KR20230054457A - 카고 뉴클레오타이드 서열을 전위시키는 시스템 및 방법 - Google Patents

카고 뉴클레오타이드 서열을 전위시키는 시스템 및 방법 Download PDF

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크리스토퍼 브라운
다니엘라 에스.에이. 골츠만
크리스티나 버터필드
리사 알렉산더
제이슨 리우
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메타지노미, 인크.
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Abstract

본 개시내용은 카고 뉴클레오타이드 서열을 표적 핵산 부위로 전위시키는 시스템 및 방법을 제공한다. 이 시스템 및 방법은 재조합효소 또는 전위효소 복합체와 상호작용하도록 구성된 카고 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 이중 가닥 핵산; Cas 이펙터, 및 표적 핵산 부위에 하이브리드화하도록 구성된 적어도 하나의 조작된 가이드 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 Cas 이펙터 복합체; 및 카고 뉴클레오타이드를 표적 핵산 부위로 끌어들이도록 구성된 재조합효소 또는 전위효소 복합체를 포함할 수 있다.

Description

카고 뉴클레오타이드 서열을 전위시키는 시스템 및 방법
관련 출원
본원은 2020년 8월 24일자로 출원된 미국 가출원 제63/069,703호(발명의 명칭: "SYSTEMS AND METHODS FOR TRANSPOSING CARGO NUCLEOTIDE SEQUENCES"), 2021년 5월 10일자로 출원된 미국 가출원 제63/186,698호(발명의 명칭: "SYSTEMS AND METHODS FOR TRANSPOSING CARGO NUCLEOTIDE SEQUENCES"), 및 2021년 8월 12일자로 출원된 미국 가출원 제63/232,593호(발명의 명칭: "SYSTEMS AND METHODS FOR TRANSPOSING CARGO NUCLEOTIDE SEQUENCES")의 이익을 주장하고, 이 출원들 각각은 전체적으로 본원에 참고로 포함된다.
Cas 효소는 그와 관련된 클러스터링된 규칙적으로 이격된 짧은 팔린드로믹 반복부(CRISPR) 가이드 리보핵산(RNA)과 함께 CRISPR-RNA 가이딩 핵산 절단을 통해 감염성 바이러스 및 플라스미드와 같은 비-자가 핵산으로부터 미생물을 보호하는 역할을 하는, 원핵생물 면역 시스템의 널리 보급된(박테리아의 약 45%, 고세균의 약 84%) 구성요소인 것으로 보인다. CRISPR RNA 요소를 코딩하는 데옥시리보핵산(DNA) 요소는 구조와 길이가 비교적 보존되어 있을 수 있지만, 그의 CRISPR 관련(Cas) 단백질은 매우 다양하며 다양한 핵산 상호작용 도메인을 함유한다. CRISPR DNA 요소는 1987년에 이미 관찰되었지만, CRISPR/Cas 복합체의 프로그래밍 가능한 엔도뉴클레아제(endonuclease) 절단 능력은 비교적 최근에야 인식되어, 다양한 DNA 조작 및 유전자 편집 응용분야에서 재조합 CRISPR/Cas 시스템의 사용으로 이어졌다.
서열목록
본원은 ASCII 형식으로 전자적으로 제출되었고 전체적으로 본원에 참고로 포함되는 서열목록을 함유한다. 2021년 8월 20일자로 생성된 상기 ASCII 사본은 명칭이 55921-714_601_SL.txt이고 크기가 488,452 바이트이다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 카고 뉴클레오타이드 서열을 표적 핵산 부위로 전위시키는 시스템으로서, 재조합효소(recombinase) 또는 전위효소(transposase) 복합체와 상호작용하도록 구성된 카고 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 이중 가닥 핵산; 클래스 II 타입 II Cas 이펙터, 및 상기 표적 핵산 부위에 하이브리드화하도록 구성된 적어도 하나의 조작된 가이드 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 Cas 이펙터 복합체; 및 상기 카고 뉴클레오타이드 서열을 상기 표적 핵산 부위로 끌어들이도록 구성된 상기 재조합효소 또는 전위효소 복합체를 포함하는 시스템을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 재조합효소 또는 전위효소 복합체는 상기 Cas 이펙터 복합체에 비공유 결합한다. 일부 실시양태에서, 상기 재조합효소 또는 전위효소 복합체는 상기 Cas 이펙터 복합체에 공유 결합한다. 일부 실시양태에서, 상기 재조합효소 또는 전위효소 복합체는 단일 폴리펩티드에서 상기 Cas 이펙터 복합체에 융합된다. 일부 실시양태에서, 상기 카고 뉴클레오타이드 서열은 좌측 전위효소 인식 서열 및 우측 전위효소 인식 서열에 의해 플랭킹된다. 일부 실시양태에서, 상기 시스템은 상기 표적 핵산 부위를 포함하는 제2 이중 가닥 핵산을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 시스템은 상기 표적 핵산 부위에 인접한 상기 Cas 이펙터 복합체와 호환되는 PAM 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 PAM 서열은 상기 표적 핵산 부위의 3'에 위치한다. 일부 실시양태에서, 상기 재조합효소 또는 전위효소 복합체는 Tn7 타입 전위효소 복합체이다. 일부 실시양태에서, 상기 조작된 가이드 폴리뉴클레오타이드는 상기 클래스 II 타입 II Cas 이펙터에 결합하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 상기 클래스 II 타입 II Cas 이펙터는 서열번호 1 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 동일성을 가진 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 재조합효소 또는 전위효소 복합체는 서열번호 2 내지 5 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 동일성을 가진 서열을 포함하는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개 또는 4개의 폴리펩티드(들)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 조작된 가이드 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 12 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 동일성을 가진 적어도 60개 내지 80개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 조작된 가이드 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 11 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 동일성을 가진 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 좌측 재조합효소 서열은 서열번호 17 및 18 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 동일성을 가진 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 우측 재조합효소 서열은 서열번호 19 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 동일성을 가진 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 클래스 II 타입 II Cas 이펙터 및 상기 재조합효소 또는 전위효소 복합체는 약 10 킬로염기 미만을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩된다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 카고 뉴클레오타이드 서열을, 표적 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 표적 핵산 부위로 전위시키는 방법으로서, 세포 내에서 본원에 기재된 측면 또는 실시양태 중 임의의 측면 또는 실시양태의 시스템을 발현시키거나 본원에 기재된 측면 또는 실시양태 중 임의의 측면 또는 실시양태의 시스템을 세포에 도입하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 카고 뉴클레오타이드 서열을 표적 핵산 부위로 전위시키는 시스템으로서, Tn7 타입 전위효소 복합체와 상호작용하도록 구성된 카고 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 이중 가닥 핵산; 클래스 II 타입 V Cas 이펙터, 및 상기 표적 뉴클레오타이드 서열에 하이브리드화하도록 구성된 조작된 가이드 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 Cas 이펙터 복합체; 및 상기 Cas 이펙터 복합체에 결합하도록 구성되고 TnsA 서브유닛을 포함하는 Tn7 타입 전위효소 복합체를 포함하는 시스템을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 전위효소 복합체는 상기 Cas 이펙터 복합체에 비공유 결합한다. 일부 실시양태에서, 상기 전위효소 복합체는 상기 Cas 이펙터 복합체에 공유 결합한다. 일부 실시양태에서, 상기 전위효소 복합체는 단일 폴리펩티드에서 상기 Cas 이펙터 복합체에 융합된다. 일부 실시양태에서, 상기 클래스 II 타입 V Cas 이펙터는 Cas12k 이펙터가 아니다. 일부 실시양태에서, 상기 카고 뉴클레오타이드 서열은 좌측 전위효소 인식 서열 및 우측 전위효소 인식 서열에 의해 플랭킹된다. 일부 실시양태에서, 상기 시스템은 상기 표적 핵산 부위를 포함하는 제2 이중 가닥 핵산을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 시스템은 상기 표적 핵산 부위에 인접한 상기 Cas 이펙터 복합체와 호환되는 PAM 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 PAM 서열은 상기 표적 핵산 부위의 5'에 위치한다. 일부 실시양태에서, 상기 조작된 가이드 폴리뉴클레오타이드는 상기 클래스 II 타입 V Cas 이펙터에 결합하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 상기 TnsA 서브유닛은 서열번호 7 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 동일성을 가진 서열을 가진 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 Tn7 타입 전위효소 복합체는 서열번호 8 내지 10 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 동일성을 가진 서열을 포함하는 적어도 1개, 적어도 2개 또는 3개의 폴리펩티드(들)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 조작된 가이드 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 13 내지 16 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 동일성을 가진 적어도 약 46개 내지 80개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 좌측 재조합효소 서열은 서열번호 20 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 동일성을 가진 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 우측 재조합효소 서열은 서열번호 21 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 동일성을 가진 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 클래스 II 타입 V Cas 이펙터는 Cas12k 이펙터가 아니다. 일부 실시양태에서, 상기 클래스 II 타입 V Cas 이펙터 및 상기 Tn7 타입 전위효소 복합체는 약 10 킬로염기 미만을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩된다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 카고 뉴클레오타이드 서열을, 표적 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 표적 핵산 부위로 전위시키는 방법으로서, 세포 내에서 본원에 기재된 측면 또는 실시양태 중 어느 한 측면 또는 실시양태의 시스템을 발현시키거나 본원에 기재된 측면 또는 실시양태 중 어느 한 측면 또는 실시양태의 시스템을 세포에 도입하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 카고 뉴클레오타이드 서열을 표적 핵산 부위로 전위시키는 방법으로서, 카고 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 이중 가닥 핵산을, 클래스 II 타입 II Cas 이펙터, 및 상기 표적 핵산 부위에 하이브리드화하도록 구성된 적어도 하나의 조작된 가이드 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 Cas 이펙터 복합체; 상기 카고 뉴클레오타이드를 상기 표적 핵산 부위로 끌어들이도록 구성된 재조합효소 또는 전위효소 복합체; 및 상기 표적 핵산 부위를 포함하는 제2 이중 가닥 핵산과 접촉시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 재조합효소 또는 전위효소 복합체는 상기 Cas 이펙터 복합체에 비공유 결합한다. 일부 실시양태에서, 상기 재조합효소 또는 전위효소 복합체는 상기 Cas 이펙터 복합체에 공유 결합한다. 일부 실시양태에서, 상기 재조합효소 또는 전위효소 복합체는 단일 폴리펩티드에서 상기 Cas 이펙터 복합체에 융합된다. 일부 실시양태에서, 상기 카고 뉴클레오타이드 서열은 좌측 전위효소 인식 서열 및 우측 전위효소 인식 서열에 의해 플랭킹된다. 일부 실시양태에서, 표적 핵산은 상기 표적 핵산 부위에 인접한 상기 Cas 이펙터 복합체와 호환되는 PAM 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 PAM 서열은 상기 표적 핵산 부위의 3'에 위치한다. 일부 실시양태에서, 상기 재조합효소 또는 전위효소 복합체는 Tn7 타입 전위효소 복합체이다. 일부 실시양태에서, 상기 조작된 가이드 폴리뉴클레오타이드는 상기 클래스 II 타입 II Cas 이펙터에 결합하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 상기 클래스 II 타입 II Cas 이펙터는 서열번호 1 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 동일성을 가진 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 재조합효소 또는 전위효소 복합체는 서열번호 2 내지 5 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 동일성을 가진 서열을 포함하는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개 또는 4개의 폴리펩티드(들)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 조작된 가이드 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 12 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 동일성을 가진 적어도 60개 내지 80개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 조작된 가이드 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 11 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 동일성을 가진 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 좌측 재조합효소 서열은 서열번호 17 및 18 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 동일성을 가진 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 우측 재조합효소 서열은 서열번호 19 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 동일성을 가진 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 클래스 II 타입 II Cas 이펙터 및 상기 Tn7 타입 전위효소 복합체는 약 10 킬로염기 미만을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩된다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 카고 뉴클레오타이드 서열을 표적 핵산 부위로 전위시키는 방법으로서, 상기 카고 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 이중 가닥 핵산을, 클래스 II 타입 V Cas 이펙터, 및 상기 표적 뉴클레오타이드 서열에 하이브리드화하도록 구성된 적어도 하나의 조작된 가이드 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 Cas 이펙터 복합체; 상기 Cas 이펙터 복합체에 결합하도록 구성되고 TnsA 서브유닛을 포함하는 Tn7 타입 전위효소 복합체; 및 상기 표적 핵산 부위를 포함하는 제2 이중 가닥 핵산과 접촉시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 전위효소 복합체는 상기 Cas 이펙터 복합체에 비공유 결합한다. 일부 실시양태에서, 상기 전위효소 복합체는 상기 Cas 이펙터 복합체에 공유 결합한다. 일부 실시양태에서, 상기 전위효소 복합체는 단일 폴리펩티드에서 상기 Cas 이펙터 복합체에 융합된다. 일부 실시양태에서, 상기 카고 뉴클레오타이드 서열은 좌측 전위효소 인식 서열 및 우측 전위효소 인식 서열에 의해 플랭킹된다. 일부 실시양태에서, 상기 표적 핵산 부위는 상기 표적 핵산 부위에 인접한 상기 Cas 이펙터 복합체와 호환되는 PAM 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 PAM 서열은 상기 표적 핵산 부위의 3'에 위치한다. 일부 실시양태에서, 상기 조작된 가이드 폴리뉴클레오타이드는 상기 클래스 II 타입 V Cas 이펙터에 결합하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 상기 TnsA 서브유닛은 서열번호 7 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 동일성을 가진 서열을 가진 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 Tn7 타입 전위효소 복합체는 서열번호 8 내지 10 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 동일성을 가진 서열을 포함하는 적어도 1개, 적어도 2개 또는 3개의 폴리펩티드(들)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 조작된 가이드 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 13 내지 16 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 동일성을 가진 적어도 약 46개 내지 80개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 좌측 재조합효소 서열은 서열번호 20 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 동일성을 가진 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 우측 재조합효소 서열은 서열번호 21 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 동일성을 가진 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 클래스 II 타입 V Cas 이펙터는 Cas12k 이펙터가 아니다. 일부 실시양태에서, 상기 클래스 II 타입 V Cas 이펙터 및 상기 Tn7 타입 전위효소 복합체는 약 10 킬로염기 미만을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩된다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 카고 뉴클레오타이드 서열을 표적 핵산 부위로 전위시키는 시스템으로서, Tn7 타입 전위효소 복합체와 상호작용하도록 구성된 카고 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 이중 가닥 핵산; 클래스 I 타입 I-F Cas 이펙터, 및 상기 표적 뉴클레오타이드 서열에 하이브리드화하도록 구성된 조작된 가이드 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 Cas 이펙터 복합체; 및 상기 Cas 이펙터 복합체에 결합하도록 구성되고 TnsA 서브유닛을 포함하는 Tn7 타입 전위효소 복합체를 포함하는 시스템을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 전위효소 복합체는 상기 Cas 이펙터 복합체에 비공유 결합한다. 일부 실시양태에서, 상기 전위효소 복합체는 상기 Cas 이펙터 복합체에 공유 결합한다. 일부 실시양태에서, 상기 전위효소 복합체는 단일 폴리펩티드에서 상기 Cas 이펙터 복합체에 융합된다. 일부 실시양태에서, 상기 카고 뉴클레오타이드 서열은 좌측 전위효소 인식 서열 및 우측 전위효소 인식 서열에 의해 플랭킹된다. 일부 실시양태에서, 상기 시스템은 상기 표적 핵산 부위를 포함하는 제2 이중 가닥 핵산을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 시스템은 상기 표적 핵산 부위에 인접한 상기 Cas 이펙터 복합체와 호환되는 PAM 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 PAM 서열은 상기 표적 핵산 부위의 3'에 위치한다. 일부 실시양태에서, 상기 PAM 서열은 상기 표적 핵산 부위의 5'에 위치한다. 일부 실시양태에서, 상기 조작된 가이드 폴리뉴클레오타이드는 상기 클래스 I 타입 I-F Cas 이펙터에 결합하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 상기 클래스 I 타입 I-F Cas 이펙터는 서열번호 41 내지 43 또는 48 내지 50 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 동일성을 가진 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 Tn7 타입 전위효소 복합체는 서열번호 44 내지 46 또는 51 내지 53 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 동일성을 가진 서열을 포함하는 적어도 1개, 적어도 2개 또는 3개의 폴리펩티드(들)를 포함한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 카고 뉴클레오타이드 서열을, 표적 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 표적 핵산 부위로 전위시키는 방법으로서, 세포 내에서 본원에 기재된 측면 또는 실시양태 중 어느 한 측면 또는 실시양태의 시스템을 발현시키거나 본원에 기재된 측면 또는 실시양태 중 어느 한 측면 또는 실시양태의 시스템을 세포에 도입하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 카고 뉴클레오타이드 서열을 표적 핵산 부위로 전위시키는 시스템으로서, Tn7 타입 전위효소 복합체와 상호작용하도록 구성된 카고 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 이중 가닥 핵산; 클래스 II 타입 V Cas 이펙터, 및 상기 표적 뉴클레오타이드 서열에 하이브리드화하도록 구성된 조작된 가이드 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 Cas 이펙터 복합체; 및 상기 Cas 이펙터 복합체에 결합하도록 구성되고 TnsB, TnsC 및 TniQ 구성요소를 포함하는 Tn7 타입 전위효소 복합체를 포함하는 시스템을 제공하는 것으로, 이때 (a) 상기 클래스 II 타입 V Cas 이펙터는 서열번호 22, 26, 30, 34, 55 내지 89, 104 또는 147 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 가진 서열을 가진 폴리펩티드를 포함하거나; (b) 상기 Tn7 타입 전위효소 복합체는 서열번호 23 내지 25, 27 내지 29, 31 내지 33, 35 내지 37, 101 내지 103, 105 내지 107 또는 148 내지 150 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 가진 서열을 가진 TnsB, TnsC 또는 TniQ 구성요소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 전위효소 복합체는 상기 Cas 이펙터 복합체에 비공유 결합한다. 일부 실시양태에서, 상기 전위효소 복합체는 상기 Cas 이펙터 복합체에 공유 결합한다. 일부 실시양태에서, 상기 전위효소 복합체는 단일 폴리펩티드에서 상기 Cas 이펙터 복합체에 융합된다. 일부 실시양태에서, 상기 클래스 II 타입 V Cas 이펙터는 서열번호 22, 26, 30, 34, 55 내지 89, 104 또는 147 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 가진 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 Tn7 타입 전위효소 복합체는 서열번호 23 내지 25, 27 내지 29, 31 내지 33, 35 내지 37, 101 내지 103, 105 내지 107 또는 148 내지 150 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 가진 서열을 포함하는 TnsB, TnsC 또는 TniQ 구성요소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 클래스 II 타입 V Cas 이펙터는 Cas12k 이펙터이다. 일부 실시양태에서, 상기 카고 뉴클레오타이드 서열은 좌측 전위효소 인식 서열 및 우측 전위효소 인식 서열에 의해 플랭킹된다. 일부 실시양태에서, 상기 시스템은 상기 표적 핵산 부위를 포함하는 제2 이중 가닥 핵산을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 시스템은 상기 표적 핵산 부위에 인접한 상기 Cas 이펙터 복합체와 호환되는 PAM 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 PAM 서열은 상기 표적 핵산 부위의 5'에 위치한다. 일부 실시양태에서, 상기 PAM 서열은 5'-nGTn-3' 또는 5'-nGTt-3'을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 조작된 가이드 폴리뉴클레오타이드는 상기 클래스 II 타입 V Cas 이펙터에 결합하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 상기 TnsB, TnsC 및 TniQ 구성요소는 각각 서열번호 23 내지 25, 27 내지 29, 31 내지 33, 35 내지 37, 101 내지 103, 105 내지 107 또는 148 내지 150 중 어느 하나에 대해 적어도 80% 동일성을 가진 서열을 가진 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 조작된 가이드 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 90, 91, 92, 93, 117, 151, 156 내지 181 또는 209 내지 234 중 어느 하나에 대해 적어도 80% 동일성을 가진 적어도 약 46개 내지 80개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 조작된 가이드 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 111 내지 114 또는 201 내지 206, 255, 262, 256, 209, 257, 263, 258, 210 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 가진 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 좌측 재조합효소 서열은 서열번호 125, 127, 123, 129, 131, 133, 153 또는 134 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 동일성을 가진 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 우측 재조합효소 서열은 서열번호 126, 155, 128, 124, 130, 132 또는 154 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 동일성을 가진 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 클래스 II 타입 V Cas 이펙터 및 상기 Tn7 타입 전위효소 복합체는 약 10 킬로염기 미만을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, (a) 상기 클래스 II 타입 V Cas 이펙터는 서열번호 22 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 가진 서열을 포함하거나; (b) 상기 좌측 재조합효소 서열은 서열번호 125 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 가진 서열을 포함하거나; (c) 상기 우측 재조합효소 서열은 서열번호 126 또는 155, 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 동일성을 가진 서열을 포함하거나; (d) 상기 조작된 가이드 폴리뉴클레오타이드는 (i) 서열번호 90의 적어도 약 46개 내지 60개의 뉴클레오타이드에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 가진 서열을 포함하거나, (ii) 서열번호 94, 112 또는 202 중 어느 하나의 비-축퇴 뉴클레오타이드에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 가진 서열을 포함하거나; (e) 상기 TnsB, TnsC 및 TniQ 구성요소는 서열번호 23 내지 25 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 가진 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, (a) 상기 클래스 II 타입 V Cas 이펙터는 서열번호 26 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 가진 서열을 포함하거나; (b) 상기 좌측 재조합효소 서열은 서열번호 127 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 가진 서열을 포함하거나; (c) 상기 우측 재조합효소 서열은 서열번호 128 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 가진 서열을 포함하거나; (d) 상기 조작된 가이드 폴리뉴클레오타이드 (i) 서열번호 91, 156 또는 209 중 어느 하나의 적어도 약 46개 내지 60개의 뉴클레오타이드에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 가진 서열을 포함하거나, (ii) 서열번호 95, 113 또는 203 중 어느 하나의 비-축퇴 뉴클레오타이드에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 가진 서열을 포함하거나; (e) 상기 TnsB, TnsC 및 TniQ 구성요소는 서열번호 27 내지 29 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 가진 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, (a) 상기 클래스 II 타입 V Cas 이펙터는 서열번호 60 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 가진 서열을 포함하거나; (b) 상기 좌측 재조합효소 서열은 서열번호 131 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 가진 서열을 포함하거나; (c) 상기 우측 재조합효소 서열은 서열번호 132 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 가진 서열을 포함하거나; (d) 상기 조작된 가이드 폴리뉴클레오타이드는 (i) 서열번호 117, 161 또는 214 중 어느 하나의 적어도 약 46개 내지 60개의 뉴클레오타이드에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 가진 서열을 포함하거나, (ii) 서열번호 119의 비-축퇴 뉴클레오타이드에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 가진 서열을 포함하거나; (e) 상기 TnsB, TnsC 및 TniQ 구성요소는 서열번호 101 내지 103 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 가진 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, (a) 상기 클래스 II 타입 V Cas 이펙터는 서열번호 147 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 가진 서열을 포함하거나; (b) 상기 좌측 재조합효소 서열은 서열번호 153 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 가진 서열을 포함하거나; (c) 상기 우측 재조합효소 서열은 서열번호 154 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 가진 서열을 포함하거나; (d) 상기 조작된 가이드 폴리뉴클레오타이드는 (i) 서열번호 151, 181 또는 234 중 어느 하나의 적어도 약 46개 내지 60개의 뉴클레오타이드에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 가진 서열을 포함하거나, (ii) 서열번호 152 또는 254의 비-축퇴 뉴클레오타이드에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 가진 서열을 포함하거나; (e) 상기 TnsB, TnsC 및 TniQ 구성요소는 서열번호 148 내지 150 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 가진 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, (a) 상기 클래스 II 타입 V Cas 이펙터는 서열번호 34 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 가진 서열을 포함하거나; (b) 상기 좌측 재조합효소 서열은 서열번호 129 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 가진 서열을 포함하거나; (c) 상기 우측 재조합효소 서열은 서열번호 130 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 가진 서열을 포함하거나; (d) 상기 조작된 가이드 폴리뉴클레오타이드는 (i) 서열번호 93, 157 또는 210 중 어느 하나의 적어도 약 46개 내지 60개의 뉴클레오타이드에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 가진 서열을 포함하거나, (ii) 서열번호 97, 114 또는 204 중 어느 하나의 비-축퇴 뉴클레오타이드에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 가진 서열을 포함하거나; (e) 상기 TnsB, TnsC 및 TniQ 구성요소는 서열번호 148 내지 150 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 가진 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, (a) 상기 클래스 II 타입 V Cas 이펙터는 서열번호 30 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 가진 서열을 포함하거나; (b) 상기 좌측 재조합효소 서열은 서열번호 123 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 가진 서열을 포함하거나; (c) 상기 우측 재조합효소 서열은 서열번호 124 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 동일성을 가진 서열을 포함하거나; (d) 상기 조작된 가이드 폴리뉴클레오타이드는 (i) 서열번호 92의 적어도 약 46개 내지 80개의 뉴클레오타이드에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 가진 서열을 포함하거나, (ii) 서열번호 111 또는 201의 비-축퇴 뉴클레오타이드에 대해 적어도 80% 동일성을 가진 서열을 포함하거나; (e) 상기 TnsB, TnsC 및 TniQ 구성요소는 서열번호 31, 32 및 33 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 동일성을 가진 서열을 가진 폴리펩티드를 포함하거나; (f) 상기 PAM 서열은 5'-nGTn-3' 또는 5'-nGTt-3'을 포함한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 카고 뉴클레오타이드 서열을 표적 핵산 부위로 전위시키는 시스템으로서, Tn7 타입 전위효소 복합체와 상호작용하도록 구성된 카고 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 이중 가닥 핵산; 클래스 II 타입 V Cas 이펙터, 및 상기 표적 뉴클레오타이드 서열에 하이브리드화하도록 구성된 조작된 가이드 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 Cas 이펙터 복합체; 및 상기 Cas 이펙터 복합체에 결합하도록 구성되고 TnsB 및 TnsC 구성요소를 포함하지만 TnsA 및/또는 TniQ 구성요소를 포함하지 않는 Tn7 타입 전위효소 복합체를 포함하는 시스템을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 전위효소 복합체는 상기 Cas 이펙터 복합체에 비공유 결합한다. 일부 실시양태에서, 상기 전위효소 복합체는 상기 Cas 이펙터 복합체에 공유 결합한다. 일부 실시양태에서, 상기 전위효소 복합체는 단일 폴리펩티드에서 상기 Cas 이펙터 복합체에 융합된다. 일부 실시양태에서, 상기 Tn7 타입 전위효소 복합체는 서열번호 39, 40, 109 또는 110 중 어느 하나에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 가진 서열을 가진 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 TnsB 구성요소는 서열번호 40 또는 109에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 가진 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 TnsC 구성요소는 서열번호 39 또는 110에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 가진 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 클래스 II 타입 V Cas 이펙터는 Cas12k 이펙터이다. 일부 실시양태에서, 상기 클래스 II 타입 V Cas 이펙터는 서열번호 38 또는 서열번호 108에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 가진 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 카고 뉴클레오타이드 서열은 좌측 전위효소 인식 서열 및 우측 전위효소 인식 서열에 의해 플랭킹된다. 일부 실시양태에서, 상기 시스템은 상기 표적 핵산 부위를 포함하는 제2 이중 가닥 핵산을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 표적 핵산 부위를 포함하는 상기 이중 가닥 핵산 또는 상기 시스템은 세포 내부에 있다. 일부 실시양태에서, 상기 시스템은 상기 표적 핵산 부위에 인접한 상기 Cas 이펙터 복합체와 호환되는 PAM 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 PAM 서열은 상기 표적 핵산 부위의 5'에 위치한다. 일부 실시양태에서, 상기 조작된 가이드 폴리뉴클레오타이드는 상기 클래스 II 타입 V Cas 이펙터에 결합하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 상기 TnsB 및 TnsC 구성요소는 각각 서열번호 40 및 39 또는 109 및 110에 대해 적어도 80% 동일성을 가진 서열을 가진 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 조작된 가이드 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 118, 182, 183, 235 또는 236 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 동일성을 가진 적어도 약 46개 내지 80개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 조작된 가이드 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 115, 116, 205, 206, 261, 235, 260 또는 236 중 어느 하나 또는 이의 변이체의 비-축퇴 뉴클레오타이드에 대해 적어도 80% 동일성을 가진 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 좌측 재조합효소 서열은 서열번호 134에 대해 적어도 80% 동일성을 가진 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 우측 재조합효소 서열은 서열번호 135 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 동일성을 가진 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 클래스 II 타입 V Cas 이펙터 및 상기 Tn7 타입 전위효소 복합체는 약 10 킬로염기 미만을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, (a) 상기 클래스 II 타입 V Cas 이펙터는 서열번호 38 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 가진 서열을 포함하거나; (b) 상기 좌측 재조합효소 서열은 서열번호 134 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 가진 서열을 포함하거나; (c) 상기 우측 재조합효소 서열은 서열번호 135 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 동일성을 가진 서열을 포함하거나; (d) 상기 조작된 가이드 폴리뉴클레오타이드는 (i) 서열번호 182 또는 235의 적어도 약 46개 내지 80개의 뉴클레오타이드에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 가진 서열을 포함하거나, (ii) 서열번호 98, 115, 116, 205 또는 206의 비-축퇴 뉴클레오타이드에 대해 적어도 80% 동일성을 가진 서열을 포함하거나; (e) 상기 TnsB 및 TnsC 구성요소는 서열번호 40 및 39 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 동일성을 가진 서열을 가진 폴리펩티드를 포함한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 RuvC 도메인 및 HNH 도메인을 포함하는 엔도뉴클레아제; 및 조작된 가이드 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 조작된 뉴클레아제 시스템을 제공하는 것으로, 이때 상기 엔도뉴클레아제는 배양되지 않은 미생물로부터 유래하고 상기 엔도뉴클레아제는 서열번호 1 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 동일성을 가진 서열을 포함하는 클래스 II 타입 II 엔도뉴클레아제이고, 상기 조작된 가이드 폴리뉴클레오타이드는 상기 엔도뉴클레아제와 복합체를 형성하도록 구성되고 상기 조작된 가이드 폴리뉴클레오타이드는 표적 핵산 서열에 하이브리드화하도록 구성된 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 조작된 가이드 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 12 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 동일성을 가진 적어도 60개 내지 80개의 연속 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 조작된 가이드 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 11 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 동일성을 가진 서열을 포함한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 RuvC 도메인을 포함하는 엔도뉴클레아제; 및 조작된 가이드 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 조작된 뉴클레아제 시스템을 제공하는 것으로, 이때 상기 엔도뉴클레아제는 배양되지 않은 미생물로부터 유래하고, 상기 엔도뉴클레아제는 서열번호 5에 대해 적어도 80% 동일성을 가진 클래스 II 타입 V 엔도뉴클레아제이고, 상기 조작된 가이드 폴리뉴클레오타이드는 상기 엔도뉴클레아제와 복합체를 형성하도록 구성되고, 상기 조작된 가이드 RNA는 표적 핵산 서열에 하이브리드화하도록 구성된 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 조작된 가이드 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 13 내지 16 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 동일성을 가진 적어도 약 46개 내지 80개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 서열을 포함한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 RuvC 도메인을 포함하는 엔도뉴클레아제; 및 조작된 가이드 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 조작된 뉴클레아제 시스템을 제공하는 것으로, 이때 상기 엔도뉴클레아제는 배양되지 않은 미생물로부터 유래하고, 상기 엔도뉴클레아제는 서열번호 22, 26, 30, 34, 55 내지 89, 104 또는 147 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 동일성을 가진 클래스 II 타입 V-K 엔도뉴클레아제이고, 상기 조작된 가이드 폴리뉴클레오타이드는 상기 엔도뉴클레아제와 복합체를 형성하도록 구성되고, 상기 조작된 가이드 RNA는 표적 핵산 서열에 하이브리드화하도록 구성된 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 조작된 가이드 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 90, 91, 92, 93, 117, 151, 156 내지 181 또는 209 내지 234 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 동일성을 가진 적어도 약 46개 내지 80개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 조작된 가이드 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 111 내지 114 또는 201 내지 206, 255, 262, 256, 209, 257, 263, 258, 210 중 어느 하나 또는 이의 변이체의 비-축퇴 뉴클레오타이드에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 가진 서열을 포함한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 RuvC 도메인을 포함하는 엔도뉴클레아제; 및 조작된 가이드 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 조작된 뉴클레아제 시스템을 제공하는 것으로, 이때 상기 엔도뉴클레아제는 배양되지 않은 미생물로부터 유래하고, 상기 엔도뉴클레아제는 서열번호 38 또는 서열번호 108 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 동일성을 가진 클래스 II 타입 V-K 엔도뉴클레아제이고, 상기 조작된 가이드 폴리뉴클레오타이드는 상기 엔도뉴클레아제와 복합체를 형성하도록 구성되고, 상기 조작된 가이드 RNA는 표적 핵산 서열에 하이브리드화하도록 구성된 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 조작된 가이드 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 118, 182, 183, 235 또는 236 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 동일성을 가진 적어도 약 46개 내지 80개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 조작된 가이드 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 111 내지 114 또는 201 내지 206, 255, 262, 256, 209, 257, 263, 258, 210, 115, 116, 205, 206, 261, 235, 260 또는 236 중 어느 하나 또는 이의 변이체의 비-축퇴 뉴클레오타이드에 대해 적어도 80% 동일성을 가진 서열을 포함한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 서열번호 41 내지 43 또는 48 내지 50 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 동일성을 가진 서열을 포함하는 적어도 하나의 Cas6, Cas7 또는 Cas8 폴리펩티드를 포함하는 클래스 I 타입 I-F Cas 엔도뉴클레아제; 및 조작된 가이드 RNA를 포함하는 조작된 뉴클레아제 시스템을 제공하는 것으로, 이때 상기 조작된 가이드 RNA는 상기 엔도뉴클레아제와 복합체를 형성하도록 구성되고, 상기 조작된 가이드 RNA는 표적 핵산 서열에 하이브리드화하도록 구성된 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 조작된 가이드 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 121, 122, 207 또는 208 중 어느 하나의 비-축퇴 뉴클레오타이드에 대해 적어도 80% 동일성을 가진 서열을 포함한다.
본 개시내용의 추가 측면 및 장점은 본 개시내용의 예시적인 실시양태만이 제시되고 기재되어 있는 하기 상세한 설명으로부터 당분야에서 숙련된 자에게 용이하게 명백해질 것이다. 인식될 바와 같이, 본 개시내용은 다른 상이한 실시양태를 가능하게 하고, 이의 여러 세부사항은 모두 본 개시내용을 벗어나지 않으면서 다양한 자명한 관점에서 변형될 수 있다. 따라서, 도면 및 설명은 본질적으로 예시적인 것으로서 간주되어야 하며, 제한적인 것으로서 간주되어서는 안 된다.
참고에 의한 포함
본 명세서에서 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은, 각각의 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원이 참고로 포함되는 것으로 구체적 및 개별적으로 표시된 것처럼 동일한 정도로 본원에 참고로 포함된다.
본 발명의 신규 특징은 첨부된 청구범위에 구체적으로 기재되어 있다. 본 발명의 특징 및 장점은 본 발명의 원리가 활용되는 예시적인 실시양태를 설명하는 하기 상세한 설명 및 첨부된 도면(본원에서 "도면" 및 "도"로서도 기재됨)을 참조함으로써 더 잘 이해될 것이다:
도 1은 상이한 클래스 및 타입의 CRISPR/Cas 유전자좌의 전형적인 조직화를 도시한다.
도 2는 crRNA와 tracrRNA가 연결되어 있는 하이브리드 sgRNA에 비해 천연 클래스 II 타입 II crRNA/tracrRNA 쌍의 구조를 도시한다.
도 3은 Tn7 및 Tn7 유사 요소에서 발견되는 2개의 경로를 도시한다.
도 4는 패밀리 MG36의 타입 II Tn7 환원 CAST의 게놈 환경을 도시한다. 도 4A는 MG36-5 CAST 시스템이 CRISPR 어레이(CRISPR 반복부), RuvC 및 HNH 엔도뉴클레아제 도메인을 가진 타입 II 뉴클레아제, 및 4개의 예측된 전위효소 단백질 오픈 리딩 프레임으로 구성됨을 보여준다. 촉매 전위효소 TnsB는 2개의 서브유닛으로서 코딩된다. 도 4B는 MG36-1 CAST 시스템에 대해 2개의 트랜스포존 말단(TIR-1 및 TIR-2)이 예측됨을 보여준다. 도 4C는 주석이 달린 반복부가 화살표로 표시되어 있는, 예측된 타입 II Tn7 환원 CAST 트랜스포존 좌측 말단(LE) 및 우측 말단(RE) 서열의 정렬을 보여준다. 좌측 말단 및 우측 말단은 이들의 배향으로 표지부착되었다.
도 5는 패밀리 MG39의 타입 V Tn7 CAST의 게놈 환경을 보여준다. 도 5A는 MG39-1 CAST 시스템이 타입 V 뉴클레아제, 4개의 예측된 트랜스포존 단백질(TnsABC 및 TniQ) 및 CRISPR 어레이로 구성됨을 보여준다. MG39-1 CAST 시스템(TIR-1)에 대해 트랜스포존 말단이 예측되었다. 도 5B는 주석이 달린 역반복부가 화살표로 표시되어 있는, 예측된 타입 V Tn7 CAST 트랜스포존 좌측 말단(LE) 및 우측 말단(RE) 서열의 정렬을 보여준다.
