DE3280422T2

DE3280422T2 - Verfahren und produkte zur leichten mikrobiologischen expression von dns-sequenzen.

Info

Publication number: DE3280422T2
Application number: DE8282304880T
Authority: DE
Inventors: Boer Herman Albert De; Herbert L Heyneker; Peter H Seeburg
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1981-09-18
Filing date: 1982-09-16
Publication date: 1993-05-27
Anticipated expiration: 2002-09-17
Also published as: ES515800A0; AU8846482A; DE3280422D1; GB2106119B; GB2106119A; DK172897B1; BR8205453A; CA1340371C; IE53897B1; JPH0776599A; ZA826802B; EP0075444A2; NZ201918A; ES8407329A1; EP0075444B1; DE3280471D1; DK413982A; AU563347B2; IE822281L; AU3279089A

Description

Die vorliegende Erfindung schafft Verfahren und Einrichtungen zum Herstellen von DNA-Sequenzen die Messenger-RNA mit verbesserten Translationseigenschaften schafft. Die resultierende Messenger-RNA kann hochwirksam bei der Translation sein, um wesentliche Mengen an Polypeptidprodukt zu ergeben, das normalerweise zum Wirtsmikroorganismus heterolog ist. Die DNA-Sequenzen, die schließlich exprimiert, d. h. in Messenger-RNA (mRNA) transkribiert werden, die wiederum in Polypeptidprodukt translatiert wird, werden zum wesentlichen Teil gemäß vorliegender Erfindung synthetisch hergestellt, wobei Einrichtungen eingesetzt werden, welche die wesentliche Reduktion oder Eliminierung von sekundärer und/oder tertiärer Struktur in der entsprechenden transkribierten mRNA begünstigen. Eine Abwesenheit oder wesentliche Verringerung derartiger sekundärer/tertiärer Struktur, an der das 5'-Ende von mRNA beteiligt ist, ermöglicht das wirksame Erkennen und Binden von Ribosom(en) an die mRNA zur darauffolgenden Translation. So wird die Wirksamkeit der Translation durch Konformationsbehinderungen in der Struktur der transkribierten mRNA nicht behindert oder beeinträchtigt. Es werden auch Verfahren und Einrichtungen zum Bestimmen von mRNA-Sekundär-/Tertiärstruktur beschrieben, sowie assoziierte Einrichtungen, die dafür gedacht sind, sicherzustellen, daß sekundäre/tertiäre Struktur unter bestimmten bevorzugten Grenzen gehalten wird. Die vorliegende Erfindung wird durch die Herstellung verschiedener bevorzugter Proteinprodukte beispielhaft dargelegt.
Mit der Einführung der rekombinanten DNA-Technologie ist die gesteuerte mikrobielle Produktion einer enormen Vielfalt nützlicher Polypeptide möglich geworden, wodurch die mikrobiell gelenkte Herstellung von Hormonen, Enzymen, Antikörpern und Impfstoffen, die gegen eine große Vielfalt von Krankheiten nützlich sind, in greifbare Nähe gerückt ist. Viele Säugetierpolypeptide, wie menschliches Wachstumshormon und Leukozytinterferone, sind mit verschiedenen Mikroorganismen bereits hergestellt worden.
Ein Grundelement der rekombinanten DNA-Technologie ist das Plasmid, eine extrachromosomale Schleife aus doppelstrangiger DNA, die in Bakterien häufig in mehreren Kopien pro Zelle festgestellt wird. In der in der Plasmid-DNA kodierten Information ist oft die eingeschlossen, die zum Reproduzieren des Plasmids in Tochterzellen (d. h. ein "Replikon") erforderlich ist, sowie üblicherweise ein oder mehrere Selektionscharakteristika, wie Antibiotikaresistenz, die es ermöglichen, daß Klone der Wirtszelle, die das interessierende Plasmid enthält, erkannt und vorzugsweise in selektiven Medien gezüchtet werden. Die Nützlichkeit derartiger bakterieller Plasmide ist in der Tatsache begründet, daß sie spezifisch durch die/das eine oder andere Restriktionsendonuklease oder "Restriktionsenzym" gespalten werden können, von denen jede(s) eine andere Stelle auf der plasmidischen DNA erkennt. Heterologe Gene oder Genfragmente können durch Verbinden an den Enden an der Spaltungsstelle oder an rekonstruierten Enden, die an die Spaltungsstelle angrenzen, in das Plasmid eingefügt werden. (Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff "heterolog" auf ein Gen, das üblicherweise nicht in einem bestimmten Mikroorganismus gefunden wird, oder eine Polypeptidsequenz, die überlichweise nicht durch sie erzeugt wird, während der Begriff "homolog" sich auf ein Gen oder Polypeptid bezieht, das im entsprechenden Wildtyp-Mikroorganismus gefunden oder durch ihn erzeugt wird.) So werden sogenannte replizierbare Expressionsvehikel gebildet.
DNA-Rekombination wird außerhalb des Mikroorganismus durchgeführt, und das resultierende "rekombinante" Plasmid kann in den Mikroorganismus durch ein als Transformation bekanntes Verfahren eingeführt werden, und große Mengen des heterologen genhältigen rekombinanten Plasmids werden durch Züchten des Transformanten erhalten. Darüberhinaus kann das resultierende Plasmid, wenn das Gen, bezogen auf Abschnitte des Plasmids, welche die Transkription und Translation der kodierenden DNA steuern, richtig eingefügt wird, verwendet werden, um tatsächlich die Polypeptidsequenz zu erzeugen, für die das eingefügte Gen kodiert; ein Verfahren, das als Expression bezeichnet wird. Plasmide, die ein (heterologes) Gen exprimieren, werden als replizierbare Expressionsvehikel bezeichnet.
Die Expression wird in einem DNA-Bereich in Gang gesetzt, der als Promotor bekannt ist. In einigen Fällen, wie in den unten besprochenen lac- und trp-Systemen, werden die Promotorbereiche von "Operator"-Bereichen überlappt, um einen kombinierten Promotor-Operator zu bilden. Operatoren sind DNA-Sequenzen, die von sogenannten Repressorproteinen erkannt werden, die dazu dienen, die Häufigkeit der Transkriptionseinleitung von einem speziellen Promotor zu regulieren. In der Transkriptionsphase der Expression erkennt RNA-Polymerase bestimmte Sequenzen und bindet sich an die Promotor-DNA. Die Bindungsinteraktion bewirkt ein Entwinden der DNA in diesem Bereich, wodurch die DNA als eine Schablone für die Synthese von Messenger-RNA freigelegt wird.
Die Messenger-RNA dient als eine Schablone für Ribosomen, die sich an die Messenger-RNA binden und die mRNA in eine Polypeptidkette mit der Aminosäuresequenz translatieren, für welche die RNA/DNA kodiert. Für jede Aminosäure kodiert ein Nukleotidtriplett oder "Kodon", die gemeinsam das "strukturelle Gen" bilden, d. h. den Teil der DNA-Sequenz, der für die Aminosäuresequenz des exprimierten Polypeptidprodukts kodiert.
Nach der Bindung an den Promotor setzt RNA-Polymerase die Transkription von DNA in Gang, die für eine Ribosombindungsstelle einschließlich eines Translations-Einleitungs- oder "Start"-Signals kodiert (üblicherweise ATG, das in der resultierenden Messenger-RNA zu AUG wird), gefolgt von DNA-Sequenzen, die für das strukturelle Gen selbst kodieren. Sogenannte translationale Stopkodone werden am Ende des strukturellen Gens transkribiert, wonach die Polymerase eine zusätzliche Sequenz von Messenger-RNA bilden kann, die aufgrund der Gegenwart des translationalen Stopsignals von den Ribosomen untranslatiert bleiben wird.
Ribosome binden sich an die auf der Messenger-RNA vorgesehene Bindungsstelle, in Bakterien üblicherweise während die mRNA gebildet wird, und lenken in der Folge die Produktion des kodierten Polypeptids, am Translationsstartsignal beginnend und am/an den zuvor erwähnten Stopsignal(en) endend. Das resultierende Produkt kann durch Lyse der Wirtszelle und Gewinnen des Produkts durch geeignete Reinigung von anderen bakteriellen Proteinen erhalten werden.
Durch den Einsatz von rekombinanter DNA-Technologie exprimierte Polypeptide können völlig heterologe, funktionelle Proteine sein, wie im Fall der direkten Expression von menschlichem Wachstumshormon, oder können alternativ dazu einen bioaktiven heterologen Polypeptidabschnitt und damit verschmolzen einen Abschnitt der Aminosäuresequenz eines homologen Polypeptids umfassen, wie im Fall der Produktion von Zwischensubstanzen für Somatostatin und die Bestandteile von menschlichem Insulin. Im letzteren Fall beispielsweise umfaßt das verschmolzene homologe Polypeptid einen Abschnitt der Aminosäuresequenz für Beta-Galactosidase. In diesen Fällen wird das beabsichtigte bioaktive Produkt innerhalb des verschmolzenen, homologen/heterologen Polypeptids bioinaktiv gemacht, bis es in einer extrazellulären Umgebung gespalten wird. Fusionsproteine wie die eben erwähnten können so konstruiert sein, daß sie höchst spezifische Spaltung des Vorläuferproteins vom beabsichtigten Produkt zulassen, wie durch die Wirkung von Zyanogenbromid auf Methionin, oder
alternativ dazu durch enzymatische Spaltung. Siehe z. B. G.B. Patentveröffentlichung Nr. 2 007 676 A.
Wenn rekombinante DNA-Technologie vollständig halten soll, was sie verspricht, müssen Systeme entworfen werden, welche die Expression von Geneinfügungen optimieren, so daß die beabsichtigten Polypeptidprodukte in kontrollierten Umgebungen und in hohen Ausbeuten verfügbar gemacht werden können.

