DE69231306T2

DE69231306T2 - Fermentationsverfahren zur Herstellung von Peptiden durch einen Wirt

Info

Publication number: DE69231306T2
Application number: DE69231306T
Authority: DE
Inventors: John Edward Fitton; Robert Craig Hockney; Bhuphendra Vallabh Kara
Original assignee: Zeneca Ltd
Current assignee: AstraZeneca UK Ltd
Priority date: 1991-02-26
Filing date: 1992-02-21
Publication date: 2001-01-11
Anticipated expiration: 2012-02-22
Also published as: ATE195142T1; US5547867A; IE920586A1; JPH05236988A; FI920836A0; JP3325597B2; IL101059A0; DE69231306D1; EP0501692B1; AU661983B2; NO920752L; EP0501692A3; FI920836A; GB2253210B; NO920752D0; AU1114592A; EP0501692A2; NZ241705A; GB2253210A; CA2061797A1

Description

Fermentationsverfahren

Diese Erfindung betrifft das Gebiet der Biotechnologie und betrifft insbesondere Verfahren zur Herstellung löslicher rekombinanter Moleküle.
Wenn rekombinante Proteine in bakteriellen Wirten wie E. coli erzeugt werden, wird die Fermentation allgemein unter Bedingungen durchgeführt, die das Wachstum begünstigen, d. h. bei einer Temperatur von ca. 37ºC und einem pH von ca. 6,8. Das Fermentationsverfahren wird gewöhnlich in einem Medium durchgeführt, das diejenigen Nährstoffe enthält, die die Erfordernisse für das bakterielle Wachstum des Wirtes erfüllen. Typischerweise schließt das Wachstumsmedium Kohlenstoff- und Stickstoffquellen zur Synthese von Zellkomponenten und Energie, Ionen wie Sulfat, Phosphat, Magnesium, Calcium, Eisen und verschiedene Spurenelemente ein. Hefeextrakt liegt ebenfalls häufig als Komponente des Wachstumsmediums vor. Z. B. enthält Luria-Bouillon ca. 0,5% Hefeextrakt zusätzlich zu Trypton und Natriumchlorid. Kürzlich wurde berichtet (X. Li, J. W. Robbins und K. B. Taylor: Journal of Industrial Microbiology, 5, 85-94, 1990), daß, wenn Luria-Bouillon mit Hefeextrakte angereichert wird, so daß sie 1 bis 3% Hefeextrakt enthält, die Biomasse und β-Galactosidase-Expression zunimmt. Es wurde ebenfalls berichtet (L. B. Tsai et al., Journal of Industrial Microbiology, 2, 181-187, 1987), daß rekombinanter menschlicher Insulin-artiger Wachstumsfaktor als Einschlußkörper hergestellt werden kann, indem Hefeextrakt und Glucose in die Fermentations-Bouillon in einem Fed-Batch- Verfahren (Zulaufverfahren) eingeleitet werden.
US-A-4 894 334 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von Ricin A, worin die Kultivierung bei 37ºC und bei einem pH von 6,8 durchgeführt wird und eine 2%ige Lösung von Caseinhydrolysat hinzugegeben wird, wenn die Turbidität des Wachstumsmediums etwa ein OD&sub6;&sub8;&sub0; von 10 ist.
Wenn viele Polypeptide durch rekombinante DNA-Technologie in E. coli hergestellt werden, wird das Polypeptid in einer unlöslichen Form erhalten, z. B. als unlösliche Aggregate oder Einschlußkörper. Falls dieses Material verwendet werden soll, muß es löslich gemacht werden, um eine Renaturierung in die biologisch aktive Form zu erlauben. Dieser Solubilisierungsschritt erfordert allgemein die Verwendung von Chemikalien, wie Detergentien oder chaotropen Mitteln, die zu verwenden schwierig und kostenintensiv ist und die zu einer chemischen Modifizierung des Proteins führen können.
Die Herstellung von unlöslichem Material neigt dann aufzutreten, wenn rekombinantes Ricin A hergestellt wird. Z. B. wird in EP 237 676 berichtet, daß die Expression von Ricin A in E. coli bei 37ºC und pH 6,8 zu unlöslichem Material führt, das durch Behandlung mit einer Mischung aus Harnstoff und SDS solubilisiert werden muß. EP 237 676 berichtet, daß lösliches Ricin A erzeugt wird, wenn die kodierende Sequenz für Ricin A in den direkten Leserahmen mit der DNA plaziert wird, die die Leitsequenz für das Struktur- Gen der alkalischen Phosphatase (phoA) von E. coli K12 kodiert.
Ricin und Moleküle vom Ricin-Typ, wie Abrin, sind bekannte Verbindungen, die von Pflanzenzellen erzeugt werden und die cytotoxische Eigenschaften besitzen. Toxine dieser Art bestehen aus zwei Polypeptid-Ketten, die über eine Disulfid- Brücke verbunden sind. Eine der Polypeptid-Ketten (die "A- Kette") ist hauptsächlich verantwortlich für die cytotoxischen Eigenschaften des Toxin-Moleküls; während die andere Polypeptid-Kette (die "B-Kette") die Bindung des Toxin-Moleküls an Zelloberflächen ermöglicht.
Die Toxizität von Ricin hängt von drei unterscheidbaren Fällen ab:
(i) Bindung des Ricin-Moleküls an die Zelloberfläche durch Wechselwirkung von Galactose- Bindungsstellen auf der B-Kette mit Glycoproteinen oder Glycolipiden, die an der Zelloberfläche freiliegen;
(ii) Eindringen wenigstens der A-Kette in das Cytosol der Zelle; und
(iii) enzymatische Spaltung von RNA in der 60S- Untereinheit des Ribosoms, was zur Inhibierung der Protein- Synthese und letztendlich zum Zelltod führt.
Es wird ebenfalls angenommen, daß die B-Kette eine wichtige sekundäre Funktion spielt, abgesehen von ihrer primären Funktion der Bindung des Ricin-Moleküls an die Zelloberfläche, indem sie die Aufnahme von Ricin in die Zelle erleichtert. So sind getrennte A- und B-Ketten im wesentlichen nichttoxisch, da die B-Kette nicht cytotoxisch ist und der A-Kette die Fähigkeit zur Bindung an Zelloberflächen und zum Eindringen in das Cytosol der Zelle in Abwesenheit der B-Kette fehlt.
Es wurde bereits vorgeschlagen, daß die Toxizität der A-Kette von Ricin nützlich in der Antitumor-Therapie sein könnte, falls die unterschiedslos bindende B-Kette durch einen unterschiedlichen Träger ersetzt werden könnte, der die Fähigkeit zur bevorzugten Bindung an Tumorzellen gegenüber normalen Zellen hat. So wurde vorgeschlagen, daß ein Immuntoxin, das Ricin A und einen Tumor spezifischen Antikörper umfaßt, von Nutzen in einer Antitumor-Therapie sein kann.
Die Herstellung der A-Kette von Ricin aus natürlichen Quellen, wie aus den Samen von Ricinus communis, ist schwierig. Es ist insbesondere schwierig, Ricin A zu reinigen, d. h. die A-Kette von der B-Kette zu trennen.
Obwohl es möglich ist, Polypeptide wie Ricin A durch rekombinante DNA-Technologie herzustellen, besteht dennoch ein Bedarf an verbesserten Verfahren für die Herstellung löslicher Polypeptide. Insbesondere besteht ein Bedarf an verbesserten Verfahren zur Herstellung von löslichem Ricin A.
Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids bereitgestellt, wobei das Verfahren umfaßt: Kultivieren eines Wirtes, der das Polypeptid exprimieren kann, in einem Wachstumsmedium und Kultivieren des Wirtes für einen Anfangszeitraum bei einem ersten pH-Wert, der das Wachstum des Wirtes begünstigt, so daß Polypeptid erzeugt wird; Einstellen des pH auf einen zweiten Wert, der die Anreicherung von löslichem Polypeptid begünstigt, und Kultivieren des Wirtes für einen weiteren Zeitraum bei dem zweiten pH-Wert; und gegebenenfalls Reduzieren der Temperatur des Wachstumsmediums während des Endbereiches der Kultivierung; so daß lösliches Polypeptid erhalten werden kann.
