОЕ НеаЬЪсате) с элюцией в 0-100% (0,5М) градиенте имидазола. Очищенную Το1Ν диализовали для удаления имидазола и хранили в буфере: 10 мМ Ττίδ-ΗΟ, рН 7,4, 75 мМ ИаС1, 1 мМ ΌΤΤ, 0,1 мМ ΕΌΤΑ и 50% глицерина.
Векторные конструкции для подтверждения активности Το1Ν были созданы направленным клонированием синтетических олигонуклеотидов, содержащих сайт узнавания Το1Ν, 1с1РБ
КЫ
З’АССТТТАТСАОСАСАСААТГССССАТТАТАСОСОСОТАТААТООАСТАТТ ОТСТССТОАТАО 3’ (ЕРЛ) ГО ΝΟ: 32)
КТ2
5’ОАТССТАТСАОСАСАСААТАОТССАТТАТАСССОСОТАТААТССОСААТТ ОТОТССТОАТАА 3’ (5Е<} ГО ΝΟ: 33) в сайты ВатН1 и ΗίηάΙΙΙ плазмид рИС18 и рВК329. РИС18 имеет номер доступа в базе данных ОепЬапк Ь09136, и ее можно приобрести в компании РегтеШак, каталожный № 8Ό0051; рВК329 имеет номер доступа в базе данных ОепЬапк - 101753, и ее можно приобрести в компании Ό8ΜΖ, каталожный № 5590.
Дополнительно для трансфекционных исследований две копии сайтов узнавания (1е1РБ) были клонированы в вектор для экспрессии люциферазы, плазмиду рОЬ4.13 (Рготеда) в уникальные сайты рестрикции 8ай и ВатН1, фланкирующие экспрессионную кассету для гена люциферазы из светлячка. Первый сайт 1е1ВБ был клонирован в уникальный сайт 8ас1 выше 8У40-промотора после отжига синтетических олигонуклеотидов 1е1ВБ с перекрывающимися концами для 8ас1. Второй сайт 1е1РБ был клонирован в уникальный сайт ВатН1 ниже сигнала полиаденилирования 8У40, используя синтетические олигонуклеотиды 1е1РБ с перекрывающимися концами для ВатН1. Полученная конструкция была названа рОЬ ΌΘΟ, поскольку она позволяет образование ковалентно закрытой линейной (в виде сахарной собачьей косточки) ДНК, кодирующей люциферазу для экспрессии в клетках млекопитающих.
Пример 2. Подтверждение способности Τе1N расщеплять ДНК.
Было подтверждено расщепление суперскрученных кольцевых векторных конструкций рИС18 1е1РБ и рОЬ ΌΘΟ с помощью Τе1N. 100 нг каждого субстрата инкубировали с 4,5 пмоль Τе1N в течение 1 ч 40 мин при 30°С. Реакцию проводили в буфере для Τе1N [10 мМ Епк-НС! рН 7,6, 5 мМ СаС12, 50 мМ глутамата калия, 0,1 мМ ΕΌΤΑ, 1 мМ ΌΤΤ].
Продукты расщепления визуализировали с помощью электрофореза в агарозном геле в нативных условиях. Инкубация суперскрученной кольцевой рИС18 1е1РБ с Τе1N высвобождала линейный фрагмент размером 2,7 т.п.о., что указывало на расщепление. Инкубация суперскрученной кольцевой рОЬ ООО с Τе1N высвобождала два фрагмента размером 2,4 т.п.о., указывая на расщепление по двум сайтам
1е1КЬ.
Дополнительно рИС18 1е1РБ и рОЬ ООО линеаризовали расщеплением рестрикционными ферментами, а затем их инкубировали с Τе1N для дополнительного подтверждения специфичного расщепления по сайту 1е1РЕ 100 нг рИС18 1е1РБ линеаризовали с помощью Хтп1 и затем инкубировали с Τе1N. Эта реакция высвобождала ожидаемые фрагменты размером 1,9 т.п.о. и 0,8 т.п.о. 100 нг рОЬ ООО линеаризовали с помощью ΡνιιΙ и затем инкубировали с Τе1N. Это высвобождало ожидаемые фрагменты размером 2,4 т.п.о., 1,6 т.п.о. и 0,7 т.п.о. Аналогичным образом, линеаризация рОЬ ООО с помощью ΡκίΙ и последующая инкубация с Τе1N высвобождала фрагменты размером 2,4 т.п.о., 1,1 т.п.о и другой фрагмент 1,1 т.п.о. Эти эксперименты демонстрируют эндонуклеазную активность Τе1N на кольцевых или линейных ДНК-субстратах, содержащих последовательность-мишень протеломеразы.
В предварительной оценке активности расщепления ДНК было найдено, что избыток Τе1N до 3,4 пмоль разрезает по меньшей мере 200 нг рИС18 1е1РБ в течение 1 ч. В экспериментах по определению
- 18 021069 зависимости расщепления от времени такое же количество ДНК расщеплялось в течение примерно 10 мин.
Пример 3. Подтверждине лигирующей активности ТеШ и образования закрытой линейной ДНК.
Подтверждение закрытой линейной структуры ДНК продуктов расщепления с помощью ТеШ проводили с использованием гель-электрофореза в денатурирующих условиях. рСЬ ООС инкубировали с ТеШ как в примере 3. Синтетический ПЦР-продукт (РСК ЭОС), соответствующий области, содержащейся в последовательности собачьей косточки, но имеющий открытые концы ДНК, использовали в качестве контроля. Линейный фрагмент РСК ООС амплифицировали с использованием праймеров, фланкирующих сайты 1е1КЬ
ЗасрОЬ 5’ ОТОСААСТОСАОСТОССАСААС 3’ (5ЕЦ ГО ΝΟ: 34);
Ваш рОЬ 5’ ОАТАААОААОАСАОТСАТААОТССООС 3’(3Εζ> ГО ΝΟ: 35).
В агарозном геле в нативных условиях [0,8% агароза в ТАЕ-буфере (40 мМ ТЛк-ацетат, 1 мМ ЕЭТА)], продукт 2,4 т.п.о., полученный в результате инкубации 100 нг рСЬ ООС с ТеШ, мигрировал на аналогичное расстояние, что и РСК ООС (2,7 т.п.о.), поскольку оба продукта оставались двухцепочечными.
Однако при разделении в денатурирующем агарозном геле [разделение в 1% агарозе в Н2О в присутствии 50 мМ №ОН, 0,1 мМ ЕЭТА и нейтрализация после разделения в 1М ТгФ-НС'Т рН 7,6, 1,5М №С1], позволяющем денатурацию и разделение двухцепочечной ДНК на одноцепочечные ДНК, фрагмент в форме собачьей косточки, полученный в результате обработки ТеШ, мигрировал с более высоким молекулярным весом [приблизительно 5 т.п.о.], чем ПЦР-контроль с открытыми концами или рИС18 1е1КЬ, линеаризованная Хтп1 (оба фрагмента с размером 2,7 т.п.о.).
Эта разница в миграции указывала на образование закрытой линейной структуры в форме собачьей косточки в результате действия ТеШ. Денатурация структуры в форме собачьей косточки будет давать одноцепочечные открытые кольца, которые мигрируют значительно медленнее через гель по сравнению с линейными одноцепочечными молекулами, высвобождаемыми при денатурации линейного ПЦР-продукта с открытыми концами.
Подтверждение образования закрытой линейной структуры продуктов в результате действия ТеШ также было показано анализом температурной денатурации с использованием капиллярного электрофореза в микрочипе (ЬОС-электрофореза). ЬОС-анализ представляет собой платформу для капиллярного электрофореза для скоростного разделения биологических молекул. АдбеШ Вюапа1у/ег с чипами ^NА 7500 (АдЛеп!, ИК) может использоваться для разделения и приблизительного определения размера фрагмента ДНК длинной до 7000 п.о.
Эта система с использованием микрочипа не детектирует одноцепочечную ДНК. Тепловая денатурация (95°С в течение 5 мин) и быстрое (<1°С/с) охлаждение со скоростью 1°С/с стандартной двухцепочечной ДНК в низкой соли, например, в Н2О, дает в результате одноцепочечную ДНК, которую невозможно визуализировать в ЬОС-системе. Однако ДНК-концы, которые ковалентно соединены в ДНК в форме собачьей косточки (получаемой в результате расщепления ТеШ), не могут разделиться после денатурации и поэтому повторно отжигаются, образуя двухцепочечную ДНК, которая остается видимой. Сравнение денатурированной с помощью температуры и быстро охлажденной ДНК поэтому позволяет отличить ковалентно закрытую ДНК в форме собачьей косточки (сс1) и обычную открытую линейную (о1) двухцепочечную ДНК.
Образцы ДНК (100 нг) в Н2О денатурировали (95°С в течение 5 мин), быстро охлаждали (<1°С/с) до 4°С в тонкостенных ПЦР-пробирках в термоциклере (Вюгаб 1-сус1ег, Вюгаб, ИК). Для сравнения с расщеплением ТеШ образцы сначала инкубировали в IX буфере для ТеШ с 1 мкл очищенной протеломеразы при 30°С в течение 10 мин. Контрольные образцы обрабатывали также, но без фермента. Образцы (1 мкл) анализировали с использованием АдЛеп! Вюапа1у8ег и чипов ^NА 7500, следуя инструкциям изготовителя.
Результаты показаны на фиг. 6В. Они показывают, что закрытая линейная ДНК в форме собачьей косточки, полученная в результате инкубации рСЬ ЭОС с ТеШ, устойчива к температурной денатурации по сравнению с эквивалентной стандартной открытой линейной ДНК (РСК ЭОС). Равная устойчивость относительно тепловой денатурации также была получена с использованием КСАамплифицированной ДНК в форме собачьей косточки, полученной в результате КСА-амплификации и расщепления ТеШ.
В других экспериментах расщепление ТеШ проводили на фрагменте РСК ЭОС с открытыми концами. Это приводило к образованию термостабильного продукта расщепления, ДНК в форме собачьей косточки с размером 2,8 т.п.о, и термостабильных концов в форме собачьей косточки с размерами 0,09 и 0,14 т.п.о.
Установленные в ЬОС-анализе размеры фрагмента в форме собачьей косточки и РСК ЭОС находились в диапазоне от 2,8 до 3,0 т.п.о. и 3,1-3,5 т.п.о. соответственно, по сравнению с данными на основе нуклеотидной последовательности, предполагающими приблизительные размеры 2,4 и 2,7 т.п.о. Это отражает разницу в размере, вызванную конформационными отличиями в миграции, которые возникают в
- 19 021069 неденатурирующем Ь0С-анализе.
Пример 4. Образование закрытой линейной ДНК из конкатемерной ДНК, полученной с помощью КСА (амплификации по типу катящегося кольца).
Был проведен ίη νίίτο бесклеточный способ амплификации ДНК-матрицы и превращения амплифицированной ДНК в закрытые линейные молекулы ДНК в форме собачьей косточки. Для амплификации ковалентно закрытых плазмидных матриц, в которых присутствовал или отсутствовал сайт 1с1РЬ, использовали методику КСЛ с использованием фермента р1й29 фага рЫ29 из ВасШик киШШк и случайные гексамеры в качестве праймеров при различных условиях проведения реакции. Это давало амплификацию конкатемерной ДНК в результате процессивной активности вытеснения цепи полимеразы рЫ29. Первые эксперименты проводились с использованием набора ТстрйРЫ (ОЕ НсаИйсагс) согласно инструкциям изготовителя. Однако этот набор впоследствии был заменен на способ, разработанный авторами (с использованием полимеразы р1й29 от компании NЕВ), который давал более высокий выход продукта с более высокой чистотой.
Денатурацию 40 пг - 200 нг закрытой кольцевой матрицы и отжиг праймеров проводили в 10 мкл буфера для отжига/денатурации: 30 мМ Тг18-НС1, рН 7,5, 20 мМ КС1, 8 мМ МдС12, 20 мкМ гексамеров со случайной последовательностью. Денатурацию и отжиг проводили прогреванием при 95° в течение 1 мин с последующем охлаждением до комнатной температуры в течение 30 мин.
Затем к 10 мл реакционной смеси, содержащей отожженные ДНК/праймер, добавляли 10 мкл реакционного буфера [35 мМ Тпк-НС1, 50 мМ КС1, 14 мМ МдС12, 10 мМ (1МН4)2804, 4 мМ ЭТТ, 10 Ед. рЫ29, 0,002 Ед. ΡΡί (неорганической пирофосфатазы из дрожжей), 1 мМ бЭТРк].
Реакционную смесь объемом 20 мкл инкубировали при 30°С в течение 18 ч. Образец разделяли электрофорезом в геле для проверки образования конкатемеров и затем реакционную смесь расщепляли ферментом рестрикции или ТсШ для проверки продуктов.
Конкатемерную ДНК, амплифицированную с помощью КСА, затем инкубировали с ТсШ. Обычно КСА-амплифицированный ДНК-субстрат разводили в воде и 10х буфере для ТсШ до конечного объема 20 мкл. Результаты для рИС18 1с1КЬ показаны на фиг. 6А.
Как видно из дорожки 1 геля, нерасщепленная конкатемерная амплифицированная ДНК образует ячеистую структуру, которая не входит в гель. Однако ТсШ была способна расщепить КСА-материал, приводя в результате к высвобождению фрагмента размером 2,7 т.п.о. в форме собачьей косточки (дорожка 6). Подтверждение, что ДНК, амплифицированная с помощью КСА, была исходной матрицей, используемой в реакции, получали рестрикцией с помощью ΡνιιΙ (дорожки 2 и 5). рИС18 (без 1с1КЬ) служила в качестве отрицательного контроля для активности ТсШ (дорожка 3).
Аналогичным образом, в других экспериментах полученные с помощью КСА конкатемеры рОЬ Ό0Ο также расщепляли ТсШ. Соответственно было показано, что способ по изобретению является эффективным для амплификации закрытой линейной ДНК на исходной матрице. Кроме того, возможно амплифицировать закрытую линейную ДНК простым способом, используя последовательные стадии с участием КСА-полимеразы и протеломеразы без необходимости промежуточной очистки амплифицированной ДНК.
Пример 5. Экспрессия амплифицированной закрытой линейной ДНК.
Для исследования экспрессии репортерного гена люциферазы из закрытой линейной ДНК в форме собачьей косточки, полученной по изобретению, были проведены эксперименты по трансфекции с использованием клеток линии НсЬа. В качестве контроля использовали ковалентно закрытую кольцевую ДНК и линейный контрольный фрагмент РСК Ό0Ο.
Трансфекцию проводили при конфлюэнтности клеток 60% в лунках диаметром 20 мм в среде КРМ1 с использованием реагента ТгапкГссйт® (Рготсда) в соответствии с инструкциями изготовителя. Для каждой трансфекции использовали 400 нг ДНК-конструкции. Эффективность трансфекции нормализовали в пределах одного эксперимента и между экспериментами, включая в каждую трансфекцию внутренний контроль, 40 нг плазмиды рОЬ4.73, экспрессирующей люциферазу КспШа (содержащей ген 1К1ис из КспШа гсшГогпик). Активность люциферазы светлячка (фермент, отвечающий за люминесценцию насекомых Рйойпик ругаНк) и люциферазы КспШа измеряли последовательно, используя набор Эиа1ЬисШсгакс® Ксройсг (ЭЬК™) Аккау 8ук1ст (Рготсда). Относительные единицы свечения измеряли, используя люминометр О1оМах Мц1й ЬипипотсЮг (Рготсда) и результаты выражали как соотношение интенсивности свечения люциферазы светлячка к люциферазе КспШа. Все эксперименты проводили в трех повторах.
В трансфекционных экспериментах тестировали следующие конструкции:
Контрольная ДНК рОЬ4.13 1ис рОЬ4.73 НН1ис РСК Ό0Ο
ПЦР-контроль (фрагмент из рОЬ4.13, перекрывающий ген 1ис) рОЬ Ό0Ο (рОЬ4.13, содержащая 2 сайта 1с1КЬ)
Собачья косточка, мини-преп (рОЬ-Э0О, выделенная с помощью набора для мини-выделений
- 20 021069
