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Die Erfindung betrifft die Isolierung einer spezifischen Nucleotidsequenz, die den genetischen Code für ein spezifisches Protein enthält, die Synthese von DNS mit dieser spezifischen Nucleotidsequenz und den Transfer dieser DNS in einen Mikroorganismus als Wirt, in dem die Replikation der DNS erfolgt. Insbesondere betrifft die Erfindung die Isolierung von Wachstumshormon-Genen, deren Reinigung, Transfer und Replikation in einem mikrobiellen Wirt und ihre anschliessende Charakterisierung. Durch die Erfindung werden neue Produkte hergestellt. Zu diesen gehören ein Plasmid, in welches eine spezifische Nucleotidsequenz, die einem höheren Organismus entstammt, inseriert ist, und ein neuer Mikroorganismus, der als Teil seiner genetischen Ausstattung eine spezifische Nucleotidsequenz aus einem höheren Organismus enthält.
Folgende Symbole und Abkürzungen werden in vorliegender Beschreibung verwendet :
DNS = Desoxyribonukleinsäure
RNS = Ribonukleinsäure cDNS = komplementäre DNS (enzymatisch synthetisiert aus einer mRNS-Sequenz) mRNS = messenger-RNS tRNS = transfer-RNS dATP = Deoxyadenosintriphosphat dGTP = Deoxyguanosintriphosphat dCTP = Deoxycytidintriphosphat 'A = Adenin
T = Thymin
G = Guanin C = Cytosin
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2-Amino-2-hydroxyäthyl-l, 3-propandiolATP = Adenosintriphosphat
TTP = Thymidintriphosphat
Die biologische Bedeutung der Basensequenz der DNS ist die eines Speichers der genetischen Information.
Es ist bekannt, dass die Basensequenz der DNS als Code verwendet wird, der die Aminosäuresequenz sämtlicher von der Zelle erzeugter Proteine bestimmt. Ausserdem dienen Teile der Sequenz regulatorischen Zwecken, zur Steuerung von Herstellungszeitpunkt und Menge jedes Proteins. Die Arbeitsweise dieser steuernden Elemente ist erst zum Teil erkannt. Schliesslich dient die Basensequenz in jedem Strang als Matrize bei der Replikation der DNS, die die Zellteilung begleitet.
Die Art und Weise, in welcher die Information der Basensequenz der DNS auf die Aminosäuresequenz von Proteinen übertragen wird, ist ein fundamentaler Vorgang, der universell für alle lebenden Organismen ist.
Es konnte bewiesen werden, dass jede üblicherweise in Proteinen vorhandene Aminosäure durch die Sequenz eines oder mehrerer Trinucleotide oder Tripletts bestimmt wird. Jedem Protein entspricht somit ein Segment der DNS mit einer Triplett-Sequenz, die der Aminosäuresequenz des Proteins entspricht.
Den genetischen Code veranschaulicht folgende Tabelle :
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Genetischer Code
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<tb>
<tb> Phenylalanin <SEP> (Phe) <SEP> TTK <SEP> Histidin <SEP> (His) <SEP> CAK
<tb> Leucin <SEP> (Leu) <SEP> XTY <SEP> Glutamin <SEP> (Gln) <SEP> CAJ
<tb> Isoleucin <SEP> (Ile) <SEP> ATM <SEP> Asparagin <SEP> (Asn) <SEP> AAK
<tb> Methionin <SEP> (Met) <SEP> ATG <SEP> Lysin <SEP> (Lys) <SEP> AAJ
<tb> Valin <SEP> (Val) <SEP> GTL <SEP> Asparaginsäure <SEP> (Asp) <SEP> GAK
<tb> Serin <SEP> (Ser) <SEP> ORS <SEP> Glutaminsäure <SEP> (Glu) <SEP> CAJ
<tb> Prolin <SEP> (Pro) <SEP> CCL <SEP> Cystein <SEP> (Cys) <SEP> TGK
<tb> Threonin <SEP> (Thr) <SEP> ACL <SEP> Tryptophan <SEP> (Try) <SEP> TGG
<tb> Alanin <SEP> (Ala) <SEP> GCL <SEP> Arginin <SEP> (Arg) <SEP> WGZ
<tb> Tyrosin <SEP> (Tyr) <SEP> TAK <SEP> Glycin <SEP> (Gly)
<SEP> GGL
<tb> Terminationssignal <SEP> TAJ
<tb> Terminationssignal <SEP> TGA
<tb>
Schlüssel :
Jedes Triplett aus drei Buchstaben stellt ein Trinucleotid der DNS dar, mit einem 5'-Ende links und einem 3'-Ende rechts. Die Buchstaben stehen für die Purin - oder Pyrimidinbasen, die die Nucleotidsequenz bilden :
A = Adenin
G = Guanin
C = Cytosin
T = Thymin X = T oder C, falls Y = A oder G X = C, falls Y = C oder T Y = A, G, C oder T, falls X = C Y = A oder G. falls X = T W = C oder A, falls Z = A oder G W = C, falls Z = C oder T
Z = A, G, C oder T, falls W = C
Z = A oder G, falls W = A
QR = TC, falls S = A, G, C oder T
QR = AG, falls S = T oder C S = A, G, C oder T, falls QR = TC S = T oder C, falls QR = AG J = A oder G
K = T oder C
L = A, T, C oder G M = A,
C oder T
Im biologischen Vorgang der Übersetzung der Nucleotidsequenz in eine Aminosäuresequenz erfolgt als erste Stufe die sogenante Transcription. In dieser Stufe wird ein Segment der DNS mit der für das herzustellende Protein zuständigen Sequenz auf eine RNS übertragen. Die RNS ist ein der DNS ähnliches Polynucleotid, in dem jedoch Ribose an Stelle der Desoxyribose und Uracil an Stelle von Thymin stehen. Die Basen der RNS sind zur gleichen Art von Basenpaarung befähigt wie die Basen der DNS. Die durch Transcription einer DNS-Nucleotidsequenz entstehende RNS ist daher zu dieser kopierten Sequenz komplementär.
Diese RNS wird als messenger-RNS (mRNS) bezeichnet wegen ihrer Zwischenstellung zwischen dem genetischen Apparat und dem
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Enzyme und Organellen innerhalb der Zelle beteiligt sind und der zur Synthese spezifischer
Aminosäuresequenzen führt. Dieser Vorgang wird als Translation bezeichnet.
Häufig gibt es weitere Stufen, die dazu dienen, aus der bei der Translation entstandenen
Aminosäuresequenz ein funktionales Protein zu erzeugen. Ein Beispiel ist die Herstellung des
Insulins.
Zahlreiche Proteine von Bedeutung für Medizin oder Forschung werden in den Zellen höherer
Organismen wie der Wirbeltiere gefunden oder hergestellt. Hiezu gehören z. B. das Hormon Insulin, andere Peptidhormone wie das Wachstumshormon, an der Regulierung des Blutdrucks beteiligte
Proteine und zahlreiche Enzyme mit Bedeutung für technische, medizinische oder Forschungszwecke.
Häufig ist es schwierig, diese Proteine in brauchbaren Mengen durch Extraktion aus dem Organis- mus zu gewinnen, insbesondere bei Proteinen menschlichen Ursprungs. Es besteht daher ein
Bedarf an Techniken, durch die derartige Proteine von Zellen ausserhalb des Organismus in vernünftigen Mengen erzeugt werden. In manchen Fällen ist es möglich, geeignete Zellstämme durch die Techniken der Gewebekultur zu erhalten. Das Wachstum von Zellen in Gewebekulturen ist jedoch langsam, das Medium ist teuer, die Bedingungen müssen genau kontrolliert werden und die Ausbeuten sind niedrig. Häufig ist es auch schwierig, einen gezüchteten Zellstamm mit den gewünschten differenzierten Eigenschaften zu erhalten.
'Im Gegensatz dazu können Mikroorganismen wie Bakterien relativ leicht in chemisch definier- ten Medien gezüchtet werden. Die Fermentationstechnologie ist bereits hochentwickelt und gut steuerbar. Das Wachstum der Organismen erfolgt rasch, und hohe Ausbeuten sind möglich. Ausserdem wurden bestimmte Mikroorganismen bereits genetisch genau charakterisiert und gehören in der
Tat zu den am besten charakterisierten und erkannten Organismen.
Es wäre daher sehr erwünscht, den Transfer eines Gen-Codes für ein Protein medizinischer Bedeutung aus einem Organismus, der normalerweise das Protein produziert, in einen geeigneten Mikroorganismus zu erzielen. Auf diese Weise könnte das Protein unter gesteuerten Wachstumsbedingungen vom Mikroorganismus hergestellt und in gewünschten Mengen erhalten werden. Es ist auch möglich, dass die Gesamtkosten der Herstellung des gewünschten Proteins durch ein derartiges Verfahren erheblich vermindert werden könnten. Die Fähigkeit zur Isolierung und zum Transfer der Gensequenz, die die Produktion eines speziellen Proteins bestimmt, in einen Mikroorganismus genau bekannter genetischer Struktur eröffnet ausserdem der Forschung die wertvolle Möglichkeit, zu untersuchen, wie die Synthese eines solchen Proteins gesteuert wird und wie das Protein nach der Synthese verarbeitet wird.
Ferner können isolierte Gene verändert werden, so dass sie Proteinvarianten mit andern therapeutischen oder funktionellen Eigenschaften codieren.
Die Erfindung betrifft Massnahmen, um die genannten Ziele zu erreichen. Ein Verfahren wird offenbart, das mehrere Stufen, einschliesslich Enzym-katalysierter Reaktionen, umfasst. Nachstehend werden die bisherigen Kenntnisse über die Natur dieser Enzymreaktionen skizziert.
