KR101926662B1 - 닫힌 선형 ｄｎａ의 제조 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 (a) 주형의 증폭을 촉진시키는 조건 하에, 하나 이상의 프로텔로머라제 타겟 서열을 포함하는 DNA 주형과, 1종 이상의 DNA 중합효소를, 하나 이상의 프라이머 존재 중에 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 (a)에서 제조되는 증폭된 DNA에, 1종 이상의 프로텔로머라제를 닫힌 선형 DNA의 제조를 촉진하는 조건 하에 접촉시키는 단계를 포함하는, 닫힌 선형(closed linear) 데옥시리보핵산(DNA)의 시험관내 무세포성 제조 방법을 제공한다. 상기 방법에 필요한 성분을 제공하는 키트에 관한 것이다.

Description

닫힌 선형 ＤＮＡ의 제조{PRODUCTION OF CLOSED LINEAR DNA}
본 발명은 닫힌 선형 데옥시리보핵산(DNA)의 시험관내 무세포성 제조 방법에 관한 것이다.
DNA를 대량으로 증폭하기 위한 전통적인 세포 기반의 프로세스는 비용이 많이 든다. 예를 들어, 박테리아를 사용하려면 배양물의 오염을 방지하기 위해 무균 상태 유지에 필요한 값비싼 발효기에서의 대규모 증식이 필요하다. 또한, 증폭된 DNA를 방출시키기 위해서는 박테리아를 용혈시켜야 하며, DNA를 그외 박테리아 성분들로부터 세정하여 정제하여야 한다. 특히, DNA 백신 또는 다른 DNA 치료제를 제조하는 경우에는, 고순도를 얻기 위해 포유류에 유해한 내독소가 존재하지 않도록 제거하는 과정이 필요하다.
박테리아를 사용하는 경우, 비용 문제 외에도, 많은 경우에, 증폭 프로세스의 충실성에 어려움이 존재할 수 있다. 박테리아 세포의 복잡한 생화학적 환경에서는 원하는 DNA 산물의 질과 수율을 조절하기 어렵다. 박테리아에서는 때때로 증폭된 DNA 내부에 클로닝된 필요한 유전자가 변이되어, 원하는 목적에 무익해질 수 있다. 또한, 재조합 현상은 대상 DNA의 정확한 제조에 문제를 초래할 수 있다. DNA를 증폭하기 위한 무세포성 효소학적 프로세스는 숙주 세포를 사용하는 경우에 수반되는 요건을 피할 수 있어, 유익하다.
예컨대, 의약용 DNA 카세트의 제조는 거의 전적으로 박테리아의 플라스미드내 삽입과 박테리아 발효 프로세스에서의 이의 증폭에 의존한다.
당해 기술 분야의 이러한 현황은 여러가지 방식으로 DNA 의약제의 제조 방법을 개선시킬 수 있는 기회를 제한하고 있다. 또한, 플라스미드 산물은, 의약적 기능에 불필요한 뉴클레오티드 서열을 포함하고 있다는 점에서, 본질적으로 조산물 DNA 분자이다. 즉, DNA 의약제와 같은 DNA 산물을 제조하는 분야에서는, DNA를 대량으로 증폭시키기 위한 개선된 방법이 요구되고 있다. 특히, 닫힌 선형 DNA와 같이, 특정 형태의 DNA를 증폭시키기 위한 개선된 방법이 요구되고 있다. 닫힌 선형 DNA 분자는, 다른 형태의 DNA에 비해 개선된 안정성과 안전성을 가지고 있기 때문에, 치료학적 활용에 특히 유용하다.
본 발명은 공유 결합으로 닫힌 선형 DNA(닫힌 선형 DNA)의 시험관내 무세포성 제조 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은, 세포성 프로세스와 플라스미드에서의 증폭으로 구성되는 현 방법과 비교하여, 공유 결합으로 닫힌 선형 DNA의 생산을 증진시킬 수 있다. 이는 산물의 정제 비용을 감소시키면서 제조 생산성은 크게 증가시킨다.
본 발명에서, DNA 주형으로부터 공유 결합으로 닫힌 선형 DNA를 제조하는 것은 숙주 세포 없이 효소학적으로 수행된다. 주형 DNA는 하나 이상의 프로텔로머라제 타겟 서열을 포함한다. 주형 DNA는 주형의 증폭을 촉진하는 조건 하에서 하나 이상의 프라이머의 존재 하에 1종 이상의 DNA 중합효소와 접촉된다. 주형으로부터 증폭된 DNA는 닫힌 선형 DNA의 제조를 촉진하는 조건 하에서 1종 이상의 프로텔로머라제와 접촉된다.
이에, 본 발명은,
(a) 1종 이상의 프로텔로머라제 타겟 서열을 포함하는 DNA 주형을, 1종 이상의 DNA 중합효소와, 상기 주형의 증폭을 촉진하는 조건 하에, 하나 이상의 프라이머의 존재 하에서 접촉시키는 단계;
(b) (a)에서 제조된 증폭된 DNA를 1종 이상의 프로텔로머라제와, 닫힌 선형 DNA의 제조를 촉진시키는 조건 하에 접촉시키는 단계를 포함하는 닫힌 선형 데옥시리보핵산(DNA)의 시험관내 무세포성 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 방법에 필요한 구성 성분을 제공하는 키트에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 1종 이상의 DNA 중합효소와 1종 이상의 프로텔로머라제를 포함하는 키트 및 본 발명의 방법의 사용 설명서를 제공한다.
도 1: 박테리오파지에서의 공유 결합으로 닫힌 선형 DNA의 복제 및 프로텔로머라제의 역할. A. 염색체외 박테리오파지의 공유 결합으로 닫힌 선형 DNA에 대한 묘사. * = 텔로미어의 팔린드롬 서열(palindromic sequence)의 센터. R 서열은 L 서열이 역위된 팔린드롬 반복체이다. B. 숙주에서의 박테리오파지 DNA의 복제: 버블은 DNA 가닥 복제를 나타낸다. R 및 L에 상보적인 가닥의 합성으로 이중 가닥 RL 서열이 만들어진다. C. 프로텔로머라제의 작용에 의해 생성되는 산물들. 프로텔로머라제는 RL 서열에 결합하여, 팔린드롬 서열의 중앙 포인트에서 가닥을 자르고 마주보고 있는 가닥을 연결함으로써, 텔로미어를 재형성하여, 공유 결합으로 닫힌 선형 오리지날 DNA의 복제를 완료한다.
도 2: 타겟 부위 telRL을 포함하고 있는 환형 이중 가닥 DNA에 대한 대장균(Escherichia coli) 파지 N15 프로텔로머라제(TelN)의 작용. TelRL은 화살표로 표시된 28 bp 우측(telR) 및 좌측(telL) 암을 가진 역위된 팔린드롬 구조이다. 밑줄 친 서열은 telRL 팔린드롬에서의 결함부를 나타낸다. 중앙의 22 bp의 완벽한 역위된 팔린드롬 Tel0는 효소 TelN이 결합하는데 필요한 부분이다. TelN이 이 22bp 서열의 중앙을 자르고, 상보적인 가닥들의 끝을 서로 연결하여 공유적으로 닫힌 말단부를 만든다.
도 3: 다양한 유기체들에서 발견되는 프로텔로머라제 타겟 서열들의 비교. 박스 친 서열은 완벽한 또는 불완전한 팔린드롬 서열 범위이다. 밑줄은 팔린드롬에서 불완전한 부분을 나타낸다. 강조된 염기쌍 서열은 프로텔로머라제 타겟 서열들 모두에서 공통되는 서열이며, 프로텔로머라제의 결합과 작용에 중요한 부분임을 시사한다. A. 대장균(Escherichia coli) 파지 N15. B. 클렙시엘라(Klebsiella) 파지 Phi KO2. C. 예르시니아(Yersinia) 파지 Py54. D. 할로모나스(Halomonas) 파지 Phi HAP. E. 비브리오(Vibrio) VP882. F. 보렐리아 부르그도르페리(Borrelia burgdorferi) 플라스미드 lpB31.16. 박스 친 서열은 각 박테리오파지에서의 완벽한 또는 불완전한 팔린드롬 서열 범위이다. G. 박테리오파지의 프로텔로머라제가 결합하고 작용하는 컨센서스 역위 팔린드롬 서열을 나타낸다. 이것은 22bp의 완벽한 역위 반복체 서열(컷 부위의 양측 11 bp)이다. 컨센서스 서열은 A-E로 나타낸 강조된 보존 잔기들로부터 유래된다. 보존된 염기쌍과 이의 팔린드롬내 위치가 표시되어 있다. -는 염기가 N(A, T, C 또는 G)일 수 있는, 서열 조성에서의 융통성(flexibility)을 나타낸다.
도 4: RCA 가닥 치환 DNA 중합효소를 TelN 프로텔로머라제와 조합하여 이용한, 공유 결합으로 닫힌 선형 이중 가닥 DNA의 특이적인 시험관내 증폭 공정. A. 닫힌 선형 DNA 주형. R과 L은 TelN 프로텔로머라제 결합 서열의 우측 암과 좌측 암의 DNA 서열이다. B. 환형 단일 가닥 DNA를 형성하기 위한 출발 주형의 변성. C. 프라이머 결합. D-E. RCA 가닥 치환 DNA 중합효소에 의한 단일 가닥 DNA 주형으로부터의 롤링 써클 증폭. F. 프로텔로머라제 결합 서열(RL)에 의해, 분리되어 있는 증폭된 단일 주형 유닛들로 구성된, 긴 콘카타머(concatamer) 이중 가닥 DNA의 생성. G. RL 서열에 특이적인 TelN 프로텔로머라제의 접촉. 프로텔로머라제는 콘카타머 DNA를 RL 부위에서 자르고, 상보적인 가닥끼리 연결함으로써, 공유 결합으로 닫힌 오리지날 선형 DNA 주형을 증폭된 카피로 제조한다.
도 5: 닫힌 선형 DNA 카세트를 제조하기 위한 긴 이중 가닥 DNA 분자로부터 대상 유전자를 발현하는 DNA 카세트의 적출. A. 프로텔로머라제 타겟 서열이 측면에 있는 대상 유전자를 포함하는 DNA 카세트를 함유한 선형 이중 가닥 DNA 분자. B. 공유 결합으로 닫힌 선형 DNA 분자로서 DNA 카세트의 적출.
도 6: "doggybone" 발현 카세트에서의 닫힌 선형 DNA의 증폭 및 리포터 유전자의 발현
A. RCA로 증폭시킨 콘카타머를 TelN 절단하여, 닫힌 선형 DNA가 형성됨을 아가로스 겔 전기영동으로 검증한 것임. 레인 1 - 3은 RCA로 증폭시킨 pUC18이다. 레인 1: RCA로 증폭시킨 pUC18의 비절단물 3 ㎕. 레인 2: RCA로 증폭시킨 pUC18의 Pvu1 절단물 2 ㎕. 레인 3: RCA로 증폭시킨 pUC18의 TelN 처리물 2 ㎕(음성 대조군). 레인 4-6은 RCA로 증폭시킨 pUC18 telRL이다. 레인 4: RCA로 증폭시킨 pUC18 telRL 비절단물 3 ㎕. 레인 5: RCA로 증폭시킨 pUC18 telRL의 Pvu1 절단물 2 ㎕. 레인 6: RCA로 증폭시킨 pUC18 telRL의 TelN 절단물 4 ㎕. TelN 처리시 2.7 kb의 닫힌 선형 DNA가 제조되는 것으로 보여진다. 양 옆 레인은 DNA 크기 마커이다.
B. 닫힌 선형 DNA가 열 변성에 내성임을 보여주는 랩 온 어 칩(LOC: Lab-On-A-Chip) 분석. 레인 1: DNA 크기 마커, 레인 2 및 3: 100 ng PCR DOG. 레인 4 및 5: 100 ng의 변성된 PCR DOG. 레인 6 및 7: "doggybone" DNA - TelN 처리한 pGL DOG 100 ng. 레인 6 및 7: "doggybone DNA" - TelN 처리하고 변성시킨 pGL DOG 100 ng.
C. 형질전환에 의한 세포 안에서의 닫힌 선형 DNA의 발현 검증. y 축: Firefly/Renilla 평균비(mean ratio); x 축: 형질전환에 사용된 선형 DNA 구조체들. PCR pGL: luc 유전자를 포함하는, pGL4.13 유래의 개방형 선형 PCR 단편. PCR DOG: telRL 부위의 측면 프라이머를 이용하여 pGL DIG로부터 증폭시킨 개방형 선형 PCR 단편. "doggy MP": (벡터 DNA 오염을 제거하기 위해) PvuI으로 절단하고 TelN으로 절단한, 미니-프랩 DNA로부터 분리된 pGL DOG의 닫힌 선형 DNA. "doggy RCA": PvuI으로 절단하고 TelN으로 절단한, pGL DOG 유래의 닫힌 선형 DNA.
서열 설명
서열번호 1은 바실러스 박테리오파지 phi29 DNA 중합효소의 핵산 서열이다.
서열번호 2는 서열번호 1에 의해 코딩되는 바실러스 박테리오파지 phi29 DNA 중합효소의 아미노산 서열이다.
서열번호 3은 피로코커스 sp Deep Vent DNA 중합효소의 아미노산 서열이다.
서열번호 4는 바실러스 스테아로서모필러스(Bacillus stearothermophilus) DNA 중합효소 I의 핵산 서열이다.
서열번호 5는 서열번호 4에 의해 코딩되는 바실러스 스테아로서모필러스(Bacillus stearothermophilus) DNA 중합효소 I의 아미노산 서열이다.
서열번호 6은 할로모나스 파지 phiHAP-1 프로텔로머라제 핵산 서열이다.
서열번호 7은 서열번호 6에 의해 코딩되는 할로모나스 파지 phiHAP-1 중합효소의 아미노산 서열이다.
서열번호 8은 예르시니아 파지 PY54의 프로텔로머라제 핵산 서열이다.
서열번호 9는 서열번호 8에 의해 코딩되는 예르시니아 파지 PY54의 프로텔로머라제 아미노산 서열이다.
서열번호 10은 크렙시엘라 파지 phiKO2의 프로텔로머라제 핵산 서열이다.
서열번호 11은 서열번호 10에 의해 코딩되는 크렙시엘라 파지 phiKO2의 프로텔로머라제 아미노산 서열이다.
서열번호 12는 비브리오 파지 VP882의 프로텔로머라제 핵산 서열이다.
서열번호 13은 서열번호 12에 의해 코딩되는 비브리오 파지 VP882의 프로텔로머라제 아미노산 서열이다.
서열번호 14는 대장균(Escherichia coli) 박테리오파지 N15의 프로텔로머라제(telN)와 이차 면역 억제자(cA)의 핵산 서열이다.
서열번호 15는 서열번호 14에 의해 코딩되는 대장균(Escherichia coli) 박테리오파지 N15의 프로텔로머라제(telN) 아미노산 서열이다.
서열번호 16은 박테리오파지 프로텔로머라제 타겟 서열에 존재하는 완벽한 역위 반복체의 컨센서스 핵산 서열이다.
서열번호 17은 E. coli 파지 N15 및 크렙시엘라 파지 phiKO2 유래의 22개의 염기로 구성된 완벽한 역위 반복체 핵산 서열이다.
서열번호 18은 예르시니아 파지 PY54 유래의 22개의 염기로 구성된 완벽한 역위 반복체 핵산 서열이다.
서열번호 19는 할로모나스 파지 phiHAP-1 유래의 22개의 염기로 구성된 완벽한 역위 반복체 핵산 서열이다.
서열번호 20은 비브리오 파지 VP882 유래의 22개의 염기로 구성된 완벽한 역위 반복체 핵산 서열이다.
서열번호 21은 보렐리아 부르그도르페리(Borrelia burgdorferi) 플라스미드 lpB31.16. 유래의 14개의 염기로 구성된 완벽한 역위 반복체 핵산 서열이다.
서열번호 22는 비브리오 파지 VP882 유래의 24개의 염기로 구성된 완벽한 역위 반복체 핵산 서열이다.
서열번호 23은 예르시니아 파지 PY54 유래의 42개의 염기로 구성된 완벽한 역위 반복체 핵산 서열이다.
서열번호 24는 할로모나스 파지 phiHAP-1 유래의 90개의 염기로 구성된 완벽한 역위 반복체 핵산 서열이다.
서열번호 25는 프로텔로머라제 타겟 서열을 포함하는 E. coli 파지 N15 유래의 핵산 서열이다.
서열번호 26은 프로텔로머라제 타겟 서열을 포함하는 크렙시엘라 파지 phiKO2 유래의 핵산 서열이다.
서열번호 27은 프로텔로머라제 타겟 서열을 포함하는 예르시니아 파지 PY54 유래의 핵산 서열이다.
서열번호 28은 프로텔로머라제 타겟 서열을 포함하는 비브리오 파지 VP882 유래의 핵산 서열이다.
서열번호 29는 프로텔로머라제 타겟 서열을 포함하는 보렐리아 부르그도르페리 플라스미드 lpB31.16 유래의 핵산 서열이다.
서열번호 30은 TelN 증폭용으로 사용되는 변형된 올리고뉴클레오티드 프라이머이다.
서열번호 31은 TelN 증폭용으로 사용되는 변형된 올리고뉴클레오티드 프라이머이다.
서열번호 32는 TelN 인지 부위 telRL을 포함하는 합성 올리고뉴클레오티드이다.
서열번호 33은 TelN 인지 부위 telRP를 포함하는 합성 올리고뉴클레오티드이다.
서열번호 34는 PCR DOG 증폭에 사용되는 프라이머 서열이다.
서열번호 35는 PCR DOG 증폭에 사용되는 프라이머 서열이다.