ДНК (мини-препа), расщепленная Руи1 (для удаления контаминирующей векторной ДНК) с последующим расщеплением ТеЮ).
Собачья косточка, КСА (рОЬ-ΌΘΟ, амплифицированная с помощью КСА, расщепленная Руи1 и расщепленная ТеШ).
КСА рОЬ ΌΘΟ (конкатемерная ДНК, полученная в результате исходной КСА-амплификации плазмиды рОЬ ΌΘΟ).
Результаты показаны на фиг. 6С. Было показано, что закрытая линейная ДНК, включая ту, что была амплифицирована с помощью КСА, экспрессирует люциферазу на более высоком уровне относительно открытых линейных ПЦР-конструкций. Это демонстрирует, что закрытую линейную ДНК, полученную по изобретению, можно использовать для успешной экспрессии люциферазы при введении в клетки млекопитающих.
Последовательности по изобретению
Таблица А
Нуклеотидная последовательность ДНК-полимеразы бактериофага рЫ29 из ВасНк1£ (ЗЕО Ю N0:1) аЕдаадсаЕа Едссдадааа даЕдЕаСадЕ ЕдЕдасЕЕЕд адасаасЕас ЕааадЕддаа 60 дасЕдЕаддд ЕаЕдддсдЕа ЕддЕЕаЕаЕд ааЕаЕадаад аЕсасадЕда дЕасааааЕа 120 ддЕааЕадсс ЕддаЕдадЕЕ ЕаЕддсдЕдд дЕдЕЕдаадд ЕасаадсЕда ЕсЕаЕаЕЕЕс 180 саЕаассЕса ааЕЕЕдасдд адсЕЕЕЕаЕс аЕЕаасЕддЕ ЕддаасдЕаа ЕддЕЕЕЕаад 240
ЕддЕсддсЕд асддаЕЕдсс ааасасаЕаЕ ааЕасдаЕса ЕаЕсЕсдсаЕ дддасааЕдд 300
ЕасаЕдаЕЕд аЕаЕаЕдЕЕЕ аддсЕасааа дддааасдЕа адаЕасаЕас адЕдаЕаЕаЕ 360 дасадсЕЕаа адааасЕасс дЕЕЕссЕдЕС аадаадаЕад сЕааадасЕЕ ЕааасЕаасЕ 420 дЕЕсЕЕааад дЕдаЕаЕЕда ЕЕассасааа дааадассад СсддсЕаЕаа даЕаасассс 480 даадааЕасд ссЕаЕаЕЕаа ааасдаЕаЕЕ садаЕЕаЕЕд сддаасдЕсЕ дЕЕааЕЕсад 540
ЕЕЕаадсаад дЕЕЕадассд даЕдасадса ддсадЕдаса дЕсЕаааадд ЕЕЕсааддаЕ 600 аЕЕаЕаасса сЕаадаааЕЕ саааааддЕд ЕЕЕссЕасаЕ ЕдадЕсЕЕдд асЕсдаЕаад 660 даадЕдадаЕ асдссЕаЕад аддЕддЕЕЕЕ асаЕддЕЕаа аЕдаЕаддЕЕ сааадааааа 720 даааЕсддад ааддсаЕддЕ сЕЕсдаЕдЕЕ ааЕадЕсЕаЕ аЕссЕдсаса даЕдЕаЕадс 780 сдЕсЕссЕЕс саЕаЕддЕда ассЕаЕадЕа ЕЕсдадддЕа ааЕасдЕЕЕд ддасдаадаЕ 840
ЕасссасЕас асаЕасадса ЕаЕсадаЕдЕ дадЕЕсдааЕ Едааададдд сЕаЕаЕассс 900 асЕаЕасада Еааааадаад ЕаддЕЕЕЕаЕ аааддЕааЕд адЕассЕааа аадЕадсддс 960 ддддадаЕад ссдассЕсЕд дЕЕдЕсаааЕ дЕадассЕад ааЕЕааЕдаа адаасасЕас 1020 даЕЕЕаЕаЕа асдЕЕдааЕа ЕаЕсадсддс ЕЕааааЕЕЕа аадсаасЕас аддЕЕЕдЕЕЕ 1080 ааадаЕЕЕЕа ЕадаЕаааЕд дасдЕасаЕс аадасдасаЕ садааддадс даСсаадсаа 1140 сЕадсаааас ЕдаЕдЕЕааа садЕсЕаЕас ддЕаааЕЕсд стадЕаассс ЕдаЕдЕЕаса 1200 дддааадЕсс сЕЕаЕЕЕааа ададааЕддд дсдсЕаддЕЕ ЕсадасЕЕдд адаададдаа 1260 асаааадасс сЕдЕЕЕаЕас ассЕаЕдддс дЕЕЕЕсаЕса сЕдсаЕдддс ЕадаЕасасд 1320 асааЕЕасад сддсасаддс ЕЕдЕЕаЕдаЕ сддаЕааЕаЕ асЕдЕдаЕас ЕдасадсаЕа 1380 саЕЕЕаасдд дЕасададаЕ ассЕдаЕдЕа аЕаааадаЕа ЕадЕЕдассс ЕаадаааЕЕд 1440 ддаЕасЕддд сасаЕдааад ЕасаЕЕсааа ададЕЕаааЕ аЕсЕдадаса даадассЕаЕ 1500 аЕасаадаса ЕсЕаЕаЕдаа адаадЕадаЕ ддЕаадЕЕад ЕадааддЕад ЕссадаЕдаЕ 1560
ЕасасЕдаЕа ЕааааЕЕЕад ЕдЕЕаааЕдЕ дсдддааЕда сЕдасаадаЕ Еаадааадад 1620 дЕЕаедЕЕЕд адааЕЕЕсаа адЕсддаЕЕс адЕсддаааа ЕдэадссЕаа дссЕдЕдсаа 1680 дЕдссдддсд дддЕддЕЕсЕ ддЕЕдаЕдас асаЕЕсасаа ЕсаааЕаа 1728
Аминокислотная последовательность ДНК-полимеразы бактериофага рЫ29 из ВасШиз (ЗЕО Ю N0:2)
ΜΚΗΜΡΚΚΜΥ3 СОГЕТТТКУЕ ОСКУНАΥСУМ ΝΙΕ0Η3ΕΥΚΙ СИЗЗОЕГМАИ УЬКУОАОЬУГ 60
ΗΝΙΚΕϋΕΑΕΙ 1НИЕЕКЫСГК ИЗАОСЬРНТУ ИТИЗКМСОИ УМЮЮЬСУК ΟΚΚΚΙΗΤνίΥ 120
ОЗЬККЬРРРУ ККТАКОГКЬТ УЦКеОЮУНК ΕΕΡνΰΥΚΙΤΡ ΕΕΥΑΥΙΚΝϋΙ ОНАЕЕЬЫО 180
РКОСЫЖМТА сзоеьксгко ΙΪΤΤΚΚΡΚΚν ГРТЕЗЬСЬОК ЕУРУАУКССР ΤΗΕΝϋΡΕΚΕΚ 240
Е1СЕСМУГЭУ Ν51ΥΡΑ2ΜΥ5 ΕΙΧΡΥβΕΡίν ГЕСКУУНОЕО УРЬНЮШЕС ЕРЕЬКЕСИР 300
ΤΙ0ΙΚΚ5ΚΕΥ КСМЕУЬКЗЗС СЕ1АОЬНЬ5И УОЬЕЬМКЕНУ 0Ь'УНУЕУ13С ЬКЕКАТТСЬЕ 360
ΚΟΕΙΟΚΗΤΥΙ ΚΤΤ3Ε6ΑΙΚ2 1АКЬМЬ№ЬУ ОКГАЗНРОУТ еКУРУЬКЕ№ АЬСГКЪСЕЕЕ 420
ТКОРУУТРМС УП ТАМАР.ΥΤ Т1ТАА2АСУ0 К11УС0Т081 НЬТСТЕ1РСУ ΙΚΟίνΟΡΚΚΕ 480
СУИАНЕЗТГК КУКУЬР.ОКТУ КДОУМКЕУО СКЕУЕС5РОО ΥΤΟΙΚΓενκε АСМТЕКХККЕ 540
УТГЕНГКУСЕ ЗККМКРКРУО УРССУУЬУРР ΤΪΤΙΚ 575
- 21 021069 _Т аблица В
Аминокислотная последовательность ДНК-полимеразы Оеер Уеп! из Ругососсиз зр. (8Е0 Ю N0:3)
МИОАОУХТЕ ϋΕΚΡΙΙΚΙΓΚ ΚΕΝ6ΕΓΚνΕΥ ΟΚΝΓΚΡΥΙΥΑ ЬЬКООЗОЮЕ νκκίΤΑΕΚΗΘ 60
ΚίνκίΙϋΑΕΚ νΚΚΚΓΙ,ΟΚΡΙ ЕУИКЬУГЕНР βΟνΡΑΙΗΟΚΙ ΑΕΗ3ΑνΐΟΙΓ ΕΥΟΙΡΓΑΚΚΥ 120
ЫОКСЫРМЕ бОЕЕЬКЫАЕ ШЕТЬУНЕСЕ ЕГАКСР11М1 ΕΥΑΟΕΕΕΑΚν ΙΤΜΚΚΙΟΕΡΥ 180 νεννΒΒΕΕΕΜ ΙΚΕΪΈΚνίΚΕ ΚΟΡΡνίΙΤΥΝ βΟΒΓϋΕΡΥΕν КРАЕКЬЩКЬ РЫЗКЕСЗЕРК 240
МЭКЬСЭМТАУ Е1КСК1НРОЕ ΥΗνίΚΚΤΙΝΕ ΡΤΥΤΙ,ΕΑνΥΕ ΑΙΕΌΚΡΚΕΚν ΥΑΗΕΙΑΕΑΗΕ 300
ТСКВЬЕКУАК ΥΕΜΕϋΑΚνΤΥ ЕЬНЕЕРГРМЕ АОЬЗМЛбОР ΕΜ0ν3Ρ.3ΞΤΰ ΝΙΛ'ΕΜΪΙΛΡ,Κ 360
ΑΥΕΚΝΕΙΑΡΝ ΚΡΟΕΚΕΥΕΚΕ ЪРЕЗУАССУУ КЕРЕКСЬНБС ЬУЗЬОРЕЗЬУ РЗШТНЫУЗ 4 20
РОТЬИР.ЕССЕ ΕΎβνΑΡΕνΟΗ КРСКОГРСЕ1 РЗЬЬКЕЫЮЕ ΚβΕΙΚΚΚΜΚΑ ЗКОРХЕККМЬ 480
ΟΥΚβΚΑΙΚΙΙ, ΜΙΕΥΥΕΥΥΰΥ АКАКИУСКЕС АЕЗУТАНСКЕ ΥΙΕΓνΚΚΕΙ,Ε ЕКРСРЮ/ЬУ1 540
ОТОСЬУАТ1Р САКРЕЕ1ККК ΑΧ,ΕΕΫΟΥΙΝΑ КЬРСЬЬЕЬЕУ ЕСРУУКСРРУ ТКККУАЫОЕ 600
ЕСКИТКСЬЕ 1УККОНЗЕ1А КЕТОАКУЬЕА ΙΣΚΗΕΝνΕΕΑ νΚίνΚΕνΤΕΚ ЬЗКУЕ1РРЕК 660
Ι,νΐΥΕβΙΤΚΡ ЬНЕУКАЮРН УАУАКЕЕААК С’7КУКРСМУ1 СУ1УЬКСБСР ХЗККАХЬАЕЕ 720 ίΌΙ,Ρ.ΚΗΚΥΌΆ ΕΥΥΙΕΝβνΐ,Ρ АУЫЧЬЕАГС ΥΕΚΕϋΕΚΗβΚ ТКОТСЬТАИЬ ΜΙΚΚΚ 775
Таблица С
Нуклеотидная последовательность ДНК-полимеразы I (ροΙΑ) из ВасШиз з(еаго№еплорЫ1из (ЗЕО Ю N0:4) абдаадаада адсЬадбасб ааСРдабддс аасадбдбдд сабассдсдс сСббСЕбдсс ббдссасбСЕ ЕдсаЕаасда саааддсаУб сабасдааТд сддЫбасдд дбСЕасдаЕд абдЕЕдааса ааабШддс ддаадаасаа ссдасссаМ? ЪаскЕдТадс дЫбдасдсс ддааааасда сдббссддса бдааасдТТС саададЕаТа ааддсддасд дсаасааась сссссддаас Сдбссдадса дЫСссдсбд ССдсдсдадс оаТСаааадс дбассдсасс сссдсббаЬд аасбЬдабса Ыасдаадсд дасдаЬаЫа ЕсдддасдсЬ сдсЬдсссдс дсТдадсаад ааддд+ССда адЕдааааТс аЬТТссддсд ассдсдаЕЕЕ аасссадсрс дссбсссдТс абдбдасддЕ сдабаССасд ааааааддда ЕЕассдасаС СдадссдТаС асдссадада ссдббсдсда аааабасддс сбдасбссдд адсааабадЬ ддабЫаааа ддаббдабдд дсдаЕаааЕс сдасаасабс ссдддсдТдс ссддсабсдд ддаааааасд дсддСсаадс Едс1даадса абЕСддСасд дбддаааабд СдсбсдсаТс дабЪдаТдад дСдааадддд ааааасбдаа адаааасЫд сдссаасасс дддаббСадс ЬсСсЬСдадс ааасадсбдд сдбссаТббд ссдсдасдсс есддббдэдс бдбсдТЕада ТдасаббдСс басдааддас аадассдсда аэаадбсабс дсдббаббба аадаасбсдд дссссадбсд ббс^бддааа аааЬддссдс дссддсадсс дааддддада аассдсббда ддадаЕддад «Сдсса^сд ббдасдСсаТ сассдаадад аСдсССдссд асааддсадс дсССдСсдСС даддСдаСдд аадаааасСа ссасдаСдсс ссдаССдСсд дааСсдсасС адСдаасдад саСдддсдаС СССССаСдсд сссддадасс дсдсСддсСд аССсдсааСС СССадсаСдд сССдссдаСд ааасдаадаа ааааадсаСд СССдасдсса адсдддсадС сдССдссССа аадСддааад дааССдадсС СсдсддсдСс дссСССдаСС СаССдсСсдс СдссСаСССд сСсааСссдд сСсаадаСдс сддсдаСаСс дсСдсддСдд сдааааСдаа асааСаСдаа дсддСдсддС сддаСдаадс ддСсСаСддс аааддсдСса адсддСсдсС дссддасдаа садасдсССд сСдадсаСсС сдССсдсааа дсддсадсса СССдддсдсС Сдадсадссд СССаСддасд аСССдсддаа саасдаасаа даСсааССаС саасдаадсС Сдадсадссд сСддсддсда ССССддсСда ааСддааССс асСддддСда асдСддаЬас ааадсддсСС даасадаСдд дССсддадсС сдссдаасаа сСдсдСдсса Ссдадсадсд саСССасдад сСадссддсс аададССсаа саССаасСса ссаааасадс СсддадСсаС СССаСССдаа аадсСдсадс СассддСдсС даадаадасд аааасаддсС аССсдасССс ддсСдаСдСд сССдадаадс ССдсдссдса СсаСдаааСс дСсдааааса ССССдсаССа ссдссадсСС ддсааасСдс ааСсаасдСа СаССдаадда ССдССдааад ССдСдсдссс СдаСассддс ааадСдсаСа сдаСдССсаа ссаадсдсСд асдсааасСд ддсддсСсад сСсддссдад ссдаасССдс аааасаССсс даССсддсСс даададдддс ддааааСссд ссаадсдССс дСсссдСсад адссддасСд дсСсаССССс дссдссдаСС асСсасаааС СдааССдсдс
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
900
960
1020
1080
1140
1200
1260
1320
1380
1440
1500
1560
1620
1680
1740
1800
1860
1920
1980
- 22 021069 дЬссЕсдссс аЬаСсдссда ЬдасдасааЪ с6аа16даад сдТСссэасд сдаСС^ддаТ 2040 аЬЬсасасаа ааасддсдаб ддасаСТТСс саСдСдадсд аададдаадЬ сасддссаас 2100 аедсдссдсс аддсаааддс сдьсаасСбс дд£а1сдСТС асддааЫад сдатсасдда 2150 Иддсдсааа асЬЬдаасаЬ Сасдсдсааа даадсЬдссд аа!ЕЪаЬсда асдТТасТЕс 2220 дссадсТТТс сдддсдкааа дсадСаСаЬд даааасаЬЬд бдсаадаадс дааасадааа 2280 ддаТасдСда саасдсТгдЫ; дса^сддсдс сдсСаЫ Сдс с1даЬаТ(:ас аадссдсааь 2340 Мсаасд1сс дсадЕЫЛдс ададсддасд дссаСдааса сдссааЕЬса аддаадсдсс 2400 дсЬдасаТЬа Ыаааааадс даСдаСТдаЕ ЕЕадсддсас ддсЕдааада ададсадсЕЕ 2460 саддсЕсдЕс ЕЕЕЕдсЕдса адЕдсаЕдас дадсЕсаЕЕЕ Еддаадсдсс аааададдаа 2520 аЕЕдадсдаЕ ЕаЕдЕдадсЕ ЕдЕЕссддаа дЕдаЕддадс аддссдЕЕас дсЕссдсдЕд 2580 ссдсЕдааад ЕсдасЕасса ЕЕасддссса асаЕддЕаЕд аЕдссаааЕа а 2531
Аминокислотная последовательность ДНК-полимеразы ί (ροΙΑ) из Васйкв $1еаго#тегторЫ1и8 (5Е0 Ю N0:5)
МКККЬУЫОС НЗУАУКАЕЕА ЬРЬЬНН0КС1 НТИАУУЙРТМ ΜΕΝΚΙΙΑΕΕ0 РТНЫЛ’ЛГОА 60 ЕКТТЕННЕТГ ΟΕΥ КСС РОСТ РРЕЬЗЕОГРЬ ЬНЕЬЬКАУНТ РАУЕЪОНУЕА ϋΟΤΙβΤΙΛΑΚ 120 ΑΕΟΕΕΓΕνΚΙ ГЗСОКОЬТО!. А5КНУТУ01Т ККС1ТОГЕРУ ТРЕТУВЕКУС ЬТРЕОТУОЬК 180 СЬМСОКЗОН1 РСУРС1СЕКТ АУКЬЬКСГСТ УЕИУЬАЗЮЕ УКСЕКЬКЕНЬ КСНРОЬАЬЬЗ 240 К(ЗЬА51СКОА РУЕЕ8Ш01У УЕ(ЗДЖЕКУ1 АЬГКЕЬбГОБ ГЬЕКМААРАА ЕСБКРЬЕЕМЕ 300 ΓΑϊνονίΤΕΕ МЬАОКААЬУУ ЕУМЕЕИУНЕА Р1УС1АЬУНЕ НСКГГМВРЕТ АЬАОЕОГЬАН 360 ЬАОЕТКККЗМ ГОАКВАУУАЬ КИКС1ЕЬВЗУ АГОЬЬЬААУЬ ΕΝΡΑΟΟΑΟΟΙ ААУАКЖОУЕ 420 АУВЗОЕАУУС КСУККЗЬРОЕ ОТЬАЕНЬУКК ААА1НАЬЕ(ЭР ГМООЬНННЕО ООЬЬТКЬЕОР 480 ΙΑΑΙ1ΑΕΜΕΓ ТСУНУОТККЬ ЕОМЙЗЕЬАЕС Ι,ΡΑΙΕΟΡΪΥΕ 1АСОЕГЫ1ВЗ РКСЬСУИТБ 540 КЬОЬРУЬККТ КТСУЗТЗАйУ ЬЕКЬАРННЕТ УЕЪЧЪНУВСЬ СКЬОЗТУТЕС ЬЬКУУВРОТС 600 КУНТМГНОАЬ ТОТСКЬЗЗАЕ РВЬ0Ы1Р1КЬ ЕЕСЕКХКСАГ УРЗЕРОМЫГ ΛΛΏΥ5Ι2ΙΕΙ.Κ 660 νίΑΚΙΑΟϋΟΝ ЫЕАГОВОЬО ΙΗΤΚΤΑΜϋΙΕ НУЗЕЕЕУТАЫ МРЕЩАКАУМГ Й1УУС130УЙ 220 ЬАСНЬШТЯК ΕΑΑΕΕΙΕΚΥΓ АЗЕРСУКОУМ ΕΝίνβΕΑΚΟΚ СУУТТЬЬНКК КУЬР01ТЗКН 780 ЕЛУКЗЕАЕКТ АМЫТР10С5А ΑΟΙΙΚΚΑΜΙΟ ЬААЕЬКЕЕОЬ ОАКЬЬЬОУНО ЕЫЬЕАРКЕЕ 840 ТЕВЬСЕЬУРЕ УМЕрАУТЬВУ РЬКУРУНУбР ТИУРАК 876
Таблица Ό
Нуклеотидная последовательность протеломеразы фага рЫНАР-'! из Накттопаэ (δΕΟ Ю N0:6) аСдадсддЬд адксасдТад аааддЬсдаЬ НадсддааЬ ЬдаЬададЬд дЬЬдсЬсадс 60 дадабсааад ада+сдасдс сдаЬдабдад аЪдссасдСа аададаааас саадсдсаЬд 120 дсдсддстдд сасдТадсСС саааасдсдс с£дсаСдаЬд асаадсдссд сааддаЬЬсС 180 дадсддабсд сдд-Ссасдас сСЬЬсдссдс СасаСдасад аадсдсдсаа ддсддЬдаеС 240 дсдсадаасС ддсдсса!са садсЬЬсдас садсадаСсд адсддсСддс садссдсЬас 300 ссддс1Ьа6д ссадсаэдсс ддаадсдсбс ддсаадсСда ссда^аСсад сдссаЬЬсд! 360 аТддсссасс дсдадсбдсЬ сдассадаЬс сдсаасдаЬд асдаедсЬЬа Тдаддасабс 420 сдддсдаСда адсъддасса сдаааСсаЪд сдссассЬда сдЬЬдадсСс Сдсасадааа 480 адсасдсТдд сЬдаададдс садсдадасд сЬддаададс дсдсддЬдаа сасддЬсдад 540 аЕсаасТасс аоСддТТдаС ддадасддТС ЬасдадсЕдо ЬдадЬаассд ддададааЬд 500 дСсда1дддд адТаТсдсдд с6ТС1СсадТ ТассТадсдс ССдддсСддс дсбддссасс 660 дддсд1сдс6 сдаЬсдаддЬ дсТдаадасс ддасддаТса сдааддЬддд одадСаЬдад 720 сТддадСХса дсддссаддс дааааадсдс ддсддсдЬсд асСаСадода ддсССассас 180 аЬНаТассс ЬддТдааадс ЬдассЬддТд аТсдаадсдЬ дддабдадсТ: бсдсТсдсЬд 840 ссддаадсТд сСдадсСдса дддсаСддас аасадсдаСд Тдаассдссд сасддсдаад 900 асдсбсааса сдсТсастаа дсддаТсСТТ аасаасдаЬд адсдсдССЬС сааддасадс 960 сдддсдаЬсЬ дддсдсддсЬ ддТдТТТдад сТдсасС£с£ сдсдсдасаа дсдсТддаад 1020 ааадТсассд аддасдТдСС сТддсдЬдад аСдсТддддс аЬдаддасаТ ддабасасад 1080 сдсадсЬасс дсдссСЬ^аа ааСсдасСас дасдадссдд аЬсаадссда ссаддаадаь 1140
Тасдэасасд сТ:адссдссС сдесдедсТд саддсдсТдд асддссаЬда дсадсЬСдад 1200 адсадсдасд сссаддсдсд 1дЬдсаЬдсс СдддТдааад сдсадаТсда дсаддадссЬ 1260 дасдсдаааа ССасдсадСс ТсЬдабсадс сдддадсЬдд дсдЬЬСаЬсд сссЬдссаЬа 1320 ааадсдЪасс бддадсЬддс дсдададдсд сЬсдасдсдс сдаасдбсда тседдасаад 1380 дЬсдсддсдд сад!дссдаа ддаадЬадсс даддсдаадс сссддсЬдаа сдсссассса_1440 сааддддаТд дсаддСдддТ сдддд£ддс± 1саабсаасд ддд1ддаад£ Ьдсасддд'Сд 1500 ддсаассадд саддссддаТ сдаадсда^д ааадсддссб аГааадсддс дддЬдддсдс 1560
Тда 1563
Аминокислотная последовательность протеломеразы фага рЫНАР-1 из Накттопаз (5ЕО Ю N0:7)
МЗСЕЗКРКУО ЬАЕЫЕИЬЬЗ ΕΤΚΕΐΌΛΟϋΕ МРВКЕКТККМ АВЬАКЗГКТК Ι.ΗΏΟΚΚΒΚΟ3 60
ЕВ1АУТТЕКК УМТЕАККАУТ Α(3Ν«ΕΗΗΞΕ0 «ЧЕЕЬАЗВУ РАУАЗКЬЕАЬ 6КЬТО15А1К 120
ΜΑΗΚΕΕΕΟΟΙ ΒΒ000ΑΥΕ0Ι РАКК10НЕ1М ВНЪТЬЗЗАСК 5ΤΙΑΕΕΑ3ΕΤ ЪЕЕНАУНТУЕ 130
ΙΝΥΗΜΕΜΕΤν УЕЬЬЗЫКЕКМ УЕЙЕУКСЕЕЗ УЬАЬСЬАХАТ СКВ31ЕУЬКТ СКХТКУСЕУЕ 240
ЬЕЕЗСОАККВ 60νϋΥ5ΕΑΥΗ ТУТЬУКАОЬУ ХЕАМОЕЬВЗЬ РЗААЕЬОСМО ВЕОУВККТЛК 300
ТЪВТЬТКВТЕ ΝΝΟΕΡνΕΚΟΚ РА1НАВЪУЕЕ ЬНГЗВОККИК КУТЕОУЕИКЕ МЬСНЕПМОТО 360
Κ3ΥΒΑΓΚΙ0Υ ΟΕΡΠΟΑϋΟΕΟ УЕНАЕВЬААЪ ОАЪОСНЕОЬЕ 5 5 ОАХАКУ НА ИУКА01Е0ЕР 420
0АК1Т05Ы5 ΚΕΪίδνΥΒΡΑΙ КАУЬЕЬАКЕА ЬОАРНУОЫЖ УАААУРКЕУА ЕАКРВЬНАНР 480
ОСРСКИУСУА 31М5УЕУАВУ СИ0АСК1ЕАМ КААУКААССВ_520
- 23 021069
ТаблицаЕ
Нуклеотидная последовательность протеломеразы фага ΡΥ54 из Уегагна (ЗЕО Ю N0: б) абдаааабсс аЕЬХЕсдсда бййадййадЬ ддЬЬйадЬйа аададаЬсда ЪдаааЬадаа 60 аааЪсадасс дддсдсаддд СдасаааасЬ сддсдХТабс адддсдсддс садааадй£с 120 ааааатдссд ХдХХбаТдда Тааэсддааа байсдсддба асддТа^даа даа-6адаа£а 180
Тсдббаасаа саббйааТаа аТаТТЬаадй сдадсассТЬ сСсддйСТда адаааддсСГ 240 сассатадет ййссбсаасс татадсааст атсТсэазТа ааЬайсстдс аССсадсдаа 300 аСааСаааад аСсСддаСаа СадасссдсС саСдаадССа дааСаааасС СааадааССа 360 аСаасСсаСс ССдааСссдд СдССааСССа ССадаааааа СаддСадсСС адддаааага 420 ааассаСсСа садсСааааа ааСадССадс ссаааааааа СдСасссаСс аСдддсСааС 480 даСсСадаСа сСССааССад СасСдаадаС дсСасадааС Сасаасаааа дССададсаа 540 дддассдасс СасССаасдс аССасаССсС сСаааадСаа ассаСдаадС СаСдСаСдса 600
ССаасдаСдс адссССсСда сададсСдса ССаааадсСа ддсаСдасдс СдсссССсас 660
СССааааадс дСаасаСсдС ассСаСсдаЬ СаСсссддсС аСаСдсаасд ааСдасддас 720 аСасСасаСс ССссадаСаС адсССССдаа даССсдаСдд саСсасССдс сссСССадса 780
СССдсСсСад садсСдсСад сддСсдсада саааССдааа СэсСааССас СддСдадССС 840 дасдссаааа аСаааадсаС саССаааССС СсСддасаад саааааааад ааСддссдСС 900
СсаддСддас аССаСдаааС аСасадСсСа аССдасСсад адсСаССсаС СсаасддССа 960 дадсссссас дсСсСсаСад сСсааСасСС сдаССасааа асссддааас адсасаСдаС 1020 даасаСсдСа сСдаасСаСс СдССаССаас ддССССдСад ссааассССС аааСдаСдса 1080 дсаааасадС СсСССдСсда Сдасадаада дСаСССааад аСасссдСдс ааСССасдсС 1140 сдсаСадсаС аСдаааааСд дСССадааса даСссСсдсС дддсдаадСд сдасдаадаС 1200 дССССсССсС сСдааССаСС аддссаСдас даессадаСа сСсадсСддс аЕаЕааасаа 1260 сСсаадсСдд СаааСССсаа СссааааСдд асассеааСа СаесадаСда ааасссСсдд 1320