Insbesondere kann das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von Polypeptiden verwendet werden, die dazu neigen, wenigstens teilweise in einer unlöslichen Form erzeugt zu werden.
Besondere Beispiele für Polypeptide, die unter Verwendung der vorliegenden Erfindung erzeugt werden können, schließen z. B. Ricin A oder ein Analogon davon ein.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids bereitgestellt, wobei das Verfahren das Kultivieren eines Wirtes, der zur Expression des Polypeptids fähig ist, und das Einstellen des pH während des Verfahrens derart umfaßt, daß lösliches Polypeptid erhalten werden kann. Insbesondere wird ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids bereitgestellt, wobei das Verfahren umfaßt: Kultivieren eines Wirtes, der zur Expression des Polypeptids fähig ist, in einem Wachstumsmedium für einen Anfangszeitraum bei einem ersten pH-Wert, der das Wachstum des Wirtes begünstigt; Einstellen des pH auf einen zweiten Wert, der die Anreicherung von löslichem Polypeptid begünstigt, und Kultivieren des Wirtes für einen weiteren Zeitraum bei dem zweiten pH-Wert.
In Verfahren, in denen die Temperatur reduziert wird, wird das Verfahren allgemein das Kultivieren der Wirtszellen bei einer Temperatur, die das Wachstum der Wirtszellen und die Erzeugung von löslichem Polypeptid begünstigt, das Abkühlen des Wachstumsmediums (und somit des Wirtes) während des Endbereiches der Kultivierung und das Ernten des Wirtes während des Endbereiches umfassen.
Die Temperatur ist bevorzugt eine solche, die die Aufrechterhaltung des Polypeptids in einer löslichen Form begünstigt.
Geeignete Temperaturen, die das Wachstum von bakteriellen Zellen begünstigen, wie E. coli, sind diejenigen von ca. 25 bis ca. 39ºC (z. B. 37 oder 38ºC), wobei die optimale Temperatur ca. 37ºC beträgt. Die Temperatur sollte bevorzugt eine solche sein, die zur Erzeugung von löslichem Polypeptid führt, und so wird die Temperatur allgemein unterhalb 40ºC liegen. Allgemein ist es bevorzugt, daß, wenn die Temperatur reduziert wird, die Wirtszellen auf eine Temperatur unterhalb von ca. 25ºC abgekühlt werden, z. B. auf eine Temperatur im Bereich von ca. 10ºC (oder darunter) bis ca. 25ºC.
Es ist bevorzugt, daß das Abkühlen an dem Punkt bewirkt wird, an dem die Anreicherung von löslichem Polypeptid (wie Ricin A) innerhalb der Zellen hoch ist, und am meisten bevorzugt bei oder nahe der maximalen spezifischen Aktivität.
Es ist allgemein bevorzugt, daß, wenn der pH eingestellt wird, der Wirt, der zur Expression des Polypeptids fähig ist, in einem Wachstumsmedium für einen Anfangszeitraum bei einem ersten pH-Wert kultiviert wird, der das Wachstum des Wirtes begünstigt, und der pH auf einen zweiten Wert eingestellt und der Wirt für einen weiteren Zeitraum bei diesem zweiten Wert kultiviert wird. Der pH kann in einer Anzahl von Arten eingestellt werden, z. B. kann er in einem Schritt oder in einer Reihe von Schritten eingestellt werden. Der zweite pH kann z. B. einen Wert umfassen, der die Anreicherung von löslichem Polypeptid begünstigt, indem er die Aufrechterhaltung und Gewinnung von Polypeptid in einer löslichen Form erleichtert.
Somit wird in einer besonderen Ausführungsform ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids bereitgestellt, wobei das Verfahren umfaßt: Kultivieren eines Wirtes, der zur Expression des Polypeptids fähig ist, bei einem ersten pH- Wert und bei einer Temperatur, die das Wachstum des Wirtes und die Erzeugung von löslichem Polypeptid begünstigt, Einstellen des pH während des Verfahrens auf einen zweiten pH-Wert und gegebenenfalls Abkühlen des Wirtes während des Endbereichs der Kultivierung und Ernten des Wirtes, der lösliches Polypeptid enthält, während des Endbereichs.
Im Falle von Ricin A wird der pH allgemein so eingestellt, daß der zweite pH-Wert niedriger als der erste pH-Wert sein wird. Für andere Polypeptide kann der zweite pH-Wert größer oder kleiner als der erste Wert sein, abhängig von der Natur des Polypeptids.
In einer besonderen Ausführungsform wird der Wert des pH, wenn der pH eingestellt wird, von einem ersten Wert auf einen zweiten Wert verändert, der niedriger als der erste Wert ist. Wie oben angegeben kann der pH in einer Anzahl von Arten erniedrig werden, z. B. kann er in einem Schritt oder in einer Reihe von Schritten erniedrigt werden.
Es ist allgemein z. B. bevorzugt, daß der pH vom ersten Wert auf den zweiten Wert in einem kurzen Zeitraum eingestellt wird, und insbesondere kann der pH direkt vom ersten Wert zum zweiten Wert eingestellt werden.
Besondere Werte für den pH während des Anfangszeitraums der Kultivierung schließen z. B. diejenigen im Bereich von ca. 6 bis 8 ein. Ein bevorzugter Wert für den pH während des Anfangszeitraums beträgt z. B. 6,7 oder ca. 6,7. Werte des pH, die ca. 6,7 sind, schließen z. B. Werte von 6,7 +/- 0,1 ein und schließen somit einen Wert von 6,8 ein.
Besondere Werte für den pH während des weiteren Zeitraums der Kultivierung sind diejenigen im Bereich von ca. 5,5 bis 8 und insbesondere im Bereich von ca. 6 bis 8. Wenn z. B. der pH während des Anfangszeitraums, d. h. der erste Wert, ca. 6,7 beträgt, ist ein besonderer Wert für den pH während des weiteren Zeitraums derjenige, der einen Wert besitzt, der niedriger als 6,7 und größer als ca. 5,5 ist (speziell ein Wert von mehr als oder gleich ca. 6,0).
Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Ricin A oder einem Analogon davon bereit. Somit wird erfindungsgemäß ein Verfahren zur Herstellung von Ricin A oder einem Analogon davon bereitgestellt, wobei das Verfahren umfaßt: Kultivieren eines Wirtes, der zur Expression von Ricin A oder einem Analogon davon fähig ist, in einem Nährmedium für einen Anfangszeitraum bei einem ersten pH-Wert, der das Wachstum des Wirtes begünstigt; und Kultivieren des Wirtes für einen weiteren Zeitraum bei einem niedrigeren pH als dem ersten pH-Wert; und gegebenenfalls Abkühlen des Wirtes während des Endbereichs der Kultivierung und Ernten des Wirtes während des Endbereichs.
Analoga von Ricin A schließen Polypeptide ein, die eine cytotoxische Aktivität aufweisen und die eine Primärstruktur besitzen, die mit Ricin A in dem Sinne verwandt ist, daß sie sich von der von Ricin A durch eine oder mehrere Aminosäure- Änderungen (Deletionen, Additionen, Substitutionen) unterscheidet, die nicht in einem Verlust der cytotoxischen Aktivität resultieren. Die Herstellung von Wirten, die zur Expression von Ricin A fähig sind, wird z. B. beschrieben in EP 145 111; WO 85/3508; und Lamb et al., Eur. J. Biochem., 1985, 148, S. 265-270.
