JP2023539237A - カーゴヌクレオチド配列を転位させるための系および方法 - Google Patents

カーゴヌクレオチド配列を転位させるための系および方法 Download PDF

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Abstract

【解決手段】本開示は、カーゴヌクレオチド配列を標的核酸部位に転位させるための系および方法を提供する。これらの系と方法は、カーゴヌクレオチド配列を含む第１の二本鎖核酸であって、カーゴヌクレオチド配列がリコンビナーゼまたはトランスポザーゼ複合体と相互作用するように構成される、第１の二本鎖核酸と、Ｃａｓエフェクター、および標的核酸部位にハイブリダイズするように構成された少なくとも１つの操作されたガイドポリヌクレオチドを含むＣａｓエフェクター複合体と、リコンビナーゼまたはトランスポザーゼ複合体であって、カーゴヌクレオチドを前記標的核酸部位に補充するように構成される、リコンビナーゼまたはトランスポザーゼ複合体とを含み得る。【選択図】図３

Description

関連出願
本出願は、２０２０年８月２４日に出願された「ＳＹＳＴＥＭＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＴＲＡＮＳＰＯＳＩＮＧ ＣＡＲＧＯ ＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ」という表題の米国仮特許出願第６３／０６９，７０３号と、２０２１年５月１０日に出願された「ＳＹＳＴＥＭＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＴＲＡＮＳＰＯＳＩＮＧ ＣＡＲＧＯ ＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ」という表題の米国仮特許出願第６３／１８６，６９８号、および２０２１年８月１２日に出願された「ＳＹＳＴＥＭＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＴＲＡＮＳＰＯＳＩＮＧ ＣＡＲＧＯ ＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ」という表題の米国仮特許出願第６３／２３２，５９３号の利益を主張するものであり、これらの各々は引用により本明細書に組み込まれる。
Ｃａｓ酵素は、それらに関連するＣｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ（クラスター化され、規則的に間隔が空いた短い回文構造の繰り返し）（ＣＲＩＳＰＲ）ガイドリボ核酸（ＲＮＡ）とともに、原核生物免疫系の広範な（細菌の約４５％、古細菌の約８４％）成分であると思われ、ＣＲＩＳＰＲ－ＲＮＡガイド核酸切断によって感染ウイルスおよびプラスミドなどの非自己核酸に対してその微生物を守る役割を担う。ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡエレメントをコードするデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エレメントは、構造および長さにおいて比較的保存され得る一方で、そのＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質は非常に多様であり、様々な核酸相互作用ドメインを含む。ＣＲＩＳＰＲ ＤＮＡエレメントは１９８７年に発見されているが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体のプログラム可能なエンドヌクレアーゼ切断能力は比較的最近になって認識され、多様なＤＮＡ操作や遺伝子編集用途に組換えＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系が使用されるようになっている。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、参照により全体として本明細書に組み込まれる配列表を含んでいる。２０２１年８月２０日に作成された上記ＡＳＣＩＩコピーは、５５９２１－７１４＿６０１＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、４８８，４５２バイトのサイズである。
いくつかの態様において、本開示は、カーゴヌクレオチド配列を標的核酸部位に転位させるための系を提供し、前記系は、前記カーゴヌクレオチド配列を含む第１の二本鎖核酸であって、前記カーゴヌクレオチド配列がリコンビナーゼまたはトランスポザーゼ複合体と相互作用するように構成される、第１の二本鎖核酸と、クラスＩＩ、タイプＩＩのＣａｓエフェクター、および前記標的核酸部位にハイブリダイズするように構成された少なくとも１つの操作されたガイドポリヌクレオチドを含むＣａｓエフェクター複合体と、前記リコンビナーゼまたはトランスポザーゼ複合体であって、前記カーゴヌクレオチド配列を前記標的核酸部位に補充するように構成される、前記リコンビナーゼまたはトランスポザーゼ複合体と、を含む。いくつかの実施形態では、前記リコンビナーゼまたはトランスポザーゼ複合体は、前記Ｃａｓエフェクター複合体に非共有結合する。いくつかの実施形態では、前記リコンビナーゼまたはトランスポザーゼ複合体は、前記Ｃａｓエフェクター複合体に共有結合する。いくつかの実施形態では、前記リコンビナーゼまたはトランスポザーゼ複合体は、単一のポリペプチドにおいて前記Ｃａｓエフェクター複合体に融合される。いくつかの実施形態では、前記カーゴヌクレオチド配列は、左側のトランスポザーゼ認識配列および右側のトランスポザーゼ認識配列に隣接している。いくつかの実施形態では、本系は、前記標的核酸部位を含む第２の二本鎖核酸をさらに含む。いくつかの実施形態では、本系は、前記標的核酸部位に隣接する前記Ｃａｓエフェクター複合体に適合するＰＡＭ配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、前記ＰＡＭ配列は、前記標的核酸部位の３’に位置する。いくつかの実施形態では、前記リコンビナーゼまたはトランスポザーゼ複合体は、Ｔｎ７タイプのトランスポザーゼ複合体である。いくつかの実施形態では、前記操作されたガイドポリヌクレオチドは、前記クラスＩＩ、タイプＩＩのＣａｓエフェクターに結合するように構成される。いくつかの実施形態では、前記クラスＩＩ、タイプＩＩのＣａｓエフェクターは、配列番号１またはその変異体に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含むポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、前記リコンビナーゼまたはトランスポザーゼ複合体は、配列番号２～５のいずれか１つあるいはその変異体に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または４つのポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、前記操作されたガイドポリヌクレオチドは、配列番号１２またはその変異体に対して少なくとも８０％の同一性を有する少なくとも６０～８０個の連続したヌクレオチドを含む配列を含む。いくつかの実施形態では、前記操作されたガイドポリヌクレオチドは、配列番号１１またはその変異体に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、前記左側のリコンビナーゼ配列は、配列番号１７～１８のいずれか１つあるいはその変異体に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、前記右側のリコンビナーゼ配列は、配列番号１９またはその変異体に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、クラスＩＩ、タイプＩＩのＣａｓエフェクターならびに前記リコンビナーゼまたはトランスポザーゼ複合体は、約１０キロベース未満を含むポリヌクレオチド配列によってコードされる。
いくつかの態様において、本開示は、標的ヌクレオチド配列を含む標的核酸部位にカーゴヌクレオチド配列を転位させるための方法を提供し、上記方法は、本明細書に記載される態様または実施形態のいずれかの系を細胞内で発現させる工程、あるいは本明細書に記載される態様または実施形態のいずれかの系を細胞に導入する工程を含む。
いくつかの態様において、本開示は、カーゴヌクレオチド配列を標的核酸部位に転位させるための系を提供し、前記系は、Ｔｎ７タイプのトランスポザーゼ複合体と相互作用するように構成されたカーゴヌクレオチド配列を含む第１の二本鎖核酸と、クラスＩＩ、タイプＶのＣａｓエフェクター、および前記標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズするように構成された操作されたガイドポリヌクレオチドを含むＣａｓエフェクター複合体と、前記Ｃａｓエフェクター複合体に結合するように構成されたＴｎ７タイプのトランスポザーゼ複合体であって、ＴｎｓＡサブユニットを含む、Ｔｎ７タイプのトランスポザーゼ複合体とを含む。いくつかの実施形態では、前記トランスポザーゼ複合体は、前記Ｃａｓエフェクター複合体に非共有結合する。いくつかの実施形態では、前記トランスポザーゼ複合体は、前記Ｃａｓエフェクター複合体に共有結合する。いくつかの実施形態では、前記トランスポザーゼ複合体は、単一のポリペプチドにおいて前記Ｃａｓエフェクター複合体に融合される。いくつかの実施形態では、前記クラスＩＩ、タイプＶのＣａｓエフェクターは、Ｃａｓ１２ｋエフェクターではない。いくつかの実施形態では、前記カーゴヌクレオチド配列は、左側のトランスポザーゼ認識配列および右側のトランスポザーゼ認識配列に隣接している。いくつかの実施形態では、本系は、前記標的核酸部位を含む第２の二本鎖核酸をさらに含む。いくつかの実施形態では、本系は、前記標的核酸部位に隣接する前記Ｃａｓエフェクター複合体に適合するＰＡＭ配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、前記ＰＡＭ配列は、前記標的核酸部位の５’に位置する。いくつかの実施形態では、前記操作されたガイドポリヌクレオチドは、前記クラスＩＩ、タイプＶのＣａｓエフェクターに結合するように構成される。いくつかの実施形態では、前記ＴｎｓＡサブユニットは、配列番号７またはその変異体に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を有するポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、前記Ｔｎ７タイプのトランスポザーゼ複合体は、配列番号８～１０のいずれか１つあるいはその変異体に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つのポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、前記操作されたガイドポリヌクレオチドは、配列番号１３～１６のいずれか１つあるいはその変異体に対して少なくとも８０％の同一性を有する少なくとも約４６～８０個の連続したヌクレオチドを含む配列を含む。いくつかの実施形態では、前記左側のリコンビナーゼ配列は、配列番号２０またはその変異体に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、前記右側のリコンビナーゼ配列は、配列番号２１またはその変異体に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、前記クラスＩＩ、タイプＶのＣａｓエフェクターは、Ｃａｓ１２ｋエフェクターではない。いくつかの実施形態では、前記クラスＩＩ、タイプＶのＣａｓエフェクターおよび前記Ｔｎ７タイプのトランスポザーゼ複合体は、約１０キロベース未満を含むポリヌクレオチド配列によってコードされる。
いくつかの態様において、本開示は、標的ヌクレオチド配列を含む標的核酸部位にカーゴヌクレオチド配列を転位させるための方法を提供し、上記方法は、本明細書に記載される態様または実施形態のうちのいずれか１つの系を細胞内で発現させる工程、あるいは本明細書に記載される態様または実施形態のいずれか１つの系を細胞に導入する工程を含む。
いくつかの態様において、本開示は、カーゴヌクレオチド配列を標的核酸部位に転位させるための方法を提供し、上記方法は、カーゴヌクレオチド配列を含む第１の二本鎖核酸を、クラスＩＩ、タイプＩＩのＣａｓエフェクター、および前記標的核酸部位にハイブリダイズするように構成された少なくとも１つの操作されたガイドポリヌクレオチドを含むＣａｓエフェクター複合体と、前記標的核酸部位に前記カーゴヌクレオチドを補充するように構成されたリコンビナーゼまたはトランスポザーゼ複合体と、前記標的核酸部位を含む第２の二本鎖核酸と、に接触させる工程を含む。いくつかの実施形態では、前記リコンビナーゼまたはトランスポザーゼ複合体は、前記Ｃａｓエフェクター複合体に非共有結合する。いくつかの実施形態では、前記リコンビナーゼまたはトランスポザーゼ複合体は、前記Ｃａｓエフェクター複合体に共有結合する。いくつかの実施形態では、前記リコンビナーゼまたはトランスポザーゼ複合体は、単一のポリペプチドにおいて前記Ｃａｓエフェクター複合体に融合される。いくつかの実施形態では、前記カーゴヌクレオチド配列は、左側のトランスポザーゼ認識配列および右側のトランスポザーゼ認識配列に隣接している。いくつかの実施形態では、標的核酸は、前記標的核酸部位に隣接する前記Ｃａｓエフェクター複合体に適合するＰＡＭ配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、前記ＰＡＭ配列は、前記標的核酸部位の３’に位置する。いくつかの実施形態では、前記リコンビナーゼまたはトランスポザーゼ複合体は、Ｔｎ７タイプのトランスポザーゼ複合体である。いくつかの実施形態では、前記操作されたガイドポリヌクレオチドは、前記クラスＩＩ、タイプＩＩのＣａｓエフェクターに結合するように構成される。いくつかの実施形態では、前記クラスＩＩ、タイプＩＩのＣａｓエフェクターは、配列番号１またはその変異体に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含むポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、前記リコンビナーゼまたはトランスポザーゼ複合体は、配列番号２～５のいずれか１つあるいはその変異体に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または４つのポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、前記操作されたガイドポリヌクレオチドは、配列番号１２またはその変異体に対して少なくとも８０％の同一性を有する少なくとも約６０～８０個の連続したヌクレオチドを含む配列を含む。いくつかの実施形態では、前記操作されたガイドポリヌクレオチドは、配列番号１１またはその変異体に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、前記左側のリコンビナーゼ配列は、配列番号１７～１８のいずれか１つあるいはその変異体に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、前記右側のリコンビナーゼ配列は、配列番号１９またはその変異体に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、前記クラスＩＩ、タイプＩＩのＣａｓエフェクターおよび前記Ｔｎ７タイプのトランスポザーゼ複合体は、約１０キロベース未満を含むポリヌクレオチド配列によってコードされる。
いくつかの態様において、本開示は、カーゴヌクレオチド配列を標的核酸部位に転位させるための方法を提供し、上記方法は、前記カーゴヌクレオチド配列を含む第１の二本鎖核酸を、クラスＩＩ、タイプＶのＣａｓエフェクター、および前記標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズするように構成された操作された少なくとも１つのガイドポリヌクレオチドを含むＣａｓエフェクター複合体と、前記Ｃａｓエフェクター複合体に結合するように構成されたＴｎ７タイプのトランスポザーゼ複合体であって、ＴｎｓＡサブユニットを含む、Ｔｎ７タイプのトランスポザーゼ複合体と、前記標的核酸部位を含む第２の二本鎖核酸と、に接触させる工程を含む。いくつかの実施形態では、前記トランスポザーゼ複合体は、前記Ｃａｓエフェクター複合体に非共有結合する。いくつかの実施形態では、前記トランスポザーゼ複合体は、前記Ｃａｓエフェクター複合体に共有結合する。いくつかの実施形態では、前記トランスポザーゼ複合体は、単一のポリペプチドにおいて前記Ｃａｓエフェクター複合体に融合される。いくつかの実施形態では、前記カーゴヌクレオチド配列は、左側のトランスポザーゼ認識配列および右側のトランスポザーゼ認識配列に隣接している。いくつかの実施形態では、前記標的核酸部位は、前記標的核酸部位に隣接する前記Ｃａｓエフェクター複合体に適合するＰＡＭ配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、前記ＰＡＭ配列は、前記標的核酸部位の３’に位置する。いくつかの実施形態では、前記操作されたガイドポリヌクレオチドは、前記クラスＩＩ、タイプＶのＣａｓエフェクターに結合するように構成される。いくつかの実施形態では、前記ＴｎｓＡサブユニットは、配列番号７またはその変異体に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を有するポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、前記Ｔｎ７タイプのトランスポザーゼ複合体は、配列番号８～１０のいずれか１つあるいはその変異体に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つのポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、前記操作されたガイドポリヌクレオチドは、配列番号１３～１６のいずれか１つあるいはその変異体に対して少なくとも８０％の同一性を有する少なくとも約４６～８０個の連続したヌクレオチドを含む配列を含む。いくつかの実施形態では、前記左側のリコンビナーゼ配列は、配列番号２０またはその変異体に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、前記右側のリコンビナーゼ配列は、配列番号２１またはその変異体に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、前記クラスＩＩ、タイプＶのＣａｓエフェクターは、Ｃａｓ１２ｋエフェクターではない。いくつかの実施形態では、前記クラスＩＩ、タイプＶのＣａｓエフェクターおよび前記Ｔｎ７タイプのトランスポザーゼ複合体は、約１０キロベース未満を含むポリヌクレオチド配列によってコードされる。
いくつかの態様において、本開示は、カーゴヌクレオチド配列を標的核酸部位に転位させるための系を提供し、前記系は、Ｔｎ７タイプのトランスポザーゼ複合体と相互作用するように構成されたカーゴヌクレオチド配列を含む第１の二本鎖核酸と、クラスＩ、タイプＩ－ＦのＣａｓエフェクター、および前記標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズするように構成された操作されたガイドポリヌクレオチドを含むＣａｓエフェクター複合体と、前記Ｃａｓエフェクター複合体に結合するように構成されたＴｎ７タイプのトランスポザーゼ複合体であって、ＴｎｓＡサブユニットを含む、Ｔｎ７タイプのトランスポザーゼ複合体とを含む。いくつかの実施形態では、前記トランスポザーゼ複合体は、前記Ｃａｓエフェクター複合体に非共有結合する。いくつかの実施形態では、前記トランスポザーゼ複合体は、前記Ｃａｓエフェクター複合体に共有結合する。いくつかの実施形態では、前記トランスポザーゼ複合体は、単一のポリペプチドにおいて前記Ｃａｓエフェクター複合体に融合される。いくつかの実施形態では、前記カーゴヌクレオチド配列は、左側のトランスポザーゼ認識配列および右側のトランスポザーゼ認識配列に隣接している。いくつかの実施形態では、本系は、前記標的核酸部位を含む第２の二本鎖核酸をさらに含む。いくつかの実施形態では、本系は、前記標的核酸部位に隣接する前記Ｃａｓエフェクター複合体に適合するＰＡＭ配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、前記ＰＡＭ配列は、前記標的核酸部位の３’に位置する。いくつかの実施形態では、前記ＰＡＭ配列は、前記標的核酸部位の５’に位置する。いくつかの実施形態では、前記操作されたガイドポリヌクレオチドは、前記クラスＩ、タイプＩ－ＦのＣａｓエフェクターに結合するように構成される。いくつかの実施形態では、前記クラスＩ、タイプＩ－ＦのＣａｓエフェクターは、配列番号４１～４３または４８～５０のいずれか１つあるいはその変異体に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含むポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、前記Ｔｎ７タイプのトランスポザーゼ複合体は、配列番号４４～４６または５１～５３のいずれか１つあるいはその変異体に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つのポリペプチドを含む。
いくつかの態様において、本開示は、標的ヌクレオチド配列を含む標的核酸部位にカーゴヌクレオチド配列を転位させるための方法を提供し、上記方法は、本明細書に記載される態様または実施形態のうちのいずれか１つの系を細胞内で発現させる工程、あるいは本明細書に記載される態様または実施形態のいずれか１つの系を細胞に導入する工程を含む。
いくつかの態様において、本開示は、カーゴヌクレオチド配列を標的核酸部位に転位させるための系を提供し、前記系は、Ｔｎ７タイプのトランスポザーゼ複合体と相互作用するように構成されたカーゴヌクレオチド配列を含む第１の二本鎖核酸と、クラスＩＩ、タイプＶのＣａｓエフェクター、および前記標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズするように構成された操作されたガイドポリヌクレオチドを含むＣａｓエフェクター複合体と、前記Ｃａｓエフェクター複合体に結合するように構成されたＴｎ７タイプのトランスポザーゼ複合体と、を含み、ここで、前記Ｔｎ７タイプのトランスポザーゼ複合体は、ＴｎｓＢ、ＴｎｓＣ、およびＴｎｉＱ成分を含み、ここで、（ａ）前記クラスＩＩ、タイプＶのＣａｓエフェクターは、配列番号２２、２６、３０、３４、５５～８９、１０４、または１４７のいずれか１つあるいはその変異体に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を有するポリペプチドを含み、あるいは、（ｂ）前記Ｔｎ７タイプのトランスポザーゼ複合体は、配列番号２３～２５、２７～２９、３１～３３、３５～３７、１０１～１０３、１０５～１０７、または１４８～１５０のいずれか１つあるいはその変異体に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を有するＴｎｓＢ、ＴｎｓＣ、またはＴｎｉＱ成分を含む。いくつかの実施形態では、前記トランスポザーゼ複合体は、前記Ｃａｓエフェクター複合体に非共有結合する。いくつかの実施形態では、前記トランスポザーゼ複合体は、前記Ｃａｓエフェクター複合体に共有結合する。いくつかの実施形態では、前記トランスポザーゼ複合体は、単一のポリペプチドにおいて前記Ｃａｓエフェクター複合体に融合される。いくつかの実施形態では、前記クラスＩＩ、タイプＶのＣａｓエフェクターは、配列番号２２、２６、３０、３４、５５～８９、１０４、または１４７のいずれか１つあるいはその変異体に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、前記Ｔｎ７タイプのトランスポザーゼ複合体は、配列番号２３～２５、２７～２９、３１～３３、３５～３７、１０１～１０３、１０５～１０７、もしくは１４８～１５０のいずれか１つあるいはその変異体に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＴｎｓＢ、ＴｎｓＣ、またはＴｎｉＱ成分を含む。いくつかの実施形態では、前記クラスＩＩ、タイプＶのＣａｓエフェクターは、Ｃａｓ１２ｋエフェクターである。いくつかの実施形態では、前記カーゴヌクレオチド配列は、左側のトランスポザーゼ認識配列および右側のトランスポザーゼ認識配列に隣接している。いくつかの実施形態では、本系は、前記標的核酸部位を含む第２の二本鎖核酸をさらに含む。いくつかの実施形態では、本系は、前記標的核酸部位に隣接する前記Ｃａｓエフェクター複合体に適合するＰＡＭ配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、前記ＰＡＭ配列は、前記標的核酸部位の５’に位置する。いくつかの実施形態では、前記ＰＡＭ配列は、５’－ｎＧＴｎ－３’または５’－ｎＧＴｔ－３’を含む。いくつかの実施形態では、前記操作されたガイドポリヌクレオチドは、前記クラスＩＩ、タイプＶのＣａｓエフェクターに結合するように構成される。いくつかの実施形態では、前記ＴｎｓＢ、ＴｎｓＣ、およびＴｎｉＱ成分は、それぞれ配列番号２３～２５、２７～２９、３１～３３、３５～３７、１０１～１０３、１０５～１０７、または１４８～１５０のいずれか１つに対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を有するポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、前記操作されたガイドポリヌクレオチドは、配列番号９０、９１、９２、９３、１１７、１５１、１５６～１８１、または２０９～２３４のいずれか１つに対して少なくとも８０％の同一性を有する少なくとも約４６～８０個の連続したヌクレオチドを含む配列を含む。