본 발명은 공유 결합으로 닫힌 선형 이중 가닥 DNA, 즉, 닫힌 선형 DNA 분자의 제조 방법에 관한 것이다. 닫힌 선형 DNA 분자는 전형적으로, 상보적인 DNA 가닥들 간의 염기쌍이 존재하지 않는 헤어핀 루프로서도 설명되는, 공유 결합으로 닫힌 말단을 포함한다. 헤어핀 루프는 상보적인 DNA 가닥들의 말단이 서로 연결된 형태이다. 이런 유형의 구조는 전형적으로 말단 뉴클레오티드들을 닫힌 구조로 차단시킴으로써 염색체 DNA의 소실 또는 손상을 방지하기 위하여, 염색체의 텔로미어 말단에서 이루어진다. 본원에 기술된 닫힌 선형 DNA 분자의 예로서, 헤어핀 루프는 "doggy-bone" 형태의 구조를 형성하는, 상보적인 염기쌍을 이룬 DNA 가닥의 측면에 위치한다(도 1).
본 발명의 방법은, 증폭된 DNA를 닫힌 선형 DNA로 변형시키는 단일 단계 처리 공정을 병합함으로써, 닫힌 선형 DNA 분자의 고속 생산(throughput production)을 제공한다. 또한, 본 발명의 방법은 시험관내 무세포 환경에서 수행되므로, 이로써 박테리아 증식에 필수적인 외래 서열을 가진 DNA 주형의 사용으로 국한되지 않는다. 아래에서 개략적으로 설명되는 바와 같이, 본 발명의 방법은 문제가 되는 벡터 서열이 결여되어 있으며, 특히 치료학적 용도에 적합한, 닫힌 선형 DNA 분자를 제조하는데 이용할 수 있다.
닫힌 선형 DNA 분자는 특히 치료학적 제제, 즉 생체내에서 유전자 산물을 발현하는데 사용될 수 있는 DNA 의약제로서 유용성을 가진다. 이는, 이의 공유 결합으로 닫힌 구조가 엑소뉴클레아제와 같은 효소의 공격을 막음으로써, DNA 말단이 노출된 "개방형" DNA 분자와 비교하여 유전자 발현의 안정성과 수명을 증진시키기 때문이다. 말단이 개방된 선형 이중 가닥 카세트는 숙주 조직에 도입하였을 때 유전자 발현 측면에서 비효율적인 것으로 입증되었다. 이는 세포외 공간에서의 엑소뉴클레아제 작용으로 인한 카세트의 불안정성에 기인한다.
또한, 공유 결합으로 닫힌 구조로 차단된 DNA 말단은 다른 이점도 가진다. 이 DNA 말단은 게놈 DNA의 통합이 방지되므로, 닫힌 선형 DNA 분자는 안전성이 개선된 분자이다. 또한, 닫힌 선형 구조는 숙주 세포 안에서의 DNA 분자의 콘카타머화(concatamerisation)를 방지하므로, 보다 민감한 방식으로 유전자 산물의 발현 수준을 조절할 수 있다. 본 발명은 주형-특이적인 DNA 증폭 단계와 프로텔로머라제에 의한 증폭된 DNA의 특이적인 처리 단계를 포함하는, 닫힌 선형 DNA 분자의 시험관내 무세포성 제조 방법을 제공한다.
전형적으로, 본 발명의 방법은, 숙주 세포에서의 시험관내 발현을 위한 DNA 제조, 특히 DNA 백신에 이용할 수 있다. DNA 백신은 전형적으로 감염성 유기체의 DNA의 변형된 형태를 코딩한다. DNA 백신을 개체에게 투여하면, 개체에서 감염성 유기체의 선택된 단백질이 발현되고, 그 단백질에 대한 면역 반응, 통상적으로 예방적인 반응이 개시되게 된다. 또한, DNA 백신은 암 면역치료 방법의 경우 종양 항원을 코딩할 수도 있다.
DNA 백신은 암, 알레르기, 독성 및 병원체에 의한 감염 등을 비제한적으로 포함하는, 여러가지 상태를 치료 또는 예방하기 위한 항원을 코딩하는 핵산 서열을 포함하며, 상기 병원체로는, 진균, 인간 파필로마 바이러스(HPV), HIV, HSV2/HSV1, 인플루엔자 바이러스(A, B 및 C형), 폴리오바이러스, RSV 바이러스, 리노바이러스, 로타바이러스, A형 간염 바이러스, 노르월크 바이러스 그룹, 엔테로바이러스, 아스트로바이러스, 홍역 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 유행성 이하선염 바이러스, 대상 포진 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 엡스타인바 바이러스, 아데노바이러스, 루벨라 바이러스, 인간 T-세포 림프종 I형 바이러스(HTLV-I), B형 간염 바이러스(HBV), C형 간염 바이러스(HCV), D형 간염 바이러스, 폭스 바이러스, 마르부르크 및 에볼라 등의 바이러스; 미코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 클라미디아(Chlamydia), 네이세리아 고노레아(Neisseria gonorrhoeae), 시겔라(Shigella), 살모넬라(Salmonella), 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae), 트레포네마 팔리듐(Treponema pallidum), 슈도모나스(Pseudomonas), 보데텔라 퍼투시스(Bordetella pertussis), 브루셀라(Brucella), 프란시셀라 툴라렌시스(Franciscella tularensis), 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori), 렙토스피라 인테로간스(Leptospira interrogans), 레지오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophila), 예르시니아 페스티스(Yersinia pestis), 스트렙토코커스(A형 및 B형), 뉴모코커스(Pneumococcus), 메닝거코커스(Meningococcus), 헤모필러스 인플루엔자(Haemophilus influenza)(b형), 톡소플라스마 곤디(Toxoplasma gondii), 캄필로박테리오시스(Campylobacteriosis), 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhalis ), 도노바노시스(Donovanosis), 및 액티노마이코시스(Actinomycosis) 등의 박테리아; 칸디다증 및 아스페르길루스증 등의 진균성 병원체; 촌충, 흡충류, 회충, 아메바증, 편모충증, 크립토스포리디움, 주혈흡충(Schistosoma), 뉴모사이스티스 카리니(Pneumocystis carinii), 트리코모나스증 및 선모충병 등의 기생충 병원체가 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다.
DNA 백신은 아데노비리대(예, 인간 아데노바이러스 포함), 헤르페스비리대(예, HSV-1, HSV-2, EBV, CMV 및 VZV 포함), 파포바비리대(예, HPV 포함), 폭시비리대(예, 소몰폭스 및 백시니아 포함), 파르보비리대(예, 파르보바이러스 B19 포함), 레오비리대(예, 로타바이러스 포함), 코로나비리대(예, SARS 포함), 플라비비리대(예, 황열, 웨스트 나일 바이러스, 뎅기, C형 간염 및 진드기 매개 뇌염 포함), 피코르나비리대(폴리오, 리노바이러스 및 A형 간염 포함), 토가비리대(예, 루벨라 바이러스 포함), 필로비리대(예, 마르버그 및 에볼라 포함), 파라믹소비리대(예, 파라인플루엔자 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 유행성 이하선염 및 홍역), 레이브도비리대(예, 광견병 바이러스 포함), 분야비리대(예, 한탄 바이러스 포함), 오르소믹소비리대(예, A, B 및 C형 인플루엔자 바이러스 포함), 레트로비리대(예, HIV 및 HTLV 포함) 및 헤파드나비리대(예, B형 간염 포함)의 일원으로부터 유래된 항원을 코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다.
항원은 수의학적 질환의 원인인 병원체 유래일 수 있으며, 특히, 예컨대 레오바이러스(예, 아프리카 마역 또는 블루텅 바이러스) 및 헤르페스 바이러스(말 헤르페스 포함) 등의 바이러스 병원체 유래일 수 있다. 항원은 구제역 바이러스(Foot and Mouth Disease virus), 진드기 매개 뇌염 바이러스, 뎅기 바이러스, SARS, 웨스트 나일 바이러스 및 한탄 바이러스 중 하나일 수 있다. 항원은 면역결핍성 바이러스 유래일 수 있으며, 예컨대 SIV 또는 고양이 면역결핍 바이러스 유래일 수도 있다.
또한, 본 발명의 방법에 따라 제조되는 DNA 백신은 종양 항원을 코딩하는 핵산 서열을 포함할 수도 있다. 종양 관련 항원의 예로는, MAGE 패밀리 (MAGE 1, 2, 3 등)의 일원, NY-ESO-1 및 SSX-2 등의 암-고환 항원들 , 티로시나제, gp100, PSA, Her-2 및 CEA 등의 분화 항원, 변이된 자가 항원 및 온코진 HPV 타입 유래의 E6 및/또는 E7 등의 바이러스 종양 항원을 포함하나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 다른 특정 종양 항원의 예로는, MART-1, Melan-A, p97, beta-HCG, GaINAc, MAGE-1, MAGE-2, MAGE-4, MAGE-12, MUC1, MUC2, MUC3, MUC4, MUC18, CEA, DDC, P1A, EpCam, 흑색종 항원 gp75, Hker 8, 고분자량의 흑색종 항원, K19, Tyrl, Tyr2, pMel 17 유전자 패밀리의 일원, c-Met, PSM (전립선 무신 항원), PSMA (전립선 특이적인 막 항원), 전립선 분비 단백질, 알파-페토단백질, CA125, CA19.9, TAG-72, BRCA-1 및 BRCA-2 항원이 있다.
또한, 본 발명의 방법은 다른 유형의 치료학적 DNA 분자, 예컨대 유전자 요법에 사용되는 것을 제조할 수도 있다. 예를 들어, 개체가 유전자의 기능부전 상태에 의해 야기되는 유전 장애를 가지고 있는 경우, 이러한 DNA 분자를 이용하여, 기능성 유전자를 발현시킬 수 있다. 이러한 질환의 예로는, 뒤센형 근 위축증, 낭포성 섬유증, 고셔병 및 아데노신 탈아미노효소(ADA) 결핍증이 있다. 유전자 요법이 유용할 수 있는 다른 질환으로는, 염증 질환, 자가면역 질환, 만성 질환 및 감염성 질환, 예컨대 AIDS, 암, 신경 질환, 심혈관 질환, 고지혈증(hypercholestemia), 다양한 빈혈, 지중해성 빈혈 및 혈우병 등의 다양한 혈액 장애, 및 폐기종과 같은 장애를 포함한다. 고형 종양을 치료하기 위해, 독성 펩타이드(즉, 리신, 디프테리아 독소 및 코브라 독 인자 등의 화학치료제)를 코딩하는 유전자, p53과 같은 종양 억제 유전자, 형질전환성 온코진(transforming oncogene)에 안티센스인 mRNA 서열을 코딩하는 유전자, 종양 괴사 인자(TNF) 및 그외 사이토카인 등의 항신생성 펩타이드, 또는 형질전환성 온코진의 트랜스도미넌트 음성 돌연변이(transdominant negative mutant)를 발현시킬 수 있다.
또한, 본 발명의 방법에 의한 제조에 다른 유형의 치료학적 DNA 분자도 고려된다. 예로, 활성 RNA 형태로 전사되는 DNA 분자, 예컨대 소형 간섭 RNA(siRNA)를 본 발명의 방법으로 제조할 수 있다.
치료학적 유용성을 갖는 DNA 분자의 제조에 관한 구현예로, DNA 주형은 전형적으로 하나 이상의 프로모터 또는 인핸서 요소와, mRNA 또는 단백질을 코딩하는 유전자 또는 다른 코딩 서열을 포함하는, 발현 카세트를 포함할 것이다. DNA 백신 분자 또는 유전자 요법용 DNA 분자의 제조에 관한 구체적인 구현예에 있어서, DNA 주형은 대상 단백질을 코딩하는 서열에 작동가능하게 연결된 진핵생물의 프로모터와, 선택적으로, 인핸서 및/또는 진핵생물의 전사 종결 서열로 구성된 발현 카세트를 포함한다. 통상적으로, DNA 주형은 유전자를 보유하기 위해 통상적으로 사용되는 벡터의 형태, 예컨대 플라스미드와 같이 염색체외 유전자 요소 형태일 수 있다.
"프로모터"는 폴리뉴클레오티드의 전사를 개시하고 조절하는 뉴클레오티드 서열이다. 프로모터는 (프로모터에 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현이 분석물, 조인자, 조절 단백질 등에 의해 유도되는 경우) 유도성 프로모터, (프로모터에 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현이 분석물, 조인자, 조절 단백질 등에 의해 억제되는 경우) 억제성 프로모터 및 구성적 프로모터(constitutive promoter)를 포함할 수 있다. 용어 "프로모터" 또는 "조절 인자"라는 용어는 전장 프로모터 영역과 이러한 영역의 기능적인(예, 전사 또는 번역을 조절하는) 세그먼트를 포함하는 것으로 의도된다.
"작동가능하게 연결된"은 기술된 구성 요소들이 그것의 일반적인 기능을 수행하도록 배치되어있는 요소들의 정렬을 의미한다. 즉, 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 해당 프로모터는 적절한 효소가 존재할 때 상기 서열의 발현을 구현할 수 있다. 프로모터는 그것의 발현을 지시하도록 기능하는 한, 서열과 인접하게 배치될 필요는 없다. 따라서, 예를 들어, 프로모터 서열과 핵산 서열 사이에 전사되지만 번역은 되지 않는 개입 서열이 존재할 수 있지만, 여전히 프로모터 서열은 코딩 서열과 "작동가능하게 연결된" 것으로 볼 수 있다. 따라서, "작동가능하게 연결된"이라는 용어는 프로모터 인자가 전사 복합체에 의해 인지되었을 때 대상 DNA 서열의 전사 개시를 허용하는, 프로모터 인자와 대상 DNA 서열 간의 임의의 간격 또는 오리엔테이션을 포괄하는 것으로 의도된다.
본 발명에서, 닫힌 선형 DNA 분자는 하나 이상의 프로텔로머라제 타겟 서열을 포함하는 DNA 주형으로부터 증폭되는 DNA에 대한 프로텔로머라제의 작용에 의해 제조된다. 프로텔로머라제 타겟 서열은, 이것이 DNA 주형에 존재하여, 프로텔로머라제의 효소학적 활성에 의해 닫힌 선형 DNA로 변환될 수 있는, 임의의 DNA 서열이다. 다시 말해, 프로텔로머라제 타겟 서열은 프로텔로머라제에 의해 이중 가닥 DNA을 절단 및 재연결(religation)하여 공유 결합으로 닫힌 선형 DNA를 형성시키는데 필요하다.
통상적으로, 프로텔로머라제 타겟 서열은, 본원에서 또한 완벽한 역위 반복체(perfect inverted repeat)라고도 하는, 임의의 완벽한 팔린드롬 서열, 즉 2접 회전 대칭(two-fold rotational symmetry)을 가진 임의의 이중 가닥 DNA 서열을 포함한다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 다양한 중온성 박테리아 파지 유래의 프로텔로머라제 타겟 서열과 박테리아 플라스미드는 모두 완벽한 역위 반복체를 포함하는 공통된 특징을 공유한다. 완벽한 역위 반복체의 길이는 특정 유기체에 따라 다르다. 보렐리아 부르그페리의 경우, 완벽한 역위 반복체의 길이는 14 bp이다. 다양한 중온성 박테리오파지의 경우, 완벽한 역위 반복체의 길이는 22 bp 또는 그 이상이다. 또한, 일부 경우, 예컨대 E. coli N15의 경우, 가운데 완벽한 역위 팔린드롬 양쪽에는 역위된 반복 서열들이 위치되어 있으며, 즉, 더 큰 불완전한 역위 팔린드롬 파트를 형성하고 있다(도 2 및 3 참조; 밑줄 친 염기들은 역위 반복체들의 대칭성이 없어진 경우를 표시함).
본 발명에서 사용되는, 프로텔로머라제 타겟 서열은 바람직하게는 적어도 14 bp 길이의 이중 가닥 팔린드롬(완벽한 역위 반복체) 서열을 포함한다. 바람직한 완벽한 역위 반복체 서열은, 서열번호 16 내지 21의 서열 및 이의 변이체를 포함한다. 서열번호 16 (NCATNNTANNCGNNTANNATGN)은 중온성 박테리오파지의 완벽한 역위 반복체인 22개의 염기로 구성된 컨센서스 서열이다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 상기 완벽한 역위 반복체의 염기쌍은 다양한 박테리오파지들에서 일정한 위치에 보존되어 있지만, 다른 위치에서의 서열 유연성도 가능하다. 따라서, 서열번호 16은 본 발명의 방법에서 박테리오파지 프로텔로머라제와 함께 이용하기 위한 완벽한 역위 반복체 서열에 대한 최소 컨센서스 서열이다.
서열번호 16으로 정의되는 컨센서스 범위에서, E. coli 파지 N15 (서열번호 15), 및 크렙시엘라 파지 Phi KO2 (서열번호 11) 프로텔로머라제와 함께 사용하기에 특히 바람직한 완벽한 역위 반복체 서열은 서열번호 17(CCATTATACGCGCGTATAATGG)이다. 또한, 서열번호 16에 의해 정의되는 컨센서스 범위에서, 예르시니아 파지 PY54 (서열번호 9), 할로모나스 파지 phiHAP-1 (서열번호 7), 및 비브리오 파지 VP882 (서열번호 13) 유래의 프로텔로머라제와 각각 함께 사용하기에 특히 바람직한 완벽한 역위 반복체 서열은, 서열번호 18 내지 20이다:
서열번호 18 (GCATACTACGCGCGTAGTATGC),
서열번호 19 (CCATACTATACGTATAGTATGG),
서열번호 20 (GCATACTATACGTATAGTATGC).
