DD145917A5 - Verfahren zur reinigung von nucleo idsequenzen - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung von Nucleotidsequenzen, insbesondere einer spezifischen Deoxyribonucleotid-Sequenz zur Neukombination mit einem DNS-Transfer-Vektor und Transformation in einen Mikroorganismus, derart, dasz man a) eine Population von cDNS-Transcripten von Polyribonucleotiden erzeugt, wobei mindestens ein Teil dieser cDNS-Transcripte mindestens zwei Restriktionsstellen besitzt, b) die cDNS-Transcripte der Einwirkung eines Restriktion-Endonuclease-Praeparats unterwirft, das zur Katalyse der Hydrolyse der cDNS-Transcripte an jeder der beiden Restriktionsstellen befaehigt ist unter Bildung eines Fragments mit spezifischer Deoxyribonucleotid-Sequenz und homogener Laenge und c) die durch Einwirkung der Restriktions-Endonuclease erzeugten Fragmente auf Grund der Laenge fraktioniert, wobei die Fragmente mit der spezifischen Deoxyribonucleotid-Sequenz homogener Laenge von cDNS-Transcripten anderer Laenge abgesondert werden. Die Erfindung wird beispielsweise angewandt in der Mikrobiologie, Endokrinologie, Pharmakologie, Medizin, Veterinaermedizin zur Behandlung von Krankheitszustaenden von Mensch und Tier sowie in der Tierzucht zur Regulierung des Wachstums bei Tieren, die zur Lebensmittelproduktion bestimmt sind.

Description

-A-

Berlin, den 7.3И979 53 781/11 AP А61К/206 482

Verfahren zur Reinigung von Nucleotidsequenzen Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung von Nucleotidsequenzen insbesondere zur Reinigung einer spezifischen Deoxyribonucleotid-Sequenz zur Neukombination mit einem DNS-Transfer-Vektor und Transformation in einen Mikroorganismus. Die Erfindung betrifft weiterhin einen Mikroorganismus, der eine erfindungsgemäß gereinigte Nucleotidsequenz enthält.

Proteine und Peptide werden in nahezu unendlicher Vielfalt von lebenden Organismen synthetisiert. Einige di-jser Stoffe erwiesen sich als brauchbar für medizinische, landwirtschaftliche oder technische Zwecke. Einige Proteine sind Enzyme, die als spezifische Katalysatoren in komplizierten chemischen Reaktionen wirksam werden. Andere funktionieren als Hormone, die Wachstuni oder Entwicklung eines Organismus steuern oder die Punktion in spezifischen Geweben in medizinisch bedeutungsvoller Weise beeinflussen. Spezielle Binderproteine können zu wirtschaftlicher Bedeutung gelangen bei der Isolierung und Reinigung von Spurensubstanzen und der Entfernung von verunreinigenden Substanzen. Sowohl Proteine wie Peptide besteben aus linearen Aminosäureketten,

7.3.1979

AP A61K/206

wobei es sich bei den letzteren um kurze, einkettige Sequenzen und den ersteren um langkettige und mehrkettige Substanzen handelt. Die vorliegende Erfindung betrifft sowohl Proteine als auch Peptide. Die Erfindung wird angewandt auf den Gebieten der Mikrobiologie, der Endokrinologie, der Pharmakologie, der Medizin, der Veterinärmedizin und der Tierzucht, Durch die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens können Krankheitszustände bei Mensch und liier behandelt und das Wachstum von Tieren beeinflußt werden.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Proteine und Peptide sind im allgemeinen hochmolekulare Substanzen mit einer spezifischen Aminosäuresequenz« Abgesehen von den кіѳіпэгѳп Peptiden ist die chemische Synthese von Peptiden und Proteinen häufig umständlich, teuer und zeitraubend, falls nicht sogar unmöglich. In den meisten Fällen muß daher bei beabsichtigter praktischer Verwendung eines Proteins dieses zunächst aus dem Organismus isoliert werden, von dem es produziert wird. Häufig ist ,das Protein dort nur in geringsten Mengen vorhanden. Ferner steht dieser Organismus häufig nicht in den Mengen zur Verfügung, die die gewünschton Proteinmengen ergeben. So liegen zahlreiche potentielle Verwendungszwecke für spezielle Proteine in Landwirtschaft, Industrie und Medizin vor, sie bleiben jedoch unentwickelt, da die entsprechende Versorgung mit dem gewünschten Protein oder Peptid nicht gegeben ist.

Kürzlich entwickelte Verfahren haben es möglich gemacht, zu raschem und reichlichem Wachstum befähigte Mikro-

7.3И979

AP A61K/206

Organismen zur Synthese technisch brauchbarer Proteine und Peptide zu verwenden, wobei die Herkunft der letzteren keine Rolle spielt. Diese Verfahren ermöglichen es, einen geeigneten Mikroorganismus genetisch mit der Fähigkeit zur Synthese eines Proteins oder Peptids auszustatten, das normalerweise von einem anderen Organismus produziert wird. Diese Verfahren basieren auf der fundamentalen Beziehung, die in allen lebenden Organismen zwischen dem genetischen Material, gewöhnlich der DNS, und den vom Organismus synthetisierten Proteinen besteht. Diese Beziehung ist derart, daß die Aminosäuresequenz des Proteins durch die Kucleotidsequenz der DHS vorgegeben ist. Ein oder mehrere Trinucleotidsequenzen stehen in spezieller Beziehung zu jeweils einer der 20 Aminosäuren, die in den Proteinen am häufigsten vorkommen. Die Beziehung zwischen den Trinucleotid-Sequenzen und den ihnen entsprechenden Aminosäuren bazeicbnet man als den genetischen Code. Der genetische Code wird für alle lebenden Organismen als gleich oder ähnlich erachtet. Demzufolge spiegelt sich die Aminosäuresequenz jedes Proteins oder Peptids in einer entsprechenden Nucleotidsequenz wider. Außerdem kann diese«

Kucleotidsequenz im Prinzip von jedem lebenden Organismus übersetzt werden. Den genetischen Code veranschaulicht folgende Tabelle:

Tabelle 1	Phenylalanin (Phe)	TTK
Genetischer	Leucin (Leu)	XTY
Isoleucin (lie)	ATM
Methionin (Met)	ATG
Valin <Val)	GTL
Serin (Ser)	QPS
Prolin (Pro)	CCL
Threonin (Thr)	ACL
Alanin (AIa)	GCL
Tyrosin (Tyr)	ТАК
Terminationssignal	TAJ
Terminationssignal	TGA

Histidin (His) CAK Glutamin (Gin) CAJ Asparagin (Asn) AAK Lysin (Lys) AAJ Asparaginsäure (Asp)GAK Glutaminsäure (GIu) GAJ Cystein (Cys) TGK Tryptophan (Try) TGG Arginin (Arg) WGZ Glycin (GIy) GGL

Schlüssel:

Jedes Triplett aus drei Buchstaben stellt ein Trinucleotid der DNS dar, mit einem 5'-Ende links und einem j5'-Ende rechts. Die Buchstaben stehen für die Purin- oder Pyrimidinbasen, die die Nucleotjidsequenz bilden:

A = Adenin, G = Guanin, C = Cytosin, T = Thymin, J=A oder G, K=T oder C, L « A, T, C oder G, M = A, C oder T

X=T oder C, falls Y=A oder G,

X=C, falls Y. = C oder .T,

Y = A, G, C oder T,. falls X=C,

Y=A oder G, falls X=T,

W=C oder A, falls Z=A oder G,

W=C, falls Z=C oder T,

Z = A, G, C oder T, falls V/ = C,

Z = A oder G, falls V/ = A,

QR = TC, falls S = A, G, C oder T,

QR = AG, falls S=T oder C,

S = A, G, C oder T, falls QR = TC,

S=T oder C, falls QR = AG

Die Trinucleotide der Tabelle 1, die als Codons bezeichnet werden, stellen DNS-Trinucleotide dar, da sie im genetischen Material eines lebenden Organismus vorliegen. Die Expression dieser Codons bei der Proteinsynthese erfordert die dazwischenliegende Bildung einer messenger-RNS (mRNS), die nachstehend noch näher beschrieben wird. Die mRNS-Codons besitzen die gleichen Sequenzen wie die DNS-Codons gemäss Tabelle 1, mit der Ausnahme, dass Thymin durch Uracil ersetzt ist. Bekanntlich sind komplementäre Trinucleotid-DNS-Sequenzen mit entgegengesetzter Polarität den Codons gemäss Tabelle 1 funktionell gleichwertig. Ein wichtiges und bekanntes Merkmal des genetischen Codes ist der Überschuss an Zeichen, wodurch für die meisten zur Herstellung von Proteinen verwendeten Aminosäuren mehr als ein codierendes Nucleotid-Triplett verwendet werden kann. Daher können mehrere verschiedene Nucleotidsequenzen eine vorgegebene Aminosäuresequenz codieren. Derartige Nucleotidsequenzen werden als funktionell gleichwertig betrachtet, da sie zur Produktion der gleichen Aminosäuresequenz in allen Organismen dienen können, wenn auch manche Sequenzen von bestimmten Stämmen wirkungsvoller übersetzt werden als von anderen.

Gelegentlich findet .sich eine methylierte Variante eines Purins oder Pyrimidine in einer vorgegebenen Nucleotidsequenz. Durch diese Methylierungen wird die Codierung in keiner Weise beeinträchtigt.

Ein Verfahren zur Ausstattung eines Mikroorganismus mit der Fähigkeit zur Synthese eines neuen Proteins umfasst drei allgemeine Stufen:

(1) die Isolierung und Reinigung der spezifischen Genoder Nucleotidsequenz, die die genetisch codierte Information für die Aminosäuresequenz des gewünschten Proteins enthält,

(2) die Neukombination der isolierten Nucleotidsequenz mit einem geeigneten Transfer-Vektor, typischerweise der DNS eines Bakteriophagen oder Plasmids, und

(5) die Einführung des Vektors in den geeigneten Mikroorganismus und Auswahl eines Stammes des aufnehmenden Mikroorganismus, der die gewünschte genetische Information enthält.

Die grundlegende Schwierigkeit bei Versuchen zur technischen Auswertung des oben skizzierten Verfahrens liegt in der ersten Stufe der Isolierung und Reinigung der spezifischen genetischen Information. Die DNSMiegt in allen lebenden Fällen in Form äusserst hochmolekularer NuJDceotidetten vor. Eine Zelle kann mehr als 10 000 Strukturgene enthalten, die die Aminosäure-Sequenzen von mehr als 10 000 Proteinen codieren, wobei Jedes Gen eine Sequenz aus mehreren Hunderten von Nucleotiden enthält. In der Regel bilden vier verschiedene Nucleotidbasen alle vorkommenden Sequenzen. Es handelt sich um das Adenin (A), Guanin (G), Cytosin (C) und Thymin (T). Die langen Sequenzen, die die Strukturgene spezifischer Proteine enthalten, sind sich daher in chemischem Aufbau und physikalischen Eigenschaften

äusserst ähnlich. Die Absonderung einer derartigen Sequenz aus der Überfülle anderer Sequenzen, die in isolierter DNS vorliegen, kann daher gewöhnlich nicht durch konventionelle physikalische und chemische präparative Methoden erzielt werden.

Die messenger-RNS beteiligt sich am Vorgang der Übersetzung der Information der Nucleotidsequenz der DNS in die Aminosäuresequenz eines Proteins. Ih der ersten Stufe dieses Vorgangs, der als Transcription bezeichnet wird, wird ein Segment der DNS mitder für das herzustellende Protein zuständigen Sequenz auf eine RNS übertragen. Die RNS ist ein der DNS ähnliches Polynucleotid, in dem jedoch Ribose anstelle der Eeoxyribose und Uracil anstelle von Thymin stehen. Die Basen der RNS sind zur gleichen Art von Basenpaarung befähigt wie die Basen der DNS. A und U (T) sowie G und C sind komplementär, Die durch Transcription einer DNS-Nucleotidsequenz entstandene RNS ist daher zu dieser kopierten Sequenz komplementär. Diese RNS wird als messenger-RNS (mRNS) bezeichnet wegen ihrer Zwischenstellung zwischen dem genetischen Apparat und dem Apparat der Proteinsynthese der Zellen. Im allgemeinen liegen zu einem bestimmten Zeitpunkt in der Zelle nur solche raRNS-Sequenzen vor, die zu diesem Zeitpunkt zu produzierenden Proteinen entsprechen. Eine differenzierte Zelle, deren Funktion hauptsächlich die Synthese eines einzigen Proteins ist, enthält daher häuptsächlich die diesem Protein entsprechende RNS. In solchen Fallen kann möglicherweise die Isolierung und Reinigung der entsprechenden, ein bestimmtes Protein codierendenNucleotidsequenz erfolgen durch Isolierung von mRNS, die die spezielle Synthese dieses Proteins codiert.

7.3.1979

AP A61K/206

Der Hauptnachteil dieses Verfahrens besteht darin, daß es nur in relativ seltenen Fällen anwendbar ist, in denen man Zellen findet, die hauptsächlich ein einziges Protein synthetisieren. Die Hauptmenge der Proteine von technischer Bedeutung werden nicht auf diese spezielle Weise erzeugt. Das gewünschte Protein kann zum Beispiel eines von hundert anderen Proteinen sein, die zum gegebenen Zeitpunkt von den Zellen eines Gewebes oder Organismus erzeugt werden. Trotzdem ist die Technik der Isolierung der mRNS potentiell anwendbar, da die in der Zelle vorhandenen SNS gewöhnlich nur einen Teil der gesamten Sequenzen der DNS darstellen, so daß eine erste Reinigung erzielt wurde. Um aus dieser Reinigung Vorteile zu ziehen, benötigt man jedoch eine Methode, mit der in geringer Häufigkeit, zum Beispiel in wenigen Prozenten, vorliegende Sequenzen in hoher Reinheit isoliert werden können.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines einfachen, wirtschaftlichen und technisch anwendbaren Verfahrens, mit dem Nueleotidsequenzen, auch bei Vorliegen in geringer Konzentration, aus Gemischen isoliert und in hoher Reinheit erhalten werden können.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, durch geeignete Verfahrensschritte und Reaktionsbedingungen, ausgebend von einer Population von Polyribonucleotiden heterogener Länge und Sequenz, eine spezifische Deoxyribonucleotid-Sequenz zur Neukombination mit einem DNS-

7.3И979 -9- AP A61K/206 482

Transfer-Vektor und Transformation in einen Mikroorganismus in hoher Reinheit zu isolieren.