いくつかの実施形態では、前記操作されたガイドポリヌクレオチドは、配列番号１１１～１１４または２０１～２０６、２５５、２６２、２５６、２０９、２５７、２６３、２５８、２１０のいずれか１つあるいはその変異体に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、前記左側のリコンビナーゼ配列は、配列番号１２５、１２７、１２３、１２９、１３１、１３３、１５３、または１３４のいずれか１つあるいはその変異体に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、前記右側のリコンビナーゼ配列は、配列番号１２６、１５５、１２８、１２４、１３０、１３２、または１５４のいずれか１つあるいはその変異体に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、前記クラスＩＩ、タイプＶのＣａｓエフェクターおよび前記Ｔｎ７タイプのトランスポザーゼ複合体は、約１０キロベース未満を含むポリヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、（ａ）前記クラスＩＩ、タイプＶのＣａｓエフェクターは、配列番号２２またはその変異体に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含み、（ｂ）前記左側のリコンビナーゼ配列は、配列番号１２５またはその変異体に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含み、（ｃ）前記右側のリコンビナーゼ配列は、配列番号１２６もしくは１５５またはその変異体に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含み、（ｄ）前記操作されたガイドポリヌクレオチドは、（ｉ）配列番号９０の少なくとも約４６～６０個のヌクレオチドに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含み、あるいは、（ｉｉ）配列番号９４、１１２、または２０２のいずれか１つの非縮重ヌクレオチドに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含み、あるいは、（ｅ）前記ＴｎｓＢ、ＴｎｓＣ、およびＴｎｉＱ成分は、配列番号２３～２５またはその変異体に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、（ａ）前記クラスＩＩ、タイプＶのＣａｓエフェクターは、配列番号２６またはその変異体に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含み、（ｂ）前記左側のリコンビナーゼ配列は、配列番号１２７またはその変異体に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含み、（ｃ）前記右側のリコンビナーゼ配列は、配列番号１２８またはその変異体に対して少なくとも８８０％の配列同一性を有する配列を含み、（ｄ）前記操作されたガイドポリヌクレオチドは、（ｉ）配列番号９１、１５６、または２０９のうちのいずれか１つの少なくとも約４６～６０個のヌクレオチドに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含み、あるいは、（ｉｉ）配列番号９５、１１３、または２０３のいずれか１つの非縮重ヌクレオチドに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含み、あるいは、（ｅ）前記ＴｎｓＢ、ＴｎｓＣ、およびＴｎｉＱ成分は、配列番号２７～２９またはその変異体に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、（ａ）前記クラスＩＩ、タイプＶのＣａｓエフェクターは、配列番号６０またはその変異体に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含み、（ｂ）前記左側のリコンビナーゼ配列は、配列番号１３１またはその変異体に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含み、（ｃ）前記右側のリコンビナーゼ配列は、配列番号１３２またはその変異体に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含み、（ｄ）前記操作されたガイドポリヌクレオチドは、（ｉ）配列番号１１７、１６１、または２１４のうちのいずれか１つの少なくとも約４６～６０個のヌクレオチドに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含み、あるいは、（ｉｉ）配列番号１１９の非縮重ヌクレオチドに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含み、あるいは、（ｅ）前記ＴｎｓＢ、ＴｎｓＣ、およびＴｎｉＱ成分は、配列番号１０１～１０３またはその変異体に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、（ａ）前記クラスＩＩ、タイプＶのＣａｓエフェクターは、配列番号１４７またはその変異体に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含み、（ｂ）前記左側のリコンビナーゼ配列は、配列番号１５３またはその変異体に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含み、（ｃ）前記右側のリコンビナーゼ配列は、配列番号１５４またはその変異体に対して少なくとも８８０％の配列同一性を有する配列を含み、（ｄ）前記操作されたガイドポリヌクレオチドは、（ｉ）配列番号１５１、１８１、または２３４のうちのいずれか１つの少なくとも約４６～６０個のヌクレオチドに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含み、あるいは、（ｉｉ）配列番号１５２または２５４の非縮重ヌクレオチドに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含み、あるいは、（ｅ）前記ＴｎｓＢ、ＴｎｓＣ、およびＴｎｉＱ成分は、配列番号１４８～１５０またはその変異体に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、（ａ）前記クラスＩＩ、タイプＶのＣａｓエフェクターは、配列番号３４またはその変異体に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含み、（ｂ）前記左側のリコンビナーゼ配列は、配列番号１２９またはその変異体に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含み、（ｃ）前記右側のリコンビナーゼ配列は、配列番号１３０またはその変異体に対して少なくとも８８０％の配列同一性を有する配列を含み、（ｄ）前記操作されたガイドポリヌクレオチドは、（ｉ）配列番号９３、１５７、または２１０のうちのいずれか１つの少なくとも約４６～６０個のヌクレオチドに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含み、あるいは、（ｉｉ）配列番号９７、１１４、または２０４のいずれか１つの非縮重ヌクレオチドに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含み、あるいは、（ｅ）前記ＴｎｓＢ、ＴｎｓＣ、およびＴｎｉＱ成分は、配列番号１４８～１５０またはその変異体に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、（ａ）前記クラスＩＩ、タイプＶのＣａｓエフェクターは、配列番号３０またはその変異体に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含み、（ｂ）前記左側のリコンビナーゼ配列は、配列番号１２３またはその変異体に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含み、（ｃ）前記右側のリコンビナーゼ配列は、配列番号１２４またはその変異体に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含み、（ｄ）前記操作されたガイドポリヌクレオチドは、（ｉ）配列番号９２の少なくとも約４６～８０個のヌクレオチドに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含み、あるいは、（ｉｉ）配列番号１１１または２０１の非縮重ヌクレオチドに対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含み、（ｅ）前記ＴｎｓＢ、ＴｎｓＣ、およびＴｎｉＱ成分は配列番号３１、３２、および３３またはその変異体に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を有するポリペプチドを含み、あるいは、（ｆ）前記ＰＡＭ配列は、５’－ｎＧＴｎ－３’または５’－ｎＧＴｔ－３’を含む。
いくつかの態様において、本開示は、カーゴヌクレオチド配列を標的核酸部位に転位させるための系を提供し、前記系は、Ｔｎ７タイプのトランスポザーゼ複合体と相互作用するように構成されたカーゴヌクレオチド配列を含む第１の二本鎖核酸と、クラスＩＩ、タイプＶのＣａｓエフェクター、および前記標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズするように構成された操作されたガイドポリヌクレオチドを含むＣａｓエフェクター複合体と、前記Ｃａｓエフェクター複合体に結合するように構成されたＴｎ７タイプのトランスポザーゼ複合体と、を含み、前記Ｔｎ７タイプのトランスポザーゼ複合体は、ＴｎｓＢおよびＴｎｓＣの成分を含むが、ＴｎｓＡおよび／またはＴｎｉＱの成分を含まない。いくつかの実施形態では、前記トランスポザーゼ複合体は、前記Ｃａｓエフェクター複合体に非共有結合する。いくつかの実施形態では、前記トランスポザーゼ複合体は、前記Ｃａｓエフェクター複合体に共有結合する。いくつかの実施形態では、前記トランスポザーゼ複合体は、単一のポリペプチドにおいて前記Ｃａｓエフェクター複合体に融合される。いくつかの実施形態では、前記Ｔｎ７タイプのトランスポザーゼ複合体は、配列番号３９～４０または１０９～１１０のいずれか１つに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、前記ＴｎｓＢ成分は、配列番号４０または１０９に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、前記ＴｎｓＣ成分は、配列番号３９または１１０に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、前記クラスＩＩ、タイプＶのＣａｓエフェクターは、Ｃａｓ１２ｋエフェクターである。いくつかの実施形態では、前記クラスＩＩ、タイプＶのＣａｓエフェクターは、配列番号３８または配列番号１０８に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、前記カーゴヌクレオチド配列は、左側のトランスポザーゼ認識配列および右側のトランスポザーゼ認識配列に隣接している。いくつかの実施形態では、本系は、前記標的核酸部位を含む第２の二本鎖核酸をさらに含む。いくつかの実施形態では、前記二本鎖核酸は前記標的核酸部位を含むか、前記系は細胞の内部にある。いくつかの実施形態では、本系は、前記標的核酸部位に隣接する前記Ｃａｓエフェクター複合体に適合するＰＡＭ配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、前記ＰＡＭ配列は、前記標的核酸部位の５’に位置する。いくつかの実施形態では、前記操作されたガイドポリヌクレオチドは、前記クラスＩＩ、タイプＶのＣａｓエフェクターに結合するように構成される。いくつかの実施形態では、前記ＴｎｓＢおよびＴｎｓＣ成分は、それぞれ配列番号４０および３９、または１０９および１１０に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を有するポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、前記操作されたガイドポリヌクレオチドは、配列番号１１８、１８２、１８３、２３５、または２３６のいずれか１つあるいはその変異体に対して少なくとも８０％の同一性を有する少なくとも約４６～８０個の連続したヌクレオチドを含む配列を含む。いくつかの実施形態では、前記操作されたガイドポリヌクレオチドは、配列番号１１５、１１６、２０５、２０６、２６１、２３５、２６０、または２３６のいずれか１つあるいはその変異体の非縮重ヌクレオチドに対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、前記左側のリコンビナーゼ配列は、配列番号１３４に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、前記右側のリコンビナーゼ配列は、配列番号１３５またはその変異体に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、前記クラスＩＩ、タイプＶのＣａｓエフェクターおよび前記Ｔｎ７タイプのトランスポザーゼ複合体は、約１０キロベース未満を含むポリヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、（ａ）前記クラスＩＩ、タイプＶのＣａｓエフェクターは、配列番号３８またはその変異体に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含み、（ｂ）前記左側のリコンビナーゼ配列は、配列番号１３４またはその変異体に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含み、（ｃ）前記右側のリコンビナーゼ配列は、配列番号１３５またはその変異体に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含み、（ｄ）前記操作されたガイドポリヌクレオチドは、（ｉ）配列番号１８２または２３５の少なくとも約４６～８０個のヌクレオチドに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含み、あるいは、（ｉｉ）配列番号９８、１１５、１１６、２０５、または２０６の非縮重ヌクレオチドに対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含み、あるいは、（ｅ）前記ＴｎｓＢおよびＴｎｓＣ成分は、配列番号４０および３９またはその変異体に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を有するポリペプチドを含む。
いくつかの態様において、本開示は、操作されたヌクレアーゼ系を提供し、前記操作されたヌクレアーゼ系は、ＲｕｖＣドメインとＨＮＨドメインとを含むエンドヌクレアーゼであって、前記エンドヌクレアーゼが未培養の微生物に由来し、前記エンドヌクレアーゼが配列番号１またはその変異体に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含むクラスＩＩ、タイプＩＩのエンドヌクレアーゼである、エンドヌクレアーゼと、操作されたガイドポリヌクレオチドであって、前記操作されたガイドポリヌクレオチドが、前記エンドヌクレアーゼと複合体を形成するように構成され、前記操作されたガイドポリヌクレオチドが、標的核酸配列にハイブリダイズするように構成されたスペーサー配列を含む、操作されたガイドポリヌクレオチドと、を含む。いくつかの実施形態では、前記操作されたガイドポリヌクレオチドは、配列番号１２またはその変異体に対して少なくとも８０％の同一性を有する少なくとも６０～８０個の連続したヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、前記操作されたガイドポリヌクレオチドは、配列番号１１またはその変異体に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む。
いくつかの態様において、本開示は、操作されたヌクレアーゼ系を提供し、前記操作されたヌクレアーゼ系は、ＲｕｖＣドメインを含むエンドヌクレアーゼであって、前記エンドヌクレアーゼが未培養の微生物に由来し、前記エンドヌクレアーゼが配列番号５に対して少なくとも８０％の同一性を有するクラスＩＩ、タイプＶのエンドヌクレアーゼである、エンドヌクレアーゼと、操作されたガイドポリヌクレオチドであって、前記操作されたガイドポリヌクレオチドが、前記エンドヌクレアーゼと複合体を形成するように構成され、前記操作されたガイドＲＮＡが、標的核酸配列にハイブリダイズするように構成されたスペーサー配列を含む、操作されたガイドポリヌクレオチドと、を含む。いくつかの実施形態では、前記操作されたガイドポリヌクレオチドは、配列番号１３～１６またはその変異体に対して少なくとも８０％の同一性を有する少なくとも約４６～８０個の連続したヌクレオチドを含む配列を含む。
いくつかの態様において、本開示は、操作されたヌクレアーゼ系を提供し、前記操作されたヌクレアーゼ系は、ＲｕｖＣドメインを含むエンドヌクレアーゼであって、前記エンドヌクレアーゼが未培養の微生物に由来し、前記エンドヌクレアーゼが配列番号２２、２６、３０、３４、５５～８９、１０４、または１４７のいずれか１つあるいはその変異体に対して少なくとも８０％の同一性を有するクラスＩＩ、タイプＶ－Ｋのエンドヌクレアーゼである、エンドヌクレアーゼと、操作されたガイドポリヌクレオチドであって、前記操作されたガイドポリヌクレオチドが、前記エンドヌクレアーゼと複合体を形成するように構成され、前記操作されたガイドＲＮＡが、標的核酸配列にハイブリダイズするように構成されたスペーサー配列を含む、操作されたガイドポリヌクレオチドと、を含む。いくつかの実施形態では、前記操作されたガイドポリヌクレオチドは、配列番号９０、９１、９２、９３、１１７、１５１、１５６～１８１、または２０９～２３４のいずれか１つあるいはその変異体に対して少なくとも８０％の同一性を有する少なくとも約４６～８０個の連続したヌクレオチドを含む配列を含む。いくつかの実施形態では、前記操作されたガイドポリヌクレオチドは、配列番号１１１～１１４または２０１～２０６、２５５、２６２、２５６、２０９、２５７、２６３、２５８、２１０のいずれか１つあるいはその変異体の非縮重ヌクレオチドに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む。
いくつかの態様において、本開示は、操作されたヌクレアーゼ系を提供し、前記操作されたヌクレアーゼ系は、ＲｕｖＣドメインを含むエンドヌクレアーゼであって、前記エンドヌクレアーゼが未培養の微生物に由来し、前記エンドヌクレアーゼが、配列番号３８または配列番号１０８のいずれか１つあるいはその変異体に対して少なくとも８０％の同一性を有するクラスＩＩ、タイプＶ－Ｋのエンドヌクレアーゼである、エンドヌクレアーゼと、操作されたガイドポリヌクレオチドであって、前記操作されたガイドポリヌクレオチドが、前記エンドヌクレアーゼと複合体を形成するように構成され、前記操作されたガイドＲＮＡが、標的核酸配列にハイブリダイズするように構成されたスペーサー配列を含む、操作されたガイドポリヌクレオチドと、を含む。いくつかの実施形態では、前記操作されたガイドポリヌクレオチドは、配列番号１１８、１８２、１８３、２３５、または２３６のいずれか１つあるいはその変異体に対して少なくとも８０％の同一性を有する少なくとも約４６～８０個の連続したヌクレオチドを含む配列を含む。いくつかの実施形態では、前記操作されたガイドポリヌクレオチドは、配列番号１１１－１１４または２０１－２０６、２５５、２６２、２５６、２０９、２５７、２６３、２５８、２１０、１１５、１１６、２０５、２０６、２６１、２３５、２６０、または２３６、またはその変異体の非縮重ヌクレオチドに対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む。
いくつかの態様において、本開示は、操作されたヌクレアーゼ系を提供し、前記操作されたヌクレアーゼ系は、配列番号４１～４３または４８～５０のいずれか１つあるいはその変異体に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む少なくとも１つのＣａｓ６、Ｃａｓ７、またはＣａｓ８ポリペプチドを含むクラスＩ、タイプＩ－ＦのＣａｓエンドヌクレアーゼと、操作されたガイドＲＮＡであって、前記操作されたガイドＲＮＡが、前記エンドヌクレアーゼと複合体を形成するように構成され、前記操作されたガイドＲＮＡが、標的核酸配列にハイブリダイズするように構成されたスペーサー配列を含む、操作されたガイドと、を含む。いくつかの実施形態では、前記操作されたガイドポリヌクレオチドは、配列番号１２１、１２２、２０７、または２０８の非縮重ヌクレオチドに対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む。
本開示のさらなる態様および利点は、以下の詳細な記載から当業者に容易に明白となり、ここでは、本開示の例示的な実施形態のみが示され、記載されている。理解されるように、本開示は、他の実施形態および異なる実施形態においても可能であり、その様々な詳細は、そのすべてが本開示から逸脱することなく様々な明白な点で修正することができる。したがって、図面および説明は本来、例示的なものとしてみなされ、限定的なものであるとはみなされない。
引用による組み込み
本明細書で言及されるすべての出版物、特許、および特許出願は、あたかも個々の出版物、特許、または特許出願が参照により組み込まれるように具体的かつ個々に指示される程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
本発明の新規な特徴は、とりわけ添付の請求項で説明される。本発明の特徴と利点は、本発明の原理が用いられる例示的な実施形態を説明する以下の詳細な説明と、以下の添付図面（本明細書では「図（“Ｆｉｇｕｒｅ”および“ＦＩＧ．”）」とも称される）とを参照することにより、より良く理解されるであろう。
様々なクラスおよびタイプのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子座の典型的な組織を描く。 天然のクラスＩＩ、タイプＩＩのｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡペアの構造を描いており、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡが連結されたハイブリッドｓｇＲＮＡと比較している。 Ｔｎ７およびＴｎ７様エレメントで見られる２つの経路を描いている。 ファミリーＭＧ３６のタイプＩＩのＴｎ７減少ＣＡＳＴのゲノムコンテクストを描いている。図４のＡは、ＭＧ３６－５ ＣＡＳＴ系が、ＣＲＩＳＰＲアレイ（ＣＲＩＳＰＲリピート）、ＲｕｖＣおよびＨＮＨエンドヌクレアーゼドメインを有するタイプＩＩのヌクレアーゼ、および４つの予測されるトランスポザーゼタンパク質オープンリーディングフレームからなることを示す。触媒トランスポザーゼＴｎｓＢは、２つのサブユニットとしてコードされる。図４のＢは、ＭＧ３６－１ ＣＡＳＴ系（ＴＩＲ－１およびＴＩＲ－２）に対して２つのトランスポゾン末端が予測されることを示す。図４のＣは、予測されたタイプＩＩのＴｎ７減少ＣＡＳＴトランスポゾン左端（ＬＥ）および右端（ＲＥ）配列のアラインメントを示し、注釈付き反復を矢印で示す。左端と右端はその配向によって標識された。 ファミリーＭＧ３９のタイプＶのＴｎ７ ＣＡＳＴのゲノムコンテクストを描いている。図５のＡは、ＭＧ３９－１ ＣＡＳＴ系が、タイプＶのヌクレアーゼ、４つの予測されたトランスポゾンタンパク質（ＴｎｓＡＢＣとＴｎｉＱ）、およびＣＲＩＳＰＲアレイからなることを示す。トランスポゾン末端は、ＭＧ３９－１ ＣＡＳＴ系（ＴＩＲ－１）に対して予測された。図５のＢは、予測されたタイプＶのＴｎ７ ＣＡＳＴトランスポゾン左端（ＬＥ）および右端（ＲＥ）配列のアラインメントを示し、注釈付き逆方向反復が矢印で表されている。 本明細書に記載されるＣＡＳＴ系の対応するｓｇＲＮＡの予測された構造（例えば、実施例３で予測された）を描いている。 本明細書に記載されるＣＡＳＴ系の対応するｓｇＲＮＡの予測された構造（例えば、実施例３で予測された）を描いている。 本明細書に記載される系であるＭＧ１０８－１のゲノムコンテクストを描いている。この候補は、ＴｎｉＱを天然に欠くＣａｓ１２Ｋ ＣＡＳＴである。ゲノム断片中の遺伝子は矢印で表される。 Ｃａｓ１２ｋエフェクター配列の系統発生学的な遺伝子ツリーを描いている。このツリーは、今回回収した６４のＣａｓ１２ｋ配列（オレンジと黒の枝）と、公開データベースからの２２９の参照Ｃａｓ１２ｋ配列（灰色の枝）の多重配列アラインメントから推論したものである。オレンジの枝は、ＣＡＳＴトランスポゾン成分との関連が確認されたＣａｓ１２ｋエフェクターを示す。 ＭＧ１１０カスケードＣＡＳＴを描いている。Ａ）ＭＧ１１０－１カスケードＣＡＳＴのゲノムコンテクスト。完全なＴｎ７の組み合わせ（ＴｎｓＡ、ＴｎｓＢ、ＴｎｓＣ／ＴｎｉＢ、ＴｎｉＱ）および欠陥のあるカスケードの組み合わせ（Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、融合Ｃａｓ５－Ｃａｓ８）は、オレンジ色の矢印で表される。ＣＡＳＴトランスポゾンに隣接するＴＩＲは、連結した矢印で表される。Ｂ）反復二次構造は、ｃｒＲＮＡのステムループ構造を示す。Ｃ）Ａ．ｗｏｄａｎｉｓ、コレラ菌（Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ）、およびＭＧ１１０ファミリーＣＡＳＴからのＣＲＩＳＰＲリピートの配列アラインメントは、ｃｒＲＮＡステム－ループ二次構造を示す保存モチーフを示している。 ＭＧ６４－３ ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座を描いている。ｔｒａｃｒＲＮＡはＣＲＩＳＰＲアレイの上流でコードされ、トランスポゾン末端は下流でコードされる（内側の黒枠）。部分的な３’ＣＲＩＳＰＲリピートに対応する配列と部分的なスペーサーがトランスポゾン内でコードされる（外側の枠）。自己一致スペーサー（ｓｅｌｆ－ｍａｔｃｈｉｎｇ ｓｐａｃｅｒ）は、トランスポゾン末端の外側にコードされる。 本明細書で提供される様々なＣＡＳＴについてのｔｒａｃｒＲＮＡ配列アラインメントを描いている。ｔｒａｃｒＲＮＡ配列のアラインメントは、保存の領域を示す。とりわけ、配列位置９２～９８の配列「ＴＧＣＴＴＴＣ」（上枠）は、ｓｇＲＮＡの三次構造にとって、およびｃｒＲＮＡとの非連続的なリピート－抗－リピートペアリングにとって重要であることが示唆される。さらに、２６５位－２７８位のヘアピン「ＣＹＣＣ（ｎ６）ＧＧＲＧ」（下枠）は機能的に重要であり、ｃｒＲＮＡペアリングのために下流の配列を位置づけることが可能であることが示唆されている。 例えば、ＭＧ６４－２、ＭＧ６４－４、ＭＧ６４－５、ＭＧ６４－６、ＭＧ６４－７、およびＭＧ１０８－１のファミリーにおける他の重要なリピート－抗－リピート（ＲＡＲ）モチーフの存在を示す。 ＭＧ６４－２ ｓｇＲＮＡの予測される構造を描いている。 ＭＧ６４－４ ｓｇＲＮＡの予測される構造を描いている。 ＭＧ６４－６ ｓｇＲＮＡの予測される構造を描いている。 ＭＧ６４－７ ｓｇＲＮＡの予測される構造を描いている。 ＭＧ１０８－１ ｓｇＲＮＡの予測される構造を描いている。 図１３は、ＭＧ６４－６がインビトロで活性であることを実証する、ＰＣＲ、ＰＡＭ、およびサンガーシーケンシングデータを描いている。インビトロ標的インテグラーゼ活性について記載したプロトコルを用いて、エフェクタータンパク質とそのＴｎｓＢ、ＴｎｓＣ、およびＴｎｉＱタンパク質を、インビトロ転写／翻訳系で発現させた。翻訳後、標的となるＤＮＡ、カーゴＤＮＡ、およびｓｇＲＮＡを、反応バッファー中に添加した。インテグレーションは、標的／ドナー接合部にわたってＰＣＲによってアッセイされた。図１３のＡは、アポ（ｓｇＲＮＡなし）およびｓｇＲＮＡ６４－６ ｓｇＲＮＡを有する６４－６を示す転位のＰＣＲのゲル画像を描いている。ＰＣＲ３はＰＡＭ遠位のＲＥ接合部を検出する。ＰＣＲ４はＰＡＭ遠位のＬＥ接合部である。ＰＣＲ５はＰＡＭ近位のＲＥ接合部である。ＰＣＲ６はＰＡＭ近位のＬＥ接合部である。ＰＣＲは、異なる可能な配向（ＰＣＲ３と６対ＰＣＲ４と５）でペアになっている。ＬＥ－ＰＡＭ近位およびＲＥ－ＰＡＭ遠位の配向が好ましい。図１３のＢは、ＰＣＲ５および６を配列決定するインビトロ転位アッセイからのＰＡＭを描いている。 図１３は、ＭＧ６４－６がインビトロで活性であることを実証する、ＰＣＲ、ＰＡＭ、およびサンガーシーケンシングデータを描いている。インビトロ標的インテグラーゼ活性について記載したプロトコルを用いて、エフェクタータンパク質とそのＴｎｓＢ、ＴｎｓＣ、およびＴｎｉＱタンパク質を、インビトロ転写／翻訳系で発現させた。翻訳後、標的となるＤＮＡ、カーゴＤＮＡ、およびｓｇＲＮＡを、反応バッファー中に添加した。インテグレーションは、標的／ドナー接合部にわたってＰＣＲによってアッセイされた。図１３のＣは、ドナーＤＮＡにおいて切除が起こる転位の接合部を示すサンガーデータを描いている。第１のパネルは、ＰＣＲ３および５（ＲＥ）を示す。第２のパネルは、ＰＣＲ４と６（ＬＥ）を示す。サンガーシーケンシング反応はドナー－標的産物のものであるため、配列決定がドナーＤＮＡと一致しなくなった時点は接合部が生じたときである（配列決定ピークの下の暗いバー）。 挿入部位の好みを明らかにするインビトロ転位産物の次世代シーケンシング（ＮＧＳ）結果を描いている。ＮＧＳリードは、６０位に転位を有する参照配列と比較して、ＣＲＩＳＰＲｅｓｓｏ２において処理された。これからのインデルは、この任意の参照配列より早いか遅い転位に対応する。 ６４－２ＴｎｓＢおよびそのＲＥ ＤＮＡ配列の電気泳動度移動アッセイ（ＥＭＳＡ）結果を描いている。ＥＭＳＡの結果は、結合およびＴｎｓＢ認識を確認する。ＴｎｓＢタンパク質をインビトロ転写／翻訳系で発現させ、ＲＥ配列を含むＦＡＭ標識ＤＮＡとインキュベートし、天然５％ＴＢＥゲル上で分離させた。結合は、標識されたバンドの上方へのシフトとして観察される。複数のＴｎｓＢ結合部位があるため、ＥＭＳＡでは複数のシフトがある。レーン１：ＦＡＭ標識したＤＮＡのみ。レーン２：ＦＡＭ ＤＮＡとインビトロ転写／翻訳系（ＴｎｓＢタンパク質なし）。レーン３：ＦＡＭ ＤＮＡとＴｎｓＢ。レーン３の標識バンドのアップシフト（ｕｐｓｈｉｆｔ）は、ＴｎｓＢによるＲＥ配列の結合を示し、それが活性なＲＥ転位配列を含んでいることを示唆している。
配列表の簡単な記載
本明細書とともに提出された配列表は、本開示にかかる方法、組成物、および系において使用するための例示的なポリヌクレオチドおよびポリペプチドの配列を提供する。以下は、その中の配列の例示的な説明である。
ＭＧ３６
配列番号１は、ＭＧ３６ Ｃａｓエフェクターの完全長ペプチド配列を示す。
配列番号２～５は、ＭＧ３６ Ｃａｓエフェクターに関連するリコンビナーゼまたはトランスポザーゼ複合体を含み得るＭＧ３６転位タンパク質のペプチド配列を示す。標識の末端に対する－Ｂ１、－Ｂ２、－Ｔ１、および－Ｃの付加は、それぞれＴｎ７様系のＴｎｓＢ１、ＴｎｓＢ２、ＴｎｓＴ１、およびＴｎｉＣタンパク質との類似性を示している。
配列番号１１は、ＭＧ３６ Ｃａｓエフェクターとともに機能するように操作されたｓｇＲＮＡのヌクレオチド配列を示す。
配列番号１２は、ＭＧ３６ Ｃａｓエフェクターと同じ遺伝子座に由来するＭＧ３６ ｔｒａｃｒＲＮＡのヌクレオチド配列を示す。
配列番号１７～１８は、ＭＧ３６系に関連する左側のトランスポザーゼ認識配列のヌクレオチド配列を示す。
配列番号１９は、ＭＧ３６系に関連する右側のトランスポザーゼ認識配列のヌクレオチド配列を示す。
ＭＧ３９
配列番号６は、ＭＧ３９－１ Ｃａｓエフェクターの完全長のペプチド配列を示す。
配列番号７～１０は、ＭＧ３９－１Ｃａｓエフェクターに関連するリコンビナーゼまたはトランスポザーゼ複合体を含み得るＭＧ３９－１転位タンパク質のペプチド配列を示す。
配列番号１３～１６は、ＭＧ３９ Ｃａｓエフェクターと同じ遺伝子座に由来するＭＧ３９ ｔｒａｃｒＲＮＡのヌクレオチド配列を示す。
配列番号２０は、ＭＧ３９系に関連する左側のトランスポザーゼ認識配列のヌクレオチド配列を示す。
配列番号２１は、ＭＧ３９系に関連する右側のトランスポザーゼ認識配列のヌクレオチド配列を示す。
ＭＧ６４
配列番号２２、２６、３０、３４、５５～８９、１０４、および１４７は、ＭＧ６４ Ｃａｓエフェクターの完全長ペプチド配列を示す。
配列番号２３～２５、２７～２９、３１～３３、３５～３７、１０１～１０３、１０５～１０７、および１４８～１５０は、ＭＧ６４ Ｃａｓエフェクターに関連するリコンビナーゼまたはトランスポザーゼ複合体を含み得るＭＧ６４転位タンパク質のペプチド配列を示す。標識の末端に対する－Ａ、－Ｂ、－Ｃ、および－Ｑの付加は、それぞれＴｎ７様系のＴｎｓＡ、ＴｎｓＢ、ＴｎｓＣ、およびＴｎｉＱタンパク質との類似性を示している。
配列番号９０～９３、１１７、１５１、１５６～１８１、および２０９～２３４は、ＭＧ６４エフェクターと同じ遺伝子座に由来するＭＧ６４ ｔｒａｃｒＲＮＡのヌクレオチド配列を示す。
配列番号９４～９７、１１９、１５２、および１８４～２００は、ＭＧ６４標的ＣＲＩＳＰＲリピートのヌクレオチド配列を示す。
配列番号２３７～２５９は、ＭＧ６４ ｃｒＲＮＡｓのヌクレオチド配列を示す。
配列番号１１１～１１４と２０１～２０４は、ＭＧ６４ Ｃａｓエフェクターとともに機能するように操作されたシングルガイドＲＮＡのヌクレオチド配列を示す。
配列番号１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、および１５３は、ＭＧ６４系に関連する左側のトランスポザーゼ認識配列のヌクレオチド配列を示す。
配列番号１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１５４、および１５５は、ＭＧ６４系に関連する右側のトランスポザーゼ認識配列のヌクレオチド配列を示す。
ＭＧ１０８
配列番号３８および１０８は、ＭＧ１０８ Ｃａｓエフェクターの完全長のペプチド配列を示す。
配列番号３９～４０および１０９～１１０は、ＭＧ１０８ Ｃａｓエフェクターに関連するリコンビナーゼまたはトランスポザーゼ複合体を含み得るＭＧ１０８転位タンパク質のペプチド配列を示す。標識の末端に対する－Ａ、－Ｂ、－Ｃ、および－Ｑの付加は、それぞれＴｎ７様系のＴｎｓＡ、ＴｎｓＢ、ＴｎｓＣ、およびＴｎｉＱタンパク質との類似性を示している。