도 6 및 도 7은 본원에 기재된 CAST 시스템의 상응하는 sgRNA의 예측된 구조(예를 들어, 실시예 3에서 예측됨)를 도시한다.
도 8은 본원에 기재된 시스템인 MG108-1의 게놈 환경을 도시한다. 이 후보는 천연적으로 TniQ를 결여하는 Cas12K CAST이다. 게놈 단편 내의 유전자는 화살표로 표시되어 있다.
도 9는 Cas12k 이펙터 서열의 계통발생학적 유전자 트리(tree)를 도시한다. 이 트리는 여기서 회수된 64개의 Cas12k 서열(주황색 및 흑색 분지)과 공개 데이터베이스로부터의 229개의 기준 Cas12k 서열(회색 분지)의 다중 서열 정렬로부터 유추되었다. 주황색 분지는 CAST 트랜스포존 구성요소와의 연관성이 확인된 Cas12k 이펙터를 표시한다.
도 10은 MG110 캐스케이드 CAST를 도시한다. A) MG110-1 캐스케이드 CAST의 게놈 환경. 완전한 Tn7 스위트(suite)(TnsA, TnsB, TnsC/TniB, TniQ) 및 결함 캐스케이드 스위트(Cas6, Cas7, 융합된 Cas5-Cas8)는 주황색 화살표로 표시되어 있다. CAST 트랜스포존을 플랭킹하는 TIR은 연결된 화살표로 표시되어 있다. B) 반복부 2차 구조는 crRNA의 스템-루프 구조를 표시한다. C) 아스퍼길루스 우다니스(A. wodanis), 비브리오 콜레라(V. cholerae)로부터의 CRISPR 반복부와 MG110 패밀리 CAST의 서열 정렬은 crRNA 스템-루프 2차 구조를 표시하는 보존된 모티프를 표시한다.
도 11a는 MG64-3 CRISPR 유전자좌를 도시한다. tracrRNA는 CRISPR 어레이로부터 업스트림에 코딩되어 있는 반면, 트랜스포존 말단은 다운스트림에 코딩되어 있다(내부 흑색 상자). 부분적 3' CRISPR 반복부 및 부분적 스페이서에 상응하는 서열은 트랜스포존 내부에 코딩되어 있다(바깥쪽 상자). 자가 일치 스페이서는 트랜스포존 말단의 외부에 코딩되어 있다. 도 11b는 본원에서 제공된 다양한 CAST에 대한 tracrRNA 서열 정렬을 도시한다. tracrRNA 서열의 정렬은 보존 영역을 보여준다. 구체적으로, 서열 위치 92 내지 98(상단 상자)에 있는 서열 "TGCTTTC"는 sgRNA 3 차 구조 및 crRNA와의 비-연속 반복부-항-반복부 페어링에 중요한 것으로 제안된다. 본 발명자들은 또한 위치 265 내지 278(하단 상자)에 있는 헤어핀 "CYCC(n6) GGRG"가 기능에 중요하며, 아마도 crRNA 페어링을 위한 다운스트림 서열을 위치시키는 데 중요하다고 제안한다. 도 11c는 예를 들어, MG64-2, MG64-4, MG64-5, MG64-6, MG64-7 및 MG108-1 패밀리에서 다른 중요한 반복부-항-반복부(RAR) 모티브의 존재를 보여준다.
도 12a는 MG64-2 sgRNA의 예측된 구조를 도시한다. 도 12b는 MG64-4 sgRNA의 예측된 구조를 도시한다. 도 12c는 MG64-6 sgRNA의 예측된 구조를 도시한다. 도 12d는 MG64-7 sgRNA의 예측된 구조를 도시한다. 도 12e는 MG108-1 sgRNA의 예측된 구조를 도시한다.
도 13은 MG64-6이 시험관내에서 활성을 나타냄을 입증하는 PCR, PAM 및 생거(Sanger) 시퀀싱 데이터를 도시한다. 시험관내 표적화된 인테그라제(integrase) 활성에 대해 기재된 프로토콜을 이용하여, 이펙터 단백질 및 이의 TnsB, TnsC 및 TniQ 단백질을 시험관내 전사/번역 시스템에서 발현시켰다. 번역 후, 표적 DNA, 카고 DNA 및 sgRNA를 반응 완충제에 첨가하였다. 표적/기증자(donor) 연접부 전체에 걸쳐 PCR로 통합을 어세이하였다. 도 13a는 apo(sgRNA 없음), 및 sgRNA 64-6 sgRNA를 가진 64-6을 보여주는 전위의 PCR의 겔 이미지를 도시한다. PCR 3은 PAM으로부터 먼 RE 연접부를 검출한다. PCR 4는 PAM으로부터 먼 LE 연접부이다. PCR 5는 PAM에 가까운 RE 연접부이다. PCR 6은 PAM에 가까운 LE 연접부이다. PCR은 상이한 가능한 배향에 걸쳐 페어링된다(PCR 3 및 6 대 PCR 4 및 5). LE-PAM 근위 및 RE-PAM 원위 배향이 바람직하다. 도 13b는 시험관내 전위 어세이, 시퀀싱 PCR 5 및 6으로부터의 PAM을 도시한다. 도 13c는 기증자 DNA에서 절제가 일어나는 전위의 연접부를 보여주는 생거 데이터를 도시한다. 첫 번째 패널은 PCR 3 및 5(RE)를 보여준다. 두 번째 패널은 PCR 4 및 6(LE)을 보여준다. 생거 시퀀싱 반응은 기증자-표적 생성물의 생거 시퀀싱 반응이므로, 시퀀싱이 기증자 DNA와 일치하지 않는 시점은 연접이 일어나는 때이다(시퀀싱 피크 아래의 어두운 막대).
도 14는 삽입 부위 선호도를 보여주는, 시험관내 전위 생성물의 차세대 시퀀싱(NGS) 결과를 도시한다. NGS 리드는 위치 60에서 전위를 가진 기준 서열에 비해 CRISPResso2에서 프로세싱되었다. 이것으로부터의 삽입결실(Indel)은 이 임의 기준 서열보다 더 빠르거나 더 늦은 전위에 상응한다.
도 15는 64-2 TnsB 및 이의 RE DNA 서열의 전기영동 이동성 변위 어세이(EMSA) 결과를 도시한다. EMSA 결과는 결합 및 TnsB 인식을 확인시켜준다. TnsB 단백질을 시험관내 전사/번역 시스템에서 발현시키고, RE 서열을 함유하는 FAM 표지부착된 DNA와 함께 인큐베이션한 다음, 천연 5% TBE 겔에서 분리하였다. 결합은 표지부착된 밴드에서 상향변위로서 관찰된다. 다수의 TnsB 결합 부위는 EMSA에서 다수의 변위로 이어진다. 레인 1: FAM 표지부착된 DNA 단독. 레인 2: FAM DNA와 시험관내 전사/번역 시스템(TnsB 단백질 없음). 레인 3: FAM DNA와 TnsB. 레인 3에서 표지부착된 밴드의 상향변위는 TnsB에 의한 RE 서열의 결합을 표시하고, 이는 이 밴드가 활성 RE 전위 서열을 함유함을 표시한다.
서열목록의 간단한 설명
본원과 함께 출원된 서열목록은 본 개시내용에 따른 방법, 조성물 및 시스템에 사용하기 위한 예시적인 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩티드 서열을 제공한다. 서열목록 내의 서열의 예시적인 설명은 이하에 제공된다.
MG36
서열번호 1은 MG36 Cas 이펙터의 전체 길이 펩티드 서열을 보여준다.
서열번호 2 내지 5는 MG36 Cas 이펙터와 회합된 재조합효소 또는 전위효소 복합체를 포함할 수 있는 MG36 전위 단백질의 펩티드 서열을 보여준다. 표지 말단에의 -B1, -B2, -T1 및 -C의 추가는 각각 Tn7 유사 시스템의 TnsB1, TnsB2, TnsT1 및 TniC 단백질과의 유사성을 표시한다.
서열번호 11은 MG36 Cas 이펙터와 함께 작용하도록 조작된 sgRNA의 뉴클레오타이드 서열을 보여준다.
서열번호 12는 MG36 Cas 이펙터와 동일한 유전자좌로부터 유래한 MG36 tracrRNA의 뉴클레오타이드 서열을 보여준다.
서열번호 17 및 18은 MG36 시스템과 회합된 좌측 전위효소 인식 서열의 뉴클레오타이드 서열을 보여준다.
서열번호 19는 MG36 시스템과 회합된 우측 전위효소 인식 서열의 뉴클레오타이드 서열을 보여준다.
MG39
서열번호 6은 MG39-1 Cas 이펙터의 전체 길이 펩티드 서열을 보여준다.
서열번호 7 내지 10은 MG39-1 Cas 이펙터와 회합된 재조합효소 또는 전위효소 복합체를 포함할 수 있는 MG39-1 전위 단백질의 펩티드 서열을 보여준다.
서열번호 13 내지 16은 MG39 Cas 이펙터와 동일한 유전자좌로부터 유래한 MG39 tracrRNA의 뉴클레오타이드 서열을 보여준다.
서열번호 20은 MG39 시스템과 회합된 좌측 전위효소 인식 서열의 뉴클레오타이드 서열을 보여준다.
서열번호 21은 MG39 시스템과 회합된 우측 전위효소 인식 서열의 뉴클레오타이드 서열을 보여준다.
MG64
서열번호 22, 26, 30, 34, 55 내지 89, 104 및 147은 MG64 Cas 이펙터의 전체 길이 펩티드 서열을 보여준다.
서열번호 23 내지 25, 27 내지 29, 31 내지 33, 35 내지 37, 101 내지 103, 105 내지 107, 및 148 내지 150은 MG64 Cas 이펙터와 회합된 재조합효소 또는 전위효소 복합체를 포함할 수 있는 MG64 전위 단백질의 펩티드 서열을 보여준다. 표지 말단에의 -A, -B, -C 및 -Q의 추가는 각각 Tn7 유사 시스템의 TnsA, TnsB, TnsC 및 TniQ 단백질과의 유사성을 표시한다.
서열번호 90 내지 93, 117, 151, 156 내지 181, 및 209 내지 234는 MG64 이펙터와 동일한 유전자좌로부터 유래한 MG64 tracrRNA의 뉴클레오타이드 서열을 보여준다.
서열번호 94 내지 97, 119, 152, 및 184 내지 200은 MG64 표적 CRISPR 반복부의 뉴클레오타이드 서열을 보여준다.
서열번호 237 내지 259는 MG64 crRNA의 뉴클레오타이드 서열을 보여준다.
서열번호 111 내지 114 및 201 내지 204는 MG64 Cas 이펙터와 함께 작용하도록 조작된 단일 가이드 RNA의 뉴클레오타이드 서열을 보여준다.
서열번호 123, 125, 127, 129, 131, 133 및 153은 MG64 시스템과 회합된 좌측 전위효소 인식 서열의 뉴클레오타이드 서열을 보여준다.
서열번호 124, 126, 128, 130, 132, 154 및 155는 MG64 시스템과 회합된 우측 전위효소 인식 서열의 뉴클레오타이드 서열을 보여준다.
MG108
서열번호 38 및 108은 MG108 Cas 이펙터의 전체 길이 펩티드 서열을 보여준다.
서열번호 39, 40, 109 및 110은 MG108 Cas 이펙터와 회합된 재조합효소 또는 전위효소 복합체를 포함할 수 있는 MG108 전위 단백질의 펩티드 서열을 보여준다. 표지 말단에의 -A, -B, -C 및 -Q의 추가는 각각 Tn7 유사 시스템의 TnsA, TnsB, TnsC 및 TniQ 단백질과의 유사성을 표시한다.
서열번호 98 및 120은 MG108 표적 CRISPR 반복부의 뉴클레오타이드 서열을 보여준다.
서열번호 260 및 261은 MG108 crRNA의 뉴클레오타이드 서열을 보여준다.
서열번호 115, 116, 205 및 206은 MG108 Cas 이펙터와 함께 작용하도록 조작된 단일 가이드 RNA의 뉴클레오타이드 서열을 보여준다.
서열번호 118, 182, 183, 235 및 236은 MG108 이펙터와 동일한 유전자좌로부터 유래한 MG108 tracrRNA의 뉴클레오타이드 서열을 보여준다.
서열번호 134는 MG108 시스템과 회합된 좌측 전위효소 인식 서열의 뉴클레오타이드 서열을 보여준다.
서열번호 135는 MG108 시스템과 회합된 우측 전위효소 인식 서열의 뉴클레오타이드 서열을 보여준다.
MG110
서열번호 41 내지 43 및 48 내지 50은 MG110 Cas 이펙터의 전체 길이 펩티드 서열을 보여준다. 표지 말단에의 -6, -7 및 -8의 추가는 각각 클래스 I 타입 I-F 시스템의 cas6, cas7 및 cas8 단백질과의 유사성을 표시한다.
서열번호 44 내지 47 및 51 내지 54는 MG110 Cas 이펙터와 회합된 재조합효소 또는 전위효소 복합체를 포함할 수 있는 MG110 전위 단백질의 펩티드 서열을 보여준다. 표지 말단에의 -A, -B, -C 및 -Q의 추가는 각각 Tn7 유사 시스템의 TnsA, TnsB, TnsC 및 TniQ 단백질과의 유사성을 표시한다.
서열번호 99 및 100은 MG110 표적 CRISPR 반복부의 뉴클레오타이드 서열을 보여준다.
서열번호 121, 122, 207 및 208은 MG110 crRNA의 뉴클레오타이드 서열을 보여준다.
서열번호 136 및 138은 MG110 시스템과 회합된 좌측 전위효소 인식 서열의 뉴클레오타이드 서열을 보여준다.
서열번호 137 및 139는 MG110 시스템과 회합된 우측 전위효소 인식 서열의 뉴클레오타이드 서열을 보여준다.
다른 서열
서열번호 140 및 141은 핵 국소화 신호의 펩티드 서열을 보여준다.
서열번호 142 및 143은 링커의 펩티드 서열을 보여준다.
서열번호 144 내지 146은 에피토프 태그의 펩티드 서열을 보여준다.
본 발명의 다양한 실시양태가 본원에 제시되고 기재되었지만, 이러한 실시양태가 단지 예시로서만 제공된다는 것은 당분야에서 숙련된 자에게 자명할 것이다. 본 발명을 벗어나지 않으면서 수많은 변경, 변화 및 치환이 당분야에서 숙련된 자에게 인식될 수 있다. 본원에 기재된 본 발명의 실시양태에 대한 다양한 대안이 사용될 수 있다는 것을 이해해야 한다.
달리 표시되지 않는 한, 본원에 개시된 일부 방법의 실시는 면역학, 생화학, 화학, 분자생물학, 미생물학, 세포생물학, 유전체학 및 재조합 DNA의 기법을 이용한다. 예를 들어, 문헌[Sambrook and Green, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th Edition (2012); the series Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel, et al. eds.); the series Methods In Enzymology (Academic Press, Inc.), PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds. (1995)), Harlow and Lane, eds. (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, and Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications, 6th Edition (R.I. Freshney, ed. (2010))](이들은 전체적으로 본원에 참고로 포함됨)을 참조한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 문맥이 달리 명시하지 않는 한, 단수 형태는 복수 형태도 포함하기 위한 것이다. 더욱이, 용어 "포함하는", "포함한다", "가진", "가진다", "와 함께" 또는 이들의 파생어가 상세한 설명 및/또는 청구범위에서 사용되는 범위에서, 이러한 용어들은 용어 "포함하는"과 유사한 방식으로 포괄하기 위한 것이다.
용어 "약" 또는 "대략"은 부분적으로 값이 측정되거나 결정되는 방법, 즉 측정 시스템의 한계에 의해 좌우될 수 있는, 당분야에서 통상의 기술을 가진 자에 의해 결정된 특정 값에 대한 허용되는 오차 범위 내에 있음을 의미한다. 예를 들어, "약"은 당분야의 관행에 따라 하나 또는 하나 초과의 표준 편차 이내에 있음을 의미할 수 있다. 대안적으로, "약"은 주어진 값의 최대 20%, 최대 15%, 최대 10%, 최대 5% 또는 최대 1%의 범위를 의미할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "세포"는 일반적으로 생물학적 세포를 지칭한다. 세포는 살아있는 유기체의 기본 구조적, 기능적 및/또는 생물학적 유닛일 수 있다. 세포는 하나 이상의 세포를 가진 임의의 유기체로부터 유래할 수 있다. 일부 비제한적 예는 원핵세포, 진핵세포, 박테리아 세포, 고세균 세포, 단세포 진핵생물 유기체의 세포, 원생동물 세포, 식물의 세포(예를 들어, 식물 작물, 과일, 채소, 곡물, 대두, 옥수수, 수수, 밀, 종자, 토마토, 쌀, 카사바, 사탕수수, 호박, 건초, 감자, 목화, 대마초, 담배, 개화 식물, 침엽수, 겉씨식물, 양치류, 클럽모스, 뿔풀, 간풀, 이끼), 조류 세포(예를 들어, 보트리오코커스 브라우니(Botryococcus braunii), 클라미도모나스 레인하르티(Chlamydomonas reinhardtii), 난노클로롭시스 가디타나(Nannochloropsis gaditana), 클로렐라 피레노이도사(Chlorella pyrenoidosa), 사르가섬 파텐스 씨. 아가드(Sargassum patens C. Agardh) 등), 해조류(예를 들어, 다시마), 진균 세포(예를 들어, 효모 세포, 버섯의 세포), 동물 세포, 무척추 동물의 세포(예를 들어, 초파리, 자포동물, 극피동물, 선충 등), 척추 동물의 세포(예를 들어, 어류, 양서류, 파충류, 조류, 포유류), 포유류(예를 들어, 돼지, 소, 염소, 양, 설치류, 래트, 마우스, 비인간 영장류, 인간 등)의 세포 등을 포함한다. 종종 세포는 천연 유기체로부터 유래하지 않는다(예를 들어, 세포는 합성에 의해 만들어질 수 있고 종종 인공 세포로서 지칭된다).
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "뉴클레오타이드"는 일반적으로 염기-당-포스페이트 조합을 의미한다. 뉴클레오타이드는 합성 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 뉴클레오타이드는 합성 뉴클레오타이드 유사체를 포함할 수 있다. 뉴클레오타이드는 핵산 서열(예를 들어, 데옥시리보핵산(DNA) 및 리보핵산(RNA))의 단량체 유닛일 수 있다. 용어 뉴클레오타이드는 리보뉴클레오사이드 트리포스페이트 아데노신 트리포스페이트(ATP), 우리딘 트리포스페이트(UTP), 사이토신 트리포스페이트(CTP), 구아노신 트리포스페이트(GTP) 및 데옥시리보뉴클레오사이드 트리포스페이트, 예컨대, dATP, dCTP, dITP, dUTP, dGTP, dTTP, 또는 이들의 유도체를 포함할 수 있다. 이러한 유도체는 예를 들어, [αS]dATP, 7-데아자-dGTP 및 7-데아자-dATP, 및 이를 함유하는 핵산 분자에 뉴클레아제 내성을 부여하는 뉴클레오타이드 유도체를 포함할 수 있다. 본원에서 사용된 용어 뉴클레오타이드는 디데옥시리보뉴클레오사이드 트리포스페이트(ddNTP) 및 이의 유도체를 지칭할 수 있다. 디데옥시리보뉴클레오사이드 트리포스페이트의 예시적인 예는 ddATP, ddCTP, ddGTP, ddITP 및 ddTTP를 포함될 수 있으나 이들로 제한되지 않는다. 뉴클레오타이드는 표지부착되지 않을 수 있거나, 예컨대, 광학적으로 검출 가능한 모이어티(예를 들어, 형광단)를 포함하는 모이어티를 사용함으로써 검출 가능하게 표지부착될 수 있다. 표지부착은 양자 점을 사용함으로써 수행될 수도 있다. 검출 가능한 표지는 예를 들어, 방사성 동위원소, 형광 표지, 화학발광 표지, 생체발광 표지 및 효소 표지를 포함할 수 있다. 뉴클레오타이드의 형광 표지는 플루오레세인, 5-카르복시플루오레세인(FAM), 2'7'-디메톡시-4'5-디클로로-6-카르복시플루오레세인(JOE), 로다민, 6-카르복시로다민(R6G), N,N,N',N'-테트라메틸-6-카르복시로다민(TAMRA), 6-카르복시-X-로다민(ROX), 4-(4'-디메틸아미노페닐아조)벤조산(DABCYL), 캐스케이드 블루(Cascade Blue), 오레곤 그린(Oregon Green), 텍사스 레드(Texas Red), 시아닌(Cyanine) 및 5-(2'-아미노에틸)아미노나프탈렌-1-설폰산(EDANS)을 포함할 수 있으나 이들로 제한되지 않는다. 형광 표지부착된 뉴클레오타이드의 구체적인 예는 퍼킨 엘머(Perkin Elmer)(캘리포니아주 포스터 시티 소재)로부터 입수될 수 있는 [R6G]dUTP, [TAMRA]dUTP, [R110]dCTP, [R6G]dCTP, [TAMRA]dCTP, [JOE]ddATP, [R6G]ddATP, [FAM]ddCTP, [R110]ddCTP, [TAMRA]ddGTP, [ROX]ddTTP, [dR6G]ddATP, [dR110]ddCTP, [dTAMRA]ddGTP 및 [dROX]ddTTP; 아머샴(Amersham)(일리노이주 알링턴 하이츠 소재)으로부터 입수될 수 있는 플루오로링크(FluoroLink) 데옥시뉴클레오타이드인 플루오로링크 Cy3-dCTP, 플루오로링크 Cy5-dCTP, 플루오로링크 플루오르 X-dCTP, 플루오로링크 Cy3-dUTP 및 플루오로링크 Cy5-dUTP; 뵈링거 만하임(Boehringer Mannheim)(인디애나주 인디애나폴리스 소재)으로부터 입수될 수 있는 플루오레세인-15-dATP, 플루오레세인-12-dUTP, 테트라메틸-로다민-6-dUTP, IR770-9-dATP, 플루오레세인-12-ddUTP, 플루오레세인-12-UTP 및 플루오레세인-15-2'-dATP; 및 몰레큘라 프로브스(Molecular Probes)(오레곤주 유진 소재)로부터 입수될 수 있는 염색체 표지부착된 뉴클레오타이드인 BODIPY-FL-14-UTP, BODIPY-FL-4-UTP, BODIPY-TMR-14-UTP, BODIPY-TMR-14-dUTP, BODIPY-TR-14-UTP, BODIPY-TR-14-dUTP, 캐스케이드 블루-7-UTP, 캐스케이드 블루-7-dUTP, 플루오레세인-12-UTP, 플루레세인-12-dUTP, 오레곤 그린 488-5-dUTP, 로다민 그린-5-UTP, 로다민 그린-5-dUTP, 테트라메틸로다민-6-UTP, 테트라메틸로다민-6-dUTP, 텍사스 레드-5-UTP, 텍사스 레드-5-dUTP 및 텍사스 레드-12-dUTP를 포함할 수 있다. 뉴클레오타이드는 화학적 변형에 의해 표지부착될 수 있거나 표시될 수도 있다. 화학적으로 변형된 단일 뉴클레오타이드는 바이오틴-dNTP일 수 있다. 바이오티닐화된 dNTP의 일부 비제한적 예는 바이오틴-dATP(예를 들어, 바이오-N6-ddATP, 바이오틴-14-dATP), 바이오틴-dCTP(예를 들어, 바이오틴-11-dCTP, 바이오틴-14-dCTP), 및 바이오틴-dUTP(예를 들어, 바이오틴-11-dUTP, 바이오틴-16-dUTP, 바이오틴-20-dUTP)를 포함할 수 있다.
용어 "폴리뉴클레오타이드", "올리고뉴클레오타이드" 및 "핵산"은 일반적으로 단일, 이중 또는 다중 가닥 형태로 존재하는, 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드인 임의의 길이의 뉴클레오타이드 또는 이의 유사체의 중합체 형태를 지칭하기 위해 상호교환 가능하게 사용된다. 폴리뉴클레오타이드는 세포에 대한 외생성 또는 내생성 폴리뉴클레오타이드일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 무세포 환경에 존재할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 유전자 또는 이의 단편일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 DNA일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 RNA일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 임의의 3차원 구조를 가질 수 있고 임의의 기능을 수행할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 유사체(예를 들면, 변경된 골격, 당 또는 핵염기)를 포함할 수 있다. 존재하는 경우, 뉴클레오타이드 구조에 대한 변형은 중합체의 어셈블리 전 또는 후에 부여될 수 있다. 유사체의 일부 비제한적 예는 5-브로모우라실, 펩티드 핵산, 제노(xeno) 핵산, 모르폴리노, 잠긴 핵산, 글리콜 핵산, 트레오스 핵산, 디데옥시뉴클레오타이드, 코르디셉핀(cordycepin), 7-데아자-GTP, 형광단(예를 들면, 당에 연결된 로다민 또는 플루오레세인), 티올 함유 뉴클레오타이드, 바이오틴 연결된 뉴클레오타이드, 형광 염기 유사체, CpG 섬, 메틸-7-구아노신, 메틸화된 뉴클레오타이드, 이노신, 티오우리딘, 슈도우리딘, 디하이드로우리딘, 퀴오신 및 와이오신을 포함한다. 폴리뉴클레오타이드의 비제한적 예는 유전자 또는 유전자 단편의 코딩 또는 비코딩 영역, 연관 분석으로부터 정의된 유전자좌들(유전자좌), 엑손, 인트론, 메신저 RNA(mRNA), 전달 RNA(tRNA), 리보좀 RNA(rRNA), 짧은 간섭 RNA(siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), 마이크로-RNA(miRNA), 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오타이드, 분지된 폴리뉴클레오타이드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 단리된 DNA, 임의의 서열의 단리된 RNA, 무세포 DNA(cfDNA) 및 무세포 RNA(cfRNA)를 포함하는 무세포 폴리뉴클레오타이드, 핵산 프로브, 및 프라이머를 포함한다. 뉴클레오타이드의 서열은 비-뉴클레오타이드 구성요소에 의해 불연속될 수 있다.
용어 "형질감염" 또는 "형질감염된"은 일반적으로 핵산이 비-바이러스 또는 바이러스 기반 방법에 의해 세포에 도입되는 것을 의미한다. 핵산 분자는 완전한 단백질 또는 이의 기능적 부분을 코딩하는 유전자 서열일 수 있다. 예를 들면, 문헌[Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 18.1-18.88]을 참조한다.
용어 "펩티드", "폴리펩티드" 및 "단백질"은 일반적으로 펩티드 결합(들)에 의해 연결된 적어도 2개의 아미노산 잔기로 이루어진 중합체를 지칭하기 위해 본원에서 상호교환 가능하게 사용된다. 이 용어들은 특정 길이의 중합체를 의미하지 않으며, 펩티드가 재조합 기법, 화학적 또는 효소적 합성을 이용함으로써 생성되는지 아니면 천연적으로 생성되는지를 암시하거나 구분하기 위한 것도 아니다. 상기 용어들은 천연 생성 아미노산 중합체뿐만 아니라, 적어도 하나의 변형된 아미노산을 포함하는 아미노산 중합체에도 적용된다. 일부 경우, 중합체는 비-아미노산에 의해 불연속될 수 있다. 상기 용어들은 전체 길이 단백질, 및 2차 및/또는 3차 구조(예를 들어, 도메인)을 갖거나 갖지 않은 단백질을 비롯한 임의의 길이의 아미노산 쇄를 포함한다. 상기 용어들은 예를 들어, 이황화 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 산화 및 임의의 다른 조작, 예컨대, 표지부착 구성요소와의 접합에 의해 변형된 아미노산 중합체도 포괄한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "아미노산" 및 "아미노산들"은 일반적으로 변형된 아미노산 및 아미노산 유사체를 포함하나 이들로 제한되지 않는 천연 아미노산 및 비천연 아미노산을 지칭한다. 변형된 아미노산은 천연 아미노산, 및 아미노산에 천연적으로 존재하지 않는 기 또는 화학적 모이어티를 포함하도록 화학적으로 변형된 비천연 아미노산을 포함할 수 있다. 아미노산 유사체는 아미노산 유도체를 지칭할 수 있다. 용어 "아미노산"은 D-아미노산 및 L-아미노산 둘 다를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "비천연"은 일반적으로 천연 핵산 또는 단백질에서 발견되지 않는 핵산 또는 폴리펩티드 서열을 지칭할 수 있다. 비천연은 친화성 태그를 지칭할 수 있다. 비천연은 융합을 지칭할 수 있다. 비천연은 돌연변이, 삽입 및/또는 결실을 포함하는 천연 생성 핵산 또는 폴리펩티드 서열을 지칭할 수 있다. 비천연 서열은 비천연 서열에 융합되어 있는 핵산 및/또는 폴리펩티드 서열에 의해서도 나타날 수 있는 활성(예를 들어, 효소 활성, 메틸트랜스퍼라제 활성, 아세틸트랜스퍼라제 활성, 키나제 활성, 유비퀴틴화 활성 등)을 나타낼 수 있고/있거나 코딩할 수 있다. 비천연 핵산 또는 폴리펩티드 서열은 키메라 핵산 및/또는 폴리펩티드를 코딩하는 키메라 핵산 및/또는 폴리펩티드 서열을 생성하기 위해 유전적 조작에 의해 천연 생성 핵산 또는 폴리펩티드 서열(또는 이의 변이체)에 연결될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "프로모터"는 일반적으로 유전자의 전사 또는 발현을 조절하고 RNA 전사가 시작되는 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 영역에 인접하거나 중첩되어 위치할 수 있는 조절 DNA 영역을 지칭한다. 프로모터는 유전자 전사로 이어지는, RNA 중합효소와 DNA의 결합을 용이하게 하는, 종종 전사 인자로서도 지칭되는 단백질 인자에 결합하는 특정 DNA 서열을 함유할 수 있다. '코어 프로모터'로서도 지칭되는 '기본 프로모터'는 일반적으로 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드의 전사 발현을 촉진하는 데 필요한 모든 기본 요소들을 함유하는 프로모터를 지칭할 수 있다. 진핵생물 기본 프로모터는 전형적으로 TATA 박스 및/또는 CAAT 박스를 함유하지만, 반드시 함유하지는 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "발현"은 일반적으로 핵산 서열 또는 폴리뉴클레오타이드가 DNA 주형으로부터 (예를 들어, mRNA 또는 다른 RNA 전사체로) 전사되는 과정, 및/또는 전사된 mRNA가 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질로 후속 번역되는 과정을 지칭한다. 전사체 및 코딩된 폴리펩티드는 "유전자 생성물"로서 통칭될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드가 게놈 DNA로부터 유래한 경우, 발현은 진핵 세포에서의 mRNA의 스플라이싱을 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "작동 가능하게 연결된", "작동 가능한 연결", "작동 가능하게 연결되어 있는" 또는 이들의 문법적으로 동등한 표현은 일반적으로 유전적 요소, 예를 들어, 프로모터, 인핸서, 폴리아데닐화 서열 등의 병치를 지칭하고, 이때 상기 요소들은 이들이 예상된 방식으로 작동할 수 있게 하는 관계에 있다. 예를 들어, 프로모터 및/또는 인핸서 서열을 포함할 수 있는 조절 요소는, 조절 요소가 코딩 서열의 전사를 시작하는 데 도움이 되는 경우, 코딩 영역에 작동 가능하게 연결되어 있다. 이러한 기능적 관계가 유지되는 한, 조절 요소와 코딩 영역 사이에 개재 잔기가 있을 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "벡터"는 일반적으로 폴리뉴클레오타이드를 포함하거나 폴리뉴클레오타이드와 회합하고 세포로의 폴리뉴클레오타이드의 전달을 매개하는 데 사용될 수 있는 거대분자 또는 거대분자의 회합을 의미한다. 벡터의 예는 플라스미드, 바이러스 벡터, 리포좀 및 다른 유전자 전달 비히클을 포함한다. 벡터는 일반적으로 표적에서 유전자의 발현을 용이하게 하기 위해 유전자에 작동 가능하게 연결된 유전적 요소, 예를 들어, 조절 요소를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "발현 카세트" 및 "핵산 카세트"는 일반적으로 함께 발현되거나 발현을 위해 작동 가능하게 연결되어 있는 핵산 서열 또는 요소의 조합을 지칭하기 위해 상호교환 가능하게 사용된다. 일부 경우, 발현 카세트는 조절 요소와, 발현을 위해 이 조절 요소에 작동 가능하게 연결되어 있는 유전자 또는 유전자들의 조합을 지칭한다.
DNA 또는 단백질 서열의 "기능적 단편"은 일반적으로 전체 길이 DNA 또는 단백질 서열의 생물학적 활성과 실질적으로 유사한 생물학적(기능적 또는 구조적) 활성을 보유하는 단편을 지칭한다. DNA 서열의 생물학적 활성은 전체 길이 서열에 기인하는 것으로 알려져 있는 방식으로 발현에 영향을 미치는 그의 능력일 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "조작된" 객체는 일반적으로 객체가 인간 개입에 의해 변형되었음을 표시한다. 비제한적 예에 따르면, 핵산은 그의 서열을 자연계에 존재하지 않는 서열로 변경함으로써 변형될 수 있고; 핵산은 라이게이션된 생성물이 원래 핵산에 존재하지 않는 기능을 갖도록 핵산을 자연계에서 그와 연관되어 있지 않은 핵산에 라이게이션시킴으로써 변형될 수 있고; 조작된 핵산은 자연계에 존재하지 않는 서열을 사용함으로써 시험관내에서 합성될 수 있고; 단백질은 그의 아미노산 서열을 자연계에 존재하지 않는 서열로 변경함으로써 변형될 수 있으며; 조작된 단백질은 새로운 기능 또는 성질을 획득할 수 있다. "조작된" 시스템은 적어도 하나의 조작된 구성요소를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "합성" 및 "인공"은 천연 생성 인간 단백질에 대해 낮은 서열 동일성(예를 들어, 50% 미만의 서열 동일성, 25% 미만의 서열 동일성, 10% 미만의 서열 동일성, 5% 미만의 서열 동일성, 1% 미만의 서열 동일성)을 가진 단백질 또는 이의 도메인을 지칭하기 위해 상호교환 가능하게 사용된다. 예를 들어, VPR 및 VP64 도메인은 합성 트랜스활성화 도메인이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "tracrRNA" 또는 "tracr 서열"은 일반적으로 야생형 예시적인 tracrRNA 서열(예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스(S. pyogenes), 스타필로코커스 아우레우스(S. aureus) 등으로부터의 tracrRNA 또는 서열번호 *_*)에 대해 적어도 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 서열 동일성 및/또는 서열 유사성을 가진 핵산을 지칭할 수 있다. tracrRNA는 야생형 예시적인 tracrRNA 서열(예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스, 스타필로코커스 아우레우스 등으로부터의 tracrRNA)에 대해 최대 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 서열 동일성 및/또는 서열 유사성을 가진 핵산을 지칭할 수 있다. tracrRNA는 뉴클레오타이드 변화, 예컨대, 결실, 삽입 또는 치환, 변이체, 돌연변이 또는 키메라를 포함할 수 있는 변형된 형태의 tracrRNA를 지칭할 수 있다. tracrRNA는 적어도 6개의 연속 뉴클레오타이드의 스트레치에 걸쳐 야생형 예시적인 tracrRNA(예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스, 스타필로코커스 아우레우스 등으로부터의 tracrRNA) 서열과 적어도 약 60% 동일할 수 있는 핵산을 지칭할 수 있다. 예를 들어, tracrRNA 서열은 적어도 6개의 연속 뉴클레오타이드의 스트레치에 걸쳐 야생형 예시적인 tracrRNA(예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스, 스타필로코커스 아우레우스 등으로부터의 tracrRNA) 서열과 적어도 약 60% 동일, 적어도 약 65% 동일, 적어도 약 70% 동일, 적어도 약 75% 동일, 적어도 약 80% 동일, 적어도 약 85% 동일, 적어도 약 90% 동일, 적어도 약 95% 동일, 적어도 약 98% 동일, 적어도 약 99% 동일 또는 100% 동일할 수 있다. 인접한 CRISPR 어레이에서 반복부 서열의 일부에 대해 상보성을 가진 영역을 식별함으로써 게놈 서열에서 타입 II tracrRNA 서열을 예측할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "가이드 핵산"은 일반적으로 또 다른 핵산에 하이브리드화할 수 있는 핵산을 지칭할 수 있다. 가이드 핵산은 RNA일 수 있다. 가이드 핵산은 DNA일 수 있다. 가이드 핵산은 핵산 부위 서열에 특이적으로 결합하도록 프로그래밍될 수 있다. 표적화될 핵산 또는 표적 핵산은 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 가이드 핵산은 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 표적 핵산의 일부는 가이드 핵산의 일부에 상보적일 수 있다. 가이드 핵산에 상보적이고 하이브리드화하는 이중 가닥 표적 폴리뉴클레오타이드의 가닥은 상보적 가닥으로서 지칭될 수 있다. 상보적 가닥에 상보적이므로 가이드 핵산에 상보적이지 않을 수 있는 이중 가닥 표적 폴리뉴클레오타이드의 가닥은 비상보적 가닥으로서 지칭될 수 있다. 가이드 핵산은 폴리뉴클레오타이드 쇄를 포함할 수 있으며 "단일 가이드 핵산"으로서 지칭될 수 있다. 가이드 핵산은 2개의 폴리뉴클레오타이드 쇄를 포함될 수 있고 "이중 가이드 핵산"으로서 지칭될 수 있다. 달리 특정되지 않는 한, 용어 "가이드 핵산"은 단일 가이드 핵산 및 이중 가이드 핵산 둘 다를 지칭하는 포괄적인 용어일 수 있다. 가이드 핵산은 "핵산 표적화 분절" 또는 "핵산 표적화 서열"로서 지칭될 수 있는 분절을 포함할 수 있다. 핵산 표적화 분절은 "단백질 결합 분절" 또는 "단백질 결합 서열" 또는 "Cas 단백질 결합 분절"로서 지칭될 수 있는 하위분절을 포함할 수 있다.