Promotorsysteme

Als Beispiele sind die Beta-Laktamase- und -Laktosepromotorsysteme vorteilhaft eingesetzt worden, um mikrobielle Produktion heterologer Polypeptide in Gang zu setzen und zu unterstützen. Details, welche den Aufbau und die Konstruktion dieser Promotorsysteme betreffen, sind von Chang et al., Nature 275,617 (1978) und Itakura et al., Science 198, 1056 (1977) veröffentlicht worden, die hiermit durch Verweis eingeschlossen sind. In jüngerer Vergangenheit ist ein System auf der Basis von Tryptophan, das sogenannte trp-Promotorsystem, entwickelt worden. Details zum Aufbau und der Konstruktion dieses Systems sind von Goeddel et al., Nucleic Acids Research 8, 4057 (1980) und Kleid et al., U.S.S.N. 133, 296, eingereicht am 24. März 1980 (oder die entsprechende Europäische Patentveröffentlichung Nr. 0036776) veröffentlicht worden, die hiermit durch Verweis eingeschlossen sind. Zahlreiche andere mikrobielle Promotoren sind entdeckt und eingesetzt worden, und Details bezüglich ihrer Nukleotidsequenzen, die es einem Fachmann ermöglichen, sie innerhalb der Plasmidvektoren funktionell zu ligieren, sind veröffentlicht worden -- siehe z. B. Siebenlist et al., Gell 20, 269 (1980), das durch diesen Verweis hierin eingeschlossen ist.
Historisch sind rekombinante Klonungsvehikel (extrachromosomale Duplex-DNA, die unter anderem einen funktionellen Replikationsursprung aufweist), hergestellt und eingesetzt worden, um Mikroorganismen zu transformieren -vergl. Ullrich et al., Science 196, 1313 (1977). Später gab es Versuche, DNA-Geneinfügungen, die für ein heterologes Polypeptid kodieren, tatsächlich zu exprimieren. Itakura et al. (Science 198, 1056 (1977)) exprimierte das Gen, das für Somatostatin kodiert, in E.coli. Andere ähnliche Erfolge folgten, wobei die Geneinfügungen durch organische Synthese unter Einsatz neu verfeinerter Techniken konstruiert wurden. Um, unter anderem, möglichen proteolytischen Abbau des Polypeptidprodukts innerhalb der Mikrobe zu vermeiden, wurden die Gene an DNA-Sequenzen ligiert, die für ein Vorläuferpolypeptid kodierten. Extrazelluläre Spaltung ergab das beabsichtigte Proteinprodukt wie oben besprochen.
Im Fall größerer Proteine erwies sich chemische Synthese der zugrundeliegenden DNA-Sequenz als unpraktisch. Demgemäß wurde auf die Herstellung von Gensequenzen durch Umkehrtranskription von entsprechender Messenger-RNA zurückgegriffen, die aus erforderlichen Geweben und/oder Kulturzellen erhalten wurde. Diese Verfahren erwiesen sich aufgrund der Beendigung der Transkription kurz vor der gesamten Sequenz nicht immer als zufriedenstellend; und/oder die gewünschte Sequenz war von natürlich auftretender Vorläuferleader- oder -signal-DNA begleitet. Somit führten diese Versuche oft zu unvollständigem Proteinprodukt und/oder Proteinprodukt in nicht-spaltbarer Konjugatform -vergl. Villa-Komaroff et al., Proc.Natl.Acad.Sci. (USA) 75, 3727 (1978) und Seeburg et al., Nature 276, 795 (1978).
Um diese Schwierigkeiten zu vermeiden, konstruierten Goeddel et al., Nature 281, 544 (197) DNA, die u. a. für menschliches Wachstumshormon kodiert, wobei chemisch synthetisierte DNA in Verbindung mit enzymatisch synthetisierter DNA verwendet wurde. Diese Entdeckung machte so die Einrichtungen verfügbar, welche die mikrobielle Expression von Hybrid-DNA (Kombination chemisch synthetisierter DNA mit enzymatisch synthetisierter DNA) ermöglichen, die insbesondere für Proteine mit beschränkter Verfügbarkeit kodiert, die anders vermutlich nicht wirtschaftlich erzeugt worden wären. Die (für heterologes Polypeptid kodierende) Hybrid-DNA wird in einem wesentlichen Anteil, vorzugsweise einer Mehrheit, über Umkehrtranskription von mRNA geschaffen, während der Rest durch chemische Synthese geschaffen wird. Bei einer bevorzugten Ausführungsform wurde synthetische DNA, die für die ersten 24 Aminosäuren von menschlichem Wachstumshormon (HGH) kodiert, nach einem Plan konstruiert, der eine Endonukleaserestriktionsstelle in der DNA einschloß, die den HGH-Aminosäuren 23 und 24 entspricht. Das wurde gemacht, um eine Verbidung mit HGH-cDNA-Sequenzen stromabwärts zu erleichtern. Die verschiedenen 12 Oligonukleotide langen Fragmente, aus denen der synthetische Teil der DNA besteht, wurden nach den bekannten Kriterien für Gensynthese ausgewählt: Vermeidung unpassender Komplementarität der Fragmente zueinander, selbstverständlich mit Ausnahme derjenigen, die dazu bestimmt sind, gegenüberliegende Abschnitte der doppelstrangigen Sequenz zu besetzen; Vermeidung AT-reicher Bereiche, um Transkriptionstermination zu minimieren; und Wahl "mikrobiell bevorzugter Kodone". Nach der Synthese wurde es zugelassen, daß die Fragmente komplementäre Wasserstoffbindungen bewirkten und wurden nach an sich bekannten Verfahren ligiert. Diese Arbeit wird in der veröffentlichten GB-PS-2O55382 A beschrieben, die Goeddel et al., U.S.S.N. 55126, eingereicht am 5. Juli 1979 entspricht, das hierin durch diesen Verweis eingeschlossen ist.
Während die erfolgreiche Herstellung und Expression derartiger Hybrid-DNA eine nützliche Einrichtung zum Herstellen heterologer Polypeptide bot, wandte sie sich nicht gegen das allgemeine Problem, daß eukaryotische Gene vom prokaryotischen Expressionsmechanismus nicht immer auf eine Art erkannt werden, die reichliche Mengen an Endprodukt schafft. Die Entwicklung hat für diskrete Organismen eine einzigartige hohe Entwicklungsstufe eingeschlossen. Wenn man berücksichtigt, daß das eukaryotische Geninsert für den prokaryotischen Organismus heterolog ist, kann die oft beobachtete relative Ineffizienz bei der Expression für jedes Geninsert gelten, unabhängig davon, ob es chemisch, aus cDNA oder als ein Hybrid erzeugt wird. Somit sind die oben definierten, zum Konstruieren des synthetischen Teils des Gens für HGH verwendeten Kriterien nicht die einzigen Faktoren, welche die Expressionswerte beeinflussen. Beispielsweise ist die Konzentration auf Kodonwahl, wie es frühere Forscher gemacht haben -- vergl. GB-PS-2O07676 A -- nicht völlig erfolgreich gewesen, wenn es darum ging, die Expressionseffizienz auf maximale Expressionswerte zu erhöhen.
Guarante et al., Science 209, 1428 (1980) führten Versuche mit mehreren Hybridribosombindungsstellen durch, die dafür bestimmt waren, mit Anzahl an Basenpaaren zwischen der Shine-Dalgarno-Sequenz und dem ATG einiger bekannter E.coli-Bindungsstellen zusammenzupassen, und ihre Arbeit deutet darauf hin, daß der/die Grund/Gründe für die beobachtete relativ geringe Effizienz eukaryotischer Genexpression durch prokaryotische Organismen subtiler ist/sind.
Daß das Ingangsetzen von mRNA-Translation ein durch mehrere Komponenten bestimmter Vorgang sein kann, wird durch die Arbeit veranschaulicht, über die von Iserentant und Fiers, Gene 9, 1 (1980) berichtet wird. Sie behaupten, daß sekundäre Struktur von mRNA eine der Komponenten ist, welche die Translationseffizienz beeinflussen, und meinen, daß das Einleitungskodon und die Ribosominteraktionsstelle von sekundär strukturierter, gefalteter mRNA "zugänglich" sein muß. Jedoch meinen diese Forscher mit "zugänglich" offensichtlich, daß das Kodon und die Stelle, auf die bezuggenommen wurde, auf der Schleife und nicht am Stamm der sekundären Strukturmodelle angeordnet sind, die sie als Hypothese vorausgesetzt haben. Shine et al, Nature 285 (1980), 456 und Bahramian, J. Theor. Biol., betonen beide die scheinbare Wichtigkeit von sekundärer Struktur in mRNA, um wirksame Translation zu erreichen.
Die vorliegende Erfindung basiert auf der Entdeckung, daß die Gegenwart von sekundärer/tertiärer Konformationsstruktur in mRNA das Einleiten und Aufrechterhalten ribosomaler Bindung während der Translationsphase heterologer Genexpression beeinträchtigt.
Die vorliegende Erfindung schafft unter Bezugnahme auf diese Ergebnisse ausschließlich Verfahren und Einrichtungen zum Schaffen wirksamer Expression heterologer Geneinfügungen durch den erforderlichen mikrobiellen Wirt. Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zum mikrobiellen Erzeugen heterologer Polypeptide, wobei sowohl spezifisch zugeschnittene heterologe Geneinfügungen in mikrobiellen Expressionsvehikeln als auch damit in Verbindung stehende Einrichtungen eingesetzt werden. Sie richtet sich insbesondere auf die Verwendung synthetisch abgeleiteter Geneinfügungsabschnitte, die so hergestellt sind, daß sie sowohl für das gewünschte Polypeptidprodukt kodieren als auch mRNA schaffen, die minimale sekundäre/tertiäre Struktur aufweist und daher für wirksame ribosomale Translation zugänglich ist.
Bei bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung wird synthetische DNA für einen wesentlichen Abschnitt der anfänglichen Kodierungssequenz einer heterologen Geneinfügung geschaffen, und wahlweise stromaufwärts davon durch das ATG-Translations-Startkodon und die Ribosombindungsstelle. Der kritische DNA-Abschnitt wird chemisch synthetisiert, wobei zwei Faktoren berücksichtigt werden: 1) die Schaffung einer Sequenz, die für die anfängliche (N-terminale) Aminosäuresequenz eines Polypeptids kodiert, das ein funktionelles Protein oder einen bioaktiven Abschnitt davon umfaßt, und 2) die Versicherung, daß die genannte Sequenz bei der Transkription Messenger-RNA schafft, die eine sekundäre/tertiäre Konformationsstruktur aufweist, die nicht ausreicht, um ihre Zugänglichkeit für wirksame ribosomale Translation wie hierin definiert zu beeinträchtigen. Bei einer derartigen chemischen Synthese kann organische Standardsynthese unter Einsatz modifizierter Mononukleotide als Baublöcke wie nach dem Verfahren von Crea et al., Nucleic Acids Research 8, 2331 (1980) eingesetzt werden, und/oder der Einsatz von stellengerichteter Mutagenese von DNA-Fragmenten wie nach dem Verfahren von Razin et al., Proc.Natl.Acad.Sci. (USA) 75, 4268 (1978) und/oder synthetische Primer auf bestimmten geeignet sequenzierten DNA-Fragmenten gefolgt von spezifischer Spaltung des gewünschten Bereiches.
Die vorliegende Erfindung ist auf ein Verfahren zur Herstellung von DNA- Sequenzen gerichtet, die sequentiell angeordnete Nukleotide umfassen, um für die richtige Aminosäuresequenz eines gegebenen Polypeptids zu kodieren.
Zu diesem Verfahren kann das Erhalten eines wesentlichen Abschnitts der DNA-Kodierungssequenz eines gegebenen Polypeptids auf andere Art als durch chemische Synthese gehören, meist durch Umkehrtranskription von erforderlichem Gewebe und/oder Kulturzellen-Messenger-RNA. Dieses Fragment kodiert für den C-terminalen Abschnitt des Polypeptids und ist gemäß vorliegender Erfindung an einen Rest der Kodierungssequenz ligiert, der z. B. durch chemische Synthese erhalten wird, wahlweise einschließlich richtig positionierter Translationsstart- und -stopsignale und DNA stromaufwärts durch die Ribosombindungsstelle und das erste Nukleotid (+1) der resultierenden Messenger-RNA. Das synthetische Fragment wird durch Nukleotidwahl in Abhängigkeit von der Konformation der entsprechenden Messenger-RNA gemäß den Kriterien wie hierin besprochen konstruiert.
Die so hergestellten DNA-Sequenzen sind zum Einfügen und zur Verwendung in replizierbaren Expressionsvehikeln geeignet, die dafür bestimmt sind, die Produktion des heterologen Polypeptids in einem Transformantmikroorganismus zu lenken. In diesen Vehikeln ist die DNA-Sequenz operabel mit Promotorsystemen verbunden, die ihre Expression steuern. Die Erfindung richtet sich weiterhin auf replizierbare Expressionsvehikel und die so erzeugten Transformantmikroorganismen sowie auf Kulturen dieser Mikroorganismen in Fermentationsmedien. Die vorliegende Erfindung richtet sich weiterhin auf damit verbundene Verfahren und Einrichtungen und auf spezifische Ausführungsformen für die gelenkte Erzeugung von Messenger-RNA-Transkripten, die für wirksame ribosomale Translation zugänglich sind.
Von der vorliegenden Erfindung ausgeschlossen ist beispielsweise die Hybrid-DNA, die für menschliches Wachstumshormon (HGH) kodiert, wie von Goeddel et al., Nature 281, 544 (1979) geoffenbart. Während diese spezielle Hybrid-DNA erfolgreich exprimiert wurde, um das beabsichtigte Produkt zu erzeugen, haben diese Forscher die Idee der vorliegenden Erfindung nicht wahrgenommen (und somit nicht gelehrt), und sie wurde folglich bei der zufälligen Herstellung ihrer exprimierbaren Hybrid-DNA für HGH nicht praktisch angewendet. Diese Hybrid-DNA weist die folgende Sequenz auf (Tabelle 1): Tabelle 1
Die chemisch synthetischen DNA-Sequenzen hiervon erstrecken sich vorzugsweise von der ATG-Translationseinleitungsstelle und wahlweise stromabwärts davon in einem gegebenen Abstand, zur oder über die Transkriptionseinleitungsstelle (wie üblich mit +1 markiert) hinaus, und zu den Sequenzen stromabwärts, die für einen wesentlichen Teil des gewünschten Polypeptids kodieren. Vorzugsweise umfaßt die synthetische DNA aufwärts von etwa 75 oder mehr Nukleotidpaaren des strukturellen Gens, das etwa die proximalen (N-terminalen) 25 Aminosäuren des beabsichtigten Polypeptids darstellt. Bei besonders bevorzugten Ausführungsformen erstreckt sich die synthetische DNA-Sequenz von etwa der Translationseinleitungsstelle (ATG) zu etwa Nukleotid 75 des heterologen Gens. Anders ausgedrückt, die synthetische DNA-Sequenz umfaßt Nukleotidpaare von +1 (Transkriptionsingangsetzung) bis etwa Nukleotid 100 des Transkripts.