Wie oben angegeben können Polypeptide, die cytotoxische Eigenschaften besitzen, wie Ricin A, zur Herstellung von Immuntoxinen zur Verwendung in der Behandlung von Tumoren verwendet werden. Allgemein umfassen solche Immuntoxine einen für den zu behandelnden Tumor spezifischen Antikörper und das Toxin. Ein Beispiel für die Herstellung eines Immuntoxins wird in der veröffentlichten PCT Patentanmeldung Nr. WO 85/003508 beschrieben.
Es ist allgemein bevorzugt, daß z. B. der Wirt bakterielle Zellen wie E. coli-Zellen umfaßt. Für den Fall von Ricin A ist es bevorzugt, daß der Wirt einen E. coli-Stamm umfaßt, wie DS410.
Der Wirt wird allgemein in einem Medium kultiviert, das diejenigen Nährstoffe enthält, die die Erfordernisse für das Zellwachstum des Wirtes erfüllen. Somit wird das Medium allgemein Kohlenstoff- und Stickstoff-Quellen zur Synthese von Zellkomponenten und Energie, Ionen wie Sulfat, Phosphat, Magnesium, Calcium, Eisen und Spurenelemente einschließen.
Es ist bevorzugt, daß Hefeextrakt zum Fermentationsmedium während des Fermentationsverlaufs hinzugegeben wird. Die Zufuhrmöglichkeiten für den Hefeextrakt schließen die unten genannten ein.
Der Wird wird eine DNA-Sequenz einschließen, die für das Polypeptid (wie Ricin A oder ein Analogon davon) kodiert und die unter der Kontrolle geeigneter Kontrollsequenzen steht, wie eine Promotorsequenz, eine Ribosom-Bindungsstelle und eine Transkriptions-Terminatorsequenz. Besondere Beispiele für geeignete Promotorsequenzen sind der Tryptophan-(trp)- Promotor und der T7A3-Promotor. Andere Promotoren, wie der lac- oder tac-Promotor, können ebenfalls verwendet werden. So kann der Wirt z. B. eine DNA-Sequenz einschließen, die für Ricin A kodiert und die unter der Kontrolle des trp- oder T7A3-Promotors steht.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfaßt das erfindungsgemäße Verfahren eine Fermentation vom "Fed-Batch- Typ".
Der hier verwendete Begriff eines Verfahren vom "Fed-Batch- Typ" bezeichnet ein Fermentationsverfahren, in dem das Ansatz-Wachstumsmedium einen Nährstoff, wie eine Kohlenstoff- Quelle, oder eine Anzahl von Nährstoffen enthält, die nach Verbrauch das Wachstum des Mikroorganismus beschränken werden. Wenn der Nährstoff oder die Nährstoffe verbraucht sind, wird eine Zufuhr des Nährstoffs/der Nährstoffe eingeleitet. Der Zeitpunkt, an dem es notwendig wird, diesen Nährstoff zuzuführen, entspricht dem Einsetzen von Fed-Batch- Bedingungen. Das Fermentationsmedium kann mit anderen Nährstoffen während oder in Stufen während der Fermentation versorgt werden.
Wenn das Verfahren ein Fed-Batch-Fermentationsverfahren umfaßt, kann der pH am oder vor dem Punkt verringert werden, an dem Fed-Batch-Bedingungen erreicht werden, bevorzugt bevor die Fed-Batch-Bedingungen erreicht sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Fermentationsverfahren vom Fed-Batch-Typ zur Herstellung von Ricin A bereitgestellt, wobei das Verfahren das Kultivieren eines E. coli-Wirtes, der zur Expression von Ricin A fähig ist, bei einem pH-Wert von ca. 6,7 für einen Anfangszeitraum und das Kultivieren des Wirtes für einen weiteren Zeitraum bei einem pH von weniger als dem Wert von 6,7 umfaßt.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Fermentationsverfahren des Fed-Batch-Typs zur Herstellung von Ricin A oder einem Analogon davon bereitgestellt, wobei das Verfahren umfaßt: Kultivieren eines Wirtes, der zur Expression von Ricin A oder einem Analogon davon fähig ist, in einem Wachstumsmedium für einen Anfangszeitraum bei einem ersten pH-Wert und bei einer Temperatur, die das Wachstum des Wirtes und die Erzeugung von löslichem Ricin A oder Ricin A-Analogon begünstigt; Einstellen des pH, bevor Fed-Batch-Bedingungen erreicht sind, auf einen zweiten Wert, der niedriger als der erste Wert ist; und gegebenenfalls Abkühlen des Wachstumsmediums während des Endbereiches der Kultivierung auf eine Temperatur, die das Aufrechterhalten von Ricin A in einer löslichen Form begünstigt, und Ernten der Zellen während des Endbereiches.
Vor der Implementierung der in dieser Anmeldung beanspruchten Verfahren wurde gefunden, daß Fermentationsverfahren des Fed- Batch-Typs in verringerten Ausbeuten an löslichem Ricin A resultierten, das am Ende des Fermentationsverfahrens gewinnbar war. Es wurde überraschend gefunden, daß dann, wenn das Abkühlen bewirkt wird, bevor Fed-Batch-Bedingungen erreicht sind, hohe Gehalte an Polypeptid in löslicher Form aufrechterhalten werden können, wodurch die Gewinnung von löslichem Polypeptid vereinfacht wird.
Somit wird in einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Ricin A oder einem Analogon davon bereitgestellt, wobei das Verfahren umfaßt:
(a) Kultivieren eines Wirtes, der zur Expression von Ricin A oder einem Analogon davon fähig ist, in einem Wachstumsmedium bei einer Temperatur, die das Wachstum des Wirtes und die Erzeugung von löslichem Ricin A oder Ricin A-Analogon begünstigt;
(b) Abkühlen des Wachstumsmediums, bevor der Verbrauch eines für das Wachstum des Wirtes essentiellen Nährstoffs erreicht ist (d. h. Fed-Batch-Bedingungen erreicht sind), auf eine Temperatur, die nicht das Wachstum des Wirtes begünstigt; und
(c) Ernten der Zellen, bevor der Verbrauch des Nährstoffs erreicht ist.
Es ist ersichtlich, daß dieses Verfahren einem Fed-Batch- Verfahren ähnlich ist, in dem das Ernten stattfindet, bevor das Verfahren in die Fed-Batch-Phase eintritt. Somit ist der Punkt, an dem der Verbrauch eines für das Wachstum des Wirtes essentiellen Nährstoffs auftritt, Äquivalent zum Punkt, an dem Fed-Batch-Bedingungen erreicht werden. Das Abkühlen wird bewirkt, bevorzugt der Nährstoffverbrauch erreicht ist, und findet bevorzugt z. B. gerade bevor oder direkt bevor der Nährstoffverbrauch erreicht ist.
Der Wirt kann in einem Medium gezüchtet werden, das so formuliert ist, daß es bei einem OD&sub5;&sub5;&sub0; von ca. 50 kohlenstoffbegrenzt wird, und das den Wirt enthaltende Fermentationsmedium wird abgekühlt, wenn das OD&sub5;&sub5;&sub0; ca. 50 beträgt oder bevor das OD&sub5;&sub5;&sub0; 50 erreicht.
Insbesondere wenn es erwünscht ist, die Temperatur in einem Fed-Batch-Verfahren zur Herstellung von Ricin A zu reduzieren, kann das Verfahren die Schritte einschließen:
(a) Kultivieren eines E. coli-Wirtes, der zur Expression von Ricin A fähig ist, in einem Nährstoffmedium bei einer Temperatur im Bereich von ca. 37 bis ca. 39ºC;
(b) Abkühlen des Fermentationsmediums, bevor Fed-Batch- Bedingungen erreicht sind, auf eine Temperatur unterhalb ca. 25ºC; und