Erfindungsgemäß werden

(a) eine Population von cDNS-Transcripten von Polyribonucleotiden erzeugt, wobei mindestens ein Teil dieser cDNS-Transeripte mindestens zwei Restriktionsstellen besitzt,

(b) die cDNS-Transcripte der Einwirkung eines Restriktions-Endonuclease-Präparats unterwirft, das zur Katalyse der Hydrolyse der cDNS-Transcripte an jeder der beiden •.Restriktionsstellen befähigt ist unter Bildung eines Fragments mit spezifischer Deoxyribonucleotid-Sequenz and homogener Länge und

(c) die durch Einwirkung der Restriktions-Endonuclease erzeugten Fragmente aufgrund der Länge fraktioniert, wobei die Fragmente mit der spezifischen Deoxyribonucleotid-Sequenz homogener Länge von cDNS-Transcripten anderer Länge abgesondert werden.

In einem Verfahren zur Reinigung linearer DNS spezifischer Nucleotidsequenz, die eine Restriktionsstelle enthält, werden erfindungsgemäß

(d) die DNS vorbehandelt zwecks Entfernung aller 5'-PbOS-phat-Endgruppen,

(e) die DNS mit einer Restriktions-Endonuclease inkubiert, die zur Einwirkung auf die Nucleotidsequenz unter Bildung von zwei linearen Unterfragmenten befähigt ist,

(f) die Unterfragmente aufgrund ihrer Länge fraktioniert,

(g) die beiden Unterfragmente isoliert,

(h) die Unterfragmente in einer durch DNS-Ligase kataly-

7.3.1979

AP А61К/206

sierten Reaktion covalent erneut verknüpft unter Wiederherstellung der ursprünglichen Sequenz und (i) die wiederverknüpften DNS-Moleküle aufgrund ihrer Länge fraktioniert.

Dabei werden zur Entfernung der 5'-Phosphatgruppen alkalische Phosphate verwendet» Die Fraktionierung erfolgt aufgrund der Länge durch Gelelektrophorese.

Die !Erfindung betrifft weiterhin einen Mikroorganismusstamm, der ein nach (a) bis (c) erhaltenes Fragment oder ein nach (d) bis (i) erhaltenes Fragment einer spezifischen Deoxyribonucleotidsequenz enthält.

Die Erfindung umfaßt auch einen Mikroorganismus, der Codons für menschliches Cblorion-Somatomammotropin mit der Hucleotidsequenz enthält:

TGGX₈₇TY₈₇GAJ

108

110

^TAK

113^TY113

₁₃₁ ^Y

QR

₁₃₆ ^AAJ

₉ СА J

_лЛ 7.3.1979

ΔΡ Α61Κ/206

(ЗА J₁₈₁TGK

₉₉ TAGGTGCCCGAGTAGCATCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGCC - 3'

worin

A = Deoxyadenyl, G = Deoxyguanyl, C = Deoxycytosyl, T = Thymidyl, J=A oder G, K=T oder C, L s A, TC oder G, M = A, C oder T, X_n= T oder C, falls Y_Q = A oder G, und C, falls i_Q = C oder

Y_n= A, G, C oder T, falls X_n = C, und A oder G, falls X_n = T, W_n= C oder A, falls Z_n = G oder A, und C, falls Z_n = C oder

Z_n= A, G, C oder T, falls W_n = C, und A oder G, falls W_n =

QR_n=TC, falls S_n = A, G, C oder T, und AG, falls S_Q = T

oder C, S_n= A, G, C oder T, falls QR_n = TC, und T oder C, falls QR_n = AG

worin die tiefgesteirten Ziffern η die Aminosäurestellung im menschlichen Chlorion-Somatomammotropin, dem die Nucleotidsequenz nach dem genetischen Co'de entspricht, bezeichnen, wobei die Aminosäurestellung vom Aminoende beziffert wird.

AP А61К/206

Erfindungsgemäß kann der Mikroorganismus aus einem Bakterium bestehen, beispielsweise aus Escherichia coli χ _ 1776 und das Plasmid pBR - 322 enthalten.

Die vorliegende Erfindung liefert ein Verfahfen, durch das Nucleotidsequenzen isoliert und gereinigt werden können, die mit einer Häufigkeit von nur 2 % in einer heterogenen Population von mBNS-Sequenzen vorliegen können. Das Verfahren kann ferner mit bekannten Methoden zur Fraktionierung von mBIiS kombiniert werden, um Sequenzen zu isolieren und zu reinigen, die in der gesamten RNS-Population in noch niedrigerer Häufigkeit als nach anfänglicher Isolierung vorliegen. Das Verfahren ist allgemein anwendbar auf XuSEQ aus praktisch jedem Organismus und stellt daher die wirksamen Maßnahmen bereit zur Produktion von geeigneten Mengen solcher Proteine, die von technischem Interesse oder Interesse für die Forschung sind.

Menschliches Wachstumshormon findet medizinische Anwendung bei der Behandlung von Hypopbysen-Mangelfunktion. Tierische Wachstumshormone werden in der Tiermedizin und Landwirtschaft angewendet, insbesondere bei Tieren, die als Nahrungsquelle

dienen, und deren rasches Wachstum und Grosse daher erwünscht sind. ,Menschliches Chorion-Somatomammotropin ist von medizinischer Bedeutung wegen seiner Rolle bei der Entwicklung des Fötus.

Das erfindungsgeroässe Verfahren zieht Vorteile aus bestimmten Strukturmerkmalen von mRNS und DNS und verwendet bestimmte Enzym-katalysierte Reaktionen. Die vorhandenen Kenntnisse über diese Reaktionen und strukturellen Einzelheiten werden nachstehend beschrieben. Dabei v/erden folgende Symbole und Abkürzungen verwendet:

Tabelle

DNS - Deoxyribonucleinsäure - Ribonucleinsäure

cDNS - komplementäre DNS (enzymatisch synthetisiert an einer

mRNS-Sequenz)

mRNS - messenger-RNS dATP - Deoxyadenosintriphosphat dGTP - Deoxyguanosintriphosphat dCTP - Deoxycytidintriphosphat HCS - menschl. Chorion-Somatomammotropin TCA - Trichloressigsäure HGH - menstihl. Wachstumshormon A - Adenin T - Thymin G - Guanin C - Cytosin TJ - Uracil Tris - 2-Amino-2-hydroxyethyl-l,^-propandiol EDTA - Ethylendiamintetraessigsäure ATP - Adenoslntriphosphat TTP - Thymidintriphosphat

Als Folge der bekannten Basenpaarungsregel, die die Replikation und Transcription von DNS steuert, ist die Isolierung der mRNS, die die Nuclei idsequenζ enthält, welche die Aminosäuresequenz eines bestimmten Proteins codiert, der Isolierung der gleichen Sequenz aus der DNS selbst gleichwertig. "Wird die mRNS transcribiert unter Bildung der komplementären DNS (cDNS), so ist damit die genaue DNS-Sequenz wieder hergestellt, und diese kann durch geeignete Techniken in das genetische Material eines anderen Organismus eingeführt werden. Die beiden komplementären Formen einer bestimmten Sequenz sind daher ineinander umwandelbar und funktionell gleichgestellt.

Die Nucleotid-Untereinheiten von DNS und RNS sind über Phosphodiester-Bindungen zwischen der 5'-Stellung eines Kucleotidzuckers und der 5'-Stellung des nächsten Nachbarn verbunden. Die ständige Wiederholung derartiger Bindungen führt zu einem linearen Polynucleotid, das insofern Polarität besitzt, als ein. Ende vom anderen unterschieden werden kann. Das 3*-Ende kann eine freie J>' -Hydroxylgruppe aufweisen, oder die Hydroxylgruppe kann durch eine Phosphatgruppe oder eine kompliziertere Gruppe ersetzt sein. Das gleiche gilt für das 5'-Ende. In eucar\/otischen Organismen, das heisst ,in Organismen mit definiertem Kern und Vermehrung unter Mitose_pumfasst die Synthese von funktionaler mRNS gewöhnlich die Addition von Polyadenylsäure an das J5'-Ende der mRNS. Die mRNS kann daher von anderen RNS-Arten, die aus einem eucarGotischen Organismus stammen, durch Säulen-Chromatographie an Cellulose, an die Polythymidylsäure gebunden ist, getrennt v/erden, vergleiche Aviv, H., und Leder, P. Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 69, Ι4θ8 (1972) . Auch andere chromatographische Verfahren sind geeignet, die die Basenpaarungsneigung von PoIy_--A für chromatographische

Packungen ausnützen, die Oligo-dT, PoIy-U oder Kombinationen aus PoIy-T und PoIy-U enthalten. Zum Beispiel kann man PoIy-U verwenden.

Reverse Transcriptase katalysiert die Synthese der einer RNS-Matrize komplementären DIiS in Gegenwart der RNS-Matrize, eines Primers, der ein beliebiges komplementäres Oligo- oder Polynucleotid mit einer 3^f-Hydroxylgruppe sein kann, und der 4 Deoxynucleosid-triphosphate dATP, dGTP, dCTP und dTTP. Die Reaktion wird eingeleitet durch die nicht-cofealente Bindung des Oligo-deoxynucleotid-Primers nahe dem 5'-Ende der mRNS, darauf folgt die stufenweise Addition der geeigneten Dbxynucleotide entsprechend der Basenpaarungsregel an das j^-Ende der wachsenden Kette. Das als Produkt erhaltene Molekül kann als haarnadelförmig beschrieben werden. Es enthält die Ausgangs-RNS durch V/asserstoffbindung gepaart rait einem komplementären DNS-Strang, von dem ein Teil an einem Ende auf sich selbst zurückgefaltet ist. Die DNS- und RNS-Stränge sind nicht covalent miteinander gebunden. Die Reverse Transcriptase kann auch eine ähnliche Reaktion katalysieren, bei der man aus einem DNS-Einzelstrang als Produkt einen haarnadelfö'rmigen DNS-Doppelstrang erhält mit einer Schleife DNS-Einzelstrang, durch die ein Paar Enden verbunden werden; vergleiche Aviv, H. und Leder, P., Proc. Nat'l. Acad. Sei. USA §£h_ I4o8 (1972) und Efstratiadis, Л., Kafatos, P.C. Maxara, A.M., und Maniatis, T. Cell. 7, (1976).

Restriktionsendonucleasen sind Enzyme, die zur Hydrolyse von Phosphodiesterbindungen in DNS befähigt sind, wobei die Sequenz des DNS-Strangs gespalten wird. Liegt die DNS in Form einer geschlossenen Schleife vor, so wird diese in eine lineare Form überführt. Das Hauptmerkmal eines Restriktionsenzyms besteht darin, dass seine hydrolytische

Wirkung nur an einer Stelle eintritt, v/o eine spezifische NucIeotidsequenz vorliegt. Diese Sequenz wird als Restriktionsstelle der Restriktions-Endonuclease bezeichnet. Restriktions-Endonucleasen wurden aus verschiedenen Quellen isoliert und ihre Nucleotidsequenz und die Restriktionsstellen wurden ermittelt. Bei Stoppelsträrigigen DNS hydro-

einißre lysieren Kestriktions-Sndonucleasen die Phosphodiesterbindungen in beiden Strängen an der gleichen Stelle, so dass stumpfe Enden entstehen. Andere katalysieren die Hydrolyse von BindEngen, die um einige Nucleotide voneinander entfernt sind, wodurch einsträngige Bereiche an Jedem Ende des gespaltenen Moleküls entstehen. Diese einsträngigen Enden sind selbst-komplementär, daher kohäsiv, und sie können verwendet werden, um die hydrolysierte DNS erneut zu binden. Da jede für eine Spaltung durch ein derartiges Enzym anfällige DNS die gleiche Erkennungsstelle enthalten muss, werden die gleichen kohäsiven Enden produziert, so dass es möglich wird, heterogene DNS-Sequenzen, die mit Restriktions-Endonuclease behandelt wurden, mit anderen analog behandelten Sequenzen zu verknüpfen; vergleiche Roberts, R. J., Crit. Rev. Biochem 4_j_ 123 (I976).

Es wurde festgestellt, dass Restriktionsstellen für ein bestimmtes _tEnzym relativ selten und nicht gleichmässig verteilt sind. Ob eine Restriktionsstelle in einem bestimmten Segment vorliegt, muss empirisch ermittelt werden. Es gibt jedoch bereits eine grosse und wachsende Anzahl Restriktions-Endonucleasen aus verschiedenen Quellen mit verschiedener Spezifxtät, so dass es hinreichend wahrscheinlich, ist, dass ein gegebenes Segment von etwa 1000 Nucleotiden ein oder mehrere Restriktionsstelleh aufweist.