ССадсСдсас ССсаададсС ЕдасааЕдаЕ аЕдсссддсс СадсасдСдд сдаСдсддса 1380 дССсдсаСас аЕдадЕдддЕ Еааададсаа сСддсдсада асссСдсддс аааааСаасС 1440 дсаСассааа Ссаадааааа СССаааССдС сдаааЕдасЕ Сддссадссд аСасаСддса 1500
СддСдсдсСд асдсдсСадд ддССдССаСС ддЕдаЕдаЕд дасаддсаад дссадаадаа 1560 сСсссассаС сдсСсдСдсС ЕдаЕаЕЕаас дсСдаСдаса сЕдасдсЕда адаадаЕдаа 1620 аЕададдаад асСССасСда ЕдаддаааЕа дасдасассд ааССсдасдС аСсадаСаас 1680 дссадЕдаЕд аадаСаадсс сдаадаЕааа ссСсдсСССд садсассааС ЕсдЕадаадЕ 1740 даддасЕсЕЕ ддсЕдаЕЕаа аСССдааССС дсЕддсаадс ааЕаЕадсЕд ддадддЕааЕ 1800 дссдааадСд ССаСсдаСдс даСдааасаа дсаЕддасЕд ааааЕаЕдда дЕаа 1854
Аминокислотная последовательность протеломеразы фага ΡΥ54 из Уетз1П1а (ЗЕО Ю N0:9)
МКНЭГКОХЛ/З СЬУКЕХСЕТЕ КЗОКАОСйКТ Р.КУОСААККГ ΚΝΑνΓΜΕΚΚΚ ΥΚ6Ν3ΜΚΝΚΙ 60 ЗЬТТГМКУЬЗ КАНЗКРЕЕКЬ ΗΗΞΚΡ03ΙΑΤ Ι8ΝΚΥΡΑΡ3Ε ИКОЬОЫКРА НЕУИКЬКЕЬ 120 ХТНЕЕЗСТЫЬ ЬЕКХС5ЬСК1 КРЗТАКК1У5 ЬККМУРЗИА» ШЛТЫЗТЕО АТБЫЗОКЬЕО 180 еТОЬЬНАЬНЗ ΕΚνΝΗΞνΗΪΑ ЬТМОРЗОКАА ЬКАВНОААЬН ΕΚΚΗΝΙΥΡΙΟ ΥΡΟΥΜΟΕΗΤϋ 240 1ЬНЬРОХАГЕ ОЗМАЗЬАРЬА ГАЬАААЗСКК 01Е1ЫТСЕГ 0ΑΚΝΚ3ΙΙΚΡ ЗСОАККВМАУ 300 36£ΗΥΕΙΥΞΕ ЮЗЕЬРЮКЬ ЕГЬКЗНЗЗХЬ КЬСНЬЕ1АНО ЕНКТЕЬЗУХЫ СП/АКРЬЫОА 360 ΑΚΟΓΕνϋΟΕΚ νΡΚΟΤΡΑΙΥΑ ΒΙΑΥΕΚΜΓΚΤ ОРВИАКСОЕО УГРЗЕЬЬСНО ΟΡϋΤΟΧΛΥΚΟ 420 ΓΚΧ,νΝΓΝΡΚΜ ΤΡΝΙ50ΕΝΡΚ ЬААЬСЕЬОМО МРСЬАКСОАА УНХНЕНУКЕО ΕΛβΝΡΑΑΚΙΤ 4 80 АУСЛККМЬМС ΚΝΟ1Λ5ΕΥΜΑ ИСАОАЬС-У’Л СОСЗОАВРЕЕ ЬРРЗЬУЬОХЫ ΑΟΟΤϋΑΕΕϋΕ 540 ΙΕΕΏΡΤΟΕΕΙ 00ΤΕΓ0ν30Ν Α30ΕΏΚΡΕ0Κ ΡΚΓΑΑΡΙΒΒ5 ЕОЗИЫКРЕГ АСКОУЗИЕСН 600 ΑΕΞνΐϋΑΜΚΟ ΑΗΤΕΝΜΕ 6X7
- 24 021069
Таблица Ρ
Нуклеотидная последовательность протеломеразы фага рЫКО2 из МеЬаеНа (ЗЕО 10 N0:10) аЕдсдГаадд бдаааатТдд ТдадсЬааТс ааЫгсдсСбд Сдадсдаддб сдаддсаабс 60 даТдсс+сСд аТсдСссдса аддсдаЬааа асдаадаааа бЕааадссдс адсабЬаааа 120
ТаЕаадааСд саЬЪаТТТаа Тдасаааада аадЕЕТсдсд дТаааддИЛ адаааааада 180 зЕТЕсТдсса асасдЕЕсаа сЬсдЬаТаТд адЕсдддсаа ддаааадаТЕ ЕдаТдаЬада 240
ТЕдсаЬсаТа асЕЕЕдаааа дааЬдЬааЫ: ааасЬаЬсад аааааТаЕсс ЫЕаЬаЬадЕ 300 даадааТЕаЬ сЬ£сд6ддс<: 1ЬсЬаЕдсс1 дсддсаСсаа ССадасадса СаСдСсаада 360
ССдсаадсса адсСаааада даТааСдсса ССддсадаад асЕСаСссаа СаСааадаСС 420 ддсасааааа аСадсдаадс аааааСаааС ааасСсдсСа аСаааСаСсс сдааСддсаа 480
СЕсдсСаТТа дСдаСТСааа СадсдаадаС сддааддаСа ааададасСа СсСССаСааа 540 сСаССссаас ааддССсССс дсСссСддаа дасССдааСа ассСдааадс ааассаСдад 600 дсссСсСаСс аСсСдсадсС СадССсСдсс дадсдаассС сСаСссадса дсдсСдддсс 660 аасдСссСса дсдадааааа дсдсаасдСС дСсдСдаССд асСаСссдсд сСаСаТдсад 720 дссаЕсСасд аСаСааСсаа саадссСаСа дЕССсдССсд аСЕСдасСас СсдСсдСддС 780 аСддссссдс СддсдССсдс ссССдссдсд сСаСсСддСс дссдааЕдаС СдаааСсаСд 840 сСссадддТд ааССТСссдС сдсаддСааа СаСасадСаа саССссСддд дсаадсСааа 900 ааасдсСсдд аадаСааадд СаСаСсаадд ааааСаСаСа ссССаСдсда сдсСасЕССа 960
СССдССадСС СддСаааСда асССсдсСса СдссссдсСд сЬдсддаССС СдаСдаадСа 1020 аСааааддаС аСддсдаааа СдасасСсдс СсадааааСд ддсдСаССаа СдсааССсСс 1080 дсЕасадсСС ЬЕааСссдСд ддСааааасС ССсССаддсд аСдассдссд сдСССаСааа 1140 даСадссдсд сЬаСССасдс ссдСаССдсс СаЕдаааЕдС ЬсССссдсдС СдасссСсдд 1200
СддаадааСд ССдаСдадда СдСаССсССс аЕддадаССс СсддссаСда сдаСдаааас 1260 асссаасЕдс асЕаСаадса дСССаааССд дсСаасЕСсЕ ссадаасаСд дсдассаааС 1320 дСсддсдадд адааСдсссд ссСадсддсд сСдсаааадс СддаСадсаЕ даЕдссадас 1380
СЕСдссаддд дсдасдссдд ддССсдСаЬС саСдадассд СдаадсадсС ддСддадсад 1440 дасссаСсда СаааааСсас ааасадсасс сСдсдассдС ССаасССсад СассаддсСд 1500 аССссСсдсС ассЬддадСЬ СдссдссдаС дсаССдддсс адЕСсдСсдд СдааааСддд 1560 сааСддсаас СдааддаСда ддсдссСдса аСадСссСдс ССдаСдадда ааССсССдад 1620 ссСаЕддасд асдСсдаСсС сдаСдасдаа аассасдасд аСдааасдсЕ ддаСдэсдаС 1680 дадаЕсдаад Сддасдааад сдааддадад даасЕддадд аадсдддсда сдсСдаадад 1740 дссдаддСдд сСдаасадда ададаадсас ссСддсаадс сааасСССаа адсдссдадд 1800 даЕааЕддсд аСддСассСа саСддСддаа СССдааССсд дСддссдЕса ССасдссСдд 1860
Сссддсдссд ссддЕааЕсд ддсададдса аЕдсаассСд ссСддадСдс сСасССсаад 1920
Еда 1923
Аминокислотная последовательность протеломеразы фага рЫК02 из К1еЬз1е11а (ЗЕО Ю ΝΟ: 11)
МККУК1СЕЫ МЗЬУЗЕУЕА! ОАЗОРРОСОЕ ТККХКАААЬК УКНАЬРЫОКК КРКСКСЬЕКК 60 Ι5ΑΝΤΡΝΞΥΜ ЗКАКККГСОК Ι,ΗΗΝΕΈΚΜνί КЬЗЕКУРЪУЗ ЕЕЬЗЗНЬЗМР ΑΑ5ΙΕ0ΚΜ3Β 120 ЬОАКЬКЕХМР ΕΑΕϋΕ5ΝΙΚΙ СТКВЗЕАКХЫ ΚΙΑΝΚΥΡΕΒΟ ГАХЗОЬВЗЕО ΜΚΟΚΚϋΥΙ.ΥΚ 180 ЬРООСЗЗЬЬЕ ОЬКЫЬКУЫНЕ УЬУНЬОЬЗЗА ЕВТ5100КИА ВУЬЗЕККРЛУ ννίΟΥΡΒΥΜΟ 240 ΑΙΥϋΙΧΒΚΡΙ УЗГОЬТТВВС МАРЬАГАЪАА Ь5СЯКМ1Е1М ЬОЕЕРЗУАСК УТУТРЬСОАК 300 ККЗЕЛКС13К КТУТЬССАТЬ ЕУЗЬУНЕЬИЗ ΟΡΑΑΑβϊΌΕν ΙΚΕΥΕΕΝϋΤΚ 3ΕΝ2ΒΧΝΑΙΙ, 360 АТАРВРНУКТ ΡΣΕΟΟΚΚνΥΚ Ο3ΒΑΙΥΑΒΙΑ УЕМРРКУОРК НКНУОЕОУЕГ ΜΕΙΙΌΗϋϋΕΝ 420 ТОЬНУКОРКЬ ΑΝΓ5ΚΤΗΚΡΝ УСЕЕНАВЬАА ЬОКЪРЗММРО РАКСОАСУК1 НЕТУВДЬУЕО 4 80 0Ρ3ΙΚΙΤΝ3Τ ЬВРРИРЗТВЪ ΙΡΚΥΕΕΓΑΑ0 АЬСОРУЕЕЫС ОНОЬКОЕАРА 1УЬРОЕЕ1ЬЕ 540 РМООУОЬСОЕ ННООЕТЬООО Е1ЕУОЕЗЕСЕ ЕЬЕЕАСОАЕЕ АЕУАЕОБЕКН РСКРНРКАРК 600 ОМСОСТУМУЕ РЕГССКНУАИ ЗСААСНКУЕА Μ03ΑΗ3ΑΥΡΚ 640
- 25 021069
Таблица С
Нуклеотидная последовательность протеломеразы фага νΡ882 из \ДЬпо (8ЕО Ю N0:12) аСдадсддсд даддСдаааа ассадддсдд ассадааСсд дадсадаасС ссдсааЬасд сСддсдсаСс сдсадсаСда дсдадасСдд аСсаасСаСс д1сддсадсд ддСсдСсдСС сСсдадССсС аССьаеассс ссадаадбсс аСсааСааас дадсдсдСдС саасдСдаСс сасдаддаса дадсадссдд дасссаааСд дадсдСаССд ддсссаддсс дСдаатасСс ааасадссда СдддаадссС сдсдССдадд ааадСадаса ссаСсдаСда сдасСаааСС сСсСдадсас ддааасасса сСдадсадсС дсдассСссС адССадасса сададдаадс асдадсСдаС асадсассСа сСаСсдадаС сСддссаадс сддседассс дсдсасСдда дсСдСдсааа
СсааадаСад сдсдсСддаа
СсдадасСса
Сдсасаадсс аддасаССас сддаадассс дСааддСдаС сСдСсдаСда адааадсдса дддсдсСддС сааСдасадс аааддсааас сааСдаддсд саадассаад
ССаСсдСаад садСсСсдад ддСддссаСс даададсасс сдаддСааСд сдссдаддсд ддссддсдСд садсССсадс асСдаадсад дааааадсдс сдассСддСа
СдадСасдас аасдсСеаае
СсдСдссаСс ааадааадас дааадссСаС
СддсаааССС сасссдсСса сдаддсдаас сааддасСас сдсадСсдСс даадсссада ддааддсдад сдсаСдддад с С еда дда дС аССасСсддС сСдсасдасд СасаСдасаа садсадаСад ддддссаСдд ааддасаасд сдссаСсСда ССдассдада дСддадсСдС сддсСддсдс ддсдадССса ддсддСдссд ссдаСддсдс саасСдддсд саааесдсса Сдддсдсдсс даддасдССС аадсааСЬса аададсадад СссаСддсса аСсасасадС сСсдассСдд даддССссад сСсдСддсСс даддСддсса дссадссааа
СааСаааСда сСдаааааас аСаадсдссд
Сддссадддс адсддсСддс аСаасаСсас аСдаадссСС сдсЬасссад адаааассдс
Сдассаадаа
ССддСаССдд ааааддедда асСаССсада
СдаадаассС адаССаадсд адсадССсСС
СддсССаСда
СсЬддсадда аддСсдасСа сСдаадсссС адаСссасда сасСсаСсас сСдасдаСдс сСдаСдСдсс ассаддССда дддСдзаааС аддсасСсда дсСсдбсдад саадССдаСс дааддасдед адсадССасС сааааадсас сдадССдсдс сдаддаСаСс
Сдсдсаааад сасддСсдас дассаадасд ссСддсСасс
Сдадсадсдд дассСаСасс дсдададССд даасдасдсс
Сддсадсдас дССдСССССС даСдсСдддс садсдаассС сдсддсдсСс сСдддСдааа ссдддаасСд ссССдсСдСд ддсадсадаа
СдаСдадсас саадддсасс
Сдасбаа
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
940
900
960
1020
1080
1140
1200
1260
1320
1380
1440
1500
1560
1617
Аминокислотная последовательность протеломеразы фага УР882 из ЩЬгю (8Е0 Ю N0:13)
МЗСЕЗГЩКУИ ЬЕЕЫКЕЬУЕ ЕУКТЮОКЕА ТЕ1АЬЗТУКК УМТМАКААУТ Ε0ΝΜΚ.4Η3Ε£ ЬАНКОЬЬКЗ! ΚϋΝΟΕΑΓΕϋΙ КЗМКЬОНЕУМ ΙΝΥΗΕΙΜΑΟν УЕЫТККТКТ УСЗОЗТУЗГЗ ЬЕЕЗСОАККК ССАйУЗЕТУТ ΙΥΊΊ,νΟΞΟΙ,ν ΙΝΚΚΕΛΚΤΙ,Ν ОТАКОГГСЗО ΕΚνΡΚϋΒΚΑΙ ΗΕΟΙΕΤβΚΆΥ Κ0ΓΚν0Υ3ΕΡ ЕОРУНКРСКР ΕΚΙΑΕϋΡΕΑΝ 1Т05ЫТКЕЬ С5СККУ1К0У КСРККАОКРК Ь’/АНОУОПЕ!! ИЕАИАЬУЕСЕ
1ТКЗЕКТКЫ ΤΚΑΑΤΚΓΚΤΚ ЬКООККККРА ΟΟΙΕΚΙιΑΚΚΗ ΡΟΥΑΕΟΙΛΑΙ САМОГЛТЕЬР. ЙНЕТЬРЗАОК АКЬАЕЕААЕА ЬТЕККТАТУО КЬАЬСТСЬАТ СЕК51Е1ЬК0 СЕРККУРЕОК ΕΜΆΙΛΐΝΙ,ΚΕΙ» РЕУКАЬОЕУО СЬСЕТКРТЮА ΗΑΚΕΑΥΕΕΓΓ ΟΚϋΡΗΗΚΚΚΟ ЕОУГНОЕМЬС Κ3ΚΑΕΑΙΑΑΙ, 05ΗΕϋΙΤΤΚ3 ΞΜΑΚΙΗΟΜνΚ ЬОЬАОСАЪАУ УМТРУООАУУ ЕУРАОУРААЕ ЕУАКУК1КЙТ КУЕАМТААНЕ А30КАЕ00
120
180
240
300
360
420
480
538
- 26 021069
Таблица Н
Нуклеотидная последовательность теломеразы (ίβΙΝ) и вторичного иммунного репрессора (сА1 бактериофага N15 из ЕвсНеггсЫа сой (5ЕО Ю N0:14) саЬаЪдсасЪ СсааЪЪасдд ааса^а^сад сасасаа^Ъд ссеаЬйа!:ас 60 дсдсдЬаЪаа ЬддасЬаЫ:д СдЪдсЬдаьа аддадааса£ аадсдсадаа саа'Са'Ьд'Ьа'Ь 120 сЪа£Ъссдд£ дЪЪд£д££сс £ЪЪдЬ£аЪЬс Ъдс£аЪ£а£д Ъ1;с£с£ЬаЪа дбдЪдасдаа 180 адсадсаСаа Ыаа£сд1;са даХЬд^дШа сдаНаЪссад адас1:1адаа 240 асдддддаас сддда^дадс ааддЪааааа ЪсддЪдад^Ъ. даЪсаасасд сЬЪдЬдааЬд 300 аддЪададдс ааЪСдаЪдсс Ъсадассдсс сасааддсда саааасдаад адааЪЪааад ЗбО ссдсадссдс асддХа^аад аасдсд±£а£. ^баа!:да1аа аадааадЫ^с сдЪдддааад 420 даЦдсадаз аадаа^аасс дсдааЪасЪЪ ЪЬаасдссЪа ЬаСдадсадд дсаадааадс 480 дд£££даЬда ЬаааНасаЪ саЪадсМЪд аНаааааЪаЪ ЪааЪаааЪЪа £сддаааадг. 540 аСссг-Сб^а садсдаадаа £Ъа1сЪ1са£ ддс££Ъс£а£ дсс±асддс± аа£аЫ:сдсс 600 адсасаЪдЪс а1:сд££асаа ЪсЪааа1Ъда аадаааТааЬ дссдсЬЬдсс даадад(Ла£ 660 сааа^дНаад ааЪаддс1:с£ аааддсад^д аЪдсааааэй адсаадаеЬа аЬаааааааЪ 720 аЬссадаЪ^д дадС^^^дсЬ сЪЪадСдаЬ'Ь ЪааасадЪда Ьда’Ь'Ьддаад дадсдссдЬд 780 ас1а£сЬЫа £аад£1:а£Ъс саасааддсЪ сЪдсдСТдЪЪ адаадаас^а сассадсХса 840 аддЪсаасса £даддЬ£с1:д ЪассаСсСдс адсЪаадссс -Ьдсддадсд^ асаЪсЪа*Ьас 900 адсаасдаТд ддссдаСдЪЪ сЪдсдсдада адаадсдиаа Ъд£Ьд£дд££. а££дасЬасс 960 саасаЪасаЪ дсадЪсЪаЪс ЬаЪдаЪаЪ*^ 1:даа1:аа1:сс ЬдсдасЪ1;£а И:ЬадЫ:1аа 1020 асасъсдиъс ЪддааЪддса ссЪСЪддссЬ ЬСдсСсЪддс ЪдсддЪаЪса дддсдаадаа 1080 ЪдаЬЪдадаЪ ааЪд£1Ъсад ддЪдааЪ1£д ссдЪМсадд ааадЪаЪасд д££ааЬ«сЪ 1140 садддсаадс £аааааасдс СсЬдаада^а ааадсдЪаас садаасдаЪЪ 1аСассЪ1а£ 1200 дсдаадсааа а£ЪаЬЪсд£± дааПЪаЪЪаа садаэЪСдед £ТсЬ£дс£сЪ дс£дсаЬс£д 1260 аЪЪЪсдаЪда дд£Ьд££ааа ддаЪаЪддаа эддаЪдаЪас ааддЪсЬдад аасддсадда 1320 1:ааа£дсъа£ ТХЪадсаааа дса^ЪЪаасс сМдддЪЪаа а£са££Ъ£Ъс ддсдаЬдасс 1380 д!сд1д1Ыа ЬааадаЬадс сдсдсЪаЪЪЪ асдсСсдсаЪ сдсСЪаЪдад а^дМсЬ^сс 1440 дсдгсдаьсс асддЪддааа аасдЪсдасд аддаЪдЪд^Ь сС^саЪддад аСЮСсддас 1500 асдасда^да даасасссад с£дсас£а£а адсадЪЪсаа дс'Ьддссаас ЪЪсСссадаа 1560 сс^ддсдасс £даад£Сддд даЬдааааса ссаддс1дд£ ддсСсСдсад ааасЬддасд 1620 аЪдааа^дсс аддс£££дсс ададдъдасд сьддсд1ссд Ъс^ссаХдаа ассдЬЪаадс 1680 адсЪддгдда дсаддассса Ъсадсааааа Ъаассэасад сасЬсЪссдд дссЪЬЪаааЪ 1740 гъадсссдас даЪдаСЪадс сддЪассСдд ад1££дссдс £даЬдса££д дддсад*Ъсд 1800 ££ддсдадаа сдддсадСдд садс^даада Ъададаезес СдсааСсд'Ьс сЬдссСдаСд 1860 аадаа£ссд£ ЬдадассаЪс дасдаассдд аЪдаЬдадЪс ссаадасдас дадсЪддаЪд 1920 аада£дааа£ ЪдадсЪсдас дадддЪддсд дсдаЪдаасс аассдаадад даадддссад 1980 аадаасаЪса дссаасЪдсЬ с£аааасссд иС1.Ъсаадсс £дсааааааЪ аасддддасд 2040 даасд^асаа да^адад):^! дааСасда'Ьд дааадсэССа ЪдссСддСсс ддссссдесд 2100 аЬадсссСаЬ ддссдсааСд сдаСссдсаС дддааасдСа сСасадсСаа аадаааадсс 2160 ассддСдССа аСсддСддсС СССССаССда ддссСдСссс СасссаСссс сСдсааддда 2220 сддааддаСС аддсддааас СдсадсСдса асСасддаса СсдссдСссс дасСдсаддд 2280 асССссссдс дСааадсддд дс£1аа&ССс дддсСддсса асссСа1£СС СсСдсааСсд 2340 сСддсдаСдС СадСССсдСд даСадсд^СС ссадсССССс аасддссадс СсааааСдСд 2400 еСддсадсас сЪСсСссадС СссдСаСсаа СаСсддСдаС сддсадеСсС ссасаадаса 2460 ЬасЪссддсд ассдссасда асЪасаЬсдс дсадсадсЪс ссдЬЪсдЪад асасдсаЪдъ 2520 Ъдссеададс сд(Ъ£с£дса дссд’СХааЬа Ъссддсдсас дЪеддсдаЪд а^Ъдссддда 2580 даЪса'Ьссас ддКаКддд ^сдд^да^д дд£Ъсс£дса ддсдсддсдд ададссаЬсс 2640 адасдссдсЬ аассса£дсд ЬЁасдд^асЬ даааасЪЪЪд ЪдсЪаЪдЪсд Ы;1;аЬсаддс 2700 ссдэад£Ес£ £с£££е£дсе дссад^ссад ^ддЕЬсасед дсд££сЬ£ад дсЪсаддсЬс 2760 дасаааадса ХасЪсдссдЬ Ь^ЪЪссддаЪ адсЬддсада ассЪсд'Ь'Ьсд ЬсассеасЪ£ 2820 дсддаассдс саддс!д£сд СссссЬдЬСС сассдсдЪсд сддсадсдда ддаХЪаСддЪ 2880 д^ададассэ да^ссда^а ссаса!77ас ИсссЪддсс а1;ссда1:саа д1:£1:1:£д1:дс 2940 сЪсддЬЪааа ссдадуд^са а'СЬ^'СЁса'Ьс аЬдаЬссадс ££асдсаа1:д саЪсадаадд 3000 дЪЪддс±аЪа ^^сааЪдсад сасада£а£с садсдссаса аассасдддЬ сассассдас 3060 аадаассасс сдЪа-ЬадддЪ ддс^^1:сс<:д аааЪдаааад асддададад ссИ*Бса^1:дс 3120 дсс£ссссдд а£££садсед с£садааадд дасадддэдс адссдсдадс £Ссс1:дсд£д 3180 адСЛсдсдсд сдассЪдсад аадЪЪссдса дсСкссСдса ааЬзсадсдЬ ддсссса£аа 3240 сГддадаНад ЪдсддЪдадс ададссеаеа адсдсЪИсаа ссЬдсадсад дсд££ссЪса 3300 а1сдЪсЪсса дсаддсссЬд ддсдЪЬЬаас ЪдааСсСддЪ £еаЪдсда£с ассЬсдс1:да 3360 ссдсдагасд ддсЪдасада асдаддасаа аасддсХддс даасЪддсда сдадс^ЬсХс 3420 дсЬсддаЪда ЪдсааЪддЪд даааддсддЪ дда£а£дддэ «СЪИдгсс дгдсддасда 3480 садсЪдсааа Ъ^ЬдааСЪЪд аасаЬддЪа'Ь дсаЪЪсс^аъ с^Ъд^аЪадд д^дсЪассас 3540 садад£1дад ааЬсЪсЬа^а ддддЬдд£ад сссадасадд д£Ъс1:сааса седдЪасаад 3600 эадааассдд сссаассдаа дЪЛддсссса ЬсХдадссас саЪаа££сад дъа1:дсдсад 3660 а1:Ъ1;аасаса саааааааса сдсЪддсдсд £д1±дЬдсдс Ыс££д£са(; £сддддЪ£да 3720 даддсссддс ЪдсадаГЪЪЪ дсЪдсадсдд ддГаасЪсЬа ссдссааадс адаасдсасд 3780 Ъсаа£аа£££ аддЪддасаЪ ЪЪЪассссдЪ дассадЪсас д^дсасаддЪ дГС^^а^ад 3840 Ъ1Хдс£Ь£ас ЪдасЪдаСса даассЪдаЪс адСЛаЪЪдда дЪссддЪааЪ с1Ла££даЪд 3900 ассдсадсса сс£Ъада&дЪ ЬдЪсЬсааас ссса^асддс сасдааЬдад ссасЪддаас 3960 ддаа£ад£са дсадд^асад сддаасдаас сасааасддЬ Ссадасдсгд ссадаасд^с 4020 дсаЪсасдас дИСссаесса ИсддСаМ:д 1сдас 4055
Аминокислотная последовательность теломеразы бактериофага N15 из ЕзсКепсЫа соН (ЗЕО Ю N0:15)
М5КУК1СЁЫ ΙίΤΐ,νΝΕνΕΑΙ ОАЗОПРОСОК ΤΚΚΙΚΑΑΑΑΕ ΪΚΝΑΙ,ΡΝΟΚΚ КГЙСКСЪ£К? 60 ΙΤΑΝΤΓΝΑΥΜ 3ΚΑΚΚΕΕΌΟΚ ЬНН5Г0КМ1М КЪЗЕКУРЬУЗ БЕЬЗЗНЬЗМР ΤΑΝΙΒΦΗΜ33 120 Ь05КЬКЁ1МР ΙΑΕΕΣ3ϊΐνΚΙ 05КС50АК1А КЫККУРОИЗ ГАЕЗОЬЫЗОЬ ΜΚΕΗΚΟΥΊ,ΥΚ 180 ЬГООСЗАЬЬЕ ЕЬНОЬКУННЕ νΕΥΗΣΟΙδΡΑ ΕΕΤ3Ι00ΕΗΑ ОУЬЕЕККОУ νΫΙΟΥΡΤΥΜ£ 240 δΙΥϋΙΙΝΝΡΑ ТЬРЗЬНТКЗС ΜΑΡΙΑΡΑ1ΑΑ У5СЕКМХЕ1М Р^СЕГАУЗСК УТУНРЗСОАК 300 ΚΚδΕϋΚδνΤΕ Т1УТЬСЕАКЬ ГУЕЬЬТЕЬКЗ СЗААЗРРОЕУ УКСУСКОРТН 5ΕΝΘΚΙΝΑΙΙ, 360 ΑΚΑΓΝΡίίνΚδ ΓΕΌΟΟΚΕνΥΚ 05ΕΑΙΥΑΕΙΑ УЕМГГНУОРЕ ΗΚΝνΟΕΟνΓΓ ΜΕΙΕΘΗΟϋΕΝ 420 ΤΟΙ*ΗΥΚζ>ΓΚΙ, ΑΝΡΞΕΤΜΚΡΕ ТСОЕЫТКЬУА ЬОКЪООЕМРб ГАЕСОАСУКЬ ΗΕΤνΚΟΙΛ/ΕΏ 480 ΟΡΞΑΚΙΓΝ3Τ ЬЕАЕКГЗРТМ ΙΞΚΥΙ,ΕΓΑΑΟ Α1ΘΰΓν5ΕΝ6 0Н£ЪК1ЕТРА ТУЪРЛЕЁЗУЕ 540 ΤΙΟΕΡϋϋΕδΰ ϋΟΕΙιΟΕϋΕΙΕ ЬОЕСССЭЕРТ ЕЕЕСРЕЕН^Р ТАЬКРУГКРА ΚΝΝΟΟΘΤΥΚΙ 600 ΕΡΕΥΟΟΚΗΥΑ НЗСРАО5РМА АМЕЗАИЕТУУ 5 631
- 27 021069