(c) Ernten der Wirtszellen, bevor Fed-Batch-Bedingungen erreicht sind.
Beispiele für besondere Temperaturen sind die oben genannten. Somit kann das Abkühlen auf eine Temperatur im Bereich von ca. 10 (oder darunter) bis ca. 25ºC sein.
Wie zuvor erwähnt kann Hefeextrakt hinzugegeben werden. Solche Verfahren schließen diejenigen ein, in denen die obigen Verfahren zur Kultivierung eines Wirtes, der zur Expression von Ricin A oder einem Analogon davon fähig ist, in einem Wachstumsmedium verwendet werden und in denen ein Ergänzungsmittel, das Hefeextrakt einschließt, zum Wachstumsmedium während der Kultivierung hinzugegeben wird.
Der Hefeextrakt kann im Wege einer einzelnen Charge, einer Reihe von Aliquoten oder einer im wesentlichen kontinuierlichen Zufuhr hinzugegeben werden. Der Hefeextrakt wird allgemein während der Wachstumsphase des Wirtes hinzugegeben werden. Es ist z. B. bevorzugt, daß die Zugabe des Ergänzungsmittels, das Hefeextrakt einschließt, bei einer vorher festgelegten Zeit nach dem dem Beginn der Kultivierung eingeleitet wird. Ein besonderes Beispiel dieses Zeitpunkts ist ein Punkt, der vor dem Erreichen von Fed-Batch- Bedingungen liegt.
Die Zugabegeschwindigkeit des Ergänzungsmittels, das Hefeextrakt umfaßt, ist bevorzugt derart, daß das Wachstumsmedium nicht an Hefeextrakt erschöpft wird. Wenn daher die Anfangszusammensetzung des Wachstumsmediums Hefeextrakt einschließt, dann wird die Zugabe des Ergänzungsmittels bevorzugt eingeleitet, bevor der in der Anfangszusammensetzung vorliegende Hefeextrakt verbraucht ist. Geeignete Geschwindigkeiten der Hefeextraktzufuhr schließen z. B. Zufuhrgeschwindigkeiten im Bereich von ca. 0,85 bis 3,4 g·l&supmin;¹h&supmin;¹ ein. Eine besondere Zufuhrgeschwindigkeit ist diejenige im Bereich von 1 bis 2 g·l&supmin;¹h&supmin;¹, besonders 1,7 g·l&supmin;¹h&supmin;¹.
Wie oben erwähnt können die Wirtszellen allgemein bakterielle Zellen umfassen, wie E. coli; und es ist z. B. bevorzugt, daß die Wirtszellen zur Expression von Ricin A fähig sind.
Die Fermentation wird allgemein bei einer Temperatur durchgeführt, die das Wachstum des Wirtes begünstigt. Eine besonders geeignete Temperatur, die das Wachstum von bakteriellen Zellen wie E. coli begünstigt, beträgt ca. 37ºC. Die Temperatur kann während der Kultivierung (speziell während des Endbereiches der Kultivierung) wie oben erwähnt reduziert werden.
Es wurde ebenfalls gefunden, daß der E. coli-Stamm DS410 überraschend effizient in der Produktion von löslichem Ricin A ist. Ebenfalls wie oben erwähnt ist es allgemein bevorzugt, daß der pH eingestellt und/oder die Temperatur reduziert wird.
Nach dem Ernten werden die Zellen zur Gewinnung des Ricin A verarbeitet. Diese Verarbeitung wird üblicherweise das Aufbrechen der Zellen, das Abtrennen des rohen Ricin A- Polypeptids von anderem proteinartigem Material durch einen oder mehrere Extraktionsschritte und die weitere Reinigung des Ricin A durch Gel-Filtration, Hochleistungs- Flüssigchromatographie oder andere herkömmliche Reinigungstechniken beinhalten.
Die erfindungsgemäßen Verfahren haben sich als vorteilhaft in der Herstellung von löslichen Polypeptiden erwiesen.
Im allgemeinen sind die erfindungsgemäßen Verfahren vorteilhaft in der Erzeugung und/oder Gewinnung von Polypeptid in einer löslichen Form. Insbesondere wurde gefunden, daß hohe Ausbeuten an löslichem Polypeptid erhalten werden können, indem der pH des Wachstumsmediums während des Verfahrens eingestellt wird. Es wurde ebenfalls unerwartet gefunden, daß dann, wenn das Wachstumsmedium während des Endbereichs der Kultivierung abgekühlt und die Zellen während dieses Endbereichs geerntet werden, hohe Ausbeuten an löslichem Polypeptid gewonnen werden können. Dieser Abkühlungsschritt hat sich als besonders vorteilhaft erwiesen, da er zu einem größeren Verfahrensspielraum führt, indem hohe Ausbeuten an löslichem Polypeptid selbst dann erhalten werden können, wenn eine Verzögerung vor dem Ernten auftritt. Fed-Batch-Verfahren, in denen der pH eingestellt wird und ein optionaler Abkühlungsschritt durchgeführt wird, haben sich als besonders vorteilhaft erwiesen.
In Verfahren, in denen das Polypeptid Ricin A ist, haben sich die erfindungsgemäßen Verfahren als besonders vorteilhaft erwiesen.
Die erhaltenen Ausbeuten an löslichem Ricin A haben sich als erhöht erwiesen, falls Hefeextrakt während des Verfahrens hinzugegeben wird. Es wurde unerwartet gefunden, daß Verfahren, in denen der pH ebenfalls eingestellt wird, und speziell Fed-Batch-Verfahren, in denen der pH eingestellt wird, hohe Ausbeuten an löslichem Ricin A ergeben.
Ebenfalls hat sich E. coli DS410 unerwartet als vorteilhaft in der Herstellung von löslichem Ricin A erwiesen. Es wurde ebenfalls gefunden, daß die Ausbeute erhöht wird, falls Hefeextrakt während des Verfahrens hinzugegeben wird.
Die Erfindung wird nun weiter allein beispielhaft unter Verweis auf die begleitenden Beispiele und Zeichnungen beschrieben, in denen gilt:
Fig. 1 veranschaulicht die Konstruktion von pICI 0020;
Fig. 2 veranschaulicht die Konstruktion von pTB344;
Fig. 3 veranschaulicht die Konstruktion von pICI 0042;
Fig. 4 veranschaulicht die Konstruktion von pICI 1079;
Fig. 5 veranschaulicht die Konstruktion von pICI 1187;
Fig. 6 veranschaulicht ein Coomassieblau-gefärbtes SDS-Gel von E. coli-Lysaten, in denen Spur A pICI 1102 ist; B pICI 0020 ist und C Molekulargewichtsmarker sind.
Fig. 7 veranschaulicht ein Gel-Profil von pICI 1102, in dem Peak R Ricin A darstellt;
Fig. 8 ist ein Western Blot von Ricin A, hergestellt durch pICI 1102, worin Spur 1 Molekulargewichtsmarker sind; 2 und 3 nicht-Ricin-erzeugende Klone sind; 4 pICI 1102 ist und 5 pICI 0020 ist (Kontrollplasmid-nicht-Ricin A-Sequenz);
Fig. 9 ist eine partielle Sequenz von pICI 1102;
Fig. 10 veranschaulicht die Konstruktion von pICI 1102;
Fig. 11 beschreibt ein in der Herstellung von Plasmiden verwendetes Fragment;
Fig. 12 ist eine Plasmid-Karte von pICI 0042;
Fig. 13 veranschaulicht die Sequenz eines Transkriptionsterminators;
Fig. 14 ist eine Plasmid-Karte von pICI 1079;
Fig. 15, 16 und 17 veranschaulichen die Wirkung der Fed- Batch-Fermentation auf Biomasse, Gesamt-Ricin-A-Anreicherung bzw. Ricin-A-Verteilung in der löslichen Fraktion für DS410;
Fig. 18, 19, 20 und 21 veranschaulichen die Wirkung von verschiedenen pH-Kontrollbereichen auf Biomasse- Konzentration, Gesamt-Ricin-A-Anreicherung, prozentuale Verteilung von löslichem Ricin A in der löslichen Fraktion bzw. Ausbeute an löslichem Ricin A.
Fig. 22 veranschaulicht die eingesetzten pH-Profile; und
Fig. 23, 24 und 25 veranschaulichen die Wirkung des Abkühlens.

