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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Die
Erfindung betrifft ein Verfahren zur In-Vitro-Amplifikation geschlossener,
ringförmiger
DNA. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur zellfreien
Amplifikation geschlossener, ringförmiger DNA für Anwendungsbereiche
wie Mutagenese, molekulares Klonen, DNA-Nachweis, DNA-Modifikation,
Gene Hunting, Gentherapie, und zellfreie DNA Produktion.
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Die
Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist ein leistungsfähiges Verfahren
für die
rasche und exponentielle Amplifikation von Target-Nukleinsäuren. S.
z. B. US Patente Nr. 4,683,195 und 4,683,202. Die PCR hat die Entwicklung
der Technologien zur Charakterisierung von Genen und des molekularen
Klonens einschließlich
der direkten Sequenzierung von PCR amplifizierter DNA, der Bestimmung
von Allel-Variationen, und dem Nachweis von Störungen aufgrund von Infekten
und genetischen Erkrankungen erleichtert. Die Durchführung der
PCR erfolgt durch wiederholte Zyklen der Wärmedenaturierung eines die
Target-Sequenz enthaltenden DNA-Templats, Hybridisieren sich gegenüber liegender
Primer mit komplementären
DNA-Strängen,
und Verlängerung
der hybridisierten Primer mit einer DNA-Polymerase. Mehrfache PCR-Zyklen
resultieren in der exponentiellen Amplifikation der Nukleotidsequenz,
die durch die flankierenden Amplifikationsprimer beschrieben wird.
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Eine
bedeutende Modifikation der ursprünglichen PCR-Technik war die
Substitution von Thermus aquaticus (Taq) DNA-Polymerase anstelle
des Klenow-Fragments von E. coli DNA-Polymerase, I. Saiki et al., 230
Science 1350–1354
(1988). Die Aufnahme einer thermostabilen DNA-Polymerase in das
PCR-Protokoll umgeht das Bedürfnis
für wiederholte
Enzymzugaben und erlaubt erhöhte
Hybridisierungs- und Primerextensionstemperaturen, welche die Spezifität von Primer/Templat-Bindungen
verbessern. Es sind auch andere thermostabile DNA-Polymerasen aufgefunden
und kommerzialisiert worden, wie beispielsweise die thermostabile
DNA-Polymerase von Pyrococcus furiosus (Pfu DNA-Polymerase; US Patent Nr. 5,545,552),
die thermostabile DNA-Polymerase von Thermus flavus (Tfl DNA-Polymerase;
Epicentre Technologies), die thermostabile DNA-Polymerase von Thermus thermophilus
(Tth DNA-Polymerase, Epicentre Technologies, Madison, Wisconsin),
ein Gemisch von Taq DNA-Polymerase und Pyrococcus Spezies GB-D thermostabile
DNA-Polymerase (ELONGASETM, Life Technologies,
Inc., Gaithersburg, Maryland), die thermostabile DNA-Polymerase von
Thermococcus litoralis (VentR ® DNA-Polymerase,
New England Biolabs, Beverly, Massachusetts), und AMPLITHERMTM DNA-Polymerase (geschützte thermostabile DNA-Polymerase,
Epicentre Technologies). Thermostabile DNA-Polymerasen dienen somit
der Erhöhung
der Spezifität
und Vereinfachung von PCR.
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PCR
kann zum Amplifizieren von linearen DNA-Segmenten, jedoch nicht
von geschlossener, ringförmiger
DNA, verwendet werden. Da die meisten replikationskompetenten DNAs
in geschlossener, ringförmiger Form
vorliegen, muss ein PCR-Produkt für funktionelle Untersuchungen
in einen geschlossenen, ringförmigen DNA-Vektor
subkloniert werden und dann in geeignete Wirtszellen eingeführt und
in diesen amplifiziert werden. Die Fähigkeit, ringförmige DNA
in einem zellfreien System in vitro zu amplifizieren, würde es erlauben, die
Nukleotidzusammensetzung und Sequenz einer ringförmigen DNA nach Belieben zu
modifizieren. Dieser Erfolg würde
einen signifikanten Fortschritt in der Technik darstellen und potentiell
auf den Gebieten der Mutagenese, des Klonens, des DNA-Nachweises,
der DNA-Modifikation, des Gene Huntings, der Gentherapie, und der
zellfreien DNA-Produktion eingesetzt werden.
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Im
Folgenden werden einige Beispiele aus dem Stand der Technik aufgeführt, die
das selbe Gebiet wie die vorliegende Erfindung betreffen. Die internationale
Patentanmeldung WO93/12257 beschreibt ein Verfahren zur zielgerichteten
Mutagenese, in diesem Dokument sind jedoch bestimmte Merkmale der
vorliegenden Erfindung nicht enthalten.
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Die
europäische
Patentanmeldung 0439182 A2 beschreibt ein Verfahren zum Amplifizieren
von Nukleinsäuren
durch PCR oder Ligase-Kettenreaktion (ligase chain reaction, LCR),
in dem Dokument wird jedoch nicht ihre kombinierte Anwendung beschrieben.
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KURZE ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Es
ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zum Herstellen
und Amplifizieren von geschlossener, ringförmiger DNA in vitro bereitzustellen.
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Es
ist ein weiteres Ziel der Erfindung, ein Verfahren zum Modifizieren
der Nukleotidzusammensetzung und Sequenz einer geschlossenen, ringförmigen DNA
und zum Amplifizieren der modifizierten geschlossenen, ringförmigen DNA
in vitro bereitzustellen.
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Noch
ein weiteres Ziel der Erfindung ist es, ein Verfahren zum selektiven
Amplifizieren einer geschlossenen, ringförmigen DNA, die eine definierte
Nukleotidsequenz aufweist, in vitro bereitzustellen.