Reverse Transcriptase katalysiert die Synthese der einer RNS-Matrize komplementären DNS in Gegenwart der RNS-Matrize, eines Oligo-deoxynucleotid-Primers und der vier Deoxynucleosid- - triphosphate dATP, dGTP, dCTP und TTP. Die Reaktion wird eingeleitet durch die nichtcovalente Bindung des Oligodeoxynucleotid-Primers an das 3'-Ende der mRNS, darauf folgt die stufenweise Addition der geeigneten Deoxynucleotide, entsprechend der Basenpaarungsregel, an das 3'-Ende der wachsenden Kette. Das als Produkt erhaltene Molekül kann als haarnadelförmig beschrieben werden, es enthält die Ausgangs-RNS und einen komplementären DNS-Einzelstrang.
Die reverse Transcriptase kann ferner eine ähnliche Reaktion katalysieren, bei der ein DNS-Einzelstrang als Matrize dient, in welchem Fall man als Produkt einen haarnadelförmigen DNS-Doppelstrang erhält mit einer Schleife DNS-Einzelstrang, durch die ein Paar Enden verbunden werden ; vgl.
Aviv, H., und Leder, P., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69,1408 (1972), und Efstratiadis, A., Kafatos, F. C., Maxam, A. F., und Maniais, T., Cell. J, 279 (1976).
Restriktions-Endonucleasen sind Enzyme, die zur Hydrolyse von Phosphodiesterbindungen in doppelsträngiger DNS befähigt sind, wobei die Sequenz des DNS-Stranges gespalten wird.
Liegt die DNS in Form einer geschlossenen Schleife vor, so wird diese in lineare Form überführt.
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Das Hauptmerkmal eines Enzyms dieser Art besteht darin, dass die hydrolytische Wirkung nur dort eintritt, wo eine spezifische Nucleotidsequenz vorliegt. Diese Sequenz wird als Erkennungsstelle (Spaltstelle) der Restriktions-Endonuclease bezeichnet. Restriktions-Endonucleasen wurden aus verschiedenen Quellen isoliert, und ihre Nucleotidsequenz und die Erkennungsstellen wurden ermittelt. Einige Restriktions-Endonucleasen hydrolysieren die Phosphodiesterbindungen in beiden Strängen an der gleichen Stelle, so dass stumpfe Enden entstehen. Andere katalysieren die Hydrolyse von Bindungen, die um einige Nucleotide voneinander entfernt sind, wodurch einsträngige Bereiche an jedem Ende des gespaltenen Moleküls entstehen.
Diese einsträngigen Enden sind selbst-komplementär, daher kohäsiv, und sie können verwendet werden, um die hydrolysierte DNS erneut zu binden. Da jede für eine Spaltung durch ein derartiges Enzym anfällige DNS die gleiche Erkennungsstelle enthalten muss, werden die gleichen kohäsiven Enden produziert, so dass es möglich wird, heterologe DNS-Sequenzen mit andern, ähnlich erhaltenen Sequenzen zu verknüpfen ; vgl. Roberts, R. J., Crit. Rev. Biochem. , 123 (1976). Die Erkennungsstellen sind relativ rar, jedoch wurde die allgemeine Verwendbarkeit der Restriktions-Endonucleasen stark erweitert durch die chemische Synthese doppelsträngiger Oligo-nucleotide mit den Sequenzen der Erkennungsstellen.
Somit kann praktisch jedes DNS-Segment an ein anderes Segment gekoppelt werden, indem man einfach das entsprechende Restriktions-oligo-nuc1eotid an die Molekülenden anhängt und das Produkt der hydrolytischen Wirkung der entsprechenden Restriktions-Endonuclease unterwirft, wobei man die erforderlichen kohäsiven Enden erhält ; vgl. Heynecker, H. L., Shine, J., Goodman, H. M., Boyer, H. W., Rosenberg, J., Dickerson, R. E., Narang, S. A., Itakura,
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D.,Sl-Endonuclease ist ein Enzym, das zur Hydrolyse der Phosphodiesterbindungen einsträngiger DNS oder einsträngiger Zwischenstücke in sonst doppelsträngiger DNS befähigt ist ; vgl. Vogt, V. M., Eur. J. Biochem. 33,192 (1973).
DNS-Ligase ist ein Enzym, das die Bildung einer Phosphodiesterbindung zwischen zwei DNS-Segmenten mit einem 5'-Phosphat bzw. einem 3'-Hydroxyl bewirkt, die z. B. von zwei DNS-Fragmenten gebildet werden, die durch kohäsive Enden zusammengehalten werden. Die normale Funktion des Enzyms besteht vermutlich darin, einsträngige Zwischenstücke in einem sonst doppelsträngigen DNS-Molekül zu verbinden. Unter geeigneten Bedingungen kann jedoch DNS-Ligase die Verbindung stumpfer Enden katalysieren, wo zwei Moleküle mit stumpfen Enden covalent gebunden sind ; vgl. Sgaramella, V., Van de Sande, J. H., und Khorana, H. G., Proc. Natl. Acad. Sci., USA j , 1468 (1970).
Alkalische Phosphatase ist ein Enzym, das Phosphatesterbindungen, einschliesslich der 5'-terminalen Phosphatgruppen in DNS hydrolysiert.
Eine weitere Stufe im zu beschreibenden Gesamtverfahren ist die Insertion eines spezifischen DNS-Fragments in einem DNS-Vektor, z. B. ein Plasmid. Als Plasmid bezeichnet man jede autonom DNS-replizierende Einheit, die in einer Mikrobenzelle neben dem Genom der Wirtszelle vorliegen kann. Ein Plasmid ist mit den Chromosomen der Wirtszelle nicht genetisch verbunden. Plasmid-Deoxyribonucleinsäuren sind doppelsträngige Ringmoleküle, im allgemeinen mit Molekulargewichten von der Grössenordnung einiger Millionen, obgleich bei einigen das Molekulargewicht grösser als 108 ist. Sie stellen gewöhnlich nur einen kleinen prozentualen Anteil der gesamten DNS der Zelle dar. Die Plasmid-DNS lässt sich im allgemeinen von der DNS der Wirtszelle auf Grund des grossen Grössenunterschiedes abtrennen.
Die Plasmide können unabhängig von der Geschwindigkeit der Teilung der Wirtszelle replizieren, und in einigen Fällen kann ihre Replikationsgeschwindigkeit durch Veränderung der Wachstumsbedingungen vom Experimentator beeinflusst werden.
Obgleich das Plasmid als geschlossener Ring vorliegt, kann man auf künstlichem Weg eine DNS-Segment in das Plasmid einführen, wobei ein rekombiniertes Plasmid mit vergrösserter Molekülgrösse entsteht, ohne dass seine Fähigkeit zur Replikation oder Expression beliebiger Gene des Plasmids wesentlich beeinträchtigt würde. Das Plasmid dient daher als nützlicher Vektor zur Übertragung eines DNS-Segments in eine neue Wirtszelle. Zur Neukombination von DNS geeignete Plasmide enthalten typischerweise Gene, die aus Selektionsgründen brauchbar sein können, z. B. Gene der Arzneimittelresistenz.
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Zur Illustrierung der Ausführung der Erfindung werden die Isolierung und der Transfer von Wachstumshormon-Gen im einzelnen beschrieben. Das Wachstumshormon wurde in diesem Fall gewählt wegen seiner zentralen Bedeutung aus der Sicht der klinischen Medizin und aus der
Sicht der Grundlagenforschung. Das offenbarte Verfahren kann vom Durchschnittsfachmann ohne weiteres auf die Isolierung von Wachstumshormon-Gen aus andern Organismen, einschliesslich
Menschen, übertragen werden.
Die Möglichkeit, menschliches Wachstumshormon in den Bedarf deckenden Mengen zu erzeugen, wäre daher äusserst erwünscht. Die Herstellung von menschlichem Wachstumshormon in Bakterien stellt eine Technik dar, mit der dieses angestrebte Ziel erreicht werden könnte. Ein Fortschritt in dieser Richtung wurde jedoch bisher dadurch vereitelt, dass keine Technik zur Einführung des Wachstumshormon-Gens in Bakterien vorlag. Die Erfindung stellt eine derartige Technik bereit.
Die Möglichkeit zur Herstellung einer DNS mit einer spezifischen Sequenz, die den genetischen
Code für ein spezifisches Protein abgibt, erlaubt die Modifizierung der Nucleotidsequenz durch chemische oder biologische Mittel derart, dass auch das schliesslich erzeugte Protein modifiziert wird. Auf diese Weise könnte man z. B. ein modifiziertes Wachstumshormon herstellen, das auf spezielle medizinische Bedürfnisse ausgerichtet ist. Die genetische Fähigkeit zur Herstellung einer wachstumshormonähnlichen Aminosäuresequenz mit den wesentlichen funktionellen Eigenschaften des Wachstumshormon kann daher auf einen Mikroorganismus übertragen werden.
Die Befähigung zum Transfer des genetischen Codes für ein bestimmtes Protein, das im normalen Stoffwechsel eines höheren Organismus benötigt wird, in einen Mikroorganismus, wie z. B. ein Bakterium, eröffnet neue Möglichkeiten zur Herstellung derartiger Proteine. Damit entsteht auch die Möglichkeit zur Vermehrung oder dem Ersatz solcher Proteine durch Proteine, welche von erfindungsgemäss veränderten Mikroorganismen erzeugt wurden dort, wo die Fähigkeit des höheren Organismus zur normalen Produktion dieser Proteine geschädigt wurde, und es ergibt sich z.
B. die Möglichkeit zum Aufbau von Symbiosen zwischen erfindungsgemässen Mikroorganismen und Menschen mit chronischen oder akuten Mangelkrankheiten, wobei die auf erfindungsgemässe Weise genetisch veränderten Mikroorganismen implantiert oder anderweitig einverleibt werden, um den pathologischen Stoffwechselfehler auszugleichen.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung einer spezifischen, genetischen Information enthaltenden Nucleotidsequenz, die Synthese von DNS mit dieser spezifischen Nucleotidsequenz und den Transfer der DNS in einen Wirts-Mikroorganismus.