配列番号９８および１２０は、ＭＧ１０８標的ＣＲＩＳＰＲリピートのヌクレオチド配列を示す。
配列番号２６０～２６１は、ＭＧ１０８ ｃｒＲＮＡｓのヌクレオチド配列を示す。
配列番号１１５～１１６と２０５～２０６は、ＭＧ１０８ Ｃａｓエフェクターとともに機能するように操作されたシングルガイドＲＮＡのヌクレオチド配列を示す。
配列番号１１８、１８２～１８３、および２３５～２３６は、ＭＧ１０８エフェクターと同じ遺伝子座に由来するＭＧ１０８ ｔｒａｃｒＲＮＡのヌクレオチド配列を示す。
配列番号１３４は、ＭＧ１０８系に関連する左側のトランスポザーゼ認識配列のヌクレオチド配列を示す。
配列番号１３５は、ＭＧ１０８系に関連する右側のトランスポザーゼ認識配列のヌクレオチド配列を示す。
ＭＧ１１０
配列番号４１～４３および４８～５０は、ＭＧ１１０ Ｃａｓエフェクターの完全長のペプチド配列を示す。標識の末端に対する－６、－７、および－８の付加は、それぞれクラスＩ、タイプＩ－Ｆの系ｃａｓ６、ｃａｓ７、およびｃａｓ８タンパク質との類似性を示している。
配列番号４４～４７および５１～５４は、ＭＧ１１０ Ｃａｓエフェクターに関連するリコンビナーゼまたはトランスポザーゼ複合体を含み得るＭＧ１１０転位タンパク質のペプチド配列を示す。標識の末端に対する－Ａ、－Ｂ、－Ｃ、および－Ｑの付加は、それぞれＴｎ７様系のＴｎｓＡ、ＴｎｓＢ、ＴｎｓＣ、およびＴｎｉＱタンパク質との類似性を示している。
配列番号９９～１００は、ＭＧ１１０標的ＣＲＩＳＰＲリピートのヌクレオチド配列を示す。
配列番号１２１～１２２および２０７～２０８は、ＭＧ１１０ ｃｒＲＮＡｓのヌクレオチド配列を示す。
配列番号１３６および１３８は、ＭＧ１１０系に関連する左側のトランスポザーゼ認識配列のヌクレオチド配列を示す。
配列番号１３７および１３９は、ＭＧ１１０系に関連する右側のトランスポザーゼ認識配列のヌクレオチド配列を示す。
他の配列
配列番号１４０～１４１は、核局在化シグナルのペプチド配列を示す。
配列番号１４２～１４３は、リンカーのペプチド配列を示す。
配列番号１４４～１４６は、エピトープタグのペプチド配列を示す。
本発明の実施形態が本明細書中で示され、記載されているが、このような実施形態はほんの一例として提供されるものであることは、当業者に明らかであろう。ここで、本発明から逸脱することなく、多数の変更、変化、および置換がなされることが、当業者によって理解され得る。本明細書に記載される本発明の実施形態の様々な代案が利用され得ることを理解されたい。
本明細書で開示されるいくつかの方法の実施は、特段の定めのない限り、免疫学、生化学、化学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、ゲノミクス、および組換えＤＮＡの技術を利用する。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｇｒｅｅｎ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ （２０１２）； ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （Ｆ． Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌ， ｅｔ ａｌ． ｅｄｓ．）； ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．）， ＰＣＲ ２： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ （Ｍ．Ｊ． ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ， Ｂ．Ｄ． Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｇ．Ｒ． Ｔａｙｌｏｒ ｅｄｓ． （１９９５））， Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ， ｅｄｓ． （１９８８） Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ａｎｄ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ： Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ａｎｄ Ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， ６ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ （Ｒ．Ｉ． Ｆｒｅｓｈｎｅｙ， ｅｄ． （２０１０））（引用により本明細書に完全に組み込まれる）を参照。
本明細書で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が他に明白に示していない限り、複数形を同様に含むことが意図されている。さらに、用語「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「有している（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「含んだ（ｗｉｔｈ）」、または、その変異形態が詳細な記載および／または請求項のいずれかで使用される程度には、上記のような用語は「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」との用語に類似する手法で包括的であることを意図している。
「約（ａｂｏｕｔ）」または「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」という用語は、当業者によって決定されるような特定の値の許容可能な誤差範囲内であることを意味し、これは、その値がどのように測定または決定されるか、つまり、測定システムの制限に部分的に依存している。例えば、「約」とは、当該技術分野での実践につき１または１を超える標準偏差を意味し得る。代替的に、「約」は、任意の値の最大２０％、最大１５％、最大１０％、最大５％、または最大１％の範囲を意味することができる。
本明細書で使用されるように、「細胞」は通常、生体細胞を指す。細胞は、生体の基本的な構造的、機能的、および／または生物学的な単位であり得る。細胞は、１つ以上の細胞を有する任意の生物に由来してもよい。いくつかの非限定的な例としては、原核細胞、真核細胞、細菌細胞、古細菌細胞、単細胞真核生物の細胞、原虫細胞、植物からの細胞（例えば、植物作物、果物、野菜、穀物、大豆、トウモロコシ（ｃｏｒｎ）、トウモロコシ（ｍａｉｚｅ）、小麦、種子、トマト、米、カッサバ、サトウキビ、カボチャ、干し草、ジャガイモ、綿、大麻、タバコ、顕花植物、針葉樹、裸子植物、シダ類、クラブモス類、ツノゴケ類、肝臓植物、コケ類）、藻類細胞、（例えば、ボツリオコッカス・ブラウニー（Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ ｂｒａｕｎｉｉ）、クラミドモナス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）、ナンノクロロプシス・ガディタナ（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｇａｄｉｔａｎａ）、クロレラ・ピレノイド（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａ）、ヤツマタモク（Ｓａｒｇａｓｓｕｍ ｐａｔｅｎｓ Ｃ． Ａｇａｒｄｈ）など）、海草（例えば、コンブ）、真菌細胞（例えば、酵母細胞、キノコの細胞）、動物細胞、無脊椎動物（例えば、ミバエ、刺胞動物、棘皮動物、線虫など）の細胞、脊椎動物（例えば、魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳類など）の細胞、哺乳類（ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、齧歯類、ラット、ネズミ、非ヒト霊長類、ヒトなど）の細胞などが挙げられる。細胞は、天然生物に由来しない細胞（例えば、合成的に作られた細胞、しばしば人工細胞と呼ばれることもある）である。
「ヌクレオチド」という用語は、本明細書で使用されるように、一般に、塩基－糖－リン酸の組み合わせを指す。ヌクレオチドは合成ヌクレオチドを含んでいてもよい。ヌクレオチドは合成ヌクレオチドアナログを含んでいてもよい。ヌクレオチドは、核酸配列（例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ））の単量体単位であり得る。ヌクレオチドという用語は、リボヌクレオシド三リン酸アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）、シトシン三リン酸（ＣＴＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、およびデオキシリボヌクレオシド三リン酸、例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＩＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、またはその誘導体を含み得る。そのような誘導体は、例えば、［αＳ］ｄＡＴＰ、７－デアザ－ｄＧＴＰ、および７－デアザ－ｄＡＴＰ、ならびに、それらを含有している核酸分子に対するヌクレアーゼ耐性を与えるヌクレオチド誘導体を含み得る。本明細書に使用されるようなヌクレオチドという用語は、ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰｓ）およびそれらの誘導体を指すこともある。ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸の例示的な例としては、限定されないが、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＩＴＰ、およびｄｄＴＴＰが挙げられ得る。光学的に検出可能な部分（例えば、フルオロフォア）を含む部分を使用するなどして、ヌクレオチドは非標識であり得るか、検出可能なように標識され得る。標識化も量子ドットを用いて行なわれてもよい。検出可能な標識としては、例えば、放射性同位体、蛍光標識、化学発光標識、生物発光標識、および酵素標識が挙げられ得る。ヌクレオチドの蛍光標識は、限定されないが、フルオレセイン、５－カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、２’７’－ジメトキシ－４’５－ジクロロ－６－カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、ローダミン、６－カルボキシルローダミン（Ｒ６Ｇ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチル－６－カルボキシルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、 ６－カルボキシ－Ｘ－ローダミン（ＲＯＸ）、４－（４’ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）、カスケードブルー、オレゴングリーン、テキサスレッド、シアニン、および５－（２’－アミノエチル）アミノナフタレン－１－スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）を含んでもよい。蛍光標識されたヌクレオチドの特定の例は、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， Ｃａｌｉｆ）から利用可能な［Ｒ６Ｇ］ｄＵＴＰ、［ＴＡＭＲＡ］ｄＵＴＰ、［Ｒ１１０］ｄＣＴＰ、［Ｒ６Ｇ］ｄＣＴＰ、［ＴＡＭＲＡ］ｄＣＴＰ、［ＪＯＥ］ｄｄＡＴＰ、［Ｒ６Ｇ］ｄｄＡＴＰ、［ＦＡＭ］ｄｄＣＴＰ、［Ｒ１１０］ｄｄＣＴＰ、［ＴＡＭＲＡ］ｄｄＧＴＰ、［ＲＯＸ］ｄｄＴＴＰ、［ｄＲ６Ｇ］ｄｄＡＴＰ、［ｄＲ１１０］ｄｄＣＴＰ、［ｄＴＡＭＲＡ］ｄｄＧＴＰ、および［ｄＲＯＸ］ｄｄＴＴＰ；Ａｍｅｒｓｈａｍ（Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ， Ｉｌｌ．）から利用可能なＦｌｕｏｒｏＬｉｎｋ ＤｅｏｘｙＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、ＦｌｕｏｒｏＬｉｎｋ Ｃｙ３－ｄＣＴＰ、ＦｌｕｏｒｏＬｉｎｋ Ｃｙ５－ｄＣＴＰ、ＦｌｕｏｒｏＬｉｎｋ Ｆｌｕｏｒ Ｘ－ｄＣＴＰ、ＦｌｕｏｒｏＬｉｎｋ Ｃｙ３－ｄＵＴＰ、およびＦｌｕｏｒｏＬｉｎｋ Ｃｙ５－ｄＵＴＰ；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ（Ｍａｎｎｈｅｉｍ， Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ， Ｉｎｄ．）から利用可能なフルオレセイン－１５－ｄＡＴＰ、フルオレセイン－１２－ｄＵＴＰ、テトラメチル－ローダミン－６－ｄＵＴＰ、ＩＲ７７０－９－ｄＡＴＰ、フルオレセイン－１２－ｄｄＵＴＰ、フルオレセイン－１２－ＵＴＰ、およびフルオレセイン－１５－２’－ｄＡＴＰ；ならびに、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ， Ｏｒｅｇ．）から利用可能な染色体標識されたヌクレオチド、ＢＯＤＩＰＹ－ＦＬ－１４－ＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ－ＦＬ－４－ＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ－ＴＭＲ－１４－ＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ－ＴＭＲ－１４－ｄＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ－ＴＲ－１４－ＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ－ＴＲ－１４－ｄＵＴＰ、カスケードブルー－７－ＵＴＰ、カスケードブルー－７－ｄＵＴＰ、フルオレセイン－１２－ＵＴＰ、フルオレセイン－１２－ｄＵＴＰ、オレゴングリーン ４８８－５－ｄＵＴＰ、ローダミングリーン－５－ＵＴＰ、ローダミングリーン－５－ｄＵＴＰ、テトラメチルローダミン－６－ＵＴＰ、テトラメチルローダミン－６－ｄＵＴＰ、テキサスレッド－５－ＵＴＰ、テキサスレッド－５－ｄＵＴＰ、およびテキサスレッド－１２－ｄＵＴＰを含み得る。ヌクレオチドはさらに化学修飾によって標識またはマークされ得る。化学修飾された単一ヌクレオチドは、ビオチン－ｄＮＴＰであり得る。ビオチン化ｄＮＴＰのいくつかの非限定的な例としては、ビオチン－ｄＡＴＰ（例えば、バイオ－Ｎ６－ｄｄＡＴＰ、ビオチン－１４－ｄＡＴＰ）、ビオチン－ｄＣＴＰ（例えば、ビオチン－１１－ｄＣＴＰ、ビオチン－１４－ｄＣＴＰ）、およびビオチン－ｄＵＴＰ（例えば、ビオチン－１１－ｄＵＴＰ、ビオチン－１６－ｄＵＴＰ、ビオチン－２０－ｄＵＴＰ）を挙げることができる。
「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、および「核酸」という用語は、一般に、一本鎖、二本鎖、または多鎖のいずれかの形態のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、あるいはそれらのアナログの任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を意味するために交換可能に使用される。ポリヌクレオチドは、細胞に対して外来性であっても内因性であってもよい。ポリヌクレオチドは、細胞を含まない環境において存在することができる。ポリヌクレオチドは、遺伝子またはその断片であってもよい。ポリヌクレオチドはＤＮＡであってもよい。ポリヌクレオチドはＲＮＡであってもよい。ポリヌクレオチドは任意の三次元構造を有してもよく、任意の機能を果たしてもよい。ポリヌクレオチドは１つ以上のアナログ（例えば、変化した骨格、糖、または核酸塩基）を含んでいてもよい。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリマーのアセンブリの前または後で与えられ得る。アナログのいくつかの非限定的な例としては、５－ブロモウラシル、ペプチド核酸、ゼノ核酸、モルホリノ、ロックド核酸、グリコール核酸、トレオース核酸、ジデオキシヌクレオチド、コルジセピン、７－デアザ－ＧＴＰ、フルオロフォア（例えば、糖に結合したローダミンまたはフルオレセイン）、チオール含有ヌクレオチド、ビオチン結合ヌクレオチド、蛍光塩基アナログ、ＣｐＧ島、メチル－７－グアノシン、メチル化ヌクレオチド、イノシン、チオウリジン、プソイドウリジン、ジヒドロウリジン、ケオシン、およびワイオシンが挙げられる。ポリヌクレオチドの非限定的な例としては、遺伝子または遺伝子断片のコード領域または非コード領域、連鎖解析から定義される遺伝子座（複数の遺伝子座）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）と無細胞ＲＮＡ（ｃｆＲＮＡ）を含む無細胞ポリヌクレオチド、核酸プローブ、およびプライマーが挙げられる。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド構成要素によって中断されてもよい。
「トランスフェクション」または「トランスフェクトされた」という用語は一般に、非ウイルス性またはウイルスベースの方法による細胞への核酸の導入を意味する。核酸分子は、完全なタンパク質またはその機能的部分をコードする遺伝子配列であってもよい。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， １９８９， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， １８．１－１８．８８を参照。
「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」という用語は、一般に、ペプチド結合によって結合された少なくとも２つのアミノ酸残基のポリマーを指すために、本明細書で互換的に使用される。この用語は、ポリマーの特定の長さを意味するものではなく、ペプチドが組換え技術、化学的または酵素的な合成を使用して生成されたか、あるいは天然に存在するかを示唆または区別することを意図するものでもない。この用語は、天然に存在するアミノ酸ポリマーだけでなく、少なくとも１つの修飾アミノ酸を含むアミノ酸ポリマーにも適用される。場合によっては、ポリマーは非アミノ酸によって中断されてもよい。この用語は、完全長タンパク質を含む任意の長さのアミノ酸鎖、ならびに、二次構造および／または三次構造（例えば、ドメイン）を有するまたは有していないタンパク質を含んでいる。この用語はさらに、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、酸化、および標識成分とのコンジュゲーションなどの任意の他の操作によって修飾されたアミノ酸ポリマーを包含する。「アミノ酸」および「アミノ酸」という用語は一般に、本明細書で使用されるように、限定されないが、修飾アミノ酸およびアミノ酸アナログを含む天然および非天然のアミノ酸を指す。修飾アミノ酸は、アミノ酸上に天然には存在しない基または化学部分を含むように化学修飾された、天然のアミノ酸および非天然のアミノ酸を含み得る。アミノ酸アナログはアミノ酸誘導体を指すこともある。「アミノ酸」という用語は、Ｄ－アミノ酸およびＬ－アミノ酸の両方を含む。
本明細書で使用されるように、「非天然」とは、一般に、天然の核酸またはタンパク質では見られない核酸またはポリペプチドの配列を指すことができる。非天然とはアフィニティタグを指すことがある。非天然とは融合を指すことがある。非天然とは、変異、挿入、および／または欠失を含む天然に存在する核酸またはポリペプチドの配列を指すことがある。非天然配列は、非天然配列が融合された核酸および／またはポリペプチド配列によっても示され得る活性（例えば、酵素活性、メチルトランスフェラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、キナーゼ活性、ユビキチン化活性など）を示すおよび／またはコードすることができる。非天然核酸またはポリペプチド配列は、キメラ核酸および／またはポリペプチドをコードするキメラ核酸および／またはポリペプチド配列を生成するために、遺伝子操作によって天然に存在する核酸またはポリペプチド配列（またはその変異体）に連結され得る。
「プロモーター」という用語は一般に、本明細書で使用されるように、遺伝子の転写または発現を制御し、ＲＮＡ転写が開始されるヌクレオチドまたはヌクレオチドの領域に隣接または重複して配置され得る制御性ＤＮＡ領域を指す。プロモーターは、しばしば転写因子と呼ばれるタンパク質因子に結合する特定のＤＮＡ配列を含むことができ、遺伝子の転写につながるＤＮＡへのＲＮＡポリメラーゼの結合を容易にする。「基本プロモーター」は、「コアプロモーター」とも呼ばれ、一般に、動作可能に連結されたポリヌクレオチドの転写発現を促進するために必要なすべての基本的なエレメントを含むプロモーターを指すことがある。真核生物の基本プロモーターは、必ずしもそうではないが、典型的には、ＴＡＴＡ－ボックスおよび／またはＣＡＡＴボックスを含む。
「発現」という用語は一般に、本明細書で使用されるように、核酸配列またはポリヌクレオチドがＤＮＡ鋳型から（ｍＲＮＡまたは他のＲＮＡ転写物などに）転写されるプロセス、および／または、転写されたｍＲＮＡがその後、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。転写産物およびコードされたポリペプチドはまとめて「遺伝子産物」と呼ばれることがある。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は真核細胞中にｍＲＮＡのスプライシングを含むことがある。
本明細書で使用されるように、「動作可能に連結された」、「動作可能な連結」、「作動可能に連結された」、またはその文法的な同等物は一般に、遺伝要素、例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化配列などの並置を指し、これらのエレメントは、期待される方法で動作することを可能にする関係にある。例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサー配列を含み得る調節エレメントは、調節エレメントがコード配列の転写を開始するのを助ける場合に、コード領域と作動可能に連結される。この機能的関係が維持される限り、調節エレメントとコード領域との間に介在する残基が存在してもよい。
「ベクター」は一般に、本明細書で使用されるように、ポリヌクレオチドを含むか、またはポリヌクレオチドと会合する高分子または高分子の会合を指し、ポリヌクレオチドの細胞への送達を媒介するために使用され得る。ベクターの例としては、プラスミド、ウイルスベクター、リポソーム、および他の遺伝子送達ビヒクルが挙げられる。ベクターは一般に、標的における遺伝子の発現を促進するために遺伝子に作動可能に連結された遺伝要素、例えば、調節エレメントを含む。
本明細書で使用されるように、「発現カセット」および「核酸カセット」は、一緒に発現されるか、または発現のために動作可能に連結される核酸配列または要素の組み合わせを指すために一般的に交換可能に使用される。場合によっては、発現カセットは、調節エレメント、およびそれらが発現のために動作可能に連結されている遺伝子または複数の遺伝子の組み合わせを指す。
ＤＮＡまたはタンパク質配列の「機能的断片」とは一般に、完全長ＤＮＡまたはタンパク質配列の生物学的活性に実質的に類似する生物学的活性（機能的または構造的のいずれか）を保持する断片を指す。ＤＮＡ配列の生物学的活性は、完全長配列に起因することが知られている方法で発現に影響を及ぼすその能力であり得る。
本明細書で使用されるように、「操作された」物体は一般に、その物体がヒトの介入によって改変されたことを示す。非限定的な例によると、核酸は、その配列を、自然界に存在しない配列に変えることによって修飾されてもよい。核酸は、自然界では会合しない核酸にライゲーションすることで修飾されてもよく、ライゲーションした生成物が元の核酸に存在しない機能を有するようになる。操作された核酸は、自然界に存在しない配列で、インビトロで合成されてもよい。タンパク質は、そのアミノ酸配列を、自然界に存在しない配列に変えることによって、修飾されてもよい。操作されたタンパク質は、新しい機能または特性を獲得することがある。「操作された」系は、少なくとも１つの操作された成分を含んでいる。
本明細書で使用されるように、「合成」および「人工」は、天然に存在するヒトタンパク質に対して低い配列同一性（例えば、５０％未満の配列同一性、２５％未満の配列同一性、１０％未満の配列同一性、５％未満の配列同一性、１％未満の配列同一性）を有するタンパク質またはそのドメインを指すために交換可能に使用される。例えば、ＶＰＲおよびＶＰ６４ドメインは、合成のトランス活性化ドメインである。
「ｔｒａｃｒＲＮＡ」または「ｔｒａｃｒ配列」という用語は一般に、本明細書で使用されるように、野生型の例示的なｔｒａｃｒＲＮＡ配列（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｓ．ａｕｒｅｕｓなど、または配列番号＊＿＊からのｔｒａｃｒＲＮＡ）に対して、少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性および／または配列類似性を有する核酸を指すことができる。ｔｒａｃｒＲＮＡは、野生型の例示的なｔｒａｃｒＲＮＡ配列（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｓ．ａｕｒｅｕｓなどに由来するｔｒａｃｒＲＮＡ）に対して最大約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％の配列同一性および／または配列類似性を有する核酸を指すことができる。ｔｒａｃｒＲＮＡは、欠失、挿入、または置換、変異、突然変異、またはキメラなどのヌクレオチド変化を含むことができるｔｒａｃｒＲＮＡの修飾形態を指してもよい。ｔｒａｃｒＲＮＡは、少なくとも６個の連続するヌクレオチドのストレッチにわたって、野生型の例示的なｔｒａｃｒＲＮＡ（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｓ．ａｕｒｅｕｓなどに由来するｔｒａｃｒＲＮＡ）配列に対して少なくとも約６０％同一であり得る核酸を指してもよい。例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、少なくとも６個の連続するヌクレオチドのストレッチにわたって、野生型の例示的なｔｒａｃｒＲＮＡ（例えば、Ｓ． ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｓ．ａｕｒｅｕｓなどに由来するｔｒａｃｒＲＮＡ）配列に対して少なくとも約６０％同一、少なくとも約６５％同一、少なくとも約７０％同一、少なくとも約７５％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一、または１００％同一であり得る。タイプＩＩのｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、隣接するＣＲＩＳＰＲアレイの反復配列の一部と相補性を有する領域を同定することにより、ゲノム配列上で予測することができる。
本明細書で使用されるように、「ガイド核酸」は一般に、別の核酸にハイブリダイズし得る核酸を指すことができる。ガイド核酸はＲＮＡであってもよい。ガイド核酸はＤＮＡであってもよい。ガイド核酸は核酸の配列に部位特異的に結合するようにプログラムされていてもよい。標的とする核酸、すなわち、標的核酸は、ヌクレオチドを含んでもよい。ガイド核酸はヌクレオチドを含んでもよい。標的核酸の一部はガイド核酸の一部に相補的であってもよい。ガイド核酸に相補的であり、ガイド核酸とハイブリダイズする二本鎖の標的ポリヌクレオチドの鎖を、相補鎖と呼ぶことがある。相補鎖に相補的であり、したがってガイド核酸に相補的ではない可能性のある二本鎖標的ポリヌクレオチドの鎖を、非相補鎖と呼ぶことがある。ガイド核酸はポリヌクレオチド鎖を含んでもよく、「シングルガイド核酸」と呼ばれることがある。ガイド核酸は２つのポリヌクレオチド鎖を含んでも良く、「ダブルガイド核酸」と呼ばれることがある。特に指定がない限り、「ガイド核酸」という用語は、シングルガイド核酸およびダブルガイド核酸の両方を指す、包括的なものであってもよい。ガイド核酸は、「核酸標的化セグメント」または「核酸標的化配列」と呼ぶことができるセグメントを含んでもよい。核酸標的化セグメントは、「タンパク質結合セグメント」または「タンパク質結合配列」または「Ｃａｓタンパク質結合セグメント」と呼ぶことがあるサブセグメントを含んでもよい。
２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈における「配列同一性」または「パーセント同一性」という用語は一般に、配列比較アルゴリズムを使用して測定されるように、局所的または全体的な比較ウインドウにわたって最大の対応について比較しておよび整列させたときに、同じであるか、または同じであるアミノ酸残基または核酸を特定の割合で有する２つの（例えば、ペアワイズアライメントにおいて）または複数の（例えば、多重配列アライメントにおいて）配列を指す。ポリペプチド配列の好適な配列比較アルゴリズムとしては、例えば、ワード長（Ｗ）が３、期待値（Ｅ）が１０、および、イグジステンス１１、エクステンション１でのギャップコストを設定するＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスのパラメータを使用して、および３０残基よりも長いポリペプチド配列の条件付き構成スコアマトリックス調整を使用するＢＬＡＳＴＰ；ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ（Ｗ）が２、ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ（Ｅ）が１００００００、３０残基未満の配列に対して、ギャップを開くギャップコストを９、ギャップを拡張するギャップコストを１に設定するＰＡＭ３０スコアリングマトリックスを使用ＢＬＡＳＴＰ（これらは、ｈｔｔｐｓ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖで利用可能なＢＬＡＳＴスイートのＢＬＡＳＴＰのデフォルトパラメータである）、マッチ２、ミスマッチ－１、およびギャップ－１のパラメータを使用するスミス－ウォーターマン相同性検索アルゴリズムのパラメータを使用するＣＬＵＳＴＡＬＷ、デフォルトのパラメータを使用するＭＵＳＣＬＥ、ｒｅｔｒｅｅ：２、ｍａｘｉｔｅｒａｔｉｏｎｓ：１０００のパラメータを使用するＭＡＦＦＴ、デフォルトのパラメータを使用するＮｏｖａｆｏｌｄ、デフォルトのパラメータＨＭＭＥＲ ｈｍｍａｌｉｇｎが挙げられる。