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Diese
und andere Ziele können
durch das Bereitstellen des in Anspruch 1 beschriebenen Verfahrens erreicht
werden. Somit umfasst das Verfahren ein Verfahren zur In-Vitro-Amplifikation einer
ausgewählten
geschlossenen ringförmigen
Nukleinsäure,
umfassend:
- a) Mischen einer wirksamen Menge
einer thermostabilen DNA-Ligase mit einem PCR-Reaktionsgemisch, das
die ausgewählte,
geschlossene, ringförmige
DNA als ein Templat und ein Paar 5-phosphorylierter PCR-Amplifikationsoligonukleotidprimer
umfasst, mit der Maßgabe,
dass jegliche Co-Faktoren, die für
die Aktivität
der thermostabilen DNA-Ligase erforderlich sind, ebenfalls in einer
wirksamen Menge zugegeben werden, wobei ein LDA-Gemisch erhalten
wird; und
- b) Thermocyceln des LDA-Gemischs durch eine ausgewählte Anzahl
von Zyklen bei
i) einer zur Denaturierung des Templats geeigneten
Temperatur,
ii) einer für
ein Annealing der Primer an das denaturierte Templat geeigneten
Temperatur,
iii) einer zur DNA-Polymerase-katalysierten Extension
der Primer geeigneten Temperatur, und
iv) einer zum DNA-Ligase-katalysierten
Schließen
der verlängerten
Primer geeigneten Temperatur, wobei ein amplifiziertes geschlossenes
ringförmiges
DNA-Produkt erhalten wird;
wobei die zur DNA-Polymerase-katalysierten
Extension der Primer geeignete Temperatur die selbe wie die zum
DNA-Ligase-katalysierten Schließen
der verlängerten
Primer geeignete Temperatur ist.
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Die
zum Annealen der Primer an das denaturierte Templat geeignete Temperatur
kann dieselbe Temperatur sein, die für eine Polymerase-katalysierte
Verlängerung
der Primer geeignet ist.
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In
bevorzugten Ausführungsformen
wird das LDA-Gemisch bei der zum Denaturieren des Templats geeigneten
Temperatur in jedem Zyklus für
etwa 1 Sekunde bis etwa 2 Minuten gehalten. Das LDA-Gemisch wird
bei der zum Annealen der Primer an das denaturierte Templat geeigneten
Temperatur in jedem Zyklus für etwa
1 Sekunde bis etwa 5 Minuten gehalten; und das LDA-Gemisch wird
bei der zur Polymerase-katalysierten Verlängerung der Primer geeigneten
Temperatur in jedem Zyklus für
etwa 1 bis 20 Minuten gehalten.
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Wenn
mindestens einer der Primer mit seinem korrespondierendem Templatstrang
mindestens eine Fehlpaarung aufweist, umfasst das erhaltene, amplifizierte,
geschlossene, ringförmige
DNA-Produkt im Vergleich zu dem Templat eine Mutation. Wenn mindestens
einer der Primer über
eine Klonierungsstelle für
ein Insert in einem Klonierungsvektor hinweg mit seinem korrespondierendem
Templatstrang hybridisiert, liegt die erhaltene, amplifizierte,
geschlossene, ringförmige
DNA in einer Orientierung des Inserts in dem Klonierungsvektor vor.
Wenn das PCR-Reaktionsgemisch darüber hinaus ein modifiziertes
Nukleotid umfasst, umfasst das amplifizierte, geschlossene, ringförmige DNA-Produkt den modifizierten
Nukleotidrest willkürlich
an irgendeiner Stelle eingebaut. Wenn mindestens einer der Primer
ein modifiziertes Nukleotid umfasst, weist das amplifizierte, geschlossene,
ringförmige
DNA-Produkt den modifizierten Nukleotidrest an einer vorgewählten Stelle eingebaut
auf.
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KURZE BESCHREIBUNG
DER VERSCHIEDENEN ANSICHTEN DER ZEICHNUNGEN
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1 zeigt
eine bevorzugte Primerkonfiguration für die Amplifizierung von geschlossener,
ringförmiger
DNA gemäß der vorliegenden
Erfindung.
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2 zeigt
die elektrophoretische Auftrennung einer 1990 bp Plasmid-DNA, die
erfindungsgemäß (LDA)
und mittels PCR (PCR) amplifiziert wurde, im Vergleich zu derselben
Plasmid-DNA, die aus einer Bakterienkultur (Zelle) isoliert wurde,
und Größenmarker
(sog. Ladder); RFI zeigt superspiralisierte DNA an, und RFII zeigt
geschlossene, ringförmige
DNA an.
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3 zeigt
die elektrophoretische Auftrennung einer 1990 bp Plasmid-DNA, die
erfindungsgemäß amplifiziert
wurde, nach 6, 12 und 24 Zyklen im Vergleich zu derselben Plasmid-DNA,
die aus einer Bakterienkultur (Zelle) isoliert wurde; RFI zeigt
superspiralisierte DNA an, und RFII zeigt geschlossene, ringförmige DNA an.
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4 zeigt
die elektrophoretische Auftrennung einer 9516 bp Plasmid-DNA, die
durch das erfindungsgemäße Verfahren
amplifiziert wurde, nach 0 und 20 Zyklen, im Vergleich zu derselben
Plasmid-DNA, die aus einer Bakterienkultur (Zelle) isoliert wurde
und zu Größenmarkern
(Ladder).
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AUSFÜHRLICHE
BESCHREIBUNG
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Bevor
das vorliegende Verfahren zur Herstellung und Amplifikation von
geschlossener, ringförmiger DNA
in vitro in einem zellfreien System offenbart und beschrieben wird,
wird darauf hingewiesen, dass diese Erfindung nicht auf die besonderen
Konfigurationen, Verfahrensschritte und Materialien beschränkt ist,
die hier beschrieben sind, da diese Konfigurationen, Verfahrensschritte
und Materialien etwas variieren können. Es wird auch darauf hingewiesen,
dass die hier verwendete Terminologie lediglich zum Zwecke der Beschreibung besonderer
Ausführungsformen
verwendet wird und nicht einschränkend
wirken soll, da der Umfang der vorliegenden Erfindung lediglich
durch die beigefügten
Ansprüche
und ihrer Äquivalente
begrenzt wird.
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Darüber hinaus
wird festgestellt, dass die in der vorliegenden Beschreibung und
den beigefügten
Patentansprüchen
verwendeten Singularformen "ein", "eine" und "der/die/das" sich auch auf den
entsprechenden Plural beziehen können,
außer
wenn aus dem Zusammenhang eindeutig etwas anderes hervorgeht. So
umfasst beispielsweise eine Bezugnahme auf ein Reaktionsgemisch,
das "eine thermostabile
DNA-Ligase" enthält, ein
Gemisch aus zwei oder mehreren solcher thermostabilen Ligasen, eine
Bezugnahme auf "eine
thermostabile DNA-Polymerase" umfasst
den Bezug auf ein oder mehrere solcher Polymerasen, und eine Bezugnahme
auf "ein Templat" umfasst eine Bezugnahme
auf ein Gemisch von zwei und mehr Templaten.