Die Erfindung wird dargestellt am Beispiel spezifischer DNS-Sequenzen, die in ein Bakterium transferiert werden, nämlich des Gens für Ratten-Wachstumshormon und des Gens für menschliches Wachstumshormon. Danach kann davon ausgegangen werden, dass die Methode auf den Transfer jeder beliebigen DNS-Sequenz eines höheren Organismus wie z. B. eines Wirbeltieres auf jeden beliebigen Mikroorganismus gut anwendbar ist. Ein höherer Organismus wird hier definiert als jeder beliebige eucaryontische Organismus mit differenzierten Geweben, einschliesslich z. B. der Insekten, Mollusken, Pflanzen, Wirbeltiere, einschliesslich Säugetiere, wobei zu letzteren Rinder, Schweine, Primaten und Menschen gehören.
Unter einem Mikroorganismus versteht man jeden mikroskopischen lebenden Organismus, der unter die Bezeichnung Protist fällt, wobei er procaryontisch oder eucaryontisch sein und z. B. aus einem Bakterium, Protozon, Algen und Pilzen, einschliesslich Hefen, bestehen kann. Im vorliegenden Verfahren wird eine ausgewählte Zellpopulation zunächst nach einer neuen Methode isoliert. Aus den Zellen wird intakte mRNS nach einem Verfahren extrahiert, bei dem praktisch sämtliche RNase-Aktivität unterdrückt wird. Die intakte messenger-RNS aus dem Extrakt wird durch Säulenchromatographie gereinigt und dann der Einwirkung von reverser Transcriptase unterworfen, wobei diese Einwirkung in Gegenwart der zur Synthese eines komplementären (eDNS)-Stranges erforderlichen vier Deoxynucleosid-triphosphate erfolgt.
Das Produkt dieser ersten Reaktion mit reverser Transcriptase wird in einem Verfahren weiterbehandelt, das die Ribonucleotidsequenz selektiv entfernt. Die zurückbleibende Deoxynucleotidsequenz, die zur Ausgangs-mRNS komplementär ist, wird in einer zweiten Reaktion mit reverser Transcriptase oder DNS-Polymerase in Gegenwart der vier Deoxynucleosid-triphosphate inkubiert.
Das resultierende Produkt ist eine doppelte cDNS-Struktur, deren komplementäre Stränge an
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einem Ende durch eine einsträngige Schleife miteinander verbunden sind. Dieses Produkt wird dann mit für den Einzelstrang spezifischer Nuclease behandelt, die die einsträngige Schleife abspaltet. Die resultierende doppelsträngige cDNS wird sodann verlängert, indem man an beiden
Enden eine spezifische DNS addiert, die die Sequenz einer Erkennungs- bzw. Spaltstelle eines
Restriktionsenzyms aufweist. Die Addition wird durch eine DNS-Ligase katalysiert. Die verlängerte cDNS wird dann mit einer Restriktions-Endonuclease behandelt, wobei an den 5'-Enden jedes
Stranges der Doppelhelix selbst-komplementäre einsträngige Enden entstehen.
Eine Plasmid-DNS mit einer Erkennungsstelle für die gleiche Restriktions-Endonuclease wird mit diesem Enzym behandelt, um den Polynucleotidstrang zu spalten und selbst-komplemen- täre einsträngige Nucleotidsequenzen an den 5'-Enden zu erzeugen. Die 5'-terminalen Phosphatgrup- pen an den einsträngigen Enden werden entfernt, um zu verhindern, dass das Plasmid eine zur Transformierung einer Wirtszelle fähige Ringstruktur bildet. Die wie vorstehend beschrieben vorbereitete cDNS und die Plasmid-DNS werden dann in Gegenwart von DNS-Ligase zusammen inkubiert. Unter den beschriebenen Reaktionsbedingungen kann die Bildung eines lebensfähigen, geschlossenen Ringes aus Plasmid-DNS nur erfolgen, falls ein Segment der cDNS eingefügt wird.
Das die cDNS-Sequenz enthaltende Plasmid wird dann in eine geeignete Wirtszelle verbracht.
Zellen, die ein lebensfähiges Plasmid aufgenommen haben, erkennt man am Auftreten von Kolonien mit einem vom Plasmid beigesteuerten Merkmal, wie z. B. Arzneimittel-Resistenz. Reine Bakterienstämme, die das rekombinierte Plasmid mit der eingebauten cDNS-Sequenz enthalten, werden dann gezüchtet, und das neukombinierte Plasmid wird anschliessend reisoliert. Auf diese Weise können grosse Mengen an rekombinierter Plasmid-DNS hergestellt werden, worauf man die spezifische cDNS-Sequenz durch endonucleolytische Spaltung mit dem entsprechenden Restriktionsenzym wieder isolieren kann.
Das erfindungsgemässe Grundverfahren ist auf die Isolierung jeder beliebigen Nucleotidsequenz aus einem höheren Organismus, einschliesslich dem Menschen, und deren Transfer in einem Mikroorganismus als Wirt anwendbar. Das Verfahren erweist sich als nützlich zum Transfer eines genetischen Codes für ein spezifisches Protein von medizinischem oder technischem Wert und zur mikrobiologischen Synthese solcher Proteine. Zur Veranschaulichung der Erfindung wurde die Wachstumshormon codierende Nucleotidsequenz aus Ratten isoliert, in Bakterien transferiert und dort repliziert.
Die Erfindung umfasst ein Verfahren zur Isolierung eines DNS-Moleküls mit spezifischer Nucleotidsequenz und deren Transfer in einen Mikroorganismus, wobei man die ursprüngliche Nucleotidsequenz der DNS nach der Vermehrung im Mikroorganismus wiederfindet.
Die das erfindungsgemässe Verfahren ausmachenden Stufen können in vier allgemeine Kategorien unterteilt werden :
1. Die Isolierung einer gewünschten Zellpopulation aus einem höheren Organismus
Es gibt zwei Quellen für eine genetische Sequenz, die ein spezielles Protein codiert : die DNS des zugrunde liegenden Organismus selbst und eine RNS-Übersetzung der DNS. Nach den heutigen Sicherheitsbestimmungen der National Institutes of Health wird für die U. S. A. vorgeschrieben, dass menschliche Gene jeder Art nur dann in neukombinierte DNS und anschliessend in Bakterien eingebracht werden können, nachdem sie sehr sorgfältig gereinigt wurden, oder wenn man
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der Isolierung der spezifischen RNS, die eine Nucleotidsequenz aufweist, die das gewünschte Protein codiert.
Auf diese Weise geniesst man den weiteren Vorteil, dass die mRNS leichter als aus Zellen extrahierte DNS gereinigt werden kann. Insbesondere kann man auch Vorteil ziehen aus der Tatsache, dass in hochdifferenzierten Organismen wie den Wirbeltieren die Identifizierung einer spezifischen Zellpopulation von spezieller Lokalisierung im Organismus möglich ist, deren Funktion hauptsächlich in der Produktion des betreffenden Proteins besteht. Eine solche Population kann auch während einer vorübergehenden Entwicklungsstufe des Organismus vorliegen. In derartigen Zellpopulationen besitzt ein grosser Anteil der aus den Zellen isolierten mRNS die gewünschte Nucleotidsequenz. Die Wahl der zu isolierenden Zellpopulation und das bei der Isolierung angewen-
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Bei der Inhibierung der RNase während der RNS-Extraktion aus Zellen oder Geweben ist die Wirkung eines chaotropen Salzes direkt von seiner Konzentration abhängig. Die bevorzugte Konzentration ist daher die höchstmögliche Konzentration. Der Erfolg des erfindungsgemässen Verfahrens hinsichtlich der Konservierung intakter mRNS während der Extraktion berruht vermutlich auf der raschen Denaturierung der RNase und dem Ausmass der Denaturierung. Dies erklärt möglicherweise die Überlegenheit des Guanidiniumthiocyanats gegenüber dem Hydrochlorid, trotz der Tatsache, dass das Hydrochlorid als Denaturierungsmittel nur wenig schwächer ist. Die Wirksamkeit eines Denaturierungsmittels wird definiert als die Schwellenkonzentration, die zur vollständigen Denaturierung eines Proteins benötigt wird.
Anderseits hängt die Geschwindigkeit der Denaturierung zahlreicher Proteine ab von der Konzentration des Denaturierungsmittels in
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stärkeres Denaturierungmsittel als Guanidiniumhydrochlorid ein Protein bei gleicher Konzentration um ein Vielfaches schneller denaturieren kann. Die kinetischen Beziehungen zwischen RNase-Denatu- rierung und mRNS-Konservierung während deren Extraktion aus den Zellen war zum Zeitpunkt der Erfindung offenbar noch nicht erkannt. Die obigen Erwägungen führen dahin, dass das bevor- zugte Denaturierungsmittel ein solches wäre, das eine niedrige Schwellenkonzentration in Kombination mit hoher Wasserlöslichkeit besitzt.
Aus diesem Grund wird Guanidiniumthiocyanat gegenüber Lithiumdijodsalylat bevorzugt, obgleich letztere Verbindung ein stärkeres Denaturierungsmittel ist, da die'Löslichkeit des Guanidiniumthiocyanats wesentlich höher ist und man es daher in einer Konzentration anwenden kann, die eine raschere RNase-Inaktivierung erlaubt. Obige Erwägungen erklären auch die Bevorzugung von Guanidiniumthiocyanat vor dem vergleichsweise löslichen Hydrochlorid, da ersteres ein etwas stärkeres Denaturierungsmittel ist.
Die Verwendung eines Disulfidbindungen spaltenden Mittels in Kombination mit einem Denaturierungsmittel verstärkt und erhöht die Wirkung des letzteren, indem auf diese Weise das RNase-Molekül vollständig entfaltet wird. Die Thiolverbindung beschleunigt den Fortgang des Denaturierungsprozesses, indem sie eine schnelle Renaturierung verhindert, die eintreten kann, falls die intramolekularen Disulfidbindungen intakt bleiben.