１つ以上の保存的アミノ酸置換を有する、本明細書に記載される酵素のいずれかの変異体変種が本開示に含まれている。そのような保存的置換は、ポリペプチドの三次元構造または機能を破壊することなく、ポリペプチドのアミノ酸配列において行われ得る。保存的置換は、互いに類似する疎水性、極性、およびＲ鎖長を持つアミノ酸を置換することにより達成することができる。さらにまたは代替的に、異なる種からの相同タンパク質の整列させた配列を比較することにより、保存的置換は、コードされたタンパク質の基本機能を変えることなく、種間で変異したアミノ酸残基（例えば、保存されていない残基）を突き止めることにより特定され得る。このような保存的に置換された変異体は、本明細書に記載される系のいずれか１つ（例えば、本明細書に記載されるＭＧ３６またはＭＧ３９系）に対して少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する変異体を含み得る。いくつかの実施形態では、そのような保存的に置換された変異体は、機能的変異体である。そのような機能的変異体は、エンドヌクレアーゼの重要な活性部位残基の活性が破壊されないような置換を有する配列を包含することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される系のいずれかの機能的変異体は、図４と５において呼び出される保存残基または機能的残基のうちの少なくとも１つの置換を欠いている。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される系のいずれかの機能的変異体は、図４および図５において呼び出される保存残基または機能的残基のすべての置換を欠いている。
機能的に類似するアミノ酸を提供する保存的置換表は、様々な文献から入手可能である（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ， Ｐｒｏｔｅｉｎｓ： Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ （Ｗ Ｈ Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．； ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ （Ｄｅｃｅｍｂｅｒ １９９３））を参照。以下の８つのグループは、それぞれ互いに保存的な置換であるアミノ酸を含んでいる。
１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、
４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）、
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）、
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、
７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、および、
８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）。
本明細書で使用されるように、「ＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメイン」という用語は一般に、ＲｕｖＣエンドヌクレアーゼドメイン（ＲｕｖＣヌクレアーゼドメインは、ＲｕｖＣ＿Ｉ、ＲｕｖＣ＿ＩＩ、およびＲｕｖＣ＿ＩＩＩという３つの不連続なセグメントで構成される）の第３の不連続セグメントを指す。ＲｕｖＣドメインまたはそのセグメントは一般に、既知のドメイン配列へのアラインメント、注釈付きドメインを有するタンパク質への構造的アラインメント、または既知のドメイン配列に基づいて構築された隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）（例えば、ＲｕｖＣ＿ＩＩＩに対するＰｆａｍ ＨＭＭ ＰＦ１８５４１）との比較によって特定することができる。
本明細書で使用されるように、「ＨＮＨドメイン」という用語は一般に、特徴的なヒスチジンおよびアスパラギン残基を有するエンドヌクレアーゼドメインを指す。ＨＮＨドメインは一般に、既知のドメイン配列へのアラインメント、注釈付きドメインを有するタンパク質への構造的アラインメント、または既知のドメイン配列に基づいて構築された隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）との比較（例えば、ドメインＨＮＨに対するＰｆａｍ ＨＭＭ ＰＦ０１８４４）により特定することができる。
本明細書で使用されるように、「リコンビナーゼ」という用語は一般に、リコンビナーゼ認識配列間のＤＮＡの組換えを仲介する部位特異的酵素を指し、結果として、リコンビナーゼ認識配列間のＤＮＡ断片の切除、インテグレーション（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）、反転、または交換（例えば、転座）を生じさせる。
本明細書で使用されるように、核酸修飾（例えば、ゲノム修飾）の文脈における「組み替える」または「組換え」という用語は一般に、２つ以上の核酸分子、または単一の核酸分子の２つ以上の領域がリコンビナーゼタンパク質の作用により修飾されるプロセスを指す。組換えは、特に、例えば、１つ以上の核酸分子の中または間の核酸配列の挿入、反転、切除、または転位をもたらし得る。
本明細書で使用されるように、「トランスポゾン」という用語は一般に、可動要素を指し、これは「カーゴＤＮＡ」を伴ってゲノムを出入りする。場合によっては、これらのトランスポゾンは、転位するする核酸の種類、トランスポゾンの末端のリピートの種類、運ばれるカーゴの種類、または転位のモード（すなわち、自己修復または宿主修復）によって異なることがある。本明細書で使用されるように、「トランスポザーゼは一般に、トランスポゾンの末端に結合し、ゲノムの別の部分へのその移動を触媒する酵素を指す。場合によっては、その移動は、カットアンドペースト機構によるものであっても、複製転置によるものであってもよい。
本明細書で使用されるように、「Ｔｎ７」または「Ｔｎ７様トランスポザーゼ」は一般に、３つの主成分：ヘテロメリックトランスポザーゼ（ＴｎｓＡおよび／またはＴｎｓＢ）と調節タンパク質（ＴｎｓＣ）を含むトランスポザーゼのファミリーを指す。ＴｎｓＡＢＣ転位タンパク質に加えて、Ｔｎ７エレメントは専用の標的部位選択タンパク質であるＴｎｓＤとＴｎｓＥをコードすることができる。ＴｎｓＡＢＣに加えて、配列特異的なＤＮＡ結合タンパク質であるＴｎｓＤは、「Ｔｎ７付着部位」（ａｔｔＴｎ７）と呼ばれる保存部位への転位を指示する。ＴｎｓＤは、ＴｎｉＱも含む大きなタンパク質ファミリーのメンバーである。ＴｎｉＱは、プラスミドの分解能部位への転位を標的とすることが示されている。
場合によっては、本明細書に記載されるＣＡＳＴ系は、１つ以上のＴｎ７またはＴｎ７様トランスポザーゼを含んでもよい。特定の例示的な実施形態では、Ｔｎ７またはＴｎ７様トランスポザーゼは、多量体タンパク質複合体を含む。特定の例示的な実施形態では、多量体タンパク質複合体は、ＴｎｓＡ、ＴｎｓＢ、ＴｎｓＣ、またはＴｎｉＱを含む。これらの組み合わせにおいて、トランスポザーゼ（ＴｎｓＡ、ＴｎｓＢ、ＴｎｓＣ、ＴｎｉＱ）は、互いに複合体または融合タンパク質を形成し得る。
本明細書で使用されるように、「Ｃａｓ１２ｋ（代替的に「クラスＩＩ、タイプＶ－Ｋ」）という用語は一般に、ヌクレアーゼ活性に欠陥があることが判明しているタイプＶのＣＲＩＳＰＲ系のサブタイプを指す（例えば、それらは、ＤＮＡ切断に重要な少なくとも一つの触媒残基を欠く少なくとも一つの欠陥ＲｕｖＣドメインを含み得る）。このようなサブタイプのエフェクターは、一般的にＣＡＳＴ系と関連付けられてきた。
本明細書で使用されるように、「タイプＩ－Ｆ」（代替的に、クラスＩ、タイプＩ－ＦのＣＲＩＳＰＲ）という用語は一般に、クラスＩ、タイプＩのＣＲＩＳＰＲ系のサブタイプを指す。このような系は一般に、Ｃａｓ８、Ｃａｓ７、およびＣａｓ６タンパク質を含む多成分ＣＲＩＳＰＲエフェクターを含む。場合によっては、このような系は、ＣＡＳＴ系と関連していることが見出される。場合によっては、タイプＩ－ＦのＣＲＩＳＰＲ系は、Ｃａｓ８および／またはＣａｓ５結合のための８－ｎｔ ５’ハンドル、標的認識のためのＣａｓ７の６コピーによって結合される３２－ｎｔスペーサー、またはＣａｓ６結合とプレｃｒＲＮＡプロセシングのための２０－ｎｔ ３’ヘアピンを含むｃｒＲＮＡを含んでいる。場合によっては、タイプＦの系は、標的結合のために非標的鎖上の５’－ＣＣ ＰＡＭを利用する。
概要
固有の機能性および構造を有する新しいＣａｓ酵素の発見は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）編集技術をさらに破壊し、速度、特異性、機能性、および使いやすさを改善する可能性を提供することができる。微生物およびまさに多種多様な微生物種におけるＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ）（クラスター化され、規則的に間隔が空いた短い回文構造の繰り返し）系の普及が予測されるなか、文献には機能的に特徴づけられたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素は比較的少ない。これは、膨大な数の微生物種が実験室での培養が容易ではないことも理由の一つである。多くの微生物種を代表する自然環境ニッチからのメタゲノム配列決定により、新たなＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の既知数が飛躍的に増加し、新たなオリゴヌクレオチド編集機能の発見を加速する可能性がある。このようなアプローチの有用性を示す最近の例は、２０１６年に天然微生物群集のメタゲノム解析からＣａｓＸ／ＣａｓＹ ＣＲＩＳＰＲ系が発見されたことである。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、微生物における適応免疫系として機能することが記載されているＲＮＡ指向性ヌクレアーゼ複合体である。その自然の文脈では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、ＣＲＩＳＰＲ（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ）オペロンまたは遺伝子座で起こり、これは一般に２つの部分：（ｉ）ＲＮＡベースの標的化エレメントをコードする、同じく短いスペーサー配列で区切られた短い反復配列（３０～４０ｂｐ）のアレイ、および、（ｉｉ）アクセサリータンパク質／酵素と一緒にＲＮＡベースの標的化エレメントによって指向されるヌクレアーゼポリペプチドをコードするＣａｓをコードするＯＲＦを含む。特定の標的核酸配列の効率的なヌクレアーゼ標的化は一般に、（ｉ）標的の最初の６～８個の核酸（標的シード）とｃｒＲＮＡガイドとの間の相補的なハイブリダイゼーション、および、（ｉｉ）標的シードの定義された近傍にプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列が存在すること（ＰＡＭは通常、宿主ゲノム内で一般的に表されない配列である）の両方を必要とする。系の正確な機能と組織に応じて、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は一般的に、共有の機能的特徴と進化的類似性に基づいて、２つのクラス、５つのタイプ、および１６のサブタイプに整理されている（図１参照）。
クラスＩ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、大規模なマルチサブユニットエフェクター複合体を有し、Ｉ、ＩＩＩ、およびＩタイプＶを含む。
タイプＩのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、成分の点で中程度の複雑さを有すると考えられる。タイプＩのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系では、ＲＮＡ標的化エレメントのアレイは、長い前駆体ｃｒＲＮＡ（プレｃｒＲＮＡ）として転写され、これは、リピートエレメントで処理されることで、短い成熟したｃｒＲＮＡを遊離させ、ｃｒＲＮＡはプロトスペーサー－隣接モチーフ（ＰＡＭ）と呼ばれる適切な短いコンセンサス配列が後に続くときに、ヌクレアーゼ複合体を核酸標的に向ける。この処理は、カスケードと呼ばれる大型エンドヌクレアーゼ複合体のエンドリボヌクレアーゼサブユニット（Ｃａｓ６）を介して生じ、この複合体は、ｃｒＲＮＡ指向性ヌクレアーゼ複合体のヌクレアーゼ（Ｃａｓ３）タンパク質成分も含んでいる。Ｃａｓ Ｉヌクレアーゼは主にＤＮＡヌクレアーゼとして機能する。
ＩタイプＩＩのＣＲＩＳＰＲ系は、ＣｓｍまたはＣｍｒタンパク質サブユニットを含むリピート関連ミステリアスタンパク質（ＲＡＭＰ）と並んで、Ｃａｓ１０として知られる中央ヌクレアーゼの存在によって特徴付けられることがある。タイプＩ系と同様に、成熟ｃｒＲＮＡはＣａｓ６様酵素を用いてプレｃｒＲＮＡから処理される。タイプＩおよびタイプＩＩの系とは異なり、ＩタイプＩＩの系は、ＤＮＡ－ＲＮＡ二重鎖（ＲＮＡポリメラーゼのテンプレートとして使用されているＤＮＡ鎖など）を標的として切断すると思われる。
ＩタイプＶのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、高度に減少した大きなサブユニットヌクレアーゼ（ｃｓｆ１）、Ｃａｓ５（ｃｓｆ３）とＣａｓ７（ｃｓｆ２）のグループのＲＡＭＰタンパク質に対する２つの遺伝子、および、場合によっては予測される小さなサブユニットに対する遺伝子からなるエフェクター複合体を有し、このような系は一般的に内因性プラスミド上に存在する。
タイプＩＩのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は一般に、単一ポリペプチドマルチドメインヌクレアーゼエフェクターを有し、タイプＩＩ、タイプＶ、およびタイプＶＩを含む。
タイプＩＩのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は成分の点で最も単純であると考えられている。タイプＩＩのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系では、ＣＲＩＳＰＲアレイの成熟ｃｒＲＮＡへの処理は、特別なエンドヌクレアーゼサブユニットの存在を必要とせず、むしろアレイ反復配列に相補的な領域を有する小さなトランスコードされたｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を必要とする。ｔｒａｃｒＲＮＡは、対応するエフェクターヌクレアーゼ（Ｃａｓ９など）および反復配列の両方と相互作用して前駆体ｄｓＲＮＡ構造を形成し、これは内因性ＲＮＡｓｅ ＩＩＩによって切断されることで、ｔｒａｃｒＲＮＡとｃｒＲＮＡの両方を負荷した成熟エフェクター酵素が生成される。Ｃａｓ ＩＩヌクレアーゼは、ＤＮＡヌクレアーゼとして知られている。タイプ２のエフェクターは一般に、ＲＮａｓｅ Ｈフォールドを採用したＲｕｖＣ様エンドヌクレアーゼドメインと、ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインのフォールド内に挿入された挿入された無関係なＨＮＨヌクレアーゼドメインからなる構造を示す。ＲｕｖＣ様ドメインは標的（例えば、ｃｒＲＮＡの相補体）ＤＮＡ鎖の切断を担い、ＨＮＨドメインは変位したＤＮＡ鎖の切断を担う。
タイプＶのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、ＲｕｖＣ様ドメインを含むタイプＩＩのエフェクターと同様のヌクレアーゼエフェクター（例えば、Ｃａｓ１２）構造を特徴とする。タイプＩＩのと同様に、ほとんどの（すべてではないが）タイプＶのＣＲＩＳＰＲ系は、プレｃｒＲＮＡを成熟ｃｒＲＮＡへと処理するためにｔｒａｃｒＲＮＡを使用する。しかしながら、プレｃｒＲＮＡを切断して複数のｃｒＲＮＡにするためにＲＮＡｓｅ ＩＩＩを必要とするタイプＩＩの系とは異なり、タイプＶの系はプレｃｒＲＮＡを切断するためにエフェクターヌクレアーゼ自体を使用することができる。タイプＩＩのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系のように、タイプＶのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は再度、ＤＮＡヌクレアーゼとして知られている。タイプＩＩのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系とは異なり、いくつかのタイプＶの酵素（例えば、Ｃａｓ１２ａ）は、二本鎖標的配列の最初のｃｒＲＮＡ指向切断によって活性化される強固な一本鎖非特異的デオキシリボヌクレアーゼ活性を有すると思われる。
タイプＶＩのＣＲＩＰＳＲ－Ｃａｓ系は、ＲＮＡガイドされたＲＮＡエンドヌクレアーゼを有する。ＲｕｖＣ様ドメインの代わりに、タイプＶＩの系の単一のポリペプチドエフェクター（例えば、Ｃａｓ１３）は、２つのＨＥＰＮリボヌクレアーゼドメインを含む。タイプＩＩのおよびタイプＶの系とは異なり、タイプＶＩの系も、プレｃｒＲＮＡをｃｒＲＮＡへと処理するためにｔｒａｃｒＲＮＡを必要としないと思われる。しかしながら、タイプＶの系と同様に、いくつかのタイプＶＩの系（例えば、Ｃ２Ｃ２）は、標的ＲＮＡの最初のｃｒＲＮＡ指向性切断によって活性化される強固な一本鎖非特異的ヌクレアーゼ（リボヌクレアーゼ）活性を有すると思われる。
より単純なアーキテクチャであることから、クラスＩＩ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓは、デザイナーヌクレアーゼ／ゲノム編集用途としての操作および開発のために最も広く採用されている。
インビトロでの使用のためのこのような系の初期の適応の１つは、Ｊｉｎｅｋら（Ｓｃｉｅｎｃｅ． ２０１２ Ａｕｇ １７；３３７（６０９６）：８１６－２１。参照により本明細書に完全に組み込まれる）。Ｊｉｎｅｋの研究は、最初に、（ｉ）Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ ＳＦ３７０から単離した組換え発現した、精製された完全長Ｃａｓ９（例えば、クラスＩＩ、タイプＩＩのＣａｓ酵素）、（ｉｉ）切断されることが望ましい標的ＤＮＡ配列に相補的な約２０ｎｔの５’配列と、その後の３’ｔｒａｃｒ結合配列とを有する精製された成熟した約４２ｎｔ ｃｒＲＮＡ（全ｃｒＲＮＡはＴ７プロモーター配列を運ぶ合成ＤＮＡテンプレートからインビトロ転写されている）、（ｉｉｉ）Ｔ７プロモーター配列を運ぶ合成ＤＮＡテンプレートからインビトロ転写された精製ｔｒａｃｒＲＮＡ、および、（ｉｖ）Ｍｇ２＋を含む系を記載していた。Ｊｉｎｅｋは後に、（ｉｉ）のｃｒＲＮＡがリンカー（例えば、ＧＡＡＡ）によって（ｉｉｉ）の５’末端に結合されて、それ自体でＣａｓ９を標的に導くことができる単一の融合合成ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を形成する、改良型の操作された系を説明した（図２の上部パネルと下部パネルを比較）。
参照により本明細書に完全に組み込まれるＭａｌｉら（Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１３ Ｆｅｂ １５； ３３９（６１２１）：８２３－８２６．）はその後、以下：（ｉ）Ｃ末端核局在化配列（例えば、ＳＶ４０ ＮＬＳ）および適切なポリアデニル化シグナル（例えば、ＴＫ ｐＡシグナル）を有する適切な哺乳類プロモーター下でコドン最適化Ｃａｓ９（例えば、クラスＩＩ、タイプＩＩのＣａｓ酵素）をコードするＯＲＦ、および、（ｉｉ）適切なポリメラーゼＩＩＩプロモーター（例えば、Ｕ６プロモーター）下で、ｓｇＲＮＡをコードするＯＲＦ（Ｇで始まる５’配列と、その後の、３’ｔｒａｃｒ結合配列、リンカー、およびｔｒａｃｒＲＮＡ配列に連結した２０ｎｔの相補的標的核酸配列とを有する）をコードするＤＮＡベクターを提供することにより、哺乳動物細胞で使用するためにこの系を適合させた。
トランスポゾンは、ゲノム内の位置を移動することができる可動要素である。そのようなトランスポゾンは、宿主に及ぼす悪影響を制限するために進化してきた。様々な調節メカニズムが、トランスポゾンを低い頻度で維持し、時にはトランスポゾンを様々な細胞プロセスと調整するために使用されている。原核生物のトランスポゾンの中には、宿主に利益をもたらす機能を動員するか、それ以外の方法でエレメントの維持に役立つことができるものもある。特定のトランスポゾンはさらに、標的部位の選択を厳密に制御するメカニズムを進化させた可能性があり、その最も顕著な例がＴｎ７ファミリーである。
トランスポゾンＴｎ７および類似のエレメントは、自然環境において他の適応的な機能をコードしているだけでなく、臨床環境において抗生物質耐性および病原体機能のリザーバーであり得る。例えば、Ｔｎ７系は、重要な宿主遺伝子へのインテグレーションをほぼ完全に回避するメカニズムを進化させたが、宿主細菌間でＴｎ７を移動させることができる移動性プラスミドおよびバクテリオファージを認識することによって、エレメントの分散を最大化させることもできる。
Ｔｎ７およびＴｎ７様エレメントは、挿入する場所と時間を制御することができ、細菌ゲノム内の単一の保存位置への挿入を誘導する１つの経路と、細菌間でエレメントを輸送できる移動性プラスミドへの標的化を最大限にするのに適合していると思われる第２の経路を有する（図３参照）。Ｔｎ７様トランスポゾンとＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系との関連は、トランスポゾンがＣＲＩＳＰＲエフェクターを乗っ取って標的部位にＲループを生成し、プラスミドおよびファージを介してトランスポゾンの拡散を促進した可能性を示唆している。
ＭＧ３６系
１つの態様において、本開示は、カーゴヌクレオチド配列を標的核酸部位に転位させるための系を提供する。この系は第１の二本鎖核酸を含んでもよい。第１の二本鎖核酸は、カーゴヌクレオチド配列を含んでもよく、カーゴヌクレオチド配列がリコンビナーゼ複合体と相互作用するように構成される。系はＣａｓエフェクター複合体を含んでもよい。Ｃａｓエフェクター複合体は、クラスＩＩ、タイプＩＩのＣａｓエフェクター、および標的核酸部位にハイブリダイズするように構成された少なくとも１つの操作されたガイドポリヌクレオチドを含み得る。クラスＩＩ、タイプＩＩのＣａｓエフェクターは、ＲｕｖＣドメインとＨＮＨドメインを含むことができる。系は、リコンビナーゼまたはトランスポザーゼ複合体を含んでもよく、リコンビナーゼまたはトランスポザーゼ複合体はカーゴヌクレオチド配列を標的核酸部位に補充するように構成される。
場合によっては、カーゴヌクレオチド配列は、左側のトランスポザーゼ認識配列に隣接している。場合によっては、カーゴヌクレオチド配列は、右側のトランスポザーゼ認識配列に隣接している。場合によっては、カーゴヌクレオチド配列は、左側のトランスポザーゼ認識配列および右側のトランスポザーゼ認識配列に隣接している。場合によっては、本系は、標的核酸部位を含む第２の二本鎖核酸をさらに含む。場合によっては、本系は、標的核酸部位に隣接するＣａｓエフェクター複合体に適合するＰＡＭ配列をさらに含む。場合によっては、ＰＡＭ配列は、標的核酸部位の３’に位置する。場合によっては、リコンビナーゼまたはトランスポザーゼ複合体は、Ｔｎ７タイプのトランスポザーゼ複合体である。場合によっては、操作されたガイドポリヌクレオチドは、クラスＩＩ、タイプＩＩのＣａｓエフェクターに結合するように構成される。場合によっては、クラスＩＩ、タイプＩＩのＣａｓエフェクターは、配列番号１またはその変異体に対して、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有するポリペプチドを含む。場合によっては、クラスＩＩ、タイプＩＩのＣａｓエフェクターは、配列番号１に対して実質的に同一のポリペプチドを含む。
場合によっては、リコンビナーゼまたはトランスポザーゼ複合体は、配列番号２～５のいずれか１つあるいはその変異体に対して、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含む少なくとも１つのポリペプチドを含む。場合によっては、リコンビナーゼまたはトランスポザーゼ複合体は、配列番号２～５のいずれか１つに対して実質的に同一の配列を含む少なくとも１つのポリペプチドを含む。場合によっては、リコンビナーゼまたはトランスポザーゼ複合体は、配列番号２～５のいずれか１つあるいはその変異体に対して、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含む少なくとも２つのポリペプチドを含む。場合によっては、リコンビナーゼまたはトランスポザーゼ複合体は、配列番号２～５のいずれか１つあるいはその変異体に対して実質的に同一の配列を含む少なくとも２つのポリペプチドを含む。場合によっては、リコンビナーゼまたはトランスポザーゼ複合体は、配列番号２～５のいずれか１つあるいはその変異体に対して、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含む少なくとも３つのポリペプチドを含む。場合によっては、リコンビナーゼまたはトランスポザーゼ複合体は、配列番号２～５のいずれか１つあるいはその変異体に対して実質的に同一の配列を含む少なくとも３つのポリペプチドを含む。場合によっては、リコンビナーゼまたはトランスポザーゼ複合体は、配列番号２～５のいずれか１つあるいはその変異体に対して、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含む少なくとも４つのポリペプチドを含む。場合によっては、リコンビナーゼまたはトランスポザーゼ複合体は、配列番号２～５のいずれか１つあるいはその変異体に対して実質的に同一の配列を含む４つのポリペプチドを含む。場合によっては、リコンビナーゼまたはトランスポザーゼ複合体は、配列番号２のいずれか１つあるいはその変異体に対して、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含むＴｎｓＢ１ポリペプチドを含む。場合によっては、リコンビナーゼまたはトランスポザーゼ複合体は、配列番号２またはその変異体に対して実質的に同一の配列を含むＴｎｓＢ１ポリペプチドを含む。場合によっては、リコンビナーゼまたはトランスポザーゼ複合体は、配列番号３のいずれか１つあるいはその変異体に対して、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含むＴｎｓＢ２ポリペプチドを含む。場合によっては、リコンビナーゼまたはトランスポザーゼ複合体は、配列番号３またはその変異体に対して実質的に同一の配列を含むＴｎｓＢ２ポリペプチドを含む。場合によっては、リコンビナーゼまたはトランスポザーゼ複合体は、配列番号４のいずれか１つあるいはその変異体に対して、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含むＴｎｓＴ１ポリペプチドを含む。場合によっては、リコンビナーゼまたはトランスポザーゼ複合体は、配列番号４またはその変異体に対して実質的に同一の配列を含むＴｎｓＴ１ポリペプチドを含む。場合によっては、リコンビナーゼまたはトランスポザーゼ複合体は、配列番号５のいずれか１つあるいはその変異体に対して、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含むＴｎｓＣポリペプチドを含む。場合によっては、リコンビナーゼまたはトランスポザーゼ複合体は、配列番号５またはその変異体に対して実質的に同一の配列を含むＴｎｓＣポリペプチドを含む。
場合によっては、操作されたガイドポリヌクレオチドは、配列番号１１またはその変異体に対して、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する少なくとも６０～８０個の連続したヌクレオチドを含む配列を含む。
場合によっては、左側のリコンビナーゼ配列は、配列番号１７～１８のいずれか１つあるいはその変異体に対して、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含む。場合によっては、右側のリコンビナーゼ配列は、配列番号１９またはその変異体に対して、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含む。
場合によっては、クラスＩＩ、タイプＩＩのＣａｓエフェクター、およびリコンビナーゼまたはトランスポザーゼ複合体は、約２０キロベース未満、約１５キロベース未満、約１０キロベース未満、または約５キロベース未満を含むポリヌクレオチド配列によってコードされる。
１つの態様において、本開示は、標的ヌクレオチド配列を含む標的核酸部位にカーゴヌクレオチド配列を転位させるための方法を提供し、上記方法は、本明細書に記載される系を細胞内で発現させる工程、または本明細書に記載される系を細胞に導入する工程を含む。
ＭＧ３９系
１つの態様において、本開示は、カーゴヌクレオチド配列を標的核酸部位に転位させるための系を提供する。系は、カーゴヌクレオチド配列を含む第１の二本鎖核酸を含んでもよい。このカーゴヌクレオチド配列は、Ｔｎ７タイプのトランスポザーゼ複合体と相互作用するように構成されてもよい。系はＣａｓエフェクター複合体を含んでもよい。Ｃａｓエフェクター複合体は、クラスＩＩ、タイプＶのＣａｓエフェクター、および標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズするように構成された操作されたガイドポリヌクレオチドを含んでもよい。クラスＩＩ、タイプＶのＣａｓエフェクターは、ＲｕｖＣドメインを含むことができる。系は、Ｃａｓエフェクター複合体に結合するように構成されたＴｎ７タイプのトランスポザーゼ複合体を含んでもよく、Ｔｎ７タイプのトランスポザーゼ複合体はＴｎｓＡサブユニットを含む。