Claims (11)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Бесклеточный способ получения закрытой линейной дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) ίη νίίτο, включающий:
    (a) приведение ДНК-матрицы, содержащей по меньшей мере одну протеломеразную последовательность-мишень, в контакт по меньшей мере с одной ДНК-полимеразой, в присутствии одного или нескольких праймеров в условиях, способствующих амплификации указанной матрицы; и (b) приведение амплифицированной ДНК, полученной в (а), в контакт по меньшей мере с одной протеломеразой в условиях, способствующих получению закрытой линейной ДНК.
  2. 2. Способ по п.1, в котором указанную ДНК-матрицу инкубируют в условиях, способствующих амплификации указанной матрицы путем вытеснения реплицированных цепей посредством репликации другой цепи по типу вытеснения цепи, необязательно, в котором амплификацию указанной матрицы проводят с помощью амплификации по типу катящегося кольца (КСА).
  3. 3. Способ по п.1 или 2, в котором:
    (a) указанные праймеры являются праймерами со случайной последовательностью; и/или (b) указанная ДНК-полимераза представляет собой рЫ29 с последовательностью 8ЕЦ ГО N0: 2 или ее вариант и/или указанная протеломераза представляет собой ТеГО бактериофага N15 с последовательностью 8ЕЦ ГО N0: 15 или ее вариант; и/или (c) амплифицированная ДНК, полученная в (а), содержит конкатемеры, включающие тандемные единицы последовательности ДНК, амплифицированные с указанной ДНК-матрицы, необязательно, в котором указанные конкатемеры разделяют на одиночные единицы амплифицированной последовательности ДНК с помощью указанной протеломеразы.
  4. 4. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором указанная протеломеразная последовательность-мишень содержит ДНК-последовательность совершенного инвертированного повтора.
  5. 5. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором:
    (a) указанная ДНК-матрица представляет собой закрытую кольцевую ДНК или (b) указанная ДНК-матрица представляет собой закрытую линейную ДНК, предпочтительно в котором указанную ДНК-матрицу инкубируют при денатурирующих условиях для образования закрытой кольцевой ДНК.
  6. 6. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором указанная ДНК-матрица содержит экспрессионную кассету, содержащую эукариотический промотор, функционально соединенный с представляющей интерес кодирующей последовательностью, и, необязательно, эукариотической последовательностью терминации транскрипции; в котором указанная представляющая интерес кодирующая последовательность, необязательно, представляет собой кодирующую последовательность человека или кодирующую последовательность из патогена, инфицирующего человека, и, необязательно, в котором указанная экспрессионная кассета фланкирована с каждой стороны последовательностью-мишенью протеломеразы, причем предпочтительно указанный способ служит для получения закрытой линейной экспрессионной ДНК-кассеты.
  7. 7. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором:
    (I) указанный способ дополнительно включает очистку закрытой линейной ДНК, полученной в (Ь); и/или (II) указанный способ включает:
    (a) приведение одноцепочечной указанной ДНК-матрицы, имеющей последовательность-мишень протеломеразы, которая расщепляется и повторно соединяется протеломеразой ТеШ с последовательностью 8ЕЦ ГО N0: 15, в контакт с ДНК-полимеразой рЫ29 с последовательностью 8ЕЦ ГО N0: 2 или ее вариантом при температуре от примерно 25 до примерно 35°С в условиях, способствующих амплификации указанной матрицы с помощью указанной ДНК-полимеразы; и (b) приведение конкатемеров, полученных на стадии (а), в контакт с указанной протеломеразой ТеШ или ее вариантом при температуре от примерно 25 до примерно 35°С в условиях, способствующих активности указанной протеломеразы;
    необязательно, в котором указанная последовательность-мишень протеломеразы включает последовательность §ЕЦ ГО N0: 25 или ее вариант.
  8. 8. Бесклеточный способ получения фармацевтической композиции, содержащей закрытую линейную молекулу ДНК, включающий:
    (a) приведение ДНК-матрицы, содержащей по меньшей мере одну протеломеразную последовательность-мишень, в контакт по меньшей мере с одной ДНК-полимеразой в присутствии одного или более праймеров в условиях, способствующих амплификации указанной матрицы;
    (b) приведение амплифицированной ДНК, полученной в (а), в контакт по меньшей мере с одной протеломеразой в условиях, способствующих получению закрытой линейной ДНК; и (c) введение полученной закрытой линейной ДНК в состав с фармацевтически приемлемым носителем или эксципиентом.
  9. 9. Набор, содержащий по меньшей мере одну ДНК-полимеразу и по меньшей мере одну протеломе- 28 021069 разу и, необязательно, инструкции по применению в способе по любому одному из предшествующих пунктов.
  10. 10. Способ индукции иммунного ответа против антигена в организме хозяина, причем способ включает осуществление способа по любому из пп.1-8 с использованием указанной ДНК-матрицы, кодирующей указанный антиген, и введение полученной закрытой линейной ДНК, кодирующей указанный антиген, указанному хозяину так, что указанный антиген экспрессируется в указанном хозяине и вызывает иммунный ответ против указанного антигена.
    - 29 021069
    Фиг. 3
    С1 1 1 11 Ογ
    Ζ Β
    Фиг. 5
    - 30 021069
    А.
    В.
    1 2345 67 89
    Фиг. 6
    - 31 021069
    Список последовательностей <ιιο> тоиснионт сеыет1С5 ыштеб <120> ПОЛУЧЕНИЕ ЗАКРЫТОЙ ЛИНЕЙНОЙ ДНК <130> Ν106698Α <140> РСТ/СВ10/000165 <141> 2010-02-01 <150> СВ 0901593.4 <151> 2009-01-30 <160> 42 <170> РабепЫп νβτβίοη 3.5 <210> 1 <211> 1728 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
    <223> Нуклеотидная последовательность ДНК-полимеразы бактериофага рЫ29 из
    ВасШив <400> 1
    абдаадсаба бдссдадааа дасдсабадб бдбдасбббд адасаасбас бааадбддаа 60 дасбдбаддд бабдддсдба бддббабабд аабабадаад абсасадбда дбасааааба 12 0 ддбаабадсс бддабдадбб баСддсдбдд дбдбСдаадд басаадсбда СсбабаССбс 180 сабаассбса аабббдасдд адсббббабс аббаасбддб Ьддаасдбаа бддббббаад 240 бддбсддсбд асддаббдсс ааасасасаб аабасдабса Сассссдсас дддасаабдд 300 басабдаббд абабабдббб аддсбасааа дддааасдба адабасабас адбдабабаб 360 дасадсббаа адааасбасс дбСбссбдбб аадаадабад сбааадасбб Сааасбаасб 420 дббсббааад дбдабаббда ббассасааа дааадассад бсддсбабаа дабаасассс 480 даадаабасд ссбабаббаа ааасдабабб садаСбаСбд сддаасдбсб дббааббсад 54 0 бббаадсаад дбббадассд даСдасадса ддсадбдаса дбсбаааадд бббсааддаб 600 аббабаасса сбаадааабб саааааддбд СбСссбасаб сдадбсббдд асСсдабаад 660 даадбдадаб асдссбабад аддбддбббб асабддббаа абдабаддбб сааадааааа 720 дааабсддад ааддсасддс есссдабдбб аабадбсбаб ассссдсаса дабдбабадс 780 сдбсбссббс сабабддбда ассбабадба ббсдадддба аабасдбббд ддасдаадаб 840 басссассас асабасадса бабсадабдб дадббсдааб Сдааададдд сбабабассс 900 асбабасада бааааадаад баддббббаб аааддбаабд адбассбааа аадбадсддс 960 ддддадабад ссдаосбсбд дббдбсаааб дбадассбад ааббаабдаа адаасасбас 1020 дабббабаба асдббдааба бабсадсддс ббааааббба аадсаасбас аддбббдббб 1080 ааадабббба бадабааабд дасдбасабс аадасдасаб садааддадс дабсаадсаа 1140 сбадсаааас бдабдббааа садбсбабас ддбаааббсд сбадбаассс бдабдббаса 1200 дддааадбсс сббабббааа ададаабддд дсдсбаддбб бсадасббдд адаададдаа 1260 асаааадасс сбдбббабас ассбабдддс дббббсабса сбдсабдддс бадабасасд 1320 асааббасад сддсасаддс ббдббабдаб сддабаабаб асбдбдабас бдасадсаба 1380 сабббаасдд дбасададаб ассбдабдба абаааадаба бадббдассс баадаааббд 1440 ддабасбддд сасабдааад басаббсааа ададббаааб абсбдадаса даадассбаб 1500 абасаадаса бсбабабдаа адаадбадаб ддбаадббад бадааддбад бссадабдаб 1560 басасбдаба баааабббад бдббааабдб дсдддаабда сбдасаадаб баадааадад 1620 дббасдбббд адаабббсаа дбдссдддсд дддбддббсб адбсддаббс ддббдабдас адбсддаааа асаббсасаа бдаадссбаа бсааабаа дссбдбдсаа 1680 1728
    <210> 2 <211> 575 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
    <223> Аминокислотная последовательность ДНК-полимеразы бактериофага рЫ29 из ВасШив <400> 2
    Меб Дуз Н1з Меб Рго Агд Дув Меб Туг Зег Сув Азр РЬе С1и ТЬг ТЬг
    15 10 15
    ТЬг Дуз Уа1 С1и Азр Суз Агд Уа1 Тгр А1а Туг С1у Туг Меб Азп Не 20 25 30
    С1и Азр Шз Зег С1и Туг Дуз Не О1у Азп Зег Деи Азр С1и РЬе Меб 35 40 45
    А1а Тгр Уа1 Деи Дуг Уа1 С1п А1а Азр Деи Туг РЬе Нхз Азп Деи Дуз 50 55 60
    РЬе Авр С1у А1а РЬе Не Не Азп Тгр Деи С1и Агд Азп С1у РЬе Дуз 65 70 75 80
    Тгр Зег А1а Азр С1у Деи Рго Азп ТЬг Туг Азп ТЬг Не Не Зег Агд 85 90 95
    Меб С1у С1п Тгр Туг Меб Не Азр Не Сув Деи С1у Туг Дув С1у Дув
    100 105 110
    Агд Ьуз Не Ηίε ТЬг λ/а! 11е Туг Авр Зег Ьеи Ьуз Ьуз Ьеи Рго РЬе 115 120 125
    Рго УаЬ Ьуз Ьуз 11е А1а Ьуз Азр РЬе Ьуз Ьеи ТЬг УаЬ Ьеи Ьуз СЬу 130 135 140
    Азр Не Азр Туг Нхз Ьуз СЬи Агд Рго УаЬ СЬу Туг Ьуз 11е ТЬг Рго 145 150 155 160 <31и <31и Туг А1а Туг Не Ьуз Азп Азр 11е О1п Не Не А1а О1и Агд
    165 170 175
    Ьеи Ьеи Не С1п РЬе Ьуз С1п (Ну Ьеи Азр Агд МеС ТЬг А1а СЬу Зег 180 185 190
    Азр Зег Ьеи Ьуз С1у РЬе Ьуз Азр 11е 11е ТЬг ТЬг Ьуз Ьуз РЬе Ьуз 195 200 205
    Ьуз Уа1 РЬе Рго ТЬг Ьеи Зег Ьеи С1у Ьеи Азр Ьуз СЬи УаЬ Агд Туг 210 215 220
    А1а Туг Агд СЬу С1у РЬе ТЬг Тгр Ьеи Азп Азр Агд РЬе Ьуз СЬи Ьуз 225 230 235 240
    СЬи 11е СЬу СЬи СЬу МеС УаЬ РЬе Азр УаЬ Азп Зег Ьеи Туг Рго А1а 245 250 255
    СЬп МеС Туг Зег Агд Ьеи Ьеи Рго Туг СЬу СЬи Рго Не УаЬ РЬе СЬи 260 265 270
    СЬу Ьуз Туг УаЬ Тгр Азр СЬи Азр Туг Рго Ьеи НЬз Не СЬп Нхз Не 275 280 285
    Агд Суз СЬи РЬе СЬи Ьеи Ьуз СЬи СЬу Туг 11е Рго ТЬг 11е СЬп 1Ье 290 295 300
    Ьуз Агд Бег Агд РЬе Туг Ьуз С1у Азп СЬи Туг Ьеи Ьуз Зег Зег СЬу 305 310 315 320
    СЬу СЬи 1Ье А1а Азр Ьеи Тгр ьеи Зег Азп УаЬ Азр Ьеи СЬи Ьеи МеС 325 330 335
    Ьуз СЬи Н1з Туг Авр Ьеи Туг Азп УаЬ СЬи Туг Пе Зег СЬу Ьеи Ьуз
    340 345 350
    РЬе Ьуз АЬа ТЬг ТЬг СЬу Ьеи РЬе Ьуз Азр РЬе ХЬе Азр Ьуз Тгр ТЬг 355 360 365
    Туг 1Ье Ьуз ТЬг ТЬг Зег СЬи СЬу АЬа 1Ье Ьуз СЬп Ьеи АЬа Ьуз Ьеи 370 375 380
    МеС Ьеи Азп Зег Ьеи Туг СЬу Ьу8 РЬе АЬа Зег Азп Рго Азр УаЬ ТЬг 385 390 395 400
    СЬу Ьуз УаЬ Рго Туг Ьеи Ьу8 СЬи Азп СЬу АЬа Ьеи СЬу РЬе Агд Ьеи 405 410 415
    СЬу СЬи СЬи СЬи ТЬг Ьуз Азр Рго УаЬ Туг ТЬг Рго МеС СЬу УаЬ РЬе 420 425 430
  11. 11е ТЬг АЬа Тгр АЬа Агд Туг ТЬг ТЬг 11е ТЬг А1а АЬа СЬп АЬа Суз 435 440 445
    Туг Азр Агд Не Не Туг Суз Азр ТЬг Азр Зег Не НЬз Ьеи ТЬг СЬу 450 455 460
    ТЬг СЬи Не Рго Азр УаЬ Не Ьуз Азр Не УаЬ Азр Рго Ьуз Ьуз Ьеи 465 470 475 480
    СЬу Туг Тгр АЬа Ηίε СЬи Зег ТЬг РЬе Ьуз Агд УаЬ Ьуз Туг Ьеи Агд 485 490 495
    СЬп Ьуз ТЬг Туг Не СЬп Азр Не Туг МеС Ьуз СЬи УаЬ Азр СЬу Ьуз 500 505 510
    Ьеи УаЬ СЬи СЬу Зег Рго Азр Азр Туг ТЬг Азр Не Ьуз РЬе Зег УаЬ 515 520 525
    Ьуз Суз АЬа С1у МеС ТЬг Азр Ьуз Не Ьуз Ьуз СЬи Уа1 ТЬг РЬе СЬи 530 535 540
    Азп РЬе Ьуз УаЬ СЬу РЬе Зег Агд Ьуз МеС Ьуз Рго Ьуз Рго УаЬ СЬп 545 550 555 560
    УаЬ Рго СЬу СЬу Уа! УаЬ Ьеи УаЬ Азр Азр ТЬг РЬе ТЬг Не Ьуз 565 570 575 :210> 3 <211> 775 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
    <223> Аминокислотная последовательность ДНК-полимеразы Ьеер УепС из Ругососсиз ер.
    <400> 3
    МеС Не Ьеи Азр А1а Азр Туг Не ТНг СЬи Азр СЬу Ьуз Рго Не Не 15 10 15
    Агд Не РЬе Ьуз Ьуз СЬи Азп С1у СЬи РЬе Ьуз Уа1 <31и Туг Азр Агд 20 25 30
    Азп РЬе Агд Рго Туг Не Туг А1а Ьеи Ьеи Ьуз Азр Азр Зег СЬп Не 35 40 45
    Азр СЬи УаЬ Агд Ьуз Не ТЬг А1а <31и Агд Ηίβ С1у Ьуз Не УаЬ Агд 50 55 60
    Не Не Азр А1а СЬи Ьуз УаЬ Агд Ьуз Ьуз РЬе Ьеи СЬу Агд Рго Не 65 70 75 80
    СЬи УаЬ Тгр Агд Ьеи Туг РЬе СЬи НЬз Рго СЬп Азр УаЬ Рго А1а Не 85 90 95
    Агд Азр Ьуз 11е Агд СЬи НЬз Зег А1а УаЬ Не Азр Не РЬе СЬи Туг 100 105 НО
    Азр Не Рго РЬе АЬа Ьуз Агд Туг Ьеи Не Азр Ьуз СЬу Ьеи Пе Рго 115 120 125
    МеС С1и СЬу Азр СЬи СЬи Ьеи Ьуз Ьеи Ьеи АЬа РЬе Азр Пе СЬи ТЬг 130 135 140
    Ьеи Туг НЬз СЬи СЬу СЬи СЬи РЬе АЬа Ьуз СЬу Рго Пе Пе МеС Пе 145 150 155 160
    Зег Туг АЬа Азр СЬи СЬи СЬи АЬа Ьуз УаЬ Пе ТЬг Тгр Ьуз Ьуз Пе 165 170 175
    Азр Ьеи Рго Туг УаЬ СЬи УаЬ УаЬ Зег Зег СЬи Агд СЬи Мес Пе Ьуз 180 185 190
    Агд РЬе Ьеи Ьуз УаЬ Пе Агд СЬи Ьуз Азр Рго Азр УаЬ Пе Пе ТЬг 195 200 205
    Туг Азп СЬу Азр Зег РЬе Азр Ьеи Рго Туг Ьеи УаЬ Ьуз Агд А1а СЬи 210 215 220
    Ьуз Ьеи СЬу Пе Ьуз Ьеи Рго Ьеи СЬу Агд Азр СЬу Зег СЬи Рго Ьуз 225 230 235 240
    МеС. СЬп Агд Ьеи СЬу Азр МеС ТЬг АЬа УаЬ СЬи 11е Ьуз СЬу Агд Пе 245 250 255
    НЬз РЬе Азр Ьеи Туг Наз УаЬ 11е Агд Агд ТЬг Пе Азп Ьеи Рго ТНг 260 265 270
    Гуг ТНг Ьеи СЬи АЬа УаЬ Туг СЬи АЬа Пе РЬе СЬу Ьуз Рго Ьуз СЬи 275 280 285
    Ьуз УаЬ Туг АЬа Наз СЬи Не А1а СЬи АЬа Тгр СЬи ТЬг СЬу Ьуз СЬу 290 295 300
    Ьеи СЬи Агд УаЬ АЬа Ьуз Туг Зег МеС СЬи Азр АЬа Ьуз УаЬ ТНг Туг 305 310 315 320
    СЬи Ьеи СЬу Агд СЬи РЬе РЬе Рго Мес СЬи АЬа СЬп Ьеи Зег Агд Ьеи 325 330 335
    УаЬ СЬу СЬп Рго Ьеи Тгр Азр УаЬ Зег Агд Зег Зег ТЬг СЬу Азп Ьеи 340 345 350
    УаЬ СЬи Тгр Туг Ьеи ьеи Агд Ьуз АЬа Туг СЬи Агд Агп СЬи Ьеи АЬа
    355 360 365
    Рго А5П Ьуг Рго Авр СЬи Агд СЬи Туг СЬи Агд Агд Ьеи Агд СЬи Зег 370 375 380
    Туг АЬа СЬу СЬу Туг УаЬ Ьуз СЬи Рго СЬи Ьуз СЬу Ьеи Тгр СЬи СЬу
    385 390 395 400
    Ьеи УаЬ Зег Ьеи Азр РНе Агд Зег Ьеи Туг Рго Зег Ые 1Ье Не ТНг 405 410 415
    НЬз Азп УаЬ Зег Рго Азр ТНг Ьеи Азп Агд СЬи СЬу Суз Агд СЬи Туг 420 425 430
    Азр УаЬ АЬа Рго СЬи УаЬ СЬу НЬз Ьуз РНе Суз Ьуз Азр РНе Рго СЬу 435 440 445
    34 021069
    11е
    Ьеи
    480
    С1у <31и
    О1и
    С1у
    Ьуз
    560
    Ьеи
    Ьуз
    С1у □1п
    А1а
    640
    11е
    Низ
    А1а
    А1а Агд С1у Уа1 Ьуз Уа1 Агд Рго <31у Мес Уа1 Не <31у Туг Не Уа1 690 695 700
    Ьеи Агд С1у Азр <31у Рго Не Зег Ьуз Агд А1а 11е Ьеи А1а С1и 01и 705 710 715 720
    РЬе Азр Ьеи Агд Ьуз Ηίβ Ьуз Туг Азр А1а С1и Туг Туг Не <31и Азп 725 730 735 <31п Уа1 Ьеи Рго А1а Уа1 Ьеи Агд 11е Ьеи <31и А1а РЬе С1у Туг Агд 740 745 750
    Ьуз С1и Азр Ьеи Агд Тгр С1п Ьуз ТЬг Ьуз О1п ТЬг С1у Ьеи ТЬг А1а 755 760 765
    Тгр Ьеи Азп Не Ьуз Ьуз Ьуз 770 775 <210> 4 <211> 2631 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
    <223> Нуклеотидная последовательность ДНК-полимеразц I (ροϊΑ) из ВасШиз зЬеагоскегторйНиз <400> 4 асдаадаада адсСадСасС аассдасддс аасадСдСдд саСассдсдс сССССССдсс
    ССдссасССС СдсаСаасда саааддсаСС сасасдаасд сддСЫзасдд дсССасдаСд асдС-Сдааса аааССССддс ддаадаасаа ссдасссаСС сасССдСадс дСССдасдсс ддааааасда сдссссддса сдааасдссс саададсаса ааддсддасд дсаасааасС сссссддаас СдСссдадса дсссссдссд сСдсдсдадс СаСсаааадс дСассдсаСС сссдсССаСд аасССдаСса ССасдаадсд дасдасасса Ссдддасдсс сдсСдсссдс дсСдадсаад аадддсссда адсдаааасс аСССссддсд ассдсдаССС аасссадсес дссссссдсс асдсдасддс сдаСаССасд ааааааддда ссассдасас сдадссдСас асдссадада ссдССсдсда аааасасддс сСдасСссдд адсаааСадс ддаСССаааа ддаССдаСдд дсдаСаааСс сдасаасасс ссдддсдсдс ссддсаСсдд ддаааааасд дсддСсаадс СдсСдаадса аСССддсасд дсддаааасд СдсСсдсаСс даССдаСдад дсдааадддд ааааасСдаа адаааасссд сдссаасасс дддаСССадс ссссссдадс
    120
    180
    240
    300
    360
    420
    480
    540
    600
    660
    720
    - 35 021069 ааасадседд
    Сасдааддас
    ССсССддааа
    СССдссаСсд даддсдасдд саСдддсдаС сссдссдасд аадсддааад сСсаасссдд дсддСдсддС садасдсссд сссаСддасд сСддсддсда даасадаедд ссадссддсс аадссдсадс сссдадаадс ддсааассдс ааадсдсаса ссдаассСдс дСсссдСсад дсссссдссс аССсасасаа асдсдссдсс
    ССддсдсааа дссадсСССс ддаСаСдСда сссаасдссс дсСдасаССа саддсссдсс аССдадсдас ссдсСдааад сдсссаСЕСд ссдсдасдсс ссддССдадс СдСсдССада СдасаССдСс аадассдсда аааадссаСс дсдссассса аадаасссдд дсссеадссд аааСддссдс дссддсадсс дааддддада аассдсссда ддадасддад
    ССдасдСсас Сассдаадад аСдсССдссд асааддсадс дссСдСсдСС аадаааасса ссасдаСдсс ссдаССдссд дааСсдсасс адсдаасдад
    СССССаСдсд сссддадасс дсдссддсСд асесдсааСС сссадсасдд ааасдаадаа ааааадсаСд СССдасдсса адсдддсадС сдССдссССа даассдадсс ссдсддсдсс дсссссдасс сассдсссдс сдессасссд сСсаадаСдс сддсдаСаСс дсСдсддСдд сдааааСдаа асааСаСдаа сддасдаадс ддссСаСддс аааддсдСса адсддСсдсс дссддасдаа сСдадсаСсС сдССсдсааа дсддсадсса СССдддсдсС Сдадсадссд аСССдсддаа саасдаасаа дассаассас СаасдаадсС Сдадсадссд ссссддссда аасддаассс ассддддсда асдСддаСас ааадсддсСС дсссддадсс сдссдаасаа ссдсдсдсса ссдадсадсд еасссасдад аададССсаа саССаассса ссаааасадс СсддадссаС СССаСССдаа