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Reinigung von cDNS gewünschter Nucleotidsequenz, die zu einer

mRNS komplementär ist. Das Verfahren verwendet die Spaltung von durch Transcription aus einem komplexen Gemisch von mRNS entstandener cDNS mit Restriktions-Endonuclease. Das Verfahren erfordert keine ausgiebige Reinigung von RNS, sondern macht stattdessen Gebrauch von der Transcription von RNS in cDNS, der Sequenz-spezifischen Fragmentierung dieser cDNS mit ein oder zwei Restriktions-Endonucleasen imd der Fraktionierung der cDNS-Restriktionsfragmente aufgrund ihrer Länge. Die Verwendung von Restriktions-Endonucleasen eliminiert Grössenunterschiede und führt zu DNS-Fragmenten homogener Länge aus Fragmenten jeder beliebigen cDNS, die mindestens zwei Restriktionsstellen enthält. Aus der anfänglich heterogenen Population von cDNS-Transcripten entstehen gleichmässig grcsse Fragmente gewünschter Sequenz. Die Fragmente können eine Länge von einigen hundert Nucleotiden besitzen und gelegentlich das gesamte Strukturgen des gewünschten Proteins enthalten. Die Länge der Fragmente hängt von der Anzahl der Nucleotide ab, die zwischen den Restriktionsstellen liegen, und ist gewöhnlich verschieden bei verschiedenen Regionen der DNS. Die Längenfraktionierung ermöglicht die Reinigung einer homogenen Population von Fragmenten gewünschter Sequenz. Die Fragmente sind von homogener Grosse und hinsichtlich der Nucleotidsequenz hochrein. Di€gäÄgiigen Trenn- und Analyseverfahren ermöglichen die Isolierung dieser Fragmente der betreffenden mRNS, die mindestens 2 % der Gesamt-RNS ausmacht. Die Verwendung der bekannten RNS-Fraktionierverfahren zur Vorreinigung der mRNS vor der Transcript ion senkt die tatsächliche untere Ermittlungsgrehze auf weniger als der gesamtenjaus dem Organismus isolierten mRNS.

NacWobigem Verfahren gereinigte, spezielle Sequenzen können in einer zweiten spezifischen Spaltungsreaktion mit einer

Restriktions-iüuclease weiter gereinigt werden, die die Sequenz an einer Stelle im Innern spaltet. Diese Spaltung führt zu zwei Unterfragmenten gewünschter Sequenz, die aufgrund ihrer länge voneinander getrennt werden können. Die Unterfragmente werden von ungespaltenen und spezifisch gespaltenen verunreinigenden Sequenzen mit im wesentlichen Ausgangsgrösse abgetrennt. Diese Methode basiert auf der Seltenheit und zufälligen Anordnung der Erkennungsstellen der Restriktions-Endonueleasen, aufgrund derer es extrem unwahrscheinlich ist, dass ein verunreinigender Anteil mit gleicher Länge vom gleichen Enzym abgespalten wird unter Bildung von Fragmenten, die die gleiche Länge wie die gewünschte Sequenz aufweisen. Nach der Absonderung von den Verunreinigungen können die Unterfragmente der gewünschten Sequenz nach bekannten Methoden zusammengefügt werden, um die Ausgangssequenz wieder herzustellen. Die beiden Unterfragmente müssen jedoch an einer Verknüpfung in umgekehrter Reihenfolge ihrer Ausgangssequenz verhindert werden. Es wird ein Verfahren offenbart, wonach sich die Unterfragmente nur in der gewünschten Reihenfolge verknüpfen können.

Abwandlungen der skizzierten Methoden können in Kombination mit geeigneten Markierungstechniken angewandt werden, um genaue quantitative Messungen der Reinheit d*r isolierten Sequenzen zu ermöglichen. Diese kombinierten Techniken wurden angewandt zur Herstellung einer bekannten Nucleotidsequenz mit mehr als 99 % Reinheit.

Die nach vorstehend beschriebenen Methoden isolierte und gereinigte cDNS kann mit einem geeigneten Transfer-Vektor rekombiniert und in bekannter V/eise in einen geeigneten Mikroorganismus als Wirt transferiert werden. Es wurden

neue Plasmide erzeugt, die die Nucleotidsequenzen enthalten, Vielehe den Hauptteil des menschlichen Chprion-Somatomammotropins bzw. des menschlichen Wachstumshormons codieren. Ferner wurden neue Mikroorganismen erzeugt, die als Teil ihrer genetischen Ausstattung den Hauptteil von KCS bzw. HGH enthalten. Die offenbarten Verfahren können angewandt werden zur Isolierung und Reinigung von Wachstumshormonen aus anderen Tieren und zur Herstellung neuer Transfer-Vektoren und Mikroorganismen, die diese Gene enthalten.

Das erfindungsgemässe Verfahren verwendet als Ausgangsmaterial polyadenylierte, rohe oder partiell gereinigte mRNS, die in Sequenz und Molekülgrösse heterogen sein kann. .Die Selektivität des RMS-Isolierverfahrens wird durch jede Methode gesteigert, die zu einer Anreicherung der gewünschten mRNS in der heterodispersen Population der isolierten mRNS führt. Mit dem erfindungsgemässen Verfahren kann jede beliebige Vorreinigung dieser Art kombiniert werden, vorausgesetzt dass die betreffende Methode keine Indonucleolytische Spaltung der mRNS bewirkt. Eine wichtige Ausgangsüberlegung ist die Wahl des geeigneten Gewebes für die gewünschte raRNS. Diese Wahl wird häufig von der Tatsache bestimmt, dass das letztlich zu produzierende Protein nur von einem bestimmten spezialisierten Gewebe eines differenzierten Organismus erzeugt wird. Dies ist beispielsweise der Fall bei den Peptidhormonen wie dem Wachstumshormon oder dem HCS. In anderen Fällen können verschiedene Zellarten oder Mikrobenarten als Quelle für die gewünschte mRNS dienen. In diesen Fällen sind einige Vorversuche zur Ermittlung des optimalen Ausgangsmaterials erforderlich. Häufig zeigt sich, dass die Menge an gevjünschter mRNS erhöht werden kann, indem man die Reaktion der Zelle auf Stimuli aus der Umgebung ausnutzt. So kann

ад 7.3.1979

AP А61К/206 482

zum Beispiel die Behandlung mit einem Hormon eine erhöhte Produktion der gewünschten mRNS bewirken. Andere Verfahren benutzen das Wachstum bei einer bestimmten Temperatur oder in Gegenwart eines speziellen Nährmediums oder einer sonstigen chemischen Substanz.

Die Vorreinigung zwecks Anreicherung der gewünschten mRNS-Sequenzen kann auch unter Anwendung konventioneller Verfahren zur Fraktionierung der RNS nach deren Isolation aus der Zelle erfolgen. Man kann jedes Verfahren anwenden, das zu keinem Abbau der RIiS führt. Besonders geeignet sind die Verfahren der präparativen Sedimentation in einem Sucrose-Gradienten und die Gelelektrophorese.

Die mRNS muß aus der Ausgangszelle unter Bestimmungen isoliert werden, die ihren Abbau ausschließen. Insbesondere muß die Wirkung von RNase-Enzymen verhindert werden, da diese Enzyme zur hydrolytischen Spaltung der RNS-Nucleotidsequenz fähig sind_o Die Hydrolyse einer Bindung in der Sequenz führt zum Abreißen dieser Sequenz und Verlust des ENS-Fragments, das das ursprüngliche 5'--Bn<le der Sequenz enthält. Sine geeignete Methode zur Inhibierung der RNase während der'Extraktion aus Zellen ist in der DiS-PS (DE-Patentamneldung P. 28 22 568.5) offenbart. Bei diesem Verfahren wendet man während dem Aufbrechen der Zellen 4-molares Guanidiniumthiocyanat und 1-molares Mercaptoethanol an. Ferner sind niedrige Temperaturen und pH-Werte nabe 5_s0 hilfreich, um einen RNase-Abbau der isolierten RNS zu vermindern.

Vor Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens muß eine von verunreinigendem Protein, DNS, Polysacchariden und

Lipiden im wesentlichen freie mRNS hergestellt werden. Zur Durchführung dieser Reinigung stehen Standardmethoden zur Verfügung. Die so isolierte RNS enthält sowohl ncn-messenger-PJiS als auch messenger-RNS. Sine bequeme Methode zur Abtrennung der mRNS von. Eucaryoten ist die Chromatographie an Säulen aus Oligo-dT-Cellulose oder einem anderen mit Oligonucleotiden substituierten Säulenmaterial wie PoIy-U-Sepharose, wobei man die Spezifität der Wasserstoffbindung heranzieht, die aui' die Anwesenheit von Polyadenylsäure am 5'-Snde der eucaryotischen mRNS zurückgeht.

Die erste Stufe des erfindungsgemässen Verfahrens ist die BJufidung der DNS, die zu den isolierten heterogenen mRNS-Sequenzen komplementär ist. Das Enzym der Wahl ist bei dieser Reaktion die Reverse Transcriptäse, obgleich man im Prinzip auch jedes andere Enzym verwenden könnte, das eine echt komplementäre DNS-Kopie der mRKS-Matrize herstellen kann. Die Reaktion kann unter den literaturbekannten Bedingungen erfolgen, wobei man mRNS als Matrize und ein Gemisch der 4 Deoxynucleosid-triphosphate dATP, dGTP, dCTP und STTP als Vorläufer für den DNS-Strang verwendet. Zweckmassig wird eines der Deoxynucleosid-triphosphate mit einem Radioisotop, zujn Beispiel P, inoO-Stellung markiert, um den Reaktionsverlauf verfolgen und die Aufarbeitung und Abtrennung, zum Beispiel durch Chromatographieren und Elektrophorese, kontrollieren und quantitative Angaben inachen zu könnenj vergleiche Efstratiadis, A., et al, loc.cit.

Die bei der Reaktion mit Reverser Transcriptase erhaltenen cDNS-Transcripte sind hinsichtlich der Sequenzen am 5'-Ende und З'-Ende etwas heterogen aufgrund von unterschiedlichen Anfangsund Endpunkten der einzelnen Transcripte im Bezug zu der mRNS-Matrize. Die Variationsmöglichkeiten am 5*-Ende gehen vermutlich

auf die Tatsache zurück, dass der zur Einleitung der Synthese verwendete Oligo-dT-Primer zur Bindung an zahlreichen Stellen längs der polyadenylierten Region der mRNS befähigt ist. Die Synthese des cDNS-Transcripts beginnt an einem unbestimmter. Punkt in der Poly-A-Region, dann wird eine variable Länge der Роіу-Л-Region transcribiert, je nach der anfänglichen Bindungsstelle des Oligo~dT-Primers. Man kann diese Unbestimmtheit vermeiden, indem man einen Primer verwendet, der zusätzlich zum Oligo-dT-Trakt ein oder zwei Nucleotide der RNS-Sequenz selbst enthält, wodurch man einen Primer erzielt, der eine bevorzugte und definierte Bindungsstelle zur Einleitung der Transcription besitzt. Die Unbestimmtheit am З'-Ende des cDNS-Transcripts geht auf verschiedene Faktoren zurück, die die Reaktion der Reversen Transcriptasc beeinflussen, und auf die Möglichkeit eines partiellen Abbaus der RNS-Katrize. Die Isolierung spezifischer cDNS-Transcripte maximaler Länge wird sehr erleichtert, wenn man solche Bedingungen für die Reaktion der Reversen Transcriptase wählt, die nicht nur die Synthese von Sequenzen voller Länge begünstigen, stbndern auch die Synthese kleiner DNS-Ketten unterdrücken. Bevorzugte Reaktionsbedingungen für Reverse Transcriptase aus Vogel-Myeloblastosis-Virus werden im Beispielteil angegeben. Die spezifischen Parameter, die man variieren kann, um eine maximale Produktion langkettiger DNS-Übersetzungen hoher Originaltreue zu erzielen, sind die Reaktionstemperatur, Salzkonzentration, Enzymmenge, Konzentration des Primers im Bezug zur Matrize und die Reaktionszeit.

Die Bedingungen von Temperatur und Salzkonzentration werden so gewählt, dass die spezifische Basenpaarung zwischen dem Oligo-dT-Primer und polyadenylierten Anteil der RNS-Matrize optimiert sind. Unter geeignet gewählten Bedingungen ist der

Primer befähigt zur Bindung an die polyadenylierte Region der RNS-Matrize, wobei eine nicht-spezifische Initierung aufgrund von Bindungen an anderen Stellen der Matrize wie kurzen Α-reichen Sequenzen im wesentlichen verhindert wird. Die Effekte von Temperatur und Salzkonzentration sind gegenseitig abhängig. Höhere'Temperaturen und niedrigere Salzkonzentrationen vermindern die Sicherheit spezifischer Basenpaarungswirkungen. Die Reaktionszeit wird so kurz wie möglich gehalten, um nicht-spezifische Ihitiierungen zu verhindern und um die Gelegenheit eines Abbaus gering zu halten. Die Reaktionszeiten sind von der Temperatur abhängig, wobei niedrigere Temperaturen längere Reaktionszeiten erfordern. Bei 42 ⁰C sind Reaktionszeiten von 1 bis 10 Min. geeignet. Der Primer sollte in 50- bis 500-fachem molarem Überschuss über die RNS-Matrize vorliegen, und auch das Enzym sollte in ähnlichem molarem Überschuss über die RNS-Matrize vorhanden sein. Die Verwendung von überschüssigem Enzym und Primer begünstigen Ihitiierung und Kettenv;achstum der cDNS, so dass man im Rahmen der kurzen Inkubationszeiten langkettige cDNS-Transcripte erhält.