場合によっては、カーゴヌクレオチド配列は、左側のトランスポザーゼ認識配列に隣接している。場合によっては、カーゴヌクレオチド配列は、右側のトランスポザーゼ認識配列に隣接している。場合によっては、カーゴヌクレオチド配列は、左側のトランスポザーゼ認識配列および右側のトランスポザーゼ認識配列に隣接している。場合によっては、本系は、標的核酸部位を含む第２の二本鎖核酸をさらに含む。場合によっては、本系は、標的核酸部位に隣接するＣａｓエフェクター複合体に適合するＰＡＭ配列をさらに含む。場合によっては、ＰＡＭ配列は、標的核酸部位の３’に位置する。
場合によっては、操作されたガイドポリヌクレオチドは、クラスＩＩ、タイプＶのＣａｓエフェクターに結合するように構成される。場合によっては、クラスＩＩ、タイプＶのＣａｓエフェクターは、配列番号５またはその変異体に対して、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含むポリペプチドを含む。場合によっては、クラスＩＩ、タイプＶのＣａｓエフェクターは、配列番号５またはその変異体に対して実質的に同一の配列を含むポリペプチドを含む。場合によっては、ＴｎｓＡサブユニットは、配列番号７またはその変異体に対して、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の同一性を有する配列を有するポリペプチドを含む。場合によっては、ＴｎｓＡサブユニットは、配列番号７またはその変異体に対して実質的に同一の配列を有するポリペプチドを含む。
場合によっては、Ｔｎ７タイプのトランスポザーゼ複合体は、配列番号８～１０のいずれか１つあるいはその変異体に対して、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含む少なくとも１つのポリペプチドを含む。場合によっては、リコンビナーゼまたはトランスポザーゼ複合体は、配列番号８～１０のいずれか１つあるいはその変異体に対して実質的に同一の配列を含む少なくとも１つのポリペプチドを含む。場合によっては、Ｔｎ７タイプのトランスポザーゼ複合体は、配列番号８～１０のいずれか１つあるいはその変異体に対して、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含む少なくとも２つのポリペプチドを含む。場合によっては、Ｔｎ７タイプのトランスポザーゼ複合体は、配列番号８～１０のいずれか１つあるいはその変異体に対して実質的に同一の配列を含む少なくとも２つのポリペプチドを含む。場合によっては、Ｔｎ７タイプのトランスポザーゼ複合体は、配列番号８～１０のいずれか１つあるいはその変異体に対して、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含む少なくとも３つのポリペプチドを含む。場合によっては、Ｔｎ７タイプのトランスポザーゼ複合体は、配列番号８～１０のいずれか１つあるいはその変異体に対して実質的に同一の配列を含む少なくとも３つのポリペプチドを含む。
場合によっては、Ｔｎ７タイプのトランスポザーゼ複合体は、配列番号７のいずれか１つあるいはその変異体に対して、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含むＴｎｓＡポリペプチドを含む。場合によっては、Ｔｎ７タイプのトランスポザーゼ複合体は、配列番号７のいずれか１つあるいはその変異体に対して実質的に同一の配列を含むＴｎｓＡポリペプチドを含む。場合によっては、Ｔｎ７タイプのトランスポザーゼ複合体は、配列番号８のいずれか１つあるいはその変異体に対して、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含むＴｎｓＢポリペプチドを含む。場合によっては、Ｔｎ７タイプのトランスポザーゼ複合体は、配列番号８のいずれか１つあるいはその変異体に対して実質的に同一の配列を含むＴｎｓＢポリペプチドを含む。場合によっては、Ｔｎ７タイプのトランスポザーゼ複合体は、配列番号９のいずれか１つあるいはその変異体に対して、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含むＴｎｓＣポリペプチドを含む。場合によっては、Ｔｎ７タイプのトランスポザーゼ複合体は、配列番号９のいずれか１つあるいはその変異体に対して実質的に同一の配列を含むＴｎｓＣポリペプチドを含む。場合によっては、Ｔｎ７タイプのトランスポザーゼ複合体は、配列番号１０のいずれか１つあるいはその変異体に対して、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含むＴｎｉＱポリペプチドを含む。場合によっては、Ｔｎ７タイプのトランスポザーゼ複合体は、配列番号１０のいずれか１つあるいはその変異体に対して実質的に同一の配列を含むＴｎｉＱポリペプチドを含む。
場合によっては、操作されたガイドポリヌクレオチドは、配列番号１３～１６のいずれか１つあるいはその変異体に対して、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する少なくとも約４６～８０個の連続したヌクレオチドを含む配列を含む。場合によっては、操作されたガイドポリヌクレオチドは、配列番号１３～１６のいずれか１つあるいはその変異体に対して実質的に同一の少なくとも約４６～８０個の連続したヌクレオチドを含む配列を含む。
場合によっては、左側のリコンビナーゼ配列は、配列番号２０またはその変異体に対して、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含む。場合によっては、左側のリコンビナーゼ配列は、配列番号２０またはその変異体に対して実質的に同一の配列を含む。
場合によっては、右側のリコンビナーゼ配列は、配列番号２１またはその変異体に対して、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含む。場合によっては、右側のリコンビナーゼ配列は、配列番号２１またはその変異体に対して実質的に同一の配列を含む。
場合によっては、クラスＩＩ、タイプＶのＣａｓエフェクター、およびＴｎ７タイプのトランスポザーゼ複合体は、約２０キロベース未満、約１５キロベース未満、約１０キロベース未満、または約５キロベース未満を含むポリヌクレオチド配列によってコードされる。
１つの態様において、本開示は、標的ヌクレオチド配列を含む標的核酸部位にカーゴヌクレオチド配列を転位させるための方法を提供し、上記方法は、本明細書に記載される系を細胞内で発現させる工程、または本明細書に記載される系を細胞に導入する工程を含む。
１つの態様において、本開示は、カーゴヌクレオチド配列を標的核酸部位に転位させるための方法を開示し、上記方法は、カーゴヌクレオチド配列を含む第１の二本鎖核酸を、Ｃａｓエフェクター複合体と接触させる工程を含む。Ｃａｓエフェクター複合体は、クラスＩＩ、タイプＩＩのＣａｓエフェクター、および標的核酸部位にハイブリダイズするように構成された少なくとも１つの操作されたガイドポリヌクレオチドを含み得る。方法は、カーゴヌクレオチド配列を含む第１の二本鎖核酸を、カーゴヌクレオチドを標的核酸部位に補充するように構成されたリコンビナーゼまたはトランスポザーゼ複合体と接触させる工程を含み得る。方法は、カーゴヌクレオチド配列を含む第１の二本鎖核酸を、標的核酸部位を含む第２の二本鎖核酸と接触させる工程を含み得る。
場合によっては、カーゴヌクレオチド配列は、左側のトランスポザーゼ認識配列に隣接している。場合によっては、カーゴヌクレオチド配列は、右側のトランスポザーゼ認識配列に隣接している。場合によっては、カーゴヌクレオチド配列は、左側のトランスポザーゼ認識配列および右側のトランスポザーゼ認識配列に隣接している。場合によっては、Ｃａｓエフェクター複合体は、標的核酸部位に隣接するＣａｓエフェクター複合体に適合するＰＡＭ配列をさらに含む。場合によっては、ＰＡＭ配列は、標的核酸部位の３’に位置する。場合によっては、ＰＡＭ配列は、標的核酸部位の５’に位置する。
ＭＧ６４系
１つの態様において、本開示は、カーゴヌクレオチド配列を標的核酸部位に転位させるための系を提供する。系は、カーゴヌクレオチド配列を含む第１の二本鎖核酸を含んでもよい。このカーゴヌクレオチド配列は、Ｔｎ７タイプのトランスポザーゼ複合体と相互作用するように構成されてもよい。系はＣａｓエフェクター複合体を含んでもよい。Ｃａｓエフェクター複合体は、クラスＩＩ、タイプＶのＣａｓエフェクター、および標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズするように構成された操作されたガイドポリヌクレオチドを含んでもよい。系は、Ｃａｓエフェクター複合体に結合するように構成されたＴｎ７タイプのトランスポザーゼ複合体を含んでもよい。クラスＩＩ、タイプＶのＣａｓエフェクターは、ＲｕｖＣドメインを含むことができる。
場合によっては、カーゴヌクレオチド配列は、左側のトランスポザーゼ認識配列に隣接している。場合によっては、カーゴヌクレオチド配列は、右側のトランスポザーゼ認識配列に隣接している。場合によっては、カーゴヌクレオチド配列は、左側のトランスポザーゼ認識配列および右側のトランスポザーゼ認識配列に隣接している。場合によっては、本系は、標的核酸部位を含む第２の二本鎖核酸をさらに含む。場合によっては、本系は、標的核酸部位に隣接するＣａｓエフェクター複合体に適合するＰＡＭ配列をさらに含む。場合によっては、ＰＡＭ配列は、標的核酸部位の３’に位置する。場合によっては、ＰＡＭ配列は、標的核酸部位の５’に位置する。場合によっては、ＰＡＭ配列は、５’－ｎＧＴｎ－３’または５’－ｎＧＴｔ－３’を含む。
場合によっては、操作されたガイドポリヌクレオチドは、クラスＩＩ、タイプＶのＣａｓエフェクターに結合するように構成される。場合によっては、クラスＩＩ、タイプＶのＣａｓエフェクターは、配列番号２２、２６、３０、３４、５５－８９、１０４、または１４７のいずれか１つあるいはその変異体に対して、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含むポリペプチドを含む。場合によっては、クラスＩＩ、タイプＶのＣａｓエフェクターは、配列番号２２、２６、３０、３４、５５～８９、１０４、または１４７のいずれか１つあるいはその変異体に対して実質的に同一の配列を含むポリペプチドを含む。
場合によっては、Ｔｎ７タイプのトランスポザーゼ複合体は、配列番号２３～２５、２７～２９、３１～３３、３５～３７、１０１～１０３、１０５～１０７、または１４８～１５０のいずれか１つあるいはその変異体に対して、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含む少なくとも１つのポリペプチドを含む。場合によっては、リコンビナーゼまたはトランスポザーゼ複合体は、配列番号２３～２５、２７～２９、３１～３３、３５～３７、１０１～１０３、１０５～１０７、または１４８～１５０のいずれか１つあるいはその変異体に対して実質的に同一の配列を含む少なくとも１つのポリペプチドを含む。場合によっては、Ｔｎ７タイプのトランスポザーゼ複合体は、配列番号２３～２５、２７～２９、３１～３３、３５～３７、１０１～１０３、１０５～１０７、または１４８～１５０のいずれか１つあるいはその変異体に対して、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含む少なくとも２つのポリペプチドを含む。場合によっては、Ｔｎ７タイプのトランスポザーゼ複合体は、配列番号２３～２５、２７～２９、３１～３３、３５～３７、１０１～１０３、１０５～１０７、または１４８～１５０のいずれか１つあるいはその変異体に対して実質的に同一の配列を含む少なくとも２つのポリペプチドを含む。場合によっては、Ｔｎ７タイプのトランスポザーゼ複合体は、配列番号２３～２５、２７～２９、３１～３３、３５～３７、１０１～１０３、１０５～１０７、または１４８～１５０のいずれか１つあるいはその変異体に対して、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含む少なくとも３つのポリペプチドを含む。場合によっては、Ｔｎ７タイプのトランスポザーゼ複合体は、配列番号２３～２５、２７～２９、３１～３３、３５～３７、１０１～１０３、１０５～１０７、または１４８～１５０のいずれか１つあるいはその変異体に対して実質的に同一の配列を含む少なくとも３つのポリペプチドを含む。
場合によっては、Ｔｎ７タイプのトランスポザーゼ複合体は、配列番号２３～２５、２７～２９、３１～３３、３５～３７、１０１～１０３、１０５～１０７、または１４８～１５０のいずれか１つあるいはその変異体に対して、それぞれ、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含むＴｎｓＢ、ＴｎｓＣ、およびＴｎｉＱのポリペプチドを含む。場合によっては、Ｔｎ７タイプのトランスポザーゼ複合体は、配列番号８のいずれか１つあるいはその変異体に対して実質的に同一の配列を含むＴｎｓＢポリペプチドを含む。場合によっては、Ｔｎ７タイプのトランスポザーゼ複合体は、配列番号２３～２５、２７～２９、３１～３３、３５～３７、１０１～１０３、１０５～１０７、または１４８～１５０のいずれか１つあるいはその変異体に対して、それぞれ、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含むＴｎｓＢ、ＴｎｓＣ、およびＴｎｉＱのポリペプチドを含む。
場合によっては、操作されたガイドポリヌクレオチドは、配列番号９０、９１、９２、９３、１１７、１５１、１５６～１８１、または２０９～２３４のいずれか１つあるいはその変異体に対して、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する少なくとも約４６～８０個の連続したヌクレオチドを含む配列を含む。場合によっては、操作されたガイドポリヌクレオチドは、配列番号９０、９１、９２、９３、１１７、１５１、１５６～１８１、または２０９～２３４のいずれか１つあるいはその変異体に対して実質的に同一の少なくとも約４６～８０個の連続したヌクレオチドを含む配列を含む。
場合によっては、操作されたガイドポリヌクレオチドは、配列番号１１１～１１４または２０１～２０４のいずれか１つあるいはその変異体の非縮重ヌクレオチドに対して、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含む。場合によっては、操作されたガイドポリヌクレオチドは、配列番号１１１～１１４または２０１～２０４のいずれか１つあるいはその変異体の非縮重ヌクレオチドに対して実質的に同一の少なくとも約４６～８０個の連続したヌクレオチドを含む配列を含む。
場合によっては、左側のリコンビナーゼ配列は、配列番号１２５、１２７、１２３、１２９、１３１、１３３、１５３、または１３４のいずれか１つあるいはその変異体に対して、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含む。場合によっては、前記左側のリコンビナーゼ配列は、配列番号１２５、１２７、１２３、１２９、１３１、１３３、１５３、または１３４のいずれか１つあるいはその変異体に対して実質的に同一の配列を含む。
場合によっては、右側のリコンビナーゼ配列は、配列番号１２６、１５５、１２８、１２４、１３０、１３２、または１５４のいずれか１つあるいはその変異体に対して、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含む。場合によっては、右側のリコンビナーゼ配列は、配列番号１２６、１５５、１２８、１２４、１３０、１３２、または１５４のいずれか１つあるいはその変異体に対して実質的に同一の配列を含む。
場合によっては、クラスＩＩ、タイプＶのＣａｓエフェクター、およびＴｎ７タイプのトランスポザーゼ複合体は、約２０キロベース未満、約１５キロベース未満、約１０キロベース未満、または約５キロベース未満を含むポリヌクレオチド配列によってコードされる。
ＭＧ１０８系
１つの態様において、本開示は、カーゴヌクレオチド配列を標的核酸部位に転位させるための系を提供する。系は、カーゴヌクレオチド配列を含む第１の二本鎖核酸を含んでもよい。このカーゴヌクレオチド配列は、Ｔｎ７タイプのトランスポザーゼ複合体と相互作用するように構成されてもよい。系はＣａｓエフェクター複合体を含んでもよい。Ｃａｓエフェクター複合体は、クラスＩＩ、タイプＶのＣａｓエフェクター、および標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズするように構成された操作されたガイドポリヌクレオチドを含んでもよい。クラスＩＩ、タイプＶのＣａｓエフェクターは、ＲｕｖＣドメインを含むことができる。系は、Ｃａｓエフェクター複合体に結合するように構成されたＴｎ７タイプのトランスポザーゼ複合体を含んでもよい。場合によっては、Ｔｎ７タイプのトランスポザーゼ複合体は、ＴｎｓＢおよびＴｎｓＣの成分を含むが、ＴｎｓＡおよび／またはＴｎｉＱの成分を含まない。
場合によっては、カーゴヌクレオチド配列は、左側のトランスポザーゼ認識配列に隣接している。場合によっては、カーゴヌクレオチド配列は、右側のトランスポザーゼ認識配列に隣接している。場合によっては、カーゴヌクレオチド配列は、左側のトランスポザーゼ認識配列および右側のトランスポザーゼ認識配列に隣接している。場合によっては、本系は、標的核酸部位を含む第２の二本鎖核酸をさらに含む。場合によっては、本系は、標的核酸部位に隣接するＣａｓエフェクター複合体に適合するＰＡＭ配列をさらに含む。場合によっては、ＰＡＭ配列は、標的核酸部位の３’に位置する。場合によっては、ＰＡＭ配列は、標的核酸部位の５’に位置する。
場合によっては、操作されたガイドポリヌクレオチドは、クラスＩＩ、タイプＶのＣａｓエフェクターに結合するように構成される。場合によっては、クラスＩＩ、タイプＶのＣａｓエフェクターは、配列番号３８または配列番号１０８あるいはその変異体に対して、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含むポリペプチドを含む。場合によっては、クラスＩＩ、タイプＶのＣａｓエフェクターは、配列番号３８または配列番号１０８あるいはその変異体に対して実質的に同一の配列を含むポリペプチドを含む。
場合によっては、Ｔｎ７タイプのトランスポザーゼ複合体は、配列番号３９～４０または１０９～１１０のいずれか１つあるいはその変異体に対して、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含む少なくとも１つのポリペプチドを含む。場合によっては、リコンビナーゼまたはトランスポザーゼ複合体は、配列番号３９～４０または１０９～１１０のいずれか１つあるいはその変異体に対して実質的に同一の配列を含む少なくとも１つのポリペプチドを含む。場合によっては、Ｔｎ７タイプのトランスポザーゼ複合体は、配列番号３９～４０または１０９～１１０のいずれか１つあるいはその変異体に対して、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含む少なくとも２つのポリペプチドを含む。場合によっては、Ｔｎ７タイプのトランスポザーゼ複合体は、配列番号３９～４０または１０９～１１０のいずれか１つあるいはその変異体に対して実質的に同一の配列を含む少なくとも２つのポリペプチドを含む。場合によっては、Ｔｎ７タイプのトランスポザーゼ複合体は、配列番号３９～４０または１０９～１１０のいずれか１つあるいはその変異体に対して、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含む少なくとも３つのポリペプチドを含む。場合によっては、Ｔｎ７タイプのトランスポザーゼ複合体は、配列番号３９～４０または１０９～１１０のいずれか１つあるいはその変異体に対して実質的に同一の配列を含む少なくとも３つのポリペプチドを含む。
場合によっては、Ｔｎ７タイプのトランスポザーゼ複合体は、配列番号４０または１０９のいずれか１つあるいはその変異体に対して、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含むＴｎｓＢ成分を含む。場合によっては、リコンビナーゼまたはトランスポザーゼ複合体は、配列番号４０または１０９のいずれか１つあるいはその変異体に対して実質的に同一の配列を含むＴｎｓＢ成分を含む。
場合によっては、Ｔｎ７タイプのトランスポザーゼ複合体は、配列番号３９または１１０あるいはその変異体に対して、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含むＴｎｓＣ成分を含む。場合によっては、リコンビナーゼまたはトランスポザーゼ複合体は、配列番号３９または１１０のいずれか１つあるいはその変異体に対して実質的に同一の配列を含むＴｎｓＣ成分を含む。
場合によっては、Ｔｎ７タイプのトランスポザーゼ複合体は、配列番号４０と３９または１０９と１１０あるいはその変異体に対して、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含むＴｎｓＢおよびＴｎｓＣの成分を含む。場合によっては、リコンビナーゼまたはトランスポザーゼ複合体は、配列番号４０と３９または１０９と１１０のいずれか１つあるいはその変異体に対して実質的に同一の配列を含むＴｎｓＢおよびＴｎｓＣの成分を含む。
場合によっては、操作されたガイドポリヌクレオチドは、配列番号１１８、１８２、１８３、２３５、または２３６のいずれか１つあるいはその変異体に対して、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する少なくとも約４６～８０個の連続したヌクレオチドを含む配列を含む。場合によっては、操作されたガイドポリヌクレオチドは、配列番号１１８、１８２、１８３、２３５、または２３６のいずれか１つあるいはその変異体に対して実質的に同一の少なくとも約４６～８０個の連続したヌクレオチドを含む配列を含む。
場合によっては、操作されたガイドポリヌクレオチドは、配列番号１１５、１１６、２０５、または２０６のいずれか１つあるいはその変異体の非縮重ヌクレオチドに対して、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含む。場合によっては、操作されたガイドポリヌクレオチドは、配列番号１１５、１１６、２０５、または２０６のいずれか１つあるいはその変異体の非縮重ヌクレオチドに対して実質的に同一の少なくとも約４６～８０個の連続したヌクレオチドを含む配列を含む。
場合によっては、左側のリコンビナーゼ配列は、配列番号１３４またはその変異体に対して、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含む。場合によっては、左側のリコンビナーゼ配列は、配列番号１３４またはその変異体に対して実質的に同一の配列を含む。
場合によっては、右側のリコンビナーゼ配列は、配列番号１３５またはその変異体に対して、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含む。場合によっては、右側のリコンビナーゼ配列は、配列番号１３５またはその変異体に対して実質的に同一の配列を含む。
場合によっては、クラスＩＩ、タイプＶのＣａｓエフェクター、およびＴｎ７タイプのトランスポザーゼ複合体は、約２０キロベース未満、約１５キロベース未満、約１０キロベース未満、または約５キロベース未満を含むポリヌクレオチド配列によってコードされる。
ＭＧ１１０系
１つの態様において、本開示は、カーゴヌクレオチド配列を標的核酸部位に転位させるための系を提供する。系は、カーゴヌクレオチド配列を含む第１の二本鎖核酸を含んでもよい。このカーゴヌクレオチド配列は、Ｔｎ７タイプのトランスポザーゼ複合体と相互作用するように構成されてもよい。系はＣａｓエフェクター複合体を含んでもよい。Ｃａｓエフェクター複合体は、クラスＩ、タイプＩのＣａｓエフェクター、および標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズするように構成された操作されたガイドポリヌクレオチドを含んでもよい。系は、Ｃａｓエフェクター複合体に結合するように構成されたＴｎ７タイプのトランスポザーゼ複合体を含んでもよい。
場合によっては、カーゴヌクレオチド配列は、左側のトランスポザーゼ認識配列に隣接している。場合によっては、カーゴヌクレオチド配列は、右側のトランスポザーゼ認識配列に隣接している。場合によっては、カーゴヌクレオチド配列は、左側のトランスポザーゼ認識配列および右側のトランスポザーゼ認識配列に隣接している。場合によっては、本系は、標的核酸部位を含む第２の二本鎖核酸をさらに含む。場合によっては、本系は、標的核酸部位に隣接するＣａｓエフェクター複合体に適合するＰＡＭ配列をさらに含む。場合によっては、ＰＡＭ配列は、標的核酸部位の３’に位置する。
場合によっては、操作されたガイドポリヌクレオチドは、クラスＩ、タイプＩのＣａｓエフェクターに結合するように構成される。場合によっては、クラスＩ、タイプＩのＣａｓエフェクターは、配列番号４１～４３または４８～５０のいずれか１つあるいはその変異体に対して、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含むポリペプチドを含む。場合によっては、クラスＩ、タイプＩのＣａｓエフェクターは、配列番号４１～４３または４８～５０のいずれか１つあるいはその変異体に対して実質的に同一の配列を含むポリペプチドを含む。
場合によっては、操作されたガイドポリヌクレオチドは、クラスＩ、タイプＩのＣａｓエフェクターに結合するように構成される。場合によっては、クラスＩ、タイプＩのＣａｓエフェクターは、配列番号４１～４３または４８～５０のいずれか１つあるいはその変異体に対して、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含むＣａｓ６、Ｃａｓ７、およびＣａｓ８のエフェクターを含む。場合によっては、クラスＩ、タイプＩのＣａｓエフェクターは、配列番号４１～４３または４８～５０のいずれか１つあるいはその変異体に対して実質的に同一の配列を含むＣａｓ６、Ｃａｓ７、およびＣａｓ８のエフェクターを含む。
場合によっては、Ｔｎ７タイプのトランスポザーゼ複合体は、配列番号４４～４７または５１～５４のいずれか１つあるいはその変異体に対して、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含む少なくとも１つのポリペプチドを含む。場合によっては、リコンビナーゼまたはトランスポザーゼ複合体は、配列番号４４～４７または５１～５４のいずれか１つあるいはその変異体に対して実質的に同一の配列を含む少なくとも１つのポリペプチドを含む。場合によっては、Ｔｎ７タイプのトランスポザーゼ複合体は、配列番号４４～４７または５１～５４のいずれか１つあるいはその変異体に対して、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含む少なくとも２つのポリペプチドを含む。場合によっては、Ｔｎ７タイプのトランスポザーゼ複合体は、配列番号４４～４７または５１～５４のいずれか１つあるいはその変異体に対して実質的に同一の配列を含む少なくとも２つのポリペプチドを含む。場合によっては、Ｔｎ７タイプのトランスポザーゼ複合体は、配列番号４４～４７または５１～５４のいずれか１つあるいはその変異体に対して、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含む少なくとも３つのポリペプチドを含む。場合によっては、Ｔｎ７タイプのトランスポザーゼ複合体は、配列番号４４～４７または５１～５４のいずれか１つあるいはその変異体に対して実質的に同一の配列を含む少なくとも３つのポリペプチドを含む。場合によっては、Ｔｎ７タイプのトランスポザーゼ複合体は、配列番号４４～４７または５１～５４のいずれか１つあるいはその変異体に対して、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含む４つのポリペプチドを含む。場合によっては、Ｔｎ７タイプのトランスポザーゼ複合体は、配列番号４４～４７または５１～５４のいずれか１つあるいはその変異体に対して実質的に同一の配列を含む４つのポリペプチドを含む。
場合によっては、Ｔｎ７タイプのトランスポザーゼ複合体は、配列番号４４～４７または５１～５４のいずれか１つあるいはその変異体に対して、それぞれ少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含むＴｎｓＡ、ＴｎｓＢ、ＴｎｓＣ、およびＴｎｉＱの成分を含む。
場合によっては、操作されたガイドポリヌクレオチドは、配列番号１２１、１２２、２０７、または２０８のいずれか１つあるいはその変異体の非縮重ヌクレオチドに対して、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含む。場合によっては、操作されたガイドポリヌクレオチドは、配列番号１２１、１２２、２０７、または２０８のいずれか１つあるいはその変異体の非縮重ヌクレオチドに対して実質的に同一の少なくとも約４６～８０個の連続したヌクレオチドを含む配列を含む。
場合によっては、左側のリコンビナーゼ配列は、配列番号１３６または１３８あるいはその変異体に対して、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含む。場合によっては、左側のリコンビナーゼ配列は、配列番号１３６または１３８あるいはその変異体に対して実質的に同一の配列を含む。
場合によっては、右側のリコンビナーゼ配列は、配列番号１３７または１３８あるいはその変異体に対して、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含む。場合によっては、右側のリコンビナーゼ配列は、配列番号１３７または１３９あるいはその変異体に対して実質的に同一の配列を含む。
場合によっては、クラスＩ、タイプＩのＣａｓエフェクター、およびＴｎ７タイプのトランスポザーゼ複合体は、約２０キロベース未満、約１５キロベース未満、約１０キロベース未満、または約５キロベース未満を含むポリヌクレオチド配列によってコードされる。