2개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열과 관련하여 용어 "서열 동일성" 또는 "퍼센트 동일성"은 일반적으로 서열 비교 알고리즘을 사용하여 측정하였을 때 국소 또는 전체 비교 윈도우에 걸쳐 최대 상응에 대해 비교되고 정렬될 때, 동일하거나 특정된 퍼센트의 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드를 가진 2개의(예를 들어, 쌍별 정렬) 또는 더 많은(예를 들어, 다중 서열 정렬) 서열을 의미한다. 폴리펩티드 서열에 적합한 서열 비교 알고리즘은 예를 들어, 30개 잔기보다 더 긴 폴리펩티드 서열에 대해 3의 단어길이(W), 10의 기대치(E), 및 갭 비용을 11의 존재 및 1의 연장으로 설정하는 BLOSUM62 점수화 매트릭스를 파라미터로서 사용하고 조건부 구성 점수 매트릭스 조절을 이용하는 BLASTP; 30개 잔기 미만의 서열에 대해 2의 단어길이(W), 1000000의 기대치(E), 및 갭 비용을 갭 개방에 대해 9 및 갭 연장에 대해 1로 설정하는 PAM30 점수화 매트릭스를 사용하는 BLASTP(이들은 https://blast.ncbi.nlm.nih.gov에서 입수될 수 있는 BLAST 스위트의 BLASTP에 대한 디폴트 파라미터임); 파라미터를 사용하는 CLUSTALW; 2의 일치, -1의 불일치 및 -1의 갭을 파라미터로서 사용하는 스위스-워터만(Smith-Waterman) 상동성 검색 알고리즘; 디폴트 파라미터를 사용하는 MUSCLE; 2의 리트리(retree) 및 1000의 최대화(maxiteration)를 파라미터로서 사용하는 MAFFT; 디폴트 파라미터를 사용하는 Novafold; 디폴트 파라미터를 사용하는 HMMER hmmalign을 포함한다.
본 개시내용은 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 가진, 본원에 기재된 효소들 중 임의의 효소의 변이체를 포함한다. 이러한 보존적 치환은 폴리펩티드의 3차원 구조 또는 기능을 파괴하지 않으면서 폴리펩티드의 아미노산 서열에서 만들어질 수 있다. 보존적 치환은 유사한 소수성, 극성 및 R 쇄 길이를 가진 아미노산들을 서로 치환함으로써 달성될 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 상이한 종으로부터의 정렬된 상동성 단백질 서열들을 비교함으로써, 코딩된 단백질의 기본 기능을 변경하지 않으면서 종 사이에 돌연변이된 아미노산 잔기(예를 들어, 보존되지 않은 잔기)를 찾아냄으로써 보존적 치환을 식별할 수 있다. 이러한 보존적으로 치환된 변이체는 본원에 기재된 시스템들 중 어느 하나(예를 들어, 본원에 기재된 MG36 또는 MG39 시스템)에 대해 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일성을 가진 변이체를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 보존적으로 치환된 변이체는 기능적 변이체이다. 이러한 기능적 변이체는 엔도뉴클레아제의 중요 활성 부위 잔기의 활성이 파괴되지 않도록 치환된 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 시스템들 중 임의의 시스템의 기능적 변이체는 도 4 및 도 5에 표시된 보존된 또는 기능적 잔기들 중 적어도 하나의 치환을 결여한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 시스템들 중 임의의 시스템의 기능적 변이체는 도 4 및 도 5에 표시된 모든 보존된 또는 기능적 잔기들의 치환을 결여한다.
기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환 표는 다양한 참고문헌들(예를 들어, 문헌[Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W H Freeman & Co.; 2nd Edition (December1993))] 참조)로부터 입수될 수 있다. 하기 8개의 군은 서로에 대해 보존적 치환인 아미노산을 각각 함유한다:
1) 알라닌(A), 글리신(G);
2) 아스파르트산(D), 글루탐산(E);
3) 아스파라긴(N), 글루타민(Q);
4) 아르기닌(R), 라이신(K);
5) 이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M), 발린(V);
6) 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 트립토판(W);
7) 세린(S), 트레오닌(T); 및
8) 시스테인(C), 메티오닌(M).
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "RuvC_III 도메인"은 일반적으로 RuvC 엔도뉴클레아제 도메인의 세 번째 불연속 분절을 지칭한다(RuvC 뉴클레아제 도메인은 3개의 불연속 분절인 RuvC_I, RuvC_II 및 RuvC_III으로 구성된다). RuvC 도메인 또는 이의 분절은 일반적으로 알려져 있는 도메인 서열과의 정렬, 주석이 달린 도메인을 가진 단백질과의 구조적 정렬, 또는 알려져 있는 도메인 서열을 기반으로 구축된 히든 마르코브 모델(Hidden Markov Model)(HMM)(예를 들어, RuvC_III의 경우 Pfam HMM PF18541)과의 비교에 의해 식별될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "HNH 도메인"은 일반적으로 특징적인 히스티딘 및 아스파라긴 잔기를 가진 엔도뉴클레아제 도메인을 지칭한다. HNH 도메인은 일반적으로 알려져 있는 도메인 서열과의 정렬, 주석이 달린 도메인을 가진 단백질과의 구조적 정렬, 또는 알려져 있는 도메인 서열을 기반으로 구축된 히든 마르코브 모델(HMM)(예를 들어, 도메인 HNH의 경우 Pfam HMM PF01844)과의 비교에 의해 식별될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "재조합효소"는 일반적으로 재조합효소 인식 서열들 사이에 DNA의 재조합을 매개하여, 재조합효소 인식 서열들 사이에 DNA 단편의 절제, 통합, 역위 또는 교환(예컨대, 전위)을 야기하는 부위 특이적 효소를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 핵산 변형(예를 들어, 게놈 변형)과 관련하여 용어 "재조합한다" 또는 "재조합"은 일반적으로 2개 이상의 핵산 분자, 또는 단일 핵산 분자의 2개 이상의 영역이 재조합효소 단백질의 작용에 의해 변형되는 과정을 지칭한다. 재조합은 특히, 하나 이상의 핵산 분자 내에서 또는 사이에 핵산 서열의 삽입, 역위, 절제 또는 전위를 야기할 수 있다.
본원에서 바와 같이, 용어 "트랜스포존"은 일반적으로 "카고 DNA"를 운반하면서 게놈 안팎으로 이동하는 이동성 요소를 지칭한다. 일부 경우, 이 트랜스포존은 전위될 핵산의 타입, 트랜스포존 말단에 있는 반복부의 타입, 운반될 카고의 타입 또는 전위 방식(즉, 자가 복구 또는 숙주 복구)에 따라 상이할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "전위효소" 또는 "전위효소들"은 일반적으로 트랜스포존의 말단에 결합하여 이를 게놈의 또 다른 부분으로 이동시키는 것을 촉매하는 효소를 지칭한다. 일부 경우, 이동은 잘라내기 및 붙여넣기 기작 또는 복제적 전위에 의해 달성될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "Tn7" 또는 "Tn7 유사 전위효소"는 일반적으로 3종의 주요 구성요소들, 즉 헤테로머성 전위효소(TnsA 및/또는 TnsB) 및 조절제 단백질(TnsC)을 포함하는 전위효소 패밀리를 지칭한다. Tn7 요소는 TnsABC 전위 단백질 외에도 전용 표적 부위 선택 단백질인 TnsD 및 TnsE를 코딩할 수 있다. 서열 특이적 DNA 결합 단백질인 TnsD는 TnsABC와 함께 "Tn7 부착 부위"로서 지칭되는 보존된 부위인 attTn7 내로의 전위를 유도한다. TnsD는 TniQ도 포함하는 큰 단백질 패밀리의 구성원이다. TniQ는 플라스미드의 분해 부위 내로의 전위를 표적화하는 것으로 밝혀졌다.
일부 경우, 본원에 기재된 CAST 시스템은 하나 이상의 Tn7 또는 Tn7 유사 전위효소를 포함할 수 있다. 특정 예시적인 실시양태에서, Tn7 또는 Tn7 유사 전위효소는 다량체성 단백질 복합체를 포함한다. 특정 예시적인 실시양태에서, 상기 다량체성 단백질 복합체는 TnsA, TnsB, TnsC 또는 TniQ를 포함한다. 이 조합에서, 전위효소(TnsA, TnsB, TnsC, TniQ)는 서로 복합체 또는 융합 단백질을 형성할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "Cas12k"(대안적으로, "클래스 II 타입 V-K")는 일반적으로 뉴클레아제 활성에 결함이 있는 것으로 발견된 타입 V CRISPR 시스템의 서브타입을 지칭한다(예를 들어, 이들은 DNA 절단에 중요한 적어도 하나의 촉매 잔기를 결여하는 적어도 하나의 결함 RuvC 도메인을 포함할 수 있다). 이러한 서브타입의 이펙터는 일반적으로 CAST 시스템과 회합된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "타입 I-F"(대안적으로, 클래스 I 타입 I-F CRISPR)는 일반적으로 클래스 I 타입 I CRISPR 시스템의 서브타입을 지칭한다. 이러한 시스템은 일반적으로 Cas8, Cas7 및 Cas6 단백질을 포함하는 다중구성요소 CRISPR 이펙터를 포함한다. 일부 경우, 이러한 시스템은 CAST 시스템과 회합된 상태로 발견된다. 일부 경우, 타입 I-F CRISPR 시스템은 Cas8 및/또는 Cas5 결합을 위한 8-nt 5' 핸들, 표적 인식을 위한 Cas7의 6개 카피에 의해 결합된 32-nt 스페이서, 또는 Cas6 결합 및 전구-crRNA 프로세싱을 위한 20-nt 3' 헤어핀을 포함하는 crRNA를 포함한다. 일부 경우, 타입 F 시스템은 표적 결합을 위해 비-표적 가닥의 5'-CC PAM을 이용한다.
개요
독특한 기능과 구조를 가진 새로운 Cas 효소의 발견은 데옥시리보핵산(DNA) 편집 기술을 더 혁신하여, 속도, 특이성, 기능 및 사용 편의성을 개선할 수 있는 잠재력을 제공할 수 있다. 미생물에서 클러스터링된 규칙적으로 이격된 짧은 팔린드로믹 반복부(CRISPR) 시스템의 예측된 보급률 및 미생물 종의 엄청난 다양성에 비해, 기능적으로 특징규명된 CRISPR/Cas 효소는 문헌에 비교적 적게 존재한다. 이것은 부분적으로는 수많은 미생물 종을 실험실 조건에서 쉽게 배양할 수 없기 때문이다. 수많은 미생물 종을 대표하는 천연 환경 니치(nich)로부터의 메타게놈 시퀀싱은 알려진 새로운 CRISPR/Cas 시스템의 수를 현저히 증가시키고 새로운 올리고뉴클레오타이드 편집 기능의 발견을 가속화할 수 있는 잠재력을 제공할 수 있다. 이러한 접근법의 결실을 보여주는 최근 사례는 2016년에 천연 미생물 군집의 메타게놈 분석으로부터 CasX/CasY CRISPR 시스템을 발견한 것에 의해 입증된다.
CRISPR/Cas 시스템은 미생물에서 적응 면역 시스템으로서 작용하는 것으로 기재된 RNA 유도 뉴클레아제 복합체이다. 그의 천연 환경에서, CRISPR/Cas 시스템은 일반적으로 2개의 부분, 즉 (i) RNA 기반 표적화 요소를 코딩하는, 동등하게 짧은 스페이서 서열에 의해 분리된 짧은 반복 서열(30 내지 40 bp)의 어레이, 및 (ii) 보조 단백질/효소와 함께 RNA 기반 표적화 요소에 의해 유도되는 뉴클레아제 폴리펩티드를 코딩하는 Cas를 코딩하는 ORF를 포함하는 CRISPR(클러스터링된 규칙적으로 이격된 짧은 팔린드로믹 반복부) 오페론 또는 유전자좌에서 생성된다. 특정 표적 핵산 서열의 효율적인 뉴클레아제 표적화는 일반적으로 (i) 표적(표적 시드)의 처음 6개 내지 8개의 핵산과 crRNA 가이드 사이의 상보적 하이브리드화; 및 (ii) 표적 시드의 정의된 근처 내부의 프로토스페이서 인접 모티브(PAM) 서열의 존재 둘 다를 요구한다(PAM은 일반적으로 숙주 게놈 내에서 통상적으로 나타나지 않는 서열이다). 시스템의 정확한 기능과 조직화에 따라, CRISPR-Cas 시스템은 통상적으로 공유된 기능적 특성 및 진화적 유사성을 기반으로 2개의 클래스, 5개의 타입 및 16개의 서브타입으로 분류된다(도 1 참조).
클래스 I CRISPR-Cas 시스템은 큰 다중서브유닛 이펙터 복합체를 갖고, 타입 I, III 및 IV를 포함한다.
타입 I CRISPR-Cas 시스템은 구성요소의 관점에서 중간 정도의 복잡성을 가진 것으로 간주된다. 타입 I CRISPR-Cas 시스템에서, RNA 표적화 요소들의 어레이는 반복부 요소에서 프로세싱되어 짧은 성숙 crRNA를 유리시키는 긴 전구체 crRNA(전구-crRNA)로서 전사되고, 이 짧은 성숙 crRNA는 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)로서 지칭되는 적합한 짧은 컨센서스 서열이 핵산 표적을 뒤따를 때 뉴클레아제 복합체를 이 핵산 표적으로 향하게 한다. 이 프로세싱은 crRNA 유도 뉴클레아제 복합체의 뉴클레아제(Cas3) 단백질 구성요소도 포함하는, 캐스케이드(Cascade)로서 지칭되는 큰 엔도뉴클레아제 복합체의 엔도리보뉴클레아제 서브유닛(Cas6)을 통해 일어난다. Cas I 뉴클레아제는 주로 DNA 뉴클레아제로서 작용한다.
타입 III CRISPR 시스템은 Csm 또는 Cmr 단백질 서브유닛을 포함하는 반복부 관련 신비스러운 단백질(RAMP)과 함께 Cas10으로서 알려진 중심 뉴클레아제의 존재를 특징으로 할 수 있다. 타입 I 시스템에서와 마찬가지로, 성숙 crRNA는 Cas6 유사 효소를 사용함으로써 전구-crRNA로부터 프로세싱된다. 타입 I 및 II 시스템과 달리, 타입 III 시스템은 DNA-RNA 이중체를 표적화하고 절단하는 것으로 보인다(예컨대, DNA 가닥은 RNA 중합효소에 대한 주형으로서 사용된다).
타입 IV CRISPR-Cas 시스템은 고도로 환원된 큰 서브유닛 뉴클레아제(csf1), Cas5(csf3) 및 Cas7(csf2) 군의 RAMP 단백질에 대한 2개의 유전자, 및 일부 경우 예측된 작은 서브유닛에 대한 유전자로 구성된 이펙터 복합체를 갖고; 이러한 시스템은 내생성 플라스미드에서 통상적으로 발견된다.
클래스 II CRISPR-Cas 시스템은 일반적으로 단일 폴리펩티드 다중도메인 뉴클레아제 이펙터를 가지며, 타입 II, V 및 VI을 포함한다.
타입 II CRISPR-Cas 시스템은 구성요소의 관점에서 가장 단순한 것으로서 간주된다. 타입 II CRISPR-Cas 시스템에서, CRISPR 어레이를 성숙 crRNA로 프로세싱하는 것은 특별한 엔도뉴클레아제 서브유닛의 존재를 요구하는 것이 아니라, 어레이 반복부 서열에 상보적인 영역을 가진 작은 트랜스 코딩된 crRNA(tracrRNA)를 요구하고; tracrRNA는 그의 상응하는 이펙터 뉴클레아제(예를 들어, Cas9) 및 반복부 서열 둘 다와 상호작용하여 전구체 dsRNA 구조를 형성하고, 전구체 dsRNA 구조는 내생성 RNAse III에 의해 절단되어, tracrRNA 및 crRNA 둘 다가 로딩된 성숙 이펙터 효소를 생성한다. Cas II 뉴클레아제는 DNA 뉴클레아제로서 알려져 있다. 타입 2 이펙터는 일반적으로 RuvC 유사 뉴클레아제 도메인의 폴드(fold) 내에 삽입된 관련 없는 HNH 뉴클레아제 도메인과 함께 RNase H 폴드를 채택하는 RuvC 유사 엔도뉴클레아제 도메인으로 구성된 구조를 나타낸다. RuvC 유사 도메인은 표적(예를 들어, crRNA 상보적) DNA 가닥의 절단을 담당하는 반면, HNH 도메인은 이탈된 DNA 가닥의 절단을 담당한다.
타입 V CRISPR-Cas 시스템은 RuvC 유사 도메인을 포함하는 타입 II 이펙터와 유사한 뉴클레아제 이펙터(예를 들어, Cas12) 구조를 특징으로 한다. 타입 II와 유사하게, (모두는 아니지만) 대다수의 타입 V CRISPR 시스템은 tracrRNA를 사용하여 전구-crRNA를 성숙 crRNA로 프로세싱하나; 전구-crRNA를 다수의 crRNA로 절단하기 위해 RNAse III을 요구하는 타입 II 시스템과 달리, 타입 V 시스템은 이펙터 뉴클레아제 그 자체를 사용하여 전구-crRNA를 절단할 수 있다. 타입 II CRISPR-Cas 시스템처럼, 타입 V CRISPR-Cas 시스템은 DNA 뉴클레아제로서도 알려져 있다. 타입 II CRISPR-Cas 시스템과 달리, 일부 타입 V 효소(예를 들어, Cas12a)는 이중 가닥 표적 서열의 첫 번째 crRNA 유도 절단에 의해 활성화되는 강력한 단일 가닥 비특이적 데옥시리보뉴클레아제 활성을 가진 것으로 보인다.
타입 VI CRIPSR-Cas 시스템은 RNA 가이딩 RNA 엔도뉴클레아제를 가진다. 타입 VI 시스템의 단일 폴리펩티드 이펙터(예를 들어, Cas13)는 RuvC 유사 도메인 대신에 2개의 HEPN 리보뉴클레아제 도메인을 포함한다. 타입 II 및 타입 V 시스템과 달리, 타입 VI 시스템은 또한 전구-crRNA를 crRNA로 프로세싱하기 위해 tracrRNA를 필요로 하지 않는 것으로 보인다. 그러나, 타입 V 시스템과 유사하게, 일부 타입 VI 시스템(예를 들어, C2C2)은 표적 RNA의 첫 번째 crRNA 유도 절단에 의해 활성화되는 강력한 단일 가닥 비특이적 뉴클레아제(리보뉴클레아제) 활성을 가진 것으로 보인다.
클래스 II CRISPR-Cas는 그들의 더 단순한 구조로 인해 설계자 뉴클레아제/게놈 편집 애플리케이션으로서 조작 및 개발을 위해 가장 널리 채택되어 왔다.
시험관내 사용을 위한 이러한 시스템의 초기 개량 중 하나는 지넥 연구진(Jinek et al.)의 문헌(전체적으로 본원에 참고로 포함되는 문헌[Science. 2012 Aug 17;337(6096):816-21])에서 발견될 수 있다. 지넥 연구는 (i) 스트렙토코커스 피오게네스 SF370으로부터 단리된 재조합 발현 정제된 전체 길이 Cas9(예를 들어, 클래스 II 타입 II Cas 효소), (ii) 절단하고자 하는 표적 DNA 서열에 상보적인 약 20 nt 5' 서열에 이어 3' tracr 결합 서열을 가진 정제된 성숙 약 42 nt crRNA(전체 crRNA는 T7 프로모터 서열을 가진 합성 DNA 주형으로부터 시험관내 전사됨), (iii) T7 프로모터 서열을 가진 합성 DNA 주형으로부터 시험관내 전사된 정제된 tracrRNA, 및 (iv) Mg2+을 포함하는 시스템을 처음으로 기술하였다. 그 후, 지넥은 개선되고 조작된 시스템을 기술하였는데, 이 시스템에서 (ii)의 crRNA는 링커(예를 들어, GAAA)에 의해 (iii)의 5' 말단에 연결되어, Cas9를 스스로 표적으로 향하게 할 수 있는 단일 융합된 합성 가이드 RNA(sgRNA)를 형성한다(도 2의 상단과 하단 패널의 비교).
그 후, 말리 연구진(Mali et al.)(전체적으로 본원에 참고로 포함되는 문헌[Science. 2013 Feb 15; 339(6121): 823-826])은 (i) C-말단 핵 국소화 서열(예를 들어, SV40 NLS) 및 적합한 폴리아데닐화 신호(예를 들어, TK pA 신호)를 가진 적합한 포유류 프로모터 하에 코돈 최적화된 Cas9(예를 들어, 클래스 II 타입 II Cas 효소)를 코딩하는 ORF; 및 (ii) 적합한 중합효소 III 프로모터(예를 들어, U6 프로모터) 하에 sgRNA(G로 시작하는 5' 서열에 이어, 3' tracr 결합 서열에 연결된 20 nt의 상보적 표적화 핵산 서열, 링커 및 tracrRNA 서열을 가짐)를 코딩하는 ORF를 코딩하는 DNA 벡터를 제공함으로써 포유류 세포에서 사용하기 위해 이 시스템을 개량하였다.
트랜스포존은 게놈 내의 위치 사이에 이동할 수 있는 이동성 요소이다. 이러한 트랜스포존은 그가 숙주에 발휘하는 부정적인 영향을 제한하도록 진화해 왔다. 다양한 조절 기작을 이용하여 전위를 낮은 빈도로 유지하고 종종 전위를 다양한 세포 과정과 조화시킨다. 일부 원핵생물 트랜스포존은 숙주에 유익하거나 그 요소를 유지하는 데 도움이 되는 기능을 동원할 수도 있다. 특정 트랜스포존은 표적 부위 선택을 엄격하게 제어하는 기작을 진화시켰을 수도 있는데, 가장 주목할 만한 예는 Tn7 패밀리이다.
트랜스포존 Tn7 및 유사한 요소는 임상 환경에서 항생제 내성 및 발병 기능을 위한 저장소일 수 있을 뿐만 아니라, 천연 환경에서 다른 적응 기능을 코딩할 수도 있다. 예를 들어, Tn7 시스템은 중요한 숙주 유전자 내로 통합되는 것을 거의 완전히 피할 뿐만 아니라, 숙주 박테리아 사이에 Tn7을 이동시킬 수 있는 이동성 플라스미드 및 박테리오파지를 인식함으로써 상기 요소의 분산을 최대화하는 기작을 진화시켜 왔다.
박테리아 게놈 내의 단일 보존된 위치 내로의 삽입을 유도하는 하나의 경로 및 박테리아 사이에 요소를 전달할 수 있는 이동성 플라스미드 내로의 표적화를 최대화하도록 적응된 것으로 보이는 제2 경로를 보유하는 Tn7 및 Tn7 유사 요소는 이들이 삽입되는 위치와 시기를 제어할 수 있다(도 3 참조). Tn7 유사 트랜스포존과 CRISPR-Cas 시스템 사이의 연관성은 트랜스포존이 CRISPR 이펙터를 탈취하여 표적 부위에서 R-루프를 생성하고 플라스미드 및 파지를 통한 트랜스포존의 확산을 용이하게 하였을 수 있음을 암시한다.
MG36 시스템
한 측면에서, 본 개시내용은 카고 뉴클레오타이드 서열을 표적 핵산 부위로 전위시키는 시스템을 제공한다. 이 시스템은 제1 이중 가닥 핵산을 포함할 수 있다. 제1 이중 가닥 핵산은 카고 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있으며, 이때 카고 뉴클레오타이드 서열은 재조합효소 복합체와 상호작용하도록 구성될 수 있다. 상기 시스템은 Cas 이펙터 복합체를 포함할 수 있다. 이 Cas 이펙터 복합체는 클래스 II 타입 II Cas 이펙터, 및 표적 핵산 부위에 하이브리드화하도록 구성된 적어도 하나의 조작된 가이드 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 클래스 II 타입 II Cas 이펙터는 RuvC 도메인 및 HNH 도메인을 포함할 수 있다. 상기 시스템은 재조합효소 또는 전위효소 복합체를 포함할 수 있고, 이때 재조합효소 또는 전위효소 복합체는 카고 뉴클레오타이드 서열을 표적 핵산 부위로 끌어들이도록 구성된다.
일부 경우, 카고 뉴클레오타이드 서열은 좌측 전위효소 인식 서열에 의해 플랭킹된다. 일부 경우, 카고 뉴클레오타이드 서열은 우측 전위효소 인식 서열에 의해 플랭킹된다. 일부 경우, 카고 뉴클레오타이드 서열은 좌측 전위효소 인식 서열 및 우측 전위효소 인식 서열에 의해 플랭킹된다. 일부 경우, 상기 시스템은 표적 핵산 부위를 포함하는 제2 이중 가닥 핵산을 추가로 포함한다. 일부 경우, 상기 시스템은 표적 핵산 부위에 인접한 Cas 이펙터 복합체와 호환되는 PAM 서열을 추가로 포함한다. 일부 경우, PAM 서열은 표적 핵산 부위의 3'에 위치한다. 일부 경우, 재조합효소 또는 전위효소 복합체는 Tn7 타입 전위효소 복합체이다. 일부 경우, 조작된 가이드 폴리뉴클레오타이드는 클래스 II 타입 II Cas 이펙터에 결합하도록 구성된다. 일부 경우, 클래스 II 타입 II Cas 이펙터는 서열번호 1 또는 이의 변이체에 대해 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일성을 가진 폴리펩티드를 포함한다. 일부 경우, 클래스 II 타입 II Cas 이펙터는 서열번호 1과 실질적으로 동일한 폴리펩티드를 포함한다.
일부 경우, 재조합효소 또는 전위효소 복합체는 서열번호 2 내지 5 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일성을 가진 서열을 포함하는 적어도 하나의 폴리펩티드를 포함한다. 일부 경우, 재조합효소 또는 전위효소 복합체는 서열번호 2 내지 5 중 어느 하나와 실질적으로 동일한 서열을 포함하는 적어도 하나의 폴리펩티드를 포함한다. 일부 경우, 상기 재조합효소 또는 전위효소 복합체는 서열번호 2 내지 5 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일성을 가진 서열을 포함하는 적어도 2개의 폴리펩티드를 포함한다. 일부 경우, 재조합효소 또는 전위효소 복합체는 서열번호 2 내지 5 중 어느 하나 또는 이의 변이체와 실질적으로 동일한 서열을 포함하는 적어도 2개의 폴리펩티드를 포함한다. 일부 경우, 재조합효소 또는 전위효소 복합체는 서열번호 2 내지 5 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일성을 가진 서열을 포함하는 적어도 3개의 폴리펩티드를 포함한다. 일부 경우, 재조합효소 또는 전위효소 복합체는 서열번호 2 내지 5 중 어느 하나 또는 이의 변이체와 실질적으로 동일한 서열을 포함하는 적어도 3개의 폴리펩티드를 포함한다. 일부 경우, 재조합효소 또는 전위효소 복합체는 서열번호 2 내지 5 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일성을 가진 서열을 포함하는 4개의 폴리펩티드를 포함한다. 일부 경우, 재조합효소 또는 전위효소 복합체는 서열번호 2 내지 5 중 어느 하나 또는 이의 변이체와 실질적으로 동일한 서열을 포함하는 4개의 폴리펩티드를 포함한다. 일부 경우, 재조합효소 또는 전위효소 복합체는 서열번호 2 또는 이의 변이체에 대해 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일성을 가진 서열을 포함하는 TnsB1 폴리펩티드를 포함한다. 일부 경우, 재조합효소 또는 전위효소 복합체는 서열번호 2 또는 이의 변이체와 실질적으로 동일한 서열을 포함하는 TnsB1 폴리펩티드를 포함한다. 일부 경우, 재조합효소 또는 전위효소 복합체는 서열번호 3 또는 이의 변이체에 대해 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일성을 가진 서열을 포함하는 TnsB2 폴리펩티드를 포함한다. 일부 경우, 재조합효소 또는 전위효소 복합체는 서열번호 3 또는 이의 변이체와 실질적으로 동일한 서열을 포함하는 TnsB2 폴리펩티드를 포함한다. 일부 경우, 재조합효소 또는 전위효소 복합체는 서열번호 4 또는 이의 변이체에 대해 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일성을 가진 서열을 포함하는 TnsT1 폴리펩티드를 포함한다. 일부 경우, 재조합효소 또는 전위효소 복합체는 서열번호 4 또는 이의 변이체와 실질적으로 동일한 서열을 포함하는 TnsT1 폴리펩티드를 포함한다. 일부 경우, 재조합효소 또는 전위효소 복합체는 서열번호 5 또는 이의 변이체에 대해 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일성을 가진 서열을 포함하는 TnsC 폴리펩티드를 포함한다. 일부 경우, 재조합효소 또는 전위효소 복합체는 서열번호 5 또는 이의 변이체와 실질적으로 동일한 서열을 포함하는 TnsC 폴리펩티드를 포함한다.
일부 경우, 조작된 가이드 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 11 또는 이의 변이체에 대해 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일성을 가진 적어도 60개 내지 80개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 서열을 포함한다.
일부 경우, 좌측 재조합효소 서열은 서열번호 17 및 18 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일성을 가진 서열을 포함한다. 일부 경우, 우측 재조합효소 서열은 서열번호 19 또는 이의 변이체에 대해 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일성을 가진 서열을 포함한다.
일부 경우, 클래스 II 타입 II Cas 이펙터 및 재조합효소 또는 전위효소 복합체는 약 20 킬로염기 미만, 약 15 킬로염기 미만, 약 10 킬로염기 미만 또는 약 5 킬로염기 미만을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩된다.
한 측면에서, 본 개시내용은 카고 뉴클레오타이드 서열을, 표적 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 표적 핵산 부위로 전위시키는 방법으로서, 세포 내에서 본원에 기재된 시스템을 발현시키거나 본원에 기재된 시스템을 세포에 도입하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
MG39 시스템
한 측면에서, 본 개시내용은 카고 뉴클레오타이드 서열을 표적 핵산 부위로 전위시키는 시스템을 제공한다. 이 시스템은 카고 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 이중 가닥 핵산을 포함할 수 있다. 이 카고 뉴클레오타이드 서열은 Tn7 타입 전위효소 복합체와 상호작용하도록 구성될 수 있다. 상기 시스템은 Cas 이펙터 복합체를 포함할 수 있다. Cas 이펙터 복합체는 클래스 II 타입 V Cas 이펙터, 및 표적 뉴클레오타이드 서열에 하이브리드화하도록 구성된 조작된 가이드 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 클래스 II 타입 V Cas 이펙터는 RuvC 도메인을 포함할 수 있다. 상기 시스템은 Cas 이펙터 복합체에 결합하도록 구성된 Tn7 타입 전위효소 복합체를 포함할 수 있으며, 이때 Tn7 타입 전위효소 복합체는 TnsA 서브유닛을 포함한다.
일부 경우, 카고 뉴클레오타이드 서열은 좌측 전위효소 인식 서열에 의해 플랭킹된다. 일부 경우, 카고 뉴클레오타이드 서열은 우측 전위효소 인식 서열에 의해 플랭킹된다. 일부 경우, 카고 뉴클레오타이드 서열은 좌측 전위효소 인식 서열 및 우측 전위효소 인식 서열에 의해 플랭킹된다. 일부 경우, 상기 시스템은 표적 핵산 부위를 포함하는 제2 이중 가닥 핵산을 추가로 포함한다. 일부 경우, 상기 시스템은 표적 핵산 부위에 인접한 Cas 이펙터 복합체와 호환되는 PAM 서열을 추가로 포함한다. 일부 경우, PAM 서열은 표적 핵산 부위의 3'에 위치한다.
일부 경우, 조작된 가이드 폴리뉴클레오타이드는 클래스 II 타입 V Cas 이펙터에 결합하도록 구성된다. 일부 경우, 클래스 II 타입 V Cas 이펙터는 서열번호 5 또는 이의 변이체에 대해 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일성을 가진 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 경우, 클래스 II 타입 V Cas 이펙터는 서열번호 5 또는 이의 변이체와 실질적으로 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 경우, TnsA 서브유닛은 서열번호 7 또는 이의 변이체에 대해 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일성을 가진 서열을 가진 폴리펩티드를 포함한다. 일부 경우, TnsA 서브유닛은 서열번호 7 또는 이의 변이체와 실질적으로 동일한 서열을 가진 폴리펩티드를 포함한다.
일부 경우, Tn7 타입 전위효소 복합체는 서열번호 8 내지 10 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일성을 가진 서열을 포함하는 적어도 하나의 폴리펩티드를 포함한다. 일부 경우, 재조합효소 또는 전위효소 복합체는 서열번호 8 내지 10 중 어느 하나 또는 이의 변이체와 실질적으로 동일한 서열을 포함하는 적어도 하나의 폴리펩티드를 포함한다. 일부 경우, Tn7 타입 전위효소 복합체는 서열번호 8 내지 10 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일성을 가진 서열을 포함하는 적어도 2개의 폴리펩티드를 포함한다. 일부 경우, Tn7 타입 전위효소 복합체는 서열번호 8 내지 10 중 어느 하나 또는 이의 변이체와 실질적으로 동일한 서열을 포함하는 적어도 2개의 폴리펩티드를 포함한다. 일부 경우, Tn7 타입 전위효소 복합체는 서열번호 8 내지 10 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일성을 가진 서열을 포함하는 적어도 3개의 폴리펩티드를 포함한다. 일부 경우, Tn7 타입 전위효소 복합체는 서열번호 8 내지 10 중 어느 하나 또는 이의 변이체와 실질적으로 동일한 서열을 포함하는 적어도 3개의 폴리펩티드를 포함한다.
일부 경우, Tn7 타입 전위효소 복합체는 서열번호 7 또는 이의 변이체에 대해 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일성을 가진 서열을 포함하는 TnsA 폴리펩티드를 포함한다. 일부 경우, Tn7 타입 전위효소 복합체는 서열번호 7 또는 이의 변이체와 실질적으로 동일한 서열을 포함하는 TnsA 폴리펩티드를 포함한다. 일부 경우, Tn7 타입 전위효소 복합체는 서열번호 8 또는 이의 변이체에 대해 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일성을 가진 서열을 포함하는 TnsB 폴리펩티드를 포함한다. 일부 경우, Tn7 타입 전위효소 복합체는 서열번호 8 또는 이의 변이체와 실질적으로 동일한 서열을 포함하는 TnsB 폴리펩티드를 포함한다. 일부 경우, Tn7 타입 전위효소 복합체는 서열번호 9 또는 이의 변이체에 대해 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일성을 가진 서열을 포함하는 TnsC 폴리펩티드를 포함한다. 일부 경우, Tn7 타입 전위효소 복합체는 서열번호 9 또는 이의 변이체와 실질적으로 동일한 서열을 포함하는 TnsC 폴리펩티드를 포함한다. 일부 경우, Tn7 타입 전위효소 복합체는 서열번호 10 또는 이의 변이체에 대해 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일성을 가진 서열을 포함하는 TniQ 폴리펩티드를 포함한다. 일부 경우, Tn7 타입 전위효소 복합체는 서열번호 10 또는 이의 변이체와 실질적으로 동일한 서열을 포함하는 TniQ 폴리펩티드를 포함한다.
일부 경우, 조작된 가이드 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 13 내지 16 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일성을 가진 적어도 약 46개 내지 80개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 서열을 포함한다. 일부 경우, 조작된 가이드 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 13 내지 16 중 어느 하나 또는 이의 변이체와 실질적으로 동일한 적어도 약 46개 내지 80개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 서열을 포함한다.
일부 경우, 좌측 재조합효소 서열은 서열번호 20 또는 이의 변이체에 대해 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일성을 가진 서열을 포함한다. 일부 경우, 좌측 재조합효소 서열은 서열번호 20 또는 이의 변이체와 실질적으로 동일한 서열을 포함한다.
일부 경우, 우측 재조합효소 서열은 서열번호 21 또는 이의 변이체에 대해 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일성을 가진 서열을 포함한다. 일부 경우, 우측 재조합효소 서열은 서열번호 21 또는 이의 변이체와 실질적으로 동일한 서열을 포함한다.
일부 경우, 클래스 II 타입 V Cas 이펙터 및 Tn7 타입 전위효소 복합체는 약 20 킬로염기 미만, 약 15 킬로염기 미만, 약 10 킬로염기 미만 또는 약 5 킬로염기 미만을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩된다.
한 측면에서, 본 개시내용은 카고 뉴클레오타이드 서열을, 표적 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 표적 핵산 부위로 전위시키는 방법으로서, 세포 내에서 본원에 기재된 시스템을 발현시키거나 본원에 기재된 시스템을 세포에 도입하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
한 측면에서, 본 개시내용은 카고 뉴클레오타이드 서열을 표적 핵산 부위로 전위시키는 방법으로서, 카고 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 이중 가닥 핵산을 Cas 이펙터 복합체와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. Cas 이펙터 복합체는 클래스 II 타입 II Cas 이펙터, 및 표적 핵산 부위에 하이브리드화하도록 구성된 적어도 하나의 조작된 가이드 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 이 방법은 카고 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 이중 가닥 핵산을, 카고 뉴클레오타이드를 표적 핵산 부위로 끌어들이도록 구성된 재조합효소 또는 전위효소 복합체와 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 이 방법은 카고 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 이중 가닥 핵산을, 표적 핵산 부위를 포함하는 제2 이중 가닥 핵산과 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다.
