DE602004004491T2

DE602004004491T2 - Verfahren zur Herstellung von zirkulären mutierten und/oder chimären Polynukleotiden

Info

Publication number: DE602004004491T2
Application number: DE602004004491T
Authority: DE
Inventors: Peter Kratzsch; Herbert Dr. Von Der Eltz; Rainer Dr. Schmuck; Mara Dr. Boenitz-Dulat
Original assignee: Roche Diagnostics GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 2003-12-04
Filing date: 2004-12-02
Publication date: 2007-12-13
Anticipated expiration: 2024-12-03
Also published as: US20050153338A1; ES2280891T3; ATE352616T1; JP2005185282A; JP4116615B2; EP1548113A1; CA2486900A1; EP1548113B1; DE602004004491D1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein schnelles, einfaches und effizientes In-vitro-Verfahren zur Erzeugung mutierter zirkulärer Polynukleotidmoleküle. Das Verfahren basiert auf der Bereitstellung einer geschlossenen zirkulären Polynukleotidmatrize, die ein erstes interessierendes Gen umfasst, der Bereitstellung von Fragmenten eines doppelsträngigen DNA-Zielpolynukleotids, welches das zweite interessierende Gen enthält, die zur Hybridisierung an das erste interessierende Gen fähig sind, wobei die Fragmente freie 3'-OH-Enden sowie phosphorylierte 5'-Enden aufweisen, Erzeugen von Einzelsträngen sowohl des Matrizenpolynukleotids als auch der Fragmente des Zielpolynukleotids, Anlagern der Fragmente des DNA-Zielpolynukleotids in einer Annealing-Reaktion an das zirkuläre Polynukleotid, Verlängern der Fragmente, z.B. unter Verwendung einer DNA-Polymerase, Ligieren der verlängerten Fragmente miteinander, z.B. unter Verwendung einer DNA-Ligase. Diese Schritte führen zu einer rekombinierten und/oder mutierten zirkulären Tochterstrang-DNA. Um die Mutations- und/oder Rekombinationshäufigkeit weiter zu erhöhen, werden die Schritte Anlagern, Verlängerung und Ligierung 1 bis 100 mal wiederholt. Durch dieses Verfahren wird leicht eine Mehrzahl an mutierten und/oder chimären Polynukleotiden erhalten. Die Erfindung offenbart außerdem Verfahren zur Gewinnung rekombinanter Biomoleküle auf Basis solcher mutierten Polynukleotide.
Es besteht großes Interesse an Biomolekülen für medizinische, industrielle und wissenschaftliche Anwendungen (Powell, K.A., et al., Directed Evolution and Biocatalysis, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 40 (2001) 3948–3959) (Kirk, O., et al., Industrial enzyme applications, Curr. Opin. Biotechnol. 13 (2002) 345–351).
Einige Anwendungen erfordern Biomoleküle mit ganz speziellen Eigenschaften oder Merkmalen, die in der Natur nicht vorkommen oder sehr schwer zu finden sind.
Eine Weise zur Erzeugung solcher Biomoleküle ahmt das Prinzip der natürlichen Evolution nach. Zufällige Mutanten eines Biomoleküls werden erzeugt, und eine Mutante mit der gewünschten Eigenschaft wird durch ein geeignetes Screeningverfahren selektiert. Diese Art des Ansatzes wird als "gerichtete Evolution" bezeichnet (Arnold, F.H., und Volkov, A.A., Directed evolution of biocatalysts, Current Opinion in Chemical Biology 3 (1999) 54–59).
Zur Erzeugung dieser Mutanten können verschiedene Techniken verwendet werden (Vasserot, A.P., et al., Optimization of protein therapeutics by directed evolution, Drug Discov Today 8 (2003) 118–126) (Graddis, T.J., et al., Designing proteins that work using recombinant technologies, Curr. Pharm. Biotechnol. 3 (2002) 285–297) (Brakmann, S., Discovery of superior enzymes by directed molecular evolution, Chembiochem. 2 (2001) 865–871).
Die heutzutage verwendeten Verfahren zur Erzeugung von Biomolekülen mit gewünschten Eigenschaften können grob unterteilt werden in Techniken, die Punktmutationen einführen, und in Techniken, bei denen ähnliche, aber nicht identische Polynukleotidsequenzen rekombiniert werden.
Der erste Typ von Verfahren führt zu mutierten Polynukleotiden durch Einführen zufälliger Punktmutationen in die interessierende Sequenz, z.B. aufgrund einer fehleranfälligen Polymerasekettenreaktion (PCR) (Cadwell, R.C., und Joyce, G.F., PCR Methods Appl. 2 (1992) 28–33), Verwendung so genannter Mutatorstämme (Greener, A., et al., Methods Mol. Biol. 57 (1996) 375–385) oder der Behandlung der DNA mit chemischen Mutagenen (Deshler, J.O., Gen. Anal. Techn. Appl. 9 (1992) 103–106).
Der zweite Typ einer Technik, der zu chimären Polynukleotiden führt, umfasst die Rekombination von Genen oder Genfragmenten, die von verschiedenen Varianten eines Gens stammen.
In WO 01/34835 sind Techniken zur Rekombination funktioneller Domänen beschrieben.
Das am häufigsten verwendete Rekombinationsverfahren zur Optimierung von Biomolekülen bezeichnet man als "DNA-Shuffling" ( US 5,834,252 ; US 5,605,793 ; US 5,830,721 ; US 5,837,458 ; US 5,811,238 ). Dieses Verfahren umfasst die Erzeugung doppelsträngiger Fragmente von verschiedenen doppelsträngigen DNA-Matrizen, wobei die verschiedenen DNA-Matrizen homologe und heterologe Bereiche enthalten. Die Wiederzusammenlagerung der zufälligen Fragmente erfolgt durch eine PCR-ähnliche Reaktion ohne weitere Zugabe von Primern. Das Auftreten überlappender Domänen der DNA-Sequenzen, die füreinander als Primer/Matrizen wirken können, ist für eine erfolgreiche Wiederzusammenlagerung wesentlich. Aufgrund der schlechten Ausbeute der rekombinierten DNA-Sequenz nach der Wiederzusammenlagerung muss sie in der Regel durch eine zusätzliche PCR-Reaktion amplifiziert werden, und anschließend muss sie in ein geeignetes Expressionssystem kloniert werden. Die Genprodukte können dann in geeignete Wirtszellen transformiert, exprimiert und anschließend auf eine verstärkte oder neue Eigenschaft gescreent werden.