보렐리아 부르그도르페리 프로텔로머라제와 함께 사용하기에 특히 바람직한 완벽한 역위 반복체 서열은 서열번호 21 (ATTATATATATAAT)이다. 이러한 완벽한 역위 반복체 서열은 보렐리아 부르그도르페리에 포함된 공유 결합으로 닫힌 선형 플라스미드 lpB31.16으로부터 유래된다. 이 14개의 염기 서열은 박테리오파지의 컨센서스 완벽한 역위 반복체 22 bp(서열번호 16) 보다 더 짧은데, 이는 박테리아 프로텔로머라제가 박테리오파지 프로텔로머라제에 대한 특이적인 타겟 서열 요건과 상이할 수 있음을 의미한다. 그러나, 모든 프로텔로머라제 타겟 서열들은 완벽한 역위 반복체라는 공통된 구조 모티프를 공유한다.
완벽한 역위 반복체 서열은 본 발명의 방법에 사용되는 특정 프로텔로머라제의 요건에 따라 22 bp 보다 길 수 있다. 즉, 일부 구현예에서, 완벽한 역위 반복체의 길이는 30 bp 이상, 40 bp 이상, 60 bp 이상, 80 bp 이상, 또는 100 bp 이상일 수 있다. 이러한 완벽한 역위 반복체 서열의 예로는, 서열번호 22 - 24와 이의 변이체를 포함한다.
서열번호 22 (GGCATAC TATACGTAT AGTATGCC)
서열번호 23 (ACCTATTTCAGCATACTACGCGCGTAGTATGCTGAAATAGGT)
서열번호 24
(CCTATATTGGGCCACCTATGTATGCACAGTTCGCCCATACTATACGTATAGTATGGGCGAACTGTGCATACATAGGTGGCCCAATATAGG)
서열번호 22 내지 24 및 이의 변이체는, 비브리오 파지 VP882 (서열번호 13), 예르시니아 파지 PY54 (서열번호 9) 및 할로모나스 파지 phi HAP-1 (서열번호 7) 유래의 프로텔로머라제들과 각각 함께 사용하는데 특히 바람직하다.
완벽한 역위 반복체의 측면에 부가적인 역위 반복체 서열이 위치될 수 있다. 측면에 있는 역위 반복체들은 완벽한 또는 불완전한 반복체일 수 있으며, 즉, 완벽하게 대칭되거나 또는 부분적으로 대칭될 수 있다. 측면에 있는 역위 반복체들은 중앙의 팔린드롬과 인접하거나 또는 인접하지 않을 수 있다. 프로텔로머라제 타겟 서열은 14 bp 길이 이상의 완벽한 역위 반복체 서열을 포함하는 불완전한 역위 반복체 서열을 포함할 수 있다. 그 예는 서열번호 29이다. 불완전한 역위 반복체 서열은 22 bp 길이 이상의 완벽한 역위 반복체 서열을 포함할 수 있다. 그 예는 서열번호 25이다.
특히 바람직한 프로텔로머라제 타겟 서열은 서열번호 25 내지 29의 서열, 또는 이의 변이체를 포함한다.
서열번호 25:
(TATCAGCACACAATTGCCCATTATACGCGCGTATAATGGACTATTGTGTGCTGATA)
서열번호 26:
(ATGCGCGCATCCATTATACGCGCGTATAATGGCGATAAT ACA)
서열번호 27:
(TAGTCACCTATTTCAGCATACTACGCGCGTAGTATGCTGAAATAGGTTACTG)
서열번호 28:
(GGGATCCCGTTCCATACATACATGTATCCATGTGGCATACTATACGTATAGTATGCCGATGTTACATATGGTATCATTCGGGATCCCGTT)
서열번호 29:
(TACTAAATAAATATTATATATATAATTTTTTATTAGTA)
서열번호 25 내지 29의 서열은 전술한 완벽한 역위 반복체 서열을 포함하며, 추가적으로 해당 유기체로부터 유래된 측면 서열을 포함한다. 서열번호 15의 E. coli N15 TelN 프로텔로머라제 또는 이의 변이체와의 조합 사용시에는 서열번호 25의 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 프로텔로머라제 타겟 서열이 바람직하다. 서열번호 11의 크렙시엘라 파지 Phi K02 프로텔로머라제 또는 이의 변이체와의 조합 사용시에는 서열번호 26의 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 프로텔로머라제 타겟 서열이 바람직하다. 서열번호 9의 예르시니아 파지 PY54 프로텔로머라제 또는 이의 변이체와의 조합 사용시에는 서열번호 27의 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 프로텔로머라제 타겟 서열이 바람직하다. 서열번호 13의 비브리오 파지 VP882 프로텔로머라제 또는 이의 변이체와의 조합 사용시에는 서열번호 28의 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 프로텔로머라제 타겟 서열이 바람직하다. 보렐리아 부르그도르페리 프로텔로머라제와 함께 사용하는데에는, 서열번호 29의 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 프로텔로머라제 타겟 서열이 바람직하다.
전술한 팔린드롬 또는 프로텔로머라제 타겟 서열들 중 임의의 서열의 변이체는 상동체(homologue) 또는 이의 돌연변이를 포함한다. 돌연변이는 천연 서열에 대한 절단, 치환 또는 결손을 포함한다. 변이체 서열은, DNA 주형 안에 존재하며 프로텔로머라제의 효소적 활성에 의한 닫힌 선형 DNA로의 변환을 허용하는 임의의 서열이다. 이 서열은 닫힌 선형 DNA의 형성을 적절한 분석법으로 확인하여 쉽게 정할 수 있다. 당해 기술 분야에 기술된 임의의 적합한 분석을 이용할 수 있다. 적합한 분석의 예는 Deneke et al, PNAS (2000) 97, 7721-7726에 기술되어 있다. 바람직하게는, 상기 변이체는 천연 서열에서 관찰되는 바와 대응되는 프로텔로머라제 결합성과 활성이 가능하다. 본원에 기술된 팔린드롬 서열에 대한 바람직한 변이체의 예로는, 완벽한 반복체 구조를 유지하고 있으며, 닫힌 선형 DNA의 형성을 허용할 수 있는 능력을 보유하고 있는, 절단된 팔린드롬 서열을 포함한다. 그러나, 프로텔로머라제 타겟 서열의 변이체가, 더 이상 완벽한 팔린드롬은 유지할 수 없게 변형될 순 있지만, 프로텔로머라제 활성에 대한 기질로서는 작용할 수 있는 것이어야 한다.
당업자는 상기에서 개략적으로 설명된 구조적인 원칙을 기초로 본 발명에 사용하기에 적합한 프로텔로머라제 타겟 서열을 쉽게 동정할 수 있을 것으로 이해된다. 프로텔로머라제 타겟 서열의 후보물질은, 전술한 분석을 이용하여 닫힌 선형 DNA의 형성을 촉진시키는 능력에 대해 스크리닝할 수 있다.
DNA 주형은, 1개 보다 많은 수, 예컨대 2, 3, 4, 5, 10 또는 그 이상의 프로텔로머라제 타겟 서열을 포함할 수 있다. 프로텔로머라제 타겟 서열을 복수 개 사용하면, 보다 큰 DNA 분자에서 대상 서열들을 포함하는 짧은 닫힌 선형 DNA들을 잘라낼 수 있다. 특히, DNA 주형에 하나 이상의 대상 서열들의 양측(즉, 5' 및 3')에 프로텔로머라제 타겟 서열을 위치시킬 수 있다. 그러면, 양측에 있는 프로텔로머라제 서열들은, 프로텔로머라제의 작용에 의해, 증폭된 DNA로부터 각각의 짧은 대상 서열들이 닫힌 선형 DNA로 절단되는 것을 매개할 수 있다(도 5). DNA 주형은 양측에 프로텔로머라제 타겟 서열이 위치된 하나 이상의 대상 서열(바람직하게는 발현 카세트)를 포함할 수 있다. DNA 주형은 전술한 프로텔로머라제 타겟 서열이 측면에 위치한, 2, 3, 4, 5 또는 그 이상의 대상 서열들을 포함할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 방법은 양측에 프로텔로머라제 타겟 서열이 위치된 발현 카세트를 포함하는 DNA 주형을 사용한다. 상기 발현 카세트는 바람직하게는 대상 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 진핵생물의 프로모터와, 선택적으로 진핵생물의 전사 종결 서열을 포함한다. 이러한 구현예에서, 주형 DNA를 증폭시키고, 본 발명에 따른 프로텔로머라제와 접촉시키면, 증폭된 주형으로부터 닫힌 선형 DNA로 발현 카세트가 분리된다. 그 결과 주형 DNA에서 불필요한 서열들은 동시에 산물에서 없어진다.
이러한 불필요한 서열 또는 외래 서열(또한, 박테리아 또는 벡터 서열로 기재됨)은 박테리아의 복제 기원, 박테리아 선별 마커(예, 항생제 내성 유전자) 및 비메틸화된 CpG인 2개의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 이러한 서열을 제거하면, 외래 유전자 물질을 포함하지 않는 "최소" 발현 카세트가 제작된다. 또한, 전술한 타입의 박테리아 서열들은 일부 치료학적 방법에서 문제가 될 수 있다. 예컨대, 포유류 세포 안에서, 박테리아/플라스미드 DNA가 클로닝된 유전자의 스위치 오프를 유발하여, 대상 단백질의 지속적인 발현이 달성되지 않게 할 수 있다. 또한, 박테리아 증식에 사용되는 항생제 내성 유전자가 인간 건강에 위험이 될 수 있다. 더욱이, 박테리아 플라스미드/벡터 DNA는 원치않는 비특이적인 면역 반응을 촉발시킬 수도 있다. 박테리아 DNA 서열의 특이적인 특징, 즉 통상 CpG 모티프라고 하는, 비메틸화된 시토신-구아닌으로 구성된 2개의 뉴클레오티드가 존재하면, 부적절한 면역 반응을 유도할 수도 있다.
특히, 닫힌 선형 DNA 산물이 DNA 백신인 일부 구현예에서, CpG 모티프가 산물의 서열 내에 유지될 수 있다. 그 이유는, 이 모티프가 코딩된 단백질에 대한 면역 반응에 유익한 보강제 효과를 나타낼 수 있기 때문이다.
따라서, 본 발명은 닫힌 선형 형태의 발현 카세트 DNA의 시험관내 제조 방법을 제공한다. 이 방법은, a) 양측에 프로텔로머라제 타겟 서열이 위치된 하나 이상의 발현 카세트를 포함하는 DNA 주형과, 하나 이상의 DNA 중합효소를, 상기 주형의 증폭을 촉진하는 조건 하에, 하나 이상의 프라이머의 존재 하에서 접촉시키는 단계; 및 b) a)에서 제조된 증폭된 DNA에, 1종 이상의 프로텔로머라제를, 닫힌 선형 발현 카세트 DNA 형성을 촉진하는 조건 하에, 접촉시키는 단계를 포함한다. 상기 닫힌 선형 발현 카세트 DNA 산물은, 대상 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 진핵생물의 프로모터와, 선택적으로 진핵생물의 전자 종결 서열을, 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 이들로 필수적으로 구성될 수 있다. 상기 닫힌 선형 발현 카세트 DNA 산물에는, 추가적으로, (i) 박테리아의 복제 오리진; (ii) 박테리아의 선별 마커(통상적으로 항생제 내성 유전자) 및 (iii) 비메틸화된 CpG 모티프로 이루어진 군으로부터 전형적으로 선택되는, 하나 이상의 박테리아 서열 또는 벡터 서열이, 결여될 수 있다.
전술한 바와 같이, 하나 이상의 프로텔로머라제 타겟 서열을 포함하는 임의의 DNA 주형은 본 발명의 방법으로 증폭될 수 있다. 즉, 본 발명의 방법은 DNA 백신 및 그외 치료학적 DNA 분자를 제조하는 것이 바람직하지만, 임의 타입의 닫힌 선형 DNA의 제조에 사용할 수도 있다. DNA 주형은 이중 가닥(ds) 또는 단일 가닥(ss) DNA일 수 있다. 이중 가닥 DNA 주형은 열린 환형의 이중 가닥 DNA, 닫힌 환형의 이중 가닥 DNA, 열린 선형의 이중 가닥 DNA 또는 닫힌 선형의 이중 가닥 DNA일 수 있다. 바람직하게는, 상기 주형은 닫힌 환형의 이중 가닥 DNA이다. RCA DNA 중합효소와 함께 사용시, 닫힌 환형 dsDNA 주형이 특히 바람직하다. 환형 dsDNA 주형은 통상적으로 박테리아 증식을 위한 유전자를 수용하기 위해 통상적으로 사용되는 플라스미드 또는 그외 벡터 형태가 될 수도 있다. 즉, 본 발명의 방법을 이용하여, 상업적으로 구입가능한 DNA 의약제와 같은, 임의의 상업적으로 구입가능한 플라스미드 또는 그외 벡터를 증폭시킨 다음, 증폭된 벡터 DNA를 닫힌 선형 DNA로 변환시킬 수 있다.
열린 환형 dsDNA는, DNA 중합효소가 닉(nick)이 형성된 DNA 가닥에서 증폭을 개시할 수 있는, 가닥 치환 중합효소(strand displacement polymerase)인 경우에, 주형으로서 사용될 수 있다. 이러한 구현예에서, 상기 주형은 미리 주형의 DNA 가닥의 한 곳 이상의 부위에서 닉을 형성시키는 하나 이상의 효소와 인큐베이션될 수 있다. 또한, 닫힌 선형 dsDNA도 주형으로서 사용할 수 있다. 닫힌 선형 dsDNA 주형(출발 물질)은 닫힌 선형 DNA 산물과 동일할 수 있다. 닫힌 선형 DNA를 주형으로 사용하는 경우, 이를 변성 조건 하에 인큐베이션하여, 주형 DNA의 증폭 전에 또는 증폭을 촉진시키는 조건에서 단일 가닥의 환형 DNA를 만들 수 있다.
전술한 바와 같이, DNA 주형은, 대상 단백질을 코딩하는 서열에 작동가능하게 연결된 진핵생물의 프로모터와, 선택적으로 진핵생물의 전사 종결 서열을 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 이들로 필수적으로 구성된, 전술한 발현 카세트를 통상적으로 포함한다. 선택적으로, 상기 발현 카세트는 전술한, 즉 통상적으로, (i) 박테리아의 복제 오리진; (ii) 박테리아의 선별 마커(통상적으로 항생제 내성 유전자) 및 (iii) 비메틸화된 CpG 모티프로 이루어진 군으로부터 선택되는, 하나 이상의 박테리아 또는 벡터 서열이 결여된, 최소 발현 카세트일 수 있다.
DNA 주형은 당해 기술 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 본 방법에 사용하기 적합한 양으로 제공되어질 수 있다. 예컨대, DNA 주형은 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 제조될 수 있다. DNA 주형이 dsDNA인 경우, 이를 94℃ 이상의 온도에서 미리 인큐베이션시켜, 변성된 단일 가닥으로서 증폭 단계에 제공되어질 수 있다. 즉, 본 발명의 방법은 바람직하게는 단일 가닥 DNA를 제공하기 위한 dsDNA 주형의 변성 단계를 포함한다. 다른 구현예에서, dsDNA 주형은 이중 가닥 형태로 제공되어질 수 있다. DNA 주형의 전체 또는 선택된 부분만 반응에서 증폭시킬 수 있다.
DNA 주형은 이 주형의 증폭을 촉진시키는 조건 하에서 1종 이상의 DNA 중합효소와 접촉된다. 임의의 DNA 중합효소가 사용될 수 있다. 모든 시판되는 DNA 중합효소가 본 발명의 방법에 사용할 수 있다. 예를 들어, 한가지는 교정 기능을 제공하고 다른 1종 이상은 그렇지 않은, 2, 3, 4, 5 또는 그 이상의 다른 DNA 중합효소들이 사용될 수 있다. 상이한 기전을 가진 DNA 중합효소, 예컨대 가닥 치환형 중합효소와 다른 방식으로 DNA를 복제하는 DNA 중합효소가 사용될 수 있다. 가닥 치환 활성이 없는 DNA 중합효소에 대한 적합한 예로는, T4 DNA 중합효소가 있다.
DNA 중합효소는 안정성이 우수하여, 이의 활성이 프로세스 조건 하에서의 장기간의 인큐베이션에 의해 실질적으로 감소되지 않는 것이 바람직하다. 따라서, 효소는 바람직하게는 비제한적으로 온도 및 pH 등의 프로세스 조건 범위에서 긴 반감기를 가진다. 또한, DNA 중합효소는 제조 프로세스에 적합한 한가지 이상의 특징을 가지는 것이 바람직하다. DNA 중합효소는 예컨대 가지고 있는 교정 활성을 통해 높은 충실성(fidelity)을 가지는 것이 바람직하다. 아울러, DNA 중합효소는 높은 진행성(processivity), 높은 가닥 치환 활성 및 dNTP와 DNA에 대한 낮은 Km을 나타내는 것이 바람직하다. DNA 중합효소는 주형으로서 환형 및/또는 선형 DNA를 이용할 수 있을 수 있다. DNA 중합효소는 주형으로서 dsDNA 또는 ssDNA를 이용할 수 있을 수 있다. DNA 중합효소는 비특이적인 엑소뉴클레아제 활성을 나타내지 않는 것이 바람직하다.
당업자는 상업적으로 구입가능한 DNA 중합효소, 예컨대 phi29, DeepVent® 및 바실러스 스테아로서모필러스(Bacillus stearothermophilus)(Bst) DNA 중합효소 I, 서열번호 2, 3 및 5 각각에 의해 표출되는 특성들과 비교함으로써, 전술한 특징들을 해당 DNA가 나타내는지를 결정할 수 있다. Bst DNA 중합효소 I은 뉴 잉글랜드 바이오랩 주식회사로부터 상업적으로 구입가능하다. 높은 처리성이 언급된 경우, 이는 통상적으로 주형과의 조합/해리 건 당 DNA 중합효소에 의해 추가되어지는 뉴클레오티드의 평균 수, 즉 하나의 조합 현상으로 수득되는 프라이머의 연장 길이를 나타낸다.