In vielen Fällen wird es möglich sein, das restliche Reinigungsverfahren gemäss der Erfindung mit einsträngigen cDNS-Sequenzen auszuführen, die durch Transcription aus mBNS erhalten wurden. Wie nachstehend noch beschrieben wird, gibt es jedoch Fälle, in denen das gewünschte Restriktionsenzym nur an doppeisträngiger DNS wirkt. In diesen Fällen kann die auf vorstehende Weise erzeugte cDNS als Matrize zur Synthese der doppeisträngigen DNS verwendet werden, wobei man eine DNS-Polymerase wie Reverse Transcriptase und eine zur Hydrolyse einsträngiger DNS befähigte Nuclease verwendet. Methoden zur Herstellung doppelsträngiger DNS auf diese Weise wurden bereits beschrieben, siehe zum Beispiel Ullrich, A.,

Shine, J., Chirgwin, J., Pictet, R., Tischer, E., Kutter, W.J. und Goodman, H.M., Science 196, Ϊ313 (1977)·

Durch Transcription heterogener mRNS-Sequenzen erhaltene heterogene cDNS wird dann mit ein oder zv/ei Restriktions-Endonucleasen behandelt. Die Wahl der Endonuclease hängt in erster Linie von einem Vorversuch ab, der die Erkennungsstellen für das Enzym in der Sequenz der zu isolierenden cDN'S feststellt. Die Methode basiert auf dem Vorliegen von zwei derartigen Stellen. Sind diese identisch, so reicht ein einsiges Enzym aus. Die gewünschte Sequenz entsteht durch Spaltung an zwei Stellen, wobei Grössenunterschiede bei der gewünschten cDNS-Sequenz eliminiert werden und man eine Anzahl von Molekülen - als Fragmente bezeichnet erhält, die die gewünschte Sequenz aufweisen und bezüglich der Länge homogen sind. Sind die Restriktionsstellen verschieden, so benötigt man zv/ei Enzyme, um die Fragmente homogener Länge zu erzeugen.

Die Wahl des oder der Restriktionsenzyme, die zur Produktion eines Nucleotidsequenz-Fragments optimaler Länge befähigt sind, welches das gesamte oderjeinen Teil des gewünschten Proteins codiert, muss empirisch erfolgen. Ist die Aminosäuresequenz des gewünschten Proteins bekannt, so kann man die Nucleotidsequenz von Nucleotidfragmenten gleichmässiger Länge, die durch Spaltung mit Restriktions-Endonucleasen entstanden ist, mit der sie codierenden Aminosäuresequenz vergleichen, wobei man die bekannte EeZiehung des genetischen Codes zugrunde legt. Eine vollständige Aminosäuresequenz des gewünschten Proteins ist jedoch nicht erforderlich, da eine hinreichend genaue Identifizierung auf der Grundlage einer Teilsequenz gemacht werden kann. Ist die Aminosäuresequenz des gewünschten Proteins unbekannt, so können die durch die Spaltung mit.der Restriktions-Endonuclease

JUT

erzeugten Polynucleotide gleicher Lange als Testreagenzien verwendet werden, die fähig sind, die 'Synthese des gewünschten Proteins in einem geeigneten, in vitro stattfindenden Proteinsynthesesystem zu identifizieren. Die mRNS kann auch durch Affinitätschromatographie oder andere, dem Fachmann geeignet erscheinende Techniken gereinigt werden.

Die Zahl der geeigneten Restriktionsenzyme hängt davon ab, ob man einsträngige oder doppelsträngige cDNS verwendet. Bevorzugt werden Enzyme, die zur Einwirkung auf einsträngige DNS befähigt sind, da letztere das direkte Reaktionsprodukt der mRNS-Transeription ist. Die Zahl der Restriktionsenzyme, von denen bisher die Fähigkeit zur Einwirkung auf einsträngige DNS bekannt ist, ist begrenzt. Zur Zeit erscheinen die Enzyme Haelll, Hhal und Hin(f)I als geeignet. Auch das Enzym MboII wirkt auf einsträngige DNS ein. Sobald weitere Untersuchungen die Wirkung anderer Restriktionsenzyme auf einsträngige DNS erkennen lassen, können diese Enzyme ohne weiteres in die Liste bevorzugter Enzyme eingereiht werden. Ausserdem eignen sich Enzyme, die auf doppelsträngige cDNS wirken. Sie werden jedoch nicht bevorzugt, da zusätzliche Reaktionen zur Herstellung der doppeisträngigen сDNS erforderlich sind, die Möglichkeiten zum Verlust langer Sequenzen und anderer Verluste bei der Aufarbeitung bieten. Das Arbeiten mit doppelsträngiger cDNS hat den weiteren technischen Nachteil, dass die spätere Sequenzanalyse komplizierter und umständlicher ist. Aus diesen Gründen wird die einsträngige cDNS bevorzugt, Jedoch ist die Verwendung doppeisträngiger DNS möglich.

Die zur Behandlung mit der Restriktions-Endonuclease vorbereitete cDNS kann radioaktiv markiert werden, so dass sie nach späteren Trennverfahren aufgefunden werden kann. Eine bevorzugte Methode besteht in der Einverleibung einer radioaktiven Markierung wie zum Beispiel P in einstellung

eines der 4 Deoxynucleosid-triphosphate. Die höchste Aktivität viird erzielt, wenn die Konzentration des radioaktiven Vorprodukts in Bezug auf die Konzentration der nicht-radioaktiven Form hoch ist. Die Gesamtkonzentration jedes Deoxynu.cleosid-triphosphats sollte jedoch grosser als jtö uM sein, um die Länge der сDNS, die in der Reaktion mit Reverser Transcriptase erhalten wird, maximal werden zu lassen; vergleiche Efstratiadis, A., Maniatis, T., Eafatos, P.C., Jeffrey, A. und Vournakis, J.N., Cell. Jt^ 367 (1975)· Zur Bestimmung der Nucleotidsequenz der cDNS können die 5'-Enden mit "" γ markiert werden, und zwar in einer Reaktion, die durch das Enzym Polynucleotidkinase katalysiert wird, vergleiche Maxam, A.M. und Gilbert, '.·/., Proc.Nat ¹I.Acad.Sci. USA 7^b. 56O (1977).

Fragmente, die durch die Einwirkung eines Restriktionsenzyms oder zweier Restriktionsenzyme erzeugt wurden, können voneinander und von heterodispersen Sequenzen, die keine Erkennungssfcellen besitzen, durch jede geeignete Technik abgetrennt werden, die zur Trennung von Polynucleotiden aufgrund der Längenunterschiede fähig ist. Zu diesen Methoden gehören die verschiedenen elektrophoretischen Verfahren und Sedimentations verfahren in der Ultrazentrifuge. Die Gelelektrophorese wird bevorzugt, da sie bezüglich der Polynucleotid-Länge die beste Trennung ergibt. Ausserdem erlaubt diese Methode die quantitative Isolierung der abgesonderten Materialien. Verfahren zur Gelelektrophorese wurden von Dingman, CV/. und Peacock, A.C., Biochemistry Jj_ 659 (I968) und Maniatis, T., Jeffrey, A. und van de Sande, H. Biochemistry Ik₁ yjQj (I975) beschrieben.

Ohne Behandlung mit Restriktions-Endonüclease sind die aus den meisten Quellen erhaltenen cDNS-Transcripte heterodispers bezüglich ihrer Länge. Durch die Einwirkung einer geeignet

gewählten Restriktions-Endonuelease oder eines Paares solcher Endonucleasen werden die die gewünschte Sequenz enthaltenden Polynucleotidketten an den Restriktionsstellen gespalten, so dass man Polynucleotidfragmente gleicher Länge erhält. Nach der Gelelektrophorese bilden diese eine ausgeprägte Bande. Je nach An- oder Abwesenheit von Restriktionsstellen an anderen Sequenzen kennen auch andere diskrete Banden entstehen, die jedoch mit grösster Wahrscheinlichkeit einer anderen Länge als derjenigen der gewünsdnten Sequenz entsprechen. Als Folge der Einwirkung der Restriktions-Endonuelease ist das Ergebnis der Gelelektrophorese das Auftreten von ein oder mehreren diskreten Banden, während der Rest der cDNS weiterhin heterodispers bleibt. Umfasst die gewünschte cDICS-Sequenz die Hauptmenge des vorhandenen Polynucleotids, so zeigt das Ergebnis der Elektrophorese, dass der grösste Teil der cDNS in der diskreten Bande vorliegt.

Obigeich es unwahrscheinlich, ist, dass zwei verschiedene Sequenzen bei der Spaltung durch Restriktionsenzyme Fragmente praktisch gleicher Länge ergeben, wäre eine Methode zur Feststellung der Reinheit der Fragmente definierter Länge wünschenswert. Die Sequenzanalyse kann angewandt werden, •um Verunreinigungen festzustellen, die 10 % oder mehr des Gesamtmaterials der betreffenden Bande ausmachen. Als Teil vorliegender Erfindung wurde eine Methode zum Auffinden geringerer Mengen an Verunreinigungen entwickelt, die auf den gleichen Prinzipien wie das vorstehend beschriebene Isolierverfahren beruht. Die Methode erfordert, dass das Nucleotidsequenz-Fragment eine Erkennungsstelle für eine Restriktions-Endonuelease aufweist, die bei der vorausgegangenen Isolierung nicht verwendet' wurde. Die Behandlung eines aus einer Gelelektrophorese-Bande eluierten Polynucleotidmaterials mit einer Restriktions-Endonuelease, welche

befähigt ist, im Innern auf die betreffende Sequenz einzuwirken, führt zur Spaltung dieser Sequenz in zwei Unterfragmente von wahrscheinlich verschiedener Länge. Diese Unterfragmente bilden bei der Elektrophorese zwei diskrete Banden an den ihren Längen entsprechenden Stellen, deren Summe gleich ist der Lange des Polynucleotids vor der Spaltung. Verunreinigungen in der ursprünglichen Bande, die vom Restriktionsenzym nicht angegriffen werden, sollten in die ursprüngliche Stellung wandern. Verunreinigungen, die ein oder mehrere Erkennungsstellen für das Enzym bieten, sollten zwei oder mehrere Unterfragmente ergeben. Da angenommen wird, dass die Verteilung der Erkennungsstellen im wesentlichen zufällig ist, ist die 'Wahrscheinlichkeit, dass eine Verunreinigung Unterfragmente gleicher Grosse wie das Fragment der gewünschten Sequenz ergibt, extrem gering. Die Menge des radioaktiv markierten Polynucleotids in jeder Bande kann durch Messen der in jeder Bande vorhandenen Radioaktivität oder durch ein anderes geeignetes Verfahren quantitativ bestimmt werden. Ein quantitatives Maß für die Reinheit der Fragmente gewünschter Sequenz kann erhalten werden, indem man die den Unterfragmenten aus der gewünschten Sequenz entsprechenden Stoffmengen mit der gesamten Stoffmenge vergleicht.

Nach der erfolgten Abtrennung kann die gewünschte Sequenz dann wieder hergestellt werden. .Zu diesem Zweck kann man das Enzym DNS-Ligase, das die End-an-Ende-Verknüpfung von DNS-Fragmenten katalysiert, verwenden. Die Banden der Gelelektrophorese, die den Unterfragmenten der gewünschten Sequenz entsprechen, können gesondert eluiert und in Gegenwart von DNS-Ligase. unter den geeigneten Bedingungen dann kombiniert werden, vergleiche Sgaramella; V., Van de Sande, J.H. und Khorana, H.G., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, §7j_ 1^68 (1970)· Sind die zu verbindenden Sequenzen nicht stumpfendig,

7.3И979

AP A61K/206 482

so kann man Ligase aus E. coli verwenden, vergleiche Modrich, P., und Lehman, I.B., J. Biol. Chem. 245, 3626 (1970).

Die Wiederherstellung der Originalsequenz aus Unterfragmenten, die durch Behandlung mit Restriktions-Endonuclease erhalten wurden, wird stark verbessert durch Anwendung einer Methode, die die Wiederherstellung in'falscher Sequenz verbindert. Dieses unerwünschte Ergebnis wird verhindert, wenn man die cDNS-Fragmente gewünschter Sequenz und homogener Länge vor der Spaltung der homogenen cDNS mit einer Restriktions-Endonuclease mit einem Reagens behandelt, das zur Entfernung der 5^f-terminalen Phosphatgruppen befähigt ist. Als Enzym wird alkalische Phosphatase bevorzugt. Die 5'-terminalen Phosphatgruppen sind eine strukturelle Voraussetzung für die nachfolgende Verknüpfung durch DNS-Ligase, die zur Wiederherstellung der Unterfragmente verwendet wird, Enden, denen eine 5^f-tenainale Phospbatgruppe fehlt, können daher nicht covalent gebunden werden. Die DNS-Unterfragmente können nur an den Enden verknüpft werden, die eine 5^f-Phosphatgruppe aufweisen, wobei diese durch die Spaltung der isolierten DNS-Pragmente mit der Restriktions-Endonuclease erzeugt wurden. Die Methode wird im einzelnen in der DE-PS (DE-PatentanmeIdung P 28 22 568.5) beschrieben.

Die Hauptmenge der cDNS-Transcripte entstammt bei den angewandten Bedingungen dem mRNS-Bereicb, welcher das 5'-3nde der mRNS-Matrize umfaßt, durch spezifische Primer-Wirkung auf diese Matrize durch ein Fragment, das durch Spaltung mit Restriktions-Endonuclease erhalten wurde. Auf diese Weise kann die vorstehend beschriebene Methode angewandt werden, um nicht nur Fragmente mit spezifischer Nucleotidsequenz in Bezug auf ein gewünschtes Protein, sondern auch die gesamte, das betreffende Protein codierende Nucleotidsequenz zu erzeugen.