Wachstumsmedium

Zusammensetzung von LCM50

Angesetzt mit destilliertem Wasser
g/l
KH&sub2;PO&sub4; 3,0
Na&sub2;HPO&sub4; 6,0
NaCl 0,5
Casein-Hydrolysat (Oxoid L41) 2,0
(NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; 10,0
Hefeextrakt (Difco) wie angegeben
Glycerin 35,0
MgSO&sub4; · 7H&sub2;O 0,5
CaCl&sub2; · 2H&sub2;O 0,03
Thiamin 0,008
FeSO&sub4;/Zitronensäure 0,04/0,02
Spurenelement-Lösung (TES) (0,5 ml l&supmin;¹)
Tetracyclin (10 mg l&supmin;¹)
Die Hefeextrakt-Konzentration im LCM50-Wachstumsmedium ist in jedem Beispiel angegeben.
Die Spurenelementlösung (TES) hat die folgende Zusammensetzung:
mg/10 ml entionisiertes Wasser
AlCl&sub3; · 6H&sub2;O 2,0
CoCl&sub2; · 6H&sub2;O 0,8
KCr(SO&sub4;)&sub2; · 12H&sub2;O 0,2
CuCl&sub2; · 2H&sub2;O 0,2
H&sub3;BO&sub3; 0,1
KI 2,0
MnSO&sub4; · H&sub2;O 2,0
NiSO&sub4; · 6H&sub2;O 0,09
Na&sub2;MoO&sub4; · 2H&sub2;O 0,4
ZnSO&sub4; · 7H&sub2;O 0,4

Stämme

Die hier genannten E. coli-Stämme sind frei erhältlich. Z. B. sind E. coli MM294 und W3110 frei erhältlich. MM294 und W3110 können z. B. erhalten werden vom E. coli Genetic Stock Centre, Yale University, USA. Δlac-Derivate von W3110 werden auf einfache Weise vom Fachmann auf diesem Gebiet hergestellt.
E. coli DS410 ist wohlbekannt (Dougan und Sherratt, Molecular and General Genetics, Bd. 151, S. 151-160, 1977) und hat den veröffentlichten Genotyp F&supmin; ara azi ton A lac Y min A min B rps L mal A xyl mtl thi. Dieser Stamm ist frei erhältlich für die Allgemeinheit und wurde ferner durch die Anmelder am 7. Juni 1985 gemäß Budapester Vertrag in der National Collections Of Industrial & Marine Bacteria Ltd., Aberdeen, Schottland unter der Hinterlegungs-Nr. 12100 hinterlegt.

Beispiel 1

E. coli-Stämme MM294, DS410 und ein Δlac-Derivat von W3110, genannt W3110Δlac, wurden mit pICI 1187 transformiert.
Die resultierenden Stämme MM294 (pICI 1187), DS410 (pICI 1187) und W3110Δlac (pICI 1187) wurden gereinigt und in Glycerin-Voratsansätzen bei -80ºC aufbewahrt. Aliquote jeder Kultur wurden aus dem Vorrat entfernt und auf Agarplatten aus L-Tetracyclin ausgestrichen, um einzelne Kolonien nach Wachstum über Nacht bei 37ºC abzutrennen.
Einzelne Kolonien von DS410 (pICI 1187), W3110Δlac (pICI 1187) und MM294 (pICI 1187) wurden entfernt, getrennt in 10 ml L-Tetracyclin-Bouillon resuspendiert und 100 ul direkt in jeweils zehn 250 ml-Erlenmeyer-Kolben übergeimpft, die 75 ml L-Tetracyclin-Bouillon enthielten. Nach Wachstum für 16 h bei 37ºC auf einem Rütteltisch wurden die Inhalte der Kolben in jedem Zehnersatz vereinigt und zur Impfung von drei getrennten Fermentern verwendet, die LCM50 (10 g/l Hefeextrakt) enthielten.
Die Fermentationen wurden bei einer Temperatur von 37ºC und einem pH von 6,7 durchgeführt, der durch automatische Zugabe von 2 M Schwefelsäure und 6 M Natriumhydroxid-Lösung reguliert wurde. Der Einstellpunkt des aufgelösten Sauerstoffdrucks (dOT) betrug 50% Luftsättigung und wurde anfangs durch automatische Einstellung der Fermenter- Rührgeschwindigkeit reguliert. Der Luftstrom zu den Fermentern betrug durchgehend 20 l/min, entsprechend 1 Volumen Volumen pro Minute (VVM).
Die Fermentationen wurden für 14,25 h durchgeführt, und während dieser Zeit wurden Proben zur Messung der optischen Dichte (OD&sub5;&sub5;&sub0;), des Zelltrockengewichts, der Anreicherung und der Verteilung von Ricin A innerhalb der Zellen entnommen. Die Ricin-A-Anreicherung wurde durch Scannen von Coomassieblau-gefärbten SDS-PAGE-Gelen von Vollzell-Lysaten der entnommenen Bakterien gemessen, wie es auf dem Gebiet wohlbekannt ist. Die Verteilung von Ricin A in den cytoplasmatischen (löslichen) und Einschlußkörper- (unlöslichen) Fraktionen der Zellen wurde bestimmt, indem die entnommenen Bakterien einer Ultraschall-Lyse unterworfen wurden, wie es auf dem Gebiet wohlbekannt ist.
Der Austausch des E. coli-Wirtstamms gegen Plasmit pICI 1187 erzeugte eine unerwartete Änderung des in der löslichen cytoplasmatischen Fraktion verteilten Ricin-A-Gehalts. Tabelle 1 veranschaulicht die Biomasse-Ausbeute, Gesamt- Ricin-A-Anreicherung und prozentuale Ricin-A-Verteilung in der löslichen Fraktion am Ende der Fermentation (14,25 h) für die Stämme DS410 (pICI 1187), W3110Δlac (pICI 1187) und MM294 (pICI 1187). Tabelle 1
* TMP bedeutet mikrobielles Gesamtprotein.
Es ist ersichtlich, daß durch den Austausch des E. coli- Wirtstammes dramatische Veränderungen in der Ricin-A- Verteilung erzeugt werden können.