가닥 치환형 중합효소가 바람직하다. 바람직한 가닥 치환형 중합효소로는 Phi 29 (서열번호 2), Deep Vent® (서열번호 3) 및 Bst DNA 중합효소 I (서열번호 5) 또는 이들 중 임의의 것의 변이체가 있다. 서열번호 2, 3 및 5의 변이체들은 아래에서 프로텔로머라제 효소와 관련하여 기술된 바와 같을 수 있다. 용어 "가닥 치환"은 본원에서 DNA 합성하는 동안에 만나는 이중 가닥 DNA 구역에서 상보적인 가닥을 치환하는 DNA 중합효소의 능력을 의미한다. 가닥 치환 증폭 방법은, 이중 가닥 DNA가 새로운 DNA 가닥의 연속적인 합성에 장애가 되지 않기 때문에, 효율적인 DNA 증폭에 변성 사이클이 필수적이지 않다는 점에서, PCR을 이용하는 방법과는 다르다. 반면, PCR 방법에서는, 이중 가닥 DNA를 해리시켜 새로운 단일 가닥 주형을 제공하기 위해서, 증폭 공정 동안에 변성 사이클(즉, 온도를 94℃ 이상으로 승온)이 필요하다.
본 발명의 방법에 사용되는 가닥 치환 DNA 중합효소는 바람직하게는 20 kb 이상, 더 바람직하게는 30 kb 이상, 50 kb 이상, 또는 70 kb 이상의 진행성성(프라이머 연장 길이)을 가진다. 특히 바람직한 구현예에서, 가닥 치환 DNA 중합효소는 phi29 DNA 중합효소와 비슷하거나 또는 보다 높은 진행성을 가진다.
바람직한 가닥 치환 복제 공정은 롤링 써클 증폭(RCA)이다. 용어 RCA는RCA 타입의 DNA 중합효소(또한 RCA 중합효소라고도 함)가 환형 DNA 주형 가닥을 돌아 계속적으로 진행하면서 혼성화된 프라이머를 연장시키는 능력을 말한다. 이로써, 증폭된 DNA가 복수 개로 반복되는 선형의 단일 가닥 산물이 형성되게 된다. 이러한 선형 단일 가닥 산물은 다중 혼성화, 프라이머 연장 및 가닥 치환 반응을 위한 토대로서 제공되며, 그 결과, 증폭된 DNA가 복수로 반복된 것을 포함하는, 콘카타머 이중 가닥 DNA 산물이 형성되게 된다. 따라서, 콘카타머 이중 가닥 DNA 산물에는 각각의 증폭된 "단일 유닛" DNA가 복수 카피로 존재한다.
RCA 중합효소는 특히 본 발명의 방법에 사용하기 바람직하다. RCA 타입의 가닥 치환 복제 방법에는 통상적으로 단일 유닛 DNA들을 방출하기 위한 복잡한 프로세싱이 필요하다. 본 발명에서는, 유익하게도, 프로텔로머라제 촉매 기능을 이용하여 한 단계로 이러한 프로세싱을 수행할 수 있다. 또한, 프로텔로머라제를 이용하여, 이러한 구조를 가진 분자를 만들기 위한 추가적인 프로세싱 단계(들) 없이도 원하는 닫힌 선형 DNA 구조를 직접 제조한다.
본 발명에 따른 증폭이 가능하기 위해서는, DNA 주형을 하나 이상의 프라이머와 접촉시키는 것이 바람직하다. 프라이머는 비특이적(즉, 서열에서 랜덤)이거나 또는 DNA 주형에 포함된 하나 이상의 서열에 특이적일 수 있다. 프라이머는 DNA 주형 상의 임의 부위에서 비특이적인 개시가 가능하도록 랜덤 서열인 것이 바람직하다. 이는, 각각의 주형 가닥으로부터의 다중 개시 반응을 통한 매우 효율적인 증폭을 가능하게 한다. 랜덤 프라이머의 예는, 헥사머, 헵타머, 옥타머, 노나머, 데카머 또는 그 보다 긴 서열, 예컨대 12, 15, 18, 20 또는 30개의 뉴클레오티드 길이의 서열이다. 랜덤 프라이머의 길이는 6 - 30, 8 - 30 또는 12 - 30개의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 랜덤 프라이머는 DNA 주형에서 예컨대 헥사머, 헵타머, 옥타머 또는 노나머와 같이, 모든 가능한 조합으로 표시되는 올리고뉴클레오티드의 믹스로서 통상 제공된다.
다른 구현예에서, 프라이머는 특이적이다. 이는, 프라이머가 증폭 개시를 원하는 DNA 주형내 서열에 대해 상보적인 서열을 가진다는 의미이다. 이러한 구현예에서, 2개의 프라이머 결합 부위들 사이에 있는 DNA 주형의 한 부분을 특이적으로 증폭시키기 위해, 한쌍의 프라이머를 이용할 수도 있다. 프라이머는 비표지될 수 있거나, 또는 하나 이상의 표지, 예컨대 방사성 핵종 또는 형광 염료를 포함할 수 있다. 또한, 프라이머는 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수도 있다. 프라이머의 길이/서열은 전형적으로 온도를 고려하여, 즉 증폭 단계에서 사용되는 온도에서 주형에 결합할 수 있도록 선택될 수 있다.
DNA 주형에, DNA 중합효소와 한가지 이상의 프라이머의 접촉은, DNA 주형에 프라이머의 어닐링을 촉진시키는 조건 하에서 이루어진다. 이러한 조건은 프라이머의 혼성화를 허용하는 단일 가닥 DNA의 존재를 포함한다. 또한, 상기 조건은 주형에 프라이머의 어닐링을 허용하는 온도와 완충제를 포함한다. 적합한 어닐링/혼성화 조건은 프라이머의 특성에 따라 선택될 수 있다. 본 발명에 사용되는 바람직한 어닐링 조건의 예는, 완충제 30 mM Tris-HCl pH 7.5, 20 mM KCl, 8 mM MgCl2을 포함한다. 어닐링은 원하는 반응 온도로 서서히 냉각시킴으로써 변성 단계 다음에 수행될 수 있다.
DNA 주형을 DNA 중합효소와 한가지 이상의 프라이머와 접촉시킨 다음, 상기 주형의 증폭을 촉진시키는 조건 하에서의 인큐베이션 단계가 수행된다. 바람직하게는, 상기 조건은 가닥 치환 복제를 통해 복제되어진 가닥을 다른 가닥을 치환함으로써 상기 주형의 증폭을 촉진시킨다. 이러한 조건은 통상 20 - 90℃의 범위인 DNA 증폭을 허용하는 임의의 온도의 사용을 포함한다. 바람직한 온도 범위는 약 20 내지 약 40℃, 또는 약 25 내지 약 35℃일 수 있다.
전형적으로, 적절한 온도는 특이적인 DNA 중합효소가 최적의 활성을 가지는 온도를 기초로 선정된다. 이러한 정보는 대게 입수가능하며, 당해 기술 분야의 당업자의 일반 지식이다. 예를 들어, phi29 DNA 중합효소를 사용하는 경우, 적합한 온도 범위는 약 25 내지 약 35℃, 바람직하게는 약 30℃일 것이다. 당업자는 본 발명의 방법에 따른 효율적인 증폭에 적합한 온도를 일상적으로 확인할 수 있을 것이다. 예컨대, 프로세스는 폭넓은 온도 범위에서 이루어지게 할 수 있으며, 증폭되는 DNA 수율을 모니터링하여 해당 DNA 중합효소에 대한 최적 온도 범위를 확인할 수 있다.
DNA 주형의 증폭을 촉진하는 그외 조건으로는, DNA 중합효소와 한가지 이상의 프라이머의 존재이다. 이러한 조건은 또한 모두 4가지의 dNTP, 즉 ATP, TTP, CTP 및 GTP, 적절한 완충화제/pH 및 효소 성능 또는 안정성을 위해 필요한 기타 인자들을 포함한다. 적합한 조건은 당해 기술 분야에 공지된 DNA 중합효소의 활성을 제공하기 위해 사용되는 모든 조건을 포함한다.
예를 들어, pH는 3-10의 범위, 바람직하게는 5-8 또는 약 7, 예컨대 약 7.5일 수 있다. pH는 한가지 이상의 완충화제를 사용하여 상기한 범위로 유지시킬 수 있다. 그러한 완충제로는, MES, Bis-Tris, ADA, ACES, PIPES, MOBS, MOPS, MOPSO, Bis-Tris Propane, BES, TES, HEPES, DIPSO, TAPSO, Trizma, HEPPSO, POPSO, TEA, EPPS, 트리신, Gly-Gly, 비신(Bicine), HEPBS, TAPS, AMPD, TABS, AMPSO, CHES, CAPSO, AMP, CAPS, CABS, 포스페이트, 시트르산-소듐 하이드로겐 포스페이트, 시트라산-소듐 시트레이트, 소듐 아세테이트-아세트산, 이미다졸 및 소듐 카보네이트-소듐 바이카보네이트가 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 또한, 반응물은, 비제한적으로, 마그네슘(Mg2 +) 및 망간(Mn2 +)의 염과 같은, 이가 금속의 염, 예컨대 클로라이드, 아세테이트 및 설페이트를 포함할 수도 있다. 소듐 염 및 포타슘 염과 같은 일가 금속의 염도 포함될 수 있는데, 그 예로는 포타슘 클로라이드가 있다. 포함될 수 있는 그외 염으로는 암모늄 염, 예컨대 암모늄 설페이트가 있다.
또한, 디터전트(detergent)도 포함될 수 있다. 적합한 디터전트의 예로는 Triton X-100, Tween 20 및 이들의 유도체가 있다. 또한, 반응에 안정화제도 포함될 수 있다. 임의의 적합한 안정화제, 특히 소 혈청 알부민(BSA) 및 그외 안정화 단백질이 사용될 수 있다. 또한, 반응 조건은 DNA를 느슨하게 하여 주형 변성을 더 쉽게 하는 제제를 첨가함으로써 개선시킬 수 있다. 이러한 제제로는, 예컨대 디메틸 설폭사이드(DMSO), 포름아미드, 글리세롤 및 베타인이 있다.
당업자는 상식을 기초로 본 발명의 방법을 위한 증폭 및 인큐베이션 조건을 변형시키고 최적화할 수 있는 것으로 이해돼야 한다. 마찬가지로, 특정 제제의 특정 농도는 당해 기술 분야의 이전 실험들을 기초로 정해질 수 있으며, 상식을 토대로 추가로 최적화될 수 있다. 예로, 당해 기술 분야에서 RCA 기반의 방법에 사용되고 있는 적합한 반응 완충제는 50 mM Tris HCl, pH 7.5, 10 mM MgCl2, 20 mM (NH4)2SO4, 5% 글리세롤, 0.2 mM BSA, 1 mM dNTP이다. 본 발명의 RCA 증폭에 사용되는 바람직한 반응 완충제는 35 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 14 mM MgCl2, 10 mM (NH4)2SO4, 4 mM DTT, 1 mM dNTP이다. 이 완충제는 특히 phi29 RCA 중합효소와 함께 사용하는 것이 좋다.
또한, 반응 조건은 한가지 이상의 추가적인 단백질의 사용을 포함할 수 있다. DNA 주형은 효모의 무기 피로포스페테이즈와 같이, 1종 이상의 피로포스페테이즈의 존재 시 증폭될 수 있다. 2, 3, 4, 5 또는 그 이상의 여러가지 피로포스페테이즈가 사용될 수 있다. 이들 효소들은 가닥을 복제하는 동안에 DNA 중합효소에 의해 dNTP로부터 제조되는 피로포스페이트를 분해시킬 수 있다. 반응에서 피로포스페이트가 구축되면 DNA 중합효소의 저해를 야기할 수 있으며, DNA 증폭의 속도와 효율을 낮출 수 있다. 피로포스페테이즈는 피로포스페이트를 비-저해성 포스페이트로 파괴시킬 수 있다. 본 발명의 방법에 사용하기 적합한 피로포스페테이즈의 예는 뉴 잉글랜드 바이오랩 주식회사로부터 상업적으로 입수할 수 있는 사카로마이세스 세레비지애의 피로포스페테이즈이다.
단일 가닥 DNA를 안정화시키기 위해, 본 발명의 방법에서는 임의의 단일 가닥 결합 단백질(SSBP)을 사용할 수 있다. SSBP는 살아있는 세포의 필수 성분이며, DNA 복제, 수리 및 재조합과 같이 ssDNA가 참여하는 모든 과정에 참여한다. 이들 과정에서, SSBP는 일시적으로 형성된 ssDNA에 결합하여, ssDNA 구조의 안정화에 일조할 수 있다. 본 발명의 방법에 사용하기 적합한 SSBP로는 뉴 잉글랜드 바이오랩 주식회사에서 시판하고 있는 T4 유전자 32 단백질이 있다.
또한, 본 발명의 방법은, 증폭 단계 외에도, 닫힌 선형 DNA 제조를 위한 프로세싱 단계를 포함한다. 증폭된 DNA를 닫힌 선형 DNA 제조를 촉진시키는 조건 하에 1종 이상의 프로텔로머라제와 접촉시킨다. 이러한 프로텔로머라제를 기반으로한 간단한 프로세싱 단계는 닫힌 선형 DNA 분자를 제조하는데 이용되는 다른 방법에 비해 유익하다. 증폭 단계와 프로세싱 단계는 동시에 또는 한번에 수행될 수 있다. 그러나, 증폭 단계와 프로세싱 단계는, 증폭 단계 다음에 (즉 증폭된 DNA 상에서) 프로세싱 단계를 수행하는, 순차적으로 수행하는 것이 바람직하다.
본 발명에 사용되는 프로텔로머라제는 공유 결합으로 닫힌 선형 DNA 분자를 제조하기 위해, 프로텔로머라제 타겟 서열을 포함하는 주형을 자르고 다시 연결할 수 있는 임의의 폴리펩타이드이다. 즉, 프로텔로머라제는 DNA 절단 기능과 연결 기능을 가지고 있다. 프로텔로머라제 유형의 활성을 가지고 있는 효소들은 텔로미어 리졸베이즈(resolvase)로서 (예, 보렐리아 부르그도르페리에서) 기술되었다. 프로텔로머라제의 대표적인 기질은 환형의 이중 가닥 DNA이다. 이 DNA가 프로텔로머라제 타겟 부위를 가지고 있다면, 효소는 그 부위에서 DNA를 잘라, 말단을 서로 연결하여 공유 결합으로 닫힌 선형의 이중가닥 DNA 분자를 만들 수 있다. 프로텔로머라제 타겟 부위의 요건들은 앞에서 논의하였다. 전술한 바와 같이, 프로텔로머라제 타겟 부위를 포함하는 주형으로부터 닫힌 선형 DNA의 제조를 촉매하는 해당 폴리펩타이드의 능력은 당해 기술 분야에 기술된 임의의 적합한 분석을 이용하여 확인할 수 있다.
프로텔로머라제 효소는 박테리오파지에서 언급되었다. 일부 용원성 박테리아에는, 박테리아파지가 공유 결합으로 닫힌 말단을 가진 선형 이중 가닥을 포함하는 염색체외 DNA로서 존재한다. 이는, DNA를 복제하고, 공유 결합으로 닫힌 말단(또는 텔로미어 말단)을 유지하는 것은 효소, 즉 프로텔로머라제의 활성에 의존한다. 바이러스 DNA의 복제에서의 프로텔로머라제의 역할은 도 1에 예시되어 있다. 이러한 촉매 활성의 예는 대장균(Escherichia coli)을 감염시키는 박테리아파지 N15로부터 유래된 효소 TelN에 의해 제공된다. TelN은 환형의 이중 가닥 DNA에서 특이적인 뉴클레오티드 서열을 인지한다. 이 서열은 22 bp 역위된 완벽한 반복체(telO) 측면에 있는 2개의 절반부, telR 및 telL을 포함하여 telRL로 칭해지는 약간 불완전한 역위된 팔린드룸 구조이다(도 2 참조). 선형의 프로파지 DNA 상에 작용하는 특이적인 DNA 중합효소의 초기 활성에 의해, 환형 이중 가닥 DNA에 2가지 telRL 부위가 형성된다. TelN이 이 환형 DNA를 2개의 동일한 선형 프로파지 DNA 분자로 변환시켜, 복제 사이클을 완료한다. telR과 telL은 동일한 방식으로 DNA를 추가로 복제할 수 있는 선형 프로파지 DNA의 닫힌 말단부를 구성한다.
본 발명의 방법에는 1종 이상의 프로텔로머라제가 사용된다. 본 발명의 방법은 2, 3, 4, 5 또는 그 이상의 여러가지 프로텔로머라제 등의 2개 이상의 프로텔로머라제의 사용을 포함할 수 있다. 적합한 프로텔로머라제의 예로는, 할로모나스 아쿠아마리나(Halomonas aquamarina)의 phiHAP-1(서열번호 7), 예르시니아 엔테롤리티카(Yersinia enterolytica)의 PY54(서열번호 9), 크렙시엘라 옥시토카(Klebsiella oxytoca)의 phiKO2(서열번호 11) 및 비브리오 속(Vibrio sp .)의 VP882(서열번호 13), 및 대장균(Escherichia coli )의 N15(서열번호 15), 또는 이들 중 임의의 것의 변이체와 같이, 박테리오파지 유래의 것을 포함한다. 특히, 박테리오파지 N15 프로텔로머라제(서열번호 15) 또는 이의 변이체를 사용하는 것이 바람직하다.
서열번호 7, 9, 11, 13 및 15의 변이체는 이의 상동체 또는 돌연변이를 포함한다. 돌연변이는 천연 서열에 대한 절단, 치환 또는 결손을 포함한다. 변이체는 전술한 프로텔로머라제 타겟 부위를 포함하는 주형으로부터 닫힌 선형 DNA를 제조하는 것이어야 한다.