１つの態様において、本開示は、標的ヌクレオチド配列を含む標的核酸部位にカーゴヌクレオチド配列を転位させるための方法を提供し、上記方法は、本明細書に記載される系を細胞内で発現させる工程、または本明細書に記載される系を細胞に導入する工程を含む。
ＩＵＰＡＣ協定に合わせて、以下の略語が実施例にわたって使用される。
Ａ＝アデニン
Ｃ＝シトシン
Ｇ＝グアニン
Ｔ＝チミン
Ｒ＝アデニンまたはグアニン
Ｙ＝シトシンまたはチミン
Ｓ＝グアニンまたはシトシン
Ｗ＝アデニンまたはチミン
Ｋ＝グアニンまたはチミン
Ｍ＝アデニンまたはシトシン
Ｂ＝Ｃ、Ｇ、またはＴ
Ｄ＝Ａ、Ｇ、またはＴ
Ｈ＝Ａ、Ｃ、またはＴ
Ｖ＝Ａ、Ｃ、またはＧ
実施例１－（一般的なプロトコル）本明細書に記載される系のためのＰＡＭ配列の同定／確認
推定上のエンドヌクレアーゼを、大腸菌溶解液ベースの発現系（ｍｙＴＸＴＬ、Ａｒｂｏｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）において発現させた。ＰＡＭ配列は、推定上のヌクレアーゼによって切断され得るランダムに生成された潜在的なＰＡＭ配列を含むプラスミドを配列決定することによって決定された。この系では、推定ヌクレアーゼをコードする大腸菌コドン最適化ヌクレオチド配列が、Ｔ７プロモーターの制御下でＰＣＲ断片からインビトロで転写および翻訳された。Ｔ７プロモーターと、その後のリピート－スペーサー－リピート配列で構成される最小限のＣＲＩＳＰＲアレイを有する第２のＰＣＲ断片も、同じ反応で転写された。ＴＸＴＬ系におけるエンドヌクレアーゼとリピート－スペーサー－リピート配列の発現の成功と、その後のＣＲＩＳＰＲアレイプロセシングとにより、活性なインビトロのＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ複合体を得た。
８Ｎの混合塩基（潜在的なＰＡＭ配列）が先行している最小限のアレイのスペーサー配列と一致するスペーサー配列を含有する標的プラスミドのライブラリーは、ＴＸＴＬ反応の産出量でインキュベートされた。１～３時間後、反応を停止させ、ＤＮＡクリーンアップキット、例えば、Ｚｙｍｏ ＤＣＣ、ＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズ、ＱｉａＱｕｉｃｋなどを用いてＤＮＡを回収した。アダプター配列は、エンドヌクレアーゼによって切断された活性なＰＡＭ配列を有するＤＮＡに平滑末端ライゲーションされたが、切断されなかったＤＮＡはライゲーションにはアクセス不可能である。その後、活性なＰＡＭ配列を含むＤＮＡセグメントを、ライブラリーとアダプター配列に特異的なプライマーを用いてＰＣＲで増幅した。ＰＣＲ増幅産物をゲル上で分解し、切断イベントに対応するアンプリコンを同定した。また、切断反応の増幅セグメントは、ＮＧＳライブラリーの調製のためのテンプレートとして、またはサンガーシーケンシングのための基剤として使用された。出発８Ｎライブラリーのサブセットであるこの得られたライブラリーを配列決定することで、ＣＲＩＳＰＲ複合体に適合するＰＡＭ活性を有する配列が明らかになった。プロセシングされたＲＮＡ構築物を用いたＰＡＭ試験については、インビトロで転写されたＲＮＡがプラスミドライブラリーとともに加えられ、最小限のＣＲＩＳＰＲアレイテンプレートが省略されることを除けば、同じ手順を繰り返した。
結合コンピテントであるがヌクレアーゼが欠損しているエンドヌクレアーゼについては、上記の手順の修正によりＰＡＭを決定した。ＴＸＴＬで発現させた後、ｓｇＲＮＡまたはｃｒＲＮＡおよびＰＡＭライブラリーを加えた。ｓｇＲＮＡ依存的にエフェクターがスペーサー配列に結合すると、スペーサー配列はエフェクタータンパク質内に封じ込められた。スペーサー配列内を標的とする適切な制限酵素を加え、ライブラリー内の保護されていないプラスミドをすべて切断した。ＰＡＭを含むライブラリーの切断されていない（エンドヌクレアーゼ結合）メンバーは、ＰＣＲとその後のバンドのＮＧＳライブラリー調製によって同定された。
実施例２－インビトロ標的化インテグラーゼ活性
インテグラーゼ活性は、以前に同定されたＰＡＭを用いて優先的にアッセイされたが、その代わりに、ＰＡＭライブラリー基質を用いて低効率で実施されることがある。インビトロ試験のための成分の１つの配置は、ドナー配列を含むもの以外の３つのプラスミドを含んでいた：（１）Ｔ７プロモーター下のエフェクター（または複数のエフェクター）を有する発現プラスミド、（２）Ｔ７プロモーター下のインテグラーゼ遺伝子を有する発現プラスミド；ｓｇＲＮＡまたはｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ、（３）スペーサー部位と適切なＰＡＭを含んでいた標的プラスミド、（４）カーゴ遺伝子（例えば、Ｔｅｔ耐性遺伝子などの選択マーカー）の周りでの転位のために必要な左端（ＬＥ）および右端（ＲＥ）のＤＮＡ配列を含んでいたドナープラスミド。インビトロ転写／翻訳（ＴＸＴＬ）系（例えば、大腸菌溶解液ベースまたは網状赤血球抽出液ベースの系）を使用して、エフェクターおよびインテグラーゼ遺伝子を発現させた。発現後、ＲＮＡ、標的ＤＮＡ、およびドナーＤＮＡを加え、インキュベートすることで、転位が起こるようにした。標的ＤＮＡに１つのプライマー、ドナーＤＮＡに１つのプライマーの状態で、インテグラーゼ部位の接合部においてＰＣＲで転位を検出した。得られたＰＣＲ産物をＮＧＳで配列決定し、ｓｇＲＮＡ／ｃｒＲＮＡ標的部位に対する正確な挿入トポロジーを決定した。プライマーは、様々な挿入部位に対応および検出できるように、下流に配置された。プライマーは、インテグレーションの配向が当初不明であったため、カーゴの配向またはスペーサーのいずれかの側でインテグレーションが検出されるように設計された。
インテグレーション効率は、インテグレーションされたカーゴを有する標的ＤＮＡの実験的出力の定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）測定により測定され、同じくｑＰＣＲにより測定された未修飾の標的ＤＮＡの量に対して正規化された。
このアッセイは、溶解物ベースの発現からではなく、精製されたタンパク質成分で実施することができる。この場合、タンパク質は、Ｔ７誘導性プロモーター下で、大腸菌プロテアーゼ欠損Ｂ株で発現され、超音波処理を用いて細胞を溶解し、ＡＫＴＡ Ａｖａｎｔ ＦＰＬＣ（ＧＥ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅ）上でＨｉｓＴｒａｐ ＦＦ（ＧＥ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅ）Ｎｉ－ＮＴＡ親和性クロマトグラフィーを用いて、関心対象のＨｉｓタグ付けタンパク質を精製した。純度は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびＩｎｓｔａｎｔＢｌｕｅ Ｕｌｔｒａｆａｓｔ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）クマシー染色アクリルアミドゲル（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）上で分離したタンパク質バンドのＩｍａｇｅＬａｂソフトウェア（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）のデンシトメトリーを用いて決定された。タンパク質を、５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、３００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＴＣＥＰ、５％のグリセロール、ｐＨ７．５で構成された貯蔵バッファー（または最大限の安定性を得るために決定された他のバッファー）で脱塩し、－８０℃で保存した。精製後、エフェクターとインテグラーゼを、反応バッファー、例えば、２６ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、４．２ｍＭのＴＲＩＳ ｐＨ８、５０μｇ／ｍＬのＢＳＡ、２ｍＭのＡＴＰ、２．１ｍＭのＤＴＴ、０．０５ｍＭのＥＤＴＡ、０．２ｍＭのＭｇＣｌ２、２８ｍＭのＮａＣｌ、２１ｍＭのＫＣｌ、１．３５％グリセロール（最終ｐＨ７．５）に１５ｍＭのＭｇ（ＯＡｃ）２を補充したものにおいて、上記のようにｓｇＲＮＡ、標的ＤＮＡ、およびドナーＤＮＡに加えた。
実施例３－予測されるＲＮＡフォールディング
活性な単一ＲＮＡ配列の予測されるＲＮＡフォールディングは、Ａｎｄｒｏｎｅｓｃｕ ２００７の方法を用いて３７°で計算された。すべてのヘアピンループ二次構造を、構造から単独で欠失させ、より小さいシングルガイドに繰り返しコンパイルした。第２のアプローチでは、ＭＧ６４－１のｔｒａｃｒＲＮＡを既知のタイプＶ－ｋのｔｒａｃｒＲＮＡに整列させ、固有の挿入領域をシングルガイドから変異させ、５７塩基最小化した。図１２Ａは、ＭＧ６４－２ ｓｇＲＮＡ（配列番号２０２）の予測される構造を描いている。図１２Ｂは、ＭＧ６４－４ ｓｇＲＮＡ（配列番号２０３）の予測される構造を描いている。図１２Ｃは、ＭＧ６４－６ ｓｇＲＮＡ（配列番号２０１）の予測される構造を描いている。図１２Ｄは、ＭＧ６４－７ ｓｇＲＮＡ（配列番号２０４）の予測される構造を描いている。図１２Ｅは、ＭＧ１０８－１ ｓｇＲＮＡ（配列番号２０６）の予測される構造を描いている。塩基の濃淡は、その塩基の塩基ペアリングの確率に対応する。
実施例４－ゲルシフトによるトランスポゾン末端の検証
トランスポゾン末端は、電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）を介してＴｎｓＢ結合について試験された。この場合、潜在的なＬＥまたはＲＥは、ＤＮＡ断片（１００～５００ｂｐ）として合成され、ＦＡＭで標識されたプライマーを用いたＰＣＲを介してＦＡＭで末端標識された。ＴｎｓＢタンパク質を、インビトロ転写／翻訳系（例えば、ＰＵＲＥｘｐｒｅｓｓ）で合成した。合成後、１μＬのＴｎｓＢタンパク質を、結合バッファー（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ ７．５、２．５ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ ７．５、１０ｍＭのＮａＣｌ、０．０６２５ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭのＴＣＥＰ、０．００５％のＢＳＡ、１ｕｇ／ｍＬのポリ（ｄＩ－ｄＣ）、および５％グリセロール）中の１０μＬ反応中の５０ｎＭの標識されたＲＥまたはＬＥに加えた。結合を３０°で４０分間インキュベートした後、２ｕＬの６Ｘローディングバッファー（６０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ７，６、５０％グリセロール）を添加した。結合反応を５％ＴＢＥゲルで分離し、可視化した。ＴｎｓＢの存在下でのＬＥまたはＲＥのシフトは、結合の成功に起因するものであり、トランスポザーゼ活性を示した。
図１５は、この実験の一例を示しており、ＭＧ６４－２のＲＥ ＤＮＡ配列（例えば、配列番号１５５）を上記の手順によりＦＡＭで末端標識し、対応するＭＧ６４－２ ＴｎｓＢ様成分（例えば、配列番号２３）とインキュベートした。レーン３の標識バンドのアップシフトは、ＴｎｓＢによるＲＥ配列の結合を示し、それが活性なＲＥ転位配列を含んでいることを示唆している。
実施例５－大腸菌におけるインテグラーゼ活性（予測的）
大腸菌はゲノムの二本鎖ＤＮＡ切断を効率的に修復する能力を欠いているため、大腸菌ゲノムにおいて二本鎖切断を引き起こすことができる薬剤による大腸菌の形質転換は、細胞死を引き起こす。この現象を利用して、エンドヌクレアーゼまたはエフェクター支援インテグラーゼ活性は、そのゲノムＤＮＡに組み込まれたスペーサー／標的およびＰＡＭ配列を有する標的株において、エンドヌクレアーゼまたはエフェクター支援インテグラーゼとガイドＲＮＡ（例えば、実施例３のように決定される）のいずれかを組換え発現させることによって大腸菌において試験される。
その後、操作した株を、シングルガイドＲＮＡを有するヌクレアーゼまたはエフェクターを含むプラスミド、インテグラーゼとアクセサリー遺伝子を発現するプラスミド、および左端（ＬＥ）と右端（ＲＥ）トランスポゾンモチーフに隣接している選択可能マーカーを有する温度感受性複製起点を含むプラスミドで形質転換して組み込む。これらの遺伝子の発現のために誘導された形質転換体を、プラスミド複製のための制限温度での選択によってゲノム標的へのマーカーの導入についてスクリーニングし、ゲノムへのマーカーのインテグレーションをＰＣＲによって確認する。
オフターゲットのインテグレーションは、不偏的なアプローチを用いてスクリーニングされる。簡潔に言えば、精製したｇＤＮＡをＴｎ５インテグラーゼまたはせん断により断片化し、その後、関心対象のＤＮＡを、ライゲーションしたアダプターおよび選択可能マーカーに特異的なプライマーを用いてＰＣＲ増幅する。その後、アンプリコンをＮＧＳシーケンシング用に調製する。得られた配列の解析は、トランスポゾン配列をトリミングし、フランキング配列をゲノムにマッピングして挿入位置を決定し、オフターゲット挿入率を決定する。
実施例６－トランスポザーゼ活性のコロニーＰＣＲスクリーニング（予測的）
細菌細胞におけるヌクレアーゼまたはエフェクター支援インテグラーゼ活性の試験のために、ＭＧ６４＿１に特異的な標的および対応するＰＡＭ配列を含むように操作されたＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌細胞から、ＭＧＢ００３２株を構築する。その後、ＭＧＢ００３２大腸菌細胞を、ｐＪＬ５６（ＭＧ６４＿１エフェクターおよびヘルパーの組み合わせを発現するプラスミド、アンピシリン耐性）と、Ｔ７プロモーターによって駆動される操作された関心対象標的のシングルガイドＲＮＡ配列を発現するクロラムフェニコール耐性プラスミドであるｐＴＣＭ ６４＿１ ｓｇとでトランスフェクトする。
次に、両方のプラスミドを含むＭＧＢ００３２培養物を飽和するまで増殖させ、適切な抗生物質を含む増殖培養物に少なくとも１：１０で希釈し、ＯＤが約１になるまで３７℃でインキュベートする。この増殖段階からの細胞をエレクトロコンピテントにし、左端（ＬＥ）および右端（ＲＥ）のトランスポゾンモチーフに隣接しているテトラサイクリン耐性マーカーを有するプラスミドである流線型の６４＿１ ｐＤｏｎｏｒでトランスフェクトして、組み込む。エレクトロポレーションした細胞を、１００μＭの最終濃度のＩＰＴＧの存在下または非存在下で、ＬＢ培地で２時間回収した後、ＬＢ－寒天－アンピシリン－クロラムフェニコール－テトラサイクリンにプレーティングし、３７℃で４日間インキュベートする。滅菌した爪楊枝を使用して、得られた各ＣＦＵをサンプリングし、これを水に混合する。この溶液に、Ｑ５高忠実度ＰＣＲマスターミックス（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）とプライマーＬＡ１５５（５’－ＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＮＮＮＮＮＧＡＴＧＡＧＣＧＣＡＴＴＧＴＴＡＧＡＴＴＴＣＡＴ－３’）およびｏＪＬ５０（５’－ＡＡＡＣＣＧＡＣＡＴＣＧＣＡＧＧＣＴＴＣ－３’）を加える。これらのプライマーは、予測される挿入接合部に隣接している。予測される産物のサイズは６０９ｂｐである。ＤＮＡ増幅されたＰＣＲ産物は、２％アガロースゲル上で可視化される。ＰＣＲ産物のサンガーシーケンシングにより、転位事象が確認される。
実施例７－細胞内発現／インビトロアッセイ（予測的）
生理的に関連する環境においてＮＬＳ構築物の機能性を試験するために、活性なＮＬＳタグ付きＣＡＳＴ構成要素でクローン化した構築物を、レンチウイルス導入を用いてＫ５６２細胞に組み込む。簡潔に言えば、レンチウイルス導入プラスミドにクローン化した構築物を、エンベローププラスミドとパッケージングプラスミドを持つ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、７２時間インキュベート後に、培地からウイルス含有上清を採取する。次に、ウイルスを含む培地を、８μｇ／ｍＬのポリブレンとともにＫ５６２細胞株と７２時間インキュベートし、トランスフェクトした細胞を、１μｇ／ｍＬのピューロマイシンを用いて４日間、大量のインテグレーションのために選択する。選択中の細胞株を４日間の終わりに収集し、核と細胞質画分について区別して溶解する。その後の画分を、インビトロで発現させた成分の相補的なセットで、転位能力について試験する。
１０００万個の細胞を遠心分離し、１ｘＰＢＳ ｐＨ７．４で１回洗浄する。上清洗浄液を細胞ペレットまで完全に吸引し、－８０℃で１６時間瞬間冷凍する。氷上で解凍後、細胞ペレットのサイズを質量で測定し、適切な抽出量の細胞分画と核抽出試薬（ＮＥ－ＰＥＲ）を用いて、細胞画分のタンパク質を自然に抽出する。簡潔に言えば、細胞質抽出試薬は、細胞の質量対抽出試薬の量が１：１０で使用される。細胞懸濁液をボルテックスによって混合し、非イオン性界面活性剤で溶解させる。その後、細胞を１６，０００ｘｇ、４℃で５分間遠心分離する。細胞質抽出上清をデカントし、インビトロ試験のために保存する。次に、核抽出試薬を、元々の細胞質量対核抽出試薬が１：２で添加し、断続的にボルテックスしながら氷上で１時間インキュベートする。その後、核懸濁液を１６，０００×ｇで１０分間、４℃で遠心分離し、上清の核抽出物をデカントし、インビトロの転位活性について試験する。各条件のそれぞれの細胞および核抽出物４μＬを使用して、インビトロ発現タンパク質、ドナーＤＮＡ、ｐＴａｒｇｅｔ、およびバッファーの相補的なセットを用いてインビトロの転位反応を実施する。転位活性の証拠は、ドナー－標的接合部のＰＣＲ増幅によってアッセイされる。
実施例８－哺乳動物細胞における活性（予測的）
哺乳動物細胞における標的化および切断活性を示すために、核局在化配列をヌクレアーゼまたはエフェクタータンパク質およびインテグラーゼタンパク質のそれぞれのＣ末端に融合させ、融合タンパク質を精製する。関心対象のゲノム遺伝子座を標的とするシングルガイドＲＮＡを合成し、ヌクレアーゼ／エフェクタータンパク質とインキュベートすることでリボ核タンパク質複合体を形成する。選択可能なネオマイシン耐性マーカー（ＮｅｏＲ）または左端（ＬＥ）および右端（ＲＥ）のモチーフに隣接している蛍光マーカーを含むプラスミドで細胞をトランスフェクトし、４～６時間回収し、その後、ヌクレアーゼＲＮＰおよびインテグラーゼタンパク質でエレクトロポレーションする。プラスミドのゲノムへのインテグレーションは、Ｇ４１８耐性コロニーのカウントまたは蛍光活性化細胞の細胞数測定によって定量化される。ゲノムＤＮＡはエレクトロポレーションから７２時間後に抽出され、ＮＧＳ－ライブラリーの調製に使用される。オフターゲット頻度は、ゲノムを断片化し、ＮＧＳライブラリー調製のためにトランスポゾンマーカーと隣接するＤＮＡのアンプリコンを調製することによってアッセイされる。各標的化系の活性を試験するために、少なくとも４０個の異なる標的部位が選択される。
実施例９－標的とされるヌクレアーゼの活性
インサイチュ発現およびタンパク質配列解析は、いくつかのＲＮＡガイドエフェクターが活性ヌクレアーゼであることを示唆している。それらは、予測されるエンドヌクレアーゼ関連ドメイン（ＲｕｖＣおよびＨＮＨ＿エンドヌクレアーゼドメインに一致）および予測されるＨＮＨおよびＲｕｖＣ触媒残基（例えば、ＭＧ３６－５エフェクターの予測される触媒残基を示す図４Ａを参照）を含む。
候補の活性は、ｍｙＴＸＴＬ系およびインビトロ転写ＲＮＡを使用して、操作されたシングルガイドＲＮＡ配列で試験される。活性なタンパク質は、アガロースゲル電気泳動でおよそ１７０ｂｐのバンドを得るためにライブラリーを成功裏に切断するものとして同定される。
実施例１０－トランスポゾンの同定
トランスポゾンは、トランスポゾンの左端と右端の間にインテグラーゼおよび／またはインテグラーゼ機能を有する１つ以上のタンパク質配列を含むときに、活性であると予測される。典型的なＴｎ７トランスポゾンは一般に、触媒インテグラーゼＴｎｓＢを含むが、ＴｎｓＡ、ＴｎｓＣ、ＴｎｓＤ、ＴｎｓＥ、ＴｎｉＱ、および／または他のインテグラーゼまたはインテグラーゼを含んでいてもよい。トランスポゾン末端は、予測されるインテグラーゼ結合部位を含み、これは、インテグラーゼタンパク質および他の「カーゴ」遺伝子に隣接する１５ｂｐ～１５０ｂｐの長さの直接反復および／または逆方向反復を含む。タンパク質配列分析は、インテグラーゼがインテグラーゼドメイン、インテグラーゼドメインおよび／またはインテグラーゼ触媒残基を含むことを示し、それらが活性であることを示唆している（例えば、ＴｎｓＢ要素を含む例示的なＭＧ３６－５エフェクターベースＣＡＳＴ系の遺伝子座の図を示す図４Ａと、ＴｎｓＡ、ＴｎｓＢ、ＴｎｓＣ、およびＴｎｉＱ要素を含む例示的ＭＧ３９－１エフェクターベースＣＡＳＴ系の遺伝子座の図を示す図５Ａ）。
実施例１１－ＣＲＩＳＰＲ関連トランスポゾンの同定
推定ＣＲＩＳＰＲ関連トランスポゾン（ＣＡＳＴ）は、ＣＲＩＳＰＲ配列の近傍に、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡを標的とするＣＲＩＳＰＲエフェクターと予測されるインテグラーゼ機能を有するタンパク質とを含む。いくつかの系では、エフェクターは、エンドヌクレアーゼ関連触媒ドメインおよび／または触媒残基の存在に基づいてヌクレアーゼ活性を有することが予測される（例えば、ＴｎｓＢ要素を含むＣＡＳＴ系の遺伝子座の文脈におけるＭＧ３６－５エフェクターの予測される触媒残基を示す図４Ａ）。インテグラーゼは、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座（ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼおよびアレイ）およびインテグラーゼタンパク質が予測されるトランスポゾンの左端と右端の間に位置する際に、活性ヌクレアーゼと関連すると予測された（例えば、図４Ｂおよび４Ｃ）。この場合、エフェクターは、ガイドＲＮＡに基づいてＤＮＡのインテグレーションを特定のゲノム位置へと向けることが予測された。
いくつかの系では、エフェクターは、既知のＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と相同性を有するが、エンドヌクレアーゼドメインおよび／または触媒残基のない状態に基づいて不活性であることが予測された（図５Ａ）。インテグラーゼは、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座（不活性なＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼおよびアレイ）およびインテグラーゼタンパク質が予測されるトランスポゾンの左端および右端内に位置するとき、エフェクターと関連すると予測される（図５Ａおよび５Ｂ）。
実施例１２－ＣＡＳＴの発見
ＣＲＩＳＰＲ関連トランスポゾン（ＣＡＳＴ）は、ＤＮＡカーゴの標的としたインテグレーションを促進するためにＣＲＩＳＰＲ系と相互作用するように進化したトランスポゾンを含む系である。
ＣＡＳＴは、トランスポゾンのシグネチャーの左端および右端内のＤＮＡ転位に関与する１つ以上のタンパク質配列をコードするゲノム配列である。典型的なＴｎ７トランスポゾンは一般に、触媒トランスポザーゼＴｎｓＢを含むが、触媒トランスポザーゼＴｎｓＡ、ローダータンパク質ＴｎｓＣまたはＴｎｉＢ、および標的認識タンパク質ＴｎｓＤ、ＴｎｓＥ、ＴｎｉＱ、および／または他のトランスポゾン関連成分を含むこともある。トランスポゾン末端は、予測されるトランスポザーゼ結合部位を含み、これは、トランスポゾン機構および他の「カーゴ」遺伝子に隣接する１５ｂｐ～１５０ｂｐの長さの直接反復および／または逆方向反復を含む。
加えて、ＣＡＳＴはさらに、ＣＲＩＳＰＲアレイの近傍でＤＮＡおよび／またはＲＮＡを標的とするＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼまたはエフェクターをコードする。いくつかの系では、エフェクターは、エンドヌクレアーゼ関連触媒ドメインおよび／または触媒残基の存在に基づいて、活性ヌクレアーゼであることが予測される。いくつかの系では、エフェクターは、既知のＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と配列類似性を有するが、エンドヌクレアーゼドメインおよび／または触媒残基が存在しない状態に基づいて不活性であることが予測された。トランスポゾンは、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座およびトランスポゾン関連タンパク質が予測されるトランスポゾンの左端および右端内に位置する場合に、エフェクターと関連すると予測される。この場合、エフェクターは、ガイドＲＮＡに基づいてＤＮＡのインテグレーションを特定のゲノム位置へと向けることが予測される。
実施例１３ａ－Ｃａｓ１２ｋＣＡＳＴ
Ｃａｓ１２ｋ ＣＡＳＴ系は、ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ１２ｋエフェクター、ＣＲＩＳＰＲアレイ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、およびＴｎ７様転位タンパク質をコードする（例えば、Ｃａｓ１２ｋを含むＭＧ１０８－１ ＣＡＳＴ系の遺伝子座組織図を示す図８を参照）。Ｃａｓ１２ｋエフェクターは系統的に多様であり、ＣＡＳＴとの関連性を確認する特徴がいくつかについて確認されている（例えば、ＭＧ６４－１、ＭＧ６４－２、ＭＧ６４－３、ＭＧ６４－５、ＭＧ６４－６、ＭＧ６４－７、ＭＧ６４－１３、ＭＧ６４－５４、ＭＧ６４－５６、ＭＧ１０８－１、およびＭＧ１０８－２エフェクターがどのようにしてこのグループの一部であるのかを示している図９を参照）。そのような特徴的な特徴の１つは、ＭＧ６４－３ ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の文脈で同定されたトランスポゾン末端であった。トランスポゾン左端は、末端の逆方向反復と自己一致スペーサー配列によって示されるように、ＭＧ６４－３ ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の下流で同定された（図１１Ａ）。同定された別のそのような特徴は、保存されたモチーフ５’－ＧＮＮＧＧＮＮＴＧＡＡＡＧ－３’を含むＣａｓ１２ｋ ＣＡＳＴ ＣＲＩＳＰＲリピート（ｃｒＲＮＡ）を含む（例えば、ＭＧ６４－２、ＭＧ６４－４、ＭＧ６４－５、ＭＧ６４－６、ＭＧ６４－７、およびＭＧ１０８－１、ならびに図１１Ｂを参照）。ｃｒＲＮＡモチーフ内の短いリピート－アンチリピート（ＲＡＲ）は、ｔｒａｃｒＲＮＡの異なる領域と整列し、ＲＡＲモチーフは、ｔｒａｃｒＲＮＡの開始および終了を定義するように思われた。図１３Ｃは、例えば、ＭＧ６４－２、ＭＧ６４－４、ＭＧ６４－５、ＭＧ６４－６、ＭＧ６４－７、およびＭＧ１０８－１のファミリーにおける３つのＲＡＲモチーフの存在を示す。
実施例１３ｂ－クラスＩ、タイプＩ－ＦのＣＡＳＴ
いくつかのＣＡＳＴは、ヌクレアーゼ欠損ＣＲＩＳＰＲ タイプＩ－Ｆのカスケードエフェクタータンパク質、ＣＲＩＳＰＲアレイ、およびＴｎ７様転位タンパク質をコードする（例えば、ＭＧ１１０－１エフェクターベースのタイプＩ－ＦのＣＡＳＴ系の遺伝子座の組織図を示す図１０Ａを参照）。タイプＩ－ＦのカスケードＣＡＳＴは、ｃｒＲＮＡによってコードされるシングルガイドＲＮＡで機能すると予測され、これは、ステムループ構造の形成に関与すると考えられる保存されたモチーフ５’－ＣＴＧＣＣＧＮＮＴＡＧＧＮＡＧＣ－３’を含む（例えば、ＭＧ１１０－１とＭＧ１１０－２のファミリーｃｒＲＮＡ 配列番号２０７および２０８におけるこの特徴のアラインメントを示す図１０Ｂ～Ｃを参照）。これらの同じ特徴を有することに一部基づいて、ＭＧ１１０－２エフェクター含有およびファミリーも、タイプＩ－ＦのＣＡＳＴ系として同定された。
実施例１４－トランスポゾン末端予測
トランスポゾン末端は、エフェクターとトランスポゾン機構に隣接している遺伝子間領域から推定された。例えば、Ｃａｓ１２ｋ ＣＡＳＴについては、ＴｎｓＢの上流に直接位置し、かつＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の下流に直接位置する遺伝子間領域が、Ｔｎ７トランスポゾン左端および右端（ＬＥおよびＲＥ）を含んでいると予測された（例えば、ＭＧ６４－３ファミリーＣＡＳＴ遺伝子座図の文脈でＬＥおよびＲＥの解析を示す図１１Ａを参照）。
最大２つのミスマッチを伴う、約１２ｂｐの直接反復および逆方向反復（ＤＲ／ＩＲ）がコンティグ上で予測された。加えて、Ｄｏｔｐｌｏｔアルゴリズムを用いて、ＣＡＳＴトランスポゾンに隣接する短い（約１０～２０ｂｐ）ＤＲ／ＩＲを発見した。ＣＡＳＴエフェクターとトランスポゾン遺伝子に隣接する遺伝子間領域に位置するマッチングＤＲ／ＩＲは、トランスポゾン結合部位をコードしていると予測された。推定トランスポゾン結合部位をコードする遺伝子間領域から抽出したＬＥとＲＥを整列させて、トランスポゾン末端境界を定義した。推定トランスポゾンのＬＥとＲＥ末端は、ａ）最初と最後に予測されたトランスポゾンコード遺伝子の上流と下流から４００ｂｐ以内に位置する領域、ｂ）複数の短い逆方向反復を共有している領域、およびｃ）６５％を超えるヌクレオチドｉｄを共有する領域として同定される。このプロセスを繰り返して、ＭＧ３６－５（配列番号１７～１８）、ＭＧ３９－１（配列番号２０～２１）、ＭＧ６４－２（配列番号１２５～１２６）、ＭＧ６４－４（配列番号１２７～１２８）、ＭＧ６４－６（配列番号１２３～１２４）、ＭＧ６４－７（配列番号１２９～１３０）、ＭＧ６４－１３（配列番号１３１～１３２）、ＭＧ６４－５４（配列番号１３３）、ＭＧ１０８－１（配列番号１３４～１３５）、ＭＧ１１０－１（配列番号１３６～１３７）、およびＭＧ１１０－２（配列番号１３８～１３９）のための推定ＬＥ／ＲＥ配列を同定した。
実施例１５－クラスＩＩ、タイプＶのＣＡＳＴ系用のシングルガイド設計
ＭＧ６４サブファミリーのＣａｓエフェクターおよびＣＲＩＳＰＲアレイを囲む遺伝子間領域の解析により、潜在的なアンチリピート配列と、ｔｒａｃｒＲＮＡの配列に対応するアンチリピートに隣接する保存された「ＣＹＣＣ（Ｎ６）ＧＧＲＧ」ステムループ構造とが同定された（図１１Ｂ）。ＴｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡリピートをフォールディングし、トリミングし、ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ相補配列のステムループ領域を維持するためにＧＡＡＡのテトラループ配列を追加して、ｓｇＲＮＡを生成した。これらの配列の概要を以下の表１に示す。