Ferner wird jede im mRNS-Präparat zurückbleibende und dieses verunreinigende RNase praktisch inaktiv, auch in Abwesenheit von Denaturierungsmittel und Thiol, Disulfidbindungen spaltende Mittel mit Thiolgruppen sind bei jeder Konzentration in gewissem Ausmass wirksam, doch wird im allgemeinen ein grosser Überschuss an Thiolgruppen gegenüber den intramolekularen Disulfidbindungen bevorzugt, damit die Gleichgewichtsreaktion in Richtung der Disulfidspaltung abläuft. Anderseits sind zahlreiche Thiolverbindungen übelriechend und unangenehm bei hohen Konzentrationen zu verarbeiten, so dass für die Praxis eine obere Konzentrationsgrenze entsteht.
Beim ss-Mercaptoäthanol erwiesen sich Konzentrationen im Bereich von 0, 05 bis 1, 0 M als wirksam, und Konzentrationen von 0, 2 M werden bei der Isolierung von nicht abgebauter RNS aus Rattenpankreas als optimal betrachtet.
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abgesondert. Zu diesem Zweck sind mehrere Verfahren bekannt, die sämtlich geeignet sind.
Eine übliche Praxis ist ein Ausfällverfahren mit Äthanol, bei dem die RNS selektiv ausfällt. Bevorzugt wird erfindungsgemäss die Ausfällstufe umgangen und das Homogenisat direkt auf eine 5, 7molare Cäsiumchloridlösung, die sich in einem Zentrifugenröhrchen befindet, aufgeschichtet, worauf Zentrifugierung erfolgt ; vgl. die Beschreibung von Glisin, V., Crkvenjakov, R., und Byus, C., Biochemistry 13,2633 (1974). Diese Methode wird bevorzugt, da sie stetig eine für RNase ungünstige Umgebung aufrechterhält, so dass man die RNS in hoher Ausbeute und frei von DNS und Protein gewinnt.
Die obigen Verfahren führen zur Reinigung der gesamten RNS aus dem Zellhomogenisat.
Nur ein Teil dieser RNS ist jedoch die erwünschte mRNS. Um diese mRNS weiter zu reinigen, benutzt man die Tatsache, dass in den Zellen höherer Organismen mRNS nach der Transcription in der Zelle weiterverarbeitet wird unter Bindung mit Polyadenylsäure. Derartige mRNS mit
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wurde von Efstratiadis, et al., loc. cit., beschrieben.
Gegebenenfalls kann man den Anteil an cDNS-Molekülen mit stumpfen Enden erhöhen durch eine Behandlung mit E. coli-DNS-Polymerase I in Gegenwart der vier Deoxynucleosid-triphosphate. Die Kombination von Exonuclease-und Polymerase-Aktivität des Enzyms führt zur Entfernung sämtlicher hervorstehender 3'-Enden und zum Auffüllen sämtlicher hervorstehender 5'-Enden. Auf diese Weise wird die Teilnahme der Hauptmenge der cDNS-Moleküle an den folgenden Verknüpfungsreaktionen sichergestellt.
Die nächste Verfahrensstufe besteht in der Behandlung der Enden des cDNS-Produktes derart, dass geeignete Sequenzen an jedem Ende stehen, die eine Erkennungsstelle für eine RestriktionsEndonuclease aufweisen. Die Wahl des an die Enden zu addierenden DNS-Fragments bestimmt sich durch Zweckmässigkeitsgründe in der Handhabung. Die an die Enden zu addierende Sequenz wird entsprechend der gewählten Restriktions-Endonuclease ausgewählt, und diese Wahl basiert wieder auf der Wahl des DNS-Vektors, mit dem die cDNS zu rekombinieren ist. Das gewählte Plasmid sollte mindestens eine Stelle besitzen, die auf die Spaltung durch Restriktions-Endonuclease anspricht. Das Plasmid pMB9 besitzt z. B. eine Erkennungsstelle für das Enzym Hind III.
Hind III wird aus Hemophilus influenza isoliert und nach dem Verfahren von Smith, H. O., und
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10,42 (1972), gereinigt. Ein Enzym aus Hemophilus suis, das als Hsu I bezeichnet wird, kataly- siert die Hydrolyse an den gleichen Erkennungsstellen wie Hind III. Diese beiden Enzyme werden daher als funktional austauschbar betrachtet.
Zweckmässig verwendet man ein chemisch synthetisiertes doppelsträngiges Decanucleotid mit der Erkennungssequenz für Hind III zur Bindung an die Enden des cDNS-Doppelstranges.
Das doppelsträngige Decanucleotid besitzt die in der Zeichnung dargestellte Sequenz, vgl.
Heyneker, H. L., et al., und Scheller, R. H., et al., loc. cit. Verschiedene solcher synthetischen
Sequenzen mit Erkennungsstellen stehen heute zur Verfügung, so dass man die Enden der doppelten
DNS so präparieren kann, dass sie auf die Einwirkung einer der zahlreichen Restriktions-Endo- nucleasen ansprechen.
Die Bindung der Erkennungsstellensequenz an die Enden der cDNS kann auf bekanntem
Weg erfolgen. Das Verfahren der Wahl ist eine Reaktion, die als "Verknüpfung stumpfer Enden" bezeichnet und von einer DNS-Ligase katalysiert wird, die nach der Methode von Panet, A., et al., Biochemistry 12,5045 (1973), gereinigt worden war. Die Reaktion der Verknüpfung stumpfer Enden wurde von Sgaramella, V., et al., loc. cit., beschrieben. Das Produkt der Verknüpfung einer cDNS mit stumpfen Enden mit einem grossen molaren Überschuss eines doppelsträngigen Decanucleotids mit einer Hind III-Endonuc1ease-Erkennungsstelle ist eine cDNS mit dieser Hind 111-Er- kennungssequenz an jedem Ende.
Die Behandlung des Reaktionsproduktes mit Hind III-Endonuclease führt zur Spaltung an der Erkennungsstelle und Bildung einsträngiger selbst-komplementärer 5'-Enden, s. Zeichnung.
4. Bildung eines rekombinierten DNS-Transfer-Vektors
Im Prinzip kann eine Vielzahl Viren- und Plasmid-DNS zur Neukombination mit der auf vorstehend beschriebene Weise hergestellten cDNS verwendet werden. Die Grundvoraussetzungen bestehen darin, dass der DNS-Transfer-Vektor zum Eintritt in eine Wirtszelle befähigt sein muss, seine Replikation in der Wirtszelle erfolgt und dass er ausserdem eine genetische Bestimmungsgrösse besitzt, die es ermöglicht, diejenigen Wirtszellen, die den Vektor aufgenommen haben, auszusondern. Aus Gründen der öffentlichen Sicherheit sollte der Auswahlbereich eingeschränkt werden auf solche Transfer-Vektorarten, die für die jeweiligen Versuche geeignet erscheinen, entsprechend den vorstehend erwähnten Richtlinien der National Institutes of Health.
Die Liste genehmigter DNS-Transfer-Vektoren wird ständig erweitert, da neue Vektoren entwickelt und vom entsprechenden Kommittee der National Institutes of Health anerkannt wurden. Erfindungsgemäss ist selbstverständlich die Verwendung jeglicher Viren- und Plasmid-DNS vorgesehen, die die beschriebenen Fähigkeiten besitzen, einschliesslich solcher, deren Genehmigung noch bevorsteht. Geeignete Transfer-Vektoren, deren Verwendung heute genehmigt ist, sind verschiedene Derivate von Bakteriophagen X
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z. B.Fox. Eds. (Academic Press, N. Y., 1976), S. 471-477].
Plasmide aus col El sind relativ klein, sie besitzen Molekulargewichte in der Grössenordnung weniger Millionen und haben die Eigenschaft, dass die Anzahl der Kopien von Plasmid-DNS pro Wirtszelle von 20 bis 40 unter Normalbedingungen auf 1000 oder mehr erhöht werden kann, wenn man die Wirtszelle mit Chloramphenicol behandelt.
Die Fähigkeit zur Erhöhung der Genmenge in der Wirtszelle erlaubt es unter bestimmten Umständen, unter der Kontrolle des Experimentators die Wirtszelle zu veranlassen, dass sie hauptsächlich
Proteine erzeugt, die von den Genen auf dem Plasmid codiert werden. Derartige Derivate von col El sind daher bevorzugt Transfer-Vektoren gemäss der Erfindung. Zu den geeigneten Derivaten von col El gehören die Plasmide pMB9, die das Gen für Tetracyclinresistenz tragen, und pBR313, pBR315, pBR316, pBR317 und pBR322, die ausser dem Tetracyclin-Resistenzgen ein Gen für Ampicillin- resistenz besitzen.
Die Anwesenheit von Arzneimittelresistenz-Genen stellt eine zweckmässige
Möglichkeit zur Auswahl der Zellen dar, die mit Erfolg vom Plasmid befallen wurden, da Kolonien dieser Zellen in Gegenwart der Wirkstoffe wachsen, während Zellen ohne das Plasmid nicht wachsen bzw. keine Kolonien bilden. In den Beispielen dieser Beschreibung wurde stets ein Plasmid aus col El verwendet, das zusätzlich zum Arzneimittelresistenz-Gen eine Hind III-Erkennungs- stelle besass.
Wie beim Plasmid kann auch die Wahl des geeigneten Wirtes aus einem sehr breiten Spektrum erfolgen, wobei der Bereich aus Gründen der öffentlichen Sicherheit jedoch eng begrenzt wurde.