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Bei
der Beschreibung und Beanspruchung der vorliegenden Erfindung wird
in Übereinstimmung
mit den im folgenden dargelegten Definitionen folgende Terminologie
verwendet.
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Der
hier verwendete Begriff "Ligation
während
Amplifizierung", "LDA" (ligation during
amplification), und ähnliche
Begriffe bedeuten ein Verfahren, das die Verwendung einer thermostabilen
DNA-Ligase in einer PCR-Reaktion unter Bedingungen umfasst, die
die Herstellung und Amplifikation von geschlossener, ringförmiger DNA
erlauben. Das heißt,
die Reaktionsbedingungen erlauben sowohl die Verlängerung
der Primer als auch die Ligation von benachbarten
5'-Phosphatgruppen
und 3'-Hydroxylgruppen
unter Bildung von Phosphodiesterbindungen, wodurch die ringförmige DNA
geschlossen wird. Der Durchschnittsfachmann wird erkennen, dass
die 5'-Phosphatgruppen üblicherweise
von 5'-phosphorylierten
Primern bereitgestellt werden können.
Wie in der Technik gut bekannt ist, können diese 5'-Phosphatgruppen
durch eine Reaktion, die mittels T4-Polynukleotid-Kinase katalysiert
wird, an die Primer angefügt
werden, z. B. J. Sambrook et al., Molecular Cloning 10-59-10.67, 11.31-11.33
(zweite Auflage, 1989), oder zum Zeitpunkt der Primersynthese.
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Der
hier verwendete Begriff "Polymerase-Kettenreaktion" oder "PCR" bedeutet ein Verfahren
zur Amplifikation eines linearen DNA-Segments, wie es beispielsweise
in den US Patenten Nr. 4,683,195 und US Patent Nr. 4,683,202 beschrieben
ist, wobei mindestens zwei Primer und eine DNA-Polymerase verwendet
werden. Bei der derzeitigen Durchführungspraxis wäre eine
solche Polymerase ein thermostabiles Enzym.
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Der
hier verwendete Begriff "PCR-Reaktionsgemisch" bedeutet ein Gemisch,
das zum Durchführen
einer PCR geeignet ist. Das PCR-Reaktionsgemisch enthält eine
geeignete Menge einer thermostabilen DNA-Polymerase, eine Templat-DNA
(vorzugsweise Doppelstränge),
die amplifiziert werden soll, ein Paar von Primern, dergestalt,
dass einer der Primer zum Annealen an einen Strang des Templats
konfiguriert ist und der andere Primer zum Annealen an den anderen
oder komplementären
Strang des Templats konfiguriert ist, ATP, geeignete Mengen eines
jeden der vier Desoxyribonukleosidtriphosphate (dNTPs), und Puffer,
Salze, Konservierungsmittel, Reduktionsmittel und Wasser je nach
Bedarf.
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Der
hier verwendete Begriff "thermostabile
DNA-Ligase" bedeutet
jede DNA-Ligase, die ihre Wirkung zum Ligieren von DNA behält, nachdem
sie mehreren Thermocycling-Zyklen
ausgesetzt wurde, wie es bei der Polymerase-Kettenreaktion oder
PCR geschieht. PCR wird normalerweise durchgeführt, indem ein Zyklus wiederholt
wird, bei dem das Reaktionsgemisch zwischen Temperaturbedingungen
zum Schmelzen oder Denaturieren von doppelsträngiger Templat-DNA (üblicherweise
etwa 95°C),
Annealing der Primer an das geschmolzene (d. h. einzelsträngige) DNA-Templat
(üblicherweise
etwa 50°C),
und Verlängern
der annealierten Primer durch Primer-Verlängerung (üblicherweise etwa 72°C). Die bei
der PCR üblicherweise
verwendeten thermostabilen DNA-Polymerasen überleben
diese Zyklen der Temperaturänderung.
Beispielsweise ist Thermus aquaticus DNA-Polymerase (Taq DNA-Polymerase)
ein thermostabiles Enzym, das DNA bei 74°C repliziert, A. Chien et al.,
127 J. Bacteriol. 1550 (1976); A. S. Kaledin et al., Biokhimiya
494 (1980), und selbst nach einer Inkubation bei 95°C ihre Funktionsfähigkeit
behält.
Im US Patent Nr. 4,889,818 wird beispielsweise eine aus Thermus
aquati cus isolierte, gereinigte, thermostabile DNA-Polymerase beschrieben.
Thermostabile DNA-Ligasen sind auch in der Technik gut bekannt und
im Handel erhältlich.
Beispielsweise ist eine thermostabile DNA-Ligase von Pyrococcus
furiosus (Pfu DNA-Ligase, US Patente Nr. 5,506,137 und 5,700,672)
von Stratagene (La Jolla, Californien) erhältlich. Dieses Enzym katalysiert
die VerknüPfung
von benachbarten 5'-Phosphat-
und 3'-Hydroxy-enden von
doppelsträngiger
DNA bei etwa 45°C
bis 80°C.
Das Enzym ist thermisch hoch stabil, weist bei 95°C eine Halbwertszeit
von mehr als 60 Minuten auf, und das Temperaturoptimum für sog. nick-sealing-Reaktionen
liegt bei etwa 70°C.
Als weiteres Beispiel katalysiert Taq DNA-Ligase (aus Thermus aquaticus)
die Bildung einer Phosphodiesterbindung zwischen nebeneinander liegenden
5'-Phophat- und 3'-Hydroxyltermini zweier benachbarter
Oligonukleotide, die zu einer komplementären DNA hybridisiert werden.
Taq DNA-Ligase ist bei erhöhten
Temperaturen (45°C
bis 65°C)
aktiv. F. Barany, 88 Proc. Nat'l
Acad. Sci. USA 189 (1991); M. Takahashi et al., 259 J. Biol. Chem.
10041–10047
(1984). Als weiteres Beispiel katalysiert thermostabile DNA-Ligase AMPLIGASE® (Epicentre
Technologies) die NAD-abhängige
Ligation von benachbarten 5'-phosphory-lierten
und 3'-hydroxylierten
Termini in DNA Doppelstrukturen. Dieses Enzym weist bei 65°C eine Halbwertszeit
von 48 Stunden und bei 95°C
von mehr als 1 Stunde auf. Es ist auch gezeigt worden, dass diese
thermostabile DNA-Ligase mindestens 500 Thermozyklen (94°C/80°C) oder 16-stündige Zyklen lang
aktiv ist. M. Schalling et al., 4 Nature Genetics 135 (1993).