본원에 언급된 임의의 상동체는 통상적으로 기능성 상동체이며, 천연 단백질의 해당 영역에 대해 통상적으로 40% 이상의 상동성을 가진다. 상동체는 공지의 방법으로 측정할 수 있다. 예컨대, UWGCG 패키지가 제공하는 BESTFIT 프로그램을 이용하여, 상동성을 계산할 수 있다(예, 이의 디폴트 세팅 조건에서 사용함)(Devereux et al (1984) Nucleic Acids Research 12, 387-395). Altschul S. F. (1993) J Mol Evol 36:290-300; Altschul, S, F et al (1990) J Mol Biol 215:403-10에 기술된 바와 같이, PILEUP 및 BLAST 알고리즘을 사용하여, 상동성을 계산하고 서열들을 정렬시킬 수 있다(통상, 디폴트 세팅 조건 사용). BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 국립 생물공학 정보 센터를 통해 공개적으로 이용가능하다(ttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/).
BLAST 알고리즘으로 2개의 서열 간의 통계학적 유사성 분석을 수행한다. 예로, Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787을 참조한다. BLAST 알고리즘에 의해 제공되는 유사성 측정값은 최소 총 확률(smallest sum probability)(P(N))이며, 이는 2개의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 간에 일치가 이루어질 가능성을 확률로 나타낸다. 예컨대, 제1 서열을 제2 서열과 비교하여 최소 총 확률이 약 1 미만, 바람직하게, 약 0.1 미만, 더 바람직하게 약 0.01 미만, 가장 바람직하게 약 0.001 미만이면, 서열은 다른 서열과 유사한 것으로 간주된다.
변이체 폴리펩타이드는 천연 단백질과 40% 이상의 동일성을 가진 서열을 포함한다(또는 이들로 구성된다). 바람직한 구현예에서, 변이체 서열은 천연 단백질의 특정 영역에 대해, 예컨대 40, 60, 100, 200, 300, 400개 또는 그 이상의 인접한 아미노산들에 대해, 또는 변이체의 전체 서열에 대해, 적어도 55%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 이상, 더 바람직하게는 적어도 95%, 97% 또는 99%의 상동성을 가질 수 있다. 통상적으로, 변이체 서열은 천연 단백질의 해당 부위와 2, 5, 10, 20, 40, 50 또는 60개 이상 또는 미만의 돌연변이 차이(각각은 치환, 삽입 또는 결손일 수 있음)를 가진다. 본 발명의 변이체 서열은, 전술한 서열의 임의의 길이에 대한, 임의의 특이적인 상동성 퍼센트 값과 동일하게, 전장 천연 단백질의 특정 부위와 동일성 퍼센트를 가질 수 있다(즉, 이는 40%, 55%, 80% 또는 90% 이상, 더 바람직하게는 95%, 97% 또는 99% 이상의 동일성을 가질 수 있음).
또한, 천연 단백질의 변이체는 절단을 포함한다. 변이체가 전술한 바와 같이 닫힌 선형 DNA를 제조할 수 있는 한, 임의의 절단체를 사용할 수 있다. 절단체는 통상 촉매 활성에 비필수적이거나 및/또는 폴딩된 단백질의 구조, 특히 활성부의 폴딩에 영향을 미치지 않는 서열을 제거함으로써 제조할 것이다. 또한, 절단체는 프로텔로머라제 폴리펩타이드의 용해성을 개선시키도록 선택할 수 있다. 적절한 절단체는 N-말단 또는 C-말단에서 다양한 길이를 가진 서열들을 체계적으로 절단함으로써 일상적으로 규정할 수 있다.
천연 단백질의 변이체는, 천연 단백질의 측정 부분에 대해, 1개 이상, 예컨대 2, 3, 4, 5 - 10, 10 - 20, 20 - 40개 또는 그 이상의, 아미노산 삽입, 치환 또는 결손을 가지고 있는 돌연변이를 추가로 포함한다. 결손 및 삽입은 바람직하게는 촉매 도메인 이외의 부위에서 이루어지는 것이 바람직하다. 삽입은 통상적으로 천연 단백질 유래 서열의 N- 말단이나 C-말단에서, 예컨대 재조합 발현을 목적으로 행해진다. 또한, 치환은 통상적으로 촉매 활성에 비필수적이거나 및/또는 폴딩된 단백질의 입체 구조에 영향을 미치지 않는 부위에서 이루어진다. 이러한 치환은 효소의 용해성 또는 다른 특징들을 개선시키기 위해 행해질 수도 있다. 일반적으로 바람직한 것은 아니지만, 치환 역시 활성 부위내에서 또는 제2 구체내에서, 즉 활성 부위내 하나 이상의 아미노산의 위치나 오리엔테이션에 영향을 미치거나 접촉하는 잔기에서 행해질 수도 있다. 이러한 치환이 촉매적 특징의 개선을 이룰 수도 있다.
치환은 바람직하게는 아미노산을 화학적 구조가 비슷하거나, 화학성 특성이 비슷하거나 또는 측쇄 체적이 유사한 다른 아미노산으로 치환하는, 하나 이상의 보존적인 변화를 도입하는 것이다. 도입되는 아미노산은 치환시키는 아미노산과 비슷한 극성, 친수성, 소수성, 염기성, 산성, 중성 또는 전하를 가질 수 있다. 또는 다른 예로, 보존적인 변화는 기존 방향족 또는 지방족 아미노산 대신 방향족 또는 지방족인 다른 아미노산을 도입할 수 있다. 보존적인 아미노산 치환은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 표 1에 나타낸 20개의 주요 아미노산의 특징들에 따라 선택될 수 있다.
아미노산의 화학적 특성
Ala 지방족, 소수성, 중성 Met 소수성, 중성
Cys 극성, 소수성, 중성 Asn 극성, 친수성, 중성
Asp 극성, 친수성, (-)로 하전됨 Pro 소수성, 중성
Glu 극성, 친수성, (-)로 하전됨 Gln 극성, 친수성, 중성
Phe 방향족, 소수성, 중성 Arg 극성, 친수성, (+)로 하전됨
Gly 지방족, 중성 Ser 극성, 친수성, 중성
His 방향족, 극성, 친수성, (+)로 하전됨 Thr 극성, 친수성, 중성
Ile 지방족, 소수성, 중성 Val 지방족, 소수성, 중성
Lys 극성, 친수성, (+)로 하전됨 Trp 방향족, 소수성, 중성
Leu 지방족, 소수성, 중성 Tyr 방향족, 극성, 소수성
변이체는 천연 단백질에 상응하거나 또는 동일한 효율로 전술한 닫힌 선형 DNA를 제조할 수 있는 것이 특히 바람직하다.
전술한 바와 같이, 본 발명의 방법에 따른 DNA의 증폭은 가닥 치환 DNA 중합효소, 더 바람직하게는 RCA DNA 중합효소에 의해 수행되는 것이 바람직하다. 시험관내 무세포성 방법에서 RCA DNA 중합효소와 프로텔로머라제의 조합은 닫힌 선형 DNA을 제조하는데 놀라운 효율과 단순성을 제공한다.
상기에서 논의한 바와 같이, 긴 선형의 단일 가닥 DNA 분자가 먼저 가닥 치환 반응에서 형성되고, 이것은 이중 가닥 분자를 형성하기 위한 새로운 주형으로서 제공된다(도 4). 이중 가닥 분자는 가닥 치환 중합효소의 진행성 작용에 의해 생성되는 증폭된 DNA의 탠덤 유닛(콘카타머)들로 구성된 연속적인 시리즈를 포함한다. 이러한 콘카타머 DNA 산물은 증폭된 주형 DNA에 복수개의 반복체를로 포함된다. 본 발명의 방법에서 제조된 콘카타머는 따라서 DNA 주형으로부터 증폭된 서열로 구성된 다중 유닛들을 포함한다. 콘카타머는 증폭되는 단일 유닛의 길이에 따라, 증폭된 서열로 구성된 유닛을 10, 20, 50, 100, 200, 500 또는 1000개 이상으로 포함할 수 있다. 콘카타머의 크기는 적어도 5kb, 적어도 10kb, 적어도 20 kb, 더 바람직하게는 적어도 30 kb, 적어도 50 kb, 또는 적어도 70 kb이거나, 또는 더 클 수 있다.
다수의 구현예들에서, 예컨대 DNA 의약제의 제조에서, 증폭된 DNA를 단일 유닛으로서 사용할 필요가 있을 것이다. 따라서, 이러한 콘카타머에서 증폭된 DNA의 단일 유닛들을 분리시키는 프로세싱이 필요하다. 콘카타머 DNA를 단일 유닛의 증폭된 DNA으로 변환시키기 위해서는, 정확하게 잘라 쌍을 이룬 가닥들의 말단들을 다시 연결시켜야 한다. 통상적으로, 이는 엔도뉴클레아제 제한 효소 부위를 DNA 주형에 삽입하여 행할 수 있었다. 따라서, 엔도뉴클레아제 제한 효소를 콘카타머와 함께 인큐베이션하여, 이의 인지 부위를 잘라 단일 유닛들을 분리시킬 수 있었다. 엔도뉴클레아제 제한 효소의 작용에 의해 생겨난 열린 선형 이중 가닥 DNA를 DNA 라이게이즈 효소와 함께 인큐베이션하여 단일 유닛 DNA들을 공유 결합으로 닫을 수 있었다.
본 발명에서는, 콘카타머 DNA을 닫힌 선형 단일 유닛 DNA로 처리하는데 하나의 효소인 프로텔로머라제를 사용하여 달성한다. 이는 닫힌 선형 DNA 분자의 제조 방법에 유익한 단순성과 경제성을 부여한다. 먼저, 단일 유닛의 절단과 재연결은 단일 효소와의 인큐베이션에 의해 달성된다. 다음으로, 원하는 닫힌 선형 구조를 가지는 단일 유닛들을 분리하는데, 이러한 구조를 (즉 공유 결합으로 닫힌 환형 단일 유닛 DNA로부터) 제조하기 위한 추가적인 프로세싱 단계가 필요없다.
DNA 주형으로부터 증폭된 DNA은 닫힌 선형 DNA의 제조를 촉진시키는 조건 하에 1종 이상의 프로텔로머라제와 함께 인큐베이션한다. 즉, 상기 조건이, 프로텔로머라제 타겟 서열을 포함하는 이중 가닥 DNA의 절단과 재연결을 촉진시켜, 헤어핀 말단을 가진 공유 결합으로 닫힌 선형 DNA가 형성되게 된다. 닫힌 선형 DNA의 제조를 촉진시키는 조건은, 통상적으로 20 내지 90℃의 범위인, 닫힌 선형 DNA의 제조를 허용하는 임의의 조건의 사용을 포함한다. 온도는 바람직하게는 25 내지 40℃, 예컨대 약 25 내지 약 35℃, 또는 약 30℃의 범위일 수 있다. 특정 프로텔로머라제에 적합한 온도는 DNA 중합효소에 대한 온도 조건에 대한 전술한 원칙에 따라 선정될 수 있다. 서열번호 15의 대장균 박테리오파지 TelN 프로텔로머라제의 사용에 적합한 온도는 약 25 내지 약 35℃, 예컨대 약 30℃이다.
또한, 닫힌 선형 DNA의 제조를 촉진하는 조건은, 프로텔로머라제와 적합한 완충화제/pH의 존재, 및 효소 성능 또는 안정성을 위해 필요한 그외 인자를 포함한다. 적합한 조건은 당해 기술 분야의 프로텔로머라제 효소 활성 제공에 사용되는 임의의 조건을 포함한다. 예로, 대장균 박테리오파지 TelN 프로텔로머라제를 사용하는 경우, 적합한 완충액은 20 mM Tris-HCl, pH 7.6; 5 mM CaCl2; 50 mM 포타슘 글루타메이트; 0.1 mM EDTA; 1 mM 디티오트레이톨(DTT)일 수 있다. 또한, 최적 활성과 안정성을 유지하기 위한 제제와 조건을 DNA 중합효소에 대해 열거된 조건들로부터 선택할 수 있다.
알부 구현예에서, DNA 증폭에 사용되는 조건과 같이, 프로텔로머라제의 활성에 동일한 조건을 이용하는 것이 가능할 수도 있다. 특히, 프로텔로머라제에 의한 DNA 증폭 및 프로세싱을 동시에 또는 한번에 수행하는 경우, 동일한 조건의 사용이 언급된다. 다른 구현예에서, 최적의 DNA 중합효소 활성을 제공하기 위해 사용되는 조건이 차선의 프로텔로머라제 활성을 유도하는 경우에는, 반응 조건의 변경이 필요할 수도 있다. 특정 제제의 제거 및 반응 조건의 변경은 당해 기술 분야에 공지된 여과, 투석 및 그외 방법에 의해 달성 가능해질 수도 있다. 당업자는 최적의 DNA 중합효소 활성 및/또는 프로텔로머라제 활성을 허용하는 조건을 쉽게 찾을 수 있을 것이다.
특히 바람직한 구현예에서, RCA DNA 중합효소, 바람직하게는 phi29에 의한 DNA 증폭에 이용하기 위해, DNA 증폭은 35 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 14 mM MgCl2, 10 mM (NH4)2SO4, 4 mM DTT, 1 mM dNTP와 실질적으로 동일하거나 또는 이들로 필수적으로 구성된 완충액 조건 하에서 25 내지 35℃, 예컨대 약 30℃의 온도에서 수행된다. 그런 다음, 프로텔로머라제를 사용한 프로세싱 단계는 바람직하게는 TelN으로, 및/또는 바람직하게는, 20 mM TrisHCl, pH 7.6; 5 mM CaCl2; 50 mM 포타슘 글루타메이트; 0.1 mM EDTA; 1 mM 디티오트레이톨(DTT)과 실질적으로 동일하거나 또는 이들로 필수적으로 구성된 완충액 조건 하에서, 25 내지 35℃, 예컨대 약 30℃의 온도에서 수행될 수 있다.
본 발명의 방법에 사용되는 모든 효소 및 단백질들은 예컨대 박테리아에서 재조합으로 제조될 수 있다. 재조합 발현을 허용하는 당업자에게 공지된 임의의 수단들이 이용될 수 있다. 대상 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 플라스미드 또는 그외 다른 발현 벡터 형태를 박테리아에 도입하여, 코딩된 단백질을 발현시킬 수 있다. 예컨대, 서열번호 2, 5, 7, 9, 11, 13 또는 15를 발현시키기 위해, 벡터는 각각 서열번호 1, 4, 6, 8, 10, 12 또는 14를 포함할 수 있다. 그런 후, 발현되는 단백질은 통상적으로 예컨대 친화성 테그를 이용하여 다량으로 정제하여, 본 발명의 방법에 사용하기 적합한 형태로 제공된다. 이러한 재조합 단백질 생산 방법은 당업자라면 일상적으로 그들의 상식을 기초로 이용가능하다. 상기 내용은 본원에 논의된 임의의 단백질의 제공에 적용된다.
DNA 주형을 DNA 중합효소와 접촉시켜 수득하는 증폭된 DNA는 프로텔로머라제와 접촉시키기 전에 정제할 수 있다. 즉, 본 발명의 방법은 DNA 주형으로부터 증폭된 DNA의 정제 단계를 더 포함할 수 있다. 그러나, 바람직한 구현예에서, 상기 방법은 프로텔로머라제와의 접촉하기 전에 증폭된 DNA를 정제하지 않고 수행한다. 이는, 상기 증폭 단계와 프로세싱 단계를 전형적으로 동일한 용기나 용액에서 한번에 수행할 수 있음을 의미한다. 이에 대한 일부 구현예에서, 상기 방법은 프로텔로머라제 활성을 위한, 즉 닫힌 선형 DNA의 생성을 촉진시키는 조건 조성을 위해, 완충액의 첨가를 포함한다.
본 발명의 방법은, 프로텔로머라제의 작용에 의해 닫힌 선형 DNA을 제조한 다음, 공유 결합으로 닫힌 선형 DNA 산물을 정제하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기에서 언급한 정제는 통상적으로 임의의 부적절한 산물을 제거하기 위해 수행될 것이다. 정제는 당해 기술 분야에 공지된 적합한 임의의 수단에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 증폭된 DNA 또는 공유 결합으로 닫힌 선형 DNA의 프로세싱은, 페놀/클로로포름 핵산 정제, 또는 Qiagen으로부터 상업적으로 입수가능한 컬럼 등의 핵산에 특이적으로 결합하는 컬럼을 사용하는 것을 포함할 수 있다. 당업자는 증폭된 DNA의 분리에 사용하기에 적합한 정제 기법들을 일상적으로 구분할 수 있다.
공유 결합으로 닫힌 선형 DNA가 제조되고 충분한 양으로 정제가 이루어지면, 본 발명의 방법은 이를 DNA 조성물, 예컨대 치료학적 DNA 조성물로의 제형화를 더 포함할 수 있다. 치료학적 DNA 조성물은 상기에서 언급되는 타입의 치료학적 DNA 분자를 포함할 것이다. 이러한 조성물은 원하는 경로로 투여하기 적합한 형태, 예컨대 에어로졸, 주사용 조성물 또는 경구, 점막 또는 국소 투여에 적합한 제형으로 치료학적 유효량의 DNA를 포함할 것이다.
기존의 약학 조제물로서의 DNA의 제형화는 당해 기술 분야의 당업자가 이용가능한 표준 약학 제형 화학 및 방법을 이용하여 행해질 수 있다. 임의의 약제학적으로 허용가능한 담체나 부형제가 사용될 수 있다. 습윤제나 유화제, pH 완충성 물질 등의 보조 물질도 부형제 또는 비히클 중에 존재될 수 있다. 이러한 부형제, 비히클 및 보조 물질들은, 일반적으로, 과도한 독성 없이 투여할 수 있으며, 백신 조성물인 경우에는 조성물을 투여받는 개체에서 면역 반응을 유도하지 않는, 약학 제제이다. 적합한 담체는 리포좀일 수 있다.