Ein E. coli-Stamm mit der Bezeichnung X-1776 wurde entwickelt und von den National Institutes of Health für Verfahren der beschriebenen Art genehmigt, wobei P2-Einrichtungen vorgeschrieben sind ; vgl. Curtiss, III, R., Ann., Rev. Microbiol. 30,507 (1976). E. coli RR-1 kann verwendet werden, wenn P3-Einrichtungen vorhanden sind. Wie im Fall der Plasmide sieht die Erfindung selbstverständlich die Verwendung von Stämmen jeglicher Wirtszellen vor, die zur Beherbergung des gewählten Vektors dienen können, einschliesslich Protisten und anderer Bakterien, z. B. Hefen.
Rekombinierte Plasmide werden erhalten, indem man mit Restriktions-Endonuclease behandelte Plasmid-DNS mit cDNS vermischt, wobei beide analog behandelte Endgruppen enthalten. Um die Möglichkeit, dass cDNS-Segmente Kombinationen miteinander eingehen, minimal zu halten, wird die Plasmid-DNS in molarem Überschuss über die cDNS eingesetzt. Diese Arbeitsweise hat bisher dazu geführt, dass die Hauptmenge der Plasmide ohne ein inseriertes cDNS-Fragment zirkuliert.
Die anschliessend transformierten Zellen enthalten dann hauptsächlich Plasmid und keine mit cDNS neukombinierten Plasmide. Das Ergebnis ist ein sehr langwieriger und zeitraubender Selektionsvorgang. Gemäss dem Stand der Technik wurde dieses Problem gelöst, indem man versuchte, DNS-Vektoren herzustellen mit einer Erkennungsstelle für die Restriktions-Endonuclease in der Mitte eines geeigneten Markierungsgens derart, dass die Insertion der cDNS das Gen teilt, wodurch Verlust der vom Gen codierten Funktion eintritt.
Vorzugsweise wird eine Methode zur Herabsetzung der Kolonienzahl, die auf neukombinierte Plasmide zu untersuchen sind, angewendet. Hiebei behandelt man Plasmid-DNS, die mit der Restriktions-Endonuclease abgeschnitten wurde, mit alkalischer Phosphatase (handelsübliches Enzym). Durch die Behandlung mit alkalischer Phosphatase werden die 5'-terminalen Phosphatgruppen von den mit der Endonuclease erzeugten Enden des Plasmids entfernt, und die Selbstverknüpfung der Plasmid-DNS wird verhindert. Die Ringbildung und Transformation hängen somit von der Insertion eines DNS-Fragments ab, das 5'-phosphorylierte Enden aufweist. Dieses Verfahren setzt die relative Häufigkeit von Transformationen ohne Neukombination auf weniger als 1 bis
10 herab.
Das erfindungsgemässe Verfahren basiert. auf der Tatsache, dass die durch DNS-Ligase katalysierte Reaktion stattfindet zwischen einer 5'-Phosphat-DNS-Endgruppe und einer 3'-Hydroxyl-DNS- - Endgruppe. Wird die terminale 5'-Phosphatgruppe entfernt, so tritt keine Bindungsreaktion ein. Ist doppelsträngige DNS zu verbinden, so sind zwei Situationen möglich, wie in Tabelle 1 gezeigt :
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Tabelle 1
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<tb>
<tb> Fall <SEP> Reaktionsteilnehmer <SEP> Ligase-Produkt
<tb> I <SEP> 3'5'3'5' <SEP>
<tb> OH <SEP> H203PO <SEP> 0-P-O-- <SEP>
<tb> + <SEP> + <SEP> 2 <SEP> H20 <SEP>
<tb> OPO3H2 <SEP> HO <SEP> O-P-O
<tb> 5' <SEP> 3' <SEP> 5' <SEP> 3'
<tb> ii <SEP> 3' <SEP> 5' <SEP> 3' <SEP> 5'
<tb> -------OH <SEP> H203PO <SEP> 0-P-O--- <SEP>
<tb> + <SEP> +h2o
<tb> OH <SEP> OH <SEP> OH <SEP> HO- <SEP> 2 <SEP>
<tb> 5'3'5'3'
<tb> III <SEP> 3' <SEP> 5'
<tb> OH <SEP> HO <SEP>
<tb> + <SEP> KEINE <SEP> Reaktion
<tb> OH <SEP> HO
<tb> 5'3'
<tb>
In Tabelle 1 wird die doppelsträngige DNS schematisch durch zwei parallele Linien wieder- gegeben, wobei die 5'- und 3'-Endgruppen je nachdem Hydroxyl- oder Phosphatgruppen aufweisen.
Im Fall I liegen 5'-Phosphatgruppen an beiden reaktionsfähigen Endgruppen vor, mit dem Ergebnis, dass beide Stränge covalent gebunden werden. Im Fall II besitzt nur einer der zu verbindenden Stränge eine terminale 5'-Phosphatgruppe mit dem Ergebnis, dass eine einsträngige covalente Bindung erfolgt, während im andern Strang eine Diskontinuität vorliegt. Der nichtcovalent verbundene Strang bleibt mit dem Molekül auf Grund von Wasserstoffbrücken zwischen komplementären Basenpaaren an den gegenüberliegenden Strängen in bekannter Weise verbunden. Im Fall III besitzt keines der Enden der Reaktionsteilnehmer eine 5'-Phosphatgruppe, so dass keine Bindungsreaktion eintreten kann.
Unerwünschte Bindungsreaktionen können daher verhindert werden, indem man entsprechende Enden der Reaktionsteilnehmer, deren Verbindung zu verhüten ist, behandelt unter Entfernung der 5'-Phosphatgruppen. Man kann jede Methode zur Entfernung von 5'-Phosphatgruppen anwenden, die die DNS nicht anderweitig beschädigt. Bevorzugt wird die durch das Enzym alkalische Phosphatase katalysierte Hydrolyse.
Das vorstehend beschriebene Verfahren ist auch dann brauchbar, wenn ein lineares DNS-Molekül in zwei Unterfragmente, typischerweise mit einer Restriktions-Endonuclease, zu spalten und dann in der originalen Sequenz zu rekonstituieren ist. Die Unterfragmente können gesondert gereinigt und die gewünschte Sequenz kann durch erneute Verbindung der Unterfragmente rekonstituiert werden. Das Enzym DNS-Ligase, das die Ende-an-Ende-Verknüpfung von DNS-Fragmenten katalysiert, kann zu diesem Zweck verwendet werden, vgl. Sgaramella, V., Van de Sande, J. H., und Khorana, H. G., Proc. Natl. Sci. USA 67, 1468 (1970). Sind die zu verbindenden Sequenzen nicht stumpf, so kann man die aus E. coli erhaltene Ligase verwenden, vgl. Modrich, P., und Lehman, I. R., J. Biol. Chem. 245,3626 (1970).
Die Rekonstituierung der Originalsequenz aus durch Restriktions-Endonuclease erhaltenen Unterfragmenten wird stark verbessert, wenn man eine Methode anwendet, die die Rekonstitution
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cDNS entfernt vor der Spaltung der homogenen cDNS mit einer Restriktions-Endonuclease. Man verwendet wieder bevorzugt alkalische Phosphatase. Die 5'-terminalen Phosphatgruppen sind
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eine strukturelle Vorbedingung für die spätere verbindende Wirkung der DNS-Ligase, die zur
Rekonstituierung der gespaltenen Unterfragmente verwendet wird. Enden ohne 5'-terminale Phosphat- gruppe können daher nicht covalent gebunden werden. Die DNS-Unterfragmente können nur an solchen Enden gebunden werden, die eine 5'-Phosphatgruppe besitzen.
Dieses Verfahren verhindert die wichtigste unerwünschte Bindungsreaktion, nämlich die
Verbindung von zwei Fragmenten mit umgekehrter Sequenz, d. h. hinten-an-vorn, statt vorn-an- hinten. Andere mögliche Nebenreaktionen wie Dimerisierung und Cyclisierung werden nicht verhin- dert, da diese in einer Reaktion vom Typ II gemäss Tabelle I erfolgen. Diese Nebenreaktionen sind weniger nachteilig, da sie zu physikalisch abtrennbaren und identifizierbaren Produkten führen, was bei der Neukombination in falscher Richtung nicht der Fall ist.
Zur Illustrierung des vorstehend beschriebenen Verfahrens wurde Wachstumshormon codierende cDNS isoliert und mit einem Plasmid rekombiniert. Die DNS-Moleküle wurden zur Transformation von E. coli X-1776 verwendet. Die Selektion der zu transformierenden Zellen erfolgte durch Wachstum auf einem tetracyclinhaltigen Medium. Eine aus transformierten Zellen gewonnene neukombinierte Plasmid-DNS enthielt ein inseriertes DNS-Fragment von etwa 410 Nucleotiden Länge. Weitere Neukombinationen, die auf gleiche Weise isoliert worden waren, wurden ebenfalls analysiert. Die inserierten Fragmente wurden mit Hind III- oder Hsu I-Endonuclease aus dem Plasmid freigesetzt und die DNS-Sequenz wurde nach der Methode von Maxam, A. M., und Gilbert, W., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 74,560 (1977), ermittelt. Die Nucleotidsequenzen der inserierten DNS-Fragmente waren überlappt und enthielten die gesamte Codierungsreaktion für Ratten-Wachstumshormon.
Nach ausgiebiger Replikation in E. coli wurde eine Nucleotidsequenz von etwa 800 Nucleotiden Länge isoliert, die die gesamte codierende Sequenz für Ratten-Wachstumshormon und Teile des Vorläuferpeptids und einen Teil der S'-untranslatierten Region enthielten.
Das beschriebene Verfahren ist allgemein anwendbar auf die Isolierung und Reinigung eines Gens aus einem höheren Organismus, einschliesslich menschlicher Gene, dessen Transfer in einen Mikroorganismus und Replikation im Mikroorganismus. Auch neue rekombinierte Plasmide, die das gesamte oder einen Teil des isolierten Gens enthalten, werden beschrieben. Ferner werden bisher unbekannte neue Mikroorganismen beschrieben, die als Teil ihrer genetischen Ausstattung ein Gen eines höheren Organismus enthalten.