Das Reinigungsverfahren ist von besonderer Bedeutung bei der Klonierung menschlicher Gene, die unter den in USA gültigen Bestimmungen nur nach sehr sorgfältiger Reiniger in rekombinante DNS und dann in Bakterien verbracht werden können, oder falls in entsprechend abgesicherten (P4) Einrichtungen gearbeitet wird, vergleiche US-Federal Register, Bd. 4l, Nr. 131, 7.7.1967, S. 27902-27943. Das vorliegende Verfahren ermöglicht die Herstellung von genügend reinen menschlichen Genen, die die wesentliche Struktur von HCS und HGH haben. Menschliches Gen-Material, das auf vorstehend beschriebene Weise isoliert und gereinigt wurde, kann in rekcmbinante Plasmide oder andere Transfer-Vektoren einverleibt werden. Doppe 1st rang ige, chemisch synthetisierte Ol&nucleotid-Bindeglieder, die die Erkennungssequenz für eine Restriktions-Endonuclease besitzen, können an die Enden der isolierten cBNS gebunden werden, um die spätere enzymatische Entfernung des Genteils von der Transfer-Vektor-DNS zu erleichtern, vergleiche Scheller, R.H., et al, Science 196, 177 (1977)· Die DNS des Transfer-Vektors wird durch Behandlung mit einer entsprechendexi Restriktions-Endonuclease· von einer geschlossenen Schleife in eine lineare Form überführt. Die dabei entstehenden Enden werden mit alkalischer Fhosphatase behandelt, um die 5'-Phosphatgruppen zu entfernen, so dass die DNS des Transfer-Vektors bei der Reaktion mit DNS-Ligase nicht erneut eine kontinuierliche Schleife bildet, ehe zunächst ein Segment der menschlichen DNS eingebaut wurde. Die сDNS mit dem Olfbnucleotid-Bindeglied und die vorbehandelte Transfer-Vektor-DNS werden mit einer DNS-Ligase vermischt, um die cDNS mit der Vektor-DNS zu verknüpfen unter Bildung einer geschlossenen Schleife aus rekombinanter Vektor-DNS mit eingebauter cDNS. Verwendet man ein Plasmid als Transfer-Vektor, so ist die geschlossene Schleife gewöhnlich die einzige, zur Transformation eines Bakteriums befähigt Form. Unter Transformation versteht man den Vorhang,

2Λ

bei welchem ein Mikroorganismus extracelluläre DNS seinem eigenen genetischen Aufbau einverleibt. Plasmid-DNS in Form einer geschlossenen Schleife kann unter geeigneten Milieubedingungen einverleibt werden. Das Plasmid in Form der geschlossenen Schleife wird in der transformierten Zelle repliziert, und die replizierten Kopien werden bei der Zellteilung auf die Zellnachkommen verteilt. Als Ergebnis entsteht ein neuer Zellstamm, der das Plasmid enthält und dessen genetische Determinanten trägt. Die derartige Transformation durch ein Plasmid unter Beibehaltung der Plasmidgene bei der Plasmid-Replikation erfolgt mit grosser Häufigkeit, wenn die transformierende Plasmid-DNS in Form einer geschlossenen Schleife vorliegt, jedoch gar nicht oder selten, wenn lineare Plasmid-DNS verwendet wird. Sobald einen rekombinanten Transfer-Vektor erhalten hat, ist die Transformation eines geeigneten Mikroorganismus ein einfacher Vorgang, und neue Mikroorganismenstämme, die menschliches Gen enthalten, können leicht unter Anwendung der entsprechenden, an sich bekannten Selektionsverfahren isoliert werden.

Unter Anwendung der -vorstehend beschriebenen Verfahren zur Reinigung und Analyse wurde eine Nucleotidsequenz isoliert, die den Ha*up tan teil, des Strukturgens für KCS enthält, deren Reinheit sich als mehr als 99 ^ig erwies. Das Strukturgen für HGH wurde in vergleichbarem Reinheitsgrad isoliert. Neue Plasmide, die die isolierten HCS-oder HGH-Sequenzen enthalten, wurden synthetisiert. Ferner wurden neue Mikroorganismen hergestellt, die die isolierten HCS- oder HGH/ Sequenzen als Teil ihres Genmaterials enthalten.

ъ% 7.3.1979

AP А61К/206

Die beiliegenden Zeichnungen demonstrieren die in den Beispielen erzielten Ergebnisse.

Figur 1 ist ein Autoradiogramm einer Serie von Gelelektro phorese-Versucben mit ^ P-markierter cDNS (vergleiche Beispiel 1).

Figur 2 ist die schematische Wiedergabe der HCS codierenden Nucleotidsequenz, die die relative Stellung verschiedener Restriktionsstellen zeigt (vergleiche Beispiel 1). Figur 3 ist ein Autoradiogramm von Gelelektrophorese-Versuchen an 3 P-markierter cDNS (vergleiche Beispiel 2). Die Figuren 4 und 5 sind Autoradiogramme von Gelelektrophorese-Versuchen mit ^ P-markierter cDNS (vergleiche Beispiel 3),

Ausführunp^sbeispiel

Nachstehend wird die Erfindung an einigen Ausführungsbeispielen näher erläutert.

Beispiel 1

Das allgemeine Verfahren zur Isolierung einer spezifischen cDNS-Sequenz wird demonstriert an der Isolierung einer Sequenz, die einen Teil der Codierungsregion für HCS umfaßt und aus Placentagewebe extrahiert wurde.

Extraktion der mRNS aus der Placenta

Menschliche Geburtsplacentas, bei Kaiserschnitt-Geburten erbalten, wurden in flüssigem Stickstoff rasch eingefroren und bei -60⁰C gelagert. Zur Extraktion der gesamten RNS wurden 40 g der gefrorenen Piacentagewebe in kleine Stücke zerbrochen und in einem Mischer in 140 ml einer frisch zubereiteten Lösung von 7 M-Guanidinium-HCl (s. Cox, R.Α.,

ЪЪ 7.3.1979

AP Δ61Κ/206

Methods in Enzymology 12, 120 (1968)) 20 шМ Tris-HCl, pH 7»5> 1 шМ EDTA, 1 % Sarcosyl (Handelsbezeichnung der СіЪа-Geigy Corp., Greensboro, N.C.) bei 0?C gelöst« Nach Zusatz von 0,5 S Cäsiumchlorid pro Milliliter wurde die dunkelbraune

Lösung 5 Min. auf 65 C erwärmt, rasch in Eis gekühlt, auf ein Kissen aus 5,7 M CsCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 M EDTA in 2,5 x 8,75 cm Nitrocellulose-Röhrchen aufgeschichtet und in einem SVv27-Rotor (Beckman Instruments Corp., Fullerton, California) bei 27 000 Umdrehungen/Min. 16 Std. lang bei I5 °C zentrifugiert(Glisin, V., Crkvenjakov, R. und Ryus, C, Biochem. IjLi. 2655 (197²O). Nach dem Zentrifugieren wurde abdekantiert, die Röhrchen wurden entwässert und das 1/2 era gross© Bodenstück, das das reine RNS-Pellet enthielt, wurde mit einem Rasiermesser zerschnitten. Die Pellets wurden in einen sterilen Srlenmeyer-Kolben überführt und in 20 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA, 5 % Sarcosyl und 5 % Phenol gelöst. Die Lösung wurde dann 0,1-molar an Natriumchlorid gemacht und mit 4o ml eines Gemischs aus 50 % Phenol und 50 % Chloroform kräftig geschüttelt. Die RNS wurde aus der wässrigen Phase mit Ethanol in Gegenwart von 0,2 M Na-acetat, pH 5*5 ausgefällt. Die RNS-Pellets wurden mit 95 % Ethanol gewaschen, getrocknet und in sterilem Wasser gelöst. Gewöhnlich ergeben 40 g Placentagev/ebe etwa 30 mg RNS, woraus man etwa ЗОО ^g polyadenylierter RJiS nacli zweimaligem Chromatographieren an Oligo-dT-zellulose erhält, vergleiche Aviv und Leder, loc.cit.

Synthese der cDNS

^^^аіЕЙхтеп wurden ausgeführt in ρ, μΐ, enthaltend 50 mM Tris-HCl, pH 8,3, 0,ImM EDTA, 7 mM MgCl, 20 m^KCl, 10 mM ß-Merkaptoethanol, .40 ;uM dCTP (50 000 cpm ^P/pMol), 500 ;лМ dCTP, dATP und dTTP, 100 /ig/ml polyadenylierte RNS, 20 /iSA-I 01igo-dT₁₂__-,o (zu beziehen bei Collaborative Research, Waltham, Mass.) und 100 Einheiten/ml Reverse Transcriptase aus Vogel-Myeloblastosis-Virus· Das Enzym kann bezogen werden bei der Life Science Incorporated, St. Petersburg, Florida, die es unter Vertrag mit den National Institutes of Health nach dem

Verfahren von Kacian, D.L. und Spiegelman, S., Methods in Enzymology 29* L. Grossman, und K. Moldave '(Herausg.) Academic Press, N.Y. (1974) S. 150 produziert. Die Reaktionen wurden eingeleitet durch Zusatz des Enzyms bei 0 ⁰C, die Synthese erfolgte während 6 Min. bei 42 °C. Unter diesen Bedingungen wurden 10 cpm ^ P in das mit Trichloressigsäure ausfällbare Material einverleibt, und Jedes /ig RNS ergab etwa 50 ng cDNS. Um genügend cDNS für eine Sequenzanalyse zu erhalten, wurden die Reaktionsvolumina auf 100 μΐ und die dCTP-Konzentrationen auf 250 uM

erhöht (spezifische Aktivität 500 cpm ^ P/Mol). Unter diesen

32

Bedingungen wurden etwa 200 000 cpra ^ P-markiertes dCTP in cDNS eingebracht.

Behandlung mit Restriktions-Endonuclease

« Zur Digerierung mit Restriktions-Endonuclease wurden die

analytischen Reaktionen durch Zusatz von 20 μΐ eiskaltem V/asser gestoppt, dann wurde 2 Min. gekocht, schnell auf Eis abgekühlt und mit Magnesium^T-moI^r gemacht. Proben von jeweils 5 ^l (2 χ 10^ cpm) wurden unter Verwendung eines Überschusses der Restriktions-Endonuclease(n) Haelll oder Hhal, oder beider, 1 Std. bei 37 °C digeriert. Das Enzym Haelll war nach der Methode von Middleton, J.H., Edgell, M.H., und Hutchinson, CA. Ill, J. Virol.10^ 42 (l97^) hergestellt worden. Die Enzyme Hhal und Нгра.ІІ waren erhalten worden von den New England Bio-Labs, Beverly, Mass.. Auch Haelll ist bei diesem Hersteller zu beziehen. Die Enzymmenge wurde empirisch so bestimmt, dass ein Überschuss über die zur vollständigen Verdauung einer äquivalenten Menge hestriktions-

notwendmge Menge

eapfindlicher DNS unter identischen Reaktionsbedingungen'vorlag. Die Reaktionen wurden mit 5 ul 20 mM EDTA, 20 % Sucrose, 0,05 # Bromphenolblau abgestoppt, 1 Min. a'uf 100 °C erhitzt, und dann durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese analysiert.

Die Trennung der Produkte erfolgte mit einem 4,5 % - 10 % Polyacrylamid-Plattengel, während 2 1/2 Std. bei I5OV in Tris-Borat-EDTA-Puffer (Fingman, CV/. und Peacock, A.C., loc.cit),die Sichtbarmachung erfolgte durch Autoradiographie des trockenen Gels.

Figur 1 zeigt die Ergebnisse von Elektrophorese und Auto-

32

radiographie der P-markierten cDNS, deren Herstellung vorstehend beschrieben ist. Die Proben wanderten elektrophoretisch durch 4,5 ^ Acrylamid und dann durch 10 % Acrylamid. Links wird mit einem Strich die Grenze zwischen den zwei Gel-Bereichen angegeben. Das Band A gibt die elektrophoretische Wanderung des gesamten cDNS-Transcripts wieder, Band B zeigt die Wanderung der mit Hhal behandelten cDNS. Band C zeigt die Wanderung der mit Haelll behandelten cDNS. Band D zeigt die elektrophoretische Wanderung der soviohl mit Hhal als auch mit Haelll behandelten gesamten cDNS. Band E zeigt die elektrophoretische Wanderung des aus der Hauptbande Band C isolierten Materials. Band P zeigt die elektrophoretisch^ Wanderung des aus der Hauptbaiide von Band C isolierten Materials nach Behandlung mit Hhal. Band G zeigt die elektrophoretische Wanderung einer

"52 mit Haelll gespaltenen, 5'-P endmarkierten einsträngigen Phagen-Ml^-DNS, die als Grössenstandard verwendet wurde, siehe Horiuchi, K., und Zinder, N.D., Proc.Nat.Acad.Sci. USA, 72, 2555 (1975)· Die angenäherten Längen dieser DNS-Fragmente in Nucleotideinheiten sind durch die Zahlen rechts angegeben.

Das Ergebnis im Band A zeigt, dass das cDNS-Transcript aus KiKNS-Geburtsplacenta heterodispers ist. Die Behandlung mit Hhal (Band B) oder Haelll (Band C) führt zur Anhäufung von Polynucleotiden diskreter Länge. Die Herstellung solcher diskreter Banden weist darauf hin, dass in einer heterogenen

Population von сDNS-Transcripten mindestens eine Sequenz in mehreren Kopien vorhanden ist, die zwei Restriktionsstellen für Hhal bzw. Haelll besitzt. Die Spaltung mit Hhal erzeugt ein Fragment von etwa 470 Nucleotiden, und mit Haelll erhält man ein Fragment, von etwa 550 Nukleotiden Länge. Die Digerierung mit beiden Enzymen ergibt drei Fragmente, nämlich A mit 90 Nucleotiden Länge, B mit 460 Nucleotiden Länge und C mit etwa 10 Nucleotiden Länge. Aufgrund der geringen Grosse wandert das Fragment C unter den bei Figur 1 verwendeten Bedingungen aus dem Gel. Die an der Grenzfläche zwischen 10 und 4,5 % Gel auftretende Bande stellt ein heterogene^ Material dar, das zum Eintritt in das 10 % Gel. zu gross war und sich daher an der Grenzfläche ansammelte. Wie aus dem einfachen Bandenmuster von Band D zu schliessen, scheinen die Fragmente A und B aus dem gleichen cDNS-Molekül zu stammen. Dieser Schluss wird durch die Eluierung des grösseren Haelll-Fragmentsaus dem Gel bestätigt, das erneut mit Hhal digeriert wird. Diese Behandlung liefert zwei Fragmente, die gleichermassen wandern wie die Banden, die entstehen bei kombinierter Digerierung der gesamten cDNS mit Haelll und Hhal, wie aus dem Vergleich der Bänder D und F ersichtlich. Im Digerierungsprodukt der gesamten cDNS gemäss. Band D ist die autoradiographische Dichte, die ein Maß für die gesamte vorhandene Radioaktivität darstellt, · für Fragment A grosser als für Fragment B, obgleich man aufgrund der Grössenunterschiede das Umgekehrte erwarten könnte. Diese Beobachtung legt den Schluss nahe, dass das Fragment A durch Transcription einer dem 3'-Ende der mRNS nähergelegenen Region als Fragment B entsteht.