Methodische Alternativen zum DNA-Shuffling sind Zufallspriming-Rekombination (random priming recombination, RPR) (Shao, Z., et al., Nucleic Acids Res. 26 (1998) 681–683) und das stufenweise Verlängerungsverfahren (staggered extension process, StEP)(Zhao, H., et al., Nat. Biotechnol. (1998) 16258–16261).
Ortsspezifische Mutationen können durch die in WO 02/16606; WO 99/35281 offenbarten Verfahren erzielt werden. Diese Verfahren verwenden zirkuläre DNA als Matrize, und ortsspezifische Mutationen werden unter Verwendung speziell gestalteter Primer, die bereits Punktmutationen umfassen, eingeführt.
WO 01/29211 beschreibt ebenfalls ein Rekombinationsverfahren. Das Matrizenpolynukleotid gemäß diesem Verfahren wird nicht in eine zirkuläre DNA integriert, wodurch es notwendig wird, die rekombinierte DNA nach der Rekombination in ein geeignetes Expressionssystem einzusetzen.
Ein weiteres Verfahren zum Erhalten chimärer Gene ist in WO 00/09697 beschrieben. Das dort offenbarte Verfahren erzielt eine größere Diversität rekombinierter DNA-Moleküle unter Verwendung verschiedener Arten Von Linear-Assembly-DNA-Matrizen.
Trotz des erheblichen Fortschritts in den verschiedenen Verfahren, die zu mutierten und insbesondere chimären Polynukleotiden führen, besteht immer noch ein starker Bedarf an der Bereitstellung eines Verfahrens zur Erzeugung chimärer Polynukleotide, die dazu beitragen, die bekannten Nachteile der Verfahren des Standes der Technik zumindest teilweise zu überwinden.
Das Ziel der vorliegenden Erfindung war daher, ein einfaches und effizientes DNA-Rekombinationsverfahren zur Gewinnung chimärer Polynukleotide zu entwickeln, indem die Anzahl der Arbeitsschritte so weit wie möglich verringert und gleichzeitig ein hohes Maß an Diversität in den erhaltenen chimären Polynukleotiden erzielt wird.
Es wurde gefunden, dass die Nachteile der im Stand der Technik bekannten Verfahren durch die erfindungsgemäßen Verfahren, Wirtszellen und rekombinanten Biomoleküle zumindest teilweise überwunden werden können.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erzeugung eines mutierten und/oder chimären Polynukleotids, wobei man in dem Verfahren eine ein erstes interessierendes Gen umfassende geschlossene zirkuläre Polynukleotidmatrize bereitstellt, Fragmente eines ein zweites interessierendes Gen umfassenden doppelsträngigen DNA-Zielpolynukleotids bereitstellt, die zur Hybridisierung an das erste interessierende Gen fähig sind, wobei die Fragmente freie 3'-OH-Enden sowie phosphorylierte 5'-Enden aufweisen, Einzelstränge sowohl des Matrizenpolynukleotids als auch der Fragmente des Zielpolynukleotids erzeugt, die Fragmente des Zielpolynukleotids in einer Annealing-Reaktion an das Matrizenpolynukleotid anlagert, die angelagerten Fragmente des Zielpolynukleotids mittels DNA-Polymerase verlängert, die Lücken zwischen den verlängerten Fragmenten unter Verwendung einer DNA-Ligase ligiert, wodurch ein chimäres zirkuläres Volllängen-DNA-Molekül erzeugt wird, und dann das chimäre zirkuläre Volllängen-DNA-Molekül wiederholt als geschlossenes zirkuläres DNA-Matrizenpolynukleotid verwendet, indem wiederum Einzelstränge erzeugt, in einer Annealing-Reaktion aneinandergelagert, verlängert und ligiert werden, wie vorstehend beschrieben. Weil diese Technologie unter einigen Aspekten der sehr bekannten Polymerasekettenreaktion ähnelt, wird der Begriff Polymerasekettenchimärisierung (PCC) vorgeschlagen.
Ein Verfahren zur Gewinnung einer transformierten Wirtszelle durch Einbringen eines mutierten und/oder chimären Polynukleotids, das gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren erhalten wird, ist ebenfalls offenbart.
Zusätzlich ist eine Wirtszelle offenbart, die ein mutiertes und/oder chimäres Polynukleotid enthält, das gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren erhalten wird.
Eine weitere Ausführungsform betrifft ein Verfahren zur Gewinnung eines rekombinanten Biomoleküls, wobei man in dem Verfahren ein mutiertes und/oder chimäres Polynukleotid unter Verwendung eines erfindungsgemäßen Verfahrens gewinnt, das mutierte und/oder chimäre Polynukleotid in einen entsprechenden Wirt transformiert, das rekombinierte Gen exprimiert und ein Screening auf das rekombinante Biomolekül durchführt.
Beschreibung der Erfindung
Bei einer ersten bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Erzeugung eines mutierten und/oder chimären Polynukleotids, wobei man in dem Verfahren eine ein erstes interessierendes Gen umfassende geschlossene zirkuläre Polynukleotidmatrize bereitstellt, Fragmente eines von einem zweiten interessierenden Gen stammenden doppelsträngigen DNA-Zielpolynukleotids bereitstellt, die zur Hybridisierung an das erste interessierende Gen fähig sind, wobei die Fragmente freie 3'-OH-Enden sowie phosphorylierte 5'-Enden aufweisen, Einzelstränge sowohl des Matrizenpolynukleotids als auch der Fragmente des Zielpolynukleotids erzeugt, die Fragmente des Zielpolynukleotids in einer Annealing-Reaktion an das Matrizenpolynukleotid anlagert, die angelagerten Fragmente des Zielpolynukleotids mittels DNA-Polymerase verlängert, die Lücken zwischen den verlängerten Fragmenten unter Verwendung einer DNA-Ligase ligiert, wodurch ein chimäres zirkuläres Volllängen-DNA-Molekül erzeugt wird. Das mutierte und/oder chimäre zirkuläre Volllängen-DNA-Molekül kann dann wiederholt als geschlossene zirkuläre Polynukleotidmatrize in den nächsten Chimärisierungszyklen verwendet werden, indem wiederum Einzelstränge erzeugt, in einer Annealing-Reaktion aneinandergelagert, verlängert und ligiert werden, wie vorstehend beschrieben. Der Einfachheit halber wird dieses Verfahren als Chimärisierungsverfahren bezeichnet, obwohl andere vorteilhafte Mutanten ohne Rekombinationsereignis ebenfalls durch das erfindungsgemäße Verfahren erhalten werden.