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Es
ist bekannt, dass viele Enzyme einschließlich Polymerasen und Ligasen
für ihre
Aktivität
Co-Faktoren benötigen.
Beispielsweise benötigt
Taq DNA-Ligase NAD+ als einen Co-Faktor.
Für eine
mittels Taq DNA-Ligase katalysierte Reaktion ist daher die Zugabe
einer geeigneten Menge NAD+ zu dem Reaktionsgemisch
erforderlich.
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Der
hier verwendete Begriff "zur
Denaturierung des Templats geeignete Temperatur" bedeutet eine Temperatur, bei der das
Templat geschmolzen oder denaturiert wird, und zwar in Folge der
in dem Reaktionsgemisch vorliegenden Konditionen, von denen es bekannt
ist, dass sie das Schmelzen von Nukleinsäuren beeinflussen, wie beispielsweise
Strangtyp, Konzentration monovalenter Kationen, GC-Gehalt, Länge der
Nukleinsäure,
Gegenwart oder Abwesenheit von Fehlpaarungen, und Konzentration
bestimmter Lösungsmittel, die
das Schmelzen beeinflussen. Diese Faktoren sind in der Technik bekannt,
ebenso wie empirische Formeln zum Bestimmen der Wärmeschmelztemperaturen
unter ausgewählten
Bedingungen. Es wird eine Temperatur oberhalb der Wärme schmelztemperatur
(Tm) des Templats ausgewählt. Typisch sind Denaturierungstemperaturen
von etwa 95°C.
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Der
hier verwendete Begriff "zum
Annealen der Primer an das denaturierte Templat geeignete Temperatur" bedeutet eine Temperatur,
bei der die Einzelstrangprimer durch Hybridisieren an die denaturierte
(einzelsträngige)
Templat Nukleinsäure
binden. Die selben Faktoren, die die Denaturierung beeinflussen,
beeinflussen auch das Annealing. Da die Primer üblicherweise eine Länge im Bereich
von etwa 10–30
Nukleotidresten aufweisen, im Gegensatz zu Templaten, die üblicherweise
Tausende von Nukleotidresten lang sind, und da die Wärmeschmelztemperaturen
kurzer Nukleinsäuren
niedriger sind als solche für
längere
Nukleinsäuren, liegt
die Annealingtemperatur weit unterhalb der Wärmeschmelztemperatur des Templats.
Typisch ist eine Temperatur von etwa 40–50°C.
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Der
hier verwendete Begriff "zur
Polymerase-katalysierten Verlängerung
der Primer geeignete Temperatur" bedeutet
eine Temperatur, bei der die thermostabile DNA-Polymerase aktiv ist. Die Temperatur
liegt vorzugsweise nahe dem Temperaturoptimum für die Enzyme. Beispielsweise
weist die Thermococcus litoralis DNA-Polymerase ein Aktivitätsmaximum
bei etwa 72–80°C auf. Dies
ist für
thermostabile Polymerasen typisch.
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Der
hier verwendete Begriff "für Ligase-katalysiertes
Schließen
der verlängerten
Primer geeignete Temperatur" bedeutet
eine Temperatur, bei der die thermostabile DNA-Ligase aktiv ist.
Diese Temperatur liegt vorzugsweise nahe dem Temperaturoptimum für die Enzyme
und ist die selbe Temperatur, die zum Durchführen der Polymerase-katalysierten
Verlängerungsreaktion
ausgewählt
wird.
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Ein
beispielhaftes Verfahren für
die Verwendung von LDA zum Ändern
der Nukleotidzusammensetzung und Sequenz einer ringförmigen DNA
und zur selektiven Amplifikation der Sequenz-mutierten, geschlossenen,
ringförmigen
DNA in vitro umfasst die folgenden Schritte:
- (a)
Mischen der geschlossenen, ringförmigen
DNA, die einzelsträngig
oder doppelsträngig
sein kann, um sie mit den 5'-phosphorylierten
Primern, Desoxyribonukleotiden, thermostabiler DNA-Polymerase, thermostabiler
DNA-Ligase, und einem Reaktionspuffer, der sowohl die Aktivität der Polymerase
als auch die der Ligase unterstützt,
zu mutieren und/oder zu amplifizieren; und
- (b) das Gemisch Wärmezyklen
der DNA-Denaturierung bei etwa 90°C,
Primer-Annealing bei etwa 50°C, Primer-Verlängerung
und Ligation bei etwa 70°C
zu unterziehen, um die geschlossene, ringförmige DNA zu erzeugen und zu
amplifizieren.
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Ein
Hauptanwendungsgebiet des vorliegenden Verfahrens ist die Einführung einer
zielgerichteten Mutagenese in geschlossene, ringförmige DNAs.
Durch die Verwendung eines oder mehrerer Mutagenese-Primer in der
LDA-Reaktion kann eine ringförmige
DNA ohne weiteres mutiert und amplifiziert werden. Die LDA-vermittelte
Mutagenese weist gegenüber
anderen Mutagenese-Verfahren klare Vorteile auf.
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Bei
der PCR-basierten Mutagenese, z. B. E. Merino et al., A. General
PCR-Based Method for Single or Combinatorial Oligonucleotide-Directed
Mutagenesis on pUC/M13 Vectors, 12 Bio/Techniques 508–510 (1992),
wird die zu mutierende Sequenz zunächst unter Verwendung mutagener
Primer amplifiziert. Dann wird das mutierte DNA-Fragment gereinigt.
Anschließend
wird die native Sequenz in dem ursprünglichen Vektor mittels Subklonierung
durch das mutierte Fragment ersetzt. Bei einer LDA-vermittelten
Mutagenese ist kein Subklonieren erforderlich, und das mutierte
Plasmid wird amplifiziert und direkt zum Transformieren eines Bakterienwirts
verwendet. Es ist daher eine viel einfachere, leichtere und schnellere
Methode für
die zielgerichtete Mutagenese.
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Das
Verknüpfen
von PCR mit einer thermostabilen DNA-Ligase für zielgerichtete Mutagenese
ist bereits beschrieben worden. Zum Beispiel S. F. Michael, Thermostable
Ligase-Mediated Incorporation of Mutagenic Oligonucleotides During
PCT Amplification, in PCR Cloning Protocols: From Molecular Cloning
to Genetic Engineering 189–195
(B. A. White, Hrsg., 1997). In diesen Verfahren umfasst die PCR-Reaktion
eine thermostabile DNA-Ligase und ein mutagenes Oligonukleotid,
das zu einer Region in einem PCR-Produkt
komplementär
ist. Während
der PCR baut die Ligase die mutagenen Primer in das PCR-Produkt
ein. Das die Mutation enthaltene PCR-Produkt wird dann gereinigt
und in das native Plasmid subkloniert, wie bei anderen PCR-basierten
Verfahren. Offenbar konnte sich der Autor nicht die Möglichkeit
vorstellen, thermostabile Ligase und PCR einzusetzen, um geschlossene,
ringförmige
DNA zu erzeugen und zu amplifizieren.