Figur 2 ist eine schematische Wiedergabe des cDNS-Moleküls mit den relativen Plazierungen der Haelll- und Hhal-Restriktionsstellen. Die DNS-Fragmente A und B, die dem gleichen cDNS-Molekül entstammen, wurden aufgrund ihrer relativen Intensität

im Autoradiogramm gemäss Figur 1, Band D angeordnet. Die Existenz des DNS-Fragments C wurde aus dem Unterschied der elektrophoretischen Mobilität der in den Bändern B tand D von Figur 1 erscheinenden Banden geschlossen. Die Grosse des DNS-Fragments A ist genau bekannt aufgrund einer Bestimmung der Nucleotidsequenz nach dem Verfahren von Maxam, A. und Gilbert, W. loc.cit. Die Grosse des DNS-Fragments B wurde durch Vergleich mit M1J5-DNS-Grössenmarkierungen gemäss Figur 1, Band G ermittelt.

Die Nucleotidsequenz des DNS-Fragments A und eines Teils des 5'-Endes von Fragment B erfolgten nach dem Verfahren von Maxam, A. und Gilbert, V/. loc.cit. Da die Aminosäuresequenz von HCS bekannt ist, kann die Nucleotidsequenz der beiden Fragmente mit der Aminosäuresequenz verglichen werden unter Anwendung der bekannten Beziehung des genetischen Codes. Auf der Basis dieser Beziehung konnte nachgewiesen werden, dass die spezifischen Sequenzen tatsächlich Teile des HCS-Moleküls codieren, ferner konnte die Anordnung dieser Fragmente gemäss Figur 2 bestätigt werden.

Beispiel 2

Folgendes Beispiel demonstriert die Fähigkeit des erfindungs« gemässen Verfahrens zum Reinigen einer Nucleotidsequenz, die als geringerer Anteil in der gesamten Population von Nucleotidsequenzen vorliegt. Als Matrize wurden definierte BNS-Gemische verwendet, die gereinigte Globin-RNS von Kaninchen und menschliche polyadenylierte Plaeenta-RNS enthielten, wobei die Reaktion mit der Reversen Transcriptase in Gegenwart von oC- P dCTP mit einer spezifischen Endaktivität von 10 cpm/pMol erfolgte. Die cDNS-Produkte wurden mit der Endonuclease Kaelll gespalten und die Spaltungsprodukte wurden auf 4,5 % - 10 % Polyacrylamid-Plattengel getrennt.

Die cDNS-Fragmente wurden durch Autoradiographie des getrockneten Gels sichtbar gemacht.

Figur J> zeigt die Ergemsse der Versuche. Die Gelelktrophorese wurde im wesentlichen wie in Beispiel 1 beschrieben ausgeführt. Die Bänder A und H bezeichnen die Grössenmarkierer, die erhalten worden waren durch Spaltung von Phagen-M13-DNS mit der Endonuclease Haelll und 5¹- P-Endmarkierung der dabei erhaltenen Fragmente. Die angenäherten Längen dieser DNS-Fragmente in Nucleotiden sind durch die Zahlen links angezeigt. Die Bänder B bis G zeigen die Elektrophoresemuster, die erhalten wurden nach Ausführung obiger Reaktionsfolge an Gemischen v&n Globin-RNS und Placenta-RNS unter Veränderung der Mengen, wie aus folgender Tabelle ersichtlich:

Band Globin-RNS Placenta-RNS Nanogramm Nanogramm

B 500 0

C 60 240

D 20 270

E 15 285

F 7,5 292,5

G 0

Man sieht, dass die Globin-cDNS ein HaeIII-Fragment von 320 Nucleotiden Länge ergibt. Das Globin-cDNS-Transcript kann noch ermittelt werden, wenn die Globin-RNS nur 2 bis 5 % der gesamten RNS ausmacht. Liegt eine RNS-Art nach der Isolierung in zur Ausführung dieser Analyse zu geringer Kopienanzahl vor, so kann sie zunächst durch eines der bekannten RNS-Reinigungsverfahren teilweise gereinigt werden, bis sie etwa 2 bis 5 % des restlichen G'emischs beträgt.

Λο

Beispiel 3

Dieses Beispiel beschreibt die Reinigung eines Nucleotidsequenz-Fragments von etwa 550 Basenpaaren Länge, das einen Teil der Codierungsregion für HCS enthält, und ein Verfahren zum Messen der Reinheit der isolierten Sequenz. Die Reinheit des gereinigten Fragments betrug mehr als 99 «*

Reinigung von HCS-eDffS

Polyadenylierte Placenta-RNS, die nach der Vorschrift von Beispiel 1 isoliert worden war, wurde an KCS-mRNS angereichert durch Sedimentation in einem 5 % bis 20 % (Gew./Vol.) Suerose-Gradienten von 4 ⁰C im SV/ 27-Rotor einer Beckman-UltrcLzentrifuge bei 25 000 Umdrehungen während 1б Std. Die llS-l4s-Region des Gradienten wurde gesammelt und 100 ug dieser RNS wurden zur Synthese der doppelsträngigen cDNS nach der Vorschrift von Ullrich, A., et al., loc.cit. verwendet. Die Synthese des zweiten .Strangs wurde gestoppt durch Extraktion des Reaktionsgemischs mit 1 Vol.teil Ethanol bei -70 ⁰C. Die Digerierung der cDNS mit Haelllendonuclease erfolgte in 50 /al 6mM Tris-HCl, pH 7,5, 6 mM MgCl₂, 6 mM ß-Merkaptoethanol mit 2 Einheiten Haelll bei УТ C während 2 Std., anschliessend erfolgte Behandlung mit 0,1 Einheiten bakterieller alkalischer Phosphatase (Typ BAPF, *Worthington .Biochemical Corp., Freehold, N.J. , Definition der Einheiten durch den Hersteller) bei бО ⁰C während 10 Minuten. Mach der Extraktion mit 1 Vol.teil Phenol/Chloroform wurde die DNS mit 2 Vol. teilen Ethanol von -70 °C ausgefällt, in 20 ^l 10 mM Tris-HCl, pH 8, 1 mM EDTA gelöst und einer Elektrophorese an б ^ (Gewicht/Vol. ) Polyaciylamidgel unterworfen. Figur 4 (F) zeigt das Elekt.rophoresemuster dieses Reaktionsgemischs,, das eine herausragende Bande entsprechend einer Nucleotidsequenz von etwa 550 Basenpaaren Länge zeigt. Das Fragment mit 550 Basenpaaren

wurde aus dem Gel ausgeschnitten und elektrophoretisch eluiert, das Ergebnis zeigt Figur 4(E).

Das restliche Material entsprechend dem Fragment mit 550 Basenpaaren gemäss Figur 4(E) vmrde mit 4 Einheiten HhaX-endonuclease in 50 ul des gleichen Puffers, der zum Digerieren mit Haelll-endonuclease verwendet worden war, 2 Std. bei 57 ⁰C behandelt. Nach der Extraktion mit Phenol/Chloroform und Ausfällung mit Ethanol wurden die Produkte der Digerierung durch Elektrophorese an einem 6 % (Gewicht/Volumen)-Polyacrylamidgel getrennt. Das Ergebnis zeigt Figur 4(D).

Die beiden Fragmente wurden elektrophoretisch eluiert, vereinigt und neu verknüpft durch zweistündiges Inkubieren bei 15 °C in 20 рі.бб.тМ-Tris-HCl, pH 7,6, 6 mM MgCIg, 15 dM Dithiothr.eit, 1 mM ATP enthaltend 20 pjg/ml Т4 DNS-Ligase. Das Reaktionsgemisch wurde dann mit 0,1-molarer Natriumchloridlösung auf 200 jil verdünnt und mit 1 Vol.teil Phenol/ Chloroform extrahiert, die DNS wurde mit 2 Vol.teilen Ethanol ausgefällt. Nach erneuter Suspendierung in 20 μΐ 10 mM Tris-HCl, pH 8, 1 mM EDTA wurden die Verknüpfungsprodukte durch Elektrophorese an б % (Gew./Vol.) Polyacrylamidgel getrennt. Das Ergebnis zeigt Figur 4(C). Aus dem Elektrophoresemuster von Figur 4(C) ist zu ersehen, dass das Fragment aus 550 Nucleotiden, durch die Verknüpfungsbehandlung wiederhergestellt worden ist. Die vorgängige Behandlung mit alkalischer Phosphatase stellte sicher, dass die beiden Hha-I-Fragmente in der ursprünglichen Reihenfolge verknüpft worden waren. Die vieiteren Banden gemäss Figur 4(C) entsprechen der Dimerbildung zwischen Hhal-Fragmenten, da diese durch die Behandlung mit alkalischer Phosphatase nicht.verhindert wird.

Das Fragment aus 550 Nucleotiden wurde aus dem Gel ausgeschnitten und elektrophoretisch eluiert. Das .Elektrophoresemuster dieses Materials zeigt Figur 4(B). Figur 4(A) ist

32

das Elektrophoresemuster eines mit ^ P-markierten Haelll-Verdauungsprodukts von doppeisträngiger M13-DNS, die zur Grössenmarkierung verwendet vmrde. Die elektrophoretischen Analysen erfolgten in 6 ^ (Gew./Vol.) Polyacrylamidge1 in 50 mM Tris-borat, pH 8, 1 mM EDTA bei 100 Volt während 2 Std. Nach der Elektrophorese wurde das Gel getrocknet und mit Hilfe eines Kodak NS2T x-Röntgenfilms wurden die Autoradiogramme hergestellt.

Reinheit des wiederhergestellten 550 Nucleotid-Fragments von HCS-cDNS

Die isolierten, wiederhergestellten HCS-cDNS-Haelll-Fragmente wurden am 5'-Ende mit ^ P markiert unter Verwendung des Enzyms Polynucleotid-Kinase aus mit Bakteriophagen Т4 infizierten E.coli, siehe Panet, A. et al., Biochemistry 12, 5045 (1975)· Polynucleotid-Kinase ist zu beziehen bei P-L- Biochemical, Milwaukee, Wisconsin. Das Fragment wurde dann entweder mit Hhal oder Hpall in 50/il 6 mM Tris-HCl, pH 7,6, 6 mM MgCl₂, 6raM ß-Merkaptoethanol bei 3>7 °C 2 Std. lang digeriert. Nach der Extraktion mit einem gleichen Volumen Phenol/Chloroform wurde die DNS mit 2 Volumina Ethanol von -70 ⁰C ausgefällt, in 20 pl, 10 mM Tris-HCl, pH 8, 1 mM EDTA erneut suspendiert und einer Elektrophorese unterworfen. Mit einem Röntgenfilm wurden die markierten Fragmente sichtbar gemacht, wie vorstehend beschrieben.

Die Ergenisse zeigt Figur 5. Figur 5 (B) und Figur 5 (E) zeigen Wiederholungsläufe mit dem 550 Nucleotid-Fragment vor der Behandlung mit Restriktionsenzym. Figur 5(C) zeigt das Muster nach Hhal-Spaltung und Figur 5 (D) nach Hpall-Spaltung.

Die Reinheit des 550 Nucleotid-Fragments wurde gemessen durch Zerlegen des Autoradiogramms der- mit dem Restriktionsenzym entstandenen Spaltprodukte und durch Quantifizierung der Verteilung der Radioaktivität in beiden Digerierungsprodukten. Diese Messungen ergeben, dass das rekonstituierte HaeIII-Fragment von menschlicher HCS-cDNS zu mehr als 99 % homogen war.

Beispiel 4

Dieses Beispiel beschreibt die Synthese eines Plasmids, öas eine Nucleotidsequenz von 550 Basenpaaren enthält, die den Hauptanteil der codierenden Region für KCS ausmacht.