Der Begriff "mutiertes und/oder chimäres Gen" wird dazu verwendet anzuzeigen, dass mutierte und/oder chimäre Polynukleotide mit hoher Frequenz unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens erhalten werden. Wie im Stand der Technik bekannt, sind Mutationen zum Beispiel Punktmutationen, Deletionen und Insertionen. Ein chimäres Polynukleotid im Sinne der vorliegenden Erfindung ist ein beliebiges interessierendes Gen, das mindestens 15 aufeinander folgende Polynukleotide umfasst, die von zwei verschiedenen interessierenden Genen stammen. Obwohl der hauptsächliche Vorteil der vorliegenden Erfindung die hohe Frequenz der Chimärisierung ist, die erhalten wird, hat sie somit die zusätzliche und willkommene Nebenwirkung, dass mutierte Polynukleotide ebenfalls häufig erzeugt werden, wenn das erfindungsgemäße Chimärisierungsverfahren verwendet wird. Der Begriff "und/oder" wird dazu verwendet anzuzeigen, dass Polynukleotide erhalten werden, die nur Mutationen, Mutationen sowie chimäre Sequenzen oder chimäre Sequenzen in Abwesenheit weiterer Mutationen umfassen.
Das durch ein erfindungsgemäßes Verfahren selektierte Gen ist vorzugsweise ein chimäres Gen mit oder ohne zusätzliche Mutationen.
Ein "interessierendes Gen" betrifft jede Polynukleotidsequenz, die eine Eigenschaft aufweist, die durch ein geeignetes Screening- oder Selektionsverfahren selektiert oder gescreent werden kann. Die vorliegende Erfindung nutzt auch mindestens ein "erstes" und ein "zweites" interessierendes Gen.
Der Begriff "ein" in Zusammenhang mit dem ersten oder dem zweiten interessierenden Gen darf nicht so verstanden werden, dass er sich ausschließlich auf ein einzelnes Gen bezieht. Stattdessen kann die vorliegende Erfindung auch erfolgreich unter Verwendung mehrerer verschiedener Matrizen- sowie mehrerer verschiedener Zielgene angewendet werden. Vorzugsweise stellen alle diese Matrizen- und Zielgene Varianten eines einzigen Gens dar. Es ist jedoch bevorzugt, drei, zwei und/oder nur ein Matrizen- oder Zielgen bzw. -gene zu verwenden.
Offensichtlich beeinflusst das Molverhältnis des Matrizengens zu Fragmenten eines Zielgens den Grad der erzielten Chimärisierung. Molverhältnisse (Fragmente/Matrize) von 15–1000 werden empfohlen, wobei Verhältnisse von 10–500, 20–400 und 30 zu 300 am stärksten bevorzugt sind.
Das erste und das zweite interessierende Gen müssen zumindest teilweise homolog sein, damit Hybridisierung und Aneinanderlagerung in einer Annealing-Reaktion, wie für das erfindungsgemäße Verfahren erforderlich, möglich sind. Der Fachmann hat kein Problem bei der Auswahl geeigneter Paare von Genen zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens.
Um eine angemessene Frequenz von Hybridisierung oder Aneinanderlagerung in einer Annealing-Reaktion zu erhalten, müssen das Matrizen- und das Zielgen eine Homologie von mindestens 40% haben. Vorzugsweise beträgt die Homologie zwischen den zwei Genen mindestens 50%. Die Homologie ist vorzugsweise höher und zumindest 60% oder zumindest 70%. Am stärksten bevorzugt ist die Homologie 80% oder mehr, wie in dem nachstehend beschriebenen Verfahren bestimmt.
Die Homologie zwischen dem ersten und dem zweiten interessierenden Gen wird vorzugsweise durch das PileUp-Programm des GCG-Paktes, Version 10.2 (Genetics Computer Group, Inc.) analysiert. PileUp erzeugt eine Ausrichtung mehrerer Sequenzen aneinander unter Verwendung einer Vereinfachung des progressiven Alignment-Verfahrens von Feng, D.F., und Doolittle, R.F., J. Mol. Evol. 25 (1987) 351–360, und die Bewertungsmatrizes für identische, ähnliche oder verschiedene Aminosäurereste werden dementsprechend definiert. Dieses Verfahren beginnt mit dem paarweisen Alignment der zwei ähnlichsten Sequenzen, wodurch ein Cluster von zwei aneinander ausgerichteten Sequenzen erzeugt wird. Dieses Cluster kann dann mit der nächsten am meisten verwandten Sequenz oder dem nächsten am meisten verwandten Cluster von aneinander ausgerichteten Sequenzen ausgerichtet werden. Zwei Cluster von Sequenzen können durch einfache Ausweitung des paarweisen Alignment von zwei einzelnen Sequenzen aneinander ausgerichtet werden. Das endgültige Alignment erfolgt durch eine Reihe progressiver, paarweiser Alignments, die mehr und mehr unterschiedliche Sequenzen und Cluster einschließen, bis alle Sequenzen in das endgültige paarweise Alignment eingeschlossen sind.
Der Einfachheit halber kann Sequenzidentität untersucht werden, wenn das Matrizen- und das Zielgen verglichen werden. Bei solchen Vergleichen werden einzelne Nukleotide an entsprechenden Sequenzpositionen miteinander verglichen. Die Sequenzidentität beträgt vorzugsweise mindestens 40% für mindestens eine Teilsequenz von 30 Nukleotiden Länge. Stärker bevorzugt ist die Sequenzidentität höher und mindestens 50% oder noch stärker bevorzugt mindestens 60%.
Viele in der Natur vorkommende verwandte Gene dienen in verschiedenen Individuen sowie in verschiedenen Spezies dem gleichen Zweck. Zum Beispiel wird Hämoglobin zum Transport von Sauerstoff im Blut verwendet. Es ist bekannt, dass innerhalb der menschlichen Spezies Hämoglobin mit leicht unterschiedlichen Sequenzen (die man als Allele kennt) vorkommt, wohingegen bei anderen Säugern Hämoglobin mehr Unterschiede auf Sequenzebene aufweist. Diese Gene stellen somit natürlich vorkommende Varianten eines einzigen Gens oder Genlocus dar. Vorzugsweise stellen sowohl ein Matrizen- als auch ein Zielgen natürlich vorkommende Varianten eines einzigen Gens dar.
Der Fachmann erkennt, dass jede Kombination von Matrizen- und Zielgen geeignet ist, solange Fragmente des Zielgens an das Matrizengen hybridisieren. Die Hybridisierungsbedingungen können variiert werden, z.B. durch Ändern der Pufferbedingungen. Erfindungsgemäß kann die Annealing-Reaktion vorzugsweise in einem Puffer durchgeführt werden, der aus 0,2 M Tris-HCl, 0,02 M MgSO₄, 0,1 M KCl, 0,1 M (NH₄)₂SO₄, 1 % Triton X-100 und 1 mg Rinderserumalbumin (BSA)/ml bei pH 8,8 besteht. Jedes Paar von Matrizen- und Zielgen, das eine ausreichende Anzahl an Annealing-Ereignissen in der ersten Runde der Chimärisierung in diesem Puffer ergibt, ist für die Durchführung des erfindungsgemäßen Chimärisierungsverfahrens geeignet.