약제학적으로 허용가능한 부형제는, 물, 염수, 폴리에틸렌글리콜, 히알루론산, 글리세롤 및 에탄올 등의 액체를 포함하나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 또한, 약제학적으로 허용가능함 염, 예컨대 하이드로클로라이드, 하이드로브로마이드, 포스페이트, 설페이트 등의 미네랄 산 염; 아세테이트, 프로피오네이트, 말로네이트, 벤조에이트 등의 유기 산의 염이, 조성물에 포함될 수 있다. 또한, 필수는 아니지만, 조성물에 포함되는 경우, 특히 펩타이드, 단백질 또는 그외 유사 분자에 대해 안정화제로서 제공하는 약제학적으로 허용가능한 부형제가 상기 조제물에 포함되는 것이 바람직하다. 또한, 펩타이드에 대한 안정화제로서 작용하는 적합한 담체의 예로는, 약제 등급의 덱스트로스, 슈크로스, 락토스, 트레할로스, 만니톨, 소르비톨, 이노시톨, 덱스트란 등이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 그외 적합한 담체로는, 전분, 셀룰로스, 소듐 포스페이트, 칼슘 포스페이트, 시트르산, 타르타르산, 글리신, 고분자량의 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 이의 조합이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 약제학적으로 허용가능한 부형제, 비히클 및 보조 물질에 대한 전반적인 사항은 REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Mack Pub. Co., N.J. 1991)에서 볼 수 있으며, 이 문헌은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
본 발명의 방법은 시험관내 무세포성 환경에서 이루어진다. 따라서, 상기 방법은 숙주 세포 없이 이루어지며, 전형적으로 정제된 효소학적 성분을 사용하여 이루어진다. 이에, 프로텔로머라제에 의한 주형 DNA의 증폭과 프로세싱은 전형적으로 적정 용기내 용액 중에서 반응 성분들과 접촉시킴으로써 수행된다. 선택적으로, 특정 성분이 고형 지지체에 부착된 것과 같이 고정된 형태로 제공될 수도 있다.
본 발명의 방법은 임의의 규모로 수행될 수 있다. 그러나, 본 방법은 상업적인 또는 산업적인 규모로 DNA를 증폭하도록, 즉 증폭된 DNA를 mg 또는 이보다 높은 함량으로 제조하도록 수행하는 것이 바람직하다. 본 방법은, 1 mg 이상, 10 mg 이상, 20 mg 이상, 50 mg 이상, 또는 100 mg 이상으로 증폭된 DNA를 제조하는 것이 바람직하다. 또한, 증폭된 DNA로부터 유래된 최종 닫힌 선형 DNA 산물은 바람직하게는 mg 또는 그 이상의 양으로 제조될 수 있다. 본 방법은 1 mg 이상, 2 mg 이상, 5 mg 이상, 10 mg 이상, 20 mg 이상, 50 mg 이상, 또는 100 mg 이상으로 닫힌 선형 DNA를 제조하는 것이 바람직하다.
본 발명은 본 발명의 방법을 수행하는데 필요한 구성 성분을 포함하는 키트를 추가로 제공한다. 이 키트는 1종 이상의 DNA 중합효소와 1종 이상의 프로텔로머라제를 포함하며, 선택적으로 본원에 기술된 방법의 사용 설명서를 포함한다. 이 키트는 2, 3, 4, 5 또는 그 이상의 상이한 DNA 중합효소를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 키트는 1종 이상의 가닥 치환형 DNA 중합효소, 더 바람직하게는 RCA DNA 중합효소를 포함한다. 특히 바람직하게는, 상기 키트는 phi29 DNA 중합효소 (서열번호 2), Deep Vent® DNA 중합효소 (서열번호 3) 또는 Bst 1 DNA 중합효소 (서열번호 5), 또는 이들의 임의의 것의 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 다른 방법에 의해 DNA를 복제하는 DNA 중합효소도 포함시킬 수 있다. 상기 키트는 1종 이상의 프로텔로머라제를 포함한다. 상기 키트는 2, 3, 4, 또는 그 이상의 상이한 프로텔로머라제를 포함할 수 있다. 프로텔로머라제는 서열번호 5, 7, 9, 11, 13 또는 15 중 임의의 것, 또는 임의의 것의 변이체로부터 선택할 수 있다. 특히 바람직하게는, 상기 키트는 E. coli N15 TelN (서열번호 15) 또는 이의 변이체를 포함한다.
또한, 키트는 1종 이상의 단일 가닥 결합 단백질(SSBP)을 포함할 수 있다. 바람직한 SSBP는 뉴 잉글랜드 바이오랩 주식회사로부터 상업적으로 구입가능한 T4 유전자 32 단백질이다. 키트에는 2, 3, 4 또는 그 이상의 여러가지 SSBP를 포함시킬 수 있다. 또한, 키트는 피로포스페테이즈를 더 포함할 수 있다. 바람직한 피로포스페테이즈는 뉴 잉글랜드 바이오랩 주식회사로부터 상업적으로 구입가능한 사카로마이세스 세레비니재의 피로포스페테이즈이다. 일부 구현예에서, 2, 3, 4, 5 또는 그 이상의 여러가지 피로포스페테이즈를 포함시킬 수 있다. 상기 키트는 본원에 기술된 임의의 DNA 중합효소, 프로텔로머라제, SSBP 또는 피로포스페테이즈를 포함할 수 있다. 또한, 상기 키트는 dNTP, 적정 완충액 및 전술한 바와 같이 DNA 중합효소 및/또는 프로텔로머라제 효소의 성능 또는 안정성에 필요한 그외 인자를 포함할 수 있다.
실시예
실시예 1 - TelN 의 발현 및 프로텔로머라제 타겟 서열을 포함하는 벡터 구조체의 제조
상업적으로 구입가능한 pQE-30 벡터 (Qiagen)에 지향성(directional) 인 프래임 클로닝을 수행하기 위해, 상업적으로 구입가능한 클로닝 벡터 pJAZZ (Lucigen)로부터 변형된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용하여 TelN을 PCR 증폭시켰다:
PT1F 5' ATGAGCAAGGTAAAAATCGGTG 3' (서열번호 30)
PT1R 5' TTAGCTGTAGTACGTTTCCCAT 3' (서열번호 31).
이 시스템은 lac 프로모터로부터 6X N-말단의 His 테깅된 단백질을 유도 발현할 수 있으며, lacI-발현성 플라스미드 pREP4로부터 트랜스로 강한 억제를 제공할 수 있다. 여러 개의 추정의 재조합 클론들을 E. coli M15에서 동정하고, TelN의 인 프래임 삽입을 확인하기 위해 서열분석으로 검증하였다. 6개의 클론을 소규모 유도 실험에서 다시 특정화하였다. 클론들 모두 재조합 TelN 프로텔로머라제에 상응하는 분자량 74.5kDa의 단백질을 발현하였다.
IPTG로 pQE-30에서 단백질 발현을 유도함으로써, E. coli M15 pREP4로부터 TelN을 발현시킨 다음, 유도된 세포를 초음파 처리(100%에서 30초간 6회 버스트)하고 원심분리(25000g로 30분)하여, 세포 용혈물로부터 불용성 분획과 가용성 분획을 수득하였다. 겔 분석에서 TelN은 가용성 분획에서 확인되었다. TelN의 정제는 Akta Prime system (GE Healthcare)을 이용한 HisTrap 컬럼에서 0-100% (0.5M) 이미다졸 농도 구배를 이용하여 용출시켜 수행하였다. 정제된 TelN을 투석하여 이미다졸을 제거하고, 10mM Tris HCl pH 7.4, 75mM NaCl, 1mM DTT, 0.1mM EDTA 및 50% 글리세롤로 구성된 완충액에 넣어 보관하였다.
TelN 활성을 검증할 수 있는 벡터 구조체를, TelN 인지 부위인 telRL을 포함하고 있는 합성 올리고뉴클레오티드를, 플라스미드 pUC18 및 pBR329의 BamHI 및 HindIII 부위에 지향적으로 클로닝하여 제조하였다.
RL1
5'AGCTTTATCAGCACACAATTGCCCATTATACGCGCGTATAATGGACTATTGTGTGCTGATAG 3' (서열번호 32)
RL2 5'GATCCTATCAGCACACAATAGTCCATTATACGCGCGTATAATGGGCAATTGTGTGCTGATAA 3' (서열번호 33)
pUC18은 유전자은행 등재 번호 L09136이며, Fermentas Cat no. SD0051로 상업적으로 입수할 수 있으며; pBR329는 유전자은행 등재 번호 J01753이며, DSMZ Cat no. 5590로 상업적으로 구입할 수 있다.
또한, 형질전환 시험을 위해, 2 카피의 telRL 인지 부위를 루시퍼라제 발현 플라스미드인 pGL4.13 (Promega)의 고유 SacI 및 BamHI 제한효소 부위에, 개똥벌레 루시퍼레이즈 유전자의 발현 카세트 옆에 클로닝하였다. SacI 오버행이 있는 telRL 합성 올리고뉴클레오티드를 다시 어닐링한 다음, 제1 telRL 부위를 SV40 프로모터로부터 상류에 있는 고유한 SacI 부위에 클로닝하였다. 제2 telRL 부위는 BamHI 오버행을 가진 telRL 합성 올리고뉴클레오티드를 이용하여 SV40 폴리아데닐 신호 하류에 있는 고유한 BamHI 부위에 클로닝하였다. 제조되는 구조체는, 포유류 세포에서 발현되는 루시퍼레이즈를 코딩하는, 공유 결합으로 닫힌 선형(doggybone) DNA를 형성시킬 수 있으므로, pGL DOG라고 하였다.
실시예 2 - TelN 절단 검증
슈퍼코일형의, 환형 pUC18 telRL 및 pGL DOG 벡터 구조체를 TelN으로 잘라 검증하였다. 각각의 기질 100 ng을 4.5 pmol TelN과 1시간 40분간 30℃에서 인큐베이션하였다. 반응은 TelN 완충액[10 mM Tris HCl pH 7.6, 5 mM CaCl2, 50 mM 포타슘 글루타메이트, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT] 내에서 수행하였다.
절단 산물은 비변성 아가로스 겔 전기영동으로 검증하였다. 슈퍼코일형의 환형 pUC18 telRL을 TelN과 인큐베이션한 결과, 2.7kb의 선형 단편이 분리되었는데, 이는 절단되었음을 나타낸다. 슈퍼코일형의 환형 pGL DOG를 TelN과 인큐베이션한 결과, 2.4kb의 단편 2개가 분리되었는데, 이는 telRL 부위 2곳에서 절단이 이루어졌음을 의미한다.
또한, 제한효소 절단하여 pUC18 telRL과 pGL DOG를 선형화한 다음, TelN과 인큐베이션하여, telRL에서의 특이적인 절단을 더욱 검증하였다. 100 ng pUC18 telRL에 Xmn1을 처리하여 선형화한 다음 TelN과 인큐베이션하였다. 이로 인해 1.9kb와 0.8kb의 예상된 단편들이 분리되었다. 100 ng pGL DOG에 Pvu1을 처리하여 선형화한 다음 TelN과 함께 인큐베이션하였다. 그 결과, 예상한 단편, 2.4kb, 1.6kb 및 0.7kb가 분리되었다. 마찬가지로, pGL DOG에 Pst1을 처리하여 선형화한 다음 TelN과 인큐베이현한 결과, 예상한 단편 2.4kb, 1.1kb와 다른 단편 1.1kb이 분리되었다. 이는, 프로텔로머라제 타겟 서열을 포함하고 있는, 환형 DNA 기질과 선형 DNA 기질에 대한, TelN의 엔도뉴클레아제 활성을 입증하는 것이다.
절단 활성의 예비 평가에서, 1시간에 3.4 pmol의 과량의 TelN이 200 ng 이상의 pUC18 telRL을 자르는 것으로 확인되었다. 시간 추이 실험에서, 동량의 DNA가 약 10분 이내에 절단되었다.
실시예 3 - TelN 의 재연결 활성 검증 및 닫힌 선형 DNA 의 형성
TelN 절단 산물인 닫힌 선형 DNA에 대한 검증을 변성 겔 전기영동으로 수행하였다. pGL DOG를 실시예 3에서 TelN과 함께 인큐베이션하였다. doggybone내에 포함된 영역에 대응되지만 열린 DNA 말단을 가지고 있는 합성 PCR 산물(PCR DOG)을 대조군으로 사용하였다. PCR DOG 선형 단편을 telRL 부위 측면에 있는 프라이머를 이용하여 pGL DOG로부터 증폭하였다:
Sac pGL 5' GTGCAAGTGCAGGTGCCAGAAC 3' (서열번호 34);
Bam pGL 5' GATAAAGAAGACAGTCATAAGTGCGGC 3'(서열번호 35).
천연 아가로스 겔[0.8% 아가로스, TAE 완충액(40mM 트리스-아세테이트, 1 mM EDTA)] 상에서, 100 ng pGL DOG를 TelN과 함께 인큐베이션하여 수득한 2.4kb의 절단 산물이, PCR DOG (2.7 kb)와 비슷한 크기로 이동하였으며, 2가지 산물 모두 이중 가닥을 유지하였다.
그러나, 이중 가닥 DNA를 단일 가닥 DNA로 변성 및 분리시키는 변성 아가로스 겔[1% 아가로스, H2O, 50 mM NaOH, 0.1 mM EDTA에서 전기영동함, 전기영동 후 1 M Tris HCl pH 7.6, 1.5M NaCl에서 중화함] 상에서, TelN "doggybone" 단편은 말단 개방형 PCR 대조군 또는 XmnI으로 선형화한 pUC18 (둘다 2.7kb) 보다 높은 분자량 위치로 이동하였다[ca. 5kb].
이러한 이동 차이는, TelN에 의해 닫힌 선형 "doggybone" 구조가 형성되었음을 의미한다. "doggybone" 구조가 변성되면, 말단 개방형의 선형 PCR 산물의 변성시에 분리되는 선형 단일 가닥 보다 더 느리게 겔 내에서 이동하는 단일 가닥의 열린 환형이 제조되게 되는 것이다.
또한, TelN에 의해 형성된 산물의 닫힌 선형 구조의 검증은, 랩 온 어 칩(LOC) 캐필러리 전기영동에 의한 열 변성 분석에서 확인되었다. LOC 분석은 생물 분자의 빠른 분리를 위한 캐필러스 전기영동 플랫폼이다. DNA 7500 칩이 구비된 Agilent Bioanalyzer(Agilent, UK)를 분리에 사용할 수 있으며, 대략적인 DNA 단편들의 분리 크기는 최대 7000bp이다.
이 칩 시스템에서는 단일 가닥 DNA가 검출되지 않는다. 기존의 이중 가닥 DNA를, H2O 중의 열 변성(5분간 95℃) 및 신속한(< 1℃/s) 냉각 1℃/s한 경우, LOC 시스템에서 가시화될 수 없는 단일 가닥 DNA가 형성되었다. 그러나, "doggybone" DNA에 공유 결합으로 연결된 DNA 말단(TelN에 의한 절단으로 생김)은 변성 후에도 분리되지 않으므로, 다시 어닐링하여, 가시적인 상태로 있는 이중 가닥 DNA로 바꾸었다. 신속하게 냉각시킨 열 변성시킨 DNA와 비교하여, 공유 결합으로 닫힌 선형(ccl) doggybone DNA와 기존의 열린 선형(ol) 이중 가닥 DNA를 구별할 수 있다.
열 사이클러에서, 얇은 벽의 PCR 튜브 내에서, 수 중의 DNA 샘플(100 ng)을, 변성(5분간 95℃)시키고, 빨리 냉각(<1℃/s)시켰다. TelN 절단을 비교하기 위해, 샘플을 먼저 1 ㎕의 정제된 프로텔로머라제 효소와 함께 1 X TelN 완충액 중에서 10분간 30℃에서 인큐베이션하였다. 대조군 샘플은 효소 처리 없이 동일하게 처리하였다. 샘플(1 ㎕)을 DNA 7500 칩이 구비된 Agilent Bioanalyser를 이용하여 제조사의 지침에 따라 분석하였다.
그 결과는 도 6B에 나타낸다. 여기에서, pGL DOG와 TelN을 인큐베이션하여 수득한, 닫힌 선형 "doggybone" DNA는, 동일한 통상적인 열린 선형 DNA (PCR DOG)와 비교하여, 열 변성에 내성을 나타내는 것으로 보인다. 또한, 열 내성에 대한 동일한 내성은 RCA 증폭 및 TelN 절단으로 생성된 RCA 증폭된 doggybone DNA를 이용한 경우에서도 나타났다.
다른 실험들에서, TelN 절단을 말단 개방형 PCR DOG에 대해 수행하였다. 그 결과 열 안정적인 절단 산물인 2.8 kb의 "doggybone" DNA와 열 안정적인 "doggybone" 말단부 0.09 및 0.14 kb가 형성되었다.
LOC 분석에서, "doggybone"와 PCR DOG의 추정 크기는, 약 2.4kb 및 2.7 kb 크기로 예측되는 서열 데이타와 비교하여, 각각 2.8kb - 3.0 kb 및 3.1-3.5 kb이었다. 이는 비변성 LOC 분석에서 이루어지는 이동에 입체 구조로 인한 차이가 반영되었음을 의미하는 것이다.