    СассддСдсС даадаадасд аааасаддсс асссдассСс ддсСдасдсд
    ССдсдссдса ссаСдаааСс дСсдааааса ССССдсасса ссдссадссс аассаасдса сассдаадда ссдссдааад ссдсдсдссс СдаСассддс сдасдсссаа ссаадсдссд асдсааассд ддсддсссад сСсддссдад аааасаССсс даССсддсСс даададдддс ддааааСссд ссаадсдССс адссддасСд дсссассссс дссдссдасс асссасааас сдаассдсдс асаСсдссда сдасдасааС сСааССдаад сдССссаасд сдаСССддаС ааасддсдас ддасассссс сасдсдадсд аададдаадс сасддссаас аддсаааддс сдсСаассСс ддсассдССС асддааССад сдассасдда асССдаасаС Сасдсдсааа даадссдссд аасссассда асдССасССс сдддсдСааа дсадСаСасд даааасаССд сдсаадаадс дааасадааа саасдссдСС дсаСсддсдс сдсСасссдс сСдасассас аадссдсааС дсадССССдс ададсддасд дссасдааса сдссаассса аддаадсдсс ссаааааадс даСдаССдас ссадсддсас ддесдааада ададсадсСС
    ССССдсСдса адсдсаСдас дадсСсаССС сддаадсдсс аааададдаа сасдсдадсс сдССссддаа дсдаСддадс аддссдссас дсСссдсдсд ссдассасса ссасддссса асасддсасд аСдссаааСа а
    780
    840
    900
    960
    1020
    1080
    1140
    1200
    1260
    1320
    1380
    1440
    1500
    1560
    1620
    1680
    1740
    1800
    1860
    1920
    1980
    2040
    2100
    2160
    2220
    2280
    2340
    2400
    2460
    2520
    2580
    2631 <210> 5 <211> 876 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
    <223> Аминокислотная последовательность ДНК-полимеразы I (ро!А) из ВасШив вСеагоСЪегторЬИиз <400> 5
    МеС Ьуз Ьуз Ьуз Ьеи Уа1 Ьеи Не Азр <31у Азп Зег Уа1 А1а Туг Агд 15 10 15
    А1а РЬе РЬе А1а Ьеи Рго Ьеи Ьеи Ηίε Аеп Азр Ьуе С1у 11е Н1з ТЬг 20 25 30
    Азп А1а Уа1 Туг <31у рЬе ТЬг МеС Мес Ьеи Азп Ьуз Не Ьеи А1а О1и 35 40 45
    С1и αΐη Рго ТЬг Ηίδ Ьеи Ьеи Уа1 А1а РЬе Азр А1а <31у Ьуз ТЬг ТЬг 50 55 60
    РЬе Агд Наз О1и ТЬг РЬе С31п С1и Туг Ьуз 61у О1у Агд С1п <31п ТЬг 65 70 75 80
    Рго Рго С1и Ьеи Зег О1и С1п РЬе Рго Ьеи Ьеи Агд С1и Ьеи Ьеи Ьуз 85 90 95
    А1а Туг Агд Не Рго А1а Туг <31и Ьеи Азр Ηίδ Туг О1и А1а Авр Азр ЮО 105 110
    Не Не О1у ТЬг Ьеи А1а А1а Агд А1а <31и <31п С1и С1у РЬе <31и Уа1 115 120 125
    Ьуз Не Не Зег С1у Азр Агд Азр Ьеи ТЬг С1п Ьеи А1а Зег Агд ΗΪ3 130 135 140
    Уа1 ТЬг Уа1 Азр Не ТЬг Ьуз Ьуз О1у Не ТЬг Азр 11е <31и Рго Туг 145 150 155 160
    ТЬг Рго О1и ТЬг Уа1 Агд С1и Ьуз Туг <31у Ьеи ТЬг Рго С1и <31п Не 165 170 175
    - 36 021069
    37 021069
    Не С1и Ьеи Агд 6 6 0 Уа1 Ьеи А1а ΗΪ3 Пе А1а Азр Азр Азр Азп Ьеи 11е 665 670 С1и А1а РЬе С1п Агд Азр Ьеи Азр Пе Ηϊ3 ТЬг Ьуз ТЬг А1а Мес Азр 675 680 685 11е РЬе Н1з Уа1 Зег <31и С1и <31и Уа1 ТЬг А1а Азп Мес Агд Агд <31п 690 695 700 А1а Ьуз А1а Уа1 Азп РЬе С1у Пе Уа1 Туг С1у Пе Зег Аер Туг С1у 705 710 715 720 Ьеи А1а <31п Аап Ьеи Азп Не ТЬг Агд ЬуЗ С1и А1а А1а О1и РЬе Пе 725 730 735 О1и Агд туг РЬе А1а Зег РЬе Рго С1у Уа1 Ьуз σΐη Туг Мес С1и Азп 740 74 5 750 11е Уа1 С1п С1и А1а Ьуз О1п Ьуз С1у Туг Уа1 ТЬг ТЬг Ьеи Ьеи Ηϊβ 755 760 765 Агд Агд Агд Туг Ьеи Рго Азр Не ТЬг Зег Агд Азп РЬе Азп Уа1 Агд 770 775 780 Зег РЬе А1а С1и Агд ТЬг А1а Мес Азп ТЬг Рго Пе С1п С1у Зег А1а 785 790 795 800 А1а Азр Пе Не Ьуз Ьуз А1а Мес Пе Авр Ьеи А1а А1а Агд Ьеи Ьуз 805 810 815 <31и О1и О1п Ьеи С1п А1а Агд Ьеи ьеи Ьеи С1п Уа1 ΗΪ3 Азр С1и Ьеи 820 825 830 11е Ьеи б1и А1а Рго Ьуе <31и <31и Пе <31и Агд Ьеи Суз <31и Ьеи Уа1 835 840 84 5 Рго С1и Уа1 МеС <ЗХи <31п А1а Уа1 ТЬг Ьеи Агд Уа1 Рго Ьеи Ьуз Уа1 850 855 660 Аер Туг Ηΐ§ Туг <31у Рго ТЬг Тгр Туг Азр А1а Ьуз 865 870 875 <21С )> ί <213 .> : 1563 <212 :> ДНК <213 ι> Искусственная последовательность
    <220>
    <223> Нуклеотидная последовательность протеломеразы фага ρ1ιίΗΑΡ-1 из На1отопа5 <400> 6
    асдадсддсд адСсасдСад аааддСсдаС ссадсддааС ЪдаСададСд дссдсссадс 60 дадаСсааад адаСсдасдс сдасдасдад асдссасдСа аададаааас саадсдсасд 120 дсдсддсСдд сасдСадсСС саааасдсдс сСдсаСдаСд асаадсдссд сааддаССсс 180 дадсддаСсд сддссасдас сссссдссдс Сасасдасад аадсдсдсаа ддсддСдасС 240 дсдсадаасс ддсдссаСса садсССсдас садсадаСсд адсддсСддс садссдсСас 300 ссддсССасд ссадсаадсС ддаадсдсСс ддсаадсСда ссдаСаСсад сдссаССсдС 360 аСддсссасс дсдадсСдсС сдассадаСс сдсаасдаСд асдасдсССа СдаддасаСс 420 сдддсдасда адссддасса СдаааСсасд сдссассСда сдссдадсСс Сдсасадааа 480 адсасдссдд седаададдс садсдадасд седдаададс дедеддсдаа сасддссдад 540 аСсаасСасс ассддССдаС ддадасддСС сасдадсСдс Сдадсаассд ддададаасд 600 дСсдаСдддд адСаСсдсдд сСССССсадС сассСадсдс ССдддсСддс дсСддссасс 660 дддсдСсдсС сдаСсдаддС дсСдаадасс ддасддаСса сдааддСддд сдадСаСдад 720 ссддадссса дсддссаддс дааааадсдс ддсддсдСсд ассасадсда ддсссассас 780 асССаСассс сддсдааадс СдасссддСд аСсдаадсдС дддасдадсс ссдсссдссд 840 ссддаадсСд сСдадсСдса дддсаСддас аасадсдаСд Сдаассдссд сасддсдаад 900 асдсссааса сдсСсасСаа дсддаСсссе аасаасдасд адсдсдсссс сааддасадс 960 сдддсдассе дддсдсддсС ддСдСССдад есдсассссс сдсдсдасаа дсдссддаад 1020 ааадссассд аддасдСдСС сСддсдсдад асдссддддс асдаддасаС ддасасасад 1080 сдсадссасс дсдссСССаа аассдассас дасдадссдд аСсаадссда ссаддаадаС 1140 сасдаасасд ссадссдссс сдссдсдсСд саддсдсСдд асддссасда дсадсссдад 1200 адсадсдасд сссаддсдсд СдСдсасдсс СдддСдааад сдсадассда дсаддадссс 1260 дасдсдаааа ССасдсадСс СсСдаСсадс сдддадссдд дсдсссассд сссСдссаса 1320 ааадсдсасс СддадсСддс дсдададдсд сссдасдсдс сдаасдссда сссддасаад 1380 дСсдсддсдд садсдссдаа ддаадсадсс даддсдаадс сссддсСдаа сдсссассса 1440 сааддддаСд дсаддсдддс сддддсддсС СсааСсаасд дддСддаадС СдсасдддСд 1500 ддсаассадд саддссддаС сдаадсдасд ааадсддссс асааадсддс дддсдддсдс 1560
    Сда 1563 <210> 7 <2Ы> 520 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
    <22Э> Аминокислотная последовательность протеломеразы фага рЫНАР-1 из На1отопаз <400> 7
    Мес Зег С1у СЬи Зег Агд Агд Ьуз УаЬ Азр Ьеи АЬа С1и Ьеи Не СЬи
    Тгр Ьеи Ьеи Зег О1и 11е Ьуз СЬи 11е Азр А1а Азр Азр С1и МеС Рго
    Агд Ьуз О1и Ьуз ТНг Ьуз Агд МеС А1а Агд Ьеи АЬа Агд Зег РЬе Ьуз
    ТЬг Агд Ьеи Шз Азр Азр Ьуз Агд Агд Ьуз Азр Зег СЬи Агд 11е А1а
    УаЬ ТЬг ТЬг РЬе Агд Агд Туг МеС ТЬг С1и А1а Агд Ьуз А1а УаЬ ТЬг
    А1а С1п Азп Тгр Агд Ηί3 Ηί3 Зег РЬе Азр СЬп СЬп 11е СЬи Агд Ьеи
    Ьеи ТЬг Азр 11е Зег АЬа 11е Агд МеС АЬа Шз Агд СЬи Ьеи Ьеи Азр 115 120 125
    СЬп 1Ье Агд Азп Азр Азр Азр АЬа Туг СЬи Азр 11е Агд АЬа Мес Ьуз 130 135 140
    Ьеи Азр НЬз СЬи 1Ье Мес Агд НЬз Ьеи ТЬг Ьеи Зег Зег АЬа СЬп Ьуз 145 150 155 160
    Зег ТЬг Ьеи АЬа СЬи СЬи АЬа Зег СЬи ТЬг Ьеи СЬи СЬи Агд АЬа УаЬ 165 170 175
    Азп ТЬг УаЬ СЬи 11е Азп Туг Шз Тгр Ьеи МеС СЬи ТЬг УаЬ Туг СЬи 180 185 190
    - 39 021069
    Ьеи С1у Уа1 Туг Агд Рго А1а Не Ьуз А1а Туг Ьеи <31и Ьеи А1а Агд 435 440 445
    С1и А1а Ьеи Азр А1а Рго Азп Уа1 Азр Ьеи Азр Ьуз Уа1 А1а А1а А1а 450 455 460
    Уа1 Рго Ьу5 О1и Уа1 А1а О1и А1а Ьуз Рго Агд Ьеи Азп А1а ΗΪ3 Рго 465 470 475 480
    С1п С1у Азр О1у Агд Тгр Уа1 01у Уа1 А1а Зег Не Азп С1у Уа1 О1и 485 490 495 <210> 8 <211> 1854 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <223 > Нуклеотидная последовательность протеломеразы фага ΡΥ54 из Уегз2П2а <400> 8 аСдааааСсс аССССсдсда СССадССадС ддСССадСса аададаСсда сдаааСадаа 60 аааСсадасс дддсдсаддд СдасаааасС сддсдссасс адддсдсддс садааадссс 120 аааааСдссд СдСССаСдда Сааасддааа СаСсдсддСа асддСаСдаа даасадааса 180 ссдССаасаа саСССааСаа аСаСССаадС сдадсасдСС сссддСССда адаааддсСС 240 сассаСадсс ССссСсаасс сасадсаасс аСсссаааСа аасасссСдс аССсадсдаа 300 асаасаааад асссддасаа садасссдсС саСдаадССа дааСаааасс сааадаасса 360 асаасСсаСс ССдааСссдд СдССааЬССа ССадаааааа СаддСадсСС адддааааса 420 ааассассса садссааааа аасадссадс ссаааааааа сдСасссаСс асдддссаас 480 даСссадаСа сСССааССад СасСдаадаС дсСасадаас Сасаасаааа дССададсаа 540 дддассдасс СасССаасдс аССасаССсС сСаааадСаа ассаСдаадС сасдСасдса 600 ссаасдасдс адссССссда сададссдса ССаааадсСа ддсасдасдс сдсссССсас 660 сссааааадс дсаасассдс асесассдас СассссддсС асасдсаасд аасдасддас 720 асассасаСс ССссадаСаС адсССССдаа даССсдаСдд сассасССдс сссСССадса 780 сссдссссад садссдссад сддссдсада сааассдааа сассааССас сддсдадссс 840 дасдссаааа аСаааадсаС саССаааССС СсСддасаад саааааааад ааСддссдСС 900 ссаддсддас ассасдааас асасадссса ассдасссад адссасссас ссаасддсса 960 дадСССССас дсСсссаСад сссаасасСС сдассасааа аСССддаааС адсасаСдаС 1020 даасассдса ссдаасСаСс сдссассаас ддссссдсад ссаааесссс аааСдаСдса 1080 дсаааасадС ссСССдСсда сдасадаада дСаСССааад аСасссдСдс аасссасдсс 1140 сдсасадсас асдааааасд дсссадааса дасссссдсс дддсдаадсд сдасдаадас 1200 дСССссССсС сСдааССаСС аддссаСдас дасссадаСа сСсадсСддс аСаСааасаа 1260
    ССсаадсСдд СаааСССсаа сссааааСдд асасссааСа СаСсадасда ааасссСсдд 1320 ссадссдсас сссаададсс сдасаасдас асдсссддсс садсасдсдд сдасдсддса 1380 дССсдсаСас асдадсдддс сааададсаа ссддсдсада ассссдсддс аааааСаасС 1440 дсаСассааа Ссаадааааа СССааасСдС сдаааСдасС Сддссадссд аСасаСддса 1500
    СддСдСдсСд асдсдсСадд ддССдССаСС ддСдаСдаСд дасаддсаад дссадаадаа 1560 сСсссассаС сдсСсдСдсС СдаСаССаас дсСдаСдаса сСдасдсСда адаадасдаа 1620 асададдаад асСССассда сдаддаааса дасдасассд ааССсдасдС аСсадаСаас 1680 дссадСдаСд аадаСаадсс сдаадасааа ссссдсСССд садсассааС ссдсадаадс 1740 даддассссс ддссдассаа асссдаассс дсСддсаадс ааСаСадсСд ддадддСааС 1800 дссдааадСд ссассдасдс дасдааасаа дсасддасСд аааасасдда дсаа 1854 <210> 9 <211> 617 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
    <223> Аминокислотная последовательность протеломераз! Уегзгпла
    МеС Ьуз Не ΗΪ3 РЬе Агд Азр Ьеи Уа1 Зег <31у Ьеи Уа1 Ьуз С1и 11е
    Авр <31и Не О1и. ьув Зег Авр Агд А1а 01η. <31у Азр Ьуз ТЬг Агд Агд
    Туг О1п <31у А1а А1а Агд Ьуз РЬе Ьуз Азп А1а 17а1 РЬе МеЬ Азр Ьуз
    Агд Ьуз Туг Агд <31у Азп С1у МеС Ьуз Азп Агд Не Зег Ьеи ТЬг ТЬг
    - 41 021069
    РЬе ТЬг Азр С1и СЬи 11е Азр Азр ТЬг СЬи РЬе Азр УаЬ Зег Азр Азп 545 550 555 560
    Ьуз СЬп Туг Зег Тгр СЬи СЬу Азп А1а СЬи Зег УаЬ Не Азр А1а МеС 595 600 605 <210> 10 <211> 1923 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
    <223> Нуклеотидная последовательность протеломераз, К1еЬв1е11а фага рЫК02 !
    <400>
    асдсдсаадд СдааааЪСдд СдадсСааСс ааССсдсССд СдадсдаддС сдаддсааСс даСдссссСд аСсдСссдса аддсдаСааа асдаадаааа ССааадссдс адсаССаааа еасаадаасд саССаСССаа сдасаааада аадссссдсд дсаааддссе адаааааада аСССсСдсса асасдССсаа сСсдСаСаСд адСсдддсаа ддаааадаСС сдаСдасада есдсассаса асСССдаааа даасдсаасс ааассассад ааааасассс сссасасадс даадаассас ссссдСддсс ссссасдссс дсддсаСсаа ссадасадса сасдссаада ссдсаадсса адсСаааада даСааСдсса ССддсадаад асССаСссаа СаСааадаСС ддСасааааа аСадсдаадС аааааСаааС ааасСсдсСа аСаааСаСсс СдааСддсаа
    ССсдсСаССа дсдасссааа садсдаадас СддааддаСа ааададаССа СсСССаСааа сСасСссаас ааддССсССс дсСсссддаа дасссдааса асссдааадс ааассасдад дсссСссасс аСсСдсадсС Садссссдсс дадсдаассс сСаСссадса дсдссдддсс аасдСссСса дсдадааааа дсдсаасдСС дссдСдассд асеаСссдсд сСаСаСдсад дссаСсСасд аСаСааСсаа саадссСаса дСССсдССсд аСССдасЬас СсдссдСддС асддссссдс СддсдССсдс ссССдссдсд сСаСссддСс дссдаасдаС СдаааСсасд сСссадддсд ааССССссдС сдсаддСааа саСасадСаа саССссСддд дсаадсСааа ааасдсСсдд аадасааадд СаСаСсаадд ааааСаСаСа ссССасдсда сдсСасСССа сссдссадсс СддСаааСда асССсдсСса Сдссссдссд ссдсддассс СдаСдаадСа асааааддас аСддсдаааа СдасасСсдс СсадааааСд ддсдсаССаа СдсааССсСс дсСасадссС ССааСссдСд ддСааааасС ССсССаддсд аСдассдссд сдсссасааа даСадссдсд ссасссасдс ссдсассдсс СасдаааСдС ссссссдсдС СдасссСсдд сддаадаасд ССдаСдадда сдСаССсССс аСддадаССс Ссддссасда сдаСдаааас асссаассдс асСаСаадса дСССаааССд дссаассссс ссадаасаСд дсдассааас дСсддсдадд адаасдсссд ссСадсддсд сСдсаааадс СддаСадсаС даСдссадаС
    СССдссаддд дсдасдссдд ддССсдСаСС саСдадассд СдаадсадсС ддсддадсад дасссассда еааааассас ааасадсасс ссдсдассдС ссаассссад сассаддссд аССссесдсС ассСддадСС Сдссдссдас дсассдддсс адССсдСсдд сдаааасддд саасддсаас СдааддаСда ддсдсссдса аСадСссСдс ССдаСдадда аасссссдад сссаСддасд асдСсдаСсС сдаСдасдаа аассасдасд асдааасдсс ддасдасдас дадаСсдаад Сддасдааад сдааддадад даасСддадд аадсдддсда сдссдаадад дссдаддсдд сСдаасадда ададаадсас ссСддсаадс сааасСССаа адсдссдадд дасаасддсд асддсассса саСддсддаа сссдаасссд дсддссдсса ссасдсссдд
    РссддСдссд ссддСааСсд ддсададдса асдсааСсСд ссСддадСдс ссассСсаад еда <210> 11 <211> 640 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
    <223> Аминокислотная последовательность протеломеразы фага рМК02 К1еЬз1е11а
    120
    180
    240
    300
    360
    420
    480
    540
    600
    660
    720
    780
    840
    900
    960
    1020
    1080
    1140
    1200
    1260
    1320
    1380
    1440
    1500
    1560
    1620
    1680
    1740
    1800
    1860
    1920
    1923
    МеС Агд Ьуз Уа1 Ьуз Не СЬу СЬи Ьеи Не Азп Зег Ьеи УаЬ Зег СЬи 15 10 15
    УаЬ СЬи АЬа Не Азр АЬа Зег Азр Агд Рго СЬп СЬу Азр Ьуз ТЬг Ьуз
    Ьуз Не Ьуз А1а АЬа АЬа Ьеи Ьуз Туг Ьуз Азп АЬа Ьеи РЬе Азп Азр <210> 12 <2Ы> 1617 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
    <223> Нуклеотидная последовательность протеломеразы фага УР882 из даддСдаааа ссассдасда саасдаддсд ассасссддс сСдаааааас саадссдасс 120 ассадддсдд сдасСаааес саадассаад сСдсасдасд асаадсдссд дааддасдсд 180 ассадаассд сСсСдадсас ссассдсаад Сасасдасаа сддссадддс адсадссасс 240 дадсадаасс ддааасасса садссссдад садсадаСад адсддссддс сааааадсас 300 ссдсаасасд ссдадсадсс ддсддссасс ддддссаедд асаасассас сдадССдсдс 360 ссддсдсаСс дсдассСссС даададсаСс ааддасаасд аСдаадссСС сдаддасасс 420 сдсадсасда адссадасса сдаддСаасд сдссаСссда сдссасссад сдсдсаааад 480 дсдадасСдд сададдаадс сдссдаддсд ССдассдада адаааассдс сасддСсдас 540 аСсаасСаСс асдадссдас ддссддсдСд дСддадсСдС сдассаадаа дассаадасд 600 дСсддсадсд асадсассСа садсССсадс сддссддсдс ССддсаССдд сссддссасс 660 ддСсдссдСС сСаСсдадас асСдаадсад ддсдадссса ааааддСдда Сдадсадсдд 720 сСсдадССсс сСддссаадс дааааадсдс ддсддсдссд ассасссада дасссасасс 780 аСССасассс СддСсдасСс сдассСддСа ссдасддсдс СдаадаассС дсдададССд 840 ссадаадССс дсдсасСдда СдадСасдас саасСдддсд адассаадсд даасдасдсс 900 ассаасааас дссдсдсааа аасдсссаас сааассдсса адсадссссс Сддсадсдас 960 дадсдсдсдС ссааадасад ссдсдссасс СдддсдсдСс сддсссасда дссдсссссс 1020 саасдСдаСс сдсдссддаа ааадааадас даддасдссс сссддсадда дасдссдддс 1080 сасдаддаса ссдадасСса дааадссСаС аадсааССса аддСсдасСа садсдаассС 1140 дадсадссдд сдсасаадсс СддсаааССС аададсадад ссдаадсссс сдсддсдссс 1200 дасСсааасд аддасаССас сасссдссса СссаСддсса адасссасда ссдддсдааа 1260 дадсдсассд сддаадассс сдаддсдаас ассасасадс сасСсаСсас ссдддаасСд 1320 ддсссаддсс дсааддсдас сааддасСас сСсдасссдд ссдасдаСдс ссССдссдсд 1380 дсдаасассс ссдСсдасда сдсадссдсс даддссссад сСдаСдСдсс ддсадсадаа 1440 ааасадссда адааадсдса даадсссада сСсдСддссс ассаддссда Сдасдадсас 1500 сдддаадссс дддсдсСддС ддааддсдад даддсддсса дддСдаааас саадддсасс 1560 сдсдссдадд сааСдасадс сдсасдддад дссадссааа аддсасСсда сдасСаа 1617 <210> 13 <211> 538 <212> БЕЛОК <213 > Искусственная последовательность <220>
    <223> Аминокислотная последовательность протеломеразы фага УР882 из УЬЬгЬо <400> 13
    МеС Зег <31у С1и Зег Агд СЬп Ьуз УаЬ Азп Ьеи СЬи СЬи Ьеи 11е Азп
    СЬи Ьеи УаЬ СЬи СЬи УаЬ Ьуз ТЬг Не Азр Азр Азп СЬи АЬа Не ТЬг
    Агд Зег СЬи Ьуз ТЬг Ьуз Ьеи Не ТЬг Агд АЬа АЬа ТЬг Ьуз РЬе Ьуз
    ТЬг Ьуз Ьеи НЬз Азр Азр Ьуз Агд Агд Ьуз Азр АЬа ТЬг Агд Не АЬа
    Ьеи Зег ТЬг Туг Агд Ьуз Туг Мес ТЬг МеС АЬа Агд АЬа АЬа УаЬ ТЬг
    - 44 021069
    65 70 75 80
    С1и С1п Азп Тгр Ьуз НЬз НЬз Зег Ьеи СЬи СЬп СЬп 11е СЬи Агд Ьеи 85 90 95
    АЬа Ьуз Ьуз НЬз Рго СЬп Туг АЬа СЬи СЬп Ьеи УаЬ АЬа Ые СЬу АЬа 100 105 110
    МеС Азр Азп 11е ТНг СЬи Ьеи Агд Ьеи АЬа НЬз Агд Азр Ьеи Ьеи Ьуз 115 120 125
    Зег 11е Ьуз Азр Азп Азр С1и А1а РЬе СЬи Азр 11е Агд Зег МеС Ьуз 130 135 140
    Ьеи Азр НЬз СЬи УаЬ МеС Агд НЬз Ьеи ТНг Ьеи Рго Зег АЬа СЬп Ьуз 145 150 155 160
    АЬа Агд Ьеи АЬа СЬи СЬи АЬа АЬа СЬи АЬа Ьеи ТНг СЬи Ьуз Ьуз ТНг 165 170 175
    АЬа ТНг УаЬ Азр 11е Азп Туг НЬз СЬи Ьеи МеС АЬа СЬу УаЬ УаЬ СЬи 180 185 190