Das erste interessierende Gen wird als interner Bestandteil eines geschlossenen zirkulären Polynukleotids bereitgestellt. Der Einfachheit halber wird das erste interessierende Gen, wie es in einem geschlossenen zirkulären Polynukleotid enthalten ist, auch als "Matrizen"gen bezeichnet.
Jeder Typ des zirkulären Polynukleotids (RNA oder DNA) oder sogar zirkuläre Pseudopolynukleotide, die Nukleotidanaloga umfassen, wie zum Beispiel Peptidnukleinsäuren (PNAs), können als erstes Polynukleotid verwendet werden. Bei einer vorteilhaften und bevorzugten Ausführungsform ist das erste Polynukleotid, welches das Matrizengen umfasst, eine Desoxyribonukleinsäure (DNA). Das geschlossene zirkuläre Polynukleotid ist am stärksten bevorzugt doppelsträngige DNA.
Es gibt viele Verfahren, um ein bestimmtes Gen zu klonieren und es in ein geeignetes Expressionssystem einzusetzen, die hier nicht genannt werden müssen. Der Einfachheit halber wird erwähnt, dass dem Fachmann diese Verfahren gut bekannt sind, die zum Beispiel in Current Protocols in Molecular Biology Band 1–4, herausgegeben von Ausubel, F.M., et al., Massachusetts General Hospital and Harward Medical School von John Wiley & Sons, Inc., zusammengefasst sind.
Das Matrizengen kann leicht amplifiziert und gleichzeitig methyliert werden, indem das Plasmid in einen geeigneten Wirtsstamm transformiert, der plasmidtragende Stamm für eine angemessene Zeit angeimpft und das Plasmid aus der Zellkultur isoliert wird. Die Verwendung eines methylierten zirkulären Polynukleotids bietet einen zusätzlichen Vorteil. Nachdem die Chimärisierung bei einem erfindungsgemäßen Verfahren beendet ist, kann die methylierte DNA (d.h. das Ausgangsmaterial) unter Verwendung spezifischer Restriktionsenzyme, die nur methylierte DNA schneiden, leicht entfernt werden. Weil die anfängliche Matrize methylierte DNA ist und nur nicht-methylierte zirkuläre mutierte und/oder chimäre DNA-Moleküle erzeugt werden, kann die Ausgangs-Matrize unter Verwendung eines Enzyms, wie DpnI, das nur Methyl-DNA spaltet, entfernt werden. Die am stärksten bevorzugte Weise zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst somit die Verwendung einer methylierten geschlossenen zirkulären DNA als das Polynukleotid, welches das erste interessierende Gen enthält.
Vorzugsweise ist die Polynukleotidsequenz des ersten interessierenden Gens das Volllängen-Polynukleotid für dieses Gen. Wie der Fachmann erkennt, kann dieses Gen jedoch verkürzt sein, so dass es nur partielle Sequenzen eines Gens darstellt. Die minimale erforderliche Länge ist ein Polynukleotid, das eine biologische Aktivität oder Funktion aufweist, die durch jedes geeignete Screening- oder Selektionsverfahren identifiziert werden kann.
Das zweite interessierende Gen wird der Einfachheit halber auch als "Ziel"gen bezeichnet. Das Zielgen muss in doppelsträngiger Form und vorzugsweise als DNA-Doppelstränge verfügbar sein. Eine exponentielle Amplifikation während der verschiedenen Runden der Chimärisierung wird nur erreicht, wenn die von dem Zielgen stammenden Fragmente sowohl Fragmente des Sense- als auch des Antisense-Strangs umfassen.
Das Zielgen oder -polynukleotid wird nicht als kontinuierliches Volllängen-Molekül, sondern in fragmentierter Form bereitgestellt. Wie der Fachmann erkennt, können geeignete Fragmente eines doppelsträngigen DNA-Polynukleotids durch verschiedene Mittel erzeugt werden. Die Verfahren zur Bereitstellung eines doppelsträngigen Zielpolynukleotids sind nicht entscheidend, solange darauf geachtet wird, dass mindestens einige der so erzeugten Fragmente zur Hybridisierung an das erste interessierende Gen fähig sind, mit der zusätzlichen Voraussetzung, dass die bereitgestellten Fragmente ein 3'-OH bzw. eine Phosphatgruppe am 5'-Ende haben. Am stärksten bevorzugt sind Verfahren, die zu einer zufälligen Fragmentierung des Zielgens führen.
Zufällige Fragmente können durch viele, dem Fachmann bekannte Verfahren erhalten werden. Eine Möglichkeit wäre die Amplifikation der interessierenden DNA-Sequenz mittels PCR und das zufällige Schneiden des PCR-Produkts durch eine Endonuklease, was zu Fragmenten mit den erforderlichen 3'- und 5'-Phosphat-Enden führt. Zum Beispiel kann ein Verdau in sehr kurzer Zeit mit DNAse I erzielt werden, und der Grad des Verdaus kann auf einem Agarosegel überwacht werden. Nachdem der gewünschte Grad der Fragmentierung erreicht worden ist, kann die Umsetzung gestoppt werden, z.B. durch Erhitzen der Probe auf 95°C für 5 Minuten, wodurch die Nuklease zerstört wird. Die DNAse I kann dann von den Fragmenten durch verschiedene Verfahren abgetrennt werden, d.h. unter Verwendung von Polymerasekettenreaktions- (PCR-) Reinigungskits, die kommerziell erhältlich sind. Eine andere Möglichkeit wäre die Verwendung sehr kurzer Primer zur zufälligen Anlagerung mittels Annealing in einer PCR-Reaktion mit der zweiten interessierenden DNA-Sequenz als Matrize, was zu PCR-Produkten verschiedener Längen führt, und die 5'-Enden der so erhaltenen Fragmente können dann mit einer geeigneten Kinase phosphoryliert werden. In der Regel sollten Fragmente mit einer Länge zwischen 8 und 1000 Basenpaaren (Bp) verwendet werden. Bei einer bevorzugten Ausführungsform liegt der größte Teil (mehr als 50%) der verwendeten Fragmente zwischen 10 und 300 Bp.