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Es
gibt viele kommerziell erhältliche
zielgerichtete Mutagenese-Verfahren. Bei dem MORPHTM-Verfahren
von 5Prime → 3Prime,
Inc. (Boulder, Colorado; Katalog Nr. 1-205387) werden beispielsweise
ein mutagener Primer, T4 DNA-Polymerase und T4 DNA Ligase (ein nicht-thermostabiles
Enzym) verwendet, um eine oder zwei Stränge eines Plasmids unter Bildung
eines "halbmutierten" Plasmids zu bilden.
Das mutierte Plasmid muss in einem E. coli mutS-Strang selektiert
werden, der den nativen Strang für
die Plasmidpropagation nicht bevorzugt auswählt. Ein LDA-mutiertes Plasmid
weist diese Einschränkung
nicht auf, da beide DNA-Stränge
mutiert sind und somit das Plasmid in einem nicht-mutS-Strang aufrechterhalten
werden kann. Bei dem Unique Site Elimination(U.S.E.)-Verfahren von
Pharmacia Biotech Inc. (Piscataway, NJ; Katalog Nr. 27-1699-01) werden zwei
mutagene Primer verwendet, die zu dem selben Strang des Plasmids
komplementär sind,
um Mutationen einzuführen.
W. P. Deng & J.
A. Nickoloff, 200 Anal. Biochem. 81 (1992). Ein Primer mutiert die
Targetstelle und ein anderer Primer mutiert eine unique-restriction-site.
Nachdem ein "halbmutiertes" Plasmid mit T4 DNA-Polymerase und T4
DNA-Ligase erzeugt wurde, muss das mutierte Plasmid durch Verdauung
mit dem Restriktionsenzym angereichert werden und durch sequenzielle
Transformation in mutS und nicht-mutS Bakterienstränge selektiert
werden. Bei dem ALTERED SITES® II-Verfahren von Promega
Corp. (Madison, Wisconsin; Katalog Nr. Q6210) wird ein ähnlicher
Ansatz verwendet. Es ist ein spezialisiertes Plasmid erforderlich,
das jedoch ein prämutiertes
und inaktiviertes Antibiotikum-Resistenzgen aufweist. In diesem Verfahren
wird ein "halbmutiertes" Plasmid auf ähnliche
Weise hergestellt, wobei ein mutagener Primer verwendet wird, der
zu der Targetsequenz komplementär
ist und ein anderer mutagener Primer, um das prämutierte Antibiotikum-Resistenzgen
zu korrigieren. Das mutierte Plasmid wird dann sequenziell in mutS
und nicht-mutS Bakterienstränge
transformiert und durch die befreite Antibiotikum-Resistenz ausgewählt. Bei
diesen Mutagenese-Verfahren wird die geschlossene, ringförmige DNA
nicht amplifiziert und es wird lediglich einer der beiden DNA-Stränge in vitro
mutiert. Sie sind im Allgemeinen arbeitsaufwändig, zeitaufwändig und
weisen geringe Mutationsraten auf. Bei dem QuickChangeTM-Verfahren
von Stratagene (La Jolla, Californien; Katalog Nr. 200518) werden
zwei komplementäre
mutagene Primer und eine thermostabile Polymerase verwendet, um
mittels Wärmezyklus
ein mutiertes und gebrochenes Plasmid zu erzeugen. Dieses Verfahren
unterscheidet sich von der LDA darin, dass es in der Reaktion keine
thermostabile DNA-Ligase enthält,
um den Bruch zu heilen und ein geschlossenes, ringförmiges Plasmid
zu erzeugen. Da die mutierten Stränge nicht kovalent geschlossen
sind, werden sie nicht als Template für eine exponentielle Amplifikation
verwendet. Die beiden mutierten Stränge müssen von den intakten nativen
DNA-Strängen
kopiert werden und dann miteinander hybridisiert werden, wobei das
mutierte Plasmid gebildet wird. Die Ausbeute an mutiertem Plasmid
ist daher gering. Anders als bei der LDA kann QuickChangeTM auch nicht zum gleichzeitigen Einführen multipler
Mutationsstellen ver wendet werden, und jede Mutation erfordert zwei
mutagene Primer, die eine komplementäre mutierte Sequenz aufweisen.
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Außer dem
Anwendungsbereich der Mutagenese weist das vorliegende Verfahren
aufgrund der Verwendung Sequenz-spezifischer Primer zum Amplifizieren
geschlossener, ringförmiger
DNA auch die folgenden Anwendungsbereiche auf, ist jedoch nicht
auf diese beschränkt.
(1) Selektieren und Amplifizieren eines Plasmids, das ein Insert
in der gewünschten
Orientierung in einem Ligationsgemisch aufweist. Plasmide mit unerwünschten
Insert-Orientierungen werden nicht amplifiziert. (2) Identifizieren
eines gewünschten
Plasmidklons, in dem dieser direkt amplifiziert wird aus den transformierten
Bakterienkolonien in einer Agarplatte. Plasmide ohne die klonierte
Sequenz werden nicht amplifiziert. Für LDA-Klonscreening sind daher
keine zeitaufwändigen
Verfahrensschritte erforderlich, wie flüssige Kulturen, Plasmidisolierung,
Restriktionskartierung und Sequenzierung. (3) Nachweisen von Punkt-Mutationen
in einer geschlossenen, ringförmigen
DNA. Die Verwendung eines Primers mit einer einzelnen Nukleotid-Fehlpaarung
an seinem 5-Ende erlaubt die Ligation, Amplifikation und somit Identifikation
der entsprechen mutierten DNA. (4) Herstellen geschlossener, ringförmiger DNA,
die modifizierte Nukleotide enthält,
entweder willkürlich
eingebaut in beiden DNA-Strängen
oder an einer spezifischen Stelle oder Stellen durch die Verwendung
eines Primers oder von Primern, welche die modifizierten Nukleotide
enthalten. Diese modifizierten DNA-Moleküle können brauchbar sein bei der
Untersuchung von DNA-DNA- und DNA-Protein-Wechselwirkungen. (5) Isolieren und
Amplifizieren von Vektoren, die ein Gen oder eine Sequenz tragen,
die von Interesse ist, aus Genom- oder cDNA-Bibliotheken. Dieses
LDA-Bibliothek-Screening-Verfahren vereinfacht die Gene-Hunting-Anstrengungen
stark. Zielklone können
rasch isoliert und analysiert werden. (6) Isolieren und Amplifizieren
geschlossener, ringförmiger
viraler DNA aus infizierten Zellen oder Gewebe zur Diagnose und
Charakterisierung. (7) Sicheres Aufrechterhalten und Erzeugen von
replikationskompetenter DNA, einschließlich viraler DNA, in zellfreien
Systemen. Dieser Ansatz kann besonders brauchbar sein, um interessierende
DNA aufrechtzuerhalten, ohne dass ein ausgeklügeltes Zellkultursystem erforderlich
ist. (8) Konvertieren und Amplifizieren von geschlossenen, ringförmigen RNA-Molekülen in ihre komplementären DNA-Gegenstücke. Dies
kann vor oder während
der LDA-Amplifikation unter Verwendung einer reversen Transkriptase
zum Kopieren der RNA in DNA erfolgen.