Die folgenden Beispiele beschreiben im einzelnen das Verfahren in der Anwendung auf die Isolierung, Reinigung und den Transfer von Wachstumshormongen in E. coli. In den Beispielen werden ferner rekombinierte Plasmide charakterisiert, die Teile von Ratten-Wachstumshormongen und von menschlichem Wachstumshormongen enthalten, sowie die die genannten Gene enthaltenden neuen Mikroorganismen.
Die Erfindung wird im folgenden durch Ausführungsbeispiele näher erläutert.
Beispiel 1 :
In diesem Beispiel wird das Isolieren und Reinigen einer die gesamte Strukturgensequenz von Rattenwachstumshormon besitzenden DNS zusammen mit der Synthese eines das gesamte Strukturgen für Rattenwachstumshomon besitzenden Transfer-Vektors und das Herstellen eines das Gen für Rattenwachstumshormon als Teil seines genetischen Aufbaus enthaltenden Mikroorganismusstammes beschrieben.
Im Zusammenhang mit Genen nichtmenschlichen Ursprungs wird durch die in den U. S. A. geltenden Sicherheitsbestimmungen nicht gefordert, dass die cDNS in ebensoich hohem Ausmass gereinigt wird, wie dies für cDNSen menschlichen Ursprungs gefordert wird. Aus diesem Grunde war es möglich, die das gesamte Strukturgen von Rattenwachstumshormon enthaltende cDNS durch Isolieren elektrophoretisch abgetrennter DNS der zu erwartenden Länge von etwa 800 Basenpaaren (bestimmt aus der bekannten Länge des aus Aminosäuren aufgebauten Rattenwachstumshormons) zu isolieren. Als Quelle für die mRNS des Rattenwachstumshormons wurden kultivierte Zellen von Rattenhypophysen, u. zw. ein Sub-Clon-der Zellspezies GH-1, verwendet, wie sie bei ATCC bezogen werden können [vgl. Tashjian, A.
H., et al., Endochrinology 82,342 (1968) ]. In solchen unter formalen Bedingungen gezüchteten Zellen ist die mRNS des Wachstumshormons nur in einer geringen Menge von 1 bis 3% der gesamten Poly-A enthaltenden RNS enthalten, jedoch konnte der Gehalt an mRNS für Wachstumshormon durch synergistische Wirkung von Thyroidhormonen
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5. 108 Zellen.(1973) ] isoliert.
Die mRNS wurde unter Verwendung von reverser Transcriptase aus Vogel-Myeloblastosis-Virus,
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markiertem Deoxynucleosid-triphosphat, spezifische Aktivität 500 bis 200 Curie je Mol, 200 ig/ml Oligo-dT (12-18) von Collaborative Research, Waltham, Massachusetts, 100 ig/ml polyadenylierter
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dem gleichen Volumen an mit Wasser gesättigtem Phenol extrahiert, worauf die wässerige Phase in einer mit Sephadex G-100 gefüllten Kolonne von 0, 3 cm Durchmesser und 10 cm Höhe unter Verwendung eines Eluiermittels chromatographiert wurde, das in Tris-HCl 10 mmolar (PH 9, 0), an NaCl 100 mmolar und an EDTA 2 mmolar war. Die aus dem Hohlvolumen eluierte Nukleinsäure wurde nach Zusetzen von Ammonacetat (PH 6, 0, auf 0, 25 mmolar) mit Äthanol ausgefällt.
Der Niederschlag wurde abfiltriert und dann in 50 ml frisch hergestellter 0, 1 molarer Natronlauge gelöst, worauf die erhaltene Lösung bei 700C 20 min inkubiert wurde, um die RNS zu hydrolysie-
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in Wasser gelöst. Nach dem Fraktionieren durch Gelelektrophorese konnte ein schwaches, jedoch deutlich sichtbares Band festgestellt werden, welches einer eine Länge von etwa 800 Basenpaaren besitzenden DNS entsprach.
Durch Behandeln der gesamten cDNS, welche aus der mRNS der kultivierten Hypophysenzellen transkribiert worden war, mit HhaI-Endonuclease wurden zwei DNS-Hauptfragmente erhalten.
Diese Hauptfragmente enthielten, nach dem elektrophoretischen Trennen voneinander, etwa 320 Nucleotide (Fragment A) bzw. 240 Nucleotide (Fragment B).
Die Nucleotidsequenz dieser Fragmente A und B wurde dadurch bestimmt, dass die Fragmente entsprechend der Methode von Maxam und Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74,560 (1977), spezifisch gespalten und der Sequenzanalyse unterworfen wurden. Die Sequenzanalyse zeigte, dass die Fragmente A und B in der Tat Teile des Rattenwachstumshormon codierenden Bereiches darstellten, wie sich durch Vergleich mit der veröffentlichten Aminosäuresequenz vom Rattenwachstumshormon und durch Vergleich mit der Aminosäuresequenz anderer bekannter Wachstumshormone ergab [vgl. Wallis, M., und Davies, R. V. N., Growth hormone and related Peptides (Fds., Copecile, A., und Muller, E. E.), S. 1-14 (Elsevier, New York, 1976), und Dayhoff, M.
O., Atlas of Protein Sequence and Structure, 5, Suppl. 2, S. 120-121 (National Biomedical Research Foundation, Washington, D. C., 1976)]. Wenn die in der oben beschriebenen Weise elektrophoretisch isolierte und 800 Basenpaare aufweisende doppelstrangige cDNS mit einer Endonuclease behandelt wurde, wurden unter den hauptsächliche Spaltprodukten zwei Fragmente festgestellt, deren Länge der Länge der Fragmente A und B entsprach.
Da die etwa 800 Basenpaare aufweisende cDNS aus Rattenwachstumshormon nicht durch Behandlung mit einer Restriktions-Endonuclease behandelt worden war, war es erforderlich, die DNS weiter zu reinigen, um einstrangige, unpaarige Enden zu entfernen. In der Praxis wurden solche unpaarige Enden vor dem elektrophoretischen Trennen in 25 111 60 mmolarem Tris-
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200 mmolarem dATP, dTTP, dGTP und dCTP abgespalten. Die Mischung wurde 10 min bei 10 C mit 1 Einheit von DNS-Polymerase I aus E. coli inkubiert, um alle abstehenden 3'-Enden exo-
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nucleolytisch abzuspalten und alle abstehenden 5'-Enden aufzufüllen. DNS-Polymerase I ist bei Boehringer-Mannheim Biochemicals, Indianapolis, Indiana, erhältlich.
Die etwa 800'Basenpaare enthaltende cDNS wurde durch Zusetzen synthetisch hergestellten Hind III-Verknüpfungsmittels behandelt. Die cDNS aus Rattenwachstumshormon wurde während 30 min bei 22 C in 0, 03 m Natriumacetat, PH 4, 6, 0, 3 m Natriumchlorid und 4, 5 mmolarem ZnCl2 mit 30 Einheiten einer eine Aktivität von 1200 Einheiten/ml besitzenden Sl-Nuclease (erhältlich bei Miles Laboratories, Elkhart, Indiana) und anschliessend noch weitere 15 min bei 10 C inkubiert.
Die Umsetzung wurde durch Zusetzen von Tris in Form der Base zum Erzielen einer Endkonzentration von 0, 1 m, von EDTA bis zu einer Endkonzentration von 25 mmolar und tRNS aus
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Behandlung führte zu einer hohen Ausbeute an cDNS-Molekülen, welche die für die Stumpfendenligation an synthetische Decanucleotide erforderlichen basenpaarigen Enden aufwiesen. Die Hind III-Decameren wurden nach der von Scheller, R. H., Dickerson, R. E., Boyer, H. W., Riggs, A. D., und Itakura, K., in Science 196,177 (1977), angegebenen Methode hergestellt. Das Verknüpfen von Hind III-Decameren mit cDNS wurde durch Inkubieren bei 14 C während 1 h in 66 mmolarem
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Das Reaktionsgemisch wurde sodann 5 min auf 65 C erwärmt, um die Ligase zu inaktivieren.
Vor dem Behandeln mit 150 Einheiten/ml vor dem Abbau mit 150 Einheiten/ml Hsu 1- oder Hind III-
Endonuclease während 2 h bei 37 C wurde KC1 bis zu einer Endkonzentration von 50 mmolar und EDTA bis zu einer Endkonzentration von 0, 1 mmolar zugesetzt. Hind III- und Hae II-Endo- nuclease können im Handel von New England Biolabs, Beverly, Massachusetts, bezogen werden.
Das Reaktionsprodukt wurde durch Gelelektrophorese analysiert, wobei zusätzlich zu den Fragmenten abgespaltener Hind II-Decamerer ein Scheitel beobachtet wurde, welcher etwa 800 Nucleotiden entsprach.
Das Plasmid pBR322, welches ein Ampicillinresistenzgen und innerhalb des Tetracyclinresistenzgens eine einzige Hind III-Stelle besass, wurde mit Hind III-Endonuclease und alkalischer Phosphatase behandelt. Das Plasmid pBR322 wurde an der Hind III-Restriktionsstelle mit Hsu IEndonuclease gespalten und dann mit alkalischer Phosphatase behandelt. Das Enzym war im Reaktionsgemisch in einer Menge von 0, 1 Einheit//lg enthalten, und das Reaktionsgemisch wurde bei 65 C 30 min in 25 mmolarem Tris-HCl, PH = 8, inkubiert, worauf die Phosphatase mit Phenol extrahiert wurde. Nach einem mit Äthanol vorgenommenen Fällen wurde die mit Phosphatase behandelte Plasmid-DNS einer 800 Basenpaare enthaltenden cDNS aus Rattenwachstumshormon zugesetzt, welches kohäsive Enden von Hind III in einem Molverhältnis von 3 Mol Plasmid je Mol cDNS enthielt.