Wegen der Degeneration des genetischen Codes gibt es bei der Kodonwahl für jede gegebene Aminosäuresequenz wesentliche Freiheit. In Anbetracht dieser Freiheit ist die Zahl an unterschiedlichen DNA-Nukleotidsequenzen, die für jede gegebene Aminosäuresequenz kodieren, übermäßig groß, beispielsweise mehr als 2,6 · 10&sup5; Möglichkeiten für Somatostatin, das aus nur 14 Aminosäuren besteht. Wiederum schafft die vorliegende Erfindung Verfahren und Einrichtungen zum Auswählen bestimmter dieser DNA-Sequenzen, nämlich derjenigen, die funktionelles Produkt wirksam erzeugen. Für ein gegebenes Polypeptidprodukt hiervon schafft die vorliegende Erfindung Einrichtungen zum Auswählen aus der großen möglichen Anzahl derjenigen DNA-Sequenzen, die Transkripte schaffen, deren Konformationsstruktur eine Zugänglichkeit für operable und wirksame ribosomale Translation zuläßt.
Die Konformationsstruktur von mRNA-Transkripten ist eine Folge der Wasserstoffbindung zwischen komplementären Nukleotidsequenzen, die voneinander durch eine Sequenz aus nicht-komplementären Nukleotiden getrennt sein können. Derartiges Binden wird üblicherweise als sekundäre Struktur bezeichnet. Sogenannte tertiäre Strukturen können zur Konformation des Gesamtmoleküls beitragen. Es wird angenommen, daß diese Strukturen ein Ergebnis räumlicher Wechselwirkungen zwischen einem oder mehreren Abschnitten des Moleküls -sogenannten Stapelwechselwirkungen -- sind. In jedem Fall kann die Konformationsstruktur eines gegebenen mRNA-Moleküls bestimmt und gemessen werden. Des weiteren wurde nun entdeckt, daß bestimmte Niveaus an Konformationsstruktur von mRNA-Transkripten die wirksame Proteinsynthese beeinträchtigen, wodurch die Ingangsetzung und/oder Fortsetzung der Translation (Verlängerung) in Polypeptidprodukt wirksam blockiert wird. Demgemäß können Niveaus, bei denen derartige Konformationsstruktur nicht auftritt oder zumindest minimal ist, vorhergesagt werden. Nukleotidwahl kann auf der Basis der vorhersehbaren zulässigen Mengen an Konformationsstruktur vorgeschrieben und bevorzugte Gensequenzen entsprechend bestimmt werden.
Die Messung der mRNA-Konformationsstruktur wird gemäß vorliegender Erfindung bestimmt, indem die mit der Konformationsstruktur des mRNA-Moleküls verbundenen Energieniveaus gemessen werden.
Beim Bestimmen derartiger Energieniveaus wird die thermodynamische Disassoziationsenergie, die mit einer oder eine Reihe homologer Basenpaarungen verbunden ist, berechnet, beispielsweise nach den Regeln von Tinoco et al., Nature New Biol 246, 40(1973). Bei der hierin verwendeten Berechnung (nicht der von Tinoco et al., oben), wird AT-Basenpaarung ein damit verbundenes Energieniveau von etwa -1,2 Kcal/Mol zugeschrieben, während einer CG-Basenpaarung ein damit verbundenes Energieniveau von etwa -2 Kcal/Mol zugeschrieben wird. Angrenzende homologe Paarungen sind mehr als additiv, zweifellos aufgrund von Stapelwechselwirkungen und anderen assoziativen Faktoren. Jedenfalls ist festgestellt worden, daß in den Fällen, in denen nach dieser Berechnung regionale Basenpaarungswechselwirkungen zu Energieniveaus über etwa -12 kcal/Mol für eine gegebene homologe Sequenz führen (d. h. Werten, die arithmetisch in Zahlen unter etwa -12 kcal/Mol ausgedrückt werden), derartige Wechselwirkungen wahrscheinlich ausreichen, um die Translationsphase der Expression zu behindern oder zu blockieren, am wahrscheinlichsten, indem sie die Zugänglichkeit für notwendige ribosomale Bindung stören.
Eine gegebene DNA-Sequenz wird folgendermaßen gescreent: Eine erste Reihe von Basenpaaren, z. B. etwa die ersten sechs Basenpaare, werden auf Homologie mit den entsprechenden letzten Umkehrbasenpaaren des Gens verglichen. Wenn derartige Homologie festgestellt wird, werden die damit verbundenen Energieniveaus nach den obigen Überlegungen berechnet. Die erste Reihe von Basenpaaren wird dann mit den entsprechenden letzten Basenpaaren bis zum vorletzten Basenpaar des Gens verglichen und die assoziativen Energieniveaus jeglicher Homologie berechnet. In der Folge wird die erste Reihe von Basenpaaren dann mit der entsprechenden Anzahl an Basenpaaren bis zum drittletzten Basenpaar verglichen, und so weiter bis die die gesamte Gensequenz von hinten nach vorne verglichen ist. Als nächstes wird die Reihe von Basenpaaren, die eins stromabwärts von der ersten Reihe beginnt, z. B. Basenpaare 2 bis 7 des vorhergehenden Beispiels, mit der entsprechenden Anzahl vom Ende und allmählich das Gen nach vorne verglichen, wie oben beschrieben. Dieser Vorgang wird wiederholt, bis jedes Basenpaar auf Homologie mit allen anderen Bereichen des Gens verglichen ist und assoziierte Energieniveaus bestimmt sind. So werden beispielsweise in Fig. 3 die Ergebnisse eines derartigen Scannings und das Berechnen für zwei Gene geliefert - die für natürliches Rinderwachstumshormon (BGH) und synthetisches (d. h. Hybrid-) BGH kodierenden. Es ist zu sehen, daß natürliches BGH zwei Homologiebereich enthält, die hierin für relevant gehalten werden (d. h. nach dieser Berechnung Energieniveau über etwa -12 kcal/Ml), nämlich 6 Basenpaare von Basenpaar 33 bis 38 mit homologen Paaren 96 bis 101 und sechs Basenpaare von 46 bis 51 mit 73 bis 78. Ersteres ist für den vorliegenden Zweck nicht von Bedeutung, trotz des Energieniveaus (-15,40 kcal/Mol), vermutlich, weil der Homologiebereich in ausreichendem Abstand stromabwärts liegt, um die Translationswirksamkeit nicht zu beeinflussen. Der zweite Bereich ist von Bedeutung, was von den schlechten Produktausbeuten wie hierin beschrieben (vergl. unten) bewiesen wird. Das synthetische BGH-Gen, worin ein derartiger Homologiebereich eliminiert wurde, schuf gute Ausbeuten des beabsichtigten Proteins.
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird nun als Beispiel unter Bezugnahme auf die beiliegenden Zeichnungen beschrieben, worin:
Fig. 1 die Aminosäure- und Nukleotidsequenzen der proximalen Abschnitte von natürlichem BGH, synthetischem HGH und synthetischem BGH darstellt. Die Aminosäuren und Nukleotide in natürlichen BGH, die sich von denen in synthetischem HGH unterscheiden, sind unterstrichen. Die Nukleotide im proximalen Abschnitt des synthetischen BGH-Gens, die sich von denjenigen im natürlichen BGH-Gen unterscheiden, sind ebenfalls unterstrichen. Die Position der PVUII-Restriktionsstelle am Ende des proximalen Abschnitts dieser Gene ist angezeigt.
Beim Erreichen des synthetischen BGH-Gens, das für die richtige Aminosäuresequenz für BGH kodiert, wurden die Nukleotidsequenzen von natürlichem BGH und synthetischem HGH verglichen. Nukleotidselektionen wurden auf der Basis des synthetischen HGH-Gens zur Konstruktion des synthetischen BGH-Gens durchgeführt, wobei auch der durch die Degeneration des genetischen Codes zugelassene Spielraum berücksichtigt wurde, wobei ein Minimum an Nukleotidveränderungen von der synthetischen HGH-Sequenz verwendet wurde.
Fig. 2 stellt die Nukleotidsequenzen der gleichsinnigen Stränge sowohl natürlicher als auch synthetischer BGH-Gene gemeinsam mit den transkribierten Abschnitten der jeweiligen vorangehenden trp-Promotorsequenzen dar. Das erste Nukleotid eines jeden Transkripts ist als "+1" angegeben, und die folgenden Nukleotide sind der Reihe nach nummeriert. Die Sequenzen sind aneinandergereiht, um zu den translatierten Kodierungsbereichen beider Gene zu passen, beginnend am Startkodon "ATG" eines jeden (überstrichen). Das Transkript des natürlichen BGH-Gens zeigt ein Gebiet mit "sekundärer Struktur" aufgrund der Wechselwirkungen der Nukleotide 46 bis 51 jeweils mit den Nukleotiden 73 bis 78 (siehe Fig. 3), wodurch die dargestellte Stammschleifenstruktur entsteht. Dieses Gebiet ist im synthetischen BGH-Gen nicht vorhanden, sondern durch Nukleotidveränderungen entfernt (siehe Fig. 1), das dennoch die korrekte Aminosäuresequenz beibehält.
Fig. 3 zeigt die Positionen und Stabilitäten sekundärer Strukturen in den Transkripten von natürlichem und synthetischem BGH. (Siehe Fig. 2). Diese Positionen und Stabilitäten wurden unter Verwendung eines Nukleotids durch Nukleotidanalyse, wie hierin beschrieben, bestimmt. Jedes Gebiet mit bedeutender sekundärer Struktur eines jeden proximalen Genabschnitts ist in der jeweiligen Tabelle angeführt. So ist für natürliches BGH gegenüber synthetischen BGH festzustellen, daß die Energieniveaus der "sekundären Struktur" an entsprechenden Abschnitten der translatierbaren Transkripte (nämlich Nukleotide 46 bis 78, die einen 6 Nukleotide langen Stamm enthalten, in natürlichem BGH, gegenüber den Nukleotiden 52 bis 84 von synthetischem BGH) sich deutlich unterscheiden (nach dieser Berechnung -15,2 kcal/Mol gegenüber mehr als -10 kcal/Mol), was für den beobachteten Erfolg der Expression des synthetischen BGH-Gens gegenüber dem natürlichen BGH-Gen verantwortlich ist, vergl. unten. Die Energieniveaus geben die Bedeutung der relativen Mengen an tolerierbarer "sekundärer Struktur" an, d. h. nach dieser Berechnung Werte über mehr als etwa -12 kcal/Mol auf Basis thermodynamischer Energieüberlegungen. Die Bedeutung der Position von "sekundärer Struktur" kann durch die Tatsache verdeutlicht werden, daß für die Positionen 33 bis 101 gegenüber 38 bis 104 von jeweils natürlichem gegenüber synthetischem BGH berechnete Energieniveaus die Expressionsmengen nicht wesentlich beeinflußten.
Fig. 4 stellt die Konstruktion von pBGH 33 wie in Fig. 5 gezeigt verwendet dar.
Fig. 5 stellt die Konstruktion von Plasmiden dar, die DNA-Sequenzen für Hybridpolypeptide enthalten: pBHGH 33-1, wie in Fig. 7 gezeigt verwendet, wobei pBHGH ein Hybrid von Rinder- und menschlichem Wachstumshormonsequenzen, und pHBGH ein Hybrid von menschlichen und Rinder-Sequenzen ist.
Fig. 6 stellt die Technik dar, die eingesetzt wird, um den synthetischen proximalen Abschnitt des BGH-Gens, pBR 322-01 zusammenzusetzen, das in der in Fig. 7 gezeigten Konstruktion verwendet wird.
Fig. 7 stellt die Konstruktion des Plasmids (pBGH 33-3) dar, welches das Gen für BGH enthält, das den synthetischen proximalen Abschnitt wie in Fig. 6 gezeigt umfaßt.
Fig. 8 stellt die Konstruktion von Expressionsplasmid pBGH 33-4 dar, welches das Hybrid-BGH-Gen enthält.
Fig. 9 ist das Ergebnis einer Polyacrylamidgelsegregation von Zellprotein. Teil A zeigt keine BGH-Produktion bei irgendeiner Zelldichte, wenn die natürliches BGH-Gen enthaltende Kultur verwendet wird. Teil B zeigt die Expression von synthetischem BGH-Gen (Bahnen BGH Nr.1 und Nr.2) im selben Medium wie für Teil A verwendet. Die in Teil B angegebenen Expressionsmengen spiegeln, im Gegensatz zu Teil A, die Produktion von BGH in Mengen über etwa 100000 Kopien pro Zelle wider.
In ihrer am meisten bevorzugten Ausführungsform wird die Erfindung durch die mikrobielle Produktion von Rinderwachstumshormon (BGH) veranschaulicht. BGH ist bei Rindern, z. B. Vieh, endogen, und ist für die richtige körperliche Reifung des Tiers verantwortlich. Es ist auch nützlich zur Verstärkung der Gewichtszunahme, Futterverwertungsrate, Verhältnis mageres Fleisch zu Fett und Milchproduktion. Seine Sequenz aus 190 Aminosäuren ist bekannt. Siehe Dayhoff, Atlas of Protein Sequence and Structure 1972, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C. Die vorliegende Erfindung macht die Herstellung kommerzieller Mengen der Verbindung möglich, wodurch es jetzt im großen Maßstab in der Tierzuchtindustrie eingesetzt werden kann. Ein erster Ansatz zur mikrobiellen Herstellung von BGH nutzte eine Quelle aus Rinder-Hirnanhangdrüsen. Durch Extraktion und Reinigung wurde die erforderliche mRNA für BGH isoliert und aus ihr entsprechende cDNA hergestellt. So führte diese erste Arbeit zu einem Gen, das für alle Absichten und Zwecke der natürlichen DNA-Sequenz von BGH entsprach. Nach dem Entfernen der für die Präsequenz kodierenden DNA und dem Hinzufügen eines Startkodons wurde die cDNA unter geeigneter Steuerung eines Promotors an einen Plasmidvektor ligiert. Dieses Plasmid wurde verwendet, um E.coli-Wirt zu transformieren, der unter herkömmlichen Bedingungen gezogen wurde. Die Wirksamkeit der Expression von BGH-Produkt war gering, was, wie entdeckt wurde, eine Folge der Konformationsstruktur der Messenger-RNA war, die seine Zugänglichkeit für ribosomale Translation stark verringerte, vergl. Fig. 3.
Beispielsweise wurde festgestellt, daß es in "natürlicher" BGH-mRNA Bereiche mit komplementärer Homologie gibt. Eine bedeutende Region hat ihr Zentrum um die Positionen +46 bis +51 mit einem homologen Bereich an den Positionen +73 bis +78. Es wird angenommen, daß Faktoren der sekundären Struktur in diesen beiden definierten Bereichen eine Haarnadelanordnung unmittelbar stromabwärts vom Translations-Startkodon ATG und der Ribosombindungsstelle erzeugen. Diese Konformationsanordnung stört oder unterbricht vorzeitig die ribosomale Bindung und hemmt so die Translation.
Das Erkennen dieses Phänomens gab den Anstoß für Untersuchungen über die Art der DNA-Sequenz in diesen Bereichen und die Entdeckung von Verfahren und Einrichtungen, um das Problem zu überwinden. Erfindungsgemäß wurde eine Pvu-II-Endonuklease-Restriktionsstelle an der BGH-DNA eingesetzt, die Aminosäure 24 entspricht. DNA für die ersten 24 Aminosäuren von BGH wurde chemisch synthetisiert, wobei bei der Wahl der Nukleotide streng auf die richtige Kodierungssequenz und resultierende mRNA Sekundär-/Tertiärstruktur geachtet wurde. Unter Einsatz des oben definierten Verfahrens wurde festgestellt, daß bestimmte Nukleotidbasenselektionen auf der Basis vorhergesagter Konformationsstruktur-Energieniveaus geeignet wären, um Gensequenzen herzustellen, die richtig für BGH kodieren, aber keine problematische Konformationsstruktur aufweisen. Eine davon wurde ausgewählt und synthetisiert. Ligationen am Pvu-II-Terminus des synthetischen Stücks an die cDNA stromabwärts davon erzeugte das gewünschte Hybridgen. Die Konstruktion eines replizierbaren Expressionsvektors, der das genannte heterologe Gen als ein operables Insert enthielt, führte erfolgreich zu wirksamer Expression von BGH in transformiertem E.coli-Wirt.
Die vollständige Nukleotid- (und abgeleitete Aminosäure-)Sequenz des so konstruierten Hybrid-BGH-Gens sieht folgendermaßen aus:

Detaillierte Beschreibung

Synthese des proximalen Abschnitts des BGH-Gens

12 Fragmente, U 1-6 (oberer Strang) und L 1-6 (unterer Strang) wurden synthetisiert. Ebenfalls synthetisiert, um das 3'-Ende des Gens zu reparieren, wurden 2 Fragmente, BGH-Repair (1) (oberer Strang) und BGH-Repair (2) (unterer Strang).
Die 14 Fragmente wurden nach dem Verfahren von Crea et al., Nucleic Acids Research, 8, 2331 (1980) synthetisiert. Die Synthesen der Fragmente wurden durch sequentielles Hinzufügen der geeigneten vollständig geschützten Dimer- oder Trimer-Blöcke vom geeigneten festen Träger (Zellulose) erreicht. Die Zyklen wurden unter den gleichen Bedingungen wie bei der Synthese von Oligothymidilsäure (siehe Crea et al., oben) beschrieben durchgeführt. Das Endpolymer wurde mit Base (wässeriges konzentriertes NH&sub3;) und Säure (80% wässeriges HOAC) behandelt, das Polymer abpelletiert und der Überstand zur Trockene abgedampft. Der Rückstand, wie in 4% wässerigem NH&sub3; aufgelöst, wurde mit Äther gewaschen (3x) und zur Isolation des vollständig schutzlos gemachten Fragments verwendet. Reinigung wurde durch HPLC auf Rsil NH&sub2;u-Teilchen-Säule durchgeführt. Analyse mittels Gelelektrophorese zeigte, daß jedes der Fragmente U,L 1-6 und BGH Reparatur (1) und (2) die richtige Größe aufwies: Fragment Sequenz Größe Reparatur