実施例１６－標的とされたヌクレアーゼを用いるインビトロでのインテグレーション活性
インサイチュ発現およびタンパク質配列解析は、いくつかのＲＮＡガイドエフェクターが活性ヌクレアーゼであることを示唆した。それらは、予測されるエンドヌクレアーゼ関連ドメイン（ＲｕｖＣおよびＨＮＨ＿エンドヌクレアーゼドメインに一致）、および／または予測されるＨＮＨおよびＲｕｖＣ触媒残基を含む。候補活性は、ｍｙＴＸＴＬ系およびインビトロ転写ＲＮＡを使用して、操作されたシングルガイドＲＮＡ配列で試験された。活性なタンパク質は、アガロースゲル電気泳動でおよそ１７０ｂｐのバンドを得るためにライブラリーを成功裏に切断するものとして同定される。
実施例１７－プログラム可能なＤＮＡインテグレーション
ＣＡＳＴ活性は、１つの反応に５種類の成分：（１）ｍｙＴＸＴＬまたはＰＵＲＥｘｐｒｅｓｓによって発現されたＣａｓエフェクタータンパク質、（２）Ｃａｓ酵素に対応する標的配列とＰＡＭを含む標的ＤＮＡ断片またはプラスミド、（３）ＤＮＡ断片またはプラスミドにおける、トランスポザーゼ系の予測されるＬＥおよびＲＥに隣接しているマーカーまたはＤＮＡの断片を含むドナーＤＮＡ断片、（４）ｍｙＴＸＴＬまたはＰＵＲＥｘｐｒｅｓｓを用いて発現されるアレイの一部であると予測される追加のトランスポザーゼタンパク質の任意の組み合わせ、および（５）操作されたインビトロ転写されたシングルガイドＲＮＡ配列を組み合わせて試験された。ドナー断片の成功裏に転位させた活性な系は、ドナー－標的接合部のＰＣＲ増幅によってアッセイされた。
図１３は、予測されたＬＥ／ＲＥドナー配列（配列番号１２３～１２４）およびインシリコ設計ｓｇＲＮＡ（配列番号２０１）を用いたＭＧ６４－６エフェクター、ＴｎｓＢ、ＴｎｓＣ、およびＴｎｉＱのタンパク質（配列番号３０～３３）を含むＭＧ６４－６系が活性であることを実証する例となるデータを示している。すべてのＭＧ６４－６成分を組み合わせることによって転位反応を行った後、接合部のＰＣＲ増幅により、適切なドナー－標的形成が起こり、転位反応がｓｇ依存性であることが示された。（図１３Ａ）。ＰＣＲ反応＃３および＃４における増幅バンドの存在（それぞれＬＥ／ＲＥがＰＡＭの遠位に挿入された場合のＬＥ／ＲＥ接合部にまたがる）は、標的に対するドナーの両方の配向：ＬＥがＰＡＭに近い場合の配向と、ＲＥがＰＡＭに近い場合の配向がなされることを示した。両方の転位配向がなされる一方で、ＬＥがＰＡＭに近い場合の標的におけるドナーのインテグレーションが優先され、反応＃４および＃５に存在する強力なバンド（それぞれ、ＰＡＭの遠位に挿入された場合のＬＥ接合部とＰＡＭの近位に挿入された場合のＲＥ接合部にまたがる）によって表された。
好ましい配向産物のサンガーシーケンシングが行われた。ＬＥをＰＡＭに近い場合に起こるインテグレーションのうち、標的／ドナー接合部にわたって順方向または逆方向のいずれかからの配列決定クロマトグラムシグナルの明らかな劣化があった（図１３Ｃ）。これは、ＬＥがＰＡＭに近い場合に配向される産物のうち、インテグレーションがヌクレオチドの範囲にわたって起こり、ＬＥがＰＡＭに近い産物の主要な産物は、ＰＡＭからの６１ｂｐのインテグレーションであることを示した（図１４）。ドナー－標的接合部にわたってドナーに由来した配列決定により、ＬＥおよびＲＥの配列の本質的な外側の境界の構成が定義された。ＬＥおよびＲＥのドメインのさらなる調査により、ＬＥおよびＲＥの配列の内部限界、したがって、転位に必須な最小限のＬＥ／ＲＥが決定される。ＬＥがＰＡＭに近い産物におけるＲＥの配列決定により、ドナーＲＥの下流に３ｂｐの重複が見られた。これは、ずれた切れ込み（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ ｃｕｔ）部位でドナー断片を切断およびライゲートするＴｎ７トランスポザーゼインテグレーション事象が一因である。３ｂｐの重複は、他のＴｎ７トランスポザーゼから予想される５ｂｐの重複よりも小さい。
標的プラスミドの８ＮライブラリーでのＰＣＲ増幅産物のサンガーシーケンシングにより、スペーサーの５’末端でのｎＧＴｎ／ｎＧＴｔとしてのＭＧ６４－６エフェクターのＰＡＭ優先度が解明された。ＰＡＭライブラリー標的のＮＧＳ解析により、５’末端でのｎＧＴｎモチーフの優先度が裏付けられた（図１３Ｂ）。
実施例１８－インテグレーションウインドウの決定
上記実施例１７で増幅したＰＡＭのＰＣＲ接合部をＮＧＳライブラリーについてインデックス付けし、Ｖ２ ３００リードキットを用いてＭｉＳｅｑで配列決定した。リードは、ＰＡＭからのインテグレーション距離が６０ｂｐである推定転位配列のアンプリコン配列（ｇｕｉｄｅｓｅｑ＝ＬＥまたはＲＥの２０ｂｐの３’末端、ウインドウの中心＝０、ウインドウサイズ＝２０）を用いるＣＲＩＳＰＲｅｓｓｏを用いてマッピングし定量化した。インデルヒストグラムは、検出された全インデルリードに対して正規化し、頻度は６０ｂｐ参照配列と比較してプロットされる（図１４）。
ＰＣＲ反応５（ＰＡＭの近位にあるＬＥ、図１３ａ）およびＰＣＲ４（ＰＡＭの遠位にあるＲＥ、図１３ｂ）の両方を、ＭＧ６４－６について配列およびＰＡＭからの距離上にプロットした（図１４）。インテグレーションウインドウの解析により、スペーサーＰＡＭ部位で発生したインテグレーションの９５％は、ＰＡＭから５８～６８ヌクレオチド離れている１０ｂｐのウインドウ内にあることが示された。遠位と近位の頻度間のインテグレーション距離の違いは、インテグレーション部位の重複－インテグレーション時にトランスポザーゼのヌクレアーゼ活性がずれた結果、３～５塩基対の重複－を反映していた。
実施例１９－ゲルシフトによるトランスポゾン末端の検証
予測されるトランスポゾン末端配列に対するＴｎｓＢの活性を検証するために、ＭＧ６４－６のＲＥを、ＦＡＭ標識オリゴを用いて増幅させた。ＭＧ６４－６ ＴｎｓＢタンパク質を、無細胞転写／翻訳系を用いて発現させ、ＲＥ ＦＡＭ標識産物とインキュベートした。３０分間インキュベートした後、天然の５％ＴＢＥゲル上で結合が観察された（図１５）。共インキュベートしたレーン（図１５、レーン３）内の蛍光産物の複数のバンドは、最低３つのＴｎｓＢ結合部位を示した。
実施例２０－トランスポザーゼ活性のコロニーＰＣＲスクリーニング（予測的）
転写活性は、コロニーＰＣＲスクリーニングを介してアッセイされる。ｐＤｏｎｏｒプラスミドで形質転換した後、大腸菌を、アンピシリン、クロラムフェニコール、およびテトラサイクリンを含むＬＢ－寒天上にプレーティングする。選択したＣＦＵを、挿入接合部に隣接するプライマーとＰＣＲ試薬を含む溶液に加えた。
実施例２２－ＬＥ－ＲＥ最小化（予測的）
標的－転位接合部の配列決定は、標的反応に組み込まれるドナープラスミドからの最も外側の配列を同定することにより、末端の逆方向反復の同定に役立つ。変動率１０％の１４ｂｐの反復解析を行うことで、末端内に含まれる短いリピートが同定され、このリピートを保存するこれらの切断物に含まれる最小限の配列を同定して、余分な配列を除去する。予測とクローニングは何度も繰り返され、それぞれの相互作用はインビトロの転位で試験される。転位は、９６ｂｐのＲＥ領域と組み合わせた６８ｂｐのＬＥ領域まで活性であると予測される。
実施例２３－転位のオーバーハングの影響（予測的）
ＴｎｓＢ結合モチーフの外側の余分な配列が転位に必要かどうかを試験するために、ＬＥとＲＥの両方のＴＧＴＡＣＡまたはＴＧＴＣＧＡのモチーフのために設計したオリゴを、０、１、２、３、５、および１０ｂｐの余分な塩基対で設計および合成する。これらの合成されたオリゴは、オーバーハングを有するドナーＰＣＲ断片の生成に使用され、標的部位へ転位する能力について試験される。
実施例２４－ＣＡＳＴ ＮＬＳ設計（予測的）
治療目的の真核生物のゲノム編集は、編集酵素の核への移入に依存している。大きなタンパク質の小さなポリペプチドストレッチは、核膜全体にタンパク質を移入するために細胞成分にシグナルを送る。ＮＬＳタグは、それが融合されるタンパク質の機能を維持しながら移入機能を提供する必要があるため、これらのタグの配置は最適化する必要がある。ＣＡＳＴ複合体の成分のそれぞれに対するＮＬＳの機能的な配向を試験するために、ＭＧ ＣＡＳＴの成分のそれぞれのＮ末端にヌクレオプラスミンＮＬＳを、Ｃ末端にＳＶ４０ ＮＬＳを融合する構築物を合成する。これらの構築物のタンパク質を無細胞のインビトロ転写／翻訳反応で発現させ、タグなし成分の相補的なセットでインビトロ転位活性について試験する。ＮＬＳタグ付き構築物は、ＰＣＲ ４（ＲＥ遠位転位を評価）、および同族の転位事象、ＰＣＲ ５（ＬＥ近位転位を評価）を用いて、ドナー－標的接合部のＰＣＲにより活性の維持について評価される。
実施例２５－Ｃａｓ１２ｋとＴｎｉＱタンパク質の融合構築物の設計と試験（予測的）
タンパク質成分の発現を単純化／最小化し、これらの成分の細胞への送達を容易にするために、様々なリンカー、リンカー長、およびドメイン境界を有するＴｎｉＱタンパク質とＣａｓ１２ｋエフェクターとの間の融合構築物が設計、合成、および試験される。Ｃａｓ１２ｋに融合したＴｎｉＱの両配向は、設計および合成されたＣ末端融合物、Ｃａｓ－ＴｎｉＱ、およびＮ末端融合物、ＴｎｉＱ－Ｃａｓである。
エフェクター遺伝子とＴｎｉＱ遺伝子を融合させるために、他に２つのリンカーも採用される。自己停止翻訳配列であるＰ２Ａは、Ｃａｓ－ＮＬＳ－Ｐ２Ａ－ＮＬＳ－ＴｎｉＱ構築物において活性であり、ＭＣＶ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｒｉｂｏｓｏｍｅ Ｅｎｔｒｙ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ（内部リボソーム進入配列）（ＩＲＥＳ）ｍＲＮＡベースのリンカーは、細胞における２つの成分の独立翻訳を可能にする。
実施例２６－インビトロ転位試験と連結した細胞内発現（予測的）
生理的に関連する環境においてＮＬＳ構築物の機能性を試験するために、活性なＮＬＳタグ付きＣＡＳＴ構成要素でクローン化した構築物を、レンチウイルス導入を用いてＫ５６２細胞に組み込む。簡潔に言えば、レンチウイルス導入プラスミドにクローン化した構築物を、エンベローププラスミドとパッケージングプラスミドを持つ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、７２時間インキュベート後に、培地からウイルス含有上清を採取する。次に、ウイルスを含む培地を、８μｇ／ｍＬのポリブレンとともにＫ５６２細胞株と７２時間インキュベートし、トランスフェクトした細胞を、１μｇ／ｍＬのピューロマイシンを用いて４日間、大量のインテグレーションのために選択する。選択中の細胞株を４日間の終わりに収集し、核と細胞質画分について区別して溶解する。その後の画分を、インビトロで発現させた成分の相補的なセットで、転位能力について試験する。
ＮＬＳ－ＴｎｓＢとＴｎｓＢ－ＮＬＳの両方が、細胞分画とインビトロ転位によって試験され、転位は、細胞質と核分画の両方にわたって検出される。
細胞内のＣａｓ１２ｋ融合体は、同様に分画され、転位について試験される。Ｃａｓ－ＮＬＳ Ｃａｓ－ＮＬＳ－Ｐ２Ａ－ＮＬＳ－ＴｎｉＱは細胞に導入され、分画され、細胞内活性についてインビトロで試験される。Ｃａｓ－ＮＬＳ－Ｐ２Ａ－ＮＬＳ－ＴｎｉＱは、反応にシングルガイドを加えることで、細胞質で転位することができる。ホロＣａｓタンパク質（＋ｓｇＲＮＡ）または追加のＴｎｉＱをｓｇＲＮＡで補充することにより、核分画中のＣａｓ－ＮＬＳ－Ｐ２Ａ－ＮＬＳ－ＴｎｉＱ構築物を補完することができる。
本開示の系は、例えば、核酸編集（例えば、遺伝子編集）または核酸分子への結合（例えば、配列特異的結合）などの様々な用途に使用され得る。このような系は、例えば、対象において疾患を引き起こす可能性のある遺伝的に受け継がれた変異を改善（例えば、除去または置換）するために、細胞内の機能を確認するべく遺伝子を不活性化するために、疾患を引き起こす遺伝要素を検出する診断ツールとして（例えば、逆転写されたウイルスＲＮＡまたは疾患を引き起こす変異をコードする増幅ＤＮＡ配列の切断を介して）、特定のヌクレオチド配列（例えば、細菌内の抗生物質耐性をコードする配列）を標的として検出するために、プローブと組み合わせた不活性化酵素として、ウイルスゲノムを標的とすることによって、ウイルスを不活性化するか、または宿主細胞へ感染できなくするために、価値のある低分子、高分子、または二次代謝産物を生成するために生物を改良するべく、遺伝子を追加したり、代謝経路を変更したりするために、進化的選択のための遺伝子駆動要素を確立し、および／または、バイオセンサーとして外来低分子とヌクレオチドによる細胞障害を検出するために、使用され得る。
本発明の好ましい実施形態が本明細書中で示され、記載されてきたが、このような実施形態はほんの一例として提供されているに過ぎないことが当業者に明らかであろう。本発明が明細書内で提供される特定の例によって制限されることは意図していない。本発明は前述の明細書に関して記載されているが、本明細書中の実施形態の記載および例示は、限定的な意味で解釈されることを意味するものではない。当業者であれば、多くの変更、変化、および置換が、本発明から逸脱することなく思いつくだろう。さらに、本発明のすべての態様は、様々な条件および変数に依存する、本明細書で説明された特定の描写、構成、または相対的な比率に限定されないことが理解されよう。本明細書に記載される本発明の実施形態の様々な代替案が、本発明の実施に際して利用され得ることを理解されたい。したがって、本発明はそのような代替、修正、変形、または同等物を包含するものでもあることが考慮される。以下の請求項は本発明の範囲を定義するものであり、この請求項とその均等物の範囲内の方法、および構造体がそれによって包含されるものであるということが意図されている。

Claims (141)

  1. 標的核酸部位にカーゴヌクレオチド配列を転位させるための系であって、前記系は、
    前記カーゴヌクレオチド配列を含む第１の二本鎖核酸であって、前記カーゴヌクレオチド配列がリコンビナーゼまたはトランスポザーゼ複合体と相互作用するように構成される、第１の二本鎖核酸と、
    クラスＩＩ、タイプＩＩのＣａｓエフェクター、および前記標的核酸部位にハイブリダイズするように構成された少なくとも１つの操作されたガイドポリヌクレオチドを含むＣａｓエフェクター複合体と、
    前記リコンビナーゼまたはトランスポザーゼ複合体であって、前記カーゴヌクレオチド配列を前記標的核酸部位に補充するように構成される、前記リコンビナーゼまたはトランスポザーゼ複合体と、
    を含む、系。
  2. 前記リコンビナーゼまたはトランスポザーゼ複合体は、前記Ｃａｓエフェクター複合体に非共有結合する、請求項１に記載の系。
  3. 前記リコンビナーゼまたはトランスポザーゼ複合体は、前記Ｃａｓエフェクター複合体に共有結合する、請求項１に記載の系。
  4. 前記リコンビナーゼまたはトランスポザーゼ複合体は、単一のポリペプチドにおいて前記Ｃａｓエフェクター複合体に融合される、請求項３に記載の系。
  5. 前記カーゴヌクレオチド配列は、左側のトランスポザーゼ認識配列および右側のトランスポザーゼ認識配列に隣接している、請求項１－４のいずれか１つに記載の系。
  6. 前記標的核酸部位を含む第２の二本鎖核酸をさらに含む、請求項１－５のいずれか１つに記載の系。
  7. 前記標的核酸部位に隣接する前記Ｃａｓエフェクター複合体に適合するＰＡＭ配列をさらに含む、請求項６に記載の系。
  8. 前記ＰＡＭ配列は、前記標的核酸部位の３’に位置する、請求項７に記載の系。
  9. 前記リコンビナーゼまたはトランスポザーゼ複合体は、Ｔｎ７タイプのトランスポザーゼ複合体である、請求項１－８のいずれか１つに記載の系。
  10. 前記操作されたガイドポリヌクレオチドは、前記クラスＩＩ、タイプＩＩのＣａｓエフェクターに結合するように構成される、請求項１－９のいずれか１つに記載の系。
  11. 前記クラスＩＩ、タイプＩＩのＣａｓエフェクターは、配列番号１またはその変異体に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含むポリペプチドを含む、請求項１－１０のいずれか１つに記載の系。
  12. 前記リコンビナーゼまたはトランスポザーゼ複合体は、配列番号２～５のいずれか１つまたはその変異体に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または４つのポリペプチドを含む、請求項１－１１のいずれか１つに記載の系。
  13. 前記操作されたガイドポリヌクレオチドは、配列番号１２またはその変異体に対して少なくとも８０％の同一性を有する少なくとも６０～８０個の連続したヌクレオチドを含む配列を含む、請求項１－１２のいずれか１つに記載の系。
  14. 前記操作されたガイドポリヌクレオチドは、配列番号１１またはその変異体に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む、請求項１－１２のいずれか１つに記載の系。
  15. 前記左側のリコンビナーゼ配列は、配列番号１７～１８のいずれか１つまたはその変異体に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む、請求項２－１４のいずれか１つに記載の系。
  16. 前記右側のリコンビナーゼ配列は、配列番号１９またはその変異体に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む、請求項２－１５のいずれか１つに記載の系。
  17. 前記クラスＩＩ、タイプＩＩのＣａｓエフェクターおよび前記リコンビナーゼまたはトランスポザーゼ複合体は、約１０キロベース未満を含むポリヌクレオチド配列によってコードされる、請求項１－１６のいずれか１つに記載の系。
  18. 標的ヌクレオチド配列を含む標的核酸部位にカーゴヌクレオチド配列を転位させるための方法であって、前記方法は、請求項１－１７のいずれか１つに記載の系を細胞内で発現させる工程、または請求項１－１７のいずれか１つに記載の系を細胞に導入する工程を含む、方法。
  19. 標的核酸部位にカーゴヌクレオチド配列を転位させるための系であって、前記系は、
    Ｔｎ７タイプのトランスポザーゼ複合体と相互作用するように構成されたカーゴヌクレオチド配列を含む第１の二本鎖核酸と、
    クラスＩＩ、タイプＶのＣａｓエフェクター、および前記標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズするように構成された操作されたガイドポリヌクレオチドを含むＣａｓエフェクター複合体と、
    前記Ｃａｓエフェクター複合体に結合するように構成されたＴｎ７タイプのトランスポザーゼ複合体であって、ＴｎｓＡサブユニットを含む、Ｔｎ７タイプのトランスポザーゼ複合体と、
    を含む、系。
  20. 前記トランスポザーゼ複合体は、前記Ｃａｓエフェクター複合体に非共有結合する、請求項１９に記載の系。
  21. 前記トランスポザーゼ複合体は、前記Ｃａｓエフェクター複合体に共有結合する、請求項１９に記載の系。
  22. 前記トランスポザーゼ複合体は、単一のポリペプチドにおいて前記Ｃａｓエフェクター複合体に融合される、請求項２１に記載の系。
  23. 前記クラスＩＩ、タイプＶのＣａｓエフェクターは、Ｃａｓ１２ｋエフェクターではない、請求項１９－２２のいずれか１つに記載の系。
  24. 前記カーゴヌクレオチド配列は、左側のトランスポザーゼ認識配列および右側のトランスポザーゼ認識配列に隣接している、請求項１９－２３のいずれか１つに記載の系。
  25. 前記標的核酸部位を含む第２の二本鎖核酸をさらに含む、請求項１９－２４のいずれか１つに記載の系。
  26. 前記標的核酸部位に隣接する前記Ｃａｓエフェクター複合体に適合するＰＡＭ配列をさらに含む、請求項１９－２５のいずれか１つに記載の系。
  27. 前記ＰＡＭ配列は、前記標的核酸部位の５’に位置する、請求項２６に記載の系。
  28. 前記操作されたガイドポリヌクレオチドは、前記クラスＩＩ、タイプＶのＣａｓエフェクターに結合するように構成される、請求項１９－２７のいずれか１つに記載の系。
  29. 前記ＴｎｓＡサブユニットは、配列番号７またはその変異体に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を有するポリペプチドを含む、請求項１９－２８のいずれか１つに記載の系。
  30. 前記Ｔｎ７タイプのトランスポザーゼ複合体は、配列番号８～１０のいずれか１つあるいはその変異体に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つのポリペプチドを含む、請求項１９－２９のいずれか１つに記載の系。
  31. 前記操作されたガイドポリヌクレオチドは、配列番号１３～１６のいずれか１つあるいはその変異体に対して少なくとも８０％の同一性を有する少なくとも約４６～８０個の連続したヌクレオチドを含む配列を含む、請求項１９－３０のいずれか１つに記載の系。
  32. 前記左側のリコンビナーゼ配列は、配列番号２０またはその変異体に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む、請求項２４－３１のいずれか１つに記載の系。
  33. 前記右側のリコンビナーゼ配列は、配列番号２１またはその変異体に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む、請求項２４－３２のいずれか１つに記載の系。
  34. 前記クラスＩＩ、タイプＶのＣａｓエフェクターは、Ｃａｓ１２ｋエフェクターではない、請求項１９－３３のいずれか１つに記載の系。
  35. 前記クラスＩＩ、タイプＶのＣａｓエフェクターおよび前記Ｔｎ７タイプのトランスポザーゼ複合体は、約１０キロベース未満を含むポリヌクレオチド配列によってコードされる、請求項１９－３４のいずれか１つに記載の系。
  36. 標的ヌクレオチド配列を含む標的核酸部位にカーゴヌクレオチド配列を転位させるための方法であって、前記方法は、請求項１９－３４のいずれか１つに記載の系を細胞内で発現させる工程、または請求項１９－３４のいずれか１つに記載の系を細胞に導入する工程を含む、方法。
  37. カーゴヌクレオチド配列を標的核酸部位に転位させるための方法であって、前記方法は、
    カーゴヌクレオチド配列を含む第１の二本鎖核酸を、
    クラスＩＩ、タイプＩＩのＣａｓエフェクター、および前記標的核酸部位にハイブリダイズするように構成された少なくとも１つの操作されたガイドポリヌクレオチドを含むＣａｓエフェクター複合体と、
    前記標的核酸部位に前記カーゴヌクレオチドを補充するように構成されたリコンビナーゼまたはトランスポザーゼ複合体と、
    前記標的核酸部位を含む第２の二本鎖核酸と、
    に接触させる工程を含む、方法。
  38. 前記リコンビナーゼまたはトランスポザーゼ複合体は、前記Ｃａｓエフェクター複合体に非共有結合する、請求項３７に記載の系。
  39. 前記リコンビナーゼまたはトランスポザーゼ複合体は、前記Ｃａｓエフェクター複合体に共有結合する、請求項３７に記載の系。
  40. 前記リコンビナーゼまたはトランスポザーゼ複合体は、単一のポリペプチドにおいて前記Ｃａｓエフェクター複合体に融合される、請求項３９に記載の系。
  41. 前記カーゴヌクレオチド配列は、左側のトランスポザーゼ認識配列および右側のトランスポザーゼ認識配列に隣接している、請求項３７－４０のいずれか１つに記載の方法。
  42. 前記標的核酸部位に隣接する前記Ｃａｓエフェクター複合体に適合するＰＡＭ配列をさらに含む、請求項３７－４１のいずれか１つに記載の方法。
  43. 前記ＰＡＭ配列は、前記標的核酸部位の３’に位置する、請求項４２に記載の方法。
  44. 前記リコンビナーゼまたはトランスポザーゼ複合体は、Ｔｎ７タイプのトランスポザーゼ複合体である、請求項３７－４３のいずれか１つに記載の系。
  45. 前記操作されたガイドポリヌクレオチドは、前記クラスＩＩ、タイプＩＩのＣａｓエフェクターに結合するように構成される、請求項３７－４４のいずれか１つに記載の方法。
  46. 前記クラスＩＩ、タイプＩＩのＣａｓエフェクターは、配列番号１またはその変異体に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含むポリペプチドを含む、請求項３７－４５のいずれか１つに記載の方法。
  47. 前記リコンビナーゼまたはトランスポザーゼ複合体は、配列番号２～５のいずれか１つあるいはその変異体に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または４つのポリペプチドを含む、請求項３７－４６のいずれか１つに記載の方法。
  48. 前記操作されたガイドポリヌクレオチドは、配列番号１２またはその変異体に対して少なくとも８０％の同一性を有する少なくとも約６０～８０個の連続したヌクレオチドを含む配列を含む、請求項３７－４７のいずれか１つに記載の方法。
  49. 前記操作されたガイドポリヌクレオチドは、配列番号１１またはその変異体に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む、請求項３７－４８のいずれか１つに記載の方法。
  50. 前記左側のリコンビナーゼ配列は、配列番号１７～１８のいずれか１つあるいはその変異体に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む、請求項４１－４９のいずれか１つに記載の方法。
  51. 前記右側のリコンビナーゼ配列は、配列番号１９またはその変異体に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む、請求項４１－５０のいずれか１つに記載の方法。
  52. 前記クラスＩＩ、タイプＩＩのＣａｓエフェクターおよび前記Ｔｎ７タイプのトランスポザーゼ複合体は、約１０キロベース未満を含むポリヌクレオチド配列によってコードされる、請求項３７－５１のいずれか１つに記載の方法。
  53. カーゴヌクレオチド配列を標的核酸部位に転位させるための方法であって、前記方法は、
    前記カーゴヌクレオチド配列を含む第１の二本鎖核酸を、
    クラスＩＩ、タイプＶのＣａｓエフェクター、および前記標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズするように構成された操作された少なくとも１つのガイドポリヌクレオチドを含むＣａｓエフェクター複合体と、
    前記Ｃａｓエフェクター複合体に結合するように構成されたＴｎ７タイプのトランスポザーゼ複合体であって、ＴｎｓＡサブユニットを含む、Ｔｎ７タイプのトランスポザーゼ複合体と、
    前記標的核酸部位を含む第２の二本鎖核酸と、
    に接触させる工程を含む、方法。
  54. 前記トランスポザーゼ複合体は、前記Ｃａｓエフェクター複合体に非共有結合する、請求項５３に記載の系。
  55. 前記トランスポザーゼ複合体は、前記Ｃａｓエフェクター複合体に共有結合する、請求項５３に記載の系。
  56. 前記トランスポザーゼ複合体は、単一のポリペプチドにおいて前記Ｃａｓエフェクター複合体に融合される、請求項５５に記載の系。
  57. 前記カーゴヌクレオチド配列は、左側のトランスポザーゼ認識配列および右側のトランスポザーゼ認識配列に隣接している、請求項５３－５６のいずれか１つに記載の方法。
  58. 前記標的核酸部位に隣接する前記Ｃａｓエフェクター複合体に適合するＰＡＭ配列をさらに含む、請求項５３－５７のいずれか１つに記載の方法。
  59. 前記ＰＡＭ配列は、前記標的核酸部位の３’に位置する、請求項５８に記載の方法。
  60. 前記操作されたガイドポリヌクレオチドは、前記クラスＩＩ、タイプＶのＣａｓエフェクターに結合するように構成される、請求項５３－５９のいずれか１つに記載の方法。
  61. 前記ＴｎｓＡサブユニットは、配列番号７またはその変異体に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を有するポリペプチドを含む、請求項５３－６０のいずれか１つに記載の方法。
  62. 前記Ｔｎ７タイプのトランスポザーゼ複合体は、配列番号８～１０のいずれか１つあるいはその変異体に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つのポリペプチドを含む、請求項５３－６１のいずれか１つに記載の方法。
  63. 前記操作されたガイドポリヌクレオチドは、配列番号１３～１６のいずれか１つあるいはその変異体に対して少なくとも８０％の同一性を有する少なくとも約４６～８０個の連続したヌクレオチドを含む配列を含む、請求項５３－６２のいずれか１つに記載の方法。
  64. 前記左側のリコンビナーゼ配列は、配列番号２０またはその変異体に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む、請求項５７－６３のいずれか１つに記載の方法。
  65. 前記右側のリコンビナーゼ配列は、配列番号２１またはその変異体に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む、請求項５７－６４のいずれか１つに記載の方法。
  66. 前記クラスＩＩ、タイプＶのＣａｓエフェクターは、Ｃａｓ１２ｋエフェクターではない、請求項５３－６５のいずれか１つに記載の方法。
  67. 前記クラスＩＩ、タイプＶのＣａｓエフェクターおよび前記Ｔｎ７タイプのトランスポザーゼ複合体は、約１０キロベース未満を含むポリヌクレオチド配列によってコードされる、請求項５３－６６のいずれか１つに記載の方法。
  68. 標的核酸部位にカーゴヌクレオチド配列を転位させるための系であって、前記系は、
    Ｔｎ７タイプのトランスポザーゼ複合体と相互作用するように構成されたカーゴヌクレオチド配列を含む第１の二本鎖核酸と、
    クラスＩ、タイプＩ－ＦのＣａｓエフェクター、および前記標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズするように構成された操作されたガイドポリヌクレオチドを含むＣａｓエフェクター複合体と、
    前記Ｃａｓエフェクター複合体に結合するように構成されたＴｎ７タイプのトランスポザーゼ複合体であって、ＴｎｓＡサブユニットを含む、Ｔｎ７タイプのトランスポザーゼ複合体と、