Das Gemisch wurde sodann 1 h bei 14 C und in Anwesenheit von 50 Einheiten/ml T4-DNS-Ligase in 66 mmolarem Tris, PH 7, 6, 6, 6 mmolarem MgCl, 10 mmolarem Dithiothreitol und 1 mmolarer ATP inkubiert.
Dieses Ligase-Reaktionsgemisch wurde zum Transformieren einer Suspension von Zellen des Mikroorganismus E. coli X-1776 verwendet, welche für die Transformation in folgender Weise vorbereitet wurden :
Die Zellen wurden in 50 ml eines 10 g/l Trypton, 5 g/l Hefeextrakt, 10 g/l NaCl, 2 mMol NaOH, 100/lg/ml Diaminopimelinsäure und 40/lg/ml Thymin enthaltenden Mediums bei 37 C bis zu einer Zelldichte von etwa 2.108 Zellen/ml kultiviert.
Die Zellen wurden bei 5 C durch Zentrifugieren bei 5000. g während 5 min abgetrennt, dann in 20 ml einer an NaCl 10 mmolaren Kochsalzlösung erneut suspendiert, anschliessend in der angegebenen Weise zentrifugiert und dann erneut in 20 ml eines Transformationspuffers suspendiert, welcher an CaC12 75 mmolar, an NaCl 140 mmolar und an Tris (PH 7, 5) 10 mmolar war. Die Suspension wurde dann 5 min in Eis stehengelassen. Die Zellen wurden dann'abzentrifugiert und erneut in 0, 5 ml Transformationspuffer suspendiert. Das Transformieren wurde durch Vermischen von 100 il der Zellsuspension mit 50 p. l recombinanter DNS (1 g/ml) durchgeführt.
Das erhaltene Gemisch wurde bei 0 C 15 min inkubiert und
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dann zunächst 4 min auf 23 C und anschliessend 30 min auf 0 C gehalten. Die Zellen wurden sodann auf Agarplatten übergeführt und dort unter selektiven Bedingungen gezüchtet. Recombinante Kolonien wurden durch'Züchten auf Ampicillin enthaltenden Nährplatten gezüchtet und im Hinblick darauf ausgewählt, dass sie auf einem 20 ! 1g/ml Tetracyclin enthaltenden Nährmedium nicht wuchsen. Es wurden insgesamt 10 solcher Kolonien erhalten, von welchen jede ein Plasmid enthielt, in das etwa 800 Basenpaare eingeschachtelt waren und das durch Hind III-Spaltung abgespalten wurde.
Die 800 Basenpaare aufweisende DNS aus Rattenwachstumshormon wurde in präparativer Menge aus recombinantem pRGH (RWH)-l-Klon isoliert, worauf deren Nucleotidsequenz nach der oben angegebenen Methode von Maxam und Gilbert bestimmt wurde. In diesem Falle enthielt die Nucleotidsequenz untranslatierte 5'-Bereiche des Rattenwachstumshormons (rgh) und zusätzlich eine 26 Aminosäuren enthaltende Sequenz, wie sie in dem Wachstumshormonvorstufenprotein vor der Sekretion anzutreffen ist. Der von der Gensequenz abgeleitete Messenger (Bote) der mDNS-Sequenz ist in Tabelle II gezeigt.
Die vorausgesagte Aminosäuresequenz stimmt mit Ausnahme der Stellungen 1 und 8 gut mit jener partiellen Aminosäuresequenz von Rattenwachstumshormon überein, welche von Wallis und Davies, supra, beschrieben wurde und die Reste 1-43,65-69, 108-113, 133-143 und 150-190 enthält.
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Tabelle II
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<tb>
<tb> Met <SEP> Ala <SEP> Ala <SEP> Asp <SEP> Ser <SEP> Gln <SEP> Thr <SEP> Pro <SEP> Trp <SEP> Leu <SEP> Leu <SEP> Thr <SEP> Phe <SEP> Ser <SEP> Leu <SEP> Leu <SEP> Cys <SEP> Leu <SEP> Leu
<tb> 5'---GTGGACAGATCACTGAGTGGCG <SEP> ATG <SEP> GCT <SEP> GCA <SEP> GAC <SEP> TCT <SEP> CAG <SEP> ACT <SEP> CCC <SEP> TCC <SEP> CTC <SEP> CTG <SEP> ACC <SEP> TTC <SEP> AGC <SEP> CTG <SEP> CTC <SEP> TCC <SEP> CTG <SEP> CTG
<tb> 1 <SEP> 20
<tb> Trp <SEP> Pro <SEP> Gln <SEP> Glu <SEP> Ala <SEP> Gly <SEP> Ala <SEP> Leu <SEP> Pro <SEP> Ala <SEP> Met <SEP> Pro <SEP> Leu <SEP> Ser <SEP> Ser <SEP> Leu <SEP> Phe <SEP> Ala <SEP> Asn <SEP> Ala <SEP> Val <SEP> Leu <SEP> Arg <SEP> Ala <SEP> Gln <SEP> His <SEP> Leu <SEP> His <SEP> Gln <SEP> Leu
<tb> TCGG <SEP> CCT <SEP> CA <SEP> GAG <SEP> GCT <SEP> GGT <SEP> GCT <SEP> TTA <SEP> CCT <SEP> GCC <SEP> ATG <SEP> CCC <SEP> TTG <SEP>
TCC <SEP> AGT <SEP> CUG <SEP> TTT <SEP> CCC <SEP> AAT <SEP> GCT <SEP> GTG <SEP> CTC <SEP> CCA <SEP> CCC <SEP> CAG <SEP> CAC <SEP> CTG <SEP> CAC <SEP> CAG <SEP> CTG
<tb> 40
<tb> Ala <SEP> Ala <SEP> Asp <SEP> Thr <SEP> Tyr <SEP> Lys <SEP> Glu <SEP> Phe <SEP> Glu <SEP> Arg <SEP> Ala <SEP> Tyr <SEP> Ile <SEP> Pro <SEP> Glu <SEP> Gly <SEP> Gln <SEP> Arg <SEP> Tyr <SEP> Ser <SEP> Ile <SEP> Gln <SEP> Asn <SEP> Ala <SEP> Gln <SEP> Ala <SEP> Ala <SEP> Phe <SEP> Cys <SEP> Phe
<tb> GCT <SEP> GCT <SEP> GAC <SEP> ACC <SEP> TAC <SEP> AAA <SEP> GAG <SEP> TTC <SEP> GAG <SEP> CGT <SEP> CCC <SEP> TAC <SEP> ATT <SEP> CCC <SEP> GAG <SEP> GGA <SEP> CAG <SEP> CGC <SEP> TAT <SEP> TCC <SEP> ATT <SEP> CAG <SEP> AAT <SEP> GCC <SEP> CAG <SEP> GCT <SEP> CCT <SEP> TTC <SEP> TCC <SEP> TTC
<tb> 60 <SEP> 80
<tb> Ser <SEP> Glu <SEP> Thr <SEP> Ile <SEP> Pro <SEP> Ala <SEP> Pro <SEP> Thr <SEP> Gly <SEP> Lys <SEP>
Glu <SEP> Glu <SEP> Ala <SEP> Gln <SEP> Gln <SEP> Arg <SEP> Thr <SEP> Asp <SEP> Met <SEP> Glu <SEP> Leu <SEP> Leu <SEP> Arg <SEP> Phe <SEP> Ser <SEP> Leu <SEP> Leu <SEP> Leu <SEP> Ile <SEP> Gln
<tb> TCA <SEP> GAG <SEP> ACC <SEP> ATC <SEP> CCA <SEP> GCC <SEP> CCC <SEP> ACC <SEP> GGC <SEP> AAG <SEP> GAG <SEP> GAG <SEP> GCC <SEP> CAG <SEP> CAG <SEP> AGA <SEP> ACT <SEP> GAC <SEP> ATG <SEP> GAA <SEP> TTG <SEP> CTT <SEP> CGC <SEP> TTC <SEP> TCG <SEP> CTG <SEP> CTG <SEP> CTC <SEP> ATC <SEP> CAG
<tb> 100
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<tb> 120 <SEP> 140
<tb> Asp <SEP> Leu <SEP> Glu <SEP> Glu <SEP> Gly <SEP> Ile <SEP> Gln <SEP> Ala <SEP> Leu <SEP> Met <SEP> Gln <SEP> Glu <SEP> Leu <SEP> Glu <SEP> Asp <SEP> Gly <SEP> Ser <SEP> Pro <SEP> Arg <SEP> Ile <SEP> Gly <SEP> Gln <SEP> Ile <SEP> Leu <SEP> Lys <SEP> Gln <SEP> Thr <SEP> Tyr <SEP> Asp <SEP> Lys
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<tb> 160
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<tb> 180
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TAG <SEP> GCACACACTGGTGTCTCTGCGGCACTCCCCCGTTACCCCCCTGTACT
<tb> CTGGCAACTGCCACCCCTACACTTTGTCCTAATAAAATTAATGATGCATCATATC <SEP> poly <SEP> (A) <SEP> --- <SEP> 3'
<tb>
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Beispiel 2 :
Im vorliegenden Beispiel wird das Isolieren und Reinigen der gesamten, menschliches Wachstumshormon codierenden'Gensequenz zusammen mit der Synthese eines das gesamte Strukturgen für menschliches Wachstumshormon enthaltenden recombinanten Plasmids und die Herstellung eines Mikroorganismus beschrieben, welcher das gesamte Strukturgen für menschliches Wachstumshormon als Teil seines genetischen Aufbaus aufweist.