Konstruktion von pBGH 33 (Fig. 4)

Frische gefrorene Rinderhirnanhangdrüsen wurden mazeriert, und RNA wurde nach dem Guanidium-Thiocyanat-Verfahren (Harding et al., J.Biol.Chem. 252 (20), 7391 (1977) und Ullrich et al., Science 196, 1313 (1977)) extrahiert. Der gesamte RNA-Extrakt wurde dann über eine Oligo-dT-Zellulosesäule geschickt, um Poly-A zu reinigen, das Messenger-RNA (mRNA) enthielt. Unter Verwendung von Umkehrtranskriptase und Oligo-dT als Primer wurde einstrangige cDNA aus der mRNA hergestellt. Synthese des zweiten Stranges wurde unter Verwendung des Klenow-Fragments von DNA-Polymerase I durchgeführt. Nach S1-Enzymbehandlung und Acrylamidgelelektrophorese wurde ein aus der gesamten cDNA geschnittenes Stück (etwa 500-1500 bp) eluiert und die Pst-I-Stelle des amp®-Gens von pBR 322 geklont, wobei herkömmliche Schwänzungs- und Ringschlußbedingungen eingesetzt wurden.
Die cDNA enthaltenden pBR-322-Plasmide wurden in E.coli K-12 Stamm 294 umgewandelt (ATCC Nr. 31446). Kolonien, die rekombinante Plasmide enthielten, wurden aufgrund ihrer Resistenz gegen Tetrazyklin und Empfindlichkeit für Ampicillin ausgewählt. Etwa 2000 dieser Klone wurden durch Koloniehybridisierung auf BGH gescreent.
Die cDNA-Klone von HGH enthalten ein inneres 550 bp HaeIII-Fragment. Die Aminosäuresequenz dieses Bereich ist der BGH-Aminosäuresequenz sehr ähnlich. Dieses HGH-HaeIII-Fragment wurde radioaktiv markiert und als eine Sonde verwendet, um die entsprechende BGH-Sequenz unter den 2000 Klonen zu finden.
Acht positive Klone wurden identifiziert. Einer davon, pBGH112, wurde durch Sequenzanalyse als BGH verifiziert. Dieser Klon voller Länge ist 940 bp lang und enthält den Kodierungsbereich der 26 Aminosäuren-Präsequenz sowie der 191 Aminosäuren-Proteinsequenz.
Um direkte BGH-Expression zu erreichen, wurde ein synthetischer "Expressionsprimer" mit der Sequenz 5'-ATGTTCCCAGCCATG-3' hergestellt. Die Nukleotide in der vierten bis fünfzehnten Position sind mit den Kodonen der ersten 4 Aminosäuren des reifen BGH-Proteins identisch, wie durch Sequenzdaten von pBGH 112 nachgewiesen. Nur das 5' ATG (Methionin) ist diesem Bereich des Proteins fremd. Das war notwendig, um den Präsequenz-Bereich unseres BGH-Klons zu eliminieren und um das richtige Ingangsetzungskodon für Proteinsynthese zu schaffen. Durch eine Reihe enzymatischer Reaktionen wurde dieser synthetische Primer an der BGH-112-cDNA-Einfügung verlängert. Das geprimte Produkt wurde mit Pst I gespalten, um ein DNA-Fragment mit 270 bp zu ergeben, das Kodierungsinformation bis zu Aminosäure 90 enthielt (Fig. 4). Dieses "Expressions"-BGH-cDNA-Fragment wurde in einen pBR 322-Vektor ligiert, der den trp-Promotor enthielt. Dieser Vektor wurde von pLeIF A trp 25 abgeleitet (Goeddel et al., Nature 287, 411 (1980)). Die Interferon-cDNA wurde entfernt und der trp25-322-Vektor durch Gelelektrophorese gereinigt. Das rekombinante Plasmid (pBGH710) enthielt nun die Kodierungsinformation für die Aminosäuren 1-90 des reifen BGH-Proteins, direkt mit dem trp-Promotor verbunden. Diese Verbindung wurde durch DNA-Sequenzanalyse verifiziert. Die zweite Hälfte des Kodierungsbereiches und des 3'-untranslatierten Bereiches wurde durch PstI-Restriktionsdigest und Acrylamidgelelektrophorese von pBGH112 isoliert. Dieses "Hinterende"-Fragment mit 540 bp wurde dann an der Stelle von Aminosäure 90 in pBGH710 ligiert. Rekombinante Plasmide wurden durch Restriktionsanalyse und DNA-Sequenzieren geprüft. Das rekombinante Plasmid, pBGH33, hatte den trp-Promotor +ber ATG direkt mit der vollständigen DNA-Kodierungssequenz für reifes BGH verbunden.