Die Begriffe Annealing, Verlängern und Ligieren, wie in der vorliegenden Erfindung verwendet, haben die Bedeutungen, die ihnen der Fachmann zuschreibt.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann 1–100 mal wiederholt werden. Während in der ersten Runde der Chimärisierung nur die geschlossene zirkuläre Polynukleotidmatrize, die das erste interessierende Gen umfasst, vorliegt, ist in jedem der folgenden Zyklen eine stetig steigende Anzahl bereits mutierter und/oder chimärer geschlossener zirkulärer DNA-Polynukleotide vorhanden, die wiederum als Matrize für den nächsten erfindungsgemäßen Zyklus dienen. Die Verwendung von Polynukleotiden, die bereits mutiert und/oder chimäre Polynukleotide sind, als Matrizen in den aufeinander folgenden Runden der Chimärisierung erhöht die Gesamtanzahl an verschiedenen mutierten und/oder chimären Molekülen weiter.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist in 1 weiter veranschaulicht. In einem ersten Schritt werden einzelsträngige Moleküle sowohl für die Matrize als auch das Zielpolynukleotid erzeugt. In einem zweiten Schritt werden einzelsträngige DNA-Fragmente eines interessierenden Zielgens oder einer interessierenden Zielsequenz in einer Annealing-Reaktion an ein Matrizenpolynukleotid angelagert, das in einem zirkulären geschlossenen einzelsträngigen Polynukleotidmolekül enthalten ist. Die angelagerten Fragmente werden durch eine DNA-Polymerase verlängert, bis das Enzym auf ein bereits gebundenes Fragment trifft. Die DNA-Polymerase fällt dann von dem DNA-Strang ab und hinterlässt eine Lücke zwischen den verlängerten 3'-OH-Enden eines Fragments und den 5'-Phosphat-Enden eines Fragments. Der Spalt oder die Lücke wird durch eine DNA-Ligase geschlossen, welche die 3'-OH-Verlängerung an das phosphorylierte 5'-Ende des nächsten gebundenen Fragments ligiert. Eine doppelsträngige DNA, die zwei geschlossene zirkuläre DNA-Moleküle umfasst, wird als Endergebnis eines derartigen Chimärisierungszyklus erhalten. Für den Fachmann ist offensichtlich, dass die Anzahl der angelagerten Fragmente den Grad der Chimärisierung der interessierenden DNA-Sequenzen bestimmt. Das erfindungsgemäße Verfahren bietet den hauptsächlichen Vorteil, dass das doppelsträngige geschlossene zirkuläre Polynukleotid, das in der ersten oder, allgemeiner gesagt, in einer vorherigen Chimärisierungsrunde erhalten wird, direkt in der nächsten Chimärisierungsrunde verwendet werden kann. Um eine nächste Chimärisierungsrunde durchzuführen, wird der in der ersten Runde erhaltene Doppelstrang geschmolzen, und beide einzelsträngigen zirkulären Moleküle dienen jetzt als Matrizenpolynukleotid im nächsten Chimärisierungszyklus. Vorzugsweise werden zwei bis fünfzig Chimärisierungszyklen, wie vorstehend beschrieben, durchgeführt. Dies führt zu einer stetig zunehmenden Anzahl an Rekombinationen, die zu einer großen Diversität von mutierten und/oder chimären Polynukleotiden führt. Zwischen 15 und 35 Chimärisierungszyklen werden am stärksten bevorzugt verwendet.
Das effiziente und angenehme erfindungsgemäße Chimärisierungsverfahren kann leicht in einem einzigen Gemisch von Reagentien durchgeführt werden, das alle erforderlichen Reaktanten enthält. Einzelheiten bevorzugter Reaktanten sind weiter unten sowie im Abschnitt Beispiele angegeben. Wenn erforderlich, kann das erfindungsgemäße Verfahren auch in Schritten durchgeführt werden, z.B. können Fragmente des Zielpolynukleotids zu Beginn und dann wieder nach einer angemessenen Anzahl von Chimärisierungszyklen zugegeben werden. Solche und ähnliche Modifikationen sind natürlich im Umfang der vorliegenden Erfindung möglich.
Die Chimärisierung kann erzielt werden, indem eine PCR-ähnliche Reaktion unter Verwendung eines geschlossenen zirkulären Polynukleotids, welches das Matrizengen umfasst, und von Fragmenten des Zielgens mit beiden Orientierungen als Primer durchgeführt wird. Vorzugsweise wird die Reaktion bei erhöhten Temperaturen durchgeführt. Die Verwendung einer thermostabilen DNA-Polymerase und einer thermostabilen DNA-Ligase, wie die DNA-Polymerasen und -Ligasen, die aus Organismen wie Pyrococcus furiosus, Thermos aquaticus usw. erhalten werden, ist ebenfalls bevorzugt. Es ist auch zu empfehlen, eine DNA-Polymerase mit Korrekturaktivität zu verwenden, um zu gewährleisten, dass ungewünschte Polymerisationsfehler über die interessierende DNA-Sequenz hinaus vermieden werden. Dies ist auch für die Beibehaltung eines intakten Expressionssystems vorteilhaft.
Wie vorstehend beschrieben, dient das Produkt eines Chimärisierungszyklus als Matrize für die restlichen Fragmente in dem Reaktionsgemisch, und der Chimärisierungszyklus kann wiederholt werden. Dies bedeutet, dass bei einer normalen PCR-Reaktion eine exponentielle Amplifikation der mutierten und/oder chimären DNA-Sequenzen erreicht wird und dass ferner die Anzahl der Polynukleotide exponentiell amplifiziert wird. Das Verhältnis von Ausgangs-Matrize zu neu erzeugter DNA steigt zugunsten des chimären Moleküls in jedem Zyklus. Dies verringert auch erheblich das Risiko oder die Wahrscheinlichkeit, dass nach Transformation der mutierten und/oder chimären Polynukleotide in eine geeignete Wirtszelle Parentalklone erhalten werden.
Ein erfindungsgemäßer PCR-ähnlicher Standard-Chimärisierungszyklus verwendet zum Beispiel die folgenden Reagentien: ein Puffersystem, in dem die gewählte Polymerase und Ligase arbeiten, dNTPs, Polymerase, Ligase, ATP (oder einen anderen Cofaktor für die Ligase), Matrize und Fragmente des Zielpolynukleotids; und umfasst die folgenden Schritte: Inkubation bei 72°C, um ungewünschte Lücken in der zirkulären Matrize zu ligieren, 30 Sekunden bei 95°C, um die doppelsträngige DNA in einzelsträngige DNA zu schmelzen, 1 Minute bei 50°C, um die Fragmente an die Matrize anzulagern, 8 Minuten bei 72°C, um die Fragmente durch DNA-Polymerase zu verlängern, 30 Sekunden bei 95°C, um gebundene DNA-Polymerase von der Matrize zu entfernen, und 8 Minuten bei 72°C, um die Fragmente miteinander zu ligieren und alle Lücken zu beseitigen. Der Chimärisierungszyklus wird vorzugsweise etwa 20 bis 25 mal wiederholt. Schließlich wird das Reaktionsgemisch auf 4°C abgekühlt.