일부 경우, 카고 뉴클레오타이드 서열은 좌측 전위효소 인식 서열에 의해 플랭킹된다. 일부 경우, 카고 뉴클레오타이드 서열은 우측 전위효소 인식 서열에 의해 플랭킹된다. 일부 경우, 카고 뉴클레오타이드 서열은 좌측 전위효소 인식 서열 및 우측 전위효소 인식 서열에 의해 플랭킹된다. 일부 경우, Cas 이펙터 복합체는 표적 핵산 부위에 인접한 Cas 이펙터 복합체와 호환되는 PAM 서열을 추가로 포함한다. 일부 경우, PAM 서열은 표적 핵산 부위의 3'에 위치한다. 일부 경우, PAM 서열은 표적 핵산 부위의 5'에 위치한다.
MG64 시스템
한 측면에서, 본 개시내용은 카고 뉴클레오타이드 서열을 표적 핵산 부위로 전위시키는 시스템을 제공한다. 이 시스템은 카고 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 이중 가닥 핵산을 포함할 수 있다. 이 카고 뉴클레오타이드 서열은 Tn7 타입 전위효소 복합체와 상호작용하도록 구성될 수 있다. 상기 시스템은 Cas 이펙터 복합체를 포함할 수 있다. Cas 이펙터 복합체는 클래스 II 타입 V Cas 이펙터, 및 표적 뉴클레오타이드 서열에 하이브리드화하록 구성된 조작된 가이드 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 상기 시스템은 Cas 이펙터 복합체에 결합하도록 구성된 Tn7 타입 전위효소 복합체를 포함할 수 있다. 클래스 II 타입 V Cas 이펙터는 RuvC 도메인을 포함할 수 있다.
일부 경우, 카고 뉴클레오타이드 서열은 좌측 전위효소 인식 서열에 의해 플랭킹된다. 일부 경우, 카고 뉴클레오타이드 서열은 우측 전위효소 인식 서열에 의해 플랭킹된다. 일부 경우, 카고 뉴클레오타이드 서열은 좌측 전위효소 인식 서열 및 우측 전위효소 인식 서열에 의해 플랭킹된다. 일부 경우, 상기 시스템은 표적 핵산 부위를 포함하는 제2 이중 가닥 핵산을 추가로 포함한다. 일부 경우, 상기 시스템은 표적 핵산 부위에 인접한 Cas 이펙터 복합체와 호환되는 PAM 서열을 추가로 포함한다. 일부 경우, PAM 서열은 표적 핵산 부위의 3'에 위치한다. 일부 경우, PAM 서열은 표적 핵산 부위의 5'에 위치한다. 일부 경우, PAM 서열은 5'-nGTn-3' 또는 5'-nGTt-3'을 포함한다.
일부 경우, 조작된 가이드 폴리뉴클레오타이드는 클래스 II 타입 V Cas 이펙터에 결합하도록 구성된다. 일부 경우, 클래스 II 타입 V Cas 이펙터는 서열번호 22, 26, 30, 34, 55 내지 89, 104 또는 147 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일성을 가진 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 경우, 클래스 II 타입 V Cas 이펙터는 서열번호 22, 26, 30, 34, 55 내지 89, 104 또는 147 중 어느 하나 또는 이의 변이체와 실질적으로 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다.
일부 경우, Tn7 타입 전위효소 복합체는 서열번호 23 내지 25, 27 내지 29, 31 내지 33, 35 내지 37, 101 내지 103, 105 내지 107 또는 148 내지 150 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일성을 가진 서열을 포함하는 적어도 하나의 폴리펩티드를 포함한다. 일부 경우, 재조합효소 또는 전위효소 복합체는 서열번호 23 내지 25, 27 내지 29, 31 내지 33, 35 내지 37, 101 내지 103, 105 내지 107 또는 148 내지 150 중 어느 하나 또는 이의 변이체와 실질적으로 동일한 서열을 포함하는 적어도 하나의 폴리펩티드를 포함한다. 일부 경우, Tn7 타입 전위효소 복합체는 서열번호 23 내지 25, 27 내지 29, 31 내지 33, 35 내지 37, 101 내지 103, 105 내지 107 또는 148 내지 150 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일성을 가진 서열을 포함하는 적어도 2개의 폴리펩티드를 포함한다. 일부 경우, Tn7 타입 전위효소 복합체는 서열번호 23 내지 25, 27 내지 29, 31 내지 33, 35 내지 37, 101 내지 103, 105 내지 107 또는 148 내지 150 중 어느 하나 또는 이의 변이체와 실질적으로 동일한 서열을 포함하는 적어도 2개의 폴리펩티드를 포함한다. 일부 경우, Tn7 타입 전위효소 복합체는 서열번호 23 내지 25, 27 내지 29, 31 내지 33, 35 내지 37, 101 내지 103, 105 내지 107 또는 148 내지 150 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일성을 가진 서열을 포함하는 적어도 3개의 폴리펩티드를 포함한다. 일부 경우, Tn7 타입 전위효소 복합체는 서열번호 23 내지 25, 27 내지 29, 31 내지 33, 35 내지 37, 101 내지 103, 105 내지 107 또는 148 내지 150 중 어느 하나 또는 이의 변이체와 실질적으로 동일한 서열을 포함하는 적어도 3개의 폴리펩티드를 포함한다.
일부 경우, Tn7 타입 전위효소 복합체는 서열번호 23 내지 25, 27 내지 29, 31 내지 33, 35 내지 37, 101 내지 103, 105 내지 107 또는 148 내지 150 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일성을 가진 서열을 포함하는 TnsB, TnsC 및 TniQ 폴리펩티드를 포함한다. 일부 경우, Tn7 타입 전위효소 복합체는 서열번호 8 또는 이의 변이체와 실질적으로 동일한 서열을 포함하는 TnsB 폴리펩티드를 포함한다. 일부 경우, Tn7 타입 전위효소 복합체는 서열번호 23 내지 25, 27 내지 29, 31 내지 33, 35 내지 37, 101 내지 103, 105 내지 107 또는 148 내지 150 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일성을 가진 서열을 포함하는 TnsB, TnsC 및 TniQ 폴리펩티드를 포함한다.
일부 경우, 조작된 가이드 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 90, 91, 92, 93, 117, 151, 156 내지 181 또는 209 내지 234 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일성을 가진 적어도 약 46개 내지 80개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 서열을 포함한다. 일부 경우, 조작된 가이드 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 90, 91, 92, 93, 117, 151, 156 내지 181 또는 209 내지 234 중 어느 하나 또는 이의 변이체와 실질적으로 동일한 적어도 약 46개 내지 80개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 서열을 포함한다.
일부 경우, 조작된 가이드 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 111 내지 114 또는 201 내지 204 중 어느 하나 또는 이의 변이체의 비-축퇴 뉴클레오타이드에 대해 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일성을 가진 서열을 포함한다. 일부 경우, 조작된 가이드 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 111 내지 114 또는 201 내지 204 중 어느 하나 또는 이의 변이체의 비-축퇴 뉴클레오타이드와 실질적으로 동일한 적어도 약 46개 내지 80개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 서열을 포함한다.
일부 경우, 좌측 재조합효소 서열은 서열번호 125, 127, 123, 129, 131, 133, 153 또는 134 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일성을 가진 서열을 포함한다. 일부 경우, 좌측 재조합효소 서열은 서열번호 125, 127, 123, 129, 131, 133, 153 또는 134 중 어느 하나 또는 이의 변이체와 실질적으로 동일한 서열을 포함한다.
일부 경우, 우측 재조합효소 서열은 서열번호 126, 155, 128, 124, 130, 132 또는 154 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일성을 가진 서열을 포함한다. 일부 경우, 우측 재조합효소 서열은 서열번호 126, 155, 128, 124, 130, 132 또는 154 중 어느 하나 또는 이의 변이체와 실질적으로 동일한 서열을 포함한다.
일부 경우, 클래스 II 타입 V Cas 이펙터 및 Tn7 타입 전위효소 복합체는 약 20 킬로염기 미만, 약 15 킬로염기 미만, 약 10 킬로염기 미만 또는 약 5 킬로염기 미만을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩된다.
MG108 시스템
한 측면에서, 본 개시내용은 카고 뉴클레오타이드 서열을 표적 핵산 부위로 전위시키는 시스템을 제공한다. 이 시스템은 카고 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 이중 가닥 핵산을 포함할 수 있다. 이 카고 뉴클레오타이드 서열은 Tn7 타입 전위효소 복합체와 상호작용하도록 구성될 수 있다. 상기 시스템은 Cas 이펙터 복합체를 포함할 수 있다. Cas 이펙터 복합체는 클래스 II 타입 V Cas 이펙터, 및 표적 뉴클레오타이드 서열에 하이브리드화하도록 구성된 조작된 가이드 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 클래스 II 타입 V Cas 이펙터는 RuvC 도메인을 포함할 수 있다. 상기 시스템은 Cas 이펙터 복합체에 결합하도록 구성된 Tn7 타입 전위효소 복합체를 포함할 수 있다. 일부 경우, Tn7 타입 전위효소 복합체는 TnsB 및 TnsC 구성요소를 포함하지만, TnsA 및/또는 TniQ 구성요소를 포함하지 않는다.
일부 경우, 카고 뉴클레오타이드 서열은 좌측 전위효소 인식 서열에 의해 플랭킹된다. 일부 경우, 카고 뉴클레오타이드 서열은 우측 전위효소 인식 서열에 의해 플랭킹된다. 일부 경우, 카고 뉴클레오타이드 서열은 좌측 전위효소 인식 서열 및 우측 전위효소 인식 서열에 의해 플랭킹된다. 일부 경우, 상기 시스템은 표적 핵산 부위를 포함하는 제2 이중 가닥 핵산을 추가로 포함한다. 일부 경우, 상기 시스템은 표적 핵산 부위에 인접한 Cas 이펙터 복합체와 호환되는 PAM 서열을 추가로 포함한다. 일부 경우, PAM 서열은 표적 핵산 부위의 3'에 위치한다. 일부 경우, PAM 서열은 표적 핵산 부위의 5'에 위치한다.
일부 경우, 조작된 가이드 폴리뉴클레오타이드는 클래스 II 타입 V Cas 이펙터에 결합하도록 구성된다. 일부 경우, 클래스 II 타입 V Cas 이펙터는 서열번호 38 또는 서열번호 108, 또는 이의 변이체에 대해 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일성을 가진 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 경우, 클래스 II 타입 V Cas 이펙터는 서열번호 38 또는 서열번호 108, 또는 이의 변이체와 실질적으로 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다.
일부 경우, Tn7 타입 전위효소 복합체는 서열번호 39, 40, 109 또는 110 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일성을 가진 서열을 포함하는 적어도 하나의 폴리펩티드를 포함한다. 일부 경우, 재조합효소 또는 전위효소 복합체는 서열번호 39, 40, 109 또는 110 중 어느 하나 또는 이의 변이체와 실질적으로 동일한 서열을 포함하는 적어도 하나의 폴리펩티드를 포함한다. 일부 경우, Tn7 타입 전위효소 복합체는 서열번호 39, 40, 109 또는 110 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일성을 가진 서열을 포함하는 적어도 2개의 폴리펩티드를 포함한다. 일부 경우, Tn7 타입 전위효소 복합체는 서열번호 39, 40, 109 또는 110 중 어느 하나 또는 이의 변이체와 실질적으로 동일한 서열을 포함하는 적어도 2개의 폴리펩티드를 포함한다. 일부 경우, Tn7 타입 전위효소 복합체는 서열번호 39, 40, 109 또는 110 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일성을 가진 서열을 포함하는 적어도 3개의 폴리펩티드를 포함한다. 일부 경우, Tn7 타입 전위효소 복합체는 서열번호 39, 40, 109 또는 110 중 어느 하나 또는 이의 변이체와 실질적으로 동일한 서열을 포함하는 적어도 3개의 폴리펩티드를 포함한다.
일부 경우, Tn7 타입 전위효소 복합체는 서열번호 40 또는 109 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일성을 가진 서열을 포함하는 TnsB 구성요소를 포함한다. 일부 경우, 재조합효소 또는 전위효소 복합체는 서열번호 40 또는 109 중 어느 하나 또는 이의 변이체와 실질적으로 동일한 서열을 포함하는 TnsB 구성요소를 포함한다.
일부 경우, Tn7 타입 전위효소 복합체는 서열번호 39 또는 110 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일성을 가진 서열을 포함하는 TnsC 구성요소를 포함한다. 일부 경우, 재조합효소 또는 전위효소 복합체는 서열번호 39 또는 110 중 어느 하나 또는 이의 변이체와 실질적으로 동일한 서열을 포함하는 TnsC 구성요소를 포함한다.
일부 경우, Tn7 타입 전위효소 복합체는 각각 서열번호 40 및 39 또는 109 및 110, 또는 이의 변이체에 대해 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일성을 가진 서열을 포함하는 TnsB 및 TnsC 구성요소를 포함한다. 일부 경우, 재조합효소 또는 전위효소 복합체는 각각 서열번호 40 및 39 또는 109 및 110 중 어느 하나 또는 이의 변이체와 실질적으로 동일한 서열을 포함하는 TnsB 및 TnsC 구성요소를 포함한다.
일부 경우, 조작된 가이드 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 118, 182, 183, 235 또는 236 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일성을 가진 적어도 약 46개 내지 80개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 서열을 포함한다. 일부 경우, 조작된 가이드 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 118, 182, 183, 235 또는 236 중 어느 하나 또는 이의 변이체와 실질적으로 동일한 적어도 약 46개 내지 80개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 서열을 포함한다.
일부 경우, 조작된 가이드 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 115, 116, 205 또는 206 중 어느 하나 또는 이의 변이체의 비-축퇴 뉴클레오타이드에 대해 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일성을 가진 서열을 포함한다. 일부 경우, 조작된 가이드 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 115, 116, 205 또는 206 중 어느 하나 또는 이의 변이체의 비-축퇴 뉴클레오타이드와 실질적으로 동일한 적어도 약 46개 내지 80개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 서열을 포함한다.
일부 경우, 좌측 재조합효소 서열은 서열번호 134 또는 이의 변이체에 대해 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일성을 가진 서열을 포함한다. 일부 경우, 좌측 재조합효소 서열은 서열번호 134 또는 이의 변이체와 실질적으로 동일한 서열을 포함한다.
일부 경우, 우측 재조합효소 서열은 서열번호 135 또는 이의 변이체에 대해 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일성을 가진 서열을 포함한다. 일부 경우, 우측 재조합효소 서열은 서열번호 135 또는 이의 변이체와 실질적으로 동일한 서열을 포함한다.
일부 경우, 클래스 II 타입 V Cas 이펙터 및 Tn7 타입 전위효소 복합체는 약 20 킬로염기 미만, 약 15 킬로염기 미만, 약 10 킬로염기 미만 또는 약 5 킬로염기 미만을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩된다.
MG110 시스템
한 측면에서, 본 개시내용은 카고 뉴클레오타이드 서열을 표적 핵산 부위로 전위시키는 시스템을 제공한다. 이 시스템은 카고 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 이중 가닥 핵산을 포함할 수 있다. 이 카고 뉴클레오타이드 서열은 Tn7 타입 전위효소 복합체와 상호작용하도록 구성될 수 있다. 상기 시스템은 Cas 이펙터 복합체를 포함할 수 있다. Cas 이펙터 복합체는 클래스 I 타입 I Cas 이펙터, 및 표적 뉴클레오타이드 서열에 하이브리드화하도록 구성된 조작된 가이드 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 상기 시스템은 Cas 이펙터 복합체에 결합하도록 구성된 Tn7 타입 전위효소 복합체를 포함할 수 있다.
일부 경우, 카고 뉴클레오타이드 서열은 좌측 전위효소 인식 서열에 의해 플랭킹된다. 일부 경우, 카고 뉴클레오타이드 서열은 우측 전위효소 인식 서열에 의해 플랭킹된다. 일부 경우, 카고 뉴클레오타이드 서열은 좌측 전위효소 인식 서열 및 우측 전위효소 인식 서열에 의해 플랭킹된다. 일부 경우, 상기 시스템은 표적 핵산 부위를 포함하는 제2 이중 가닥 핵산을 추가로 포함한다. 일부 경우, 상기 시스템은 표적 핵산 부위에 인접한 Cas 이펙터 복합체와 호환되는 PAM 서열을 추가로 포함한다. 일부 경우, PAM 서열은 표적 핵산 부위의 3'에 위치한다.
일부 경우, 조작된 가이드 폴리뉴클레오타이드는 클래스 I 타입 I Cas 이펙터에 결합하도록 구성된다. 일부 경우, 클래스 I 타입 I Cas 이펙터는 서열번호 41 내지 43 또는 48 내지 50 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일성을 가진 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 경우, 클래스 I 타입 I Cas 이펙터는 서열번호 41 내지 43 또는 48 내지 50 중 어느 하나 또는 이의 변이체와 실질적으로 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다.
일부 경우, 조작된 가이드 폴리뉴클레오타이드는 클래스 I 타입 I Cas 이펙터에 결합하도록 구성된다. 일부 경우, 클래스 I 타입 I Cas 이펙터는 서열번호 41 내지 43 또는 48 내지 50 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일성을 가진 서열을 포함하는 Cas6, Cas7 및 Cas8 이펙터를 포함한다. 일부 경우, 클래스 I 타입 I Cas 이펙터는 서열번호 41 내지 43 또는 48 내지 50 중 어느 하나 또는 이의 변이체와 실질적으로 동일한 서열을 포함하는 Cas6, Cas7 및 Cas8 이펙터를 포함한다.
일부 경우, Tn7 타입 전위효소 복합체는 서열번호 44 내지 47 또는 51 내지 54 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일성을 가진 서열을 포함하는 적어도 하나의 폴리펩티드를 포함한다. 일부 경우, 재조합효소 또는 전위효소 복합체는 서열번호 44 내지 47 또는 51 내지 54 중 어느 하나 또는 이의 변이체와 실질적으로 동일한 서열을 포함하는 적어도 하나의 폴리펩티드를 포함한다. 일부 경우, Tn7 타입 전위효소 복합체는 서열번호 44 내지 47 또는 51 내지 54 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일성을 가진 서열을 포함하는 적어도 2개의 폴리펩티드를 포함한다. 일부 경우, Tn7 타입 전위효소 복합체는 서열번호 44 내지 47 또는 51 내지 54 중 어느 하나 또는 이의 변이체와 실질적으로 동일한 서열을 포함하는 적어도 2개의 폴리펩티드를 포함한다. 일부 경우, Tn7 타입 전위효소 복합체는 서열번호 44 내지 47 또는 51 내지 54 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일성을 가진 서열을 포함하는 적어도 3개의 폴리펩티드를 포함한다. 일부 경우, Tn7 타입 전위효소 복합체는 서열번호 44 내지 47 또는 51 내지 54 중 어느 하나 또는 이의 변이체와 실질적으로 동일한 서열을 포함하는 적어도 3개의 폴리펩티드를 포함한다. 일부 경우, Tn7 타입 전위효소 복합체는 서열번호 44 내지 47 또는 51 내지 54 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일성을 가진 서열을 포함하는 4개의 폴리펩티드를 포함한다. 일부 경우, Tn7 타입 전위효소 복합체는 서열번호 44 내지 47 또는 51 내지 54 중 어느 하나 또는 이의 변이체와 실질적으로 동일한 서열을 포함하는 4개의 폴리펩티드를 포함한다.
일부 경우, Tn7 타입 전위효소 복합체는 각각 서열번호 44 내지 47 또는 51 내지 54 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일성을 가진 서열을 포함하는 TnsA, TnsB, TnsC 및 TniQ 구성요소를 포함한다.
일부 경우, 조작된 가이드 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 121, 122, 207 또는 208 중 어느 하나 또는 이의 변이체의 비-축퇴 뉴클레오타이드에 대해 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일성을 가진 서열을 포함한다. 일부 경우, 조작된 가이드 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 121, 122, 207 또는 208 중 어느 하나 또는 이의 변이체의 비-축퇴 뉴클레오타이드와 실질적으로 동일한 적어도 약 46개 내지 80개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 서열을 포함한다.
일부 경우, 좌측 재조합효소 서열은 서열번호 136 또는 138, 또는 이의 변이체에 대해 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일성을 가진 서열을 포함한다. 일부 경우, 좌측 재조합효소 서열은 서열번호 136 또는 138, 또는 이의 변이체와 실질적으로 동일한 서열을 포함한다.
일부 경우, 우측 재조합효소 서열은 서열번호 137 또는 139, 또는 이의 변이체에 대해 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일성을 가진 서열을 포함한다. 일부 경우, 우측 재조합효소 서열은 서열번호 137 또는 139, 또는 이의 변이체와 실질적으로 동일한 서열을 포함한다.
일부 경우, 클래스 I 타입 I Cas 이펙터 및 Tn7 타입 전위효소 복합체는 약 20 킬로염기 미만, 약 15 킬로염기 미만, 약 10 킬로염기 미만 또는 약 5 킬로염기 미만을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩된다.
한 측면에서, 본 개시내용은 카고 뉴클레오타이드 서열을, 표적 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 표적 핵산 부위로 전위시키는 방법으로서, 세포 내에서 본원에 기재된 시스템을 발현시키거나 본원에 기재된 시스템을 세포에 도입하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
IUPAC 관례에 따라, 하기 약어가 실시예 전체에서 사용된다:
A = 아데닌
C = 사이토신
G = 구아닌
T = 타이민
R = 아데닌 또는 구아닌
Y = 사이토신 또는 타이민
S = 구아닌 또는 사이토신
W = 아데닌 또는 타이민
K = 구아닌 또는 타이민
M = 아데닌 또는 사이토신
B = C, G 또는 T
D = A, G 또는 T
H = A, C 또는 T
V = A, C 또는 G
실시예
실시예 1 - (일반 프로토콜) 본원에 기재된 시스템을 위한 PAM 서열 식별/확인
추정 엔도뉴클레아제를 대장균 용해물 기반 발현 시스템(myTXTL, 아버 바이오사이언스(Arbor Biosciences))에서 발현시켰다. 추정 뉴클레아제에 의해 절단될 수 있는 무작위로 생성된 잠재적 PAM 서열을 함유하는 플라스미드를 시퀀싱하여 PAM 서열을 확인하였다. 이 시스템에서, 추정 뉴클레아제를 코딩하는 대장균 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열을 T7 프로모터의 제어 하에 시험관내에서 PCR 단편으로부터 전사하고 번역하였다. T7 프로모터 및 이를 뒤따르는 반복부-스페이서-반복부 서열로 구성된 최소 CRISPR 어레이를 가진 제2 PCR 단편을 동일한 반응에서 전사하였다. TXTL 시스템에서의 성공적인 엔도뉴클레아제 및 반복부-스페이서-반복부 서열의 발현에 이은 CRISPR 어레이 프로세싱은 활성 시험관내 CRISPR 뉴클레아제 복합체를 제공하였다.
최소 어레이에서 8N 혼합된 염기(잠재적 PAM 서열) 및 이를 뒤따르는 스페이서 서열 일치를 함유하는 표적 플라스미드의 라이브러리를 TXTL 반응의 결과물과 함께 인큐베이션하였다. 1시간 내지 3시간 후, 반응을 중단하고 DNA 클린업 키트, 예를 들어, Zymo DCC, AMPure XP 비드, QiaQuick 등을 통해 DNA를 회수하였다. 어댑터 서열은 엔도뉴클레아제에 의해 절단된 활성 PAM 서열을 가진 DNA에 블런트-말단 라이게이션된 반면, 절단되지 않은 DNA는 라이게이션을 위해 접근될 수 없다. 그 다음, 활성 PAM 서열을 포함하는 DNA 분절을, 상기 라이브러리 및 어댑터 서열에 특이적인 프라이머를 사용한 PCR로 증폭하였다. PCR 증폭 생성물을 겔에서 해상하여, 절단 사건에 상응하는 앰플리콘을 식별하였다. 절단 반응의 증폭된 분절은 NGS 라이브러리의 제조를 위한 주형, 또는 생거 시퀀싱을 위한 기질로서도 사용되었다. 출발 8N 라이브러리의 서브세트인 이 생성된 라이브러리의 시퀀싱은 CRISPR 복합체와 호환되는 PAM 활성을 가진 서열을 보여주었다. 프로세싱된 RNA 구축물을 사용한 PAM 시험을 위해, 시험관내 전사된 RNA를 플라스미드 라이브러리와 함께 첨가하고 최소 CRISPR 어레이 주형을 생략한다는 점을 제외하고 상기 절차를 반복하였다.
결합 능력을 갖지만 뉴클레아제가 결핍된 엔도뉴클레아제의 경우, 상기 절차의 변형을 통해 PAM을 확인하였다. TXTL에서 발현시킨 후, sgRNA 또는 crRNA 및 PAM 라이브러리를 첨가하였다. 이펙터가 sgRNA 의존적 방식으로 스페이서 서열에 결합하였을 때, 스페이서 서열은 이펙터 단백질 내에서 격리되었다. 스페이서 서열 내부를 표적화하는 적절한 제한 효소를 첨가하였고 라이브러리 내의 모든 보호되지 않은 플라스미드를 절단하였다. 밴드의 PCR 및 후속 NGS 라이브러리 제조를 통해 PAM을 함유하는 라이브러리의 절단되지 않은(엔도뉴클레아제 결합된) 구성원을 식별하였다.
실시예 2 - 시험관내 표적화된 인테그라제 활성
이전에 식별된 PAM을 사용하여 인테그라제 활성을 우선적으로 어세이하였지만, PAM 라이브러리 기질을 대신 사용하여 수행할 수 있고, 이때 효율은 감소된다. 시험관내 시험을 위한 구성요소의 한 배열은 기증자 서열을 함유하는 플라스미드 이외의 3개의 플라스미드를 포함하였다: (1) T7 프로모터 하에 이펙터(또는 이펙터들)를 가진 발현 플라스미드; (2) T7 프로모터 하에 인테그라제 유전자를 가진 발현 플라스미드; sgRNA 또는 crRNA 및 tracrRNA; (3) 스페이서 부위 및 적절한 PAM을 함유하는 표적 플라스미드; 및 (4) 카고 유전자(예를 들어, Tet 내성 유전자와 같은 선택 마커) 주변에서의 전위에 필요한 좌측 말단(LE) 및 우측 말단(RE) DNA 서열을 함유하는 기증자 플라스미드. 시험관내 전사/번역(TXTL) 시스템(예를 들어, 대장균 용해물 또는 망상적혈구 용해물 기반 시스템)을 사용하여 이펙터 및 인테그라제 유전자를 발현시켰다. 발현 후, 전위가 일어날 수 있도록 RNA, 표적 DNA 및 기증자 DNA를 첨가하고 인큐베이션하였다. 표적 DNA에 대한 하나의 프라이머 및 기증자 DNA에 대한 하나의 프라이머를 사용하여 인테그라제 부위의 연접부에 걸쳐 PCR을 통해 전위를 검출하였다. 생성된 PCR 생성물을, NGS를 통해 시퀀싱하여 sgRNA/crRNA 표적화된 부위에 대한 정확한 삽입 토폴로지(topology)를 확인하였다. 상기 프라이머들은 다양한 삽입 부위가 수용되고 검출될 수 있도록 다운스트림에 위치하였다. 처음에 삽입 방향도 알지 못했기 때문에, 카고의 어느 한 배향 또는 스페이서의 어느 한 측면에서 통합이 검출되도록 프라이머를 설계하였다.
통합된 카고를 가진 표적 DNA의 실험 결과물의 정량적 PCR(qPCR) 측정을 통해 통합 효율을 측정하였고, 마찬가지로 qPCR을 통해 측정된 비변형 표적 DNA의 양으로 정규화하였다.
이 어세이는 용해물 기반 발현보다는 정제된 단백질 구성요소의 사용을 통해 수행될 수 있다. 이 경우, T7 유도성 프로모터 하에 대장균 프로테아제 결핍 B 균주에서 단백질을 발현시켰고, 초음파처리를 이용하여 세포를 용해시켰으며, AKTA 아반트(Avant) FPLC(지이 라이프사이언스(GE Lifescience))에서 HisTrap FF(지이 라이프사이언스) Ni-NTA 친화성 크로마토그래피를 이용하여 관심 있는 His-태그부착된 단백질을 정제하였다. SDS-PAGE 및 인스탄트블루 울트라패스트(InstantBlue Ultrafast)(시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)) 쿠마시(coomassie) 염색된 아크릴아미드 겔(바이오-라드(Bio-Rad))에서 해상된 단백질 밴드의 순도를, 이미지랩(ImageLab) 소프트웨어(바이오-라드)에서 밀도측정을 이용하여 측정하였다. 50 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, 1 mM TCEP 및 5% 글리세롤로 구성된 저장 완충제(pH 7.5)(또는 최대 안정성에 대해 확인된 다른 완충제)에서 단백질을 탈염하고 -80℃에서 저장하였다. 정제 후 이펙터(들) 및 인테그라제(들)를, 예를 들어, 26 mM HEPES pH 7.5, 4.2 mM TRIS pH 8, 50 ㎍/㎖ BSA, 2 mM ATP, 2.1 mM DTT, 0.05 mM EDTA, 0.2 mM MgCl2, 28 mM NaCl, 21 mM KCl 및 1.35% 글리세롤로 구성되고 15 mM Mg(OAc)2로 보충된 반응 완충제(최종 pH 7.5) 중의 전술된 sgRNA, 표적 DNA 및 기증자 DNA에 첨가하였다.
실시예 3 - 예측된 RNA 폴딩
안드로네스쿠(Andronescu) 2007의 방법을 이용하여 활성 단일 RNA 서열의 예측된 RNA 폴딩을 37˚에서 계산하였다. 모든 헤어핀-루프 2차 구조를 구조로부터 단독으로 삭제하고 더 작은 단일 가이드로 반복적으로 컴파일링하였다. 제2 접근법에서, MG64-1의 tracrRNA를 알려져 있는 타입 V-k tracrRNA에 정렬하고 단일 가이드로부터 고유 삽입 영역을 돌연변이시키고 57개 염기까지 최소화하였다. 도 12a는 MG64-2 sgRNA(서열번호 202)의 예측된 구조를 도시한다. 도 12b는 MG64-4 sgRNA(서열번호 203)의 예측된 구조를 도시한다. 도 12c는 MG64-6 sgRNA(서열번호 201)의 예측된 구조를 도시한다. 도 12d는 MG64-7 sgRNA(서열번호 204)의 예측된 구조를 도시한다. 도 12e는 MG108-1 sgRNA(서열번호 206)의 예측된 구조를 도시한다. 염기의 음영은 그 염기의 염기 페어링 확률에 상응한다.
실시예 4 - 겔 변위를 통한 트랜스포존 말단 검증
전기영동 이동성 변위 어세이(EMSA)를 통해 TnsB 결합에 대해 트랜스포존 말단을 시험하였다. 이 경우, 잠재적 LE 또는 RE를 DNA 단편(100 내지 500 bp)으로서 합성하고 FAM-표지부착된 프라이머를 사용한 PCR을 통해 FAM으로 말단-표지부착하였다. 시험관내 전사/번역 시스템(예를 들어, PURExpress)에서 TnsB 단백질을 합성하였다. 합성 후, 1 ㎕의 TnsB 단백질을 결합 완충제(20 mM HEPES pH 7.5, 2.5 mM Tris pH 7.5, 10 mM NaCl, 0.0625 mM EDTA, 5 mM TCEP, 0.005% BSA, 1 ㎍/㎖ 폴리(dI-dC) 및 5% 글리세롤)에서 10 ㎕ 반응물 중의 50 nM의 표지부착된 RE 또는 LE에 첨가하였다. 결합을 40분 동안 30˚에서 인큐베이션한 다음, 2 ㎕의 6X 로딩 완충제(60 mM KCl, 10 mM Tris pH 7,6, 50% 글리세롤)를 첨가하였다. 결합 반응물을 5% TBE 겔에서 분리하고 시각화하였다. TnsB의 존재 하에 LE 또는 RE의 변위는 성공적인 결합에 기인하였고 전위효소 활성을 표시하였다.
도 15는 이 실험의 예를 보여주는데, 이때 MG64-2에 대한 RE DNA 서열(예를 들어, 서열번호 155)을 상기 절차를 통해 FAM으로 말단-표지부착하고 상응하는 MG64-2 TnsB 유사 구성요소(예를 들어, 서열번호 23)와 함께 인큐베이션하였다. 레인 3에서 표지부착된 밴드의 상향변위는 이것이 활성 RE 전위 서열을 함유함을 표시하는, TnsB에 의한 RE 서열의 결합을 표시한다.
실시예 5 - 대장균에서의 인테그라제 활성(예측)
대장균은 게놈 이중 가닥 DNA 절단을 효율적으로 복구하는 능력을 결여하기 때문에, 대장균 게놈에서 이중 가닥 절단을 야기할 수 있는 작용제에 의한 대장균의 형질전환은 세포 사멸을 야기한다. 이 현상을 이용하여, 스페이서/표적 및 PAM 서열이 게놈 DNA 내로 통합되어 있는 표적 균주에서 엔도뉴클레아제 또는 이펙터 보조 인테그라제 및 가이드 RNA(예를 들어, 실시예 3에서와 같이 확인됨)를 재조합적으로 발현시킴으로써 대장균에서 엔도뉴클레아제 또는 이펙터 보조 인테그라제 활성을 시험한다.
그 다음, 단일 가이드 RNA와 함께 뉴클레아제 또는 이펙터를 함유하는 플라스미드, 인테그라제 및 보조 유전자를 발현하는 플라스미드, 및 통합을 위해 좌측 말단(LE) 및 우측 말단(RE) 트랜스포존 모티프에 의해 플랭킹된 선택 마커와 함께 온도 민감성 복제 기점을 함유하는 플라스미드를 사용하여 조작된 균주를 형질전환시킨다. 이어서, 플라스미드 복제를 위한 제한 온도에서 선택함으로써, 이 유전자들의 발현을 위해 유도된 형질전환체를, 게놈 표적으로의 상기 마커의 전달에 대해 스크리닝하고, 게놈 내로의 마커 통합을 PCR로 확인한다.
비편향 접근법을 이용하여 오프-표적 통합을 스크리닝한다. 요약하면, 정제된 gDNA를 Tn5 인테그라제 또는 전단으로 단편화한 다음, 라이게이션된 어댑터 및 선택 마커에 특이적인 프라이머를 사용하여 관심 있는 DNA를 PCR 증폭한다. 그 후, NGS 시퀀싱을 위해 앰플리콘을 준비한다. 생성된 서열의 분석을 통해 트랜스포존 서열을 트리밍하고, 플랭킹 서열을 게놈에 맵핑하여 삽입 위치를 확인하고, 오프-표적 삽입률을 측정한다.
실시예 6 - 전위효소 활성의 콜로니 PCR 스크린(예측)
박테리아 세포에서 뉴클레아제 또는 이펙터 보조 인테그라제 활성을 시험하기 위해, MG64_1에 특이적인 표적 및 상응하는 PAM 서열을 함유하도록 조작된 BL21(DE3) 대장균 세포로부터 균주 MGB0032를 구축한다. 그 다음, pJL56(MG64_1 이펙터 및 헬퍼 스위트를 발현하는 플라스미드, 암피실린 내성), 및 T7 프로모터에 의해 유도되는 관심 있는 조작된 표적에 대한 단일 가이드 RNA 서열을 발현하는 클로람페니콜 내성 플라스미드인 pTCM 64_1 sg로 MGB0032 대장균 세포를 형질전환시킨다.
이어서, 상기 두 플라스미드를 함유하는 MGB0032 배양물을 포화 상태까지 생장시키고, 적절한 항생제를 가진 생장 배지에 적어도 1:10으로 희석하고, 대략 1의 OD까지 37℃에서 인큐베이션한다. 이 생장 단계의 세포를 전기적격(electrocompetent) 세포로 만들고, 통합을 위해 좌측 말단(LE) 및 우측 말단(RE) 트랜스포존 모티프에 의해 플랭킹된 테트라사이클린 내성 마커를 가진 플라스미드인 간소화된 64_1 pDonor로 형질전환시킨다. 그 다음, 전기천공된 세포를 최종 농도 100 μM의 IPTG의 존재 또는 부재 하에 LB 배지에서 2시간 동안 회복시킨 후, LB-한천-암피실린-클로람페니콜-테트라사이클린에 플레이트하고 37℃에서 4일 동안 인큐베이션한다. 멸균 이쑤시개를 이용하여 각각의 생성된 CFU를 샘플링하고, 이를 물에 혼합한다. 이 용액에 Q5 고충실도(High Fidelity) PCR 마스터믹스(뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs)) 및 프라이머 LA155(5'-GCTCTTCCGATCTNNNNGATGAGCGCATTGTTAGATTTCAT-3') 및 oJL50(5'-AAACCGACATCGCAGGCTTC-3')을 첨가한다. 이 프라이머들은 예측된 삽입 연접부를 플랭킹한다. 예측된 생성물 크기는 609 bp이다. DNA 증폭 PCR 생성물을 2% 아가로스 겔에서 시각화한다. PCR 생성물의 생거 시퀀싱은 전위 사건을 확인시켜준다.