Nach der Vorschrift von Beispiel 3 wird ein 550 Nucleotidfragment von HCS-cDNS von mehr als 99 % Reinheit hergestellt. Die Serminalen 5'-Phosphatgruppen werden in einem Reaktionsgemisch wiederhergestellt, das 50 mM Tris-HCl, .pH 8,5, 10 mM MgCl₂, 0,1 mM Spermidin, 5 mM ß-Merkaptoethanol, 5 % (Gew,/Vol.) Glycerin, 333 pMol ATP, 5 Einheiten T^-PoIynucleotid-Kinase enthält unter zweistündiger Inkubation in einem Endvolumen von 40 ul bei 37 ⁰C. Die DNS wird aus dem Reaktionsgemisch durch Phenol-Extraktion und Ausfällung mit Ethanol isoliert. Dann werden synthetische Decanucleotid-Bindeglieder mit einer Restriktions-Spezifitat für EcoRI mit der Seq,uenz S'-CCGAATTCGG^¹ (Herstellung s. Scheller, et al., loc.cit) an die HCS-DNS angeknüpft im Molverhältnis von etwa 50:1 in. 50 ^l 66 mM Tris-Hßl, pH 7,6, 9 mM MgCl₂, 15 mM Dithiothreit, 1 mM ATP und 20 με/ral T^ DNS-Ligase. Die Bindeglieder sind zu beziehen von Collaborative Research,. It'altham,· Massachusetts. Nach lSstündiger Inkubation bei 4 °C wird die Reaktion durch Extraktion mit Phenol/Chloroform gestoppt. Die Verknüpfungsprodukte werden mit Ethanol ausgefällt, erneut gelöst in 50 ^l 100 mM NaCL, 50 mM Tris-HCl, pH 7,6, 7 mM MgCl₂ und mit 50 Einheiten EcoRI-endonuclease- bei 37 °C

_цц 7.3.1979

AP А61К/206

2 Std. digeriert. Die Digerierung mit der Endonuclease führt zur Spaltung an der EcoRI-Stelle der Decameren, wodurch man HCS-cDNS mit kohäsivan EcoRI-Enden sowie abgespaltete nicht-umgesetzte Decanucleotide und mit sich selbst verknüpfte Decanucleotide erhält. Da die gespalteten Decamere auch EcoKI-Endgruppen besitzen und bei der Neukombination mit dem ähnlich gespalteten riasmid mit der HCS-cDNS konkurrieren würden, wird die HCS-cDNS vor der Umsetzung mit dem Transfer-Vektor durch Gelelektrophorese isoliert. Die Verwendung obiger Decanucleotid-Bindeglieder besitzt den Vorteil, daß man das HCS-cDNS-Fragment aus dem Plasmid in einer Form isolieren kann, die mit dem ursprünglichen Fragment identisch ist.

Als Transfer-Vektor wurde das bakterielle Plasmid pMß-9 verwendet, ein Molekül vom Molekulargewicht 3,5 x 10 , das eine einzige EcoRI-Stellung aufweist (Herstellung siehe Rodriguez, R.L., Bolivar, F., Goodman, H.M., Boyer, H.W., und Betlach, M. ICN-UCLA Symposium On Molecular and Genetic Biology, D.P. Wierlicb, W.J. Rutter und CF. Fox (Herausg.) Academic Press, New York (1976) S. 4-71-4-77). Die Plasmide pMB-9 und pBR-322 (siehe Beispiel 5) sind zu beziehen von Betbesda Research Labs, Rockville, Maryland. Die Infizierung von S.coli mit pMB-9 verleiht Resistenz gegen Tetracyclin. Die Einverleibung von DNS in die ScoRI-Stellung von pMB-9 verändert weder die Tetracyclin-Resistenz noch eine andere bekannte Eigenschaft des Plasmids. Daher gibt es keine phänotypiscben Unterschiede zwischen rekombinanten und normalen Plasmiden. Das mit EcoRI gespaltete pMB-9 wurde somit zunächst mit alkalischer Phosphatase behandelt nach dem Verfahren der DE-PS (DE-Patentanmeldung P 28 22 568.5), vergleiche auch Ullrich, et al., loc.cit. Die Behandlung mit alkalischer Phosphatase entfernt die 5'-Phosphatgruppen von den mit EcoRI erzeugten Enden des Plasmids

Hoverhindert Selbstverknüpfung der Plasmid-DNS, wodurch sichergestellt wird, dass die Ringbildung und spätere Transformation abhängig werden von der Inserierung eines DNS-Fragments mit 5'-phosphorylierten Enden. Die Behandlung mit alkalischer Phosphatase erfolgte in einem Reaktionsgemisch mit 1,0 Enzymeinheiten pro Milligramm Plasmid-DNS in 25 mM Tris-HCl, pH 8 während JO Min. bei 65 °C. Dann erfolgte Phenol-Extraktion zur Entfernung der Phosphatase und Ausfällung der DNS mit Ethanol. Die Verknüpfung der HCS-cDNS mit dem so behandelten pMB-9 erfolgte in 50 ul -Reaktionen enthaltend во mM Tris-HCl, pH 8, 10 mM ß-Merkaptoethanol, 9 mM MgCL₂, 10 bis 50 ng der gereinigten HCS-cDNS und etwa 5OO ng mit EcoRI gespaltener, 5'-dephosphorylierter Plasmid-DNS. Die Reaktionen wurden eingeleitet durch Zusatz von Τ4 DNS-Ligase bis 5 pjg/ml, 1 Std. bei I5 °C ablaufen gelassen und danft. wurde das Gemisch verdünnt auf 0,25 ml mit 120 mM NaCl, 1 inM EDTA. Das verdünnte Reaktionsgemisch wurde direkt zur Transformation von E.coli-X-1776 verwendet.

E.coli X-I776 ist ein Wirtsorganismus, der speziell zur rekombinanten DNA-Technik entwickelt wurde und vom National Institut of Health in den Richtlinien als EK>2-Wirt bezeichnet wird. Der Stamm kann bezogen werden von Dr. Roy Curtiss III, University of Alabama, Department of Microbiology, Birmingham, Alabama. Die Bakterien werden in I50 ml Nährbrühe gezüchtet, die mit 100 jjg/ml Diaminopimelinsäure (DAP) und 40 ^ig/ml Thymin ergänzt ist, bis zu einer Zelldichte von etwa 2 χ 10 Zellen/ml. Die Zellen werden durch Zentrifugieren gesammelt und in 60 ml 10 mM NaCL gewaschen, erneut zentrifugiert und in 60 ml Transformat ions-Puff er suspendiert, der 10 mM Tris-HCl, pH 8, l40 mM NaCl, 75 raM CaCIp enthält. Die Zellsuspension wird 15 Min. auf Eis gehalten, dann werden die Zellen abzentrifugiert und in 1,5 ml des gleichen Transformations-Puffers suspendiert. 0,5 der Zellsuspension werden zu 0,5 ml verdünntem Verknüpfungs-

Reaktionsgemisch zugegeben, worauf 15 Min. auf Eis inkubiert wird. Nach 4 Min. bei 25 ⁰C wird das Gemisch wieder JO Min. auf Eis gehalten. 0,2 ml der Zellsuspension werden direkt auf Nähragar-Platten verbracht, die mit 100 jug/ml DAP, hO Thymin und 20 ng/ml Tetracyclin ergänzt sind. Man erhält Transformationsproben, die alle eine Inserierung von 550 Basenpaaren enthielten, welche von der Plasmid-DNS durch Digerierung mit EcoRI- oder Haelll-endonuclease freigesetzt wurde.

Zur Sequenzanalyse wurde ein Transformations-Klon mit der Bezeichnung pHCS-1 ausgewählt. E.coli X-I776 (pKCS-1) wurde in geeignetem Nährmedium gezüchtet, die Plasmid-DNS wurde daraus isoliert und mit EcoRI-endonuclease gespalten. Die Ihserierung aus 550 Basenpaaren wurde von dem linearen pMB-9 isoliert durch Elektrophorese in 6 % Polyacrylamidgel, worauf die DNS-Sequenzanalyse nach dem Verfahren von Maxam und Gilbert, loc.cit. erfolgte. Unterfragmente der KCS-DNS wurden hergestellt durch Inkubation mit Hpall-Restriktionsendonuclease und die 5'-Enden wurden unter Verwendung von if P-ATP und Polynucleotid-Kinase markiert. Nach der Sequenz-.analysenach Maxam und Gilbert wurde die Nucleotidsequenz der klonierten HCS-DMS bestimmt. Durch Vergleich mit der bekannten Aminosäuresequenz der HCS ergab sich, dass die Sequenz aus 557 Nucleotiden den Teil der codierenden Region der HCS-mRNS von den Aminosäuren 24 bis I9I plus 50 Nucleotiden der j^'-unübersetzten Begion darstellte, vergleiche Niall, H.D«, Hogan, M.L., Sauer, R*, Rosenblum, I.Y. und Greenwood, P.C. Proc.Nat.Aead.Sci.USA. 68, 866 (1971). Die Primärstruktur der HCS-mRNSV bestimmt aus der DNS-Sequenz des klonierten Fragments pHCS-1 zeigt Tabelle 3* zusammen mit der daraus,entsprechend dem genetischen Code, resultierenden Aminosäuresequenz. Die sich aus der Nucleotidsequenz ergebende Aminosäuresequenz ist identisch mit der kürzlich veröffentlichten, auf chemischem

ц>

Weg ermittelten Aminosäuresequenz. Dies zeigt, dass die anfangs isolierte HCS-mRNS in vitro mit grosser Genauigkeit kopiert vnirde, und dass das klonierte KCS-DNS-Fragment im transformierten Bakterium mit grosser Genauigkeit repliziert wurde.

Tabelle 3

Nucleotidsequenz eines Stranges von HCS-DNS aus kloniertem pHCS-1.

Die Zahlen beziehen sich auf die Aminosäuresequenz, beginnend am Aminoende. Die gezeigte DNS-Sequenz entspricht der mRNS-Sequenz für HCS, abgesehen davon, dass in der mRIJS T durch U ersetzt ist. Ferner wird die Aminosäuresequenz von Stellung bis 2J) gezeigt.

Tabelle

3 OJ »4

гЧ СЭ

0} •Η К

to

(O -H

«a

.4 O

U CJ

»4

β)

•Η

O) O O

tu

Э CJ

.4

to

Ui I

CJ

»4

•-Ч

»4

C »4 O

»4

«3

C O

•Η <

ο υ

и о ο υ

СО £-1

со

W < < О

to S-« •и <

О

GJ E-I

HJ О

CJ О

и о α о

со H

W СЭ

S3

с о

О H < ST О CJ

со < сэ

(0 СЭ

Рч О

CJ О •Η Η

м <:

U H

H О

3

С5 О

GIu	GAA
Phe	TTX
GIu	GAG
Gin	OVO
Туг	OVX
Thr	ACC
Asp	CAC

CJ £ч

rt о

«гни

CNl < CJ

I I

try

3 О

о е-« »4 о

3 О CJ с-· •4 О

3 О

гч <j

о о

з <:

CJ H ь4 О

С H И <й <^

и о о о

со H

со <;

al

О О

с <

t4 <

о о

»-I СЭ

J= υ H <

3 <. гЧ <j

о о

3 О Ή <

о о

AJ О

CJ н ß о

W <

и о

CJ О

со н о о

J-I О P* О

и <

ΟΛΟ ѵо н <

о о

»4 О P* О

CJ H гЧ H W <

H H CJ О

со н

со < о

CJ О СО H

CJ О

J= H Рч H

W О

>» о

О H

	о
υ	о
со	H
Vi	о
г-	о
H	<

	с о	3 О	J-· E-I
H £-і	< СЗ	CJ H і-З О	CJ О со н
гЧ О сЗ H	3 ·< •ч «5	3 О	to о
> S	о о	CJ H •4 О	•м о < о
3 О OJ H	3 О CJ с-і	rj <:	и о
•4 О	к4 О	гЧ О < о	>чО О H
осо о W <ί •ч < <2	to о P О < <	с о 01 < < о	с: о .4 < О О
Ö О	>%о сЧ О о о	со H н < W О	оно со Π H t-i >· о
сЗ О гЧ О	и о CJ Е-4	J= О	U О
< о	«S <;	СО <! < <	CJ H S <
CJ О J= Е-·	3 О CJ Е-·		töo
P* Е-·	►4 υ	W О	M О < о
4J О £S	M О J= О H <	I^ О CJ О СО H	3 О CJ H *4 О
J-I H α о со <	с < гЧ < о о	с о < <	CJ О J= H P4 н
to о J-· о	CJ О іЧ £-<	м <:	к <ί
< <	M <	J= О H <	J= О H <
3 О CJ Е-· •4 О	о >^ о CJ H U •ч О О	со и < < о	3 О гЧ < о о
CJ О J= H	лз	О H	-t о
Pi H	о о	Л Е-« Р< H	ta н > о

to о и о <: о

гЧ О CS^-E-. > О

о о J-I О P* О

3 Оt4 <

о δ

3 О CJ H »4 О

со и о H H

J-I О CJ О СО H3 ОгЧ < о о

CJ О Η Η M <3 О CJ H ►4 О

3 СЭ CJ Η ►4 О

3 О О о Е-і

со ^ υ

5-t Oα Cj со H

о о *ч н W <

too U СЭ < о

3 О

гч <

о о

CJ н к-} О

с о W <; < о

W СЭ

3 <

CJ Е-< і-З О

3 О CJ E-I t-J О

W О

Zi <

ts о

К E-" H Е-«

со и <:

< о

W <:

< о

P О CJ О

со <

со и <

< о

^ о о о со н

CJ

•с о

со

W <

< о

« о

я о

CJ О

со <

H О

P О

Xt О H <

с о

гЧ <

о о

OWO

3 ЯІ	о
»4	о
Cl гЧ H	АТС
β	о
о	<ί о
гЧ о	000
Thr	ACT
Arg	CCG
Arg	CGC
Ser	AGC
;ч •ч о	GCC

W

с о и <

<

W СЭ

co

μ <:

<

и о

S3

too

}-i О

CJ О

οι	о f 1
о	> Vj E-i
J-I	О
H	H
Leu	cue
Leu	oxo
GIy	о о о

О <

и о >

о о о о

о о о Е-і о о о о < о

о о о о

о	ρ
Pi	с-ч Еч
>> гЧ О	ODD
СО Iy,
О	H
Scr	ACC
.4 О	GGC
3 .,J	о
о	о

> о

Beispiel 5

Dieses Beispiel beschreibt die Reinigimg von DNS, deren Nucleotidsequenz den Hauptanteil der codierenden Region für HGH umfasst, und die Synthese eines plasmidischen Transfer-Vektors, der die gereinigte DNS enthält. Ferner wird die Herstellung eines Mikroorganismenstammes beschrieben, der die DNS als Teil seiner genetischen Ausstattung enthält. Das HGH war im wesentlichen nach der Vorschrift von Beispiel J> für HCS gereinigt worden, abgesehen von den nachstehenden Änderungen.