Da das beschriebene Verfahren auf der Verwendung geschlossener zirkulärer Polynukleotide basiert und hauptsächlich zu geschlossenen zirkulären chimären DNA-Molekülen führt, ist ersichtlich, dass es vorteilhaft ist, Plasmide als geschlossene zirkuläre DNA-Matrizenmoleküle zu verwenden. Ein derartiges Plasmid umfasst vorzugsweise ein geeignetes Expressionssystem für die interessierende DNA-Sequenz oder das interessierende Gen. Das Matrizenpolynukleotid ist vorzugsweise ein doppelsträngiges geschlossenes zirkuläres Plasmid, das einen Replikationsursprung, einen Promotor für die Genexpression, ein Gen zur Selektion und ein erstes interessierendes Gen umfasst. Wie der Fachmann leicht erkennt, wird vorzugsweise nur der Teil der Polynukleotidsequenz rekombiniert, der das interessierende Gen umfasst, und der Rest der DNA-Sequenz, d.h. das Expressionssystem oder der Plasmidanteil der Sequenz, wird unverändert belassen. Zwei oder mehrere verschiedene Plasmide, welche die interessierende DNA-Sequenz enthalten, können ebenfalls bei einem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden.
Die Arbeitsschritte, die gewöhnlich von den anderen, aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren benötigt werden, die z.B. die Insertion der neu mutierten und/oder chimären DNA-Moleküle in ein geeignetes Expressionssystem erfordern, sind im Fall der mutierten und/oder chimären DNA-Polynukleotide, die durch ein erfindungsgemäßes Verfahren erzeugt werden und bereits in ein Expressionssystem eingebaut sind, nicht notwendig. Somit werden zusätzliche Schritte, wie die Herstellung von Vektoren und die Insertion unter Verwendung geeigneter Restriktionsenzyme und die Ligierung der Letzteren, vermieden. Dies macht das erfindungsgemäße Verfahren viel angenehmer und einfacher anzuwenden.
Das Ergebnis der Chimärisierungs-PCR, d.h. der PCC, kann mittels Agarosegelelektrophorese überprüft werden. Ein Polynukleotid der gewünschten Größe (das mit der Matrize identisch ist) sollte auf dem Agarosegel sichtbar sein.
Die vorliegende Erfindung eignet sich auch für ein Verfahren zur Gewinnung einer transformierten Wirtszelle durch Einbringen eines mutierten und/oder chimären Polynukleotids, das gemäß einem erfindungsgemäßen Verfahren erhalten wird, in den Wirt.
Bakterien, wie E. coli- oder Bacillus-Stämme, sind als Wirtsstämme bevorzugt. Es hat sich herausgestellt, dass solche Transformationen recht erfolgreich sind und eine hohe Ausbeute an Transformanten liefern.
Die bei einem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene mutierte und/oder chimäre zirkuläre DNA kann anschließend ohne jegliche weiteren Arbeitsschritte in eine geeignete Wirtszelle transformiert werden. Wie vorstehend beschrieben, kann diese Transformation gegebenenfalls einen Schritt zur Entfernung eines methylierten Matrizenpolynukleotids beinhalten. Auch dieser Schritt erfordert jedoch keine weitere Reinigung. Es ist daher bevorzugt, die bei einem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen mutierten und/oder chimären Polynukleotide direkt ohne vorherige Reinigung zur Transformation einer Wirtszelle zu verwenden.
Natürlich ist auch eine Wirtszelle geeignet, die durch Transformation mit einem durch das erfindungsgemäße Verfahren erhaltenen mutierten und/oder chimären Polynukleotid erhalten wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Gewinnung eines rekombinanten Biomoleküls, wobei man in dem Verfahren ein mutiertes und/oder chimäres Polynukleotid unter Verwendung eines erfindungsgemäßen Verfahrens gewinnt, das mutierte und/oder chimäre Polynukleotid in einen entsprechenden Wirt transformiert, das rekombinierte Gen exprimiert und ein Screening auf das rekombinante Biomolekül durchführt.
Nach Isolation einzelner Klone, Animpfen und Expression der mutierten und/oder chimären Genprodukte können die neuen Biomoleküle gescreent werden, um Klone zu identifizieren, die ein rekombinantes Gen mit der gewünschten Eigenschaft enthalten.
Das Screening kann auf jede selektierbare Eigenschaft durchgeführt werden. Vorzugsweise ist das Biomolekül ein Expressionsvektor, und Expressionsvektoren, die zu einer höheren Proteinausbeute führen, werden ausgewählt. Das Biomolekül ist am stärksten bevorzugt ein Polypeptid, und das Selektionsverfahren basiert zum Beispiel einfach auf einer selektierbaren Eigenschaft eines solchen Polypeptids. Ein derartiges rekombinantes Polypeptid ist am stärksten bevorzugt ein Enzym. Wie der Fachmann erkennt, lassen sich verschiedene enzymatische Eigenschaften recht leicht selektieren, wenn das neue (mutierte und/oder chimäre) Polynukleotid verfügbar ist und wie vorstehend beschrieben exprimiert worden ist.
Wie der Fachmann leicht erkennt, sind die hier offenbarten Verfahren aus verschiedenen Gründen recht vorteilhaft, z.B. machen sie die Notwendigkeit einer amplifizierenden PCR-Reaktion überflüssig, die Verfahren des Standes der Technik immer noch erfordern, insbesondere um mutierte und/oder chimäre DNA-Moleküle in einer vernünftigen Häufigkeit zu erzeugen, und es ist kein Reinigungsschritt vor der Transformation notwendig. Es ist außerdem recht offensichtlich, dass durch Weglassen der Amplifikations-PCR keine Vorselektion von mutiertem und/oder chimärem Polynukleotid erfolgt. Dies führt zu einer größeren Diversität an mutierten und/oder chimären Polynukleotiden, die in die Transformation eingehen, was außerdem zu einer größeren Diversität genetischer Varianten für das Screening und die Selektion führt.
Die folgenden Beispiele, Bezugsstellen, das Sequenzprotokoll und die Figuren werden bereitgestellt, damit sie zum Verständnis der vorliegenden Erfindung beitragen, dessen wirklicher Umfang in den beigefügten Ansprüchen dargelegt ist.