실시예 7 - 세포내 발현/시험관내 어세이(예측)
생리학적으로 적절한 환경에서 NLS 구축물의 기능을 시험하기 위해, 렌티바이러스 형질도입을 이용하여 활성 NLS-태그부착된 CAST 구성요소를 가진 클로닝된 구축물을 K562 세포 내로 통합한다. 요약하건대, 렌티바이러스 전달 플라스미드 내로 클로닝된 구축물을 외피 및 팩키징 플라스미드와 함께 293T 세포 내로 형질감염시키고, 72시간 인큐베이션 후 배지로부터 바이러스 함유 상청액을 수거한다. 이어서, 바이러스를 함유하는 배지를 8 ㎍/㎖의 폴리브렌과 함께 K562 세포주와 72시간 동안 인큐베이션한 다음, 통합을 위해 4일 동안 1 ㎍/㎖의 푸로마이신을 사용하여 형질감염된 세포를 대량으로 선택한다. 선택된 세포주를 4일 기간의 말기에 수거하고 핵 분획 및 세포질 분획을 위해 차등적으로 용해시킨다. 그 다음, 시험관내 발현된 구성요소의 상보적 세트를 사용하여 전위 능력에 대해 후속 분획을 시험한다.
1,000만 개의 세포를 원심분리하고 1xPBS(pH 7.4)로 한 번 세척한다. 상청액 세척제를 완전히 흡인하여 세포 펠릿을 얻고 -80℃에서 16시간 동안 급속 냉동한다. 얼음 위에서 해동한 후, 세포 펠릿 크기를 질량으로 측정하고, 적절한 추출 부피의 세포 분획화 및 핵 추출 시약(NE-PER)을 사용하여 세포 분획에서 단백질을 천연적으로 추출한다. 요약하면, 세포질 추출 시약을 1:10의 세포 질량 대 추출 시약 부피로 사용한다. 세포 현탁액을 볼텍싱으로 혼합하고 비이온성 세제로 용해시킨다. 이어서, 세포를 4℃에서 5분 동안 16,000xg로 원심분리한다. 그 다음, 세포질 추출 상청액을 기울여 따라내고 시험관내 시험을 위해 보관한다. 그 후, 핵 추출 시약을 1:2의 원래 세포 질량 대 핵 추출 시약으로 첨가하고 간헐적으로 볼텍싱하면서 얼음 위에서 1시간 동안 인큐베이션한다. 이어서, 핵 현탁액을 4℃에서 10분 동안 16,000xg로 원심분리하고 상청액 핵 추출물을 기울여 따라내고 시험관내 전위 활성에 대해 시험한다. 본 발명자들은 시험관내 발현된 단백질, 기증자 DNA, pTarget 및 완충제의 상보적 세트와 함께 각각의 조건에 대해 각각의 세포 및 핵 추출물 4 ㎕를 사용하여 시험관내 전위 반응을 수행한다. 전위 활성의 증거는 기증자-표적 연접부의 PCR 증폭에 의해 어세이된다.
실시예 8 - 포유류 세포에서의 활성(예측)
포유류 세포에서 표적화 및 절단 활성을 보여주기 위해, 핵 국소화 서열을 각각의 뉴클레아제 또는 이펙터 단백질 및 인테그라제 단백질의 C 말단에 융합시키고, 융합 단백질을 정제한다. 관심 있는 게놈 유전자좌를 표적화하는 단일 가이드 RNA를 합성하고 뉴클레아제/이펙터 단백질과 함께 인큐베이션하여 리보핵단백질 복합체를 형성한다. 좌측 말단(LE) 및 우측 말단(RE) 모티프에 의해 플랭킹된 선택 네오마이신 내성 마커(NeoR) 또는 형광 마커를 함유하는 플라스미드로 세포를 형질감염시키고 4시간 내지 6시간 동안 회복시킨 후, 뉴클레아제 RNP 및 인테그라제 단백질로 전기천공시킨다. G418 내성 콜로니의 계수 또는 형광 활성화된 세포 세포분석법으로 게놈 내로의 플라스미드의 통합을 정량한다. 게놈 DNA를 전기천공 후 72시간에서 추출하고 NGS 라이브러리의 제조에 사용한다. 게놈을 단편화하고 NGS 라이브러리 제조를 위해 트랜스포존 마커 및 플랭킹 DNA의 앰플리콘을 제조함으로써 오프-표적 빈도를 어세이한다. 각각의 표적화 시스템의 활성을 시험하기 위해 적어도 40개의 상이한 표적 부위를 선택한다.
실시예 9 - 표적화된 뉴클레아제의 활성
제자리 발현 및 단백질 서열 분석은 일부 RNA 가이딩 이펙터가 활성 뉴클레아제임을 암시한다. 이들은 예측된 엔도뉴클레아제 관련 도메인(일치하는 RuvC 및 HNH_엔도뉴클레아제 도메인) 및 예측된 HNH와 RuvC 촉매 잔기를 함유한다(예를 들어, MG36-5 이펙터의 예측된 촉매 잔기를 보여주는 도 4A 참조).
myTXTL 시스템 및 시험관내 전사된 RNA를 사용하여 조작된 단일 가이드 RNA 서열로 후보 활성을 시험한다. 활성 단백질은 라이브러리를 성공적으로 절단하여 아가로스 겔 전기영동에서 약 170 bp의 밴드를 생성하는 단백질로서 식별된다.
실시예 10 - 트랜스포존의 식별
트랜스포존은 트랜스포존의 좌측 말단과 우측 말단 사이에 인테그라제 및/또는 인테그라제 기능을 가진 하나 이상의 단백질 서열을 함유할 때 활성을 나타낼 것으로 예측된다. 전형적인 Tn7 트랜스포존은 일반적으로 촉매 인테그라제 TnsB를 포함하지만, TnsA, TnsC, TnsD, TnsE, TniQ 및/또는 다른 인테그라제 또는 인테그라제를 함유할 수도 있다. 트랜스포존 말단은 인테그라제 단백질 및 다른 '카고' 유전자를 플랭킹하는 15 bp 내지 150 bp 길이의 직접 반복부 및/또는 역반복부를 함유하는 예측된 인테그라제 결합 부위를 포함한다. 단백질 서열 분석은 인테그라제가 인테그라제 도메인, 인테그라제 도메인 및/또는 인테그라제 촉매 잔기를 함유함을 표시하였는데, 이는 인테그라제가 활성 상태임을 암시한다(예를 들어, TnsB 요소를 함유하는 예시적인 MG36-5 이펙터 기반 CAST 시스템에 대한 유전자좌 도표를 보여주는 도 4A; 및 TnsA, TnsB, TnsC 및 TniQ 요소를 함유하는 예시적인 MG39-1 이펙터 기반 CAST 시스템에 대한 유전자좌 도표를 보여주는 도 5A).
실시예 11 - CRISPR 관련 트랜스포존의 식별
추정 CRISPR 관련 트랜스포존(CAST)은 DNA 및/또는 RNA 표적화 CRISPR 이펙터, 및 CRISPR 어레이의 근처에서 예측된 인테그라제 기능을 가진 단백질을 함유한다. 일부 시스템에서, 이펙터는 엔도뉴클레아제 관련 촉매 도메인 및/또는 촉매 잔기의 존재를 기반으로 뉴클레아제 활성을 가질 것으로 예측된다(예를 들어, TnsB 요소를 함유하는 CAST 시스템 유전자좌와 관련하여 MG36-5 이펙터의 예측된 촉매 잔기를 보여주는 도 4A). 인테그라제는 CRISPR 유전자좌(CRISPR 뉴클레아제 및 어레이) 및 인테그라제 단백질이 예측된 트랜스포존 좌측 말단과 우측 말단 사이에 위치할 때 활성 뉴클레아제와 회합될 것으로 예측되었다(예를 들어, 도 4B 및 4C). 이 경우, 이펙터는 가이드 RNA를 기반으로 특정 게놈 위치로의 DNA 통합을 유도할 것으로 예측되었다.
일부 시스템에서, 이펙터는 알려져 있는 CRISPR 이펙터 단백질과 상동성을 갖지만, 엔도뉴클레아제 도메인 및/또는 촉매 잔기의 부재를 기반으로 비활성 상태일 것으로 예측되었다(도 5A). 인테그라제는 CRISPR 유전자좌(비활성 CRISPR 뉴클레아제 및 어레이) 및 인테그라제 단백질이 예측된 트랜스포존 좌측 말단 및 우측 말단 내에 위치할 때 이펙터와 회합될 것으로 예측된다(도 5A 및 5B).
실시예 12 - CAST 발견
CRISPR 관련 트랜스포존(CAST)은 DNA 카고의 표적화된 통합을 촉진하기 위해 CRISPR 시스템과 상호작용하도록 진화된 트랜스포존을 포함하는 시스템이다.
CAST는 트랜스포존의 시그니처 좌측 말단 및 우측 말단 내에서의 DNA 전위에 관여하는 하나 이상의 단백질 서열을 코딩하는 게놈 서열이다. 전형적인 Tn7 트랜스포존은 일반적으로 촉매 전위효소 TnsB를 포함하지만, 촉매 전위효소 TnsA, 로더(loader) 단백질 TnsC 또는 TniB, 및 표적 인식 단백질 TnsD, TnsE, TniQ 및/또는 다른 트랜스포존 관련 구성요소도 함유할 수 있다. 트랜스포존 말단은 트랜스포존 기구 및 다른 '카고' 유전자를 플랭킹하는 15 bp 내지 150 bp 길이의 직접 반복부 및/또는 역반복부를 함유하는 예측된 전위효소 결합 부위를 포함한다.
또한, CAST는 CRISPR 어레이의 근처에서 DNA 및/또는 RNA 표적화 CRISPR 뉴클레아제 또는 이펙터도 코딩한다. 일부 시스템에서, 이펙터는 엔도뉴클레아제 관련 촉매 도메인 및/또는 촉매 잔기의 존재를 기반으로 활성 뉴클레아제일 것으로 예측된다. 일부 시스템에서, 이펙터는 알려져 있는 CRISPR 이펙터 단백질과 서열 유사성을 갖지만, 엔도뉴클레아제 도메인 및/또는 촉매 잔기의 부재를 기반으로 비활성 상태일 것으로 예측되었다. CRISPR 유전자좌 및 트랜스포존 관련 단백질이 예측된 트랜스포존 좌측 말단 및 우측 말단 내에 위치할 때, 트랜스포존은 이펙터와 회합될 것으로 예측된다. 이 경우, 이펙터는 가이드 RNA를 기반으로 특정 게놈 위치로의 DNA 통합을 유도할 것으로 예측된다.
실시예 13a - Cas12k CAST
Cas12k CAST 시스템은 뉴클레아제 결함 CRISPR Cas12k 이펙터, CRISPR 어레이, tracrRNA 및 Tn7 유사 전위 단백질을 코딩한다(예를 들어, Cas12k를 함유하는 MG108-1 CAST 시스템에 대한 유전자좌 조직화 도표를 보여주는 도 8 참조). Cas12k 이펙터는 계통발생학적으로 다양하며 이들과 CAST의 회합을 확인시켜주는 특징은 여러 경우에서 확인되었다(예를 들어, MG64-1, MG64-2, MG64-3, MG64-5, MG64-6, MG64-7, MG64-13, MG64-54, MG64-56, MG108-1 및 MG108-2 이펙터가 어떻게 이 군의 일부인지를 보여주는 도 9 참조). 이러한 특징적인 특징 중 하나는 MG64-3 CRISPR 유전자좌와 관련하여 확인된 트랜스포존 말단이었고; 트랜스포존 좌측 말단은 말단 역반복부 및 자가 일치 스페이서 서열에 의해 표시된 바와 같이 MG64-3 CRISPR 유전자좌로부터 다운스트림에서 식별되었다(도 11a). 식별된 또 다른 이러한 특징은 보존된 모티프 5'-GNNGGNNTGAAAG-3'을 함유하는 Cas12k CAST CRISPR 반복부(crRNA)를 포함한다(예를 들어, MG64-2, MG64-4, MG64-5, MG64-6, MG64-7 및 MG108-1, 및 도 11b 참조). crRNA 모티프 내의 짧은 반복부-항-반복부(RAR)는 tracrRNA의 상이한 영역들과 정렬되었고, RAR 모티프는 tracrRNA의 시작 및 말단을 정의하는 것으로 보였다. 도 13c는 예를 들어, MG64-2, MG64-4, MG64-5, MG64-6, MG64-7 및 MG108-1 패밀리에서 이러한 RAR 모티프의 존재를 보여준다.
실시예 13b - 클래스 I 타입 I-F CAST
일부 CAST는 뉴클레아제 결함 CRISPR 타입 I-F 캐스케이드 이펙터 단백질, CRISPR 어레이 및 Tn7 유사 전위 단백질을 코딩한다(예를 들어, MG110-1 이펙터 기반 타입 I-F CAST 시스템의 유전자좌 조직화 도표를 보여주는 도 10A 참조). 타입 I-F 캐스케이드 CAST는 스템-루프 구조의 형성에 관여할 가능성이 있는 보존된 모티프 5'-CTGCCGNTAGGNAGC-3'를 함유하는, crRNA에 의해 코딩된 단일 가이드 RNA를 사용하여 작용할 것으로 예측되었다(예를 들어, MG110-1 및 MG110-2 패밀리 crRNA(서열번호 207 및 208)에서 이 특징의 정렬을 보여주는 도 10B 및 10C 참조). 부분적으로 이 동일한 특징을 가진다는 점을 기반으로, MG110-2 이펙터 함유 패밀리도 타입 I-F CAST 시스템으로서 식별되었다.
실시예 14 - 트랜스포존 말단 예측
이펙터 및 트랜스포존 기구를 플랭킹하는 유전자간 영역으로부터 트랜스포존 말단을 추정하였다. 예를 들어, Cas12k CAST의 경우, TnsB로부터 바로 업스트림에 위치하며 CRISPR 유전자좌로부터 바로 다운스트림에 위치한 유전자간 영역은 Tn7 트랜스포존 좌측 말단 및 우측 말단(LE 및 RE)을 함유하는 것으로서 예측되었다(예를 들어, MG64-3 패밀리 CAST 유전자좌 도표와 관련하여 LE 및 RE 분석을 보여주는 도 11a 참조).
최대 2개의 불일치가 있는 약 12 bp의 직접 반복부 및 역반복부(DR/IR)를 콘티그(contig)에서 예측하였다. 또한, 도트플롯(Dotplot) 알고리즘을 이용하여 CAST 트랜스포존을 플랭킹하는 짧은(약 10 내지 20 bp) DR/IR을 찾았다. CAST 이펙터 및 트랜스포존 유전자를 플랭킹하는 유전자간 영역에 위치한 일치하는 DR/IR은 트랜스포존 결합 부위를 코딩할 것으로 예측되었다. 추정 트랜스포존 결합 부위를 코딩하는, 유전자간 영역으로부터 추출된 LE 및 RE를 정렬하여 트랜스포존 말단 경계를 정의하였다. 추정 트랜스포존 LE 및 RE 말단은 a) 첫 번째로 예측된 트랜스포존 코딩 유전자 및 마지막 예측된 트랜스포존 코딩 유전자로부터 400 bp 업스트림 및 다운스트림 내에 위치하고; b) 다수의 짧은 역반복부를 공유하고; c) 65% 초과의 뉴클레오타이드 동일성을 공유하는 영역으로서 식별된다. 이 과정을 반복하여, MG36-5(서열번호 17 및 18), MG39-1(서열번호 20 및 21), MG64-2(서열번호 125 및 126), MG64-4(서열번호 127 및 128), MG64-6(서열번호 123 및 124), MG64-7(서열번호 129 및 130), MG64-13(서열번호 131 및 132), MG64-54(서열번호 133), MG108-1(서열번호 134 및 135), MG110-1(서열번호 136 및 137) 및 MG110-2(서열번호 138 및 139)에 대한 추정 LE/RE 서열을 식별하였다.
실시예 15 - 클래스 II 타입 V CAST 시스템을 위한 단일 가이드 설계
MG64 서브패밀리에 대한 Cas 이펙터 및 CRISPR 어레이를 둘러싼 유전자간 영역의 분석은 잠재적 항-반복부 서열, 및 tracrRNA의 서열에 상응하는 항-반복부에 인접하는 보존된 "CYCC(N6)GGRG" 스템-루프 구조를 식별하였다(도 11b). sgRNA를 생성하기 위해, 테트라루프 서열인 GAAA를 추가하여 crRNA-tracrRNA 상보적 서열의 스템-루프 영역을 유지하면서, tracrRNA 및 crRNA 반복부를 폴딩하고 트리밍하였다. 이 서열들은 아래 표 1에 요약되어 있다.
Figure pct00001
Figure pct00002
실시예 16 - 표적화된 뉴클레아제를 사용한 시험관내 통합 활성
제자리 발현 및 단백질 서열 분석은 일부 RNA 가이딩 이펙터들이 활성 뉴클레아제임을 시사하였다. 이 이펙터들은 예측된 엔도뉴클레아제 관련 도메인(일치하는 RuvC 및 HNH_엔도뉴클레아제 도메인), 및/또는 예측된 HNH 및 RuvC 촉매 잔기를 함유한다. myTXTL 시스템 및 시험관내 전사된 RNA를 사용하여 조작된 단일 가이드 RNA 서열로 후보 활성을 시험하였다. 활성 단백질은 라이브러리를 성공적으로 절단하여 아가로스 겔 전기영동에서 약 170 bp의 밴드를 생성하는 단백질로서 식별되었다.
실시예 17 - 프로그래밍 가능한 DNA 통합
단일 반응에서 5종의 구성요소들을 조합하여 CAST 활성을 시험하였다: (1) myTXTL 또는 PURExpress에 의해 발현된 Cas 이펙터 단백질; (2) Cas 효소에상응하는 표적 서열 및 PAM을 함유하는 표적 DNA 단편 또는 플라스미드; (3) DNA 단편 또는 플라스미드에서 전위효소 시스템의 예측된 LE 및 RE에 의해 플랭킹된 DNA 마커 또는 단편을 함유하는 기증자 DNA 단편; (4) myTXTL 또는 PURExpress를 사용함으로써 발현된 어레이의 일부인 것으로 예측된 추가 전위효소 단백질의 임의의 조합; 및 (5) 조작된 시험관내 전사된 단일 가이드 RNA 서열. 기증자 단편을 성공적으로 전위시킨 활성 시스템을 기증자-표적 연접부의 PCR 증폭으로 어세이하였다.
도 13은 예측된 LE/RE 기증자 서열(서열번호 123 및 124) 및 인실리코(in silico) 설계된 sgRNA(서열번호 201)를 사용하여 MG64-6 이펙터, TnsB, TnsC 및 TniQ 단백질(서열번호 30 내지 33)을 포함하는 MG64-6 시스템이 활성을 나타냄을 입증하는 예시적인 데이터를 보여준다. 모든 MG64-6 구성요소들을 조합하여 전위 반응을 수행한 후, 연접부의 PCR 증폭은 적절한 기증자-표적 형성이 일어났고 전위 반응이 sg 의존적이었음을 보여주었다(도 13a). (각각 LE/RE가 PAM에 원위로 삽입될 때 LE/RE 연접부에 걸쳐 있는) PCR 반응 #3 및 #4에서 증폭된 밴드의 존재는 표적에 대한 기증자의 두 가지 배향, 즉 LE가 PAM에 더 가까운 배향, 및 RE가 PAM에 더 가까운 배향이 만들어짐을 시사하였다. 두 가지 전위 배향이 만들어졌지만, LE가 PAM에 더 가까운 경우 표적 내로의 기증자 통합에 대한 선호가 있었고, 이는 (각각 PAM에 원위 삽입된 LE 연접부 및 PAM에 근위 삽입된 RE 연접부에 걸쳐 있는) 반응 #4 및 #5의 경우 존재하는 강한 밴드에 의해 표시된다.
바람직한 배향 생성물의 생거 시퀀싱을 수행하였다. LE가 PAM에 더 가까운 경우 일어나는 통합 중에서, 표적/기증자 연접부에 걸쳐 정방향 또는 역방향으로부터 시퀀싱 크로마토그램 신호의 분명한 저하가 있었다(도 13c). 이것은 LE가 PAM에 더 가까운 경우 배향된 생성물의 통합이 다양한 뉴클레오타이드에 걸쳐 일어났고, 이때 LE가 PAM에 더 가까운 경우 생성물들 중 주요 생성물은 PAM으로부터의 61 bp 통합이었다(도 14). 기증자-표적 연접부에 걸쳐 기증자로부터 유래한 시퀀싱은 LE 및 RE 서열의 필수 외부 경계의 조성을 정의하였다. LE 및 RE 도메인의 추가 조사는 LE 및 RE 서열의 내부 한계를 확인함으로써, 전위에 필수적인 최소 LE/RE를 확인할 것이다. LE가 PAM에 더 가까운 경우 생성물에 대한 RE의 시퀀싱은 기증자 RE의 다운스트림에서 3 bp 중복을 보여주었다. 이것은 부분적으로 엇갈린(staggered) 절단 부위에서 기증자 단편을 절단하고 라이게이션하는 Tn7 전위효소 통합 사건에 기인한다. 3 bp 중복은 다른 Tn7 전위효소로부터 예상된 5 bp의 중복보다 더 작다.
표적 플라스미드의 8N 라이브러리에 대한 PCR 증폭 생성물의 생거 시퀀싱은 또한 스페이서의 5' 말단에서 MG64-6 이펙터의 PAM 선호가 nGTn/nGTt임을 밝혔다. PAM 라이브러리 표적의 NGS 분석은 5' 말단에서 nGTn 모티프 선호를 확인시켜주었다(도 13b).
실시예 18 - 통합 윈도우 확인
상기 실시예 17에서 증폭된 PAM의 PCR 연접부를 NGS 라이브러리에 대해 인덱싱하고, V2 300 판독 키트를 사용하여 MiSeq에서 시퀀싱하였다. PAM으로부터 60 bp 통합 거리를 가진 추정 전위 서열의 앰플리콘 서열을 사용하는 CRISPResso를 사용하여 리드를 맵핑하고 정량하였다(guideseq = LE 또는 RE의 20 bp 3' 말단, 윈도우의 중심 = 0, 윈도우 크기 = 20). 삽입결실 히스토그램을 검출된 총 삽입결실 리드로 정규화하였고, 빈도를 60 bp 기준 서열과 비교하여 플롯팅하였다(도 14).
PCR 반응 5(PAM에 인접한 LE, 도 13a) 및 PCR 4(PAM으로부터 먼 RE, 도 13b) 둘 다를 MG64-6에 대한 서열 및 PAM으로부터의 거리에 대해 플롯팅하였다(도 14). 통합 윈도우의 분석은 스페이서 PAM 부위에서 일어난 통합의 95%가 PAM으로부터 58개 내지 68개의 뉴클레오타이드만큼 떨어진 10 bp 윈도우 내에 있음을 표시하였다. 원위 빈도와 근위 빈도 사이의 통합 거리의 차이는 통합 시 전위효소의 엇갈린 뉴클레아제 활성의 결과로서 3개 내지 5개의 염기쌍 중복인 통합 부위 중복을 반영하였다.
실시예 19 - 겔 변위를 통한 트랜스포존 말단 검증
예측된 트랜스포존 말단 서열에 대한 TnsB의 활성을 검증하기 위해, FAM 표지부착된 올리고를 사용하여 MG64-6의 RE를 증폭하였다. 무세포 전사/번역 시스템을 사용하여 MG64-6 TnsB 단백질을 발현시키고 RE FAM 표지부착된 생성물과 함께 인큐베이션하였다. 30분 동안 인큐베이션한 후, 천연 5% TBE 겔에서 결합을 관찰하였다(도 15). 함께 인큐베이션된 레인(도 15, 레인 3) 내의 형광 생성물의 다수의 밴드는 최소 3개의 TnsB 결합 부위를 표시하였다.
실시예 20 - 전위효소 활성의 콜로니 PCR 스크린(예측)
콜로니 PCR 스크린을 통해 전위 활성을 어세이한다. 대장균을 pDonor 플라스미드로 형질전환시킨 후, 암피실린, 클로람페니콜 및 테트라사이클린을 함유하는 LB 한천에 플레이트한다. 선택된 CFU를, PCR 시약 및 삽입 연접부를 플랭킹하는 프라이머를 함유하는 용액에 첨가한다.
실시예 22 - LE-RE 최소화(예측)
표적-전위 연접부의 시퀀싱은 표적 반응 내로 혼입되는 기증자 플라스미드로부터 가장 바깥쪽 서열을 식별함으로써 말단 역반복부를 식별하는 데 도움을 준다. 10%의 가변성으로 14 bp의 반복부 분석을 수행함으로써, 말단 내에 함유된 짧은 반복부를 식별하고; 불필요한 서열을 결실시키면서 반복부를 보존하는 이들의 절두(truncation)에 포함될 최소 서열을 식별한다. 예측 및 클로닝은 다회 반복을 통해 수행되고, 이때 각각의 상호작용을 시험관내 전위로 시험한다. 전위는 96 bp의 RE 영역과 조합된 68 bp의 LE 영역에 이르기까지 활성을 띨 것으로 예측된다.
실시예 23 - 전위의 오버행(overhang) 영향(예측)
TnsB 결합 모티프 외부의 불필요한 서열이 전위에 필요한지를 시험하기 위해, LE 및 RE 둘 다의 TGTACA 또는 TGTCGA 모티프용으로 설계된 올리고를, 0, 1, 2, 3, 5 및 10 bp 추가 염기쌍을 갖도록 설계하고 합성한다. 이 합성된 올리고를 사용하여 오버행을 가진 기증자 PCR 단편을 생성하고, 표적 부위 내로 전위하는 그의 능력에 대해 시험한다.
실시예 24 - CAST NLS 설계(예측)
치료 목적용 진핵생물 게놈 편집은 편집 효소를 핵 내로 가져오는 것에 의존한다. 더 큰 단백질의 작은 폴리펩티드 스트레치는 핵막을 가로질러 단백질을 가져오도록 세포 구성요소에 신호를 보낸다. 이 NLS 태그는 그 자신에 융합된 단백질의 기능도 유지하면서 가져오는 기능을 제공할 필요가 있기 때문에, 이 태그의 배치는 최적화를 요구할 수 있다. CAST 복합체의 각각의 구성요소에 대한 NLS의 기능적 배향을 시험하기 위해, 뉴클레오플라스민(Nucleoplasmin) NLS를 MG CAST의 각각의 구성요소의 N-말단에 융합시키고 SV40 NLS를 MG CAST의 각각의 구성요소의 C-말단에 융합시키는 구축물을 합성한다. 이러한 구축물의 단백질을 무세포 시험관내 전사/번역 반응에서 발현시키고, 태그부착되지 않은 구성요소의 상보적 세트를 사용하여 시험관내 전위 활성에 대해 시험한다. PCR 4(RE 원위 전위 평가) 및 동족 전위 사건인 PCR 5(LE 근위 전위 평가)를 사용하여 기증자-표적 연접부의 PCR을 통해 활성의 유지에 대해 NLS 태그부착된 구축물을 평가한다.
실시예 25 - Cas12k 및 TniQ 단백질 융합 구축물 설계 및 시험(예측)
단백질 구성요소의 발현을 단순화/최소화하고 이 구성요소를 세포 내로 전달하는 것을 용이하게 하기 위해, 다양한 링커, 링커 길이 및 도메인 경계를 사용하여 Cas12k 이펙터와 TniQ 단백질 사이의 융합 구축물을 설계하고 합성하고 시험한다. Cas12k에 융합된 TniQ의 두 가지 배향, 즉 C-말단 융합인 Cas-TniQ, 및 N-말단 융합인 TniQ-Cas를 설계하고 합성한다.
2개의 다른 링커도 사용하여 이펙터와 TniQ 유전자를 융합시킨다. 자가 중단 번역 서열인 P2A는 Cas-NLS-P2A-NLS-TniQ 구축물에서 활성을 띠고, MCV 내부 리보좀 진입 서열(IRES) mRNA 기반 링커는 세포에서 상기 두 구성요소들의 독립적인 번역을 가능하게 한다.
실시예 26 - 시험관내 전위 시험과 커플링된 세포내 발현(예측)
생리학적으로 적절한 환경에서 NLS 구축물의 기능을 시험하기 위해, 렌티바이러스 형질도입을 이용하여 활성 NLS 태그부착된 CAST 구성요소를 가진 클로닝된 구축물을 K562 세포 내로 통합한다. 요약하면, 렌티바이러스 전달 플라스미드 내로 클로닝된 구축물을 외피 및 팩키징 플라스미드와 함께 293T 세포 내로 형질감염시키고 72시간 인큐베이션 후 배지로부터 바이러스 함유 상청액을 수거한다. 그 다음, 바이러스를 함유하는 배지를 8 ㎍/㎖의 폴리브렌과 함께 72시간 동안 K562 세포주와 인큐베이션한 후, 4일 동안 1 ㎍/㎖의 푸로마이신을 사용하여 형질감염된 세포를 대량으로 통합을 위해 선택한다. 선택된 세포주를 4일 기간의 말기에 수거하고 핵 및 세포질 분획을 위해 차등적으로 용해시킨다. 그 다음, 시험관내 발현된 구성요소의 상보적 세트를 사용하여 전위 능력에 대해 후속 분획을 시험한다.
NLS-TnsB 및 TnsB-NLS 둘 다를 세포 분획화 및 시험관내 전위로 시험하고, 세포질 분획 및 핵 분획 둘 다에 대해 전위를 검출한다.
세포 내의 Cas12k 융합체를 유사하게 분획화하고 전위에 대해 시험한다. Cas-NLS Cas-NLS-P2A-NLS-TniQ를 세포 내로 형질도입하고, 분획화하고, 시험관내에서 하위세포 활성에 대해 시험한다. Cas-NLS-P2A-NLS-TniQ는 단일 가이드를 반응물에 첨가하였을 때 세포질에서 전위할 수 있다. 본 발명자들은 홀로(holo) Cas 단백질(+sgRNA) 또는 추가 TniQ를 sgRNA로 보충함으로써, 핵 분획에서 Cas-NLS-P2A-NLS-TniQ 구축물을 보완할 수 있었다.
본 개시내용의 시스템은 다양한 응용분야, 예를 들어, 핵산 편집(예를 들어, 유전자 편집) 또는 핵산 분자와의 결합(예를 들어, 서열 특이적 결합)에 사용될 수 있다. 이러한 시스템은 예를 들어, 대상체에서 질환을 야기할 수 있는 유전적으로 유전된 돌연변이의 교정(예를 들어, 제거 또는 대체)에 사용될 수 있고/있거나; 세포에서 유전자의 기능을 확인하기 위해 그 유전자를 비활성화시키는 데 사용될 수 있고/있거나; (예를 들어, 역전사된 바이러스 RNA 또는 질환 야기 돌연변이를 코딩하는 증폭된 DNA 서열의 절단을 통해) 질환 야기 유전적 요소를 검출하는 진단 수단으로서 사용될 수 있고/있거나; 특정 뉴클레오타이드 서열(예를 들어, 박테리아에 대한 항생제 내성을 코딩하는 서열)을 표적화하고 검출하기 위해 프로브와 함께 비활성화된 효소로서 사용될 수 있고/있거나; 바이러스 게놈을 표적화하여 바이러스를 비활성 상태로 만들거나 숙주 세포를 감염시킬 수 없게 만드는 데 사용될 수 있고/있거나; 유전자를 추가하거나 대사 경로를 수정함으로써, 유기체가 귀중한 소분자, 거대분자 또는 2차 대사산물을 생성하도록 조작하는 데 사용될 수 있고/있거나; 진화적 선택을 위한 유전자 유도 요소를 확립하는 데 사용될 수 있고/있거나; 바이오센서로서 외래 소분자 및 뉴클레오타이드에 의한 세포 교란을 검출하는 데 사용될 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시양태들이 본원에 제시되고 설명되었지만, 이러한 실시양태들이 단지 예시로서만 제공된다는 것은 당분야에서 숙련된 자에게 자명할 것이다. 본 발명은 본 명세서에서 제공된 특정 실시예에 의해 제한되지 않는다. 본 발명이 상기 언급된 본 명세서를 참조함으로써 설명되었지만, 본원에서 실시양태의 설명 및 예시는 제한적인 의미로 해석되어서는 안 된다. 본 발명을 벗어나지 않으면서 수많은 변경, 변화 및 치환이 당분야에서 숙련된 자에게 인식될 것이다. 나아가, 본 발명의 모든 측면은 다양한 조건 및 변수에 의해 좌우되는, 본원에 기재된 특정 묘사, 구성 또는 상대적 비율로 제한되지 않음을 이해해야 한다. 본원에 기재된 본 발명의 실시양태에 대한 다양한 대안이 본 발명의 실시에 사용될 수 있음을 이해해야 한다. 따라서, 본 발명은 임의의 이러한 대안, 변형, 변경 또는 등가물도 커버하는 것으로 생각된다. 하기 청구범위는 본 발명의 범위를 정의하고, 이 청구범위 내의 방법과 구조 및 이들의 등가물도 이에 의해 커버된다.