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Beispiel 1
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Um
die Machbarkeit der Verwendung von LDA zum Erzeugen und Amplifizieren
von geschlossener, ringförmiger
DNA zu demonstrieren, wurden zwei 5'-phosphorylierte Primer (ein 16mer und
ein 17mer) verwendet, um ein ringförmiges 1990 bp Plasmid zu mutieren
und zu amplifizieren. Die Primer waren komplementär zu unterschiedlichen
Strängen
des Plasmids in einer Innenorientierung (inward orientation), d.
h. die 3'-Termini
der Primer auf unterschiedlichen Strängen zeigen aufeinander (1).
Einer der Primer (offener Pfeil) besaß eine einzelne G bis A Fehlpaarung
auf einer HphI-Restriktionsstelle im Bleomycin-Resistenzgen des
Plasmids. Das Reaktionsgemisch (50 μl) enthielt 10 ng des nativen
Plasmids, 10 pmol eines jeden Primers, 10 nmol der vier dNTPs, 5
nmol ATP, 2,5 Einheiten Pfu DNA-Polymerase (Stratagene, La Jolla,
Californien), 4 Einheiten Pfu DNA-Ligase (Stratagene), in 1 × Pfu DNA-Polymerase-Reaktionspuffer
(20 mM Tris-HCl (pH 8,8), 10 mM KCl, 10 mM (NH4)2SO4, 2 mM MgSO4, 1% Triton X-100 und 100 μg/ml bovines
Serumalbumin). Das Gemisch wurde 10 Minuten lang bei 70°C prä-inkubiert,
um es der Ligase zu ermöglichen,
jeden Bruch in dem Templat reparieren. Das Gemisch wurde dann bei
95°C 1 Sekunde
lang einem Wärmezyklus
unterzogen (Denaturierung), 1 Sekunde lang bei 50°C (Annealing),
4 Minuten lang bei 72°C
(Verlängerung),
1 Sekunde lang bei 95°C (Denaturierung),
und 4 Minuten lang bei 72°C
(Annealing, Verlängerung
und Ligation), 20 Zyklen lang. Dieses Verfahren begünstigt die
Bildung von fulllength-Plasmidsträngen und die Bildung von geschlossener,
ringförmiger
Plasmid-DNA. Eine Kontroll-PCR wurde unter ähnlichen Bedingungen durchgeführt, mit
der Ausnahme, dass Pfu DNA-Ligase in dem Reaktionsgemisch nicht
enthalten war. Die LDA- und PCR-Produkte
wurden mittels Agarose-Gel-Elektrophorese zusammen mit dem direkt
aus Bakterienkultur isolierten nativem Plasmid analysiert. Wie in 2 gezeigt
ist, wurde, wenn Pfu DNA-Ligase in der Reaktion enthalten war, d.
h. LDA, eine geschlossene, ringförmige
Plasmid-DNA erzeugt, die in dem Gel geringfügig schneller wanderte als
die relaxierte Form (RFII), jedoch langsamer als die superspiralisierte
Form (RFI) des direkt aus Bakterienkultur isolierten Plasmids. Im
Gegensatz dazu wurde in Abwesenheit von Pfu DNA-Ligase, d. h. PCR,
keine ringförmige
Plasmid-DNA gebildet.
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Beispiel 2
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Um
die Amplifikation von geschlossener, ringförmiger DNA als eine Funktion
der LDA-Zykluszahl
zu demonstrieren, wurde die Vorgehensweise von Beispiel 1 nachgearbeitet,
mit der Ausnahme, dass LDA-Reaktionen für 6, 12 und 24 Zyklen durchgeführt wurden.
Wie in 3 gezeigt ist, nimmt die Plasmidausbeute mit der
Anzahl der LDA-Zyklen zu.
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Beispiel 3
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Um
die funktionelle Kompetenz des LDA-Produkts zu demonstrieren, wurden
die entsprechend der Vorgehensweise von Beispiel 1 hergestellten
amplifizierten Plasmide verwendet, um E. coli DH5α, einen nicht-mutS-Bakterienstamm
zu transformieren. Das LDA-amplifizierte Plasmid wurde zunächst mit
DpnI-Restriktionsenzym verdaut, um die Start-Templat-DNA zu entfernen.
DpnI verdaut DNA nur, wenn seine Erkennungsstelle (5'-GATC-3') methyliert ist,
und somit wird die ursprüngliche
Templat-DNA, jedoch nicht in vitro amplifizierte DNA, verdaut. Nach
der DpnI-Verdauung wurde die amplifizierte DNA in den E. coli Stamm
DH5α mittels
Elektroporation eingeführt.
Die Analyse von zehn willkürlich
gewählten
Transformanten zeigte, dass sämtliche
Klone die gewünschte
Mutation aufwiesen.
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Die
Ergebnisse der Beispiele 1–3
zeigen, wie einfach es ist, LDA zum Einführen von zielgerichteten Mutationen
in geschlossene, ringförmige
Plasmid-DNA zu verwenden und sie zeigen die Machbarkeit der Verwendung
von LDA bei amplifizierter, geschlossener, ringförmiger DNA mit einer spezifizierten
Sequenz in vitro in einem zellfreien System.
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Beispiel 4
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Dieses
Bespiel zeigt, dass die vorliegende Erfindung verwendet werden kann,
um multiple Mutationen gleichzeitig in eine geschlossene, ringförmige DNA
einzuführen.