Beschreibung der Figuren
1 Schema eines erfindungsgemäßen Verfahrens
In 1 ist das erfindungsgemäße Verfahren unter Verwendung eines doppelsträngigen geschlossenen zirkulären Polynukleotids, das ein erstes interessierendes Gen(gestreifter Pfeil) umfasst, und von Fragmenten, die von einer doppelsträngigen Ziel-DNA (ausgefüllter Pfeil) stammen, gezeigt. Die Polynukleotide werden bereitgestellt und mit allen benötigten Reagentien gemischt, dann werden die Schritte Schmelzen, Annealing, Polymerisation und Ligation durchgeführt.
2 Aminosäuresequenzen für hAP und ciAP
Die Aminosäuresequenz für alkalische Phosphatase aus Kälberdarm ist in der ersten Reihe und die entsprechende Sequenz der alkalischen Phosphatase aus humaner Plazenta in der zweiten Reihe dargestellt.
3 Fragmentierung von Ziel-DNA
Die Ergebnisse der Ziel-DNA-Fragmentierung mit DNAse I gemäß Beispiel 1 sind in 3 dargestellt.
4 Nach 20 Chimärisierungszyklen erhaltene Nukleinsäuren
5 μl Probe, die wie im Beispiel 1 beschrieben erhalten wurden, wurden auf ein 1%iges Agarosegel aufgetragen. Nach der Elektrophorese wurden die DNA-Banden mit Ethidiumbromid angefärbt. Die gefärbten Banden sind gezeigt.
Beispiel 1
Chimärisierung von alkalischer Phosphatase aus humaner Plazenta (hpAP) mit alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm (ciAP)
Die Gene von ciAP und hpAP zeigen eine Homologie von etwa 80% zueinander (siehe SEQ ID NR. 1 bzw. 3). Beide Aminosäuresequenzen sind in 2 sowie in den SEQ ID NR. 2 bzw. 4 gezeigt. Die Verteilung von homologen und heterologen Bereichen ist nahezu zufällig über das gesamte Gen, wodurch es leicht ist, den Grad der Chimärisierung beider Gene zu überprüfen.
Die zwei Gene wurden in das Plasmid pkk 177 mit einem Ampicillin-Resistenzgen kloniert, in dem sie unter der Kontrolle eines pmgl-Promotors (siehe Patentanmeldung WO 88/09373) standen, und in den E.-coli-Stamm XL-blue-MRF' transformiert.
Für das folgende Experiment wurde hpAP als erstes interessierendes Gen verwendet.
Die zufälligen Fragmente des Zielgens wurden aus dem ciAP-Gen erzeugt.
Matrizengen (Plasmid):
Der E.-coli-Stamm, der das Plasmid mit dem hpAP-Gen trug, wurde über Nacht bei 37°C angeimpft. Das Plasmid wurde unter Verwendung eines Roche-High-Pure-Plasmidisolationskits Id. 1754777 isoliert und die Konzentration mittels UV bei 260 nm bestimmt. Eine Lösung von 5 ng DNA/μl Wasser wurde hergestellt.
Zielgen (Fragmente):
Eine wässrige Lösung mit dem Plasmid, welches das ciAP-Gen trug, wurde unter Verwendung des gleichen Verfahrens, wie für die Matrize, hergestellt. Das ciAP-Gen wurde mittels PCR unter Verwendung geeigneter Primer (siehe SEQ ID NR. 5 bzw. 6) amplifiziert.
Das erhaltene PCR-Produkt wurde unter Verwendung eines Roche-PCR-Reinigungskits gereinigt und die DNA-Konzentration bestimmt.
Fragmentierung:
Das ciAP-Gen wurde einem DNAse-I-Verdau unterzogen. Die folgende Zubereitung wurde hergestellt:

30 μl ciAP (100 ng DNA/μl Wasser)
1,5 μl DNAse I (0,1 U/μl; Roche Kat. Nr. 776785, verdünnt mit 1x-Puffer Kat. Nr. 1417991)
8 μl Puffer (10x-Puffer Kat. Nr. 1417991)
40,5 μl Wasser

Nach 10-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur wurde die Zubereitung schnell auf Trockeneis eingefroren, um den DNAse-I-Verdau zu beenden. 5 μl Probe wurden auf einem 1%igen Agarosegel analysiert, um den Verdau zu überprüfen (siehe 3). Die Wolke von Fragmenten bewies, dass der Großteil der Fragmente eine Größe von etwa 50 Bp hatte. Die DNAse I wurde durch Erhitzen der restlichen Zubereitung bei 95°C für 10 Minuten inaktiviert. Die DNA wurde mit dem Roche-PCR-Reinigunskit gereinigt und die DNA-Konzentration bei 260 nm bestimmt. Chimärisierungs-PCR (PCC):

2,5 U/μl Pfu-Polymerase von Stratagene Kat. Nr. 600252
10× Pfu-Polymerase-Puffer von Stratagene Kat. Nr. 600252
4 U/μl Pfu-Ligase von Stratagene Kat. Nr. 600191
40 mM dNTP = 10 mM dATP, 10 mM dCTP, 10 mM dTTP, 10 mM dGTP
5 μM/μl ATP von Roche Kat. Nr. 1140965

Temperaturprogramm:

a) 10 Minuten 72°C
b) 30 Sekunden 95°C
c) 1 Minute 55°C
d) 8 Minuten 72°C
e) 30 Sekunden 95°C
f) 8 Minuten 72°C
g) 20-fache Wiederholung der Schritte b) bis f)
h) 4°C

Nach den Temperaturzyklen wurden 5 μl der PCC-PCR-Produkte auf ein 1%iges Agarosegel aufgetragen (siehe 4).
Ergebnisse:
Die PCC-Probe zeigt eine Bande mit der gewünschten Größe, wohingegen die neg. Kontrolle keine Bande zeigt.
Beispiel 2
Transformation
Die Transformation erfolgte durch Elektroporation beider Proben PCC bzw. neg. Kontrolle in den E.-coli-XL-MRF'-Stamm (Stratagene Kat. Nr. 200158). Anschließend wurden 100 μl der PCC-Zubereitung und 1 ml der neg. Kontrolle auf eine LB-Agarplatte ausplattiert, die 100 μg/ml Ampicillin enthielt. Die Zellen wurden über Nacht bei 37°C inkubiert.