Beispiel 2

Das in Beispiel 1 beschriebene Fermentationsverfahren wurde mit LCM50-Wachstumsmedium (20 g/l Hefeextrakt) unter Verwendung der Stämme DS410 (pICI 1187), W3110Δlac (pICI 1187) und MM294 (pICI 1187) wiederholt. Eine Hefeextrakt- Lösung (333 g·l&supmin;¹) wurde den Fermentern 4,25 h nach der Fermenterimpfung mit 0,85 g·l&supmin;¹h&supmin;¹ zugeführt. Die Hefeextrakt-Zufuhrgeschwindigkeit wurde auf 1,7 g·l&supmin;¹h&supmin;¹ 5,75 h nach der Fermenterimpfung erhöht. Als die Kohlenstoff- Quelle in den Fermentationen verbraucht war (was zu einem schnellen Anstieg des dOT führte), wurde eine Zufuhr, die Glycerin (714 g·l&supmin;¹) und Ammoniumsulfat (143 g·l&supmin;¹) enthielt, in die Fermenter mit einer Geschwindigkeit gepumpt, die die bakterielle Sauerstoffaufnahmegeschwindigkeit einschränkte.
Außer der erhöhten Hefeextrakt-Ansatzkonzentration und der Zufuhr von Hefeextraktlösung während der Fermentation waren die Medium- und Fermentationsbedingungen für die drei Fermenter identisch mit dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren.
Das in diesem Beispiel beschriebene Fermentationsverfahren resultierte in einer Verbesserung der Biomasse für alle drei Stämme, einer Verbesserung der Ricin-A-Menge, die in der löslichen Fraktion verteilt war, für die Stämme W3110Δlac (pICI 1187) und MM294 (pICI 1187) und einer Verbesserung in der Gesamtausbeute an löslichem Ricin A für alle Stämme im Vergleich zu Beispiel 1. Tabelle 2 zeigt die Biomasse- Endkonzentrationen, Gesamt-Ricin-A-Anreicherung, prozentuale Ricin-A-Verteilung in der löslichen Fraktion und berechnete Ausbeuten an löslichem Ricin A am Ende der Fermentationen (16,25 h). Tabelle 2
* Berechnete Ausbeute mg lösliches Ricin A pro Liter Fermentationsbouillon.
(1) Verglichen mit den berechneten Ausbeuten an löslichem Ricin A für die drei Stämme in den in Beispiel 1 beschriebenen Fermentationsverfahren von ca. 150 bis 200 mg·l&supmin;¹.
Ähnliche Ergebnisse wurden erhalten, wenn die Hefeextrakt- Konzentration in LCM50 10 g/l betrug und der Hefeextrakt dem Fermenter zugeführt wurde und/oder wenn der Hefeextrakt in den Fermenter durchgehend mit 0,85 g·l&supmin;¹h&supmin;¹, 1,7 g·l&supmin;¹h&supmin;¹ oder 3,4 g·l&supmin;¹h&supmin;¹ gepumpt wurde.
Die Hefeextraktzufuhr kann somit die prozentuale Ricin-A- Verteilung in der löslichen Fraktion und die Ausbeute an löslichem Ricin pro Liter Fermentationsbouillon erhöhen.

Beispiel 3

Das Fermentationsverfahren aus Beispiel 1 wurde mit den E. coli-Stämmen MM294 (pICI 1187), W3110Δlac (pICI 1187) und DS410 (pICI 1187) unter Verwendung von mit 100 mg·l&supmin;¹ L-Tryptophan ergänztem LCM 50 (10 g/l Hefeextrakt) wiederholt. Eine L-Tryptophan-Lösung (10 g·l&supmin;¹) wurde in die Fermenter durchgehend mit 90 mg·l&supmin;¹h&supmin;¹ gepumpt.
Tabelle 3 vergleicht die Biomasse-Konzentration, Gesamt- Ricin-A-Anreicherung und prozentuale Ricin-A-Verteilung in der löslichen Fraktion am Ende der Fermentation (14,25 h) für die drei Stämme. Die Ergänzung und Zufuhr von L-Tryptophan wurde durchgeführt, um die Aktivität des Tryptophan-Promotors zu beeinflussen, wie es auf dem Gebiet wohlbekannt ist. Im Vergleich mit dem in Beispiel 1 und insbesondere Beispiel 2 beschriebenen Fermentationsverfahren wurde ein nachteiliger Effekt allgemein beobachtet. Stamm MM294 (pICI 1187) erzeugt höhere Biomassengehalte, aber die prozentuale Ricin-A- Verteilung in der löslichen Fraktion wird verringert. Die Stämme DS410 (pICI 1187) und W3110Δlac (pICI 1187) zeigen keine Veränderung in der Ricin-A-Verteilung, aber der erzeugte Biomassegehalt wird verringert. Die in Beispiel 2 beschriebenen, mit Hefeextrakt erreichten Ergebnisse sind daher höchst überraschend, da der hinzugegebene Hefeextrakt große Menge an Tryptophan enthält. Tabelle 3

Beispiel 4

Das Fermentationsverfahren von Beispiel 2 wurde mit dem E. coli-Stamm DS410 (pICI 1187) in LCM50 (20 g/l Hefeextrakt) wiederholt.
Die Fermentation wurde bei einer Temperatur von 37ºC und einem durch automatische Zugabe von 2 M Schwefelsäure und 6 M Natriumhydroxid-Lösung regulierten pH von 6,7 durchgeführt. Der Einstellwert des aufgelösten Sauerstoffdrucks (dOT) betrug 50% Luftsättigung und wurde anfänglich durch automatische Eistellung der Fermenter-Rührergeschwindigkeit reguliert. Der Luftstrom zum Fermenter betrug anfänglich 20 l/min, entsprechend 1 Volumen Volumen pro Minute (VVM), und wurde manuell auf 45 l/min erhöht, als die Fermenter- Rührergeschwindigkeit ihr Maximum erreichte. Die Fermentation wurde für 34 h durchgeführt, und während dieser Zeit wurden Proben zur Messung von optischer Dichte (OD&sub5;&sub5;&sub0;), Zelltrockengewicht, Anreicherung und Verteilung von Ricin A innerhalb der bakteriellen Zellen entnommen. Die Ricin-A- Anreicherung wurde durch Scannen von Coomassieblau-gefärbten SDS-PAGE-Gelen von Vollzell-Lysaten der entommenen Bakterien gemessen, wie es auf dem Gebiet wohlbekannt ist. Die Verteilung von Ricin A in den cytoplasmatischen (löslichen) und Einschlußkörper- (unlöslichen) Fraktionen von Zellen wurde bestimmt, indem die entnommenen Bakterien einer Ultraschall-Lyse unterworfen wurden, wie es auf dem Gebiet wohlbekannt ist. Eine Hefeextrakt-Lösung (333 g·l&supmin;¹) wurde in den Fermenter 4,5 h nach der Impfung mit 1,7 g·l&supmin;¹h&supmin;¹ gepumpt.
Zwischen 12 und 13 h nach der Impfung erschöpfte sich der Vorrat an Kohlenstoff-Quelle in der Fermentation, was zu einem schnellen Anstieg des dOT von 50% Luftsättigung führte. Von diesem Punkt an wurde eine Zufuhr, die Glycerin (714 g·l&supmin;¹) und Ammoniumsulfat (143 g·l&supmin;¹) enthielt, in den Fermenter mit einer Geschwindigkeit gepumpt, die die bakterielle Sauerstoff-Aufnahmerate (OUR) auf ca. 80% der maximalen Sauerstoff-Transferrate (OTR) des Fermenters beschränkte, während der dOT zurückkehrte und dann bei 50%iger Luftsättigung beibehalten wurde.
Der Einfluß von Fed-Batch-Fermentation auf die Biomasse- Erzeugung, Gesamt-Ricin-A-Anreicherung und Ricin-Verteilung in der löslichen Fraktion wird in Fig. 15, 16 bzw. 17 veranschaulicht. Der Punkt, an dem die Fed-Batch-Fermentation beginnt, ist in jeder Figur angegeben (FB). Der Effekt der Fed-Batch-Fermentation auf die Ricin-Verteilung in der löslichen Fraktion ist ersichtlich.