    を含む、系。
  69. 前記トランスポザーゼ複合体は、前記Ｃａｓエフェクター複合体に非共有結合する、請求項６８に記載の系。
  70. 前記トランスポザーゼ複合体は、前記Ｃａｓエフェクター複合体に共有結合する、請求項６８に記載の系。
  71. 前記トランスポザーゼ複合体は、単一のポリペプチドにおいて前記Ｃａｓエフェクター複合体に融合される、請求項７０に記載の系。
  72. 前記カーゴヌクレオチド配列は、左側のトランスポザーゼ認識配列および右側のトランスポザーゼ認識配列に隣接している、請求項６８－７１のいずれか１つに記載の系。
  73. 前記標的核酸部位を含む第２の二本鎖核酸をさらに含む、請求項６８－７２のいずれか１つに記載の系。
  74. 前記標的核酸部位に隣接する前記Ｃａｓエフェクター複合体に適合するＰＡＭ配列をさらに含む、請求項６８－７３のいずれか１つに記載の方法。
  75. 前記ＰＡＭ配列は、前記標的核酸部位の３’に位置する、請求項７４に記載の系。
  76. 前記ＰＡＭ配列は、前記標的核酸部位の５’に位置する、請求項７４に記載の系。
  77. 前記操作されたガイドポリヌクレオチドは、前記クラスＩ、タイプＩ－ＦのＣａｓエフェクターに結合するように構成される、請求項６８－７６のいずれか１つに記載の系。
  78. 前記クラスＩ、タイプＩ－ＦのＣａｓエフェクターは、配列番号４１～４３または４８～５０のいずれか１つあるいはその変異体に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含むポリペプチドを含む、請求項６８－７７のいずれか１つに記載の系。
  79. 前記Ｔｎ７タイプのトランスポザーゼ複合体は、配列番号４４～４６または５１～５３のいずれか１つあるいはその変異体に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つのポリペプチドを含む、請求項６８－７８のいずれか１つに記載の系。
  80. 標的ヌクレオチド配列を含む標的核酸部位にカーゴヌクレオチド配列を転位させるための方法であって、前記方法は、請求項６８－７９のいずれか１つに記載の系を細胞内で発現させる工程、または請求項６８－７９のいずれか１つに記載の系を細胞に導入する工程を含む、方法。
  81. 標的核酸部位にカーゴヌクレオチド配列を転位させるための系であって、前記系は、
    Ｔｎ７タイプのトランスポザーゼ複合体と相互作用するように構成されたカーゴヌクレオチド配列を含む第１の二本鎖核酸と、
    クラスＩＩ、タイプＶのＣａｓエフェクター、および前記標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズするように構成された操作されたガイドポリヌクレオチドを含むＣａｓエフェクター複合体と、
    前記Ｃａｓエフェクター複合体に結合するように構成されたＴｎ７タイプのトランスポザーゼ複合体であって、ＴｎｓＢ、ＴｎｓＣ、およびＴｎｉＱ成分を含む、Ｔｎ７タイプのトランスポザーゼ複合体と、
    を含み、
    （ａ）前記クラスＩＩ、タイプＶのＣａｓエフェクターは、配列番号２２、２６、３０、３４、５５～８９、１０４、または１４７のいずれか１つあるいはその変異体に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を有するポリペプチドを含み、あるいは、
    （ｂ）前記Ｔｎ７タイプのトランスポザーゼ複合体は、配列番号２３～２５、２７～２９、３１～３３、３５～３７、１０１～１０３、１０５～１０７、または１４８～１５０のいずれか１つあるいはその変異体に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を有するＴｎｓＢ、ＴｎｓＣ、またはＴｎｉＱ成分を含む、
    系。
  82. 前記トランスポザーゼ複合体は、前記Ｃａｓエフェクター複合体に非共有結合する、請求項８１に記載の系。
  83. 前記トランスポザーゼ複合体は、前記Ｃａｓエフェクター複合体に共有結合する、請求項８１に記載の系。
  84. 前記トランスポザーゼ複合体は、単一のポリペプチドにおいて前記Ｃａｓエフェクター複合体に融合される、請求項８３に記載の系。
  85. 前記クラスＩＩ、タイプＶのＣａｓエフェクターは、配列番号２２、２６、３０、３４、５５～８９、１０４、または１４７のいずれか１つあるいはその変異体に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むポリペプチドを含む、請求項８１－８４のいずれか１つに記載の系。
  86. 前記Ｔｎ７タイプのトランスポザーゼ複合体は、配列番号２３～２５、２７～２９、３１～３３、３５～３７、１０１～１０３、１０５～１０７、または１４８～１５０のいずれか１つあるいはその変異体に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＴｎｓＢ、ＴｎｓＣ、またはＴｎｉＱ成分を含む、請求項８１－８５のいずれか１つに記載の系。
  87. 前記クラスＩＩ、タイプＶのＣａｓエフェクターは、Ｃａｓ１２ｋエフェクターである、請求項８１－８６のいずれか１つに記載の系。
  88. 前記カーゴヌクレオチド配列は、左側のトランスポザーゼ認識配列および右側のトランスポザーゼ認識配列に隣接している、請求項８１－８７のいずれか１つに記載の系。
  89. 前記標的核酸部位を含む第２の二本鎖核酸をさらに含む、請求項８１－８８のいずれか１つに記載の系。
  90. 前記標的核酸部位に隣接する前記Ｃａｓエフェクター複合体に適合するＰＡＭ配列をさらに含む、請求項８１－８９のいずれか１つに記載の系。
  91. 前記ＰＡＭ配列は、前記標的核酸部位の５’に位置する、請求項９０に記載の系。
  92. 前記ＰＡＭ配列は、５’－ｎＧＴｎ－３’または５’－ｎＧＴｔ－３’を含む、請求項９１に記載の系。
  93. 前記操作されたガイドポリヌクレオチドは、前記クラスＩＩ、タイプＶのＣａｓエフェクターに結合するように構成される、請求項８１－９２のいずれか１つに記載の系。
  94. 前記ＴｎｓＢ、ＴｎｓＣ、およびＴｎｉＱ成分は、それぞれ配列番号２３～２５、２７～２９、３１～３３、３５～３７、１０１～１０３、１０５～１０７、または１４８～１５０のいずれか１つに対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を有するポリペプチドを含む、請求項８１－９３のいずれか１つに記載の系。
  95. 前記操作されたガイドポリヌクレオチドは、配列番号９０、９１、９２、９３、１１７、１５１、１５６～１８１、または２０９～２３４のいずれか１つに対して少なくとも８０％の同一性を有する少なくとも約４６～８０個の連続したヌクレオチドを含む配列を含む、請求項８１－９４のいずれか１つに記載の系。
  96. 前記操作されたガイドポリヌクレオチドは、配列番号１１１～１１４または２０１～２０６、２５５、２６２、２５６、２０９、２５７、２６３、２５８、２１０のいずれか１つあるいはその変異体に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項８１－９５のいずれか１つに記載の系。
  97. 前記左側のリコンビナーゼ配列は、配列番号１２５、１２７、１２３、１２９、１３１、１３３、１５３、または１３４のいずれか１つあるいはその変異体に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む、請求項８８－９６のいずれか１つに記載の系。
  98. 前記右側のリコンビナーゼ配列は、配列番号１２６、１５５、１２８、１２４、１３０、１３２、または１５４のいずれか１つあるいはその変異体に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む、請求項８８－９７のいずれか１つに記載の系。
  99. 前記クラスＩＩ、タイプＶのＣａｓエフェクターおよび前記Ｔｎ７タイプのトランスポザーゼ複合体は、約１０キロベース未満を含むポリヌクレオチド配列によってコードされる、請求項８１－９７のいずれか１つに記載の系。
  100. （ａ）前記クラスＩＩ、タイプＶのＣａｓエフェクターは、配列番号２２またはその変異体に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含み、
    （ｂ）前記左側のリコンビナーゼ配列は、配列番号１２５またはその変異体に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含み、
    （ｃ）前記右側のリコンビナーゼ配列は、配列番号１２６もしくは１５５またはその変異体に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含み、
    （ｄ）前記操作されたガイドポリヌクレオチドは、（ｉ）配列番号９０の少なくとも約４６～６０個のヌクレオチドに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含み、あるいは、（ｉｉ）配列番号９４、１１２、または２０２のいずれか１つの非縮重ヌクレオチドに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含み、あるいは、
    （ｅ）前記ＴｎｓＢ、ＴｎｓＣ、およびＴｎｉＱ成分は、配列番号２３～２５またはその変異体に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項８１および８８に記載の系。
  101. （ａ）前記クラスＩＩ、タイプＶのＣａｓエフェクターは、配列番号２６またはその変異体に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含み、
    （ｂ）前記左側のリコンビナーゼ配列は、配列番号１２７またはその変異体に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含み、
    （ｃ）前記右側のリコンビナーゼ配列は、配列番号１２８またはその変異体に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含み、
    （ｄ）前記操作されたガイドポリヌクレオチドは、（ｉ）配列番号９１、１５６、または２０９のいずれか１つの少なくとも約４６～６０個のヌクレオチドに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含み、あるいは、（ｉｉ）配列番号９５、１１３、または２０３のいずれか１つの非縮重ヌクレオチドに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含み、あるいは、
    （ｅ）前記ＴｎｓＢ、ＴｎｓＣ、およびＴｎｉＱ成分は、配列番号２７～２９またはその変異体に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項８１および８８に記載の系。
  102. （ａ）前記クラスＩＩ、タイプＶのＣａｓエフェクターは、配列番号６０またはその変異体に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含み、
    （ｂ）前記左側のリコンビナーゼ配列は、配列番号１３１またはその変異体に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含み、
    （ｃ）前記右側のリコンビナーゼ配列は、配列番号１３２またはその変異体に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含み、
    （ｄ）前記操作されたガイドポリヌクレオチドは、（ｉ）配列番号１１７、１６１、または２１４のいずれか１つの少なくとも約４６～６０個のヌクレオチドに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含み、あるいは、（ｉｉ）配列番号１１９の非縮重ヌクレオチドに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含み、あるいは、
    （ｅ）前記ＴｎｓＢ、ＴｎｓＣ、およびＴｎｉＱ成分は、配列番号１０１～１０３またはその変異体に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項８１および８８に記載の系。
  103. （ａ）前記クラスＩＩ、タイプＶのＣａｓエフェクターは、配列番号１４７またはその変異体に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含み、
    （ｂ）前記左側のリコンビナーゼ配列は、配列番号１５３またはその変異体に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含み、
    （ｃ）前記右側のリコンビナーゼ配列は、配列番号１５４またはその変異体に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含み、
    （ｄ）前記操作されたガイドポリヌクレオチドは、（ｉ）配列番号１５１、１８１、または２３４のいずれか１つの少なくとも約４６～６０個のヌクレオチドに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含み、あるいは、（ｉｉ）配列番号１５２または２５４の非縮重ヌクレオチドに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含み、あるいは、
    （ｅ）前記ＴｎｓＢ、ＴｎｓＣ、およびＴｎｉＱ成分は、配列番号１４８～１５０またはその変異体に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項８１および８８に記載の系。
  104. （ａ）前記クラスＩＩ、タイプＶのＣａｓエフェクターは、配列番号３４またはその変異体に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含み、
    （ｂ）前記左側のリコンビナーゼ配列は、配列番号１２９またはその変異体に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含み、
    （ｃ）前記右側のリコンビナーゼ配列は、配列番号１３０またはその変異体に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含み、
    （ｄ）前記操作されたガイドポリヌクレオチドは、（ｉ）配列番号９３、１５７、または２１０のいずれか１つの少なくとも約４６～６０個のヌクレオチドに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含み、あるいは、（ｉｉ）配列番号９７、１１４、または２０４のいずれか１つの非縮重ヌクレオチドに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含み、
    （ｅ）前記ＴｎｓＢ、ＴｎｓＣ、およびＴｎｉＱ成分は、配列番号１４８～１５０またはその変異体に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項８１および８８に記載の系。
  105. （ａ）前記クラスＩＩ、タイプＶのＣａｓエフェクターは、配列番号３０またはその変異体に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含み、
    （ｂ）前記左側のリコンビナーゼ配列は、配列番号１２３またはその変異体に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含み、
    （ｃ）前記右側のリコンビナーゼ配列は、配列番号１２４またはその変異体に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含み、
    （ｄ）前記操作されたガイドポリヌクレオチドは、（ｉ）配列番号９２の少なくとも約４６～８０個のヌクレオチドに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含み、あるいは、（ｉｉ）配列番号１１１または２０１の非縮重ヌクレオチドに対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含み、
    （ｅ）前記ＴｎｓＢ、ＴｎｓＣ、およびＴｎｉＱ成分は配列番号３１、３２、および３３またはその変異体に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を有するポリペプチドを含み、あるいは、
    （ｆ）前記ＰＡＭ配列は、５’－ｎＧＴｎ－３’または５’－ｎＧＴｔ－３’を含む、請求項８１、８８、および９１に記載の系。
  106. 標的核酸部位にカーゴヌクレオチド配列を転位させるための系であって、前記系は、
    Ｔｎ７タイプのトランスポザーゼ複合体と相互作用するように構成されたカーゴヌクレオチド配列を含む第１の二本鎖核酸と、
    クラスＩＩ、タイプＶのＣａｓエフェクター、および前記標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズするように構成された操作されたガイドポリヌクレオチドを含むＣａｓエフェクター複合体と、
    前記Ｃａｓエフェクター複合体に結合するように構成されたＴｎ７タイプのトランスポザーゼ複合体であって、ＴｎｓＢおよびＴｎｓＣの成分を含むが、ＴｎｓＡおよび／またはＴｎｉＱの成分を含まない、トランスポザーゼ複合体と、
    を含む、系。
  107. 前記トランスポザーゼ複合体は、前記Ｃａｓエフェクター複合体に非共有結合する、請求項１０６に記載の系。
  108. 前記トランスポザーゼ複合体は、前記Ｃａｓエフェクター複合体に共有結合する、請求項１０６に記載の系。
  109. 前記トランスポザーゼ複合体は、単一のポリペプチドにおいて前記Ｃａｓエフェクター複合体に融合される、請求項１０８に記載の系。
  110. 前記Ｔｎ７タイプのトランスポザーゼ複合体は、配列番号３９～４０または１０９～１１０のいずれか１つに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むポリペプチドを含む、請求項１０６－１０９のいずれか１つに記載の系。
  111. 前記ＴｎｓＢ成分は、配列番号４０または１０９に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むポリペプチドを含む、請求項１０６－１１０のいずれか１つに記載の系。
  112. 前記ＴｎｓＣ成分は、配列番号３９または１１０に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むポリペプチドを含む、請求項１０６－１１１のいずれか１つに記載の系。
  113. 前記クラスＩＩ、タイプＶのＣａｓエフェクターは、Ｃａｓ１２ｋエフェクターである、請求項１０６－１１２のいずれか１つに記載の系。
  114. 前記クラスＩＩ、タイプＶのＣａｓエフェクターは、配列番号３８または配列番号１０８に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１０６－１１２のいずれか１つに記載の系。
  115. 前記カーゴヌクレオチド配列は、左側のトランスポザーゼ認識配列および右側のトランスポザーゼ認識配列に隣接している、請求項１０６－１１４のいずれか１つに記載の系。
  116. 前記標的核酸部位を含む第２の二本鎖核酸をさらに含む、請求項１０６－１１５のいずれか１つに記載のシステム。
  117. 前記二本鎖核酸は前記標的核酸部位を含むか、前記系は細胞の内部にある、請求項１０６－１１６のいずれか１つに記載の系。
  118. 前記標的核酸部位に隣接する前記Ｃａｓエフェクター複合体に適合するＰＡＭ配列をさらに含む、請求項１０６－１１７のいずれか１つに記載のシステム。
  119. 前記ＰＡＭ配列は、前記標的核酸部位の５’に位置する、請求項１１８に記載の系。
  120. 前記操作されたガイドポリヌクレオチドは、前記クラスＩＩ、タイプＶのＣａｓエフェクターに結合するように構成される、請求項１０６－１１９のいずれか１つに記載の系。
  121. 前記ＴｎｓＢおよびＴｎｓＣ成分は、それぞれ配列番号４０および３９、または１０９および１１０に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を有するポリペプチドを含む、請求項１０６－１２０のいずれか１つに記載の系。
  122. 前記操作されたガイドポリヌクレオチドは、配列番号１１８、１８２、１８３、２３５、または２３６のいずれか１つあるいはその変異体に対して少なくとも８０％の同一性を有する少なくとも約４６～８０個の連続したヌクレオチドを含む配列を含む、請求項１０６－１２１のいずれか１つに記載の系。
  123. 前記操作されたガイドポリヌクレオチドは、配列番号１１５、１１６、２０５、２０６、２６１、２３５、２６０、または２３６のいずれか１つあるいはその変異体の非縮重ヌクレオチドに対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む、請求項１０６－１２１のいずれか１つに記載の系。
  124. 前記左側のリコンビナーゼ配列は、配列番号１３４に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む、請求項１１５－１２３のいずれか１つに記載の系。
  125. 前記右側のリコンビナーゼ配列は、配列番号１３５またはその変異体に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む、請求項１１５－１２４のいずれか１つに記載の系。
  126. 前記クラスＩＩ、タイプＶのＣａｓエフェクターおよび前記Ｔｎ７タイプのトランスポザーゼ複合体は、約１０キロベース未満を含むポリヌクレオチド配列によってコードされる、請求項１０６－１２５のいずれか１つに記載の系。
  127. （ａ）前記クラスＩＩ、タイプＶのＣａｓエフェクターは、配列番号３８またはその変異体に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含み、
    （ｂ）前記左側のリコンビナーゼ配列は、配列番号１３４またはその変異体に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含み、
    （ｃ）前記右側のリコンビナーゼ配列は、配列番号１３５またはその変異体に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含み、
    （ｄ）前記操作されたガイドポリヌクレオチドは、（ｉ）配列番号１８２または２３５の少なくとも約４６～８０個のヌクレオチドに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含み、あるいは、（ｉｉ）配列番号９８、１１５、１１６、２０５、または２０６の非縮重ヌクレオチドに対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含み、あるいは、
    （ｅ）前記ＴｎｓＢおよびＴｎｓＣ成分は、配列番号４０および３９またはその変異体に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を有するポリペプチドを含む、請求項１０６および１１５に記載の系。
  128. 標的ヌクレオチド配列を含む標的核酸部位にカーゴヌクレオチド配列を転位させるための方法であって、前記方法は、請求項８１－１２７のいずれか１つに記載の系を細胞内で発現させる工程、または請求項８１－１２７のいずれか１つに記載の系を細胞に導入する工程を含む、方法。
  129. 操作されたヌクレアーゼ系であって、
    ＲｕｖＣドメインとＨＮＨドメインとを含むエンドヌクレアーゼであって、前記エンドヌクレアーゼが未培養の微生物に由来し、前記エンドヌクレアーゼが配列番号１またはその変異体に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含むクラスＩＩ、タイプＩＩのエンドヌクレアーゼである、エンドヌクレアーゼと、
    操作されたガイドポリヌクレオチドであって、前記操作されたガイドＲＮＡが、前記エンドヌクレアーゼと複合体を形成するように構成され、前記操作されたガイドＲＮＡが、標的核酸配列にハイブリダイズするように構成されたスペーサー配列を含む、操作されたガイドポリヌクレオチドと、
    を含む、操作されたヌクレアーゼ系。
  130. 前記操作されたガイドポリヌクレオチドは、配列番号１２またはその変異体に対して少なくとも８０％の同一性を有する少なくとも６０～８０個の連続したヌクレオチドを含む、請求項１２９に記載の操作されたヌクレアーゼ系。
  131. 前記操作されたガイドポリヌクレオチドは、配列番号１１またはその変異体に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む、請求項１２９と１３０に記載の操作されたヌクレアーゼ系。
  132. 操作されたヌクレアーゼ系であって、
    ＲｕｖＣドメインを含むエンドヌクレアーゼであって、前記エンドヌクレアーゼが未培養の微生物に由来し、前記エンドヌクレアーゼが配列番号５に対して少なくとも８０％の同一性を有するクラスＩＩ、タイプＶのエンドヌクレアーゼである、エンドヌクレアーゼと、
    操作されたガイドＲＮＡであって、前記操作されたガイドＲＮＡが、前記エンドヌクレアーゼと複合体を形成するように構成され、前記操作されたガイドＲＮＡが、標的核酸配列にハイブリダイズするように構成されたスペーサー配列を含む、操作されたガイドＲＮＡと、
    を含む、操作されたヌクレアーゼ系。
  133. 前記操作されたガイドポリヌクレオチドは、配列番号１３～１６またはその変異体に対して少なくとも８０％の同一性を有する少なくとも約４６～８０個の連続したヌクレオチドを含む配列を含む、請求項１３２に記載の操作されたヌクレアーゼ系。
  134. 操作されたヌクレアーゼ系であって、
    ＲｕｖＣドメインを含むエンドヌクレアーゼであって、前記エンドヌクレアーゼが未培養の微生物に由来し、前記エンドヌクレアーゼが配列番号２２、２６、３０、３４、５５～８９、１０４、または１４７のいずれか１つあるいはその変異体に対して少なくとも８０％の同一性を有するクラスＩＩ、タイプＶ－Ｋのエンドヌクレアーゼである、エンドヌクレアーゼと、
    操作されたガイドＲＮＡであって、前記操作されたガイドＲＮＡが、前記エンドヌクレアーゼと複合体を形成するように構成され、前記操作されたガイドＲＮＡが、標的核酸配列にハイブリダイズするように構成されたスペーサー配列を含む、操作されたガイドＲＮＡと、
    を含む、操作されたヌクレアーゼ系。
  135. 前記操作されたガイドポリヌクレオチドは、配列番号９０、９１、９２、９３、１１７、１５１、１５６～１８１、または２０９～２３４のいずれか１つあるいはその変異体に対して少なくとも８０％の同一性を有する少なくとも約４６～８０個の連続したヌクレオチドを含む配列を含む、請求項１３４に記載の操作されたヌクレアーゼ系。
  136. 前記操作されたガイドポリヌクレオチドは、配列番号１１１～１１４または２０１～２０６、２５５、２６２、２５６、２０９、２５７、２６３、２５８、２１０のいずれか１つあるいはその変異体の非縮重ヌクレオチドに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１３４または１３５に記載の操作されたヌクレアーゼ系。
  137. 操作されたヌクレアーゼ系であって、
    ＲｕｖＣドメインを含むエンドヌクレアーゼであって、
    前記エンドヌクレアーゼが未培養の微生物に由来し、前記エンドヌクレアーゼが、配列番号３８または配列番号１０８のいずれか１つあるいはその変異体に対して少なくとも８０％の同一性を有するクラスＩＩ、タイプＶ－Ｋのエンドヌクレアーゼである、エンドヌクレアーゼと、
    操作されたガイドＲＮＡであって、前記操作されたガイドＲＮＡが、前記エンドヌクレアーゼと複合体を形成するように構成され、前記操作されたガイドＲＮＡが、標的核酸配列にハイブリダイズするように構成されたスペーサー配列を含む、操作されたガイドＲＮＡと、
    を含む、操作されたヌクレアーゼ系。
  138. 前記操作されたガイドポリヌクレオチドは、配列番号１１８、１８２、１８３、２３５、または２３６のいずれか１つあるいはその変異体に対して少なくとも８０％の同一性を有する少なくとも約４６～８０個の連続したヌクレオチドを含む配列を含む、請求項１３７に操作された記載の操作されたヌクレアーゼ系。
  139. 前記操作されたガイドポリヌクレオチドは、配列番号１１１－１１４または２０１－２０６、２５５、２６２、２５６、２０９、２５７、２６３、２５８、２１０、１１５、１１６、２０５、２０６、２６１、２３５、２６０、または２３６のいずれか１つあるいはその変異体の非縮重ヌクレオチドに対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む、請求項１３７に記載の操作されたヌクレアーゼ系。
  140. 操作されたヌクレアーゼ系であって、
    配列番号４１～４３または４８～５０のいずれか１つあるいはその変異体に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む少なくとも１つのＣａｓ６、Ｃａｓ７、またはＣａｓ８ポリペプチドを含むクラスＩ、タイプＩ－ＦのＣａｓエンドヌクレアーゼと、
    操作されたガイドＲＮＡであって、前記操作されたガイドＲＮＡが、前記エンドヌクレアーゼと複合体を形成するように構成され、前記操作されたガイドＲＮＡが、標的核酸配列にハイブリダイズするように構成されたスペーサー配列を含む、操作されたガイドＲＮＡと、
    を含む、操作されたヌクレアーゼ系。
  141. 前記操作されたガイドポリヌクレオチドは、配列番号１２１、１２２、２０７、または２０８のいずれか１つの非縮重ヌクレオチドに対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む、請求項１４０に記載の操作されたヌクレアーゼ系。
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