Drei phosphorylierte mutagene Primer, komplementär zu den BsgI-, BpmI- und BsmI-Stellen
in dem großen
T Antigen-Gen des BK-Virus in einem Plasmid von 5192 bp wurden in
einer LDA-Reaktion verwendet. Der BsgI-Primer war komplementär zu einem
der DNA-Stränge und
die BpmI- und BsmI-Primer zu dem anderen Strang in einer Außenorientierung
(outward orientation), d. h. die 3'-Termini der Primer auf verschiedenen
Strängen
des Plasmids zeigen voneinander weg. Das Reaktionsgemisch (50 μl) enthielt
50 ng des Plasmids, 20 pmol eines jeden Primers, 10 nmol dNTPs,
5 nmol ATP, 2,5 Einheiten Pfu DNA-Polymerase (Stratagene), 4 Einheiten
Pfu DNA-Ligase (Stratagene), in 1 × Pfu DNA-Polymerase-Reaktionspuffer.
Nach den ersten 10 Minuten der Denaturierung bei 95°C wurde das Gemisch
15 Thermozyklen unterworfen bei 50°C für 1 Minute, 72°C für 8 Minuten,
95°C für 1 Minute,
72°C für 8 Minuten,
und 95°C
für 1 Minute.
Nach der LDA-Amplifikation
wurde das Reaktionsgemisch mit dem Restriktionsenzym DpnI verdaut,
um das methylierte native Plasmid zu entfernen und wurde dann in
E. coli DH5α elektroporiert.
Eine Klonanalyse zeigte, dass von zehn getesteten Klonen sämtliche
die BsgI-Stelle
verloren hatten, 8 Klone auch die BpmI-Stelle verloren hatte, und
6 Klone sämtli che
drei Restriktionsstellen verloren hatten. Diese Ergebnisse zeigen,
dass LDA bequem dazu verwendet werden kann, um multiple Mutationen gleichzeitig
in eine geschlossene, ringförmige
DNA einzuführen.
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Beispiel 5
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Dieses
Beispiel zeigt, dass LDA zum Amplifizieren von großen, geschlossenen,
ringförmigen
DNAs verwendet werden kann. Die Größen der meisten Plasmid-Vektoren,
die beim molekularen Klonen verwendet werden, betragen unter 10.000
bp. In diesem Beispiel wurde ein 9516 bp Plasmid mittels LDA amplifiziert.
Die verwendeten Reaktionsbedingungen waren ähnlich den in Beispiel 1 beschriebenen,
mit der Ausnahme, dass die verwendeten Zyklisierungsbedingungen
10 Sekunden lang bei 94°C,
2 Minuten bei 50°C,
10 Minuten bei 72°C,
10 Sekunden bei 94°C
und 10 Minuten bei 72°C,
für 20
Zyklen, betrugen, um der größeren Größe des Plasmids
entgegenzukommen. Ähnlich
der Amplifikation kleinerer Plasmide kann dieses große Plasmid
ebenfalls mittels LDA amplifiziert werden (4). Dieses
Ergebnis zeigt, dass LDA für
die Amplifikation von Plasmid-Vektoren, die üblicherweise beim molekularen
Klonen verwendet werden, anwendbar sein sollte.
-
Beispiel 6
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Dieses
Beispiel zeigt, dass verschiedene thermostabile DNA-Polymerasen
und thermostabile Ligasen zur LDA-Amplifikation verwendet werden
können.
Die folgenden Kombinationen aus thermostabiler DNA-Polymerase und
DNA-Ligase wurden in LDA-Reaktionen
untersucht: (1) Pfu DNA-Polymerase (Stratagene) und Pfu DNA-Ligase
(Stratagene), (2) Pfu DNA-Polymerase (Stratagene) und AMPLIGASE® (eine
thermostabile DNA-Ligase, Epicentre Technologies, Madison, Wisconsin),
(3) ELONGASE® (ein
Gemisch aus Taq DNA-Polymerase und Pyrococcus-Spezies GB-D thermostabiler
DNA-Polymerase, Life Technologies, Gaithersburg, Maryland) und AMPLIGASE®,
(4) VENT® DNA-Polymerase
(Thermococcus litoralis DNA-Polymerase, F. Perler et al., 89 Proc.
Nat'l Acad. Sci.
USA 5577 (1992), New England Biolabs, Beverly, Massachusetts) und
AMPLIGASE®,
(5) BIO-X-ACTTM (ein Gemisch aus thermostabilen
DNA-Polymerasen,
Intermountain Scientic Co., Kaysville, Utah) und Pfu DNA-Ligase
(Stratagene). Wenn LDA unter Verwendung von Pfu DNA-Ligase durchgeführt wurde,
waren die verwendeten Reaktionspuffer diejenigen der DNA-Polymerasen,
die mit ATP ergänzt waren,
das ein Co-Faktor der Ligase ist. Wenn AMPLIGASE® in
der LDA-Reaktion verwendet wurde, bestanden die Reaktionspuffer
aus einem 1:1 Gemisch der Polymerase- und Ligase-Puffer, die von den Herstellern bereitgestellt
wurden. AMPLIGASE® verwen det β-NAD als
einen Co-Faktor und wird von ATP inhibiert, daher müssen die
in der LDA-Reaktion verwendeten phosphorylierten Primer gereinigt
werden, damit sie frei von ATP sind. Alternativ können die
in LDA verwendeten Primer in dem DNA-Synthesizer chemisch phosphoryliert werden.
Sämtliche
dieser Enzymkombinationen funktionierten in den LDA-Reaktionen zum
Amplifizieren von geschlossenen, ringförmigen Plasmiden gut. Die Kombination
von BIO-X-ACTTM DNA-Polymerase und Pfu DNA-Ligase
ergab die höchsten
Ausbeuten an LDA-Produkt, und die erwartete geschlossene, ringförmige DNA
war das einzige Produkt, was mittels Gel-Elektrophorese beobachtet
wurde. Diese Ergebnisse zeigen, dass verschiedene thermostabile
DNA-Polymerasen und -Ligasen in LDA-Reaktionen verwendet werden
können,
um geschlossene, ringförmige
DNA herzustellen und zu amplifizieren.