Beispiel 5

Eine einzelne Ampulle mit DS410 (pICI 1187) wurde aus dem Vorrat entfernt, 100 ul der Kultur entfernt und unverzüglich in jeden von drei 2 l-Erlenmeyer-Kolben übergeimpft, die 600 ml L-Tetracyclin-Bouillon enthielten. Nach Wachstum für 16 h bei 37ºC auf einem Rütteltisch wurden die Inhalte der Kolben verwendet, um drei Fermenter zu impfen, die LCM50- Wachstumsmedium enthielten (20 g/l Hefeextrakt).
Die Fermentationen wurden bei einer Temperatur von 37ºC und einem pH durchgeführt, der durch automatische Zugabe von 2 M Schwefelsäure und 6 M Natriumhydroxid-Lösung kontrolliert wurde, mit:
(A) pH 6,7 durchgehend in der Fermentation
(B) pH 6,7 bis 10 h nach der Impfung, danach reguliert auf pH 6,0
(C) pH 6,7 bis 10 h nach der Impfung, danach reguliert auf pH 7,6
Der Einstellwert des aufgelösten Sauerstoffdrucks (dOT) betrug 50% Luftsättigung und wurde anfänglich durch automatische Einstellung der Fermenter-Rührergeschwindigkeit kontrolliert. Der Luftstrom zu den Fermentern betrug anfänglich 20 l/min. entsprechend 1 Volumen Volumen pro Minute (VVM), und wurde manuell auf 45 l/min erhöht, als die Fermenter-Rührergeschwindigkeit ihr Maximum (1000 U.p.M.) erreichte. Der Luftstrom zu den Fermentern wurde manuell zurück auf 20 l/min verringert, als die Rührergeschwindigkeit, in den späteren Stufen der Fermentationen, automatisch auf ca. 500 U.p.M. zurückgegangen war.
Die Fermentationen wurden für 23 h durchgeführt, und während dieser Zeit wurden Proben zur Messung von optischer Dichte (OD&sub5;&sub5;&sub0;), Zelltrockengewicht, Gesamt-Ricin-A-Anreicherung und Ricin-Verteilung in der löslichen Fraktion entnommen. Ricin- A-Anreicherung wurde durch Scannen von Coomassieblau gefärbten SDS-PAGE-Gelen von Vollzell-Lysaten der entnommen Bakterien gemessen, wie es auf dem Gebiet wohlbekannt ist. Die Verteilung von Ricin A in den cytoplasmatischen (löslichen) und Einschlußkörper- (unlöslichen) Fraktionen von Zellen wurde bestimmt, indem die entnommenen Bakterien einer Ultraschall-Lyse unterworfen wurden, wie es auf dem Gebiet wohlbekannt ist.
Eine Hefeextrakt-Lösung (333 g·l&supmin;¹) wurde den Fermentern 4,5 h nach der Impfung mit 1,7 g·l&supmin;¹h&supmin;¹ zugeführt.
Als die Kohlenstoff-Quelle in den Fermentationen verbraucht war (was zu einem schnellen Anstieg des dOT von 50% Luftsättigung führte), wurde eine Zufuhr, die Glycerin (714 g·l&supmin;¹) und Ammoniumsulfat (143 g·l&supmin;¹) enthielt, in die Fermenter mit einer Geschwindigkeit gepumpt, die ausreichte, um den maximalen Kohlenstoffbedarf der Bakterien zu decken. Die Zufuhrgeschwindigkeit der begrenzenden Kohlenstoff-Quelle und des Ammoniumsulfats wurde dann während der übrigen Fermentation unverändert gelassen.
Die Wirkung der drei unterschiedlichen pH-Kontrollbereiche (A, B und C) ist in Fig. 18, 19, 20 und 21 gezeigt, die die Biomasse-Konzentration, Gesamt-Ricin-A-Anreicherung, prozentuale Ricin-A-Verteilung in der löslichen Fraktion bzw. berechnete Ausbeute an löslichem Ricin A zeigen. Fig. 22 zeigt den pH des Wachstumsmediums während der Fermentationen. Die vorteilhafte Wirkung auf die Ausbeute an löslichem Ricin durch die Änderung des pHs für pH 6,7 bis pH 6,0 wird ersichtlich veranschaulicht.

Beispiel 6

Das in Beispiel 4 beschriebene Fermentationsverfahren wurde wiederholt, aber 11,5 h nach der Fermenter-Impfung wurde die Fermentationstemperatur allmählich abgesenkt.
Eine unerwartete Beibehaltung der Ricin-Löslichkeit wurde beobachtet. Fig. 23, 24 und 25 veranschaulichen die erhaltenen Ergebnisse. Fig. 25 zeigt das Fermentations- Temperaturprofil während des Verfahrens.

Herstellung von Plasmiden

Das Folgende veranschaulicht die Herstellung des oben verwendeten Plasmid pICI 1187. Verschiedene Zwischenstufen in der Ableitung des zur Herstellung von rekombinantem Ricin A verwendeten Vektors werden beschrieben.

Experimentelle Verfahren

1. Synthetische Oligonukleotide

Synthetische Oligonukleotide wurden verwendet, um spezifische DNA-Sequenzänderungen des Ricin-Gens einzuführen. Alle anschließend beschriebenen Oligonukleotide wurden auf einem DNA-Syntheseautomaten Applied Biosystems 380A aus 5'-Dimethoxytritylbase-geschützten Nukleosid-2-cyanoethyl- N,N-diisopropylphosphoramiditen und geschützten Nukleosiden, die an Träger aus Glas mit kontrollierten Poren gebunden waren, in einem 0,2 umol-Maßstab hergestellt, entsprechend Anweisungen von Applied Biosystems Inc.
Jedes Oligonukleotid wurde nach Spaltung vom festen Träger und Entfernung aller Schutzgruppen in Wasser (1 ml) aufgelöst, und eine Messung der Extinktion bei 260 nm wurde zur Bestimmung der Konzentration verwendet.

2. Enzyme

Eine Anzahl von Restriktionsendonukleasen und DNA- modifizierenden Enzymen wurde in den nachfolgend beschriebenen Manipulationen verwendet. Diese wurden von einem aus einer Anzahl von Lieferanten erworben (Amersham International, Bethesda Research Laboratories, Boehringer Mannheim oder New England Biolabs) und gemäß Herstelleranweisungen bezüglich der Reaktionsbedingungen verwendet.

3. Geneclean (TM)

Das Kit enthält 1) 6 M Natriumjodid, 2) eine konzentrierte Lösung aus Natriumchlorid, Tris und EDTA zur Herstellung einer Natriumchlorid/Wasser-Ethanol/Wasser-Spülung; 3) Glassmilk (TM) - eine 1,5 ml Glasampulle, die 1,25 ml einer Suspension von Silica-Matrix in Wasser enthält.
Dies ist einer Technik zur DNA-Reinigung, die auf der Methode von Vogelstein und Gillespie beruht, die in Proceedings of the National Acadamy of Sciences USA (1979), Bd. 76, S. 615 veröffentlicht wurde.
Alternativ kann jedes der Verfahren verwendet werden, die in "Molecular Cloning - a laboratory manual", 2. Auflage, Sambrook, Fritsch und Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory, 1989) beschrieben werden.

4. Sequenase (TM)

Chemisch modifizierte T7-DNA-Polymerase Beruhend auf dem Verfahren von Tabor und Richardson, veröffentlicht in Proceedings of the National Academy of Sciences, USA (1987), Band 84, S. 4767-4771.