    Ьеи Ьеи ТНг Ьуз Ьуз ТНг Ьуз ТНг УаЬ СЬу Зег Азр Зег ТНг Туг Зег 195 200 205
    РНе Зег Агд Ьеи А1а Ьеи С1у 11е С1у Ьеи АЬа ТНг СЬу Агд Агд Зег 210 215 220
    11е СЬи 11е Ьеи Ьуз СЬп СЬу СЬи РНе Ьуз Ьуз УаЬ Азр СЬи СЬп Агд 225 230 235 240
    Ьеи СЬи РНе Зег СЬу СЬп АЬа Ьуз Ьуз Агд СЬу СЬу АЬа Азр Туг Зег 245 250 255
    СЬи ТНг Туг ТНг 11е Туг ТНг Ьеи УаЬ Азр Зег Азр Ьеи УаЬ Ьеи МеС 260 265 270
    А1а Ьеи Ьуз Азп Ьеи Агд СЬи Ьеи Рго СЬи УаЬ Агд АЬа Ьеи Азр СЬи 275 280 285
    Туг Азр СЬп Ьеи СЬу СЬи 11е Ьуз Агд Азп Азр АЬа 11е Азп Ьуз Агд 290 295 300
    Суз АЬа Ьуз ТНг Ьеи Азп СЬп ТНг АЬа Ьуз СЬп РНе РЬе СЬу Зег Азр
    305 310 315 320
    СЬи Агд УаЬ РНе Ьуз Азр Зег Агд АЬа 11е Тгр АЬа Агд Ьеи АЬа Туг 325 330 335
    СЬи Ьеи РНе РНе СЬп Агд Азр Рго Агд Тгр Ьуз Ьуз Ьуз Азр СЬи Азр 340 345 350
    УаЬ РНе Тгр СЬп СЬи МеС Ьеи СЬу НЬз СЬи Азр 11е СЬи ТНг СЬп Ьуз 355 360 365
    АЬа Туг Ьуз СЬп РНе Ьуз УаЬ Азр Туг Зег СЬи Рго СЬи СЬп Рго УаЬ 370 375 380
    НЬз Ьуз Рго СЬу Ьуз РНе Ьуз Зег Агд АЬа СЬи АЬа Ьеи АЬа АЬа Ьеи 385 390 395 400
    Азр Зег Азп СЬи Азр 11е ТНг ТНг Агд Зег Зег МеС АЬа Ьуз 11е НЬз 405 410 415
    Азр Тгр УаЬ Ьуз СЬи Агд 11е АЬа СЬи Азр Рго СЬи АЬа Азп 11е ТНг 420 425 430
    СЬп Зег Ьеи 11е ТНг Агд С1и Ьеи СЬу Зег СЬу Агд Ьуз УаЬ Ые Ьуз 435 440 445
    Азр Туг Ьеи Азр Ьеи АЬа Азр Азр АЬа Ьеи АЬа УаЬ УаЬ Азп ТНг Рго 450 455 460
    УаЬ Азр Азр АЬа УаЬ УаЬ СЬи УаЬ Рго А1а Азр УаЬ Рго АЬа АЬа СЬи 465 470 475 480
    Ьуз СЬп Рго Ьуз Ьуз АЬа СЬп Ьуз Рго Агд Ьеи УаЬ АЬа Н1з СЬп УаЬ 485 490 495
    Азр Азр СЬи Ηίε Тгр СЬи АЬа Тгр А1а Ьеи УаЬ СЬи СЬу СЬи СЬи УаЬ 500 505 510
    АЬа Агд УаЬ Ьуз 11е Ьуз СЬу ТНг Агд УаЬ СЬи АЬа МеС ТНг АЬа АЬа 515 520 525
    Тгр СЬи АЬа Зег СЬп Ьуз АЬа Ьеи Азр Азр 530 535 <210> 14 <211> 4055 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
    <223> Нуклеотидная последовательность теломеразы (ΡβίΝ) и вторичного иммунного репрессора (сА) бактериофага N15 из ЕзсЛег/сЫа соН <400> 14 сасасдсасс асассасасс ссаассасдд аасасассад сасасаассд сссассасас 60 дсдсдСаСаа СддасСаССд СдсдссдаСа аддадаасаС аадсдсадаа саасасдсас 120 сСаССссддС дссдсдсссс СССдССаССс СдсСаССаСд ССсСсССаСа дсдсдасдаа 180 адсадсасаа ссаассдсса ессдсссссс дассдсдсса сдаСаСссад адаессадаа 240 асдддддаас сдддасдадс ааддсааааа Ссддсдадсс даСсаасасд сссдсдаасд 300 аддсададдс аассдасдсс ссадассдсс сасааддсда саааасдаад адаассааад 360 ссдсадссдс асддСаСаад аасдсдссас ссааСдаСаа аадааадССс сдСдддааад 420 дассдсадаа аадаасаасс дсдаасассс ССаасдссса сасдадсадд дсаадааадс 480 ддсссдасда сааассасас саСадсСССд асааааасас сааСаааССа СсддаааадС 540 асссСессса садсдаадаа ссасссссас ддсСССсСаС дссСасддсС ааСаССсдсс 600 адсасаСдСс аСсдССасаа Сссааассда аадаааСааС дссдсссдсс даададссас 660 саааСдСаад ааСаддсСсС аааддсадСд аСдсаааааС адсаадасСа аСаааааааС 720 асссадассд дадССССдсС сССадСдаСС СааасадСда СдаССддаад дадсдссдСд 780 асСаСсСССа саадссассс саасааддсС сСдсдССдсс адаадаасса сассадссса 840 аддссаасса сдаддссссд сассассСдс адссаадссс сдсддадсдС асаСсСаСас 900 адсаасдасд ддссдасдсь ссдсдсдада адаадедсаа сдссдсддсс ассдасСасс 960 саасасасаС дсадСсСаСс СаСдаСаССС сдаасаассс сдсдассССа СССадСССаа 1020 асасСсдССс сддаасддса сссссддсес ссдссссддс сдсддсасса дддсдаадаа 1080 сдассдадас аасдссссад ддсдааСССд ссдСССсадд ааадСаСасд дссаассссс 1140 садддсаадс саааааасдс сссдаадаСа ааадсдсаас садаасдасс саСасСССаС 1200 дсдаадсааа ассасссдсс дааССассаа садаассдсд ССсССдсСсС дссдсасссд 1260 ассссдасда ддССдССааа ддаСаСддаа аддаСдаСас ааддСсСдад аасддсадда 1320 сааасдссас СССадсаааа дсасссаасс сССдддССаа асоасссссс ддсдасдасс 1380 дСсдсдСССа СааадаСадс сдсдсСассс асдсСсдсаС сдсССаСдад асдссссссс 1440 дсдСсдаСсс асддсддааа аасдСсдасд аддасдсдСС сССсасддад аССсссддас 1500 асдасдасда даасасссад сСдсассаСа адсадсссаа дссддссаас ССсСссадаа 1560 сссддсдасс сдаадссддд дасдааааса ссаддссддС ддссссдсад аааседдасд 1620 аСдаааСдсс аддссссдсс ададдсдасд сСддсдсссд ссСссасдаа ассдССаадс 1680 адседдедда дсаддассса ссадсааааа Саассаасад сасссессдд дсссССаааС 1740
    ССадсссдас дасдассадс сддсасседд адсссдссдс сдасдсассд дддсадсссд 1800 ссддсдадаа сдддсадедд садседаада сададасасс сдсаассдсс ссдсссдасд 1860 аадаасссдС Сдадассаес дасдаассдд аСдаСдадСс ссаадасдас дадсСддаСд 1920 аадасдааас сдадсссдас дадддсддсд дсдасдаасс аассдаадад даадддссад 1980 аадаасаСса дссааседсе сбаааасссд СсССсаадсс сдсааааааС аасддддасд 2040 даасдсасаа дасададссс дааеасдасд дааадсасса сдсссддСсс ддссссдссд 2100 аСадсссеаС ддссдсааед сдасссдсае дддааасдСа ссасадсСаа аадаааадсс 2160 ассддедсса ассддсддсе сссссассда ддсседессс сасссасссс седсааддда 2220 сддааддаСС аддсддааас сдсадседса асСасддаса СсдссдСссс дасСдсаддд 2280 асссссссдс дсааадсддд дсссааассс дддседдсса ассссасссе СсСдсаассд 2340 ссддсдаСдс СадСССсдСд даСадсдССС ссадсССССс аасддссадс СсааааСдСд 2400 сСддсадсас сССссссаде сссдеассаа сассддсдас сддсадсссе ссасаадаса 2460 сассссддсд ассдссасда ассасассдс дсадсадсес ссдсесдеад асасдсаСдС 2520
    Сдсссададс сдСССсСдса дссдССааСа Сссддсдсас дСсддсдаед ассдссддда 2580 даСсасссас ддссассддд сссддсдасд ддсссссдса ддсдсддсдд ададссаесс 2640 адасдссдсс аасссаСдсд ссасддсаес даааасСССд СдсСаСдСсд СССаСсаддс 2700 ссдаадССсС есСССсСдсс дссадсссад СддССсассд дсдССсССад дсСсаддсСс 2760 дасаааадса СасСсдссдс ССССссддаС адсСддсада ассСсдССсд СсасссасСС 2820 дсддаассдс саддсСдСсд ссссссдссс сассдсдСсд сддсадсдда ддаССаСддС 2880 дСададасса даеессдаСа ссасаСССас сссссСддсс аСссдаСсаа дСССССдСдс 2940 сссддссааа ссдадддсса ассссссасс аСдаСссадс ССасдсааСд саСсадаадд 3000 дседдсСаСа сссааСдсад сасадасасс садсдссаса аассасдддс сассассдас 3060 аадаассасс сдсасадддс ддссссссед ааасдаааад асддададад ссССсаССдс 3120 дсссссссдд ассссадсСд сСсадааадд дасадддадс адссдсдадс ССсссдсдсд 3180 адсссдсдсд сдассСдсад аадССссдса дсССсссдса ааСасадсдС ддссСсаСаа 3240 сСддадаСад СдсддСдадс ададсссаса адсдссссаа ссСдсадсад дсдССссСса 3300 ассдссссса дсаддссссд ддсдсссаас сдаасссддс есасдсдасс ассссдсСда 3360
    - 46 021069 ссдддаСасд ддссдасада асдаддасаа аасддссддс даассддсда сдадсССссс дсссддасда сдсаасддсд даааддсддс ддаСаСддда ссссссдссс дсдсддасда садссдсааа СССдааСССд аасасддсас дсассссСаС сссдсасадд дСдсСассас сададССдад ааСсСсСаСа ддддсддсад сссадасадд дССсСсааса ссддСасаад аадааассдд сссаассдаа дССддсссса ссСдадссас саСаасссад дСаСдсдсад асссаасаса саааааааса сдсСддсдсд СдССдСдсдс ССсССдСсаС Ссддддссда даддсссддс СдсадаСССС дссдсадсдд ддсаасссса ссдссааадс адаасдсасд
    СсааСааССС аддСддаСаС СССассссдС дассадСсас дсдсасаддс дсссссаСад сссдссссас Сдассдасса даасссдасс адссассдда дСссддсааС сССаССдасд ассдсадсса ссссадасдс сдссСсааас сссасасддс сасдаасдад ссасСддаас ддаасадсса дсаддСасад сддаасдаас сасааасддС Ссадасдссд ссадаасдСс дсассасдас дССссаСсса ССсддсаССд ссдас <210> 15 <211> 631 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
    <223> Аминокислотная последовательность теломеразы бактериофага N15 Е5сЬег1сЫа соН <400> 15
    Мес Зег Ьуз Уа1 Ьуз 11е С1у СЬи Ьеи 11е Азп ТЪг Ьеи Уа1 Азп С1и 15 10 15
    УаЬ СЬи АЬа 11е Азр А1а Зег Азр Агд Рго <31п СЬу Азр Ьуз ТНг Ьуз 20 25 30
    Агд 11е Ьуз А1а А1а АХа А1а Агд Туг Ьуз Авп А1а Ьеи РЬе Азп Азр 35 40 45
    Ьуз Агд Ьуз РЬе Агд СЬу Ьуз СЬу Ьеи СЬп Ьуз Агд 1Ье ТЬг АЬа Азп 50 55 60
    ТЬг РЬе Авп АЬа Туг МеС Зег Агд АЬа Агд Ьуз Агд РЬе Азр Азр Ьуз 65 70 75 80
    Ьеи ΗΪ3 НЬз Зег РЬе Азр Ьуз Азп 1Ье Азп Ьуз Ьеи Зег СЬи Ьуз Туг 85 90 95
    Рго ьеи Туг зег С1и С1и ьеи зег Зег тгр ьеи зег мес Рго тьг ЬОО 105 110
    Азп 11е Агд <31п Нхз МеС Зег Зег Ьеи ОЬп Зег Ьуз Ьеи Ьуз СЬи 115 120 125
    МеС Рго Ьеи А1а С1и С1и Ьеи Зег Азп УаЬ Агд 11е СЬу Зег Ьуз 130 135 140
    Зег Адр А1а Ьуз 11е А1а Агд Ьеи 11е Ьуз Ьуз Туг Рго Авр Тгр 145 150 155
    РЬе АЬа Ьеи Зег Азр Ьеи Азп Зег Азр Азр Тгр Ьуз СЬи Агд Агд
    165 170 175
    Туг Ьеи Туг Ьуз Ьеи РЬе СЬп С1п СЬу Зег АЬа Ьеи Ьеи СЬи СЬи
    180 185 190
    Нхз С1п Ьеи Ьуз Уа1 Азп Нхз СЬи Уа1 Ьеи Туг Нхз Ьеи СЬп Ьеи 195 200 205
    Рго А1а СЬи Агд ТЪг Зег Не С1п <31п Агд Тгр А1а Азр УаЬ Ьеи 210 215 220 <31и Ьуз Ьуз Агд Азп Уа1 УаЬ Уа1 11е Азр Туг Рго ТЪг Туг Мес 225 230 235
    Зег 11е Туг Азр Г1е Ьеи Азп Азп Рго А1а ТЪг Ьеи РЬе Зег Ьеи 245 250 255
    ТЬг Агд Зег СЬу МеС АЬа Рго Ьеи А1а РЬе АЬа Ьеи АЬа АЬа Уа1
    260 265 270
    СЬу Агд Агд Мес Не СЬи Не Мес РЬе СЬп СЬу С1и РЬе АЬа УаЬ 275 280 285
    СЬу Ьуз Туг ТЬг УаЬ Азп РЬе Зег СЬу С1п А1а Ьуз Ьуз Агд Зег
    290 295 300
    Азр Ьуз Зег Уа1 ТЬг Агд ТЬг Не Туг тЬг Ьеи Суз СЬи А1а Ьуз 305 310 315
    РЬе ν«ι1 <31и Ьеи Ьеи ТЬг СЬи ьеи Агд Зег Суз Зег АЬа АЬа Зег 325 330 335
    3420
    3480
    3540
    3600
    3660
    3720
    3780
    3840
    3900
    3960
    4020
    4055
    АЬа
    11е
    СЬу
    Зег
    160
    Азр
    Ьеи
    Зег
    Агд
    ОЬп
    240
    Азп
    Зег зег
    СЬи
    Ьеи
    320
    Азр
    - 47 021069
    РЬе Азр Ии Уа1 Уа1 Ьуз С1у Туг <31у Ьуз Азр Азр ТЬг Агд Зег О1и 340 345 350
    Азп Иу Агд Не Азп А1а Не Ьеи А1а ьуз АЛа РЬе Азп Рго Тгр Уа1 355 360 365
    Ьуз Зег РЬе РЬе С1у Азр Азр Агд Агд Уа1 Туг Ьуз Азр Зег Агд А1а 370 375 360
    11е Туг А1а Агд Не А1а Туг Пи МеС РЬе РЬе Агд Уа1 Азр Рго Агд 385 390 395 400
    Тгр Ьуз Аеп Уа1 Азр СЬи Азр Уа1 РЬе РЬе МеС 01и Не Ьеи О1у Кхэ 405 410 415
    Аер Азр (31и Азп ТЬг Ип Ьеи ΗΪ3 Туг Ьуз С1п РЬе Ьуз Ьеи А1а Азп 420 425 430
    РЬе Зег Агд ТЬг Тгр Агд Рго СЯи Уа1 О1у Азр С1и Азп ТЬг Агд Ьеи 435 440 445
    Уа1 А1а Ьеи Нп Ьуз Ьеи Азр Азр С1и Мес Рго С1у РЬе А1а Агд С1у 450 455 460
    Авр А1а Ну Уа1 Агд Ьеи Нхз С1и ТЬг Уа1 Ьуз Ип Ьеи Уа1 С1и С1п 465 470 475 480
    Азр Рго Зег А1а Ьуз Не ТЬг Азп Зег ТЬг Ьеи Агд А1а РЬе Ьув РЬе 485 490 495
    Зег Рго ТЬг МеС Не Зег Агд Туг ьеи С1и РЬе А1а А1а Азр А1а Ьеи
    500 505 510
    СЯу Пп РЬе Уа1 СЯу Ии Азп О1у С1п Тгр С1п Ьеи Ьуз Не С1и ТЬг 515 520 525
    Рго А1а Пе Уа1 Ьеи Рго Азр Ни С1и Зег Уа! С1и ТЬг 11е Азр Ни 530 535 540
    Рго Азр Азр Ии Зег Ип Азр Азр Ии Ьеи Азр Пи Азр Ии Пе Ии 545 550 555 560
    Ьеи Азр Ии Иу Иу Иу Азр Ии Рго ТЬг Ни Ии Ии Иу Рго Ии 565 570 575
    С1и Нхв С1п Рго ТЬг А1а Ьеи Ьуз Рго Уа1 РЬе Ьуз Рго А1а Ьуз Азп 580 585 590
    Азп Иу Азр С1у ТЬг Туг Ьуз 11е С1и РЬе 01и Туг Азр СЯу Ьуз Ηίδ 595 600 605
    Туг А1а Тгр Зег Иу Рго А1а Азр Зег Рго МеС А1а А1а МеС Агд Зег
    610 615 620
    А1а Тгр С1и ТЬг Туг Туг Зег <210> 16 <211> 22 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
    <223> 22-нуклеотидная консенсусная последовательность совершенного инвертированного повтора из мезофильного бактериофага <220>
    <221> прочие признаки <222> (1)..(1) <223> η представляет собой а, с, д или С <220>
    <221> прочие признаки <222> (5)..(6) <223> η представляет собой а, с, д или с <220>
    <221> прочие признаки <222> (9)..(10) <223> η представляет собой а, с, д или С <220>
    <221> прочие признаки <222> (13)..(14) <223> п представляет собой а, с, д или С <220>
    <221> прочие признаки <222> (17)..(18) <223> п представляет собой а, с, д или с <220>
    <221> прочие признаки <222> (22) . . (22) <223> η представляет собой а, с, д или С <400> 16 псаСппсапп сдппСаппаС дп <210> 17 <211> 22 <212> ДНК <213> Искусе 'венная последовательн <220>
    <223> Особенно предпочтительная последовательность совершенного инвертированного повтора для использования с протеломеразами фага N15 из ЕзсЪеггсЫа соН и фага РЫ КО2 из К1еЪз1е11а <210>
    <211>
    <212>
    <213>
    Особенно предпочтительная последовательность совершенного инвертированного повтора для использования с протеломеразой фага ΡΥ54 из Уег52П2а <400> 18 дсабасбасд сдсдбадбаб дс <210> 19 <211> 22 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <223> Особенно предпочтительная последовательность совершенного инвертированного повтора для использования с протеломеразой фага ρΚίΗΑΡ-1 из На1отопаз <400> 19 ссабасбаба едбабадбаб дд <210> 20 <211> 22 <212> ДНК <213> Искусственная последовательност
    Особенно предпочтительная последовательность совершенного инвертированного повтора для использования с протеломеразо: фага УР882 из νίύΓίο <400> 20 дсабасбаба едбабадбаб дс <220>
    <223 > Особенно предпочтительная последовательность совершенного инвертированного повтора для использования с протеломеразой из ВоггеНа Ьигд0ог£ег1 <210> 22 <211> 24 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность
    Особенно предпочтительная последовательность совершенного инвертированного повтора для использования с протеломераз' фага νρθ82 из УхЬгго <210> 23 <211> 42 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
    <223> Особенно предпочтительная последовательность совершенного инвертированного повтора для использования с протеломеразой фага ΡΥ54 из УегзтЫа <400> 23 ассбабсбса дсабасбасд сдсдбадбаб дсбдааабад дб <210> 24 <211> 90 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
    <223> Особенно предпочтительная последовательность совершенного инвертированного повтора для использования с протеломеразой фага рЫНАР-1 из На1отопав <400> 24 ссбабаббдд дссассбабд бабдсасадб бсдсссабас бабаедбаба дбабдддсда асбдбдсаба сабаддбддс ссаабабадд
    - 49 021069 <210> 25 <211> 56 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
    <223> Особенно предпочтительная последовательность-мишень протеломеразы <400> 25 бабсадсаса сааббдссса ббабасдсдс дбабаабдда сбаббдбдбд сбдаба 5ι <210> 26 <211> 42 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
    <223 > Особенно предпочтите.
    последовательность-мишень протеломеразы абдсдсдсаб ссаббабасд сдсдбабааб ддсдабааба са 4:
    <210> 27 <211> 52 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
    <223> Особенно предпочтительная последовательность-мишень протеломеразы <400> 27 бадбсассба бббсадсаба сбасдсдсдб адбабдсбда аабаддббас Од 5;
    ДНК
    Искусственная
    Особенно прелпочтитель последовательность : последовательность-мишень протеломераз!
    дддабсссдб сссабасаба сабдбабсса бдбддсабас бабасдбаба дбабдссдаб дббасабабд дбабсаббсд ддабсссдбб <210> 29 <211> 38 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
    <223> Особенно предпочтительная последовательность-мишень протеломеразы <400> 29 басбааабаа абаббабаба бабааббббб баббадба
    - 50 021069 <223> Зас рСЬ <400> 34 дСдсаадСдс аддСдссада ас 22 <210> 35 <211> 27 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
    <223> Ваш рОЬ <400> 35 даСааадаад асадСсаСаа дСдсддс 27 <210> 36 <211> 56 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
    <223> Последовательность, комплементарная ЗЕф 10 N0: 25 <400> 36
    СаСсадсаса сааСадСсса ССасасдсдс дсасаасддд саассдсдсд сСдаСа 56 <210> 37 <211> 56 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
    <223> Се1К <400> 37
    СаСсадсаса сааССдссса ССасасдсдс дсасаасддд саассдсдсд сСдаСа 56 <210> 38 <211> 56 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
    <223> Се1Ь <400> 38 саСсадсаса сааСадСсса ССасасдсдс дсасаасдда есассдсдсд седаСа 56 <210> 39 <211> 42 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
    <223> Последовательность, комплементарная ЗЕО Ю N0: 26 <400> 39
    СдСаЬСаСсд ссаССаСасд сдсдСаСааС ддаСдсдсдс аС 42 <210> 40 <211> 52 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
    <223> Последовательность, комплементарная ЗЕ(2 Ю N0: 27 <400> 40 садСаассса ссссадсаса сСасдсдсдС адсасдссда аатаддСдас Са 52 <210> 41 <211> 90 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
    <223> Последовательность, комплементарная 5Е0 Ю N0: 28 <400> 41 аасдддассс сдааСдаСас сасасдсаас аСсддсаСас сасасдсаса дСаСдссаса 60
    СддасасаСд СаСдСаСдда асдддасссс эо <210> 42 <2ΐι> за <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
    <223> Последовательность, комплементарная ЗЕф ю N0: 29 <400> 42 сассаасааа ааассасаса сасаасассс асссадса 38
EA201101141A 2009-01-30 2010-02-01 Получение закрытой линейной днк EA021069B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB0901593.4A GB0901593D0 (en) 2009-01-30 2009-01-30 Production of closed linear DNA
PCT/GB2010/000165 WO2010086626A1 (en) 2009-01-30 2010-02-01 Production of closed linear dna