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protein sequence <220> <223> MG39-1-B transposition protein <400> 8 Met Thr Ile Leu Ile Glu Tyr Gly Val Asn Thr Glu Met Asn Asp Tyr 1 5 10 15 Val Leu Ala Ile Gly Asp Ile Leu Tyr Asp Lys Asp Asn Gln Asn Ser 20 25 30 Tyr Arg Ile Ile Ser Leu Ile Asp Asp His Leu Ile Leu Cys Glu Met 35 40 45 Glu Thr Thr Lys Leu Glu Leu Gln Gln Ile Lys Tyr Thr Ile Ile Ala 50 55 60 Asp Leu Val Leu Ser Asn Lys Ile Glu Ile Lys Lys Asp Gln Ala Leu 65 70 75 80 Val Tyr Asp Ile Asp Gln Leu Ser Glu Ser Val Arg Asn Arg Tyr Ile 85 90 95 Leu Lys Val His Ile Met Asn Asp Val Lys Ile Ala Tyr Gly Pro Ser 100 105 110 Tyr Leu Gly Leu Met Gly Lys Ser Ser Lys Ile Glu Leu Gln Lys Ile 115 120 125 Leu Ala Lys Tyr Asn Tyr Pro Ile Ser Ser Phe Trp Arg Met Cys Thr 130 135 140 Thr Tyr Phe Gln Ser Gly Met Lys Asn Tyr Ser Leu Ile Asn Ala Lys 145 150 155 160 Ser Phe Lys Ser Asn Glu Val Lys Thr Tyr Thr Tyr Lys Ala Arg Pro 165 170 175 Gly Ala Lys Ser Thr Tyr Asn Leu Asp Asn Val Val Lys Pro Asn Glu 180 185 190 Tyr Val Ile Tyr Phe Glu Glu 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12 uacuaaaaug aagcaaauca caauaaggau uauuccguug ugaaaacauu agguucccuc 60 gcccuucugc gggggauuuu 80 <210> 13 <211> 46 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> MG39-1 effector tracrRNA sequence 1 <400> 13 uuuuuguaaa aucauuuugu aaaauuacaa uucauaauga gauaug 46 <210> 14 <211> 66 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> MG39-1 effector tracrRNA sequence 2 <400> 14 uuuuuguaaa aucauuuugu aaaauuacaa uucauaauga gauaugacaa uucauaauga 60 gauauu 66 <210> 15 <211> 109 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> MG39-1 effector tracrRNA sequence 3 <400> 15 aaaauauagg auauuaaugu cagagauauc ucauuauaau uguaauuuug uuuuguguac 60 aagcuguuaa uaucucauua ugaauuguca uaucucauua ugaauugua 109 <210> 16 <211> 88 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> MG39-1 effector tracrRNA sequence 4 <400> 16 aaaauauagg auauuaaugu cagagauauc ucauuauaau uguaauuuug uuuuguguac 60 aagcuguuaa uaucucauua ugaauugu 88 <210> 17 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> putative MG36-5 transposon end LE1 <400> 17 ttaattgaaa attgaaaatt gagaattgaa aattaa 36 <210> 18 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> putative MG36-5 transposon end LE2 <400> 18 tgagaattga aaattgagaa ttgggaattg agaatt 36 <210> 19 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> putative MG36-5 transposon end RE1 <400> 19 ttaattttca attctcaatt ttcaatta 28 <210> 20 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> putative MG39-1 transposon end LE1 <400> 20 aaaagtattg acaaattgac aaaatggtgg tataat 36 <210> 21 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> putative MG39-1 transposon end RE1 <400> 21 attataacct atatttttga ttttgtcaat agtttt 36 <210> 22 <211> 637 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: MG64 effector sequence <220> <223> MG64-2 effector <400> 22 Met Ser Gln Ile Thr Ile Gln Cys Gln Leu Val Ala Ser Ala Ser Thr 1 5 10 15 Arg Gln Gln Leu Trp Leu Leu Met Thr Gln Lys Asn Thr Pro Leu Ile 20 25 30 Asn Glu Leu Leu Gln Gln Val Gly Gln His Pro Glu Phe Glu Thr Trp 35 40 45 Arg Gln Lys Gly Lys Leu Gln Ala Gly Ile Val Lys Ala Leu Cys Gln 50 55 60 Pro Leu Lys Ala Asp Pro Arg Phe Met Gly Gln Pro Ala Arg Phe Tyr 65 70 75 80 Ala Ser Ala Ile Ala Val Val Asp Tyr Ile Tyr Arg Ser Trp Leu Ala 85 90 95 Leu Gln Lys Arg Leu Gln Tyr Gln Leu Glu Gly Gln Thr Arg Trp Tyr 100 105 110 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cacagtggtg gctactgaat cacctccgag 240 caaggaggaa cccactttaa ttttttttcg taaagccaag cgggagccaa aaccctaggg 300 ggtttacgaa agtctcacga ttcttacatt gagtaagttt cagtgttttt gggatggtta 360 accctttatt tacaag 376 <210> 91 <211> 390 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> MG64-4 effector intergenic region encoding tracrRNA <400> 91 tatacaaacg tttgaacctg gaaaatagaa taatgagaaa tagcgccgct tgttcatgcg 60 cgaaagcgtc tctgaacagt gtaaatgtgg gttagtttga ctgtcgtgaa gacggtcttg 120 ctttctgacc ctggtagctg cccaccttga agctgctgtc tcttgtagac aggaatcagg 180 tgcgccccca gtaatatagg tgcgggttta ccgcagtggt ggctacccaa tcacctccga 240 gcaaggagga acccacctta attatttttt ggcaaaccaa agtgggagca atttcactgg 300 gaggttcgcc aagttttcaa acaacttatt ttgtagaggt tttgccgttt tctgctaaga 360 aaagattttc ttgtccagat gcagtgataa 390 <210> 92 <211> 462 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> MG64-6 effector intergenic region encoding tracrRNA <400> 92 gatttatcag taccgtacct ggaaaattga atataattga taacagcgcc gcaggtcatg 60 ccgtcaaaag cctctgaact gtgttaaatg ggggttagtt tgactgttga aagacagttg 120 tgctttctga ccctggtagc tgcccaccct gatgctgcta tctttcggga taggaataag 180 gtgcgctccc agtaataggg gtgtagatgt actacagtgg tggctactaa atcacctccg 240 accaaggagg aatccatcct taatttttta ttttttcgtg aacctaagcg agagcaaaat 300 ctctaggagg ttcacgaaaa agctgaatcc ttcatggaat atgagtttca gtttgttagt 360 gggatgatgg cttctcctga aaaggagaaa tggagtaaga attttagagg tttacgaaaa 420 tgacctttaa aagctacttc aggcaagtgt tacagcgctc gc 462 <210> 93 <211> 456 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> MG64-7 effector intergenic region encoding tracrRNA <400> 93 tcaaaaagac cgtaccttga aaatataatg gtaacaaaca gcgccgcagt tcatgcgtct 60 tatggcgcct ctgtgctgtg caaaatgtgg gttagtttga ctgttggaag acagtcttgc 120 tttctgaccc tggtagctgc ccaccttgaa gctgctatcc cttgtggata ggaatcaggt 180 gcgcccccag taatagaggt gcgggtttac cgcagtggtg gctaccgaat cacctccgag 240 caaggaggaa cccaccttaa ttattttttt ggcatggcaa agcgggagcg attttaccgg 300 gactgatgcc aaagcttcaa atctttttat tgacaaggtt tctagacttt tgtttgtcac 360 ttgatttatt tttttaattg tcaactagca agtgattttg gtagttttgc caaaagtgtc 420 tctaggaatc ttgataaata aagggtttta ggcgcg 456 <210> 94 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> MG64-2 effector target CRISPR repeat <400> 94 gtttcaacga ccatcccaac taggggtggg ttgaaag 37 <210> 95 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> MG64-4 effector target CRISPR repeat <400> 95 gtttcaactt tccttccagc tagaggcggg ttgaaag 37 <210> 96 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> MG64-6 effector target CRISPR repeat <400> 96 gtttcaacca ccatctcaac tagggatggg ttgaaag 37 <210> 97 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> MG64-7 effector target CRISPR repeat <400> 97 gtttcaacgc cccttcaagc tttgggcggg ttgaaagc 38 <210> 98 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> MG108-1 effector target CRISPR repeat <400> 98 gttgcgatcg ccgctccggt ggcgatgggg ttgaaag 37 <210> 99 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> MG110-1-6 effector target CRISPR repeat <400> 99 gtgacctgcc gcataggcag ctggtaaa 28 <210> 100 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> MG110-2-6 effector target CRISPR repeat <400> 100 tatgaactgc cgcataggca gccaaga 27 <210> 101 <211> 922 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: MG64 transposition protein sequence <220> <223> MG64-13-B transposition protein <400> 101 Met Leu Ser Ser Gln Ala Phe Asn Asp Trp Cys Gln Arg Leu Gln Ile 1 5 10 15 Asn Ser Val Ala Arg Ala Val Ile Glu Gln Val Arg Asn Ala Ala Pro 20 25 30 Ser Arg Gln Val Gln Gly Arg Arg Lys Asn Val Cys Gly Ser Tyr Pro 35 40 45 Ser Arg Lys Met Gly Val Thr Ile Gln Phe Glu Ser His Arg Asn Glu 50 55 60 Leu Ala Arg Ile His Glu Leu Glu His Asp Gln Thr Val Leu Glu Tyr 65 70 75 80 Tyr Asp Gln Pro Pro Pro Ile Glu Leu Val Tyr Ser Ser Lys Thr Gly 85 90 95 Arg Arg Thr Arg His Gln Tyr Thr Pro Asp Phe Phe Val Leu Arg Thr 100 105 110 Asp Gly Val Glu Trp Glu Glu Cys Lys Thr Glu Thr Glu Leu Ile Lys 115 120 125 Leu Ala Gln Glu Asn Ser Asn Arg Tyr Cys Gln Asp Val Glu Gly Lys 130 135 140 Trp His Cys Pro Pro Gly Glu Ala Tyr Ala Gln Val Phe Gly Phe Gln 145 150 155 160 Phe Arg Val Trp Cys Asn Ser Glu Ile Asn Trp Val Leu Gln Asp Asn 165 170 175 Trp Val Trp Leu Glu Asp Tyr Leu Gly Val Glu Val Pro Ser Val 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aucuuucggg auaggaauaa ggugcgcucc caguaauagg gguguagaug uacuacagug 180 guggcuacua aaucaccucc gaccaaggag gaauccaucc gaaaggaugg guugaaagnn 240 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn n 261 <210> 112 <211> 263 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> MG64-2 effector sgRNA <220> <221> modified_base <222> (241)..(263) <223> a, c, u, g, unknown or other <400> 112 gaauuaauag cgccgccguu caugcuucua ggagccucug aaaggugaca aaugcggguu 60 aguuuggcug uugucagaca gucuugcuuu cugacccugg uagcugccca ccccgaagcu 120 gcuguuccuu gugaacagga auuaggugcg cccccaguaa uaaggguaug gguuuaccac 180 agugguggcu acugaaucac cuccgagcaa ggaggaaccc acugaaaggu ggguugaaag 240 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnn 263 <210> 113 <211> 265 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> MG64-4 effector sgRNA <220> <221> modified_base <222> (243)..(265) <223> a, c, u, g, unknown or other <400> 113 gaaauagcgc cgcuuguuca ugcgcgaaag cgucucugaa caguguaaau guggguuagu 60 uugacugucg ugaagacggu cuugcuuucu gacccuggua gcugcccacc uugaagcugc 120 ugucucuugu agacaggaau caggugcgcc cccaguaaua uaggugcggg uuuaccgcag 180 ugguggcuac ccaaucaccu ccgagcaagg aggaacccac cuugaaagag gcggguugaa 240 agnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnn 265 <210> 114 <211> 276 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> MG64-7 effector sgRNA <220> <221> modified_base <222> (254)..(276) <223> a, c, u, g, unknown or other <400> 114 guaacaaaca gcgccgcagu ucaugcgucu uauggcgccu cugugcugug caaaaugugg 60 guuaguuuga cuguuggaag acagucuugc uuucugaccc ugguagcugc ccaccuugaa 120 gcugcuaucc cuuguggaua ggaaucaggu gcgcccccag uaauagaggu gcggguuuac 180 cgcaguggug gcuaccgaau caccuccgag caaggaggaa cccaccuuga aaaagcuuug 240 ggcggguuga aagnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnn 276 <210> 115 <211> 246 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> MG108-1 effector sgRNA 1 <220> <221> modified_base <222> (224)..(246) <223> a, c, u, g, unknown or other <400> 115 gaugcuaagu cgcgccuagc aucaaggagc uaugucuuga uugucuuggg uguccgcccu 60 ggaugaguug agguguagau gcuucuauca uggcagcuac uaaacgcccc aagcaagggg 120 aacccaucuu uaauuuuggc aaaccgaagc gggggcaaaa ucuccaggag guucgccaaa 180 accuuugaaa cuccuuagcu ggaaauggcg augggguuga aagnnnnnnn nnnnnnnnnn 240 nnnnnn 246 <210> 116 <211> 274 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> MG108-1 effector sgRNA 2 <220> <221> modified_base <222> (252)..(274) <223> a, c, u, g, unknown or other <400> 116 cuuguucgag uucguuugaa cugaacaagg guaaguaugg gccaguuuaa uugcuuuccg 60 ucccaggaua gcugccagcu ucuaccguag guucguccug caagugaugc uaagucgcgc 120 cuagcaucaa ggagcuaugu cuugauuguc uugggugucc gcccuggaug aguugaggug 180 uagaugcuuc uaucauggca gcuacuaaac gccccaagca aggggaaccc aucgaaagau 240 gggguugaaa gnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnn 274 <210> 117 <211> 550 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> MG64-13 effector intergenic region encoding tracrRNA <400> 117 gttgaggtgg atttgtgtac tgggtcaaaa gatttcgcta ggtttgcctt ttcgcgcgct 60 gctgaagcag tgaaaagttc cgacagttta aaagttctaa cacttttact gctttccgtc 120 gggagtagtt gtccgcttct gcgttgttga gaccgaagtt tgtccaggtg ataggcagaa 180 cgttgatgca acaggtagat agtcgcgctc tatcaggaag ctgttctagt tattagtgtt 240 cgtgcactaa taaagaggat acagggatac atgtggttgt gtccagcaat ggcacaacag 300 ggccactact cgaagccccg agcaagggtt gagcctaccc aaattttgta ctaaaaattt 360 ggcaaaccga agcgaggtca gtttgaccca gcaccttgtc aatcagtcga aatcttgcac 420 cagtctgcgt tttgagttgg caacagcctc acgctgaacc acttcaagca gaaagttatg 480 gcaatgtgat gacctttgcc aaaataggtg tgcaaagccg actgtagcaa gaatttgagc 540 actaggagtt 550 <210> 118 <211> 457 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> MG108-2 effector intergenic region encoding tracrRNA <400> 118 tactagaaaa atttgcacct tgataataga ataatagtca caatagcgcc gtagttcatg 60 cttgctaaag cctctgaatt gcgaaaagtc cgggttagtg ctgtcggcag acagcgttgc 120 tttctgaccc tggtagctgc ccaccccgat gctgctgtcc cttgcagaca ggaaccaggt 180 gcgcccccag taataagggt gtgggtttac cacagtggtg gctactgaat cacctccgag 240 caaggaggaa tccaccttaa ctattttttc gtgaatccaa gcgggagcaa aattcccaag 300 ggatagacga atttggtgaa ataaatagcc agacttaagt ttgagctttt tctgggatgg 360 tcaaccctcc tgttacgaca gtttccaaag taaaattttc gagttttacg agttttgttt 420 ctggaagcta gtacacaaaa gggttgaagc gtttaaa 457 <210> 119 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> MG64-13 effector target CRISPR repeat <400> 119 tggcaattgc ccttccagtg ttgggtgggt tgaaag 36 <210> 120 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> MG108-2 effector target CRISPR repeat <400> 120 gtttcaacga ccatcccgac aaggggtggg ttgaaag 37 <210> 121 <211> 60 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> MG110-1-6 effector crRNA <220> <221> modified_base <222> (9)..(40) <223> a, c, u, g, unknown or other <400> 121 cugguaaann nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn gugaccugcc gcauaggcag 60 <210> 122 <211> 59 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> MG110-2-6 effector crRNA <220> <221> modified_base <222> (7)..(38) <223> a, c, u, g, unknown or other <400> 122 ccaagannnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnua ugaacugccg cauaggcag 59 <210> 123 <211> 385 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> MG64-6 active transposon end LE <400> 123 gggaggaaag gttaattggg gggttgattt attttggttg gttgtgttat atttgttatt 60 cgcgggcgat tagcacagtg gtagcgcact tccttcacac ggaaggggtc acaggttcaa 120 atcctgtatc gcccatttgt gtacagtgac acattaattg tcatcaatga cagattgctg 180 tcgtggagcc aaattatgtg tcgctgagac aaattaatgt cgtttaacta tcagtgacaa 240 atttttgtcg cttttcacaa caatagtgtg aaggaagtgc gcctttcaat ccatcctaga 300 aattataatt ccaatcccta cttacctaga atggtggttg aaactgtaag attcgcgccg 360 ctaataaaac tttcagcgat ttgga 385 <210> 124 <211> 313 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> MG64-6 active transposon end RE <400> 124 aacacataat gctatcctag cttacaaaaa agaaagcgac aatcaatctg tcactcctca 60 aattctcttc tttgagaacg acgacagcta aattgtcact gattgggagg acgacactta 120 atttgtcact aacggctagc gatctttaat caaggaaaac agctagaata tagagaaatc 180 aatagttttc atcagcgaca acaatttggc atcacgtcaa ataattagtc actgtacagg 240 ttttattttt aatgtacagt agccctcttg caaaagtcca agaattagga atgttagagg 300 aggtttgata act 313 <210> 125 <211> 300 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> MG64-2 putative transposon end LE <400> 125 ttgtaaaacc tcagatgagc aaggtattga tgaataatat tttccgccaa aatttacctc 60 tgtttgggca ataattgtat gatagaattt atatattagt tgcttcaata gcaaaatgcg 120 ggtgtagttc agtggtagaa cgtcaccttc ccaaggtgaa tgtcgtgggt tcgagtccca 180 tctcccgctt gtgttgttgt tgtacagtgt tgtcgattgc caaattattt gtccgcgttg 240 acaaattgat gtccgtttgc caaattattt gtcatttaca aaactcgaac ccacgacatt 300 <210> 126 <211> 400 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> MG64-2 putative transposon end RE <400> 126 atctacaaaa ttgttttata caactatgtt tgtattttag ttctcaggac aaagattgtg 60 tcaattcttc acaaaagttg taattctcgc ctttttcaaa aaaggacaaa gaatttgtca 120 actttcctaa accggacaac taatttgtca aaaagctttt tcaatatata aagggggtat 180 aatagctgta acccttgcgt agagtaggtt agtgagctac taggtttggc ggtcaataat 240 ttggcaagtg gtcaaataat ttggcaatcg acaattattt atcgttgggg acgaatcagt 300 gtcacggagt caaattatgt gtcgttgtga cagattgatg tcgtctaagc accagtgaca 360 aattgatgtt gctttaataa tttaaaatcg tcacgaaata 400 <210> 127 <211> 489 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> MG64-4 putative transposon end LE <400> 127 tttcgggttc tccagttgtg ctcacaaggc tgcccgtttg gcttcatccc gttggcaata 60 cccatacgtt tttttttacg gctgtgtcca atcttccgta gtgccctcga aatcgtgcgc 120 tgactaatct ccccctccca tagctgtgcc atctcgcttt gggttttatc cccatgctct 180 ttgacgaaag cccgaaaatt ctcccaatcg ctgattttgc ctgtctgttg gcatgcttgc 240 cttggctttg gcttgacatc gcccgtttcg gcttggcgct caaaccataa gttaatcgta 300 ttgcgactga tattgaacag ttgactcgcc tcacttttct tcagaccgtc caactcaatc 360 gcttgcatta ctttttgccg gaagtcatca ctgtaaggtt tagccattga aatgaggtag 420 acgcaatggg tattcttcta gcttacgtcc taacctgcat ggctatagct atactatcca 480 cgacttgga 489 <210> 128 <211> 602 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> MG64-4 putative transposon end RE <400> 128 aagtgttcaa tcaaaacaca tatgtattat aaagttaaaa ggacatttat tttgtcaatg 60 acagtaaaaa gtcacaaaaa tattgatttc agaaaaaaga catatatttt gtcgaattta 120 caatatagga cggctaattc gtcaataact tcgtgctagg aattagcgat agaaaaacaa 180 taaaaccctt gcatagcaaa ggctttagag taaataataa gttgtcaatt aatttggcaa 240 acggtcagat aatgtgacac tcgacagaaa tcctttctag ggaaaggttt tgttgtttat 300 atatctaact ttgttcgagc gctcattctc aataagcagc ctagaaatgg gtacagatcg 360 agatatctag agccggaatt gagataggat tgagataatt taatcagggc cattaagcat 420 atggcaaggg tttcggacgc tacgaagaaa ccacatgaga taaacccaag ctctcaatct 480 ttatagctcg taagctcaac aatttcttaa gtcacattga aagcactggt tctaacgatt 540 tcaatctcta taggcagtca gaaaagaatc caagtgaaga taaacctttg tttgtgctag 600 tg 602 <210> 129 <211> 681 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> MG64-7 putative transposon end LE <400> 129 agttaggagt ttgaagttag gagtttgaag ttaccactca gcactcaata ctcagcactt 60 tctactcatt tccctttctt tgtggtacac tgcaatatag gctagtcaaa ctatgccggg 120 atgtagcgca gcttggtagc gcacttcgtt cgggacgaag gggtcgctgg ttcgaatcca 180 gtcatcccga taattattta gttatttata cgacatatta cacgtaatga aagctgtaca 240 ttaactaatt atttgtcact gttaacagat tgatgtcaaa tttcacaaat tgatgtcact 300 attaacagat tagtgtgctt gagctagccg ttaagactca gcttttgatt gtagctgaaa 360 tttatttgtt tgctatgtta caggctcacc cttgaaatta attataactg gacatgactt 420 tacttgttca aatacgaact gttctggtat ataatgattt ttgtttgggg tcatacttca 480 aactgttagg attattttgc aatatacatt tcggcagttt ttgacccttc ctaaaatctt 540 gtgagaaatc cgggacaact ggattcgctt tcaacccacc actaataatt ttaaattatt 600 ctttccactg ttgattaatc catttaattt cagctaaggc ttaaaacatc aaaatattca 660 aagtatctca ctgccaacag a 681 <210> 130 <211> 415 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> MG64-7 putative transposon end RE <400> 130 atttgtgttt tataaaaaca tagttgtatt atactgacac ctggacaaag aatttgttaa 60 attttgcaaa atcattggtt tgtttgtttt ttggaaaatg acaattaatg tgttatattt 120 ctgagattgg acagttaata tgttaattaa ggtttgaaag gctttaaatc tgaaaataat 180 aaaagcccca tcagaaacct ttctatgaca gggctttcaa tatttgatag agttgtgaca 240 ataatttgtt aagttgacaa ataattagtt aatgtacaaa atatttaatg tatagttaaa 300 atattgtaat agtaacggtt ttgtctatga attatagcaa aggacgggca aggatgcccg 360 ttccacaaga ttttgatttg tagtttactt tggaattttt ctttttatta tttaa 415 <210> 131 <211> 260 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> MG64-13 putative transposon end LE <400> 131 tgtcactgta tccataaggt gagccattgt gaaagcataa gttgagccaa aaatgcttga 60 aatgctgatt tttgcgttgc ttgatttagt ttaatccaaa cggtttgaaa gcataacgtg 120 agccaaagtt ttattttgaa agcataagct gagcaaacat ttgcggcaac ggcttgaaca 180 gcctcaaaat tgtgattagc tgaaatcaga agcgatgagt tccggtttca cggttgtaac 240 tcttcaggag gctgcgaaga 260 <210> 132 <211> 1979 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> MG64-13 putative transposon end RE <400> 132 agagcctcac tttatcgcat tgccacacaa gagcgcacac ataaaacatt aggggtaggt 60 tgaaagaggc aggggtctgc aaattaaata ccaagcttga cctgaagcag cattagcttt 120 aggaactgcg atcgccatca tgcgaactgc tttattaatg cagtgagcag aaattcaagt 180 ttcgacgagt aattgtcgat tattagaagg agttacaaag tatggagcca gaagatacgg 240 aattgagagt gagcaaacca atccaagtgg gagcaagaaa tcaattctgg caaatagatt 300 gcactgtttt tgatgtcagt ctggtcgaga aaactactcc agattattgg caaatggatt 360 ttactgctct tgatgtaaat ctggtcgggg aaactacttc agatgaccct ctttaaccct 420 agctactgtg cgcgacacac aatcgcaaac tatgttggga taccaactta catctgaaga 480 ggtacatggg agtgcgatcg caacactact tcatgctgcc gctcgaaaaa ctatctatca 540 caatatgaat tatttaatct gcgttttcat ggaggcatga tggaagaaca taaatttgga 600 atcactaatg cagttatcct taattcaata tcagggtacg tcaaactcac aagaagaaga 660 cccagcaccc tcaaggatat tgaagagatg gtgaatcgat attttcagca aagctcaggt 720 gactagaaac aatattcatc cacgaatgct tgataagtat agcttgattc tcgtctgagc 780 gagaatcaag ctggcatata tcgttagaac ttcgtggaca acagcacaaa aaacaagaga 840 caaactgctc gttaataaac tcaagtttcg cattaaagct atttagaaat gggtgaagac 900 cgttttatct tcatctattt ttagtctagc tcataaacct tttggaacag tacgttacaa 960 attaattaca ttagcagccg gggacttagc gctacagata aacgtgaatc tgggataagc 1020 tgaaacgcat ttaacccgag ataaagttag ctcatctagg tatagacaca ctagtccaat 1080 taatttggag gctttcttat tcaggttata catactgaaa ctcttttcct ctctatctgc 1140 caagcaccgc aactaatttg atagaaggca accaggaaat ttattggata aattggcgcg 1200 gtaatttgac gatgtgttag ggcagtgatg cactgcttct tgtgaagaag cgtttaaaga 1260 gtaatttgtc tctcatattt cttgctcaac gcagcaaatg tgatgctagt gcaaaatagc 1320 gtgacgggtg acacttacta aattgagtca gccgagcatc ggatggtgat atggagcgac 1380 agcaaaccag agcatcggtt gccaatccag caatctagct gactaagcag tgcaagtaat 1440 ttgacagcag agcaaaacag cgtgactgtt gacaaggaga aatttcattt ctagatcgtg 1500 ccattaattt gcgaatttag gtgaattttg tgctatcaat ttgcgaacct agaatttgtg 1560 ccattgattt aagaacaaag gatcgtgcag tagaccgcca gatcggttgc aatgcactag 1620 gttcgattcc ttcaatgtgc tttcagatga acaagcaagt atctgtgcca ctgatttgcg 1680 aatcggtcga agatttgtgc cacagattta caaatgacta ttcgacccta acaagccgat 1740 tgtgccagca atttgcgaat cgtgccatat tttttgatta ttcacacgtg cgactttccc 1800 aaaagtcagc caaaaatcgc tcaaaacgac attagcgtgc gacaagcgac atttatcgtg 1860 cgaccgtaca tttgctttta caaaggcggc acccagattc gaactggggg tggaggtttt 1920 gcagacctct gccttaccac ttggcgatgc cgccgaattg catcatggac attgtatca 1979 <210> 133 <211> 1444 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> MG64-54 putative transposon end LE <400> 133 ccgccggagg gtcgagcgac aaactgagca aaagtagtga taaattttgt ctaaaatcaa 60 gcgacctcat tctctgtaca gtgccagatt aaatgacgtg atgccaaatt agtgtcgtcg 120 gttgataccc ttgctacatc aacactctac agcctcataa ccattcttag acctatcact 180 ttagtgccaa attgtgagtc gtttaatcaa ataatgacag attaatcgtc tttaaagaat 240 taatctcagt gacgaattaa ctgtcattat ccgacgatag ccccaagata atatcatgtt 300 gcctctaaca tgaatatgta atggggagaa tatcctaaac cattagtatc ctttcctaaa 360 taaacacttt cattcgcgcg aagagttata gcgccgttat tgccgataaa ctcaagcgcc 420 gttattgccg ataaactcaa tggtgttatt ctacaacggc ggtcaattaa tatttatagt 480 gaaactcctc catttttagt aaaaaatagc aacgtaacaa catagggcta tcgtttatta 540 taaatacgta attcccgaaa attagtggga aggtcacacc ttccatccgt tccatatatc 600 tgagagctga attgatttga attcatcaaa ctccaagtcg catacattct agtagtacag 660 ccatttcttc tatcctgacg tgtataagtt acagaggctt gattataact cttatggcgg 720 cctttaattt gatgatcgaa atctcctgaa tatagttcag cattaatatt aactccatca 780 tcactagaat taataactac tgcgtcctgt tctgaagctt gccacatacc attaaatgct 840 ccaggtgctc tattttgagc aaaagcagaa gacaatccag aaatagctat tacgcaaata 900 gaagaagcaa gtacaagtac gagtttttta ggtctcatgg tttttaattc taaaagctag 960 tcaatttgtg agattgaagg gtgttaaact aaagcagagg tagctacaaa taatgtagaa 1020 gctacgaaat tacgtatgaa acttttttca aatccagcgt ggtcattatg gatagtgatt 1080 tttacgccta tagcttctta ttctaaagga atttcctatt aacgatcgcc gctattgtag 1140 cagtggcata attgtcacac taaggattga ctcccaaccg tataattaaa cactatttga 1200 aaggtagggg cagattttga tgtttgctac tccacggtat aagttttctt cggggagagc 1260 taaaacgtcc tttattcgcc gatgcaggcg aaaccataga gttttgaatt acagggtgga 1320 agacccaaac aaaacgtgcc gctcatgttc tgttgtctcc gccagtgcta aatgccaaac 1380 taattgtcgc attatcttag tatgttgcta ggataacaat atgttttatt aaaattttta 1440 ttta 1444 <210> 134 <211> 307 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> MG108-1 putative transposon end LE <400> 134 tgtccattaa agaattattt gtcgccttta aagaattaat gtccaatttc aggaattttg 60 gatgtttcag gctttggcaa gaaatctctt gctcaaaatt ttggtttaaa gaattaatgt 120 ccaaaatttc gacatacttg cgttgaaata catcactcat cgttagagtg cgatcgcagc 180 gctcctttca acccatctac attcacacaa aagcactctt accaaagact cttactcttt 240 cagtgcaatc aaccttggaa gggcgattac aaagcagtct tccaaattca gcgtagtatt 300 gacattc 307 <210> 135 <211> 619 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> 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tttaaacaac aataaataga 60 taccatcaaa atacaatttg tacagtgata aaatcgaaaa aatagataac aatttgttat 120 atgcagcgcg aaaactggaa tagagaactg agcggcgtgg tttaatatat gagcggcaat 180 agtggaagtt taagggggaa tgtatcgctg acgggtatag cttgttgatt gaagcataaa 240 ttgacaaatt cacaaacgaa aaatcaatga gttacgcttc tctttgaacc ataagatggc 300 aaaaaattaa accataagct gacaaatttc ttagtgaacg tgttacacca cccaaaacgt 360 ggtaagccac tgttgtaaaa ttacaagata tctcatgtac ttcatagtta cgaagtcggt 420 ttagctaagg gcgagtcact cacgaccagt tcaacagtgt tacgggcact gtttaccagc 480 gacctatgac gaagaccttc gatactttca ataatactac tgtagagcat ttcaaaggcc 540 atcgaaatat agaggtgtag ttatatttta agcgtctcag agcaaaaaag ccctctccat 600 agcgctttca cattttcatc cattctcgat ctcgacaatg aaacttaact cccaaatcaa 660 cgagccagcg gagaggagca atttagctag ctccgcgtgc attggcttg 709 <210> 137 <211> 479 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> MG110-1-6 putative transposon end RE <400> 137 aaccgagacc tgtaagttgt aagtaaataa caacttaaat ataggttatg ccagctatta 60 ctgcaaattt gacaacttat ggttcaaatt tgtcacttta tgcttcaatt tacatagctt 120 taagttggtg gcatctctgc cagcctcacc ccggcacccg agtctaccgc tgtggctgct 180 tccttccgga cctgaccaga ttcacggttt atcgttgcgg ggggaccagc agagacacca 240 tagaggaggt ctcgttgacc ttggtggggc attatacgca ctctgtttcg atgtgcaacc 300 tacgctatgg ggtttattat cttttttcta ttagtgagaa tactttaacg aaattcgctg 360 gttcgccgct cccgttgctg aagcttttag cgctctcggc tatacttgac taactttatc 420 ggtttttgcc gctgtctctg tatcacagag ccggcgatgt attttatggg agcgcgcag 479 <210> 138 <211> 474 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> MG110-2-6 putative transposon end LE <400> 138 tgaggttgcc tccagtacgt ccacaccacg tggatgacca gacaggcttt gaggttaact 60 aattgatgtt gttacaacca taagttgaca taacggccat aataaaatca acaggttaca 120 aaacgatttt tacccataag ttgacataaa aatgaagcat aagctgacat agagtgacaa 180 gaccacacat ggacacaaaa tcggcgttgt aagtttacaa gatcgacttg tagcatccac 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<212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: MG64 transposition protein sequence <220> <223> MG64-56-Q transposition protein <400> 150 Met Glu Ile Pro Ala Glu Gln Pro Arg Phe Phe Gln Val Glu Pro Leu 1 5 10 15 Glu Gly Glu Ser Leu Ser His Phe Leu Gly Arg Phe Arg Arg Glu Asn 20 25 30 Tyr Leu Thr Ala Thr Gln Leu Gly Lys Leu Thr Gly Ile Gly Ala Val 35 40 45 Ile Ser Arg Trp Glu Lys Phe Tyr Leu Asn Pro Phe Pro Thr Pro Gln 50 55 60 Glu Leu Glu Ala Leu Ala Ala Val Val Glu Val Lys Val Asp Arg Leu 65 70 75 80 Ile Glu Met Leu Pro Pro Arg Gly Val Thr Met Lys Pro Arg Pro Ile 85 90 95 Arg Leu Cys Ser Ala Cys Tyr Gln Glu Ser Pro Cys His Arg Val Glu 100 105 110 Trp Gln Phe Lys Asp Val Met Val Cys Asp Cys Leu Arg His Cys Pro 115 120 125 Leu Asn Asn Arg His Gln Leu Ala Leu Leu Thr Lys Cys Thr Asn Cys 130 135 140 Glu Thr Pro Phe Pro Ile Pro Ala Asp Trp Val Gln Gly Glu Cys Pro 145 150 155 160 His Cys Phe Leu Pro Phe Thr Lys Met Ala Arg Arg Gln Lys Arg Tyr 165 170 175 <210> 151 <211> 485 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> MG64-56 effector intergenic region encoding tracrRNA <400> 151 caaaataccg aaccttgaaa acttaatatg aaagtaacag cgccgcagtt catgctcttc 60 tgagtctctg tactgtgata aatctgggtt agtttaacgg ttgaaagacc gttttgcttt 120 ctgaccctgg tagctgctcg ctcttgatgc tgctgtcttt tgacaggata ggtgcgctcc 180 cagcaataaa gagttaaagc tgataaagct tgagccgttg taaaacggtg gggtttacct 240 cagtggtggc tactgaatca cccccttcgt cgggggaacc ctcctaaata ttttttttgg 300 cgtgtcaaag cgggggcaaa aatcctggag tcccgccaaa atctcaaaac ctttgtccta 360 tcttgacttg ataaactagc atgtcagtta atttagtttt ttgatgtcaa gtaggagatg 420 cttttaggca gtcctgccaa agatgtgtat ggaaagctct aatagcaagg gttctagacg 480 gatcg 485 <210> 152 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> MG64-56 effector target CRISPR repeat <400> 152 gtttcaacaa ccatcccagc taggggtggg ttgaaag 37 <210> 153 <211> 595 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> MG64-56 putative transposon end LE <400> 153 tatgcgactt gagcgatttg tgtaagtttt gtgttgcaca aaccatccta agcgacatta 60 gtttgcaaaa aacgacatta atttacgaat cgcgaccttt aatttgcgaa tatacaacag 120 attttgtcga ttaactaatt atttgtcgtc ttaacaaatt aatgtcgccc aaatcttcaa 180 gactataatc cttatgtatc aaaggttata gccttttgaa cttatattgg ctatcatcaa 240 atatttaact aattaagtgt cgtcttttaa ttaattaaca ttttaaatgt cgttttttca 300 aaaaacacct ttccaaattt ttcttttgct cataacaaaa taactgtcgt cttttggaag 360 tgagtgaaaa atataaaatt aaatgtcgct ttttggaaca aagtagtatg atatttatta 420 ggcaatagta gctatgtaac aacaaaaaca tagttagatt gaagtcttct tttttgtctc 480 tagctacgaa gtcattaccc ttgctgcgat taaatttaga cgcaagctaa tttcgctctt 540 agacttgctg taccgtattg cctaaccaac tagtttcaag cgatgaagtt tgttt 595 <210> 154 <211> 493 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> MG64-56 putative transposon end RE <400> 154 taagttctat taactccaag ttttaataat tgcatggcaa taacaatcct ttttagaaag 60 gatttaagag ggttgaaagg aatgtcacct tcccaagaat acttttcaaa agctattttg 120 ggttagggaa gaataatcac agataactaa tatgcacaag taagtctaaa atagggataa 180 gtctgtcgat tagtccaata gcaaggcatc ttgttagacg acattaattt gttaacgtta 240 gttggaacta attcgacgac attaattcgt taacagcgac attaatttgt taatgacgac 300 attaatctgt taacgacgac attaatctgt taacgacgac aaataatctg ttaattgaca 360 gatttgaaag cgggtgatgg gactcgaacc cacgacgttc accttgggaa ggtgacattc 420 taccactgaa ttacacccgc aaatggagtt taggctcaat aaagctaacc cccattataa 480 cacgatttgc cca 493 <210> 155 <211> 568 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> MG64-2 active transposon end RE <400> 155 cctcgtgata cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata ataatggttt cttagacgtc 60 aggtggcact tttcggggaa atgtgttcta tctacaaaat tgttttatac aactatgttt 120 gtattttagt tctcaggaca aagattgtgt caattcttca caaaagttgt aattctcgcc 180 tttttcaaaa aaggacaaag aatttgtcaa ctttcctaaa ccggacaact aatttgtcaa 240 aaagcttttt caatatataa agggggtata atagctgtaa cccttgcgta gagtaggtta 300 gtgagctact aggtttggcg gtcaataatt tggcaagtgg tcaaataatt tggcaatcga 360 caattattta tcgttgggga cgaatcagtg tcacggagtc aaattatgtg tcgttgtgac 420 agattgatgt cgtctaagca ccagtgacaa attgatgttg ctttaataat ttaaaatcgt 480 cacgaaataa gcctaacgtg agttttcgtt ccactgagcg tcagaccacc gttgatgata 540 ccgctgcctt actgggtgca ttagccag 568 <210> 156 <211> 227 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> MG64-4 effector putative tracrRNA <400> 156 aatagcgccg cttgttcatg cgcgaaagcg tctctgaaca gtgtaaatgt gggttagttt 60 gactgtcgtg aagacggtct tgctttctga ccctggtagc tgcccacctt gaagctgctg 120 tctcttgtag acaggaatca ggtgcgcccc cagtaatata ggtgcgggtt taccgcagtg 180 gtggctaccc aatcacctcc gagcaaggag gaacccacct taattat 227 <210> 157 <211> 228 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> MG64-7 effector putative tracrRNA <400> 157 aacagcgccg cagttcatgc gtcttatggc gcctctgtgc tgtgcaaaat gtgggttagt 60 ttgactgttg gaagacagtc ttgctttctg accctggtag ctgcccacct tgaagctgct 120 atcccttgtg gataggaatc aggtgcgccc ccagtaatag aggtgcgggt ttaccgcagt 180 ggtggctacc gaatcacctc cgagcaagga ggaacccacc ttaattat 228 <210> 158 <211> 328 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> MG64-9 effector putative tracrRNA <400> 158 gctgaagtta gtctctggat actgaagtca gtgtctaggg actgaagtaa ggggagcttt 60 acccgcaagg gatactttcg accccctgta gctgcccgct cctggtgggg tgccctgaca 120 cccgcctcat tacagcaatg tatgactgtc tgggctaatg aaagaaggat tagggacgca 180 ggttcacgac ctacttcaat catagtctgt gcaacccaga taagtgagta tgacccgcaa 240 gggtctaaac gcctttagta gaatggttct tccagtttgt taagggcagg gcttggttct 300 ccaaggtggc tacgaattct tctcgatt 328 <210> 159 <211> 187 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> MG64-10 effector putative tracrRNA <400> 159 ggtagcgctg gagccacata gttcataagc tcacgcttct tggacttcct gtgttctcta 60 aaacgggttc tgttttaccc ttaccaaggg atactttcag atccgagtag ctgcaagctc 120 atggcggagt gtcccctgac gctttgccac cgtcatagcg atgtgatggc cgtctggcgt 180 atgaacg 187 <210> 160 <211> 326 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> MG64-12 effector putative tracrRNA <400> 160 aatagcgccc ctaatcaaat cgaaggcgtt tgaggacggg gaaaatgggt aagtttccat 60 cgaaaggtgg ttcttttcag ccctatgtag tcccactccc ttgtggagtg ttagcatctg 120 aggtgcctag cacagcaaag tctctcagga gacggagtca aagctgggga acaagtatta 180 cgaacgaatc tcgcgattct attagtatac gtaggtcgct cccatgcaac aagatgctca 240 tctctcagca atgagggtag ggaacgtatc ccaaacacta catgaatagc tcgtcgggct 300 tgcccggtga gtatccacca agcctt 326 <210> 161 <211> 311 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> MG64-13 effector putative