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Beispiel 7
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Wie
in den vorhergehenden Beispielen gezeigt worden ist, wurde festgestellt,
dass die Aufnahme eines Annealing-Schritts (z. B. Inkubation bei
etwa 72°C)
unmittelbar im Anschluss an einen Denaturierungsschritt (z. B. Inkubation
bei etwa 95°C)
für die
Amplifikation geschlossener, ringförmiger DNA von Bedeutung ist.
Diese Schrittsequenz inhibiert das Annealen der eingesetzten Primer
und erlaubt stattdessen, dass die beiden Stränge des Standard PCR-Produkts
(z. B. ein 68 bp Fragment mit der Darstellung von 1)
an das Templat hybridisieren und für die LDA-Reaktion als Megaprimer
dienen, S. H. Ke & E.
L. Madison, 25 Nucl. Acids Res. 3371–72 (1997). Dies verhindert
eine Akkumulierung des Standard PCR-Produkts (d. h., das durch die 5'-Enden der beiden
Primer definierte Produkt), und begünstigt die Amplifikation des
ganzen ringförmigen
Moleküls.
Wenn das hier beschriebene Thermo-cycling-Protokoll verwendet wird,
kann in der Tat ringförmige
DNA amplifiziert werden, indem entweder nach innen oder nach außen gerichtete
Primer-Orientierungen verwendet werden, die zehn oder Tausende von
Basenpaaren auseinander liegen. In dem vorliegenden Beispiel wurde ein
1990 Basenpaar-Plasmid
gemäß der Vorgehensweise
von Beispiel 1 amplifiziert, mit der Ausnahme, dass die zwei 20-Nukleotid,
5'-phosphorylierten
Primer so gestaltet wurden, dass sie 10 komplementäre Nukleotide an
ihren 5'-Enden aufwiesen
und dass Thermo-cycling-Protokoll lediglich zwei Schritte umfasste,
einen Denaturierunsschritt bei 95°C,
gefolgt von einem Verlängerungs-
und Ligationsschritt bei 68°C.
Die Ergebnisse waren im Wesentlichen ähnlich denjenigen von Beispiel
1.
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Beispiel 8
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In
diesem Beispiel wird ein Gemisch aus einem Wildtyp-Plasmid und einem
mutierten Plasmid hergestellt, das sich von dem Wildtyp-Plasmid
durch eine einzelne Punkt-Mutation
unterscheidet, wobei das Wildtyp-Plasmid in großem Überschuss vorliegt. 5'-phosphorylierte
Primer wurden so gestaltet, dass einer der Primer sein 5'-Nukleotid komplementär zu dem
Nukleotid an der Punkt-Mutation aufweist, wogegen dieser Primer eine
Fehlpaarung mit dem Wildtyp-Plasmid an dem korrespondierenden Nukleotidrest
aufweist. Das Plasmidgemisch wird gemäß der Vorgehensweise von Beispiel
1 verarbeitet, was zu der selektiven Amplifikation des mutierten
Plasmids und der fehlenden Amplfikation des Wildtyp-Plasmids führt. Dieses
Beispiel zeigt, dass LDA zum Nachweis von Punkt-Mutationen verwendet
werden kann.
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Beispiel 9
-
In
diesem Beispiel wird die Vorgehensweise von Beispiel 1 nachgearbeitet,
mit der Ausnahme, dass dATP durch ein Gemisch aus [α-35S]dATPαS
und dATP ersetzt wird. Die erhaltenen, amplifizierten, geschlossenen,
ringförmigen
Plasmide enthalten das modifizierte Nukleotid, was zeigt, dass LDA
zum Amplifizieren von Plasmiden verwendet werden kann, die statistisch
eingebaute modifizierte Nukleotide enthalten.
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Beispiel 10
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In
diesem Beispiel wird die Vorgehensweise von Beispiel 1 nachgearbeitet,
mit der Ausnahme, dass die Primer hergestellt werden, indem [α-35S]dATPαS anstelle
von dATP verwendet wird. Die erhaltenen, amplifizierten, geschlossenen,
ringförmigen
Plasmide enthalten das modifizierte Nukleotid, was zeigt, dass modifizierte
Nukleotide an ausgewählten
Stellen eingeführt
werden können.
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Beispiel 11
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In
diesem Beispiel wird die Vorgehensweise von Beispiel 1 nachgearbeitet,
mit der Ausnahme, dass die Templat-DNA ein Gemisch aus DNAs ist,
die aus einer humanen genomischen Bibliothek hergestellt wurden,
und die Primer zum Amplifizieren des β-Actin-Gens ausgelegt sind. Die erhaltene,
amplifizierte, geschlossene, ringförmige DNA enthält das β-Actin-Gen.
Dies zeigt, dass LDA zum Amplifizieren eines interessierenden Gens
aus einer genomischen oder cDNA-Bibliothek verwendet werden kann,
ohne dass ein Sreenen gemäß den Standardverfahren
der Kolonie- oder Plaque-Hybridisierung erforderlich ist.
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Beispiel 12
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In
diesem Beispiel wird die Vorgehensweise von Beispiel 1 nachgearbeitet,
mit der Ausnahme, dass das Templat gereinigte SV40 DNA ist, und
die Primer zum Amplifizieren einer derartigen SV40 DNA ausgelegt sind.
Die erhaltene, amplifizierte DNA ist kovalent geschlossene, ringförmige SV40
DNA. Dies zeigt, dass LDA verwendet werden kann, um replikationskompetente
DNA sicher zu erzeugen, einschließlich viraler DNA, in einem
zellfreien System.
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Beispiel 13
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In
diesem Beispiel wird die Vorgehensweise von Beispiel 1 nachgearbeitet,
mit der Ausnahme, dass das Templat ein Gemisch aus Plasmiden ist,
die das β-Actin-Gen
aufweisen, kloniert in beiden möglichen
Orientierungen in pBR322, und die Primer durch Überbrücken der Klonierungsstellen
ausgewählt
werden, um die Gene in lediglich einer Orientierung selektiv zu
amplifizieren. Die erhaltene, amplifizierte, geschlossene, ringförmige DNA
enthält
das β-Actin-Gen
in der ausgewählten
Orientierung. Dies zeigt, dass LDA zum selektiven Amplifizieren
eines in einer ausgewählten
Orientierung geklonten Gens verwendet werden kann.
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Beispiel 14
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In
diesem Beispiel wird das Plasmid pBR322 gemäß der Vorgehensweise von Beispiel
1 amplifiziert, wobei 5'-phosphorylierte
Primer, Seq Id Nr. 1 und Seq Id Nr. 2, verwendet werden. Die erhaltene,
amplifizierte DNA ist geschlossene, ringförmige DNA.
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