Konstruktion von pHGH 207-1

Plasmid pGM1 trägt das E.coli-Tryptophanoperon, welches die Löschung LE1413 enthält (G.F. Miozzari et al., (1978) J. Bacteriology 1457-1466)) und exprimiert somit ein Fusionsprotein, das die ersten 6 Aminosäuren des trp-Leaders und etwa das letzte Drittel des trp-E-Polypeptids (in der Folge gemeinsam als LE' bezeichnet) sowie das trp-D-Polypeptid in seiner Gesamtheit enthält, alle gesteuert vom trp-Promotor-Operator-System. Das Plasmid, 20 ug, wurde mit dem Restriktionsenzym PvuII digeriert, welches das Plasmid an 5 Stellen spaltet. Die Genfragmente wurden dann mit EcoRI-Linkern (bestehend aus einem selbst-komplementären Oligonukleotid der Sequenz pCATGAATTCATG) kombiniert, wodurch eine EcoRI-Spaltungsstelle für ein späteres Klonen in ein Plasmid geschaffen wurde, das eine EcoRI-Stelle enthält. Die von pGM1 erhaltenen 20 ug DNA-Fragmente wurden mit 10 Einheiten T&sub4;DNA-Ligase in Gegenwart von 200 Picomol des 5'-phosphorylierten synthetischen Oligonukleotids pCATGAATTCATG und in 20 ul T&sub4; DNA-Ligasepuffer (20mM tris, pH 7,6, 0,5 mM ATP, 10 mM MgCl&sub2;, 5mM Dithiotreitol) bei 4ºC über Nacht behandelt. Die Lösung wurde dann 10 Minuten lang bei 70ºC erwärmt, um Ligase zu inaktivieren. Die Linker wurden durch EcoRI-Digestion gespalten und die Fragmente, nun mit EcoRI-Enden, wurden unter Verwendung von Polyacrylamidgelelektrophorese (in der Folge "PAGE") abgetrennt und die drei größten Fragmente vom Gel isoliert, indem zuerst mit Ethidiumbromid gefärbt wurde, die Fragmente mit Ultraviolettlicht lokalisiert wurden und die interessierenden Abschnitte vom Gel abgeschnitten wurden. Jedes Gelfragment mit 300 ul 0,1·TBE wurde in einen Dialysebeutel gegeben und der Elektrophorese bei 100 V eine Stunde lang in 0,1·TBE-Puffer unterworfen (TBE-Puffer enthält: 10,8 g tris-Base, 5,5 g Borsäure, 0,09 g Na&sub2; EDTA in 1 Liter H&sub2;O). Die wässerige Lösung wurde aus dem Dialysebeutel gesammelt, mit Phenol extrahiert, mit Chloroform extrahiert und auf eine Gehalt von 0,2 M an Natriumchlorid gebracht, und die DNA nach Äthanolausfällung in Wasser gewonnen. (Alle in der Folge beschriebenen DNA-Fragment-Isolationen werden unter Verwendung von PAGE gefolgt vom gerade besprochenen Elektroeluierungsverfahren durchgeführt.) Das trp-Promotor-Operator enthaltende Gen mit EcoRI-klebrigen Enden wurde im als nächstes beschriebenen Verfahren identifiziert, welches das Einfügen von Fragmenten in ein Tetrazyklin-empfindliches Plasmid mit sich bringt, das, nach der Promotor-Operator-Einfügung, tetrazyklinresistent wird.
Plasmid pBRH1, (R.I. Rodriguez et al., Nucleic Acids Research 6, 3267-3287 1979) exprimiert Ampicillinresistenz und enthält das Gen für Tetrazyklinresistenz, exprimiert aber, da es keinen assoziierten Promotor gibt, diese Resistenz nicht. Das Plasmid ist demgemäß Tetrazyklin-empfindlich. Durch Einbringen eines Promotor-Operatorsystems in die EcoRI-Stelle kann das Plasmid tetrazyklinresistent gemacht werden.
pBRH1 wurde mit EcoRI digeriert und das Enzym durch Phenol/CHCl&sub3;-Extraktion gefolgt von Chloroformextraktion entfernt, und nach Äthanoiausfällung in Wasser gewonnen. Das resultierende DNA-Molekül wurde in getrennten Reaktionsmischungen mit jedem der drei wie oben beschrieben erhaltenen DNA-Fragmente kombiniert und mit T&sub4;-DNA-Ligase wie zuvor beschrieben ligiert. Die in der Reaktionsmischung vorhandene DNA wurde verwendet, um kompetentes E.coli K-12 Stamm 294 (K.Backman et al., Proc. Nat'l Acad.Sci. USA 73, 4174-4198 (1976) (ATCC Nr. 31446) nach Standardtechniken (V. Hershfield et al., (Proc Nat'l Acad Sci USA 71, 3455-3459 (1974)) zu transformieren, und die Bakterien auf LB-Platten plattiert, die 20 ug/ml Ampicillin und 5 ug/ml Tetrazyklin enthielten. Mehrere tetrazyklin-resistente Kolonien wurden ausgewählt, Plasmid-DNA isoliert und die Gegenwart des gewünschten Fragments durch Restriktionsenzymanalyse bestätigt. Das resultierende Plasmid, als pBRHtrp bezeichnet, exprimiert
Bezugszeichenliste
-Laktamase, die Ampicillinresistenz verleiht, und es enthält ein DNA-Fragment, das den trp-Promotor-Operator enthält und für ein erstes Protein kodiert, das eine Fusion der ersten sechs Aminosäuren des trp-Leaders und etwa das letzte Drittel des trp-E-Polypeptids umfaßt (dieses Polypeptid wird als LE' bezeichnet), und für ein zweites Protein, das etwa der ersten Hälfte des trp-D-Polypeptids entspricht, (dieses Polypeptid wird als D' bezeichnet), sowie für ein drittes Protein, für welches das Tetrazyklinresistenzgen kodiert.
pBRH trp wurde mit EcoRI-Restriktionsenzym digeriert, und das resultierende Fragment 1 durch PAGE und Elektroeluierung isoliert. Eco-RI-digeriertes Plasmid pSom 11 (K. Itakura et al., Science 198, 1056 (1977); GB-Patentveröffentlichung Nr. 2 007 676 A) wurde mit diesem Fragment 1 kombiniert. Die Mischung wurde mit T&sub4;-DNA-Ligase wie zuvor beschrieben ligiert, und die resultierende DNA in E.coli K-12 Stamm 294 transformiert, wie zuvor beschrieben. Transformantenbakterien wurden auf Ampicillin enthaltenden Platten ausgewählt. Resultierende Ampicillin-resistente Kolonien wurden durch Koloniehybridisierung (M. Gruenstein et al., Proc.Nat'l Acad Sci USA 72, 3951-3965 [1975]) gescreent, wobei als Sonde das von pBRHtrp isolierte trp-Promotor-Operator-hältige Fragment 1 verwendet wurde, das mit P³² radioaktiv markiert worden war. Mehrere durch Koloniehybridisierung als positiv gezeigte Kolonien wurden ausgewählt, Plasmid-DNA wurde isoliert und die Ausrichtung der eingefügten Fragmente durch Restriktionsanalyse bestimmt, wobei die Restriktionsenzyme BglII und BamHI in Doppeldigestion eingesetzt wurden. E.coli 294, welches das als pSOM7Δ2 bezeichnete Plasmid enthält, welches das trp-Promotor-Operator-Fragment in der gewünschten Ausrichtung aufweist, wurde in LB-Medium gezüchtet, das 10 ug/ml Ampicillin enthielt. Die Zellen wurden bis zur optischen Dichte 1 (bei 550 nM) gezüchtet, durch Zentrifugieren gesammelt und in M9-Medien in zehnfacher Verdünnung resuspendiert. Zellen wurden 2-3 Stunden lang gezüchtet wieder bis zu optischer Dichte 1, dann lysiert und das gesamte zellulare Protein durch SDS (Natriumdodecylsulfat)-Flächen(15 Prozent)-Polyacrylamidelektrophorese (J.V. Maizel Jr. et al., Meth Viral 5, 180-246 (1971)) analysiert.
Das Plasmid pSom7Δ2, 10 ug, wurde mit EcoRI gespalten und das DNA-Fragment 1, das die genetischen Tryptophan-Elemente enthielt, wurde durch PAGE und Elektroeluierung isoliert. Dieses Fragment, 2 ug, wurde mit der Restriktionsendonuklease Taq I, 2 Einheiten, 10 Minuten lang bei 37º C digeriert, sodaß durchschnittlich nur eine der etwa fünf Taq 1-Stellen in jedem Molekul gespalten ist. Diese teilweise digerierte Mischung von Fragmenten wurde durch PAGE abgetrennt und ein Fragment 2 mit etwa 300 Basenpaaren, das ein EcoRI-Ende und ein Taq 1-Ende enthielt, wurde durch Elektroeluierung isoliert. Die entsprechende Taq 1-Stelle ist zwischen den Transkriptions-Start- und Translations-Start-Stellen angeordnet und befindet sich 5 Nukleotide stromaufwärts vom ATG-Kodon des trp-Leaderpeptids. Die DNA-Sequenz um diese Stelle wird in Fig. 4 gezeigt. Durch die beschriebene Vorgangsweise konnte ein Fragment isoliert werden, das alle Steuerelemente des trp-Operons enthält, d. h. Promotor-Operator-System, Transkriptions-Ingangsetzungssignal und Teil der trp-Leaderribosombindungsstelle.
Der Taq 1-Rest am 3'-Ende des resultierenden Fragments angrenzend an das Translationsstartsignal für die trp-Leadersequenz wurde dann in eine XbaI-Stelle umgewandelt. Das wurde gemacht, indem das oben erhaltene Fragment 2 an ein Plasmid ligiert wurde, das eine einzige Eco RI-Stelle und eine einzige XbaI-Stelle enthielt. Zu diesem Zweck kann im wesentlichen jedes Plasmid eingesetzt werden, daß, der Reihe nach, ein Replikon, eine selektierbare Markierung wie Antibiotikaresistenz und EcoRI-, XbaI- und BamHI-Stellen enthält. So kann beispielsweise zwischen der EcoRI- und BamHI-Stelle von pBR322 eine XbaI-Stelle eingefügt werden (F. Bolivar et al., Gene 2, 95-119 [1977]), indem z. B. an der einzigen Hind III-Stelle des Plasmids mit Hind III gespalten wird, gefolgt von einzelstrangspezifischer Nukleasedigestion der resultierenden klebrigen Enden, und Stumpfendligation eines sich selbst zum Ring schließenden doppelstrangigen synthetischen Nukleotids, das die Erkennungsstelle wie CCTCTAGAGG enthielt. Alternativ dazu können natürlich abgeleitete DNA-Fragmente eingesetzt werden, wie das im vorliegenden Fall geschah, die eine einzelne XbaI-Stelle zwischen den EcoRI- und BamHI-Spaltungsresten enthalten. So wurde ein EcoRI- und BamHI-Digestionsprodukt des viralen Genoms von Hepatitis B auf herkömmliche Weise erhalten und in die EcoRI- und BamHI-Stellen von Plasmid pGH6 geklont (D.V. Goeddel et al., Nature 281, 544 [1979])), um das Plasmid pHS32 zu bilden. Plasmid pHS32 wurde mit XbaI gespalten, mit Phenol extrahiert, mit Chloroform extrahiert und mit Äthanol ausgefällt. Es wurde dann mit 1 ul E.coli Polymerase I, Klenow-Fragment (Boehringer-Mannheim) in 30 ul Polymerasepuffer (50 mM Kaliumphosphat pH 7,4 7mM MgCl&sub2;, 1 mM β-Mercaptoäthanol), das 0,1 mM dTTP und 0,1mM dCTP enthielt, 30 Minuten lang bei 0ºC und dann 2 Stunden lang bei 37ºC behandelt. Diese Behandlung verursacht 2 der 4 Nukleotide, die für das 5' vorragende Ende der XbaI-Spaltungsstelle komplementär sind, die aufzufüllen ist:
Zwei Nukleotide, dC und dT, wurden eingeschlossen, was ein Ende mit zwei 5' vorragenden Nukleotiden ergab. Dieser lineare Rest von Plasmid pHS32 (nach Phenol- und Chloroformextraktion und Gewinnung in Wasser nach Äthanolausfällung) wurde mit EcoRI gespalten. Das große Plasmidfragment wurde durch PAGE vom kleineren EcoRI-Xbal-Fragment abgetrennt und nach dem Elektroeluieren isoliert. Dieses DNA-Fragment von pHS32 (0,2 ug) wurde unter den oben beschriebenen ähnlichen Bedingungen an das EcoRI-Taq 1-Fragment dieses Tryptophanoperons (0,01 ug) ligiert. Bei diesem Vorgang wird das Taq I vorragende Ende an das XbaI verbleibende vorragende Ende ligiert, obwohl es nicht vollkommen Watson-Crick basengepaart ist:
Eine Teilmenge dieser Ligationsreaktionsmischung wurde wie in Teil I, oben, in E.coli 294 Zellen transformiert, wärmebehandelt und auf LB-Platten plattiert, die Ampicillin enthielten. 24 Kolonien wurden ausgewählt, in 3 ml LB-Medien gezogen und Plasmid isoliert. Bei 6 davon wurde festgestellt, daß die XbaI-Stelle über E.coli katalysierte DNA-Reparatur und Replikation:
regeneriert war.
Von diesen Plasmiden wurde auch festgestellt, daß sie sowohl mit EcoRI als auch HpaI spalteten und die erwarteten Restriktionsfragmente ergaben. Ein als pTrp14 bezeichnetes Plasmid 14 wurde zur Expression heterologer Polypeptide verwendet, wie als nächstes besprochen.
Das Plasmid pHGH 107 (D.V. Goeddel et al, Nature, 281, 544, 1979) enthält ein Gen für menschliches Wachstumshormon, das aus 23 Aminosäurekodonen, die aus synthetischen DNA-Fragmenten erzeugt waren, und 163 Aminosäurekodonen bestand, die aus komplementärer DNA erhalten wurden, die durch Umkehrtranskription von Messenger-RNA von menschlichem Wachstumshormon erzeugt wurden. Dieses Gen 3, enthält, obwohl ihm die Kodone der "Prä-"Sequenz von menschlichem Wachstumshormon fehlen, ein ATG-Translationseinleitungskodon.
Dieses Gen wurde nach der Behandlung mit EcoRI aus 10 ug pHGH 107 isoliert, gefolgt von E.coli Polymerase I Klenow-Fragment und dTTP und dATP wie oben beschrieben. Nach der Extraktion mit Phenol und Chloroform und Äthanolausfällung wurde das Plasmid mit BamHI behandelt. Das menschliches Wachstumshormon("HGH")-Gen enthaltende Fragment 3 wurde durch PAGE isoliert, gefolgt von Elektroeluieren. Das resultierende DNA-Fragment enthält auch die ersten 350 Nukleotide des Tetrazyklinresistenz-strukturellen Gens, ihm fehlt aber das Tetrazyklin-Promotor-Operator-System, so daß, wenn es daraufhin in ein Expressionsplasmid geklont wurde, Plasmide, welche die Einfügung enthalten, durch die Wiederherstellung der Tetrazyklinresistenz lokalisiert werden können. Weil das EcoRI-Ende des Fragments 3 nach dem Klenow-Polymerase-I-Verfahren aufgefüllt worden ist, weist das Fragment ein stumpfes und ein klebriges Ende auf, wodurch die richtige Ausrichtung gewährleistet ist, wenn es später in ein Expressionsplasmid eingefügt wird.
Als nächstes wurde das Expressionsplasmid pTrp14 hergestellt, um das oben hergestellte HGH-Gen-enthaltende Fragment aufzunehmen. So wurde pTrp14 XbaI-digeriert und die resultierenden klebrigen Enden mit dem Klenow-Polymerase I-Verfahren aufgefüllt, wobei dATP, dTTP, dGTP und dCTP verwendet wurden. Nach der Extraktion mit Phenol und Chloroform und Äthanolausfällung wurde die resultierende DNA mit BamHI behandelt und das resultierende große Plasmidfragment durch PAGE und Elektroeluierung isoliert. Das pTrp14-abgeleitete Fragment wies ein stumpfes und ein klebriges Ende auf, wodurch die Rekombination in richtiger Ausrichtung mit dem zuvor beschriebenen HGH-Gen enthaltenden Fragment 3 ermöglicht wurde.
Das HGH-Genfragment 3 und das pTrp14 Xba-BamHI-Fragment wurden unter den oben beschriebenen ähnlichen Bedingungen kombiniert und miteinander ligiert. Die eingefüllten XbaI- und EcoRI-Enden wurden durch Stumpfendenligation aneinander ligiert, um sowohl die XbaI- als auch die EcoRI-Stelle wiederherzustellen: aufgefülltes XbaI aufgefülltes EcoRI HGH-Geneinleitung
Diese Konstruktion stellt auch das Tetrazyklinresistenzgen wieder her. Da das Plasmid pHGH 107 Tetrazyklinresistenz von einem Promotor exprimiert, der stromaufwärts des HGH-Gens liegt (der lac-Promotor), ermöglicht diese als pHGH 207 bezeichnete Konstruktion die Expression des Gens für Tetrazyklinresistenz unter der Steuerung des Tryptophan-Promotor-Operators. So wurde die Ligationsmischung in E.coli 294 transformiert und Kolonien auf LB-Platten ausgewählt, die 5 ug/ml Tetrazyklin enthielten.