5. Konstruktion der pICI-Expressionsvektoren

5. a) pICI 0020

Der Plasmid-Vektor pICI 0020 ist ein auf pAT153 basierendes Plasmid, in dem die EcoRI-Accl-Region mit 651 bp durch ein EcoRI-ClaI-Fragment mit 167 bp ersetzt ist, das aus folgendem besteht:
(1) einem synthetischen E. coli-trp-Promotor und trp- Leitribosom-Bindungsstelle
(2) einem Translations-Startkodon
(3) einer aus M13mp18 abgeleiteten multiplen Restriktionsenzym-Erkennungssequenz, die Stellen für KpnI, BamHI, XbaI, SalI, PstI, SphI und HindIII enthält
(4) einer synthetischen Transkriptions-Terminierungssequenz
Die DNA-Sequenzen dieser Region ist in Fig. 11 gezeigt. Die Konstruktion eines Plasmid-Vektors, der eine synthetische trp-Promotorsequenz enthält, ist veröffentlicht (Windass et al., Nuc. Acids Res., 10, S. 6639-6657, 1982). Ein Promotor- Fragment wurde aus einem solchen Vektor nach Verdauung mit den Enzymen EcoRI und HpaI und Reinigung der entsprechenden Bande aus einem Agarose-Gel durch Elektro-Elution isoliert (in "Molecular Cloning - A Laboratory Manual", Maniatis, Fritsch und Sambrook, veröffentlicht von CSH Laboratory, 2. Auflage 1989, nachfolgend als "Maniatis" bezeichnet).
Ein Paar komplementärer synthetischer Oligonukleotide wurde hergestellt, die an das HpaI-Ende des Promotor-Fragments ligieren würden, das die natürliche trp-Leitribosom- Bindungsstelle, ein Translations-Startkodon und eine 3'-KpnI- Klonierungsstelle bereitstellt. Diese Oligonukleotide wurden in äquimolaren Konzentrationen vermischt und durch Erwärmen auf 100ºC, gefolgt von langsamem Abkühlen auf Raumtemperatur verschmelzen gelassen.
Das Promotor-Fragment und die verschmolzenen Oligonukleotide wurden dann ligiert und die entsprechende Bande aus einem Polyacrylamid-Gel durch Elektroelution isoliert. Dieses Fragment wurde dann mit einem M13mp18-Vektor-Derivat ligiert, das die in die HindIII-Stelle klonierte trp-Attenuatorsequenz (erzeugt aus synthetischen Oligonukleotiden) enthielt und 3' zum Attenuator eine zusätzliche ClaI-Restriktionsstelle einführte. Die ligierte DNA wurde in den E. coli-Stamm JM109 (Yanisch-Perron et al., Gene, 33, S. 103, 1985) transfiziert, kompetent gemacht durch die CaCl&sub2;-Methode (Maniatis, Kapitel 1, S. 82). Nach Ausplattieren und Inkubation der Platten wurden die Beläge nach der Methode von Benton und Davis (Maniatis, Kapitel 4, S. 41) durchmustert, wobei eine ³²P- markierte Sonde verwendet wurde, die durch Nick-Translation des zuvor isolierten EcoRI-HpaI-Promotor-Fragments erzeugt wurde. Einsträngige DNA wurde aus positiv hybridisierenden Belägen durch eine Standardmethode (Maniatis, Kapitel 4, S. 29) hergestellt und unter Verwendung des universellen M13- Primers und der Sanger-Didesoxy-Kettenterminierungsmethode sequenziert, wie sie in Kit-Form von einer Anzahl von Anbietern bereitgestellt wird, z. B. Sequenase (United States Bioscience).
RF-DNA wurde aus einem Isolat hergestellt, in dem die Promotor/Ribosom-Bindungsstelle/Attenuatorsegenz bestätigt worden war. Diese DNA wurde mit EcoRI und ClaI verdaut und das entsprechende Fragment aus einem Polyacrylamid-Gel wie oben isoliert. Das Plasmid pAT153 wurde mit den Enzymen EcoRI und AccI verdaut und mit dem isolierten Promotor-Fragment ligiert. Ligierte DNA wurde zur Transformierung von kompetentem E. coli HB101 (Bethesda Research Laboratories) verwendet und Ampicillin-resistente Kolonien ausgewählt.
Plasmid-DNA aus verschiedenen Klonen wurde hergestellt und DNA-Sequenz aus der Region zwischen den EcoRI- und ClaI- Stellen derivatisiert. Ein Klon, von dem bestätigt wurde, daß er die korrekte Promotor/Attenuator-Region enthielt, wurde als pICI 0020 bezeichnet.
Diese Konstruktion ist in Fig. 1 umrissen.

5. b.) pICI 0042

pICI 0042 (Fig. 12) ist ein Plasmid, in dem die antibiotischen Resistenzmarker von pAT153 durch ein einzelnes, induzierbares Tetracyclin-Resistenzgen aus dem Plasmid RP4 (kodiert durch das Gen tetA und reguliert durch das Produkt des tetR-Gens) ersetzt wurden. Diese Gene wurden von Klock et al. (J. Bacteriol. 161, S. 326-332, 1985) charakterisiert. Eine Plasmid-Stabilitätsfunktion (cer) wurde ebenfalls eingeführt. Dies vermeidet das Erfordernis von β-Lactam-Antibiotika in irgendeinem Teil des Herstellungsverfahrens und wird ebenfalls Untersuchungen für diese im Endprodukt zulassen. Weil der neue Resistenzmarker nur in Gegenwart eines Antibiotikums exprimiert wird, wird das tetA-Genprodukt keine potentielle Verunreinigung eines rekombinanten Recin A in Kulturen sein, in denen das Plasmid in Abwesenheit von Tetracyclin stabil bewahrt wird.
Der Anfangsschritt in der Erzeugung dieses Vektors war die Erzeugung eines Derivats von pAT153, aus dem das die Tetracyclin-Resistenz kodierende Gen vollständig entfernt worden war. Ein komplementäres Paar synthetischer Oligonukleotide wurde konstruiert, um das EcoRI-AvaI-Fragment aus pAT153 durch eine kurze Sequenz, die verschiedene besondere Restriktionsendonuklease-Stellen enthielt, zum anschließenden Klonieren zu ersetzen.
pAT153-Plasmid-DNA wurde mit den Enzymen EcoRI und Aval verdaut und das Plasmid-DNA-Fragment mit 2175 kBP aus einem 0,7% Agarose-Gel unter Verwendung von Geneclean (Bio 101, Kalifornien) gemäß Herstelleranweisungen isoliert. Das die Tetracyclin-Resistenz enthaltende Fragment mit 1425 kBP wird somit entfernt.
Die Oligonukleotide (exp79 und 80) wurde unter Verwendung von T4-Polynukleotidkinase phosophoryliert und äquimolare Mengen miteinander verschmolzen. Eine Probe der verschmolzenen Oligonukleotide wurde dann mit dem Plasmid-Fragment aus pAT153 ligiert. Ligierte DNA wurde in E. coli HB101 (BRL) transformiert und Ampicillin-resistente Kolonien ausgewählt.
Mehrere Kolonien wurden zur Plasmid-DNA-Herstellung gepickt (Methode von Birnboim und Doly, angegeben in Maniatis, Kapitel 1, S. 25) und die gewünschte Konstruktion durch Restriktionsanalyse mit geeigneten Enzymen, z. B. EcoRI, Aval und BamHI, identifiziert. Die Struktur von 3 Isolaten, die mit dem korrekten Restriktionsmuster identifiziert wurden, wurde durch DNA-Sequenzanalyse unter Verwendung eines Primers im Uhrzeigersinn für die pBR322 EcoRI-Stelle (New England Biolabs) bestätigt. Ein Isolat wurde als pICI 0019 bezeichnet.
RP4-Plasmid-DNA wurde aus noch vorhandenen Vorräten durch die Methode von Holmes und Quigley (Maniatis, Kapitel 1, S. 29) isoliert. Diese DNA wurde vollständig mit BgrlII und dann teilweise mit XmaI (bei 25ºC für bis zu 35 min) zerschnitten, wobei Proben zu verschiedenen Zeitpunkten genommen wurden, bis ein Fragment mit 2,45 Kbp, das tetR und tetA enthielt, klar identifizierbar war. Eine Probe von pUC8-DNA (Amersham International) wurde vollständig mit BamHI und XmaI verdaut. Ligationen wurden durchgeführt, um die Tetracyclin- Resistenzgene in das pUC8 zu insertieren. Ligierte DNA wurde zur Transformierung von E. coli C600 (Appleyard, R. K. Genetic, 39, S. 440, 1954), das nach der CaCl&sub2;-Methode kompetent gemacht worden war (Maniatis, Kapitel 1, S. 82), verwendet und Tetracyclin-