5 benigne Hypohysentumoren vom Menschen, die nach chirurgischer Entfernung in flüssigem Stickstoff eingefroren worden waren und von denen jeder 0,4 bis 1,5 g wog, wurden in 4-molarer Guanidiniumthiocyanatlösung, die an Merkaptoethanol 1-molar und auf pH 5*0 gepuffert worden war, bei k ⁰C aufgetaut und homogenisiert. Das Homogenisat wurde über 1,2 ml 5,7-molare Cäsiumchloridlösung, die 100 Millimol Ethylendiamintetraessigsäure enthielt, aufgeschichtet und 18 Std. bei yj Umdrehungen/Minute im Rotor SV/ 50,1 einer Beсkman-Ultrazentrifuge bei 15 ⁰C zentrifugiert. Dabei gelangte die RNS auf den Boden des Zentrifugenröhrchens. Die weitere Reinigung.in einer Säule mit Oligo-dT und Sucrose-Gradientensedimentation erfolgte wie in den Beispiel 1 und 3> beschrieben.« Eewa 10 % der so isolierten RNS codierten Wachstumshormon, wie abzuschätzen war aus der Einverleibung eines radioaktiven Aminosäure-Vorläufers im Niederschlagsmaterial aus Antiwachstumshormon in einem zellfreien Translationssystem aus Weizenkeimen; vergleiche Roberts, B.E. und Patterson, B.M., Proc. Nat. Acad. Sei. USA 70, 2J^O (1975). Einsträngige und doppelsträngige cDNS wurden, wie in Beispiel 3 beschrieben, hergestellt. Die HGH-cDNS wurde dann mit der Restriktions-Endonuclease Haelll und alkalischer Phosphatase, wie in Beispiel J5 beschrieben, behandelt, dann erfolgte Fraktionierung

durch Gelelektrophorese. Es wurde eine diskrete Eande in etwa 550 Nucleotiden Länge entsprechender Stellung beobachtet und zur weiteren Reinigung isoliert.

Zur weiteren Reinigung wurde die vorstehend beschriebene Technik der Aufteilung der DNS in Unterfragmente, gesonderten Reinigung dieser Unterfragmente und deren Rekombination durchgeführt, wobei jedoch im Fall von HGH die Restriktions-EndonucleasePvuII verwendet wurde, die zwei Unterfragmente von etwa 4-90 bzw. etwa 60 Nucleotiden Länge ergab. Alle verwendeten Restriktionsenzyme sind Handelsprodukte der New England Biolabs, Beverly, Massachusetts. Das neu verknüpfte Produkte von etwa 550 Basenpaaten Länge war von mehr als 99 #iger Reinheit, wie durch Unterfraktionierung in 4 verschiedenen Restriktions-Endonucleasesystemen ersichtlich.

Die Synthese eines rekombinanten Transfer-Vektors,der HGH-DKS enthält, erfolgte im wesentlichen nach der Vorschrift von Beispiel 4, wobei sich jedoch das Decanucleotid-Bindeglied und Plasmid unterschieden. Es wurde ein Decanucleotid-Bindeglied mit Hind III-Spezifität verwendet, des die Sequenz 5'-CCAAGCTTGG-jJ' beaass. Die Behandlung mit Hsul ergab HGH-cDNS mit kohäsiven Enden. Hsul und Hind III besitzen die gleiche Spaltstellen-SpezifItät und können im Austausch verwendet werden. Als Transfer-Vektor wurde das Plasmid pBR-^22 verwendet. Es verleiht dem Wirt Resistenz gegen die Antibiotika Ampicillin und Tetracyclin. Durch DNS-Inserierung in die Hind IIIrwfra^edie ^JTetracyclinresistenz vermindert oder beseitigt. Die auswahl der Neu-.kombinationen erfolgte daher durch Wachstum auf Ampicillin enthaltenden Nährplatten und aufgrund der Unfähigkeit zum Wachstum auf 20 pig/ml Tetracyclin. Die HGH-cDNS wurde rekombiniert mit durch Hsul gespaltenem und mit alkalischer

si

Fhosphatase behandeltem pBE-j522, wobei im wesentlichen die Bedingungen von Beispiel 4 angewandt wurden.

Die Produkte der Ligase-Reaktion wurden zur Transformation von E.coli X-I776 unter den Bedingungen von Beispiel 4 eingesetzt. Sieben Kolonien wurden isoliert aufgrund ihrer Fähigkeit zum V/achstum in Gegenwart von Ampicillin und ihrer Unfähigkeit zum Wachstum in Gegenwart von Tetracyclin. Fünf der sieben Kolonien enthielten das rekombinante Plasmid, welches den Teil der HGH-DNS mit etwa 550 Basenpaaren aufwies. Einer der Bakterienstämme, pHGH-1, der die HGH-DNS als Teil seiner genetischen Ausstattung trug, wurde in ausreichender Menge gezüchtet, so dass er eine Quelle für Plasmid-DNS bildete, aus der die HGH-DNS durch Behandlung mit Hind III oder Hsul reisoliert werden konnte. Diese isolierte HGH-DNS, die zahlreiche Replikationen durchlaufen hatte, wurde der Sequenzanalyse gemäss Beispiel 4 unterworfen, wobei folgendes Ergebnis erzielt wurde:

Tabelle 4t

Nucleotidsequenz eines Strangs von HGH-DNS aus kloniertem pHGH-1. Die Zahlen beziehen sich auf die Aminosäuresequenz von HGH, beginnend am Amino-Ende. Die gezeigte DNS-Sequenz stimmt überein mit der mRNS-Sequenz für HGH, abgesehen davon, dass in der mRNS T durch U ersetzt ist.

Tabelle Ч

с о -и -<	3 О CJ H ►4 О	Vl H	! 0Y1	с о < о	3 О CJ H ►J О	Vi H CJ О со H	t~i CJ	«о
о о о о и υ	3 О α я >J О	VaI	GTG	3 3 о о	э <: о н t-5 O	too Vi О < CJ	cn χ •ч p<
I Рч О	3"	GJ	о	3 О ΓΙ Г і	« <;	01 О	GIy	I
с о	о о		о	СУ f* ►4 О	< о-	SO О Η	гл S о	I
< 5	3 «ί	о с	о	too	СО	C О <Ч <5 о о	Ser	GGCC
с о іЧ <	о н ►-3 О	о ω .-I <		Vi О < <	ю < < о	оно г-ч > о	GIy	о
; о о j 3 О i CJ с-·	CJ О ОТ -ST < <	Asn	OVV	іЧ О О О	И Ь* •н < Я О	Л] Г)	GIu	о Е-ч
} і-Э О	M О	«а	о	.и О	й о	mmtJ Ψ ш	VaI	,0X00
I	CJ О	іЧ	о	CJ £-1	от <:	M <		AGTGi
J CJ о і X H	СО £-1	<	о	S <	< <2	too Vi О < о		о о
j Рч H I Vi <5 ; со о о	ω <з 5*5	Phe	TTC	3 О α н ►4 О	ю о •и < я о	3 О CJ ЕЧ »J О		о υ
'-а- ѵз н « is ·<	о о	VaI	0X0	Vi О X О H <	ѵі <: CJ О со H	CJ О		Еч о
HH	с: < f-Ч ·<	Vl CJ	H о	сі <; гЧ <«	с о	X H Рч H		о о
W О S <	о о	со	<	о о	< 5	Vi <: X О H <		TGAC
.J < с о 33	ν· <:	te $	ACG	α о гЧ H и <	Vi < X О H <	3 О •ч < о о		CCTG
о о	о о	Leu	0X0	О Su N rl Ü •ч О О	со и < < о	«ч о	CATC
и о s<	3 СЭ •Ч «£	α	ρ	о о	CJ О	га Е-· > о	о о
^4<	о о		C-I	3 О гЧ <й ·	ев	W О	15
о < и о	tao W О	η *~\	о <:	о о	со о	S <! 1-3 <	о о о <J
Рч О OJ О •Ч H	< <	O	о	3 <С CJ H ►4 О	·-< <	со со <; <о	о о о
W < Vi H S <ί	от < <: <	VaI	OXO	СО 03 <	Vi О CJ О со <	U О он Л. ·<	о
H H «а о <·πυ	Vi О CJ О со H	Pro	000	M О ►J ^	Vl О >>< E-" H	со и < < о
СО < О	о о Vi О Рч О	3 гЧ О	GAG	3 <	Vi О X О in <	И О'
з <; Ή ·<	Vi < oxo	3 CJ	о £-4	»J О	CS О гЧ < о о	S3	H Е-«
О О 3 <. тЧ -3		_1	О	з о ω η нЗ О	OWO -* hJ <	too Vi О < <	CGC
о о OJ H X f-l	о о Vl О РЧ О	Тгр	TGG	с о и <: < о	CJ О X Е-· Рч H	CJ О ев	TGT
Рч H	GJ H .4 H 14 <	Ser	TCG	Vi H	О О г—( C-J	W О	AGC
з о іч <:	Vi H CJ О	й гЧ	о	*· -~* H H	м <;	S О О H	CGC
о о	со-н	О	о	гЧ О	с о	Vi О	GAG
с о тЧ <	5°.	CJ	о	fd H > о	•ч < о о	s-=c ЕЧ H	0X0
о о Vi О S<	гч <; о о	гЧ H	S2	с о и <: < <	іЧ О О О	3 О CJ E-I ьЛ О
H H Vi О X О	Vi < о о «со H	Leu	0X0	V» О CJ О со <,	Vi Е-· X О н <;	3 О α s-ч *4 О
H < со ад <	α о Eh1	Leu	0X0	с о < о	to о ν. υ < о	SO .4 О о о
< ti О £-ч **^ ί—4	so H SO O-E-I	о υ СО .-J	oxo	Vi H о о со H	о υ Vi О Рч О	OMO ѵо >><: -ι н £ч
S I-· ГЗ О	3 О CJ H ►4 О	Ser	TCC	с« О гЧ О < о	Vl О о о от <;	C О и <: < ·5
сч < о о	Vi О !У О со H	lic	АТС	>чО гЧ О О О	SO гЧ О о о	W О s< »4 <
Vi О JZ О H <	ьз о и о < о

Die vorliegende Erfindung liefert erstmalig ein allgemein anwendbares Verfahren zum Reinigen spezifischer Nucleotidsequenzen. Diese Sequenzen können in Beziehung gesetzt werden zur Produktion eines speziellen Proteins von technischer oder medizinischer Bedeutung. Das Verfahren fuhrt zu gereinigten Nucleotidsequenzen, die Fragmente grösserer Sequenzen sein können, Vielehe das gewünschte Protein codieren. Das erfindungsgemässe Verfahren kann in Kombination mit bekannten Hilfsverfahren zur Erzeugung der gesamten, ein spezielles Protein codierenden Nucleotidsequenz angewandt werden.

Die Erfindung erlaubt auch die Hochreinigung einer Nucleotidr sequenz spezieller Länge und beliebiger Herkunft. Ferner wird ein Verfahren zum Messen des Reinheitsgrades derartiger Fragmente offenbart. Erfindungsgemäss wurde eine einen Teil von menschlichem HCS codierende Nucleotidsequenz isoliert, deren Reinheit mindestens 99 % betrug.

Es wurden Transfer-Vektoren synthetisiert, die den Hauptanteil der HCS bzw. HGH codierenden Nucleotidsequenz enthielten. Ferner wurden neue Stämme von Mikroorganismen erzeugt, die die genannten Gene und Teile von Genen enthalten. Die Nucleotidsequenzen wurden nach zahlreichen Replikationen ira Wirtsorganismus erneut isoliert und es wurde gefunden, dass ihre Nucleotidsequenz im wesentlichen identisch war mit der im Ausgangsorganismus vorliegenden Sequenz.

Auf der Grundlage des genetischen Codes gibt es eine endliehe Anordnung von Nucleotidsequenzen, die eine vorgegebene Aminosäuresequenz codieren. All diese äquivalenten Nucleotidsequenzen sind brauchbare Varianten der offenbarten

Sequenzen, da sie alle zum gleichen Proteinhormon mit der gleichen Aminosäuresequenz im Verlauf der Transcription und Translation in vivo führen. Folglich sind alle derartigen Varianten vom Rahmen der vorliegenden Erfindung umfasst.

Der hier beschriebene Mikroorganismus E. coli HCS X-1776 wurde bei der ATCC unter der Hinterlegungsnummer 31391 hinterlegt. Dieser Mikroorganismus trägt eine DNS-Sequenz, die den Hauptteil von menschlichem HCS codiert. Die DNS-Sequenz wird von einem Plasmid getragen, das ebenfalls bei der ATCC hinterlegt wurde und die Hinterlegungsnummer 40002 besitzt.

Claims (1)

1. 7.3И979

   AP Δ61Κ/206 482

   Erfindungsanspruch

   Verfahren zur Reinigung einer spezifischen Deoxyribonucleotid-Sequenz zur Heukombination mit einem DlTS-Transfer-Vektor und Transformation in einen Mikroorganismus, ausgehend von einer Population von Polyribonucleotiden heterogener Länge und Sequenz, gekennzeichnet dadurch, daß man

   (a) eine Population von cDNS-Transcripten von Polyribonucleotiden erzeugt, wobei mindestens ein Teil dieser cDNS-Transcripte mindestens zwei Restriktionsstellen besitzt,

   (b) die cDNS-Transcripte der Einwirkung eines Restriktions-Endonuclease-Präparats unterwirft, das zur Katalyse der Hydrolyse der cDNS-Transcripte an jeder der beiden Restriktionsstellen befähigt ist unter Bildung eines Fragments mit spezifischer Deoxyribonucleotid-Sequenz und homogener Länge und

   (c) die durch Einwirkung der Restriktions-Sndonuclease erzeugten Fragmente aufgrund der Länge fraktioniert, wobei die Fragmente mit der spezifischen Deoxyribonucleotid-Sequenz homogener Länge von cDNS-Transcripten anderer Länge abgesondert werden.

   Hierzu чЗ Seite