Konstruktion von pBGH33-1 (Fig. 5)

Es wird die Struktur von pHGH207-1 gezeigt, das die gesamte menschliche Wachstumshormongensequenz aufweist. Der vordere Teil dieses Gens ist synthetisch, wie von Goeddel et al, Nature 281, 544 (1979) beschrieben. Im folgenden wurde ein Plasmid konstruiert, welches das BGH-Gen in der gleichen Ausrichtung und in der gleichen Position bezogen auf den trp-Promotor enthält, wie das beim HGH-Gen in pHGH 207-1 der Fall ist.
20 ul (d. h. 10 ug) der Plasmid-DNA wurde folgendermaßen mit BamHI und PvuII digeriert: Zu 20 ul DNA wurden 5 ul 10X-Restriktionsenzympuffer (500 mM NaCl, 100 mM Tris HCl,pH 7,4, 100 mM MgSO&sub4; und 10 mM DTT), 20 ul H&sub2;O und 10 Einheiten BamHI Restriktionsenzym und 2 ul PvuII-Restriktionsenzym hinzugefügt.
Daraufhin wurde diese Reaktionsmischung bei 37ºC 90 Minuten lang inkubiert. Die Mischung wurde auf ein 6% Acrylamidgel geladen und Elektrophorese wurde 2 Stunden lang bei 50 mA durchgeführt. Die DNA im Gel wurde mit Ethidiumbromid gefärbt und mit UV-Licht sichtbar gemacht. Das Band, das dem 365 bp (bezogen auf HaeIII-Digest von pBR322) Fragment entsprach, wurde ausgeschnitten und in einen Dialysebeutel eingebracht, und die DNA wurde unter Verwendung eines Stroms von 100 mA elektroeluiert. Die Flüssigkeit wurde vom Beutel entfernt und ihre Salzkonzentration auf 0,3 M NaCl eingestellt. Zwei Volumina Äthanol wurden hinzugefügt und die DNA bei -70ºC ausgefällt. Die DNA wurde in einer Eppendorf-Zentrifuge abzentrifugiert, mit 70% Äthanol gewaschen und getrocknet und in 10 ul TAE (10 mM Tris HCl, pH 7,4, 0,1 mM EDTA) resuspendiert. Auf ähnliche Weise wurden das große Xbal-BamHI-Fragment von pHGH 207-1 und das XbaI, teilweise PvuII 570 bp Fragment von pBGH33 isoliert.
2 ul eines jeden der so isolierten DNA-Fragmente wurden gemischt. 1 ul 10 mM ATP und 1 ul 10x Ligasepuffer (200 mM Tris HCl, pH 7,5, 100 mM MgCl&sub2;, 20 mM DTT) und 1 ul T&sub4; DNA-Ligase und 2 ul H&sub2;O wurden hinzugefügt. Die Ligation wurde über Nacht bei 4ºC durchgeführt. Diese Mischung wurde verwendet, um kompetente E.coli K-12 294 Zellen folgendermaßen zu transformieren: 10 ml L-Brühe wurde mit E.coli K-12 294 geimpft und bei 37ºC in einem Schüttelbad bei 37ºC inkubiert. Bei OD&sub5;&sub5;&sub0; von 0,8 wurden die Zellen durch Zentrifugieren in einer Sorvall-Zentrifuge für 5 min bei 6000 UpM geerntet. Das Zellpellet wurde gewaschen/in 0,15 M NaCl resuspendiert und wieder zentrifugiert. Die Zellen wurden in 75 mM CaCl&sub2;, 5 mM MgCl&sub2; und 10 mM Tris HCl, pH 7,8, resuspendiert und zumindest 20 Minuten lang auf Eis inkubiert. Die Zellen wurden 5 min lang bei 2500 UpM abzentrifugiert und im gleichen Puffer resuspendiert. Zu 250 ul dieser Zellsuspension wurde jede der Ligationsmischungen hinzugefügt und 60 Minuten lang auf Eis inkubiert. Die Zellen wurden 90 Sekunden bei 42ºC mit Wärmeschock behandelt, abgeschreckt, und es wurden 2 ml L-Brühe hinzugefügt. Man ließ die Zellen durch Inkubation bei 37ºC 1 Stunde lang rasten. 100 ul dieser Zellsuspension wurden auf geeignete Platten plattiert, die daraufhin über Nacht bei 37ºC inkubiert wurden. Die Plasmidstruktur in mehreren der so erhaltenen Kolonien wird in Fig. 5 gezeigt (pBGH 33-1).
Alle weiteren Konstruktionen wurden nach dem gleichen Verfahren wie oben beschrieben mutatis mutandis durchgeführt.

Konstruktion der Hybrid-Wachstumshormon-Gene HBGH und BHGH (Fig. 5)

Die beiden PvuII-Stellen in den HGH- und BGH-Genen befinden sich an identischen Positionen. Der Austausch von PvuII-Fragmenten ist ohne Veränderung des Leserasters der Messenger-RNA dieser Gene möglich. Der große Unterschied bei der Expression der beiden Gene ist auf die Unterschiede der Einleitung der Proteinsynthese am Beginn der Botschaften zurückzuführen. Deshalb wurde der vordere Teil der beiden Gene ausgetauscht, wodurch Hybridgene konstruiert wurden, die nach der Transkription Hybrid-Messenger-RNAs ergaben. Die beiden Plasmide pBHGH und pHBGH wurden folgendermaßen konstruiert:
Von pHGH207-1 wurden das große BamHI-XbaI-Fragment und das 857 bp BamHI (teilweise) PvuII-Fragment isoliert, welches das HGH-Gen ohne seinen vorderen Teil enthielt. Von pBGH33-1 wurde das 75 bp XbaI-PvuII-Fragment isoliert, das den vorderen Teil des BGH-Gens enthält. Nach Ligation und Transformation wurde pBHGH erhalten. pHBGH wurde auf ähnliche Weise wie pBHGH konstruiert; in diesem Fall wurde der hintere Teil von pBGH33-1 abgeleitet, während der vordere Teil, das 75 bp XbaI-PvuII-Fragment, von pHGH207-1 abgeleitet wurde.

Aufbau und Klonen des synthetischen Vorderteils des BGH-Gens (Fig. 6)

Die DNA-Sequenz bis zur PvuII-Stelle der BGH- und HGH-Gene kodiert für 22 Aminosäuren. Da der Vorderteil des HGH-Gens hervorragende Proteinsynthese-Ingangsetzungseigenschaften aufwies, war die Sequenz des vorderen Teils von BGH so aufgebaut, daß die Anzahl an Nukleotidveränderungen im BGH-Gen bezogen auf das HGH-Gen minimal waren. Nur 14 Basenpaar-Änderungen von der natürlichen BGH-Sequenz wurden durchgeführt, um für die richtige BGH-Aminosäuresequenz zu kodieren und die Konformationsstruktur in der voraussichtlichen mRNA zu reduzieren. Die DNA-Sequenz wird in Fig. 6 gezeigt. Die Sequenz endet mit klebrigen EcoRI- und HindIII-Enden, um das Klonen in einen Vektor einfach zu machen. Nahe der HindIII-Stelle befindet sich eine PvuII-Stelle für die richtige Verbindung mit dem verbleibenden Teil des BGH-Gens.
Die Fragmente U1 bis U6 und L1 bis L6 wurden nach den oben beschriebenen Verfahren chemisch synthetisiert. Alle Fragmente mit Ausnahme von U1 und U6 wurden gemischt und kinasiert. Nach dem Hinzufügen von U1 und L6 wurden die gemischten Fragmente ligiert, auf einem 6%-Polyacrylamidgel gereinigt und das 75 bp-Band nach herkömmlichen Verfahren extrahiert und isoliert. Dieses Fragment wurde in pBR322 eingefügt, das mit EcoRI und HindIII geschnitten worden war. So wurde Plasmid pBR322-01 erhalten.