tracrRNA <400> 161 cgctaggttt gccttttcgc gcgctgctga agcagtgaaa agttccgaca gtttaaaagt 60 tctaacactt ttactgcttt ccgtcgggag tagttgtccg cttctgcgtt gttgagaccg 120 aagtttgtcc aggtgatagg cagaacgttg atgcaacagg tagatagtcg cgctctatca 180 ggaagctgtt ctagttatta gtgttcgtgc actaataaag aggatacagg gatacatgtg 240 gttgtgtcca gcaatggcac aacagggcca ctactcgaag ccccgagcaa gggttgagcc 300 tacccaaatt t 311 <210> 162 <211> 342 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> MG64-14 effector putative tracrRNA <400> 162 aacagcgccg cagtttaagc tctatagccg ctgaactgtg aaaaatgtgg gtcagtttgg 60 tcgttgcaag acgatcgtgc tttccgaccc tagtaactgt ccgctcactg actgccatcc 120 tggggcaaat cttcaaattt tgtgtatttg tgtggggatg gaaagctgca ttagtcgatt 180 ctcttcctcc aatgtagcgt aggtgcgcac ccagcagaag tgagttaagc cttcacaatg 240 tggaggtaca gaagcatcat ctctccattt tttggtgtag atggtgtgac tgaagtggta 300 gttaccgaat cgcccctgat caagggggag ccctccataa tt 342 <210> 163 <211> 297 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> MG64-15 effector putative tracrRNA <400> 163 aatgacgttt gtttctgtgc gcgctgctga agcagtgaaa aatacggaca gtctaatttg 60 ctttccgtcc ggagtagttg tccgcttctg cgttgttgga accgaagttt gtccaggtga 120 taggcggagt gtttcggcaa cagatggaga gtcgcacctc tatcaggggg cagttttagt 180 ggttagtgtt tagcgcacta tcactaggat acagggatac atgtggtagt gaccagagat 240 ggcactgcgg gaccgctact cgaagccccg aacaagggtt gagcttaccc aaatctt 297 <210> 164 <211> 226 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> MG64-16 effector putative tracrRNA <400> 164 aatagcgccg cagtttaagc tcagcaagcc tctggactgc gaaaagtatg gggtagtttg 60 accgtcggta aacggttgtg ctttctgccc ctggcgactg cccaccccga tgctgtcgat 120 ttcttaactg ggaatcgaga tgaggtgcgc ccccagcaaa agggaacggg tttactggag 180 tggtggtcgc cgaatcaccc ccgagcaagg gggactcgtc ctttgc 226 <210> 165 <211> 227 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> MG64-17 effector putative tracrRNA <400> 165 aatagcgccg cagtttaagc tcaatgagcc tcttgactgc gaacagtatg gggtagtttg 60 accggcggta accggttgtg ctttctgccc ctggcgactg cccaccccga tgctgtcgat 120 ttctcaaccg ggaatcgaga atcaggtgcg cccccagcaa gagggaacgg gtttactgga 180 gtggtggtcg ccgaatcacc cccgagcaag ggggactcgt cctttgc 227 <210> 166 <211> 227 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> MG64-19 effector putative tracrRNA <400> 166 aatagcgccg cagtttaagc tcagcaagcc tctggactgc gaaaagtatg gggtagtttg 60 accgtcggta aacggttgtg ctttctgccc ctggcgactg cccaccccga tgctgtcgat 120 ttctcaaccg ggaatcgaga atcaggtgcg cccccagcaa gagggaacgg gtttactgga 180 gtggtggtcg ccgaatcacc cccgagcaag ggggactcgt cctttgc 227 <210> 167 <211> 211 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> MG64-20 effector putative tracrRNA <400> 167 aatagcgccg cagtttaagc tcaatgagcc tcttgactgc gaacagtatg gggtagtttg 60 accggcggta accggttgtg ctttctgccc ctggcgactg cccaccccga tgctgtcgat 120 ttctcaaccg ggaatcgaga atcaggtgcg cccccagcaa gagggaacgg gtttactgga 180 gtggtggtcg ccgaatcacc cccgagcaag g 211 <210> 168 <211> 222 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> MG64-21 effector putative tracrRNA <400> 168 aatagcgccg cagttcatgc ttctttgaag cctctgtgct gtgcaaaatg tgggttagtt 60 tggctgttga agaaacagcc ttgctttctg accctggtag ctgtccaccc tgaagctgct 120 atcccctgtg gataggatag gtgcgccccc agcaataggg gagcgggtat accgcagtgg 180 tggctactga atcacctcca agcaaggagg aatccacttt at 222 <210> 169 <211> 222 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> MG64-22 effector putative tracrRNA <400> 169 aatagcgccg cagttcatgc ttctttgaag cctctgtgct gtgcaaaatg tgggttagtt 60 tggctgttga agaaacagcc ttgctttctg accctggtag ctgtccaccc tgaagctgct 120 atcccctgtg gataggatag gtgcgccccc agcaataggg gagcgggtat accgcagtgg 180 tggctactga atcacctcca agcaaggagg aatccacttt at 222 <210> 170 <211> 248 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> MG64-24 effector putative tracrRNA <400> 170 aaaagcgccg tagaacatgc tcacgcctct gttctgcgaa aaattagggt ttgtttggct 60 gtctgacagc agtcttactt tctgtcccta gaatctgacc actccgatgc tgctgttgta 120 agtgaacttg attgagctcg gacaccatgc aacaggataa ggggcgcacc cagcaagaga 180 ggacggactt accgtagtgt tggcttctga agcaactccg accaaggagt agtccatgca 240 ttcatcat 248 <210> 171 <211> 277 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> MG64-25 effector putative tracrRNA <400> 171 aatcgcgccg cacattcatg ttccttgaga acctctgaat tgcgaaagtg tgggctagtt 60 tgttcgcttg atgcgaatgt gctttctggc cctggtagct gtccgccctg atgctgattt 120 ctacgggtaa ctgtaggaat gattaactcg ttctatagac aggtttcgtg ctttctattg 180 taacggggtc ggtgcgctcc cagcaatagg ggtgtgggtc tactacagtg atggctactg 240 aatcacctcc gagcaaggag gaatccacct taacttt 277 <210> 172 <211> 226 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> MG64-27 effector putative tracrRNA <400> 172 aatagcgccg cagtttaagc tcagcaagcc tctggactgc gaaaagtatg gggtagtttg 60 accgtcggta aacggttgtg ctttctgccc ctggcgactg cccaccccga tgctgtcgat 120 ttcttaactg ggaatcgaga tgaggtgcgc ccccagcaag agggaacggg tttactggag 180 tggtggtcgc cgaatcaccc ccgagcaagg gggactcgtc ctttgc 226 <210> 173 <211> 226 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> MG64-28 effector putative tracrRNA <400> 173 aatagcgccg cagtttaagc tcagcaagcc tctggactgc gaaaagtatg gggtagtttg 60 accgtcggta aacggttgtg ctttctgccc ctggcgactg cccaccccga tgctgtcgat 120 ttcttaactg ggaatcgaga tgaggtgcgc ccccagcaag agggaacggg tttactggag 180 tggtggtcgc cgaatcaccc ccgagcaagg gggactcgtc ctttgc 226 <210> 174 <211> 255 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> MG64-29 effector putative tracrRNA <400> 174 tagcgcacga acctgactag cgtcattacg atgcgagttc tggaaatggg acagtttcat 60 tgctttccgt ccctggcact gcctgcttac tcacgaccac aaggagacaa ttcagcgctg 120 tgagttcgcg attctctact gtttatgaca aactaacgtt tgtctggcag tacagcaaga 180 ttgtgtatca gaccatgttt ggcgaagata catggcaggc cgaatcgcca atgaaaccag 240 cggacttccc ctaat 255 <210> 175 <211> 226 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> MG64-32 effector putative tracrRNA <400> 175 aatagcgccg cagtttaagc tcaatgagcc tcttgactgc gaacagtatg gggtagtttg 60 accggcggta accggttgtg ctttctgccc ctggcgactg cccaccccga tgctgtcgat 120 ttcttaactg ggaatcgaga tgaggtgcgc ccccagcaag agggaacggg tttactggag 180 tggtggtcgc cgaatcaccc ccgagcaagg gggactcgtc ctttgc 226 <210> 176 <211> 203 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> MG64-44 effector putative tracrRNA <400> 176 tctagcgccg cagctcatgt cagcaatggc caatgtgttg tgctaaatgc gagctagttt 60 gactgcctgc taagcagtct tgctttctgg ctcaggtgac tatccaccca aaggtcgttg 120 gtgcgctggc gatttgaggg cacgggttcc ggagtgatag ttaccattac acctccggcc 180 aaggaggaat ccaccccacc ccc 203 <210> 177 <211> 203 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> MG64-46 effector putative tracrRNA <400> 177 tctagcgccg cagctcatgt cagcaatggc caatgtgttg tgctaaatgc gagctagttt 60 gactgcctgc taagcagtct tgctttctgg ctcaggtgac tatccaccca aaggtcgttg 120 gtgcgctggc gatttgaggg cacgggttcc ggagtgatag ttaccattac acctccggcc 180 aaggaggaat ccaccccacc ccc 203 <210> 178 <211> 310 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> MG64-49 effector putative tracrRNA <400> 178 gattgcgcct cgatcgatgc tctatgagcc gctcgatcgt agaaaaatgg gtgagtttga 60 ttatctactt cgttagataa tgctgctttc cgaccctggc attctgtccg cccttgaagc 120 tgcttctcat ggactagcgt aagctcgttg gtaagaagga aaagtcataa tttaaagtca 180 cgtctttcta gtatgacata ggtgcgctcc cacgcaatat agggttcagc ttttatttta 240 taaaagtaga gactttcctc tagtgacagt gccgaaatga ccccgtgcga ggggtaacta 300 cctaagtttt 310 <210> 179 <211> 227 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> MG64-51 effector putative tracrRNA <400> 179 aacagcgccg cagttcatgt ttgttataaa cctctgtact gcgataaatg cgggttagtt 60 tgactgttgt gagacagtct tgctttctga ccctagtagc tgcccacctt gatgctgctg 120 ttcccagtga acaggaataa ggtgcgcccc cagtaataga ggtgcgggtt taccgcagtg 180 gtggctactg aatcacctcc gactaaggag gaatccacct taattat 227 <210> 180 <211> 380 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> MG64-52 effector putative tracrRNA <400> 180 accggggatc gtcctggtga agggagagtt gctttggatc ggtcacaagc ttttccttaa 60 ctaattctca ctgactgact aggatgatcg agggggttat gttttaccac tgcaaggtgg 120 atactttcaa acccctgtgg tagctgctcg ctcctggtga ggtgccctga cacttcaccc 180 cactacagca atgtgtgtgg ctgtctggtt atgagagaag ttagggcata ggttcgttac 240 ctgcattcaa tcataaatta cgcgaccaga taagtgagta tgatccgcaa ggatctatat 300 gtctttagca aagaagtgct tctgctttgt tactggcgta gggcatggtt ctctaaagtg 360 gctaccgaac cttcccaatt 380 <210> 181 <211> 257 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> MG64_56 effector putative tracrRNA <400> 181 aacagcgccg cagttcatgc tcttctgagt ctctgtactg tgataaatct gggttagttt 60 aacggttgaa agaccgtttt gctttctgac cctggtagct gctcgctctt gatgctgctg 120 tcttttgaca ggataggtgc gctcccagca ataaagagtt aaagctgata aagcttgagc 180 cgttgtaaaa cggtggggtt tacctcagtg gtggctactg aatcaccccc ttcgtcgggg 240 gaaccctcct aaatatt 257 <210> 182 <211> 246 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> MG108-1 effector putative tracrRNA <400> 182 tttagcgcac ttgttcgagt tcgtttgaac tgaacaaggg taagtatggg ccagtttaat 60 tgctttccgt cccaggatag ctgccagctt ctaccgtagg ttcgtcctgc aagtgatgct 120 aagtcgcgcc tagcatcaag gagctatgtc ttgattgtct tgggtgtccg ccctggatga 180 gttgaggtgt agatgcttct atcatggcag ctactaaacg ccccaagcaa ggggaaccca 240 tcttta 246 <210> 183 <211> 223 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> MG108-2 effector putative tracrRNA <400> 183 aatagcgccg tagttcatgc ttgctaaagc ctctgaattg cgaaaagtcc gggttagtgc 60 tgtcggcaga cagcgttgct ttctgaccct ggtagctgcc caccccgatg ctgctgtccc 120 ttgcagacag gaaccaggtg cgcccccagt aataagggtg tgggtttacc acagtggtgg 180 ctactgaatc acctccgagc aaggaggaat ccaccttaac tat 223 <210> 184 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> MG64-9 effector target CRISPR repeat <400> 184 gtctttcatc ctatctcgcg ccagatcgct tcctgcaacc c 41 <210> 185 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> MG64-12 effector target CRISPR repeat <400> 185 gttgcaagcg cctccttggc tgttggtggg tggaaag 37 <210> 186 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> MG64-14 effector target CRISPR repeat <400> 186 gttgcaatcg ccttcccaga gatgggtggg ctgaaag 37 <210> 187 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> MG64-15 effector target CRISPR repeat <400> 187 gttacaatta ccctcccagc gttgggtggg ttgaaagg 38 <210> 188 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> MG64-16 effector target CRISPR repeat <400> 188 aagttgcatc cgctttccag caaccagggc gggtgaaag 39 <210> 189 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> MG64-17 effector target CRISPR repeat <400> 189 gttgcatccg ctttccagca accagggcgg gtgaaag 37 <210> 190 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> MG64-19 effector target CRISPR repeat <400> 190 gtacccaaag ccttttttcc ttaagcctat ccg 33 <210> 191 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> MG64-25 effector target CRISPR repeat <400> 191 gtttcaaccg ccatcccagc taggggt 27 <210> 192 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> MG64-27 effector target CRISPR repeat <400> 192 agttgcatcc gctttccagc aaccagggcg ggtgaaag 38 <210> 193 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> MG64-28 effector target CRISPR repeat <400> 193 gttgcatctg cttttcagca actagggcgg gggaaagc 38 <210> 194 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> MG64-29 effector target CRISPR repeat <400> 194 ggcgcgatcg cctttatggg tacgggcaag ttgaaag 37 <210> 195 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> MG64-32 effector target CRISPR repeat <400> 195 aagttgcatc cgctttccag caaccagggc gggtgaaagt t 41 <210> 196 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> MG64-44 effector target CRISPR repeat <400> 196 gttgcctccc gcttcgaggc acgggaacga ttgaaag 37 <210> 197 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> MG64-46 effector target CRISPR repeat <400> 197 gttgcctccc gcttcgaggc acgggaacga ttgaaag 37 <210> 198 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> MG64-49 effector target CRISPR repeat <400> 198 gttgcaacac tccctgactg cctgacacaa atgcctcgaa agc 43 <210> 199 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> MG64-52 effector target CRISPR repeat <400> 199 gtcgcaatga ctattttggc ttggggcgga atga 34 <210> 200 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> MG64-51 effector target CRISPR repeat <400> 200 gtttcaacac ccctcccgaa gtggggcggg ttgaaag 37 <210> 201 <211> 261 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> MG64-6 active effector sgRNA <220> <221> modified_base <222> (239)..(261) <223> a, c, u, g, unknown or other <400> 201 auaacagcgc cgcaggucau gccgucaaaa gccucugaac uguguuaaau ggggguuagu 60 uugacuguug aaagacaguu gugcuuucug acccugguag cugcccaccc ugaugcugcu 120 aucuuucggg auaggaauaa ggugcgcucc caguaauagg gguguagaug uacuacagug 180 guggcuacua aaucaccucc gaccaaggag gaauccaucc gaaaggaugg guugaaagnn 240 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn n 261 <210> 202 <211> 263 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> MG64-2 effector sgRNA <220> <221> modified_base <222> (241)..(263) <223> a, c, u, g, unknown or other <400> 202 gaauuaauag cgccgccguu caugcuucua ggagccucug aaaggugaca aaugcggguu 60 aguuuggcug uugucagaca gucuugcuuu cugacccugg uagcugccca ccccgaagcu 120 gcuguuccuu gugaacagga auuaggugcg cccccaguaa uaaggguaug gguuuaccac 180 agugguggcu acugaaucac cuccgagcaa ggaggaaccc acugaaaggu ggguugaaag 240 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnn 263 <210> 203 <211> 265 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> MG64-4 effector sgRNA <220> <221> modified_base <222> (243)..(265) <223> a, c, u, g, unknown or other <400> 203 gaaauagcgc cgcuuguuca ugcgcgaaag cgucucugaa caguguaaau guggguuagu 60 uugacugucg ugaagacggu cuugcuuucu gacccuggua gcugcccacc uugaagcugc 120 ugucucuugu agacaggaau caggugcgcc cccaguaaua uaggugcggg uuuaccgcag 180 ugguggcuac ccaaucaccu ccgagcaagg aggaacccac cuugaaagag gcggguugaa 240 agnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnn 265 <210> 204 <211> 276 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> MG64-7 effector sgRNA <220> <221> modified_base <222> (254)..(276) <223> a, c, u, g, unknown or other <400> 204 guaacaaaca gcgccgcagu ucaugcgucu uauggcgccu cugugcugug caaaaugugg 60 guuaguuuga cuguuggaag acagucuugc uuucugaccc ugguagcugc ccaccuugaa 120 gcugcuaucc cuuguggaua ggaaucaggu gcgcccccag uaauagaggu gcggguuuac 180 cgcaguggug gcuaccgaau caccuccgag caaggaggaa cccaccuuga aaaagcuuug 240 ggcggguuga aagnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnn 276 <210> 205 <211> 246 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> MG108-1 effector sgRNA 1 <220> <221> modified_base <222> (224)..(246) <223> a, c, u, g, unknown or other <400> 205 gaugcuaagu cgcgccuagc aucaaggagc uaugucuuga uugucuuggg uguccgcccu 60 ggaugaguug agguguagau gcuucuauca uggcagcuac uaaacgcccc aagcaagggg 120 aacccaucuu uaauuuuggc aaaccgaagc gggggcaaaa ucuccaggag guucgccaaa 180 accuuugaaa cuccuuagcu ggaaauggcg augggguuga aagnnnnnnn nnnnnnnnnn 240 nnnnnn 246 <210> 206 <211> 274 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> MG108-1 effector sgRNA 2 <220> <221> modified_base <222> (252)..(274) <223> a, c, u, g, unknown or other <400> 206 cuuguucgag uucguuugaa cugaacaagg guaaguaugg gccaguuuaa uugcuuuccg 60 ucccaggaua gcugccagcu ucuaccguag guucguccug caagugaugc uaagucgcgc 120 cuagcaucaa ggagcuaugu cuugauuguc uugggugucc gcccuggaug aguugaggug 180 uagaugcuuc uaucauggca gcuacuaaac gccccaagca aggggaaccc aucgaaagau 240 gggguugaaa gnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnn 274 <210> 207 <211> 60 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> MG110-1-6 effector crRNA <220> <221> modified_base <222> (9)..(40) <223> a, c, u, g, unknown or other <400> 207 cugguaaann nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn gugaccugcc gcauaggcag 60 <210> 208 <211> 59 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> MG110-2-6 effector crRNA <220> <221> modified_base <222> (7)..(38) <223> a, c, u, g, unknown or other <400> 208 ccaagannnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnua ugaacugccg cauaggcag 59 <210> 209 <211> 227 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> MG64-4 effector putative tracrRNA <400> 209 aauagcgccg cuuguucaug cgcgaaagcg ucucugaaca guguaaaugu ggguuaguuu 60 gacugucgug aagacggucu ugcuuucuga cccugguagc ugcccaccuu gaagcugcug 120 ucucuuguag acaggaauca ggugcgcccc caguaauaua ggugcggguu uaccgcagug 180 guggcuaccc aaucaccucc gagcaaggag gaacccaccu uaauuau 227 <210> 210 <211> 228 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> MG64-7 effector putative tracrRNA <400> 210 aacagcgccg caguucaugc gucuuauggc gccucugugc ugugcaaaau guggguuagu 60 uugacuguug gaagacaguc uugcuuucug acccugguag cugcccaccu ugaagcugcu 120 aucccuugug gauaggaauc aggugcgccc ccaguaauag aggugcgggu uuaccgcagu 180 gguggcuacc gaaucaccuc cgagcaagga ggaacccacc uuaauuau 228 <210> 211 <211> 328 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> MG64-9 effector putative tracrRNA <400> 211 gcugaaguua gucucuggau acugaaguca gugucuaggg acugaaguaa ggggagcuuu 60 acccgcaagg gauacuuucg acccccugua gcugcccgcu ccuggugggg ugcccugaca 120 cccgccucau uacagcaaug uaugacuguc ugggcuaaug aaagaaggau uagggacgca 180 gguucacgac cuacuucaau cauagucugu gcaacccaga uaagugagua ugacccgcaa 240 gggucuaaac gccuuuagua gaaugguucu uccaguuugu uaagggcagg gcuugguucu 300 ccaagguggc uacgaauucu ucucgauu 328 <210> 212 <211> 187 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> MG64-10 effector putative tracrRNA <400> 212 gguagcgcug gagccacaua guucauaagc ucacgcuucu uggacuuccu guguucucua 60 aaacggguuc uguuuuaccc uuaccaaggg auacuuucag auccgaguag cugcaagcuc 120 auggcggagu guccccugac gcuuugccac cgucauagcg augugauggc cgucuggcgu 180 augaacg 187 <210> 213 <211> 326 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> MG64-12 effector putative tracrRNA <400> 213 aauagcgccc cuaaucaaau cgaaggcguu ugaggacggg gaaaaugggu aaguuuccau 60 cgaaaggugg uucuuuucag cccuauguag ucccacuccc uuguggagug uuagcaucug 120 aggugccuag cacagcaaag ucucucagga gacggaguca aagcugggga acaaguauua 180 cgaacgaauc ucgcgauucu auuaguauac guaggucgcu cccaugcaac aagaugcuca 240 ucucucagca augaggguag ggaacguauc ccaaacacua caugaauagc ucgucgggcu 300 ugcccgguga guauccacca agccuu 326 <210> 214 <211> 311 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> MG64-13 effector putative tracrRNA <400> 214 cgcuagguuu gccuuuucgc gcgcugcuga agcagugaaa aguuccgaca guuuaaaagu 60 ucuaacacuu uuacugcuuu ccgucgggag uaguuguccg cuucugcguu guugagaccg 120 aaguuugucc aggugauagg cagaacguug augcaacagg uagauagucg cgcucuauca 180 ggaagcuguu cuaguuauua guguucgugc acuaauaaag aggauacagg gauacaugug 240 guugugucca gcaauggcac aacagggcca cuacucgaag ccccgagcaa ggguugagcc 300 uacccaaauu u 311 <210> 215 <211> 342 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> MG64-14 effector putative tracrRNA <400> 215 aacagcgccg caguuuaagc ucuauagccg cugaacugug aaaaaugugg gucaguuugg 60 ucguugcaag acgaucgugc uuuccgaccc uaguaacugu ccgcucacug acugccaucc 120 uggggcaaau cuucaaauuu uguguauuug uguggggaug gaaagcugca uuagucgauu 180 cucuuccucc aauguagcgu aggugcgcac ccagcagaag ugaguuaagc cuucacaaug 240 uggagguaca gaagcaucau cucuccauuu uuugguguag auggugugac ugaaguggua 300 guuaccgaau cgccccugau caagggggag cccuccauaa uu 342 <210> 216 <211> 297 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> MG64-15 effector putative tracrRNA <400> 216 aaugacguuu guuucugugc gcgcugcuga agcagugaaa aauacggaca gucuaauuug 60 cuuuccgucc ggaguaguug uccgcuucug cguuguugga accgaaguuu guccagguga 120 uaggcggagu guuucggcaa cagauggaga gucgcaccuc uaucaggggg caguuuuagu 180 gguuaguguu uagcgcacua ucacuaggau acagggauac augugguagu gaccagagau 240 ggcacugcgg gaccgcuacu cgaagccccg aacaaggguu gagcuuaccc aaaucuu 297 <210> 217 <211> 226 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> MG64-16 effector putative tracrRNA <400> 217 aauagcgccg caguuuaagc ucagcaagcc ucuggacugc gaaaaguaug ggguaguuug 60 accgucggua aacgguugug cuuucugccc cuggcgacug cccaccccga ugcugucgau 120 uucuuaacug ggaaucgaga ugaggugcgc ccccagcaaa agggaacggg uuuacuggag 180 ugguggucgc cgaaucaccc ccgagcaagg gggacucguc cuuugc 226 <210> 218 <211> 227 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> MG64-17 effector putative tracrRNA <400> 218 aauagcgccg caguuuaagc ucaaugagcc ucuugacugc gaacaguaug ggguaguuug 60 accggcggua accgguugug cuuucugccc cuggcgacug cccaccccga ugcugucgau 120 uucucaaccg ggaaucgaga aucaggugcg cccccagcaa gagggaacgg guuuacugga 180 gugguggucg ccgaaucacc cccgagcaag ggggacucgu ccuuugc 227 <210> 219 <211> 227 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> MG64-19 effector putative tracrRNA <400> 219 aauagcgccg caguuuaagc ucagcaagcc ucuggacugc gaaaaguaug ggguaguuug 60 accgucggua aacgguugug cuuucugccc cuggcgacug cccaccccga ugcugucgau 120 uucucaaccg ggaaucgaga aucaggugcg cccccagcaa gagggaacgg guuuacugga 180 gugguggucg ccgaaucacc cccgagcaag ggggacucgu ccuuugc 227 <210> 220 <211> 211 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> MG64-20 effector putative tracrRNA <400> 220 aauagcgccg caguuuaagc ucaaugagcc ucuugacugc gaacaguaug ggguaguuug 60 accggcggua accgguugug cuuucugccc cuggcgacug cccaccccga ugcugucgau 120 uucucaaccg ggaaucgaga aucaggugcg cccccagcaa gagggaacgg guuuacugga 180 gugguggucg ccgaaucacc cccgagcaag g 211 <210> 221 <211> 222 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> MG64-21 effector putative tracrRNA <400> 221 aauagcgccg caguucaugc uucuuugaag ccucugugcu gugcaaaaug uggguuaguu 60 uggcuguuga agaaacagcc uugcuuucug acccugguag cuguccaccc ugaagcugcu 120 auccccugug gauaggauag gugcgccccc agcaauaggg gagcggguau accgcagugg 180 uggcuacuga aucaccucca agcaaggagg aauccacuuu au 222 <210> 222 <211> 222 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> MG64-22 effector putative tracrRNA <400> 222 aauagcgccg caguucaugc uucuuugaag ccucugugcu gugcaaaaug uggguuaguu 60 uggcuguuga agaaacagcc uugcuuucug acccugguag cuguccaccc ugaagcugcu 120 auccccugug gauaggauag gugcgccccc agcaauaggg gagcggguau accgcagugg 180 uggcuacuga aucaccucca agcaaggagg aauccacuuu au 222 <210> 223 <211> 248 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> MG64-24 effector putative tracrRNA <400> 223 aaaagcgccg uagaacaugc ucacgccucu guucugcgaa aaauuagggu uuguuuggcu 60 gucugacagc agucuuacuu ucugucccua gaaucugacc acuccgaugc ugcuguugua 120 agugaacuug auugagcucg gacaccaugc aacaggauaa ggggcgcacc cagcaagaga 180 ggacggacuu accguagugu uggcuucuga agcaacuccg accaaggagu aguccaugca 240 uucaucau 248 <210> 224 <211> 277 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> MG64-25 effector putative tracrRNA <400> 224 aaucgcgccg cacauucaug uuccuugaga accucugaau ugcgaaagug ugggcuaguu 60 uguucgcuug augcgaaugu gcuuucuggc ccugguagcu guccgcccug augcugauuu 120 cuacggguaa cuguaggaau gauuaacucg uucuauagac agguuucgug cuuucuauug 180 uaacgggguc ggugcgcucc cagcaauagg gguguggguc uacuacagug auggcuacug 240 aaucaccucc gagcaaggag gaauccaccu uaacuuu 277 <210> 225 <211> 226 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> MG64-27 effector putative tracrRNA <400> 225 aauagcgccg caguuuaagc ucagcaagcc ucuggacugc gaaaaguaug ggguaguuug 60 accgucggua aacgguugug cuuucugccc cuggcgacug cccaccccga ugcugucgau 120 uucuuaacug ggaaucgaga ugaggugcgc ccccagcaag agggaacggg uuuacuggag 180 ugguggucgc cgaaucaccc ccgagcaagg gggacucguc cuuugc 226 <210> 226 <211> 226 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> MG64-28 effector putative tracrRNA <400> 226 aauagcgccg caguuuaagc ucagcaagcc ucuggacugc gaaaaguaug ggguaguuug 60 accgucggua aacgguugug cuuucugccc cuggcgacug cccaccccga ugcugucgau 120 uucuuaacug ggaaucgaga ugaggugcgc ccccagcaag agggaacggg uuuacuggag 180 ugguggucgc cgaaucaccc ccgagcaagg gggacucguc cuuugc 226 <210> 227 <211> 255 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> MG64-29 effector putative tracrRNA <400> 227 uagcgcacga accugacuag cgucauuacg augcgaguuc uggaaauggg acaguuucau 60 ugcuuuccgu cccuggcacu gccugcuuac ucacgaccac aaggagacaa uucagcgcug 120 ugaguucgcg auucucuacu guuuaugaca aacuaacguu ugucuggcag uacagcaaga 180 uuguguauca gaccauguuu ggcgaagaua cauggcaggc cgaaucgcca augaaaccag 240 cggacuuccc cuaau 255 <210> 228 <211> 226 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> MG64-32 effector putative tracrRNA <400> 228 aauagcgccg caguuuaagc ucaaugagcc ucuugacugc gaacaguaug ggguaguuug 60 accggcggua accgguugug cuuucugccc cuggcgacug cccaccccga ugcugucgau 120 uucuuaacug ggaaucgaga ugaggugcgc ccccagcaag agggaacggg uuuacuggag 180 ugguggucgc cgaaucaccc ccgagcaagg gggacucguc cuuugc 226 <210> 229 <211> 203 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> MG64-44 effector putative tracrRNA <400> 229 ucuagcgccg cagcucaugu cagcaauggc caauguguug ugcuaaaugc gagcuaguuu 60 gacugccugc uaagcagucu ugcuuucugg cucaggugac uauccaccca aaggucguug 120 gugcgcuggc gauuugaggg cacggguucc ggagugauag uuaccauuac accuccggcc 180 aaggaggaau ccaccccacc ccc 203 <210> 230 <211> 203 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> MG64-46 effector putative tracrRNA <400> 230 ucuagcgccg cagcucaugu cagcaauggc caauguguug ugcuaaaugc gagcuaguuu 60 gacugccugc uaagcagucu ugcuuucugg cucaggugac uauccaccca aaggucguug 120 gugcgcuggc gauuugaggg cacggguucc ggagugauag uuaccauuac accuccggcc 180 aaggaggaau ccaccccacc ccc 203 <210> 231 <211> 310 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> MG64-49 effector putative tracrRNA <400> 231 gauugcgccu cgaucgaugc ucuaugagcc gcucgaucgu agaaaaaugg gugaguuuga 60 uuaucuacuu cguuagauaa ugcugcuuuc cgacccuggc auucuguccg cccuugaagc 120 ugcuucucau ggacuagcgu aagcucguug guaagaagga aaagucauaa uuuaaaguca 180 cgucuuucua guaugacaua ggugcgcucc cacgcaauau aggguucagc uuuuauuuua 240 uaaaaguaga gacuuuccuc uagugacagu gccgaaauga ccccgugcga gggguaacua 300 ccuaaguuuu 310 <210> 232 <211> 227 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> MG64-51 effector putative tracrRNA <400> 232 aacagcgccg caguucaugu uuguuauaaa ccucuguacu gcgauaaaug cggguuaguu 60 ugacuguugu gagacagucu ugcuuucuga cccuaguagc ugcccaccuu gaugcugcug 120 uucccaguga acaggaauaa ggugcgcccc caguaauaga ggugcggguu uaccgcagug 180 guggcuacug aaucaccucc gacuaaggag gaauccaccu uaauuau 227 <210> 233 <211> 380 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> MG64-52 effector putative tracrRNA <400> 233 accggggauc guccugguga agggagaguu gcuuuggauc ggucacaagc uuuuccuuaa 60 cuaauucuca cugacugacu aggaugaucg aggggguuau guuuuaccac ugcaaggugg 120 auacuuucaa accccugugg uagcugcucg cuccugguga ggugcccuga cacuucaccc 180 cacuacagca augugugugg cugucugguu augagagaag uuagggcaua gguucguuac 240 cugcauucaa ucauaaauua cgcgaccaga uaagugagua ugauccgcaa ggaucuauau 300 gucuuuagca aagaagugcu ucugcuuugu uacuggcgua gggcaugguu cucuaaagug 360 gcuaccgaac cuucccaauu 380 <210> 234 <211> 257 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> MG64-56 effector putative tracrRNA <400> 234 aacagcgccg caguucaugc ucuucugagu cucuguacug ugauaaaucu ggguuaguuu 60 aacgguugaa agaccguuuu gcuuucugac ccugguagcu gcucgcucuu gaugcugcug 120 ucuuuugaca ggauaggugc gcucccagca auaaagaguu aaagcugaua aagcuugagc 180 cguuguaaaa cggugggguu uaccucagug guggcuacug aaucaccccc uucgucgggg 240 gaacccuccu aaauauu 257 <210> 235 <211> 246 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> MG108-1 effector putative tracrRNA <400> 235 uuuagcgcac uuguucgagu ucguuugaac ugaacaaggg uaaguauggg ccaguuuaau 60 ugcuuuccgu cccaggauag cugccagcuu cuaccguagg uucguccugc aagugaugcu 120 aagucgcgcc uagcaucaag gagcuauguc uugauugucu uggguguccg cccuggauga 180 guugaggugu agaugcuucu aucauggcag cuacuaaacg ccccaagcaa ggggaaccca 240 ucuuua 246 <210> 236 <211> 223 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> MG108-2 effector putative tracrRNA <400> 236 aauagcgccg uaguucaugc uugcuaaagc cucugaauug cgaaaagucc ggguuagugc 60 ugucggcaga cagcguugcu uucugacccu gguagcugcc caccccgaug cugcuguccc 120 uugcagacag gaaccaggug cgcccccagu aauaagggug uggguuuacc acaguggugg 180 cuacugaauc accuccgagc aaggaggaau ccaccuuaac uau 223 <210> 237 <211> 41 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> MG64-9 effector crRNA <400> 237 gucuuucauc cuaucucgcg ccagaucgcu uccugcaacc c 41 <210> 238 <211> 37 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> MG64-12 effector crRNA <400> 238 guugcaagcg ccuccuuggc uguugguggg uggaaag 37 <210> 239 <211> 37 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> MG64-14 effector crRNA <400> 239 guugcaaucg ccuucccaga gauggguggg cugaaag 37 <210> 240 <211> 38 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> MG64-15 effector crRNA <400> 240 guuacaauua cccucccagc guuggguggg uugaaagg 38 <210> 241 <211> 39 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> MG64-16 effector crRNA <400> 241 aaguugcauc cgcuuuccag caaccagggc gggugaaag 39 <210> 242 <211> 37 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> MG64-17 effector crRNA <400> 242 guugcauccg cuuuccagca accagggcgg gugaaag 37 <210> 243 <211> 33 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> MG64-19 effector crRNA <400> 243 guacccaaag ccuuuuuucc uuaagccuau ccg 33 <210> 244 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> MG64-25 effector crRNA <400> 244 guuucaaccg ccaucccagc uaggggu 27 <210> 245 <211> 38 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> MG64-27 effector crRNA <400> 245 aguugcaucc gcuuuccagc aaccagggcg ggugaaag 38 <210> 246 <211> 38 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> MG64-28 effector crRNA <400> 246 guugcaucug cuuuucagca acuagggcgg gggaaagc 38 <210> 247 <211> 37 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> MG64-29 effector crRNA <400> 247 ggcgcgaucg ccuuuauggg uacgggcaag uugaaag 37 <210> 248 <211> 41 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> MG64-32 effector crRNA <400> 248 aaguugcauc cgcuuuccag caaccagggc gggugaaagu u 41 <210> 249 <211> 37 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> MG64-44 effector crRNA <400> 249 guugccuccc gcuucgaggc acgggaacga uugaaag 37 <210> 250 <211> 37 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> MG64-46 effector crRNA <400> 250 guugccuccc gcuucgaggc acgggaacga uugaaag 37 <210> 251 <211> 43 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> MG64-49 effector crRNA <400> 251 guugcaacac ucccugacug ccugacacaa augccucgaa agc 43 <210> 252 <211> 34 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> MG64-52 effector crRNA <400> 252 gucgcaauga cuauuuuggc uuggggcgga auga 34 <210> 253 <211> 37 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> MG64-51 effector crRNA <400> 253 guuucaacac cccucccgaa guggggcggg uugaaag 37 <210> 254 <211> 37 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> MG64-56 effector crRNA <400> 254 guuucaacaa ccaucccagc uagggguggg uugaaag 37 <210> 255 <211> 37 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> MG64-2 effector crRNA <400> 255 guuucaacga ccaucccaac uagggguggg uugaaag 37 <210> 256 <211> 37 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> MG64-4 effector crRNA <400> 256 guuucaacuu uccuuccagc uagaggcggg uugaaag 37 <210> 257 <211> 37 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> MG64-6 effector crRNA <400> 257 guuucaacca ccaucucaac uagggauggg uugaaag 37 <210> 258 <211> 38 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> MG64-7 effector crRNA <400> 258 guuucaacgc cccuucaagc uuugggcggg uugaaagc 38 <210> 259 <211> 36 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> MG64-13 effector crRNA <400> 259 uggcaauugc ccuuccagug uugggugggu ugaaag 36 <210> 260 <211> 37 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> MG108-2 effector crRNA <400> 260 guuucaacga ccaucccgac aagggguggg uugaaag 37 <210> 261 <211> 37 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> MG108-1 effector crRNA <400> 261 guugcgaucg ccgcuccggu ggcgaugggg uugaaag 37

Claims (141)

  1. 카고(cargo) 뉴클레오타이드 서열을 표적 핵산 부위로 전위시키는 시스템으로서,
    재조합효소(recombinase) 또는 전위효소(transposase) 복합체와 상호작용하도록 구성된 카고 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 이중 가닥 핵산;
    클래스 II 타입 II Cas 이펙터, 및 상기 표적 핵산 부위에 하이브리드화하도록 구성된 적어도 하나의 조작된 가이드 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 Cas 이펙터 복합체; 및
    상기 카고 뉴클레오타이드 서열을 상기 표적 핵산 부위로 끌어들이도록 구성된 상기 재조합효소 또는 전위효소 복합체
    를 포함하는 시스템.