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201101141A1 EA201101141A1 (ru) 2012-05-30
EA021069B1 true EA021069B1 (ru) 2015-03-31

Family

ID=40469378

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201101141A EA021069B1 (ru) 2009-01-30 2010-02-01 Получение закрытой линейной днк

Country Status (19)

Country Link
US (4) US9109250B2 (ru)
EP (3) EP3150722B1 (ru)
JP (2) JP2012516147A (ru)
KR (1) KR101926662B1 (ru)
CN (2) CN102301010B (ru)
AU (1) AU2010209532B2 (ru)
BR (1) BRPI1005683B1 (ru)
CA (1) CA2751130C (ru)
DK (2) DK3150722T3 (ru)
EA (1) EA021069B1 (ru)
ES (2) ES2749629T3 (ru)
GB (1) GB0901593D0 (ru)
IL (1) IL213930A (ru)
LT (1) LT3150722T (ru)
MX (1) MX2011007937A (ru)
NZ (1) NZ594004A (ru)
SG (1) SG173102A1 (ru)
WO (1) WO2010086626A1 (ru)
ZA (1) ZA201105013B (ru)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2616279C1 (ru) * 2015-12-28 2017-04-13 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук (ИБГ УНЦ РАН) Способ получения маркерных лестниц для гель-электрофоретического определения размеров фрагментов нуклеиновых кислот
WO2017060650A1 (fr) 2015-10-08 2017-04-13 Jean-Marc Limacher Composition anti-tumorale
WO2025190971A1 (fr) 2024-03-13 2025-09-18 Odimma Therapeutics Vecteur non-viral pour transcription augmentee