실시예 4 - RCA (롤링 써클 증폭)에 의해 생성된 콘카타머 DNA 로부터의 닫힌 선형 DNA 의 형성
DNA 주형을 증폭시키고, 증폭된 DNA를 닫힌 선형 "doggybone" DNA로 변환시키는 시험관내 무세포 방법을 수행하였다. 바실러스 섭틸리스 파지 phi29의 phi29 효소와 프라이머로서 랜덤 헥사머를 이용한 RCA를 다양한 조건에서 실시하여, telRL 부위가 있거나 없는, 공유 결합으로 닫힌 플라스미드 주형들을 증폭하였다. 이로써 phi29의 진행성 가닥 치환 활성을 통해 콘카타머 DNA가 증폭된다. 초기 작업은 TempliPhi 키트(GE Healthcare)를 제조사의 지침에 따라 수행하였다. 그러나, 나중에는 하우스 프로세스(NEB 사의 phi29를 이용함)로 대체하였으며, 생산 수율과 순도가 더 높았다.
40 pg - 200 ng의 닫힌 서클 주형의 변형과, 프라이머의 어닐링은 10 ㎕의 어닐링/변성 완충액(30 mM Tris-HCl pH 7.5, 20 mM KCl, 8 mM MgCl2, 20 μM 랜덤 헥사머)에서 수행하였다. 변셩과 어닐링은 95℃에서 1분 열처리한 다음 30분간 실온으로 냉각시킴으로써 수행하였다.
10 ㎕의 반응 완충액[35 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 14 mM MgCl2, 10 mM (NH4)2SO4, 4 mM DTT, 10U phi29, 0.002U PPi (효모의 무기 피로포스파테이즈), 1 mM dNTP]을 10 ㎕의 어닐링한 DNA/프라이머 반응물에 첨가하였다.
반응액 20 ㎕를 18시간 동안 30℃에서 인큐베이션하였다. 그 후, 샘플을 겔에서 전기영동하여 콘카타머의 형성을 체크한 다음, 반응 혼합물을 제한효소나 TelN으로 잘라 산물을 확인하였다.
그 후, RCA로 증폭시킨 콘카타머 DNA를 TelN과 함께 인큐베이션하였다. 통상적으로, RCA 증폭시킨 DNA 기질을 수 중에서 10x TelN 완충액으로 최종 부피 20 ㎕로 희석하였다. pUC18 telRL 결과는 도 6A에 나타낸다.
겔의 1번 레인에서 알 수 있는 바와 같이, 콘카타머로 증폭된 DNA 비절단물은 겔을 통과하지 않는 메쉬를 형성한다. 그러나, TelN은 RCA 물질을 절단할 수 있어, 2.7kb의 doggybone 단편(6번 레인)을 분리시켰다. RCA에 의해 증폭된 DNA를 반응에 사용되는 출발 주형인지에 대한 검증은, Pvu1 (2 및 5번 레인)을 이용한 제한효소 절단으로 실시하였다. pUC18 (telRL 없음)은 TelN 활성에 대한 음성 대조군으로 사용하였다(3번 레인).
마찬가지로, 다른 실험에서도, pGL DOG의 RCA 제조된 콘카타머는 TelN으로 절단되었다. 즉, 본 발명의 방법은 출발 주형으로부터 닫힌 선형 DNA를 증폭시키는데 효과적인 것으로 입증되었다. 또한, RCA 중합효소와 프로텔로머라제를 순차적인 단계로 이용하는 단순한 방식으로 닫힌 선형 DNA 증폭이 가능하였으며, 도중에 증폭된 DNA를 정제할 필요도 없었다.
실시예 5 - 증폭된 닫힌 선형 DNA 의 발현
HeLa 세포를 이용한 형질전환 실험을 수행하여, 본 발명에 따라 제조한 닫힌 선형 "doggybone" DNA로부터 루시퍼레이즈 리포터 유전자의 발현을 조사하였다. 공유 결합으로 닫힌 환형 DNA와 선형 PCR DOG 대조군을 대조군으로 사용하였다.
형질전환은 20 mm 직경의 웰 내 RPMI에서 60% 컬플루언스에서 수행하였고, Transfectam® (Promega)을 제조사의 지침에 따라 사용하였다. 각 형질전환에는 DNA 구조체 400 ng을 사용하였다. 형질전환 빈도는, Renilla 루시퍼레이즈-발현성 플라스미드 pGL4.73 (레닐라 레니포르미스(Renilla reniformis)의 hRluc 유전자를 함유함) 40 ng을 내부 대조군으로 포함시켜, 실험에서 실험들간에 정규화하였다. 개똥벌레 루시퍼레이즈(포티누스 피랄리스(Photinus pyralis)로부터의 발광) 및 Renilla 루시퍼레이즈 활성을 듀얼-루시퍼레이즈® 리포터 (DLR™) 분석 시스템(Promega)을 이용하여 순차적으로 측정하였다. 상대적인 라이트 유닛(light unit)을 GloMax Multi Luminometer (Promega)를 사용하여 측정하고, 결과는 개똥벌레 루시퍼레이즈/Renilla 루시퍼레이즈 비율로 나타내었다. 모든 실험은 3번 수행하였다.
형질전환에 테스트한 구조체는 다음과 같다:
pGL4.13 luc 대조군 DNA
pGL4.73 hRluc
PCR DOG
PCR 대조군(luc 유전자를 포함하는 pGL4.13 유래의 단편)
pGL DOG (2개의 telRL 부위를 포함하는 pGL4.13)
"doggybone" MP (미니-프렙 DNA로부터 분리된 pGL DOG를 PvuI으로 자르고(벡터 DNA 오염 제거), TelN으로 절단)
"doggybone" RCA (RCA에 의해 증폭된 pGL DOG를 PvuI으로 자른 후, TelN으로 절단)
RCA pGL DOG - pGL DOG의 처음 RCA 증폭에서 제조된 콘카타머 DNA.
그 결과는 도 6C에 나타내며, RCA에 의한 증폭이 열린 선형 PCR 구조체 보다 높은 수준으로 루시퍼레이즈를 발현하는 것으로 확인된 결과를 보여준다. 이는, 본 발명에 따라 제조된 닫힌 선형 DNA를 이용하여, 포유류 세포에 도입하였을 때 루시퍼레이즈를 성공적으로 발현시킬 수 있다는 것을 입증한다.
본 발명의 서열들
Figure 112011062189406-pct00001
Figure 112011062189406-pct00002
Figure 112011062189406-pct00003
Figure 112011062189406-pct00004
Figure 112011062189406-pct00005
Figure 112011062189406-pct00006
Figure 112011062189406-pct00007
Figure 112011062189406-pct00008
Figure 112011062189406-pct00009
Figure 112011062189406-pct00010
SEQUENCE LISTING <110> TOUCHLIGHT GENETICS LIMITED <120> PRODUCTION OF CLOSED LINEAR DNA <130> N106698A <140> PCT/GB10/000165 <141> 2010-02-01 <150> GB 0901593.4 <151> 2009-01-30 <160> 42 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1728 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bacillus bacteriophage phi29 DNA polymerase nucleic acid sequence <400> 1 atgaagcata tgccgagaaa gatgtatagt tgtgactttg agacaactac taaagtggaa 60 gactgtaggg tatgggcgta tggttatatg aatatagaag atcacagtga gtacaaaata 120 ggtaatagcc tggatgagtt tatggcgtgg gtgttgaagg tacaagctga tctatatttc 180 cataacctca aatttgacgg agcttttatc attaactggt tggaacgtaa tggttttaag 240 tggtcggctg acggattgcc aaacacatat aatacgatca tatctcgcat gggacaatgg 300 tacatgattg atatatgttt aggctacaaa gggaaacgta agatacatac agtgatatat 360 gacagcttaa agaaactacc gtttcctgtt aagaagatag ctaaagactt taaactaact 420 gttcttaaag gtgatattga ttaccacaaa gaaagaccag tcggctataa gataacaccc 480 gaagaatacg cctatattaa aaacgatatt cagattattg cggaacgtct gttaattcag 540 tttaagcaag gtttagaccg gatgacagca ggcagtgaca gtctaaaagg tttcaaggat 600 attataacca ctaagaaatt caaaaaggtg tttcctacat tgagtcttgg actcgataag 660 gaagtgagat acgcctatag aggtggtttt acatggttaa atgataggtt caaagaaaaa 720 gaaatcggag aaggcatggt cttcgatgtt aatagtctat atcctgcaca gatgtatagc 780 cgtctccttc catatggtga acctatagta ttcgagggta aatacgtttg ggacgaagat 840 tacccactac acatacagca tatcagatgt gagttcgaat tgaaagaggg ctatataccc 900 actatacaga taaaaagaag taggttttat aaaggtaatg agtacctaaa aagtagcggc 960 ggggagatag ccgacctctg gttgtcaaat gtagacctag aattaatgaa agaacactac 1020 gatttatata acgttgaata tatcagcggc ttaaaattta aagcaactac aggtttgttt 1080 aaagatttta tagataaatg gacgtacatc aagacgacat cagaaggagc gatcaagcaa 1140 ctagcaaaac tgatgttaaa cagtctatac ggtaaattcg ctagtaaccc tgatgttaca 1200 gggaaagtcc cttatttaaa agagaatggg gcgctaggtt tcagacttgg agaagaggaa 1260 acaaaagacc ctgtttatac acctatgggc gttttcatca ctgcatgggc tagatacacg 1320 acaattacag cggcacaggc ttgttatgat cggataatat actgtgatac tgacagcata 1380 catttaacgg gtacagagat acctgatgta ataaaagata tagttgaccc taagaaattg 1440 ggatactggg cacatgaaag tacattcaaa agagttaaat atctgagaca gaagacctat 1500 atacaagaca tctatatgaa agaagtagat ggtaagttag tagaaggtag tccagatgat 1560 tacactgata taaaatttag tgttaaatgt gcgggaatga ctgacaagat taagaaagag 1620 gttacgtttg agaatttcaa agtcggattc agtcggaaaa tgaagcctaa gcctgtgcaa 1680 gtgccgggcg gggtggttct ggttgatgac acattcacaa tcaaataa 1728 <210> 2 <211> 575 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Bacillus bacteriophage phi29 DNA polymerase amino acid sequence <400> 2 Met Lys His Met Pro Arg Lys Met Tyr Ser Cys Asp Phe Glu Thr Thr 1 5 10 15 Thr Lys Val Glu Asp Cys Arg Val Trp Ala Tyr Gly Tyr Met Asn Ile 20 25 30 Glu Asp His Ser Glu Tyr Lys Ile Gly Asn Ser Leu Asp Glu Phe Met 35 40 45 Ala Trp Val Leu Lys Val Gln Ala Asp Leu Tyr Phe His Asn Leu Lys 50 55 60 Phe Asp Gly Ala Phe Ile Ile Asn Trp Leu Glu Arg Asn Gly Phe Lys 65 70 75 80 Trp Ser Ala Asp Gly Leu Pro Asn Thr Tyr Asn Thr Ile Ile Ser Arg 85 90 95 Met Gly Gln Trp Tyr Met Ile Asp Ile Cys Leu Gly Tyr Lys Gly Lys 100 105 110 Arg Lys Ile His Thr Val Ile Tyr Asp Ser Leu Lys Lys Leu Pro Phe 115 120 125 Pro Val Lys Lys Ile Ala Lys Asp Phe Lys Leu Thr Val Leu Lys Gly 130 135 140 Asp Ile Asp Tyr His Lys Glu Arg Pro Val Gly Tyr Lys Ile Thr Pro 145 150 155 160 Glu Glu Tyr Ala Tyr Ile Lys Asn Asp Ile Gln Ile Ile Ala Glu Arg 165 170 175 Leu Leu Ile Gln Phe Lys Gln Gly Leu Asp Arg Met Thr Ala Gly Ser 180 185 190 Asp Ser Leu Lys Gly Phe Lys Asp Ile Ile Thr Thr Lys Lys Phe Lys 195 200 205 Lys Val Phe Pro Thr Leu Ser Leu Gly Leu Asp Lys Glu Val Arg Tyr 210 215 220 Ala Tyr Arg Gly Gly Phe Thr Trp Leu Asn Asp Arg Phe Lys Glu Lys 225 230 235 240 Glu Ile Gly Glu Gly Met Val Phe Asp Val Asn Ser Leu Tyr Pro Ala 245 250 255 Gln Met Tyr Ser Arg Leu Leu Pro Tyr Gly Glu Pro Ile Val Phe Glu 260 265 270 Gly Lys Tyr Val Trp Asp Glu Asp Tyr Pro Leu His Ile Gln His Ile 275 280 285 Arg Cys Glu Phe Glu Leu Lys Glu Gly Tyr Ile Pro Thr Ile Gln Ile 290 295 300 Lys Arg Ser Arg Phe Tyr Lys Gly Asn Glu Tyr Leu Lys Ser Ser Gly 305 310 315 320 Gly Glu Ile Ala Asp Leu Trp Leu Ser Asn Val Asp Leu Glu Leu Met 325 330 335 Lys Glu His Tyr Asp Leu Tyr Asn Val Glu Tyr Ile Ser Gly Leu Lys 340 345 350 Phe Lys Ala Thr Thr Gly Leu Phe Lys Asp Phe Ile Asp Lys Trp Thr 355 360 365 Tyr Ile Lys Thr Thr Ser Glu Gly Ala Ile Lys Gln Leu Ala Lys Leu 370 375 380 Met Leu Asn Ser Leu Tyr Gly Lys Phe Ala Ser Asn Pro Asp Val Thr 385 390 395 400 Gly Lys Val Pro Tyr Leu Lys Glu Asn Gly Ala Leu Gly Phe Arg Leu 405 410 415 Gly Glu Glu Glu Thr Lys Asp Pro Val Tyr Thr Pro Met Gly Val Phe 420 425 430 Ile Thr Ala Trp Ala Arg Tyr Thr Thr Ile Thr Ala Ala Gln Ala Cys 435 440 445 Tyr Asp Arg Ile Ile Tyr Cys Asp Thr Asp Ser Ile His Leu Thr Gly 450 455 460 Thr Glu Ile Pro Asp Val Ile Lys Asp Ile Val Asp Pro Lys Lys Leu 465 470 475 480 Gly Tyr Trp Ala His Glu Ser Thr Phe Lys Arg Val Lys Tyr Leu Arg 485 490 495 Gln Lys Thr Tyr Ile Gln Asp Ile Tyr Met Lys Glu Val Asp Gly Lys 500 505 510 Leu Val Glu Gly Ser Pro Asp Asp 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Met Glu Gly Asp Glu Glu Leu Lys Leu Leu Ala Phe Asp Ile Glu Thr 130 135 140 Leu Tyr His Glu Gly Glu Glu Phe Ala Lys Gly Pro Ile Ile Met Ile 145 150 155 160 Ser Tyr Ala Asp Glu Glu Glu Ala Lys Val Ile Thr Trp Lys Lys Ile 165 170 175 Asp Leu Pro Tyr Val Glu Val Val Ser Ser Glu Arg Glu Met Ile Lys 180 185 190 Arg Phe Leu Lys Val Ile Arg Glu Lys Asp Pro Asp Val Ile Ile Thr 195 200 205 Tyr Asn Gly Asp Ser Phe Asp Leu Pro Tyr Leu Val Lys Arg Ala Glu 210 215 220 Lys Leu Gly Ile Lys Leu Pro Leu Gly Arg Asp Gly Ser Glu Pro Lys 225 230 235 240 Met Gln Arg Leu Gly Asp Met Thr Ala Val Glu Ile Lys Gly Arg Ile 245 250 255 His Phe Asp Leu Tyr His Val Ile Arg Arg Thr Ile Asn Leu Pro Thr 260 265 270 Tyr Thr Leu Glu Ala Val Tyr Glu Ala Ile Phe Gly Lys Pro Lys Glu 275 280 285 Lys Val Tyr Ala His Glu Ile Ala Glu Ala Trp Glu Thr Gly Lys Gly 290 295 300 Leu Glu Arg Val Ala Lys Tyr Ser Met Glu Asp Ala Lys Val Thr Tyr 305 310 315 320 Glu Leu Gly Arg Glu Phe Phe Pro Met Glu Ala Gln Leu Ser Arg Leu 325 330 335 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ccagcttttc aatggccagc tcaaaatgtg 2400 ctggcagcac cttctccagt tccgtatcaa tatcggtgat cggcagctct ccacaagaca 2460 tactccggcg accgccacga actacatcgc gcagcagctc ccgttcgtag acacgcatgt 2520 tgcccagagc cgtttctgca gccgttaata tccggcgcac gtcggcgatg attgccggga 2580 gatcatccac ggttattggg ttcggtgatg ggttcctgca ggcgcggcgg agagccatcc 2640 agacgccgct aacccatgcg ttacggtact gaaaactttg tgctatgtcg tttatcaggc 2700 ccgaagttct tctttctgcc gccagtccag tggttcaccg gcgttcttag gctcaggctc 2760 gacaaaagca tactcgccgt ttttccggat agctggcaga acctcgttcg tcacccactt 2820 gcggaaccgc caggctgtcg tcccctgttt caccgcgtcg cggcagcgga ggattatggt 2880 gtagagacca gattccgata ccacatttac ttccctggcc atccgatcaa gtttttgtgc 2940 ctcggttaaa ccgagggtca atttttcatc atgatccagc ttacgcaatg catcagaagg 3000 gttggctata ttcaatgcag cacagatatc cagcgccaca aaccacgggt caccaccgac 3060 aagaaccacc cgtatagggt ggctttcctg aaatgaaaag acggagagag ccttcattgc 3120 gcctccccgg atttcagctg ctcagaaagg gacagggagc agccgcgagc ttcctgcgtg 3180 agttcgcgcg cgacctgcag aagttccgca gcttcctgca aatacagcgt ggcctcataa 3240 ctggagatag tgcggtgagc agagcccaca agcgcttcaa cctgcagcag gcgttcctca 3300 atcgtctcca gcaggccctg ggcgtttaac tgaatctggt tcatgcgatc acctcgctga 3360 ccgggatacg ggctgacaga acgaggacaa aacggctggc gaactggcga cgagcttctc 3420 gctcggatga tgcaatggtg gaaaggcggt ggatatggga ttttttgtcc gtgcggacga 3480 cagctgcaaa tttgaatttg aacatggtat gcattcctat cttgtatagg gtgctaccac 3540 cagagttgag aatctctata ggggtggtag cccagacagg gttctcaaca ccggtacaag 3600 aagaaaccgg cccaaccgaa gttggcccca tctgagccac cataattcag gtatgcgcag 3660 atttaacaca caaaaaaaca cgctggcgcg tgttgtgcgc ttcttgtcat tcggggttga 3720 gaggcccggc tgcagatttt gctgcagcgg ggtaactcta ccgccaaagc agaacgcacg 3780 tcaataattt aggtggatat tttaccccgt gaccagtcac gtgcacaggt gtttttatag 3840 tttgctttac tgactgatca gaacctgatc agttattgga gtccggtaat cttattgatg 3900 accgcagcca ccttagatgt tgtctcaaac cccatacggc cacgaatgag ccactggaac 3960 ggaatagtca gcaggtacag cggaacgaac cacaaacggt tcagacgctg ccagaacgtc 4020 gcatcacgac gttccatcca ttcggtattg tcgac 4055 <210> 15 <211> 631 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Escherichia coli bacteriophage N15 telomerase amino acid sequence <400> 15 Met Ser Lys Val Lys Ile Gly Glu Leu Ile Asn Thr Leu Val Asn Glu 1 5 10 15 Val Glu Ala Ile Asp Ala Ser Asp Arg Pro Gln Gly Asp Lys Thr Lys 20 25 30 Arg Ile Lys Ala Ala Ala Ala Arg Tyr Lys Asn Ala Leu Phe Asn Asp 35 40 45 Lys Arg Lys Phe Arg Gly Lys Gly Leu Gln Lys Arg Ile Thr Ala Asn 50 55 60 Thr Phe Asn Ala Tyr Met Ser Arg Ala Arg Lys Arg Phe Asp Asp Lys 65 70 75 80 Leu His His Ser Phe Asp Lys Asn Ile Asn Lys Leu Ser Glu Lys Tyr 85 90 95 Pro Leu Tyr Ser Glu Glu Leu Ser Ser Trp Leu Ser Met Pro Thr Ala 100 105 110 Asn Ile Arg Gln His Met Ser Ser Leu Gln Ser Lys Leu Lys Glu Ile 115 120 125 Met Pro Leu Ala Glu Glu Leu Ser Asn Val Arg Ile Gly Ser Lys Gly 130 135 140 Ser Asp