  2. 제1항에 있어서, 상기 재조합효소 또는 전위효소 복합체가 상기 Cas 이펙터 복합체에 비공유 결합하는 것인 시스템.
  3. 제1항에 있어서, 상기 재조합효소 또는 전위효소 복합체가 상기 Cas 이펙터 복합체에 공유 결합하는 것인 시스템.
  4. 제3항에 있어서, 상기 재조합효소 또는 전위효소 복합체가 단일 폴리펩티드에서 상기 Cas 이펙터 복합체에 융합되는 것인 시스템.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 카고 뉴클레오타이드 서열이 좌측 전위효소 인식 서열 및 우측 전위효소 인식 서열에 의해 플랭킹되는 것인 시스템.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 핵산 부위를 포함하는 제2 이중 가닥 핵산을 추가로 포함하는 시스템.
  7. 제6항에 있어서, 상기 표적 핵산 부위에 인접한 상기 Cas 이펙터 복합체와 호환되는 PAM 서열을 추가로 포함하는 시스템.
  8. 제7항에 있어서, 상기 PAM 서열이 상기 표적 핵산 부위의 3'에 위치하는 것인 시스템.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합효소 또는 전위효소 복합체가 Tn7 타입 전위효소 복합체인 시스템.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 가이드 폴리뉴클레오타이드가 상기 클래스 II 타입 II Cas 이펙터에 결합하도록 구성된 것인 시스템.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 클래스 II 타입 II Cas 이펙터가 서열번호 1 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 동일성을 가진 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 것인 시스템.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합효소 또는 전위효소 복합체가 서열번호 2 내지 5 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 동일성을 가진 서열을 포함하는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개 또는 4개의 폴리펩티드(들)를 포함하는 것인 시스템.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 가이드 폴리뉴클레오타이드가 서열번호 12 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 동일성을 가진 적어도 60개 내지 80개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 서열을 포함하는 것인 시스템.
  14. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 가이드 폴리뉴클레오타이드가 서열번호 11 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 동일성을 가진 서열을 포함하는 것인 시스템.
  15. 제2항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 좌측 재조합효소 서열이 서열번호 17 및 18 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 동일성을 가진 서열을 포함하는 것인 시스템.
  16. 제2항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 우측 재조합효소 서열이 서열번호 19 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 동일성을 가진 서열을 포함하는 것인 시스템.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 클래스 II 타입 II Cas 이펙터 및 상기 재조합효소 또는 전위효소 복합체가 약 10 킬로염기 미만을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩되는 것인 시스템.
  18. 카고 뉴클레오타이드 서열을, 표적 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 표적 핵산 부위로 전위시키는 방법으로서, 세포 내에서 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 시스템을 발현시키거나 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 시스템을 세포에 도입하는 단계를 포함하는 방법.
  19. 카고 뉴클레오타이드 서열을 표적 핵산 부위로 전위시키는 시스템으로서,
    Tn7 타입 전위효소 복합체와 상호작용하도록 구성된 카고 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 이중 가닥 핵산;
    클래스 II 타입 V Cas 이펙터, 및 상기 표적 뉴클레오타이드 서열에 하이브리드화하도록 구성된 조작된 가이드 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 Cas 이펙터 복합체; 및
    상기 Cas 이펙터 복합체에 결합하도록 구성되고 TnsA 서브유닛을 포함하는 Tn7 타입 전위효소 복합체
    를 포함하는 시스템.
  20. 제19항에 있어서, 상기 전위효소 복합체가 상기 Cas 이펙터 복합체에 비공유 결합하는 것인 시스템.
  21. 제19항에 있어서, 상기 전위효소 복합체가 상기 Cas 이펙터 복합체에 공유 결합하는 것인 시스템.
  22. 제21항에 있어서, 상기 전위효소 복합체가 단일 폴리펩티드에서 상기 Cas 이펙터 복합체에 융합되는 것인 시스템.
  23. 제19항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 클래스 II 타입 V Cas 이펙터가 Cas12k 이펙터가 아닌 것인 시스템.
  24. 제19항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 카고 뉴클레오타이드 서열이 좌측 전위효소 인식 서열 및 우측 전위효소 인식 서열에 의해 플랭킹되는 것인 시스템.
  25. 제19항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 핵산 부위를 포함하는 제2 이중 가닥 핵산을 추가로 포함하는 시스템.
  26. 제19항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 핵산 부위에 인접한 상기 Cas 이펙터 복합체와 호환되는 PAM 서열을 추가로 포함하는 시스템.
  27. 제26항에 있어서, 상기 PAM 서열이 상기 표적 핵산 부위의 5'에 위치하는 것인 시스템.
  28. 제19항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 가이드 폴리뉴클레오타이드가 상기 클래스 II 타입 V Cas 이펙터에 결합하도록 구성된 것인 시스템.
  29. 제19항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TnsA 서브유닛이 서열번호 7 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 동일성을 가진 서열을 가진 폴리펩티드를 포함하는 것인 시스템.
  30. 제19항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Tn7 타입 전위효소 복합체가 서열번호 8 내지 10 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 동일성을 가진 서열을 포함하는 적어도 1개, 적어도 2개 또는 3개의 폴리펩티드(들)를 포함하는 것인 시스템.
  31. 제19항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 가이드 폴리뉴클레오타이드가 서열번호 13 내지 16 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 동일성을 가진 적어도 약 46개 내지 80개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 서열을 포함하는 것인 시스템.
  32. 제24항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 좌측 재조합효소 서열이 서열번호 20 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 동일성을 가진 서열을 포함하는 것인 시스템.
  33. 제24항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 우측 재조합효소 서열이 서열번호 21 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 동일성을 가진 서열을 포함하는 것인 시스템.
  34. 제19항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 클래스 II 타입 V Cas 이펙터가 Cas12k 이펙터가 아닌 것인 시스템.
  35. 제19항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 클래스 II 타입 V Cas 이펙터 및 상기 Tn7 타입 전위효소 복합체가 약 10 킬로염기 미만을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩되는 것인 시스템.
  36. 카고 뉴클레오타이드 서열을, 표적 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 표적 핵산 부위로 전위시키는 방법으로서, 세포 내에서 제19항 내지 제34항 중 어느 한 항의 시스템을 발현시키거나 제19항 내지 제34항 중 어느 한 항의 시스템을 세포에 도입하는 단계를 포함하는 방법.
  37. 카고 뉴클레오타이드 서열을 표적 핵산 부위로 전위시키는 방법으로서,
    카고 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 이중 가닥 핵산을,
    클래스 II 타입 II Cas 이펙터, 및 상기 표적 핵산 부위에 하이브리드화하도록 구성된 적어도 하나의 조작된 가이드 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 Cas 이펙터 복합체;
    상기 카고 뉴클레오타이드를 상기 표적 핵산 부위로 끌어들이도록 구성된 재조합효소 또는 전위효소 복합체; 및
    상기 표적 핵산 부위를 포함하는 제2 이중 가닥 핵산
    과 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
  38. 제37항에 있어서, 상기 재조합효소 또는 전위효소 복합체가 상기 Cas 이펙터 복합체에 비공유 결합하는 것인 시스템.
  39. 제37항에 있어서, 상기 재조합효소 또는 전위효소 복합체가 상기 Cas 이펙터 복합체에 공유 결합하는 것인 시스템.
  40. 제39항에 있어서, 상기 재조합효소 또는 전위효소 복합체가 단일 폴리펩티드에서 상기 Cas 이펙터 복합체에 융합되는 것인 시스템.
  41. 제37항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 카고 뉴클레오타이드 서열이 좌측 전위효소 인식 서열 및 우측 전위효소 인식 서열에 의해 플랭킹되는 것인 방법.
  42. 제37항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 핵산 부위에 인접한 상기 Cas 이펙터 복합체와 호환되는 PAM 서열을 추가로 포함하는 방법.
  43. 제42항에 있어서, 상기 PAM 서열이 상기 표적 핵산 부위의 3'에 위치하는 것인 방법.
  44. 제37항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합효소 또는 전위효소 복합체가 Tn7 타입 전위효소 복합체인 시스템.
  45. 제37항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 가이드 폴리뉴클레오타이드가 상기 클래스 II 타입 II Cas 이펙터에 결합하도록 구성된 것인 방법.
  46. 제37항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 클래스 II 타입 II Cas 이펙터가 서열번호 1 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 동일성을 가진 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 것인 방법.
  47. 제37항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합효소 또는 전위효소 복합체가 서열번호 2 내지 5 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 동일성을 가진 서열을 포함하는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개 또는 4개의 폴리펩티드(들)를 포함하는 것인 방법.
  48. 제37항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 가이드 폴리뉴클레오타이드가 서열번호 12 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 동일성을 가진 적어도 60개 내지 80개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 서열을 포함하는 것인 방법.
  49. 제37항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 가이드 폴리뉴클레오타이드가 서열번호 11 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 동일성을 가진 서열을 포함하는 것인 방법.
  50. 제41항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 좌측 재조합효소 서열이 서열번호 17 및 18 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 동일성을 가진 서열을 포함하는 것인 방법.
  51. 제41항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 우측 재조합효소 서열이 서열번호 19 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 동일성을 가진 서열을 포함하는 것인 방법.
  52. 제37항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 클래스 II 타입 II Cas 이펙터 및 상기 Tn7 타입 전위효소 복합체가 약 10 킬로염기 미만을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩되는 것인 방법.
  53. 카고 뉴클레오타이드 서열을 표적 핵산 부위로 전위시키는 방법으로서,
    상기 카고 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 이중 가닥 핵산을,
    클래스 II 타입 V Cas 이펙터, 및 상기 표적 뉴클레오타이드 서열에 하이브리드화하도록 구성된 적어도 하나의 조작된 가이드 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 Cas 이펙터 복합체;
    상기 Cas 이펙터 복합체에 결합하도록 구성되고 TnsA 서브유닛을 포함하는 Tn7 타입 전위효소 복합체; 및
    상기 표적 핵산 부위를 포함하는 제2 이중 가닥 핵산
    과 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
  54. 제53항에 있어서, 상기 전위효소 복합체가 상기 Cas 이펙터 복합체에 비공유 결합하는 것인 시스템.
  55. 제53항에 있어서, 상기 전위효소 복합체가 상기 Cas 이펙터 복합체에 공유 결합하는 것인 시스템.
  56. 제55항에 있어서, 상기 전위효소 복합체가 단일 폴리펩티드에서 상기 Cas 이펙터 복합체에 융합되는 것인 시스템.
  57. 제53항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 카고 뉴클레오타이드 서열이 좌측 전위효소 인식 서열 및 우측 전위효소 인식 서열에 의해 플랭킹되는 것인 방법.
  58. 제53항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 핵산 부위에 인접한 상기 Cas 이펙터 복합체와 호환되는 PAM 서열을 추가로 포함하는 방법.
  59. 제58항에 있어서, 상기 PAM 서열이 상기 표적 핵산 부위의 3'에 위치하는 것인 방법.
  60. 제53항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 가이드 폴리뉴클레오타이드가 상기 클래스 II 타입 V Cas 이펙터에 결합하도록 구성된 것인 방법.
  61. 제53항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TnsA 서브유닛이 서열번호 7 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 동일성을 가진 서열을 가진 폴리펩티드를 포함하는 것인 방법.
  62. 제53항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Tn7 타입 전위효소 복합체가 서열번호 8 내지 10 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 동일성을 가진 서열을 포함하는 적어도 1개, 적어도 2개 또는 3개의 폴리펩티드(들)를 포함하는 것인 방법.
  63. 제53항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 가이드 폴리뉴클레오타이드가 서열번호 13 내지 16 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 동일성을 가진 적어도 약 46개 내지 80개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 서열을 포함하는 것인 방법.
  64. 제57항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 좌측 재조합효소 서열이 서열번호 20 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 동일성을 가진 서열을 포함하는 것인 방법.
  65. 제57항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 우측 재조합효소 서열이 서열번호 21 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 동일성을 가진 서열을 포함하는 것인 방법.
  66. 제53항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 클래스 II 타입 V Cas 이펙터가 Cas12k 이펙터가 아닌 것인 방법.
  67. 제53항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 클래스 II 타입 V Cas 이펙터 및 상기 Tn7 타입 전위효소 복합체가 약 10 킬로염기 미만을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩되는 것인 방법.
  68. 카고 뉴클레오타이드 서열을 표적 핵산 부위로 전위시키는 시스템으로서,
    Tn7 타입 전위효소 복합체와 상호작용하도록 구성된 카고 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 이중 가닥 핵산;
    클래스 I 타입 I-F Cas 이펙터, 및 상기 표적 뉴클레오타이드 서열에 하이브리드화하도록 구성된 조작된 가이드 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 Cas 이펙터 복합체; 및
    상기 Cas 이펙터 복합체에 결합하도록 구성되고 TnsA 서브유닛을 포함하는 Tn7 타입 전위효소 복합체
    를 포함하는 시스템.
  69. 제68항에 있어서, 상기 전위효소 복합체가 상기 Cas 이펙터 복합체에 비공유 결합하는 것인 시스템.
  70. 제68항에 있어서, 상기 전위효소 복합체가 상기 Cas 이펙터 복합체에 공유 결합하는 것인 시스템.
  71. 제70항에 있어서, 상기 전위효소 복합체가 단일 폴리펩티드에서 상기 Cas 이펙터 복합체에 융합되는 것인 시스템.
  72. 제68항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 카고 뉴클레오타이드 서열이 좌측 전위효소 인식 서열 및 우측 전위효소 인식 서열에 의해 플랭킹되는 것인 시스템.
  73. 제68항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 핵산 부위를 포함하는 제2 이중 가닥 핵산을 추가로 포함하는 시스템.
  74. 제68항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 핵산 부위에 인접한 상기 Cas 이펙터 복합체와 호환되는 PAM 서열을 추가로 포함하는 시스템.
  75. 제74항에 있어서, 상기 PAM 서열이 상기 표적 핵산 부위의 3'에 위치하는 것인 시스템.
  76. 제74항에 있어서, 상기 PAM 서열이 상기 표적 핵산 부위의 5'에 위치하는 것인 시스템.
  77. 제68항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 가이드 폴리뉴클레오타이드가 상기 클래스 I 타입 I-F Cas 이펙터에 결합하도록 구성된 것인 시스템.
  78. 제68항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 클래스 I 타입 I-F Cas 이펙터가 서열번호 41 내지 43 또는 48 내지 50 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 동일성을 가진 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 것인 시스템.
  79. 제68항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Tn7 타입 전위효소 복합체가 서열번호 44 내지 46 또는 51 내지 53 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 동일성을 가진 서열을 포함하는 적어도 1개, 적어도 2개 또는 3개의 폴리펩티드(들)를 포함하는 것인 시스템.
  80. 카고 뉴클레오타이드 서열을, 표적 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 표적 핵산 부위로 전위시키는 방법으로서, 세포 내에서 제68항 내지 제79항 중 어느 한 항의 시스템을 발현시키거나 제68항 내지 제79항 중 어느 한 항의 시스템을 세포에 도입하는 단계를 포함하는 방법.
  81. 카고 뉴클레오타이드 서열을 표적 핵산 부위로 전위시키는 시스템으로서,
    Tn7 타입 전위효소 복합체와 상호작용하도록 구성된 카고 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 이중 가닥 핵산;
    클래스 II 타입 V Cas 이펙터, 및 상기 표적 뉴클레오타이드 서열에 하이브리드화하도록 구성된 조작된 가이드 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 Cas 이펙터 복합체; 및
    상기 Cas 이펙터 복합체에 결합하도록 구성되고 TnsB, TnsC 및 TniQ 구성요소를 포함하는 Tn7 타입 전위효소 복합체
    를 포함하고, 이때 (a) 상기 클래스 II 타입 V Cas 이펙터가 서열번호 22, 26, 30, 34, 55 내지 89, 104 또는 147 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 가진 서열을 가진 폴리펩티드를 포함하거나;
    (b) 상기 Tn7 타입 전위효소 복합체가 서열번호 23 내지 25, 27 내지 29, 31 내지 33, 35 내지 37, 101 내지 103, 105 내지 107 또는 148 내지 150 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 가진 서열을 가진 TnsB, TnsC 또는 TniQ 구성요소를 포함하는 것인 시스템.
  82. 제81항에 있어서, 상기 전위효소 복합체가 상기 Cas 이펙터 복합체에 비공유 결합하는 것인 시스템.
  83. 제81항에 있어서, 상기 전위효소 복합체가 상기 Cas 이펙터 복합체에 공유 결합하는 것인 시스템.
  84. 제83항에 있어서, 상기 전위효소 복합체가 단일 폴리펩티드에서 상기 Cas 이펙터 복합체에 융합되는 것인 시스템.
  85. 제81항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 클래스 II 타입 V Cas 이펙터가 서열번호 22, 26, 30, 34, 55 내지 89, 104 또는 147 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 가진 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 것인 시스템.
  86. 제81항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Tn7 타입 전위효소 복합체가 서열번호 23 내지 25, 27 내지 29, 31 내지 33, 35 내지 37, 101 내지 103, 105 내지 107 또는 148 내지 150 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 가진 서열을 포함하는 TnsB, TnsC 또는 TniQ 구성요소를 포함하는 것인 시스템.
  87. 제81항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 클래스 II 타입 V Cas 이펙터가 Cas12k 이펙터인 시스템.
  88. 제81항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 카고 뉴클레오타이드 서열이 좌측 전위효소 인식 서열 및 우측 전위효소 인식 서열에 의해 플랭킹되는 것인 시스템.
  89. 제81항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 핵산 부위를 포함하는 제2 이중 가닥 핵산을 추가로 포함하는 시스템.
  90. 제81항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 핵산 부위에 인접한 상기 Cas 이펙터 복합체와 호환되는 PAM 서열을 추가로 포함하는 시스템.
  91. 제90항에 있어서, 상기 PAM 서열이 상기 표적 핵산 부위의 5'에 위치하는 것인 시스템.
  92. 제91항에 있어서, 상기 PAM 서열이 5'-nGTn-3' 또는 5'-nGTt-3'을 포함하는 것인 시스템.
  93. 제81항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 가이드 폴리뉴클레오타이드가 상기 클래스 II 타입 V Cas 이펙터에 결합하도록 구성된 것인 시스템.
  94. 제81항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TnsB, TnsC 및 TniQ 구성요소가 각각 서열번호 23 내지 25, 27 내지 29, 31 내지 33, 35 내지 37, 101 내지 103, 105 내지 107 또는 148 내지 150 중 어느 하나에 대해 적어도 80% 동일성을 가진 서열을 가진 폴리펩티드를 포함하는 것인 시스템.
  95. 제81항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 가이드 폴리뉴클레오타이드가 서열번호 90, 91, 92, 93, 117, 151, 156 내지 181 또는 209 내지 234 중 어느 하나에 대해 적어도 80% 동일성을 가진 적어도 약 46개 내지 80개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 서열을 포함하는 것인 시스템.
  96. 제81항 내지 제95항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 가이드 폴리뉴클레오타이드가 서열번호 111 내지 114 또는 201 내지 206, 255, 262, 256, 209, 257, 263, 258, 210 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 가진 서열을 포함하는 것인 시스템.
  97. 제88항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 좌측 재조합효소 서열이 서열번호 125, 127, 123, 129, 131, 133, 153 또는 134 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 동일성을 가진 서열을 포함하는 것인 시스템.
  98. 제88항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 우측 재조합효소 서열이 서열번호 126, 155, 128, 124, 130, 132 또는 154 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 동일성을 가진 서열을 포함하는 것인 시스템.
  99. 제81항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 클래스 II 타입 V Cas 이펙터 및 상기 Tn7 타입 전위효소 복합체가 약 10 킬로염기 미만을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩되는 것인 시스템.
  100. 제81항 또는 제88항에 있어서,
    (a) 상기 클래스 II 타입 V Cas 이펙터가 서열번호 22 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 가진 서열을 포함하거나;
    (b) 상기 좌측 재조합효소 서열이 서열번호 125 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 가진 서열을 포함하거나;
    (c) 상기 우측 재조합효소 서열이 서열번호 126 또는 155, 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 동일성을 가진 서열을 포함하거나;
    (d) 상기 조작된 가이드 폴리뉴클레오타이드가 (i) 서열번호 90의 적어도 약 46개 내지 60개의 뉴클레오타이드에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 가진 서열을 포함하거나, (ii) 서열번호 94, 112 또는 202 중 어느 하나의 비-축퇴 뉴클레오타이드에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 가진 서열을 포함하거나;
    (e) 상기 TnsB, TnsC 및 TniQ 구성요소가 서열번호 23 내지 25 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 가진 서열을 포함하는 것인 시스템.
  101. 제81항 또는 제88항에 있어서,
    (a) 상기 클래스 II 타입 V Cas 이펙터가 서열번호 26 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 가진 서열을 포함하거나;
    (b) 상기 좌측 재조합효소 서열이 서열번호 127 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 가진 서열을 포함하거나;
    (c) 상기 우측 재조합효소 서열이 서열번호 128 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 가진 서열을 포함하거나;
    (d) 상기 조작된 가이드 폴리뉴클레오타이드가 (i) 서열번호 91, 156 또는 209 중 어느 하나의 적어도 약 46개 내지 60개의 뉴클레오타이드에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 가진 서열을 포함하거나, (ii) 서열번호 95, 113 또는 203 중 어느 하나의 비-축퇴 뉴클레오타이드에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 가진 서열을 포함하거나;
    (e) 상기 TnsB, TnsC 및 TniQ 구성요소가 서열번호 27 내지 29 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 가진 서열을 포함하는 것인 시스템.
  102. 제81항 또는 제88항에 있어서,
    (a) 상기 클래스 II 타입 V Cas 이펙터가 서열번호 60 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 가진 서열을 포함하거나;
    (b) 상기 좌측 재조합효소 서열이 서열번호 131 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 가진 서열을 포함하거나;
    (c) 상기 우측 재조합효소 서열이 서열번호 132 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 가진 서열을 포함하거나;
    (d) 상기 조작된 가이드 폴리뉴클레오타이드가 (i) 서열번호 117, 161 또는 214 중 어느 하나의 적어도 약 46개 내지 60개의 뉴클레오타이드에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 가진 서열을 포함하거나, (ii) 서열번호 119의 비-축퇴 뉴클레오타이드에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 가진 서열을 포함하거나;
    (e) 상기 TnsB, TnsC 및 TniQ 구성요소가 서열번호 101 내지 103 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 가진 서열을 포함하는 것인 시스템.
  103. 제81항 또는 제88항에 있어서,
    (a) 상기 클래스 II 타입 V Cas 이펙터가 서열번호 147 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 가진 서열을 포함하거나;
    (b) 상기 좌측 재조합효소 서열이 서열번호 153 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 가진 서열을 포함하거나;
    (c) 상기 우측 재조합효소 서열이 서열번호 154 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 가진 서열을 포함하거나;
    (d) 상기 조작된 가이드 폴리뉴클레오타이드가 (i) 서열번호 151, 181 또는 234 중 어느 하나의 적어도 약 46개 내지 60개의 뉴클레오타이드에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 가진 서열을 포함하거나, (ii) 서열번호 152 또는 254의 비-축퇴 뉴클레오타이드에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 가진 서열을 포함하거나;
    (e) 상기 TnsB, TnsC 및 TniQ 구성요소가 서열번호 148 내지 150 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 가진 서열을 포함하는 것인 시스템.
  104. 제81항 또는 제88항에 있어서,
    (a) 상기 클래스 II 타입 V Cas 이펙터가 서열번호 34 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 가진 서열을 포함하거나;
    (b) 상기 좌측 재조합효소 서열이 서열번호 129 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 가진 서열을 포함하거나;
    (c) 상기 우측 재조합효소 서열이 서열번호 130 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 가진 서열을 포함하거나;
    (d) 상기 조작된 가이드 폴리뉴클레오타이드가 (i) 서열번호 93, 157 또는 210 중 어느 하나의 적어도 약 46개 내지 60개의 뉴클레오타이드에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 가진 서열을 포함하거나, (ii) 서열번호 97, 114 또는 204 중 어느 하나의 비-축퇴 뉴클레오타이드에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 가진 서열을 포함하거나;
    (e) 상기 TnsB, TnsC 및 TniQ 구성요소가 서열번호 148 내지 150 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 가진 서열을 포함하는 것인 시스템.
  105. 제81항, 제88항 및 제91항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 상기 클래스 II 타입 V Cas 이펙터가 서열번호 30 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 가진 서열을 포함하거나;
    (b) 상기 좌측 재조합효소 서열이 서열번호 123 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 가진 서열을 포함하거나;
    (c) 상기 우측 재조합효소 서열이 서열번호 124 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 동일성을 가진 서열을 포함하거나;
    (d) 상기 조작된 가이드 폴리뉴클레오타이드가 (i) 서열번호 92의 적어도 약 46개 내지 80개의 뉴클레오타이드에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 가진 서열을 포함하거나, (ii) 서열번호 111 또는 201의 비-축퇴 뉴클레오타이드에 대해 적어도 80% 동일성을 가진 서열을 포함하거나;
    (e) 상기 TnsB, TnsC 및 TniQ 구성요소가 서열번호 31, 32 및 33, 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 동일성을 가진 서열을 가진 폴리펩티드를 포함하거나;
    (f) 상기 PAM 서열이 5'-nGTn-3' 또는 5'-nGTt-3'을 포함하는 것인 시스템.
  106. 카고 뉴클레오타이드 서열을 표적 핵산 부위로 전위시키는 시스템으로서,
    Tn7 타입 전위효소 복합체와 상호작용하도록 구성된 카고 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 이중 가닥 핵산;
    클래스 II 타입 V Cas 이펙터, 및 상기 표적 뉴클레오타이드 서열에 하이브리드화하도록 구성된 조작된 가이드 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 Cas 이펙터 복합체; 및
    상기 Cas 이펙터 복합체에 결합하도록 구성되고 TnsB 및 TnsC 구성요소를 포함하지만 TnsA 및/또는 TniQ 구성요소를 포함하지 않는 Tn7 타입 전위효소 복합체
    를 포함하는 시스템.
  107. 제106항에 있어서, 상기 전위효소 복합체가 상기 Cas 이펙터 복합체에 비공유 결합하는 것인 시스템.
  108. 제106항에 있어서, 상기 전위효소 복합체가 상기 Cas 이펙터 복합체에 공유 결합하는 것인 시스템.
  109. 제108항에 있어서, 상기 전위효소 복합체가 단일 폴리펩티드에서 상기 Cas 이펙터 복합체에 융합되는 것인 시스템.
  110. 제106항 내지 제109항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Tn7 타입 전위효소 복합체가 서열번호 39, 40, 109 또는 110 중 어느 하나에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 가진 서열을 가진 폴리펩티드를 포함하는 것인 시스템.
  111. 제106항 내지 제110항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TnsB 구성요소가 서열번호 40 또는 109에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 가진 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 것인 시스템.
  112. 제106항 내지 제111항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TnsC 구성요소가 서열번호 39 또는 110에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 가진 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 것인 시스템.
  113. 제106항 내지 제112항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 클래스 II 타입 V Cas 이펙터가 Cas12k 이펙터인 시스템.
  114. 제106항 내지 제112항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 클래스 II 타입 V Cas 이펙터가 서열번호 38 또는 서열번호 108에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 가진 서열을 포함하는 것인 시스템.
  115. 제106항 내지 제114항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 카고 뉴클레오타이드 서열이 좌측 전위효소 인식 서열 및 우측 전위효소 인식 서열에 의해 플랭킹되는 것인 시스템.
  116. 제106항 내지 제115항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 핵산 부위를 포함하는 제2 이중 가닥 핵산을 추가로 포함하는 시스템.
  117. 제106항 내지 제116항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 핵산 부위를 포함하는 상기 이중 가닥 핵산 또는 상기 시스템이 세포 내부에 있는 것인 시스템.
  118. 제106항 내지 제117항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 핵산 부위에 인접한 상기 Cas 이펙터 복합체와 호환되는 PAM 서열을 추가로 포함하는 시스템.
  119. 제118항에 있어서, 상기 PAM 서열이 상기 표적 핵산 부위의 5'에 위치하는 것인 시스템.
  120. 제106항 내지 제119항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 가이드 폴리뉴클레오타이드가 상기 클래스 II 타입 V Cas 이펙터에 결합하도록 구성된 것인 시스템.
  121. 제106항 내지 제120항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TnsB 및 TnsC 구성요소가 각각 서열번호 40 및 39 또는 109 및 110에 대해 적어도 80% 동일성을 가진 서열을 가진 폴리펩티드를 포함하는 것인 시스템.
  122. 제106항 내지 제121항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 가이드 폴리뉴클레오타이드가 서열번호 118, 182, 183, 235 또는 236 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 동일성을 가진 적어도 약 46개 내지 80개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 서열을 포함하는 것인 시스템.
  123. 제106항 내지 제121항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 가이드 폴리뉴클레오타이드가 서열번호 115, 116, 205, 206, 261, 235, 260 또는 236 중 어느 하나 또는 이의 변이체의 비-축퇴 뉴클레오타이드에 대해 적어도 80% 동일성을 가진 서열을 포함하는 것인 시스템.
  124. 제115항 내지 제123항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 좌측 재조합효소 서열이 서열번호 134에 대해 적어도 80% 동일성을 가진 서열을 포함하는 것인 시스템.
  125. 제115항 내지 제124항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 우측 재조합효소 서열이 서열번호 135 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 동일성을 가진 서열을 포함하는 것인 시스템.
  126. 제106항 내지 제125항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 클래스 II 타입 V Cas 이펙터 및 상기 Tn7 타입 전위효소 복합체가 약 10 킬로염기 미만을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩되는 것인 시스템.
  127. 제106항 또는 제115항에 있어서,
    (a) 상기 클래스 II 타입 V Cas 이펙터가 서열번호 38 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 가진 서열을 포함하거나;
    (b) 상기 좌측 재조합효소 서열이 서열번호 134 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 가진 서열을 포함하거나;
    (c) 상기 우측 재조합효소 서열이 서열번호 135 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 동일성을 가진 서열을 포함하거나;
    (d) 상기 조작된 가이드 폴리뉴클레오타이드가 (i) 서열번호 182 또는 235의 적어도 약 46개 내지 80개의 뉴클레오타이드에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 가진 서열을 포함하거나, (ii) 서열번호 98, 115, 116, 205 또는 206의 비-축퇴 뉴클레오타이드에 대해 적어도 80% 동일성을 가진 서열을 포함하거나;
    (e) 상기 TnsB 및 TnsC 구성요소가 서열번호 40 및 39 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 동일성을 가진 서열을 가진 폴리펩티드를 포함하는 것인 시스템.
  128. 카고 뉴클레오타이드 서열을, 표적 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 표적 핵산 부위로 전위시키는 방법으로서, 세포 내에서 제81항 내지 제127항 중 어느 한 항의 시스템을 발현시키거나 제81항 내지 제127항 중 어느 한 항의 시스템을 세포에 도입하는 단계를 포함하는 방법.
  129. RuvC 도메인 및 HNH 도메인을 포함하는 엔도뉴클레아제; 및 조작된 가이드 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 조작된 뉴클레아제 시스템으로서, 상기 엔도뉴클레아제가 배양되지 않은 미생물로부터 유래하고, 상기 엔도뉴클레아제가 서열번호 1 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 동일성을 가진 서열을 포함하는 클래스 II 타입 II 엔도뉴클레아제이고, 상기 조작된 가이드 RNA가 상기 엔도뉴클레아제와 복합체를 형성하도록 구성되고, 상기 조작된 가이드 RNA가 표적 핵산 서열에 하이브리드화하도록 구성된 스페이서 서열을 포함하는 것인 조작된 뉴클레아제 시스템.
  130. 제129항에 있어서, 상기 조작된 가이드 폴리뉴클레오타이드가 서열번호 12 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 동일성을 가진 적어도 60개 내지 80개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 것인 조작된 뉴클레아제 시스템.
  131. 제129항 또는 제130항에 있어서, 상기 조작된 가이드 폴리뉴클레오타이드가 서열번호 11 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 동일성을 가진 서열을 포함하는 것인 조작된 뉴클레아제 시스템.
  132. RuvC 도메인을 포함하는 엔도뉴클레아제; 및 조작된 가이드 RNA를 포함하는 조작된 뉴클레아제 시스템으로서, 상기 엔도뉴클레아제가 배양되지 않은 미생물로부터 유래하고, 상기 엔도뉴클레아제가 서열번호 5에 대해 적어도 80% 동일성을 가진 클래스 II 타입 V 엔도뉴클레아제이고, 상기 조작된 가이드 RNA가 상기 엔도뉴클레아제와 복합체를 형성하도록 구성되고, 상기 조작된 가이드 RNA가 표적 핵산 서열에 하이브리드화하도록 구성된 스페이서 서열을 포함하는 것인 조작된 뉴클레아제 시스템.
  133. 제132항에 있어서, 상기 조작된 가이드 폴리뉴클레오타이드가 서열번호 13 내지 16 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 동일성을 가진 적어도 약 46개 내지 80개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 서열을 포함하는 것인 조작된 뉴클레아제 시스템.
  134. RuvC 도메인을 포함하는 엔도뉴클레아제; 및 조작된 가이드 RNA를 포함하는 조작된 뉴클레아제 시스템으로서, 상기 엔도뉴클레아제가 배양되지 않은 미생물로부터 유래하고, 상기 엔도뉴클레아제가 서열번호 22, 26, 30, 34, 55 내지 89, 104 또는 147 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 동일성을 가진 클래스 II 타입 V-K 엔도뉴클레아제이고, 상기 조작된 가이드 RNA가 상기 엔도뉴클레아제와 복합체를 형성하도록 구성되고, 상기 조작된 가이드 RNA가 표적 핵산 서열에 하이브리드화하도록 구성된 스페이서 서열을 포함하는 것인 조작된 뉴클레아제 시스템.
  135. 제134항에 있어서, 상기 조작된 가이드 폴리뉴클레오타이드가 서열번호 90, 91, 92, 93, 117, 151, 156 내지 181 또는 209 내지 234 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 동일성을 가진 적어도 약 46개 내지 80개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 서열을 포함하는 것인 조작된 뉴클레아제 시스템.
  136. 제134항 또는 제135항에 있어서, 상기 조작된 가이드 폴리뉴클레오타이드가 서열번호 111 내지 114 또는 201 내지 206, 255, 262, 256, 209, 257, 263, 258, 210 중 어느 하나 또는 이의 변이체의 비-축퇴 뉴클레오타이드에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 가진 서열을 포함하는 것인 조작된 뉴클레아제 시스템.
  137. RuvC 도메인을 포함하는 엔도뉴클레아제; 및 조작된 가이드 RNA를 포함하는 조작된 뉴클레아제 시스템으로서, 상기 엔도뉴클레아제가 배양되지 않은 미생물로부터 유래하고, 상기 엔도뉴클레아제가 서열번호 38 또는 서열번호 108 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 동일성을 가진 클래스 II 타입 V-K 엔도뉴클레아제이고, 상기 조작된 가이드 RNA가 상기 엔도뉴클레아제와 복합체를 형성하도록 구성되고, 상기 조작된 가이드 RNA가 표적 핵산 서열에 하이브리드화하도록 구성된 스페이서 서열을 포함하는 것인 조작된 뉴클레아제 시스템.
  138. 제137항에 있어서, 상기 조작된 가이드 폴리뉴클레오타이드가 서열번호 118, 182, 183, 235 또는 236 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 동일성을 가진 적어도 약 46개 내지 80개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 서열을 포함하는 것인 조작된 뉴클레아제 시스템.
  139. 제137항에 있어서, 상기 조작된 가이드 폴리뉴클레오타이드가 서열번호 111 내지 114 또는 201 내지 206, 255, 262, 256, 209, 257, 263, 258, 210, 115, 116, 205, 206, 261, 235, 260 또는 236 중 어느 하나 또는 이의 변이체의 비-축퇴 뉴클레오타이드에 대해 적어도 80% 동일성을 가진 서열을 포함하는 것인 조작된 뉴클레아제 시스템.
  140. 서열번호 41 내지 43 또는 48 내지 50 중 어느 하나 또는 이의 변이체에 대해 적어도 80% 동일성을 가진 서열을 포함하는 적어도 하나의 Cas6, Cas7 또는 Cas8 폴리펩티드를 포함하는 클래스 I 타입 I-F Cas 엔도뉴클레아제; 및 조작된 가이드 RNA를 포함하는 조작된 뉴클레아제 시스템으로서, 상기 조작된 가이드 RNA가 상기 엔도뉴클레아제와 복합체를 형성하도록 구성되고, 상기 조작된 가이드 RNA가 표적 핵산 서열에 하이브리드화하도록 구성된 스페이서 서열을 포함하는 것인 조작된 뉴클레아제 시스템.
  141. 제140항에 있어서, 상기 조작된 가이드 폴리뉴클레오타이드가 서열번호 121, 122, 207 또는 208 중 어느 하나의 비-축퇴 뉴클레오타이드에 대해 적어도 80% 동일성을 가진 서열을 포함하는 것인 조작된 뉴클레아제 시스템.
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