Families Citing this family (68)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2351294B8 (es) * 2009-07-02 2012-06-06 Consejo Superior De Investigaciones Científicas (Csic) Metodo para la replicación, amplificación, o secuenciación de un adn molde.
GB201013153D0 (en) * 2010-08-04 2010-09-22 Touchlight Genetics Ltd Primer for production of closed linear DNA
US9290800B2 (en) 2013-03-15 2016-03-22 Pacific Biosciences Of California, Inc. Targeted rolling circle amplification
GB201502645D0 (en) 2015-02-17 2015-04-01 Touchlight Genetics Ltd Method
CN108778308A (zh) 2015-12-22 2018-11-09 库瑞瓦格股份公司 生产rna分子组合物的方法
US10077459B2 (en) 2016-05-04 2018-09-18 General Electric Company Cell-free protein expression using rolling circle amplification product
EP3763823A1 (en) 2016-08-16 2021-01-13 Touchlight IP Limited Closed linear dna production
WO2019118806A1 (en) * 2017-12-14 2019-06-20 Solid Biosciences Inc. Non-viral production and delivery of genes
GB201721846D0 (en) * 2017-12-22 2018-02-07 Arecor Ltd Novel composition
CN109971825B (zh) * 2017-12-28 2020-11-10 南京金斯瑞生物科技有限公司 快速制备桑格测序模板的方法
GB201805683D0 (en) * 2018-04-05 2018-05-23 Touchlight Ip Ltd Reprogramming vectors
AU2019290228A1 (en) * 2018-06-22 2021-01-28 AskBio Inc. Vectors for gene delivery that persist within cells
US12297446B2 (en) 2018-11-02 2025-05-13 Nikegen Limited Recombinant parvoviral vectors and method of making and use thereof
GB201905651D0 (en) * 2019-04-24 2019-06-05 Lightbio Ltd Nucleic acid constructs and methods for their manufacture
WO2020254876A1 (en) 2019-06-18 2020-12-24 Janssen Sciences Ireland Unlimited Company Virus-like particle delivery of hepatitis b virus (hbv) vaccines
CA3143634A1 (en) 2019-06-18 2020-12-24 Janssen Sciences Ireland Unlimited Company Combination of hepatitis b virus (hbv) vaccines and anti-pd-1 antibody
CA3143679A1 (en) 2019-06-18 2020-12-24 Janssen Sciences Ireland Unlimited Company Combination of hepatitis b virus (hbv) vaccines and hbv-targeting rnai
EP3986915A1 (en) 2019-06-18 2022-04-27 Janssen Sciences Ireland Unlimited Company Recombinant interleukin 12 construct and uses thereof
EP3986454A1 (en) 2019-06-18 2022-04-27 Janssen Sciences Ireland Unlimited Company Combination of hepatitis b virus (hbv) vaccines and anti-pd-1 or anti-pd-l1 antibody
WO2020255010A1 (en) 2019-06-18 2020-12-24 Janssen Sciences Ireland Unlimited Company Combination of recombinant interleukin 12 construct and hepatitis b virus (hbv) vaccines
US20220305117A1 (en) 2019-06-18 2022-09-29 Janssen Sciences Ireland Unlimited Company Combination of hepatitis b virus (hbv) vaccines and hbv-targeting rnai
EP3986563A1 (en) 2019-06-20 2022-04-27 Janssen Sciences Ireland Unlimited Company Lipid nanoparticle or liposome delivery of hepatitis b virus (hbv) vaccines
US20220305118A1 (en) 2019-06-20 2022-09-29 Janssen Sciences Ireland Unlimited Company Carbohydrate nanocarrier delivery of hepatitis b virus (hbv) vaccines
EP3792367A1 (en) 2019-09-11 2021-03-17 Universität Bielefeld Method for the production of raav and method for the in vitro generation of genetically engineered, linear, single-stranded nucleic acid fragments containing itr sequences flanking a gene of interest
GB2700048B (en) 2019-09-18 2026-03-04 Aldevron Llc synthetic dna vectors and method of use
GB201915163D0 (en) 2019-10-18 2019-12-04 Univ Southampton Cancer vaccine
EP4077661A1 (en) 2019-12-20 2022-10-26 Keygene N.V. Ngs library preparation using covalently closed nucleic acid molecule ends
EP4090750A4 (en) * 2020-01-17 2024-03-13 Asklepios Biopharmaceutical, Inc. RECOMBINANT AAV PRODUCTION
KR20220134001A (ko) * 2020-01-31 2022-10-05 타이리스 테라뷰틱스, 에스.엘. 닫힌 선형 dna의 제조방법
IL296024A (en) 2020-03-04 2022-10-01 Flagship Pioneering Innovations Vi Llc Methods and compositions for modulating a genome
GB202007428D0 (en) 2020-05-19 2020-07-01 Fabricnano Ltd Polynucleotide synthesis
WO2021252354A1 (en) 2020-06-12 2021-12-16 University Of Rochester ENCODING AND EXPRESSION OF ACE-tRNAs
CA3189358A1 (en) 2020-08-26 2022-03-03 Scancell Limited Nucleic acids encoding a polypeptide comprising a modified fc region of a human igg1 and at least one heterologous antigen
US20230407366A1 (en) 2020-10-06 2023-12-21 Keygene N.V. Targeted sequence addition
EP4317424A4 (en) 2021-03-29 2025-10-22 Kaneka Corp VECTOR, METHOD FOR PREPARING COVALENTLY BONDED CLOSED LINEAR DNA USING SAME, METHOD FOR PREPARING PARVOVIRAL VECTOR, AND PARVOVIRAL VECTOR PRODUCTION CELL
JP2024520797A (ja) 2021-06-08 2024-05-24 タッチライト・アイピー・リミテッド レンチウイルスベクター
GB202108176D0 (en) 2021-06-08 2021-07-21 Touchlight Ip Ltd Vector
WO2022272296A2 (en) 2021-06-25 2022-12-29 Homology Medicines, Inc. Adeno-associated virus packaging systems
WO2023285976A1 (en) 2021-07-13 2023-01-19 Stonehaven Incubate AG Composition and uses thereof
ES2947031T6 (ru) * 2021-07-30 2023-08-02
JP2024533311A (ja) 2021-09-08 2024-09-12 フラッグシップ パイオニアリング イノベーションズ シックス，エルエルシー ゲノムを調節するための方法及び組成物
GB202114105D0 (en) 2021-10-01 2021-11-17 Fabricnano Ltd Nucleotide synthesis
WO2023069948A1 (en) 2021-10-18 2023-04-27 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Dna compositions and related methods
WO2023114901A2 (en) 2021-12-15 2023-06-22 Oxford Biomedica Solutions Llc Methods and compositions for the production of adeno-associated virus
MX2024007755A (es) * 2021-12-23 2024-07-01 Generation Bio Co Sintesis escalable y de alta pureza libre de celulas de vectores de adn de extremo cerrado.
CN114561372B (zh) * 2022-04-27 2022-07-26 南京巨匠生物科技有限公司 Bst DNA聚合酶突变体及其应用和产品、基因、重组质粒和基因工程菌
EP4293101A1 (en) 2022-06-14 2023-12-20 Asklepios Biopharmaceutical, Inc. Reactor with temperature control and method of using the same
CN119698477A (zh) 2022-08-10 2025-03-25 镇江蓬勃生物科技有限公司 线性闭合dna的制备方法及该方法所用质粒
CA3263806A1 (en) 2022-08-16 2024-02-22 Aldevron, L.L.C. CELLULAR PROCESS FOR THE PRODUCTION OF SYNTHETIC CIRCULAR NUCLEIC ACID
EP4589008A1 (en) 2022-09-12 2025-07-23 Kaneka Corporation Double stranded circular dna vector, method for producing linear covalently closed dna, and fusion polypeptide containing protelomerase and endonuclease
AU2023352042A1 (en) 2022-09-29 2025-04-10 Ceva Hampton Limited Vaccine construct and uses thereof
EP4365303A1 (en) 2022-11-02 2024-05-08 4basebio, S.L.U. Purification of linear dna products
EP4612320A1 (en) 2022-11-02 2025-09-10 4basebio UK Ltd Purification of linear dna products
KR102753513B1 (ko) * 2022-11-18 2025-01-13 최낙식 Direct RNA 추출 버퍼 및 이의 용도
WO2024121354A1 (en) 2022-12-08 2024-06-13 Keygene N.V. Duplex sequencing with covalently closed dna ends
EP4638776A1 (en) 2022-12-19 2025-10-29 Thermo Fisher Scientific GENEART GmbH Retrieval of sequence-verified nucleic acid molecules
EP4410995A1 (en) 2023-02-01 2024-08-07 4basebio, S.L.U. Linear dna with enhanced resistance against exonucleases and methods for the production thereof
EP4410992B1 (en) 2023-02-01 2025-12-17 4basebio UK Ltd Linear dna with enhanced resistance against exonucleases and methods for the production thereof
WO2024197081A1 (en) 2023-03-20 2024-09-26 Hc Bioscience, Inc. Minimally-sized dna threads for trna therapy
CN116606834A (zh) * 2023-04-10 2023-08-18 天津中合基因科技有限公司 多种具有切割连接活性的原端酶及其应用
CN121241060A (zh) 2023-04-18 2025-12-30 优尼科生物制药有限公司 昆虫细胞的腺相关病毒衣壳文库的产生
WO2024256842A1 (en) 2023-06-16 2024-12-19 Touchlight IP Limited Therapeutic transfection
US11981936B1 (en) 2023-09-29 2024-05-14 New England Biolabs, Inc. TelA variants, compositions, and methods
EP4553156A1 (en) 2023-11-08 2025-05-14 4basebio UK Ltd Synthetic dna production using cas nuclease
GB202319998D0 (en) 2023-12-22 2024-02-07 Touchlight Ip Ltd duplexing method
EP4596713A1 (en) 2024-02-05 2025-08-06 4basebio UK Ltd Dna with enhanced resistance against exonucleases and methods for the production thereof
WO2025194042A1 (en) 2024-03-14 2025-09-18 Affinia Therapeutics Inc. Plasmid system for production of recombinant adenoassociated virus
WO2025202929A1 (en) * 2024-03-29 2025-10-02 Pfizer Inc. Methods for producing nucleic acids

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001004280A2 (de) * 1999-07-08 2001-01-18 Mologen Forschungs-, Entwicklungs- Und Vertriebs Gmbh Impfstoff gegen infektionen mit lentiviren, wie dem felinen immunschwäche-virus der katze
WO2004028562A2 (de) * 2002-09-23 2004-04-08 Mologen Ag Impfstoff gegen infektionen mit onkoviren, wie dem felinen leukosevirus der katze

Family Cites Families (42)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
CA2087256A1 (en) 1990-07-25 1992-01-26 Jerry L. Ruth Circular extension for generating multiple nucleic acid complements
FR2675803B1 (fr) 1991-04-25 1996-09-06 Genset Sa Oligonucleotides fermes, antisens et sens et leurs applications.
US6953676B1 (en) 1992-05-01 2005-10-11 Trustees Of The University Of Pennsylvania Mesoscale polynucleotide amplification device and method
WO1994003624A1 (en) 1992-08-04 1994-02-17 Auerbach Jeffrey I Methods for the isothermal amplification of nucleic acid molecules
US5714320A (en) 1993-04-15 1998-02-03 University Of Rochester Rolling circle synthesis of oligonucleotides and amplification of select randomized circular oligonucleotides
DE69429038T2 (de) 1993-07-28 2002-03-21 Pe Corporation (Ny), Norwalk Vorrichtung und Verfahren zur Nukleinsäurevervielfältigung
FR2732971B1 (fr) 1995-04-13 1997-07-04 Genset Sa Oligonucleotide sens inhibiteur de virus herpes simplex (hsv) a structure en haltere
US5856174A (en) 1995-06-29 1999-01-05 Affymetrix, Inc. Integrated nucleic acid diagnostic device
WO1997019193A2 (en) 1995-11-21 1997-05-29 Yale University Unimolecular segment amplification and detection
DE19648625A1 (de) 1996-11-13 1998-05-14 Soft Gene Gmbh Mikroprojektil für das Einbringen von Substanzen in Zellen durch ballistischen Transfer
JPH10234399A (ja) 1997-02-28 1998-09-08 Shinkinrui Kinou Kaihatsu Kenkyusho:Kk ピシウム属菌検出用の核酸配列
US6124120A (en) 1997-10-08 2000-09-26 Yale University Multiple displacement amplification
US6054274A (en) * 1997-11-12 2000-04-25 Hewlett-Packard Company Method of amplifying the signal of target nucleic acid sequence analyte
DK1179585T3 (da) 1997-12-24 2008-11-10 Cepheid Indretning og fremgangsmåde til lysis
ATE346158T1 (de) 1998-01-09 2006-12-15 Univ Utah Res Found Verfahren zur in vitro amplifikation zirkulärer dna
DE19826758C1 (de) 1998-06-15 1999-10-21 Soft Gene Gmbh Darstellung von linearen kovalent geschlossenen DNA-Molekülen als Expressionskonstrukte
AU770993B2 (en) 1998-09-15 2004-03-11 Yale University Molecular cloning using rolling circle amplification
AU2001250572A1 (en) 2000-04-07 2001-10-23 Epigenomics Ag Detection of single nucleotide polymorphisms (snp's) and cytosine-methylations
GB0018120D0 (en) 2000-07-24 2000-09-13 Fermentas Ab Nuclease
US6977148B2 (en) 2001-10-15 2005-12-20 Qiagen Gmbh Multiple displacement amplification
US20030077611A1 (en) 2001-10-24 2003-04-24 Sention Methods and systems for dynamic gene expression profiling
CA2412187A1 (en) 2001-12-21 2003-06-21 University Of Western Ontario Assay for identifying modulators of borrelia telomere resolvase
US7081339B2 (en) 2002-04-12 2006-07-25 Primera Biosystems, Inc. Methods for variation detection
CA2492203A1 (en) 2002-07-12 2004-01-22 Affymetrix, Inc. Synthetic tag genes
US20040022764A1 (en) 2002-07-31 2004-02-05 Hanan Polansky Inhibition of microcompetition with a foreign polynucleotide as treatment of chronic disease
US7955795B2 (en) 2003-06-06 2011-06-07 Qiagen Gmbh Method of whole genome amplification with reduced artifact production
US7452699B2 (en) 2003-01-15 2008-11-18 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Amplification of DNA in a hairpin structure, and applications
DE602004021235D1 (de) 2003-02-21 2009-07-09 Geneform Technologies Ltd Verfahren, kits und reagenzien zur nukleinsäuresequenzierung
WO2005054435A2 (en) 2003-11-26 2005-06-16 Eppendorf Ag Methods and compositions for in vitro amplification of extrachromosomal nucleic acid
AU2005314431B2 (en) 2004-12-11 2011-02-17 Cytogenix, Inc. Cell free biosynthesis of high-quality nucleic acid and uses thereof
US8080393B2 (en) 2005-04-12 2011-12-20 Olink Ab Methods for production of oligonucleotides
WO2006119066A2 (en) 2005-04-29 2006-11-09 The J. Craig Venter Institute Amplification and cloning of single dna molecules using rolling circle amplification
JP2009511019A (ja) 2005-10-06 2009-03-19 ルシジェン コーポレイション 耐熱性ウィルス性ポリメラーゼ及びその使用法
EP1974037B1 (en) 2006-01-12 2012-03-14 Lucigen Corporation Linear vectors, host cells and cloning methods
WO2008045288A2 (en) 2006-10-06 2008-04-17 Vandalia Research, Inc. Method for a continuous rapid thermo cycle system
US9598724B2 (en) * 2007-06-01 2017-03-21 Ibis Biosciences, Inc. Methods and compositions for multiple displacement amplification of nucleic acids
US8921072B2 (en) 2008-09-02 2014-12-30 General Electric Compnay Methods to generate DNA mini-circles
GB201013153D0 (en) * 2010-08-04 2010-09-22 Touchlight Genetics Ltd Primer for production of closed linear DNA
US9114399B2 (en) 2010-08-31 2015-08-25 Canon U.S. Life Sciences, Inc. System and method for serial processing of multiple nucleic acid assays
EP2692870A1 (en) 2012-08-03 2014-02-05 Alacris Theranostics GmbH Method for nucleic acid amplification
KR102014989B1 (ko) 2013-04-15 2019-08-27 삼성전자주식회사 폴리뉴클레오티드 및 그의 용도

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001004280A2 (de) * 1999-07-08 2001-01-18 Mologen Forschungs-, Entwicklungs- Und Vertriebs Gmbh Impfstoff gegen infektionen mit lentiviren, wie dem felinen immunschwäche-virus der katze
WO2004028562A2 (de) * 2002-09-23 2004-04-08 Mologen Ag Impfstoff gegen infektionen mit onkoviren, wie dem felinen leukosevirus der katze

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HUANG W.M. ET AL.: "Protelomerase Uses a Topoi somerase IB/Y-Recombinase Type Mechanism to Generate DNA Hairpin Ends" JOURNAL OF MOLECULAR BIOLOGY, LONDON, GB LNKD-DOI: 10.1016/J.JMB.2004.01.012, vol. 337, no. 1, 12 March 2004 (2004-03-12), pages 77-92, XP004491619 ISSN: 0022-2836, page 77 - page 86 *
JAN DENEKE ET AL.: "THE PROTELOMERASE OF TEMPERATE ESCHERICHIA COLI PHAGE N15 HAS CLEAVING-JOINING ACTIVITY" PNAS, vol. 97, no. 14, 5 July 2000 (2000-07-05) pages 7721-7726, XP002580375 page 7721 - page 7725; figure 3 *
JOCHEN HEINRICH ET AL.: "Linear closed mini DNA generated by the prokaryotic cleaving-joining enzyme TelN is functional in mammalian cells" J. MOL. MED., vol. 80, 2002, pages 648-654, XP002580374, page 648 - page 653 *
MARDANOV A.V. ET AL.: "Functional characterization of the repA replication gene of linear plasmid prophage N15" RESEARCH IN MICROBIOLOGY, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL LNKD-DOI: 10.1016/J.RESMIC.2005.06.008, vol. 157, no. 2, 1 March 2006 (2006-03-01), pages 176-183, XP025101129 ISSN: 0923-2508 [retrieved on 2006-03-01] page 176 - page 182 *
RAVIN N.V. ET AL.: "The protelomerase of the phage-plasmid N15 Is responsible for its maintenance in linear form" JOURNAL OF MOLECULAR BIOLOGY, LONDON, GB LNKD-DOI: 10.1006/JMBI.2001.5019, vol. 312, no. 5, 5 October 2001 (2001-10-05), pages 899-906, XP004490133 ISSN: 0022-2836, page 899 - page 905 *
RAVIN V. ET AL.: "Genomic sequence and analysis of the atypical temperate bacteriophage N15" JOURNAL OF MOLECULAR BIOLOGY, LONDON, GB LNKD-DOI: 10.1006/JMBI.2000. 3731, vol. 299, no. l, 26 May 2000 (2000-05-26), pages 53-73, XP004470889 ISSN: 0022-2836 the whole document *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017060650A1 (fr) 2015-10-08 2017-04-13 Jean-Marc Limacher Composition anti-tumorale
RU2616279C1 (ru) * 2015-12-28 2017-04-13 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук (ИБГ УНЦ РАН) Способ получения маркерных лестниц для гель-электрофоретического определения размеров фрагментов нуклеиновых кислот
WO2025190971A1 (fr) 2024-03-13 2025-09-18 Odimma Therapeutics Vecteur non-viral pour transcription augmentee
FR3160186A1 (fr) 2024-03-13 2025-09-19 Odimma Therapeutics Vecteur non-viral pour transcription augmentee

Also Published As

Publication number Publication date
IL213930A0 (en) 2011-07-31
DK2391731T3 (da) 2013-04-22
JP2016047049A (ja) 2016-04-07
US11384388B2 (en) 2022-07-12
US20150329902A1 (en) 2015-11-19
ES2749629T3 (es) 2020-03-23
ES2400890T3 (es) 2013-04-15
EP2612925B1 (en) 2016-11-30
LT3150722T (lt) 2019-12-10
SG173102A1 (en) 2011-08-29
ZA201105013B (en) 2013-03-27
GB0901593D0 (en) 2009-03-11
EP2612925A1 (en) 2013-07-10
HK1159693A1 (en) 2012-08-03
CN102301010B (zh) 2015-07-08
CN102301010A (zh) 2011-12-28
DK3150722T3 (da) 2019-12-16
US20190203282A1 (en) 2019-07-04
IL213930A (en) 2014-08-31
KR20110107846A (ko) 2011-10-04
MX2011007937A (es) 2011-08-17
CA2751130C (en) 2018-03-06
JP6454243B2 (ja) 2019-01-16
CN104911177A (zh) 2015-09-16
JP2012516147A (ja) 2012-07-19
EP3150722A1 (en) 2017-04-05
NZ594004A (en) 2013-01-25
KR101926662B1 (ko) 2018-12-07
EP2391731A1 (en) 2011-12-07
BRPI1005683A2 (pt) 2019-04-02
AU2010209532A1 (en) 2011-07-28
US20220372565A1 (en) 2022-11-24
US20120282283A1 (en) 2012-11-08
EA201101141A1 (ru) 2012-05-30
BRPI1005683B1 (pt) 2019-11-12
WO2010086626A1 (en) 2010-08-05
US9109250B2 (en) 2015-08-18
CA2751130A1 (en) 2010-08-05
AU2010209532B2 (en) 2015-06-25
EP2391731B1 (en) 2013-01-23
EP3150722B1 (en) 2019-09-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA021069B1 (ru) Получение закрытой линейной днк
US12509718B2 (en) Method of DNA synthesis
AU2019266327B2 (en) Methods of editing single nucleotide polymorphism using programmable base editor systems
AU2019265018B2 (en) Methods of suppressing pathogenic mutations using programmable base editor systems
US12286654B2 (en) Base editing enzymes
JP7093728B2 (ja) 化学的に修飾されたガイドｒｎａを使用する高特異性ゲノム編集
EP3918077A1 (en) Nucleobase editors having reduced off-target deamination and methods of using same to modify a nucleobase target sequence
EP3830263A1 (en) Multi-effector nucleobase editors and methods of using same to modify a nucleic acid target sequence
KR20180015731A (ko) 캄필로박터 제주니 crispr/cas 시스템 유래 rgen을 이용한 유전체 교정
RU2707542C1 (ru) Способ получения препарата рекомбинантной нуклеазы CAS, по существу, свободного от бактериальных эндотоксинов, полученный данным способом препарат и содержащий его набор для использования в системе CRISPR/Cas
CA3234217A1 (en) Base editing enzymes
US20230348877A1 (en) Base editing enzymes
US20220389418A1 (en) Rna-guided cas nucleases and uses thereof in diagnostics and therapy
JP2025506888A (ja) 合成ウイルス及びその提供
US20260049341A1 (en) Method to generate supercoiled circular dna in vitro
CN114144231B (zh) 用于治疗癌症的crispr方法
JP2023539237A (ja) カーゴヌクレオチド配列を転位させるための系および方法
KR20240141024A (ko) E1347A DddAtox 변이체-TnpB fusion 단백질을 이용한 유전자 가위 시스템
CN116875597A (zh) 修正lmna心肌病致病突变的载体及其应用
US12371725B2 (en) Synthesis of DNA molecules in in vitro enzymatic systems
US20230287374A1 (en) Targeted dna demethylation method, fusion protein and application thereof
CN119162157B (zh) 用于碱基编辑的脱氨酶及其变体
WO2024245139A9 (en) Gene editing systems and uses thereof
Sretenovic Developing and Improving CRISPR-Based Genome Editing Technologies in Plants
HK1215045A1 (zh) 用於制备闭合线状dna的体外无细胞方法的试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM

PC4A Registration of transfer of a eurasian patent by assignment