Ala Lys Ile Ala Arg Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Asp Trp Ser 145 150 155 160 Phe Ala Leu Ser Asp Leu Asn Ser Asp Asp Trp Lys Glu Arg Arg Asp 165 170 175 Tyr Leu Tyr Lys Leu Phe Gln Gln Gly Ser Ala Leu Leu Glu Glu Leu 180 185 190 His Gln Leu Lys Val Asn His Glu Val Leu Tyr His Leu Gln Leu Ser 195 200 205 Pro Ala Glu Arg Thr Ser Ile Gln Gln Arg Trp Ala Asp Val Leu Arg 210 215 220 Glu Lys Lys Arg Asn Val Val Val Ile Asp Tyr Pro Thr Tyr Met Gln 225 230 235 240 Ser Ile Tyr Asp Ile Leu Asn Asn Pro Ala Thr Leu Phe Ser Leu Asn 245 250 255 Thr Arg Ser Gly Met Ala Pro Leu Ala Phe Ala Leu Ala Ala Val Ser 260 265 270 Gly Arg Arg Met Ile Glu Ile Met Phe Gln Gly Glu Phe Ala Val Ser 275 280 285 Gly Lys Tyr Thr Val Asn Phe Ser Gly Gln Ala Lys Lys Arg Ser Glu 290 295 300 Asp Lys Ser Val Thr Arg Thr Ile Tyr Thr Leu Cys Glu Ala Lys Leu 305 310 315 320 Phe Val Glu Leu Leu Thr Glu Leu Arg Ser Cys Ser Ala Ala Ser Asp 325 330 335 Phe Asp Glu Val Val Lys Gly Tyr Gly Lys Asp Asp Thr Arg Ser Glu 340 345 350 Asn Gly Arg Ile Asn Ala Ile Leu Ala Lys Ala Phe Asn Pro Trp Val 355 360 365 Lys Ser Phe Phe Gly Asp Asp Arg Arg Val Tyr Lys Asp Ser Arg Ala 370 375 380 Ile Tyr Ala Arg Ile Ala Tyr Glu Met Phe Phe Arg Val Asp Pro Arg 385 390 395 400 Trp Lys Asn Val Asp Glu Asp Val Phe Phe Met Glu Ile Leu Gly His 405 410 415 Asp Asp Glu Asn Thr Gln Leu His Tyr Lys Gln Phe Lys Leu Ala Asn 420 425 430 Phe Ser Arg Thr Trp Arg Pro Glu Val Gly Asp Glu Asn Thr Arg Leu 435 440 445 Val Ala Leu Gln Lys Leu Asp Asp Glu Met Pro Gly Phe Ala Arg Gly 450 455 460 Asp Ala Gly Val Arg Leu His Glu Thr Val Lys Gln Leu Val Glu Gln 465 470 475 480 Asp Pro Ser Ala Lys Ile Thr Asn Ser Thr Leu Arg Ala Phe Lys Phe 485 490 495 Ser Pro Thr Met Ile Ser Arg Tyr Leu Glu Phe Ala Ala Asp Ala Leu 500 505 510 Gly Gln Phe Val Gly Glu Asn Gly Gln Trp Gln Leu Lys Ile Glu Thr 515 520 525 Pro Ala Ile Val Leu Pro Asp Glu Glu Ser Val Glu Thr Ile Asp Glu 530 535 540 Pro Asp Asp Glu Ser Gln Asp Asp Glu Leu Asp Glu Asp Glu Ile Glu 545 550 555 560 Leu Asp Glu Gly Gly Gly Asp Glu Pro Thr Glu Glu Glu Gly Pro Glu 565 570 575 Glu His Gln Pro Thr Ala Leu Lys Pro Val Phe Lys Pro Ala Lys Asn 580 585 590 Asn Gly Asp Gly Thr Tyr Lys Ile Glu Phe Glu Tyr Asp Gly Lys His 595 600 605 Tyr Ala Trp Ser Gly Pro Ala Asp Ser Pro Met Ala Ala Met Arg Ser 610 615 620 Ala Trp Glu Thr Tyr Tyr Ser 625 630 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 22 base consensus sequence for a mesophilic bacteriophage perfect inverted repeat <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (5)..(6) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (9)..(10) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (13)..(14) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (17)..(18) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> n is a, c, g, or t <400> 16 ncatnntann cgnntannat gn 22 <210> 17 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> particularly preferred perfect inverted repeat sequence for use with E.coli phage N15 and Klebsiella phage Phi KO2 protelomerases <400> 17 ccattatacg cgcgtataat gg 22 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> particularly preferred perfect inverted repeat sequence for use with Yersinia phage PY54 protelomerase <400> 18 gcatactacg cgcgtagtat gc 22 <210> 19 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> particularly preferred perfect inverted repeat sequence for use with Halomonas phage phiHAP-1 protelomerase <400> 19 ccatactata cgtatagtat gg 22 <210> 20 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> particularly preferred perfect inverted repeat sequence for use with Vibrio phage VP882 protelomerase <400> 20 gcatactata cgtatagtat gc 22 <210> 21 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> particularly preferred perfect inverted repeat sequence for use with a Borrelia burgdorferi protelomerase <400> 21 attatatata taat 14 <210> 22 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> particularly preferred perfect inverted repeat sequence for use with Vibrio phage VP882 protelomerase <400> 22 ggcatactat acgtatagta tgcc 24 <210> 23 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> particularly preferred perfect inverted repeat sequence for use with Yersinia phage PY54 protelomerase <400> 23 acctatttca gcatactacg cgcgtagtat gctgaaatag gt 42 <210> 24 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> particularly preferred perfect inverted repeat sequence for use with Halomonas phage phiHAP-1 protelomerase <400> 24 cctatattgg gccacctatg tatgcacagt tcgcccatac tatacgtata gtatgggcga 60 actgtgcata cataggtggc ccaatatagg 90 <210> 25 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Particularly preferred protelomerase target sequence <400> 25 tatcagcaca caattgccca ttatacgcgc gtataatgga ctattgtgtg ctgata 56 <210> 26 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Particularly preferred protelomerase target sequence <400> 26 atgcgcgcat ccattatacg cgcgtataat ggcgataata ca 42 <210> 27 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Particularly preferred protelomerase target sequence <400> 27 tagtcaccta tttcagcata ctacgcgcgt agtatgctga aataggttac tg 52 <210> 28 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Particularly preferred protelomerase target sequence <400> 28 gggatcccgt tccatacata catgtatcca tgtggcatac tatacgtata gtatgccgat 60 gttacatatg gtatcattcg ggatcccgtt 90 <210> 29 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Particularly preferred protelomerase target sequence <400> 29 tactaaataa atattatata tataattttt tattagta 38 <210> 30 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PT1F primer <400> 30 atgagcaagg taaaaatcgg tg 22 <210> 31 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PT1R primer <400> 31 ttagctgtag tacgtttccc at 22 <210> 32 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RL1 <400> 32 agctttatca gcacacaatt gcccattata cgcgcgtata atggactatt gtgtgctgat 60 ag 62 <210> 33 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RL2 <400> 33 gatcctatca gcacacaata gtccattata cgcgcgtata atgggcaatt gtgtgctgat 60 aa 62 <210> 34 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sac pGL <400> 34 gtgcaagtgc aggtgccaga ac 22 <210> 35 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bam pGL <400> 35 gataaagaag acagtcataa gtgcggc 27 <210> 36 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Complememt to SEQ ID NO: 25 <400> 36 tatcagcaca caatagtcca ttatacgcgc gtataatggg caattgtgtg ctgata 56 <210> 37 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> telR <400> 37 tatcagcaca caattgccca ttatacgcgc gtataatggg caattgtgtg ctgata 56 <210> 38 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> telL <400> 38 tatcagcaca caatagtcca ttatacgcgc gtataatgga ctattgtgtg ctgata 56 <210> 39 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Complement of SEQ ID NO: 26 <400> 39 tgtattatcg ccattatacg cgcgtataat ggatgcgcgc at 42 <210> 40 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Complement of SEQ ID NO: 27 <400> 40 cagtaaccta tttcagcata ctacgcgcgt agtatgctga aataggtgac ta 52 <210> 41 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Complement of SEQ ID NO: 28 <400> 41 aacgggatcc cgaatgatac cacatgtaac atcggcatac tatacgtata gtatgccaca 60 tggatacatg tatgtatgga acgggatccc 90 <210> 42 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Complement of SEQ ID NO: 29 <400> 42 tactaataaa aaattatata tataatattt atttagta 38

Claims (31)

  1. 닫힌 선형(closed linear) 데옥시리보핵산(DNA)의 시험관내 무세포성 제조 방법으로서,
    (a) 주형의 증폭을 촉진시키는 조건 하에, 하나 이상의 프로텔로머라제 타겟 서열을 포함하는 DNA 주형과, 1종 이상의 DNA 중합효소를, 하나 이상의 프라이머 존재 하에 접촉시키는 단계;
    (b) 상기 (a)에서 제조되는 증폭된 DNA에, 1종 이상의 프로텔로머라제를 닫힌 선형 DNA의 제조를 촉진하는 조건 하에 접촉시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 DNA 주형은 가닥 치환 복제(strand displacement replication)를 통해 복제된 가닥이 다른 가닥을 치환함으로써 상기 주형의 증폭을 촉진하는 조건 하에 인큐베이션되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 주형의 증폭은 롤링 써클 증폭(RCA)에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 프라이머는 랜덤 프라이머인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 DNA 중합효소는 서열번호 2의 phi29, 서열번호 2와 90% 이상의 상동성을 가지는 DNA 중합효소, 또는 서열번호 2에서 보존적 아미노산 치환을 포함하는 DNA 중합효소이며, 및/또는 상기 프로텔로머라제는 서열번호 15의 박테리오파지 N15 TelN, 서열번호 15와 90% 이상의 상동성을 가지는 프로텔로머라제, 또는 서열번호 15에서 보존적 아미노산 치환을 포함하는 프로텔로머라제인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 (a)에서 제조되는 증폭된 DNA는 상기 DNA 주형으로부터 증폭된 DNA 서열의 탠덤 유닛을 포함하는 콘카타머(concatamer)를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 콘카타머는 상기 프로텔로머라제에 의해 증폭된 DNA 서열로 구성된 단일 유닛으로 분리되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 1종 이상의 프로텔로머라제 타겟 서열은 완벽한 역위 반복체(perfect inverted repeat) DNA 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 DNA 주형은 닫힌 환형 DNA인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 DNA 주형은 닫힌 선형 DNA 인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 DNA 주형은 변성 조건에서 인큐베이션시 닫힌 환형 DNA를 형성하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 DNA 주형은, 대상 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 진핵생물의 프로모터를 포함하는 발현 카세트를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 발현 카세트는 진핵생물의 전사 종결 서열을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  14. 제12항에 있어서, 상기 대상 코딩 서열은 인간 코딩 서열 또는 인간에 감염되는 병원체의 코딩 서열인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  15. 제12항에 있어서, 상기 발현 카세트의 양 측면에 프로텔로머라제 타겟 서열이 위치되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  16. 제15항에 있어서, 닫힌 선형 발현 카세트 DNA의 제조용인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  17. 제1항에 있어서, (b)에서 제조되는 닫힌 선형 DNA의 정제 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  18. 제1항에 있어서,
    (a) 서열번호 15의 TelN에 의해 절단되고 재연결되는, 프로텔로머라제 타겟 서열을 가지고 있는 단일 가닥의 DNA 주형을, 서열번호 2의 phi29 DNA 중합효소, 서열번호 2와 90% 이상의 상동성을 가지는 DNA 중합효소, 또는 서열번호 2에서 보존적 아미노산 치환을 포함하는 DNA 중합효소와, 25 - 35℃의 온도에서, 상기 DNA 중합효소에 의한 주형의 증폭을 촉진하는 조건 하에, 접촉시키는 단계; 및
    (b) 단계 (a)에서 제조되는 콘카타머를, 상기 프로텔로머라제 TelN, 서열번호 15와 90% 이상의 상동성을 가지는 프로텔로머라제, 또는 서열번호 15에서 보존적 아미노산 치환을 포함하는 프로텔로머라제와, 25 - 35℃에서, 상기 프로텔로머라제의 활성을 촉진하는 조건 하에 접촉시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 프로텔로머라제 타겟 서열은 서열번호 25의 서열, 서열번호 25와 90% 이상의 상동성을 가지는 서열, 또는 서열번호 25에서 보존적 아미노산 치환을 포함하는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  20. 1종 이상의 DNA 중합효소 및 1종 이상의 프로텔로머라제를 포함하며, 제1항에 따른 방법의 사용 설명서를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  21. 닫힌 선형 DNA 분자를 포함하는 약학 조성물의 제조 방법으로서,
    상기 방법은 제1항에 따른 방법을 수행하는 단계, 및 제조되는 닫힌 선형 DNA를 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제와 함께 제형화하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 양 말단이 헤어핀 루프에 의해 공유 결합으로 닫힌, 선형의 이중 가닥 DNA의 시험관내 무세포성 제조 방법으로서,
    (a) 주형의 증폭을 촉진시키는 조건 하에, 하나 이상의 프로텔로머라제 타겟 서열을 포함하는 DNA 주형과, DNA 중합효소를 접촉시켜, 상기 DNA 주형으로부터 DNA 를 증폭하는 단계;
    (b) 상기 증폭된 DNA에, 1종 이상의 프로텔로머라제를, 양 말단이 헤어핀 루프에 의해 공유 결합으로 닫힌, 선형의 이중 가닥 DNA의 제조를 촉진하는 조건 하에 접촉시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 제조 방법.
  23. 시험관내 무세포성 제조 방법에서 닫힌 선형 DNA의 제조용 조성물로서,
    DNA 서열의 복수의 반복체를 포함하며, 상기 DNA 서열은 양 측면에 프로텔로머라제 타겟 서열이 위치되는, 시험관내 무세포성 콘카타머 DNA(concatameric DNA)를 포함하고,
    1종 이상의 프로텔로머라제와 함께 사용되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  24. 제23항에 있어서, 상기 콘카타머 DNA 서열은 하나 이상의 발현 카세트를 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  25. 제24항에 있어서, 상기 발현 카세트는 mRNA 또는 단백질을 코딩하는 서열과 작동가능하게 연결된 진핵생물의 프로모터를 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  26. 제25항에 있어서, 상기 발현 카세트는 진핵생물의 전사 종결 서열을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  27. 제24항에 있어서, 상기 발현 카세트는 하기로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 박테리아의 서열 또는 벡터 서열을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는, 조성물:
    (i) 박테리아의 복제 기원;
    (ii) 박테리아의 선별 마커; 및
    (iii) 비메틸화된 CpG 모티프.
  28. 제23항에 있어서, 상기 콘카타머 DNA는 양 측면에 프로텔로머라제 타겟 서열이 위치한 DNA 서열 단위를 10개 이상 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  29. 제23항에 있어서, 상기 콘카타머 DNA는 5kb 이상의 크기인, 조성물.
  30. 제23항에 있어서, 상기 콘카타머 DNA는, 양 측면에 프로텔로머라제 타겟 서열이 위치한 DNA 서열의 복수의 반복체를 가지는 선형의 단일 가닥 DNA인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  31. 삭제
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