Die Ergebnisse dieses Transformationsexperiments, ausgedrückt als Anzahl wachsender Klone, sind in der folgenden Tabelle angegeben:
20 Klone wurden zufällig von der PCC-Probenplatte gepickt und getrennt in LB-Amp-Medium über Nacht bei 37°C angeimpft. Die Plasmide der 20 Proben wurden unter Verwendung eines Roche-High-Pure-Plasmidisolationskits Id. 1754777 isoliert und unter Verwendung eines ABI-Prism-Dye-Terminator-Sequenzierkits und eines ABI-3/73-und -3/77-Sequenziergeräts (Amersham Pharmacia Biotech) sequenziert. Die verwendeten Sequenzierprimer basierten sämtlich auf dem ciAP-Gen (siehe SEQ ID NR. 5, 7, 8 bzw. 9).
Beispiel 3
Test von Klonen auf AP-Aktivität
Die AP-Aktivität wurde wie folgt ermittelt: 90 μl Zellsuspension der Übernachtkultur wurden mit 10 μl B-PER (bakterielles Proteinextraktionsreagens, Pierce Kat. Nr. 78248) gemischt, um die Zellen aufzubrechen. 50 μl dieses Gemischs wurden zu 90 μl Reagens (Roche Kat. Nr. 2173107) gegeben. Aktive AP setzt p-Nitrophenol frei, das mit einem Photometer bei 405 nm überwacht werden kann. Eine Zellsuspension des E.-coli-XL-MRF'-Stamms ohne hpAP- oder ciAP-Plasmid wurde als neg. Kontrolle verwendet.
Beispiel 4
Erhaltene mutierte und chimäre Klone
Die Ergebnisse des AP-Aktivitätstests und der entsprechenden Klonanalyse mittels Sequenzierung sind in der folgenden Tabelle angegeben:
Es sollte beachtet werden, dass hpAP die Ausgangs-Matrize ist. Die Zahlen betreffen die Aminosäurepositionen im AP-Enzym. Ausdrücke wie V69A bedeuten einen Aminosäureaustausch bei Position 69 von V (Valin) nach A (Alanin). Das Alignment der Sequenzen auf Aminosäurebasis ist in 2 gezeigt.
Die vorstehenden Daten zeigen, dass eine Chimärisierung fast bis zu jedem gewünschten Ausmaß auftrat. Das Mutantenspektrum reicht von überhaupt keiner Genmischung (hpAP) bis zu einer vollständigen Umordnung des fragmentierten ciAP-Gens.
Von den 20 isolierten Klonen zeigten 50% alkalische Phosphatase-Aktivität, wobei auch die Mutanten mit gemischter DNA eingeschlossen sind. Tatsächlich ist der Klon mit der höchsten Aktivität (Nr. 12) eine Chimäre. Punktmutationen, Insertionen und Deletionen wurden zusätzlich zu der Chimärisierung beobachtet, wodurch der Pool an neuen Polynukleotiden weiter ausgeweitet wird, auf denen die Selektion nach neuen oder verbesserten Eigenschaften basieren kann.
Literatur

Arnold, F.H., und Volkov, A.A., Curr. Opin. Chem. Biol. 3 (1999) 54–59
Ausubel, F.M., et al., Massachusetts General Hospital and Harward Medical School von John Wiley & Sons, Inc. Brakmann, S., Chembiochem. 2 (2001) 865–871
Cadwell, R.C., und Joyce, G.F., PCR Methods Appl. 2 (1992) 28–33
Deshler, J.O., Gen. Anal. Techn. Appl. 9 (1992) 103–106
Feng, D.F., und Doolittle, R.F., J. Mol. Evol. 25 (1987) 351–360
Graddis, T.J., et al., Curr. Pharm. Biotechnol. 3(2002) 285–297
Greener, A., et al., Methods Mol. Biol. 57 (1996) 375–385
Kirk, O., et al., Curr. Opin. Biotechnol. 13(2002) 345–351
Powell, K.A., et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 40 (2001) 3948–3959
Shao, Z., et al., Nucleic Acids Res. 26 (1998) 681–683
US 5,605,793
US 5,811,238
US 5,830,721
US 5,834,252
US 5,837,458
Vasserot, A.P., et al., Drug Discov. Today 8 (2003) 118–126
WO 00/09697
WO 01/29211
WO 01/34835
WO 02/16606
WO 99/35281
Zhao, H., et al., Nat. Biotechnol. 16 (1998) 258–261

SEQUENCE LISTING

Claims

Verfahren zur Erzeugung eines mutierten und/oder chimären Polynukleotids, wobei man in dem Verfahren: a) eine ein erstes interessierendes Gen umfassende geschlossene zirkuläre Polynukleotidmatrize bereitstellt, b) Fragmente eines von einem zweiten interessierenden Gen abgeleiteten doppelsträngigen DNA-Zielpolynukleotids bereitstellt, die zur Hybridisierung an das erste interessierende Gen fähig sind, wobei die Fragmente freie 3'-OH-Enden sowie phosphorylierte 5'-Enden aufweisen, c) Einzelstränge sowohl des Matrizenpolynukleotids als auch der Fragmente des Zielpolynukleotids erzeugt, d) die Fragmente des Zielpolynukleotids in einer Annealing-Reaktion an das Matrizenpolynukleotid anlagert, e) die angelagerten Fragmente des Zielpolynukleotids mittels DNA-Polymerase verlängert, f) die Lücken zwischen den verlängerten Fragmenten unter Verwendung einer DNA-Ligase ligiert, wodurch ein chimäres zirkuläres Volllängen-DNA-Molekül erzeugt wird, und g) mit dem in f) erhaltenen Produkt die Schritte c) bis f) 1 bis 100 mal wiederholt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei eine temperaturstabile DNA-Polymerase sowie eine temperaturstabile DNA-Ligase verwendet werden.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei es sich bei dem in dem Matrizenpolynukleotid enthaltenen interessierenden Gen und dem in dem Zielpolynukleotid enthaltenen interessierenden Gen um Varianten eines einzigen Gens handelt.
Vefahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei mindestens zwei Varianten eines interessierenden Gens in einem Matrizenpolynukleotid und/oder in einem Zielpolynukleotid enthalten sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei es sich bei dem Matrizenpolynukleotid um ein einen Replikationsursprung, einen Promotor zur Genexpression, ein Gen zur Selektion sowie ein erstes interessierendes Gen umfassendes doppelsträngiges geschlossenes zirkuläres Plasmid handelt.
Verfahren zur Gewinnung eines rekombinanten Biomoleküls, wobei man in dem Verfahren a) ein mutiertes und/oder chimäres Polynukleotid unter Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 5 gewinnt, b) das mutierte und/oder chimäre Polynukleotid in einen entsprechenden Wirt transformiert, c) das rekombinierte Gen exprimiert und d) ein Screening auf das rekombinante Biomolekül durchführt.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei es sich bei dem Biomolekül um ein Enzym handelt.