Ersetzen des natürlichen vorderen Teils des BGH-Gens durch den synthetischen vorderen Teil (Fig. 7)

Von pBR322-01 wurde der geklonte synthetische Vorderteil des BGH-Gens mit EcoRI und PvuII ausgeschnitten, und das resultierende 70 bp-Fragment wurde isoliert. Von pBGH33-1 wurde das große EcoRI-BamHI-Fragment und das 875 bp BamHI (teilweise) PvuII-Fragment wurde isoliert. Die drei Fragmente wurden isoliert und ligiert und verwendet, um E.coli K-12 294 wie zuvor beschrieben zu transformieren. So wurde pBGH33-2 erhalten. Dieses Plasmid enthält das gesamte BGH-Gen, hat aber keinen Promotor. Deshalb wurde pBGH33-2 mit EcoRI geschnitten und der trp-Promotor, der 310 bp von pHGH207-1 abgeleitetes 310 bp EcoRI-Fragment enthielt, wurde durch Ligation eingefügt. Nach der Transformation wurden tetrazyklinresistente Kolonien analysiert. Deshalb hatten diese Kolonien den eingefügten trp-Promotor hin zum HGH- und tet-Gen ausgerichtet, wie in der Figur gezeigt.

Reparatur des 3'-Endes des BGH-Gens (Fig. 8)

Die Sequenzen über die zweite PvuII-Stelle des BGH-Gens hinaus, sind vom HGH-Gen abgeleitet. Eine der Aminosäuren am Ende unterscheidet sich von der im natürlichen BGH-Gen. Dieses 3'-Ende wurde folgendermaßen repariert. Ein synthetisches DNA-Fragment wie gezeigt wurde synthetisiert. Es wird von einem EcoRI- und einem HindIII-Ende flankiert, um das Klonen zu erleichtern, und enthält eine PvuII-Stelle und 3 Aminosäurekodone und ein Stopkodon im Leseraster des BGH-Gens selbst. Dieses Fragment wurde in EcoRI-HindIII- geöffnetes pBR322 eingefügt. So wurde pBR322-02 erhalten. Daraufhin wurde dieses Plasmid mit PvuII und BamHI geschnitten, und das 360 bp Fragment wurde isoliert. Von pBGH33-3, welches das gesamte BGH-Gen mit dem synthetischen vorderen Teil aufweist, wurde das große BamHI- und XbaI-Fragment und das 570 bp XbaI (teilweise) PvuII-Fragment isoliert. Diese drei Fragmente wurden ligiert und verwendet, um Zellen zu transformirene. So wurde pBGH33-4 erhalten. In diesem Plasmid ist eine einzelne HindIII-Stelle zwischen dem Stopkodon des BGH-Gens und dem Startkodon der tet-mRNA vorhanden. Beide Gene werden unter der Lenkung des trp-Promotors transkribiert.
Ein typisches Wachstumsmedium, das verwendet wird, um hohe Mengen an BGH pro Liter zu dereprimieren und zu erzeugen, (Fig. 9) enthält: 5,0 g (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 6,0 g K&sub2; HPO&sub4;, 3,0 g NaH&sub2; PO&sub4;·2H&sub2;O, 1,0 g Natriumzitrat, 2,5 g Glukose, 5 mg Tetrazyklin, 70 mg Thiamin-HCl und 60 g MgSO&sub4;·7H&sub2;O.
Während die vorliegende Erfindung in ihren bevorzugten Ausführungsformen unter Bezugnahme auf die Verwendung von E.coli-Transformanten beschrieben worden ist, wird anerkannt werden, daß andere Mikroorganismen mutatis mutandis verwendet werden können. Beispiele dafür sind andere E.coli-Organismen, z. B. E.coli B., E.coli W3110 ATCC Nr. 31622 (F&supmin;,λ-, gal&supmin;, prototroph), E.coli x 1776, ATCC Nr. 31537, E.coli D1210, E.coli RV308, ATCC Nr. 31608 usw., Bacillus subtilis-Stämme, Pseudomonas-Stämme usw. und verschiedene Hefearten, z. B. Saccharomyces cerevisiae, von denen viele bei anerkannten Hinterlegungsinstituten, z. B. ATCC hinterlegt und (potentiell) von diesen verfügbar sind. Nach der Praxis der vorliegenden Erfindung und der endgültigen Expression des beabsichtigten Polypeptidprodukts können Extraktions- und Reinigungstechniken die an sich bekannten sein, die üblicherweise auf diesem Gebiet eingesetzt werden.

Claims

1. Verfahren zum Verbesseren der Translationswirksamkeit einer mikrobiellen Messenger-RNA, die für ein heterologes funktional es Polypeptid oder einen bioaktiven Abschnitt davon kodiert, wobei das Verfahren umfaßt:

(a) das Bestimmen der thermodynamischen Energien regionaler Basenpaarungswechselwirkungen in der Messenger-RNA, die einer DNA-Sequenz innerhalb des Bereiches entspricht, der sich von der Transkriptionseinleitungsstelle zum Nukleotid +100 der DNA erstreckt, die für den N-terminalen Abschnitt des genannten Polypeptids kodiert;

und gemäß der genannten Bestimmung,

(b) das Schaffen einer synthetischen DNA-Sequenz, die dadurch gekennzeichnet ist, daß die Nukleotide davon so ausgewählt sind, daß bei der Transkription entsprechende Messenger-RNA geschaffen wird, die für eine Sequenz von Aminosäuren kodiert, die jene umfassen, für welche die DNA-Sequenz von Schritt

(a) kodiert, und die, dank der Unterschiede zur Sequenz der Messenger-RNA, auf die in Schritt (a) bezuggenommen wird, verringerte regionale Basenpaarungswechselwirkung zeigt, die zu erhöhter Wirksamkeit der ribosomalen Translation führt; und

(c) das Ligieren der DNA von Schritt (b) in richtige Leserasterbeziehung mit DNA, die für den C-terminalen Abschnitt des genannten Polypeptids kodiert, um DNA zu schaffen, die für eine Aminosäuresequenz kodiert, welche die natürliche Sequenz des genannten Polypeptids umfaßt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Messenger-RNA von Schritt (b) innerhalb des Bereiches von Nukleotid +1 bis +100 frei von sekundärer Struktur ist, die eine thermodynamische Energie aufweist, die arithmetisch geringer oder gleich groß wie die thermodynamische Energiestruktur ist, die durch homologe Basenpaarung zwischen den Nukleotiden 46 bis 51 und den Nukleotiden 73 bis 78 der mRNA von natürlichem BGH, wie in Fig. 2 hiervon abgebildet, gebildet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin das erste Nukleotid der genannten DNA-Sequenz von Schritt (b) dem Nukleotid +1 der entsprechenden Messenger-RNA entspricht.

4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin das erste Nukleotid der genannten DNA-Sequenz von Schritt (b) einem Nukleotid des translationalen Startsignals entspricht.

5. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin die genannte DNA-Sequenz von Schritt (b) sich von etwa dem translationalen Startsignal bis etwa 75 oder mehr Nukleotide stromabwärts davon erstreckt.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das genannte heterologe funktionale Polypeptid Rinderwachstumshormon ist.

7. Verfahren nach Anspruch 6, worin dem Rinderwachstumshormon die BGH-Präsequenz fehlt.

8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die DNA-Sequenz von Schritt (b) wie in Fig. 1 als "BGH-synthetisch" dargestellt ist.

9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die resultierende DNA-Sequenz gemeinsam mit auf geeignete Weise angeordneten translationalen Start- und Stopsignalen in einen mikrobiellen Expressionsvektor eingefügt wird und darin unter die Kontrolle eines mikrobiell operablen Promotors gebracht wird, um ein entsprechendes mikrobielles Expressionsvehikel zu schaffen.

10. Verfahren nach Anspruch 9, worin ein Mikroorganismus mit dem genannten mikrobiellen Expressionsvehikel transformiert wird, um den entsprechenden transformierten Mikroorganismus zu schaffen.

11. Verfahren nach Anspruch 10, worin der resultierende transformierte Mikroorganismus unter geeigneten Fermentationsbedingungen gezüchtet wird und dazu gebracht wird, das genannte Polypeptid zu erzeugen, wobei das genannte Polypeptid in der Folge aus dem Fermentationsmedium rückgewonnen wird.

12. Verfahren zur Herstellung von Rinderwachstumshormon, welches das Kultivieren eines Mikroorganismus umfaßt, um darin enthaltene DNA zu exprimieren, die für ein reifes Rinderwachstumshormon kodiert, worin die Kodierungssequenz innerhalb des Bereiches bis zu Nukleotid +100 der mRNA von jener der natürlichen mRNA-Sequenz von Rinderwachstumshormon geändert worden ist, ohne aber die natürliche Aminosäuresequenz zu ändern, so daß die resultierende mRNA eine Konformationsstruktur aufweist, die, verglichen mit der Verwendung der entsprechenden natürlichen Rinderwachstumshormonkodierungssequenz, die Expression des Hormons im genannten Mikroorganismus weniger stört.

13. Verfahren zur Herstellung von Rinderwachstumshormon, welches das Kultivieren eines Mikroorganismus umfaßt, um darin enthaltene DNA zu exprimieren, die für ein reifes Rinderwachstumshormon kodiert, worin die Kodierungssequenz innerhalb der etwa 25 N-terminalen Aminosäuren durch synthetische DNA geschaffen wird, deren Nukleotidsequenz von jener der natürlichen Nukleotidsequenz von Rinderwachstumshormon geändert worden ist, ohne aber die natürliche Aminosäuresequenz zu ändern, so daß die resultierende mRNA eine Konformationsstruktur aufweist, die, im Vergleich zur Verwendung der entsprechenden natürlichen Rinderwachstumshormonkodierungssequenz, die Expression des Hormons im genannten Mikroorganismus weniger stört.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 13, worin die Nukleotide, die für Alanin innerhalb der Prolin-Alanin-Methionin-Sequenz nahe des N-Terminus des Hormons kodieren, GCT sind, und nicht die GCC der natürlich auftretenden Rinderwachstumshormon-DNA.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 14, worin der genannte Mikroorganismus ein E.coli-Stamm ist.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 15, worin das Rinderwachstumshormon gewonnen und gereinigt wird.