Das Isolieren von mDNS aus menschlichem Wachstumshormon wird im wesentlichen nach der im Beispiel 1 beschriebenen Methode vorgenommen, wobei jedoch als biologischer Ausgangsstoff Gewebe aus menschlichem Hypophysentumor verwendet wurde. 5 bösartige, menschliche Hypophysentumoren wurden nach dem Entfernen durch einen chirurgischen Eingriff in flüssigem Stickstoff rasch eingefroren. Diese Tumoren besassen ein Gewicht von 0, 4 bis 1, 5 g und wurden zunächst aufgetaut und dann in 4 molarem Guanidiniumthiocyanat, welches an Mercaptoäthanol 1 molar war und einen pH-Wert von 5, 0 besass, bei 4 C homogenisiert. Das Homogenisat wurde mit 1, 2 ml einer 5, 7 molaren Lösung von CsCl überschichtet, welche an EDTA 100 mmolar war, worauf das
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wanderte zum Boden des Zentrifugenrohres.
Die RNS wurde unter Verwendung einer Oligo-dT-Kolonne und durch Saccharosegradientensedimentation weiter gereinigt.
Etwa 10% der so isolierten RNS codierten Wachstumshormone, wie beim Einbauen einer radioaktiven Aminosäurevorstufe in ein ausfällbares Material mit Antiwachstumshormonwirkung in einem aus Weizenkeimen gewonnenen zellfreien Translationssystem [vgl. Roberts, B. E., und Patterson, B. M., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 70, 2330 (1973)] gezeigt werden konnte.
Die menschliches Wachstumshormon codierende cDNS wird im wesentlichen nach den Angaben in Beispiel 1 hergestellt. Die menschliches Wachstumshormon codierende cDNS wird durch Gelelektrophorese fraktioniert, wobei jenes Material für das Klonen ausgewählt wird, welches an eine Stelle wandert, die einer Kettenlänge von etwa 800 Nucleotiden entspricht. Die ausgewählte Fraktion wird mit DNS-Polymerase I behandelt und dann durch End-Addition von Hind III-Verknüpfern behandelt. Die erhaltene cDNS wird sodann unter Verwendung von DNS-Ligase mit mit alkalischer Phosphatase behandeltem Plasmid pBR322 rekombiniert. E. coli X-1776 wird mit der recombinanten DNS transformiert, wobei ein DNS für menschliches Wachstumshormon enthaltender Stamm ausgewählt wird.
Dieser DNS für menschliches Wachstumshormon enthaltende Stamm wird in präparativen Mengen gezüchtet, worauf die menschliches Wachstumshormon codierende DNS aus dem Mikroorganismus isoliert und ihre Nucleotidsequenz bestimmt wird. Es wurde gefunden, dass die geklonte DNS für menschliches Wachstumshormon Nucleotide enthält, welche die gesamte Aminosäuresequenz menschlichen Wachstumshormons codiert. Die ersten 23 Aminosäuren des menschlichen Wachstumshormons sind H. N-Phe-Pro-Thr-Ile-Pro-Leu-Ser-Arg-Leu-Phe-Asp-Asn-Ala-Met-Leu-Arg-Ala.-His-Arg- -Leu-Cis-Gln-Leu. Der Rest der Sequenz ist in der folgenden Tabelle III gezeigt.
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Tabelle III
EMI19.1
<tb>
<tb> 24 <SEP> 34 <SEP> 40 <SEP> 43
<tb> Ala <SEP> Phe <SEP> Asp <SEP> Thr <SEP> Tyr <SEP> Gln <SEP> Glu <SEP> Phe <SEP> Glu <SEP> Glu <SEP> Ala <SEP> Tyr <SEP> Ile <SEP> Pro <SEP> Lys <SEP> Glu <SEP> Gln <SEP> Lys <SEP> Tyr <SEP> Ser <SEP> Phe <SEP> Leu <SEP> Gln <SEP> Asn <SEP> Pro <SEP> Gln
<tb> 5'-----G <SEP> GCC <SEP> TTT <SEP> GAC <SEP> ACC <SEP> TAC <SEP> CAG <SEP> GAG <SEP> TTT <SEP> GAA <SEP> GAA <SEP> GCC <SEP> TAT <SEP> ATC <SEP> CCA <SEP> AAG <SEP> GAA <SEP> CAG <SEP> AAG <SEP> TAT <SEP> TCA <SEP> TTC <SEP> CTG <SEP> CAG <SEP> AAC <SEP> CCC <SEP> CAG
<tb> 60
<tb> Thr <SEP> Ser <SEP> Leu <SEP> Cys <SEP> Phe <SEP> Ser <SEP> Glu <SEP> Ser <SEP> Ile <SEP> Pro <SEP> Thr <SEP> Pro <SEP> Ser <SEP> Asn <SEP> Asg <SEP> Glu <SEP> Glu <SEP> Thr <SEP> Gln <SEP> Gln <SEP> Lys <SEP> Ser <SEP> Asn <SEP> Leu <SEP> Glu <SEP> Leu <SEP> Leu
<tb> ACC <SEP> TCC
<SEP> CTC <SEP> TGT <SEP> TTC <SEP> TCA <SEP> GAG <SEP> TCT <SEP> ATT <SEP> CCG <SEP> ACA <SEP> CCC <SEP> TCC <SEP> AAC <SEP> ACG <SEP> GAG <SEP> GAA <SEP> ACA <SEP> CAA <SEP> CAG <SEP> AAA <SEP> TCC <SEP> AAC <SEP> CTA <SEP> GAG <SEP> CTG <SEP> CTC
<tb> 80 <SEP> 100
<tb> Arg <SEP> Ile <SEP> Ser <SEP> Leu <SEP> Leu <SEP> Leu <SEP> Ile <SEP> Gln <SEP> Ser <SEP> Trp <SEP> Leu <SEP> Glu <SEP> Pro <SEP> Val <SEP> Gln <SEP> Phe <SEP> Leu <SEP> Arg <SEP> Ser <SEP> Val <SEP> Phe <SEP> Ala <SEP> Asn <SEP> Asn <SEP> Leu <SEP> Val <SEP> Tyr
<tb> CGC <SEP> ATC <SEP> TCC <SEP> CTG <SEP> CTG <SEP> CTC <SEP> ATC <SEP> CAG <SEP> TCG <SEP> TGG <SEP> CTG <SEP> GAG <SEP> CCC <SEP> GTG <SEP> CAG <SEP> TTC <SEP> CTC <SEP> ACC <SEP> CGT <SEP> GTC <SEP> TTC <SEP> GCC <SEP> AAC <SEP> AAC <SEP> CTG <SEP> GTG <SEP> TAC
<tb> 120
<tb> Gly <SEP> Ala <SEP> Ser <SEP> Asp <SEP> Ser <SEP> Asn <SEP> Val <SEP> Tyr
<SEP> Asp <SEP> Leu <SEP> Leu <SEP> Lys <SEP> Asp <SEP> Leu <SEP> Glu <SEP> Glu <SEP> Gly <SEP> Ile <SEP> Gln <SEP> Thr <SEP> Leu <SEP> Met <SEP> Gly <SEP> Arg <SEP> Leu <SEP> Glu <SEP> Asp
<tb> GGC <SEP> GCC <SEP> TCT <SEP> GAC <SEP> AGC <SEP> AAC <SEP> GTC <SEP> TAT <SEP> GAC <SEP> CTC <SEP> CTA <SEP> AAG <SEP> GAC <SEP> CTA <SEP> GAG <SEP> GAA <SEP> GGC <SEP> ATC <SEP> CAA <SEP> ACG <SEP> CTG <SEP> ATG <SEP> GGG <SEP> AGG <SEP> CTG <SEP> GAA <SEP> GAC
<tb> 140
<tb> Gly <SEP> Ser <SEP> Pro <SEP> Arg <SEP> Thr <SEP> Gly <SEP> Gln <SEP> Ile <SEP> Phe <SEP> Lys <SEP> Gln <SEP> Thr <SEP> Tyr <SEP> Ser <SEP> Lys <SEP> Phe <SEP> Asp <SEP> Thr <SEP> Arn <SEP> Ser <SEP> His <SEP> Asn <SEP> His <SEP> Asp <SEP> Ala <SEP> Leu <SEP> Leu
<tb> GGC <SEP> AGC <SEP> CCC <SEP> CCG <SEP> ACT <SEP> GGG <SEP> CAG <SEP> ATC <SEP> TTC <SEP> AAG <SEP> CAG <SEP> ACC <SEP> TAC <SEP> AGC <SEP> AAG <SEP>
TTG <SEP> GAC <SEP> ACA <SEP> AAG <SEP> TCA <SEP> GAC <SEP> AAC <SEP> CAT <SEP> GAC <SEP> GCA <SEP> CTA <SEP> CTC
<tb> 160 <SEP> 180
<tb> Lys <SEP> Asn <SEP> Tyr <SEP> Gly <SEP> Leu <SEP> Leu <SEP> Tyr <SEP> Cys <SEP> Phe <SEP> Arg <SEP> Lys <SEP> Asp <SEP> Met <SEP> Asp <SEP> Lys <SEP> Val <SEP> Glu <SEP> Thr <SEP> Phe <SEP> Leu <SEP> Arg <SEP> Ile <SEP> Val <SEP> Gln <SEP> Cys <SEP> Arg <SEP> Ser
<tb> AAG <SEP> AAC <SEP> TAC <SEP> CCG <SEP> CTG <SEP> CTC <SEP> TAC <SEP> TGG <SEP> TTC <SEP> ACG <SEP> AAG <SEP> GAC <SEP> ATG <SEP> GAC <SEP> AAG <SEP> GTC <SEP> GAG <SEP> ACA <SEP> TTC <SEP> CTG <SEP> CGC <SEP> ATG <SEP> GTG <SEP> GAG <SEP> TGC <SEP> CGC <SEP> TCT
<tb> 191
<tb> Val <SEP> Glu <SEP> Gly <SEP> Ser <SEP> Cys <SEP> Gly <SEP> Phe
<tb> GTG <SEP> GAG <SEP> GGC <SEP> AGC <SEP> TGT <SEP> GGC <SEP> TTC <SEP> TAG <SEP> CTGCCCGGGTGGCATCCCTGTGACCGCTGGGCAGTGGCTCTGGTGGCC <SEP> -----
<SEP> 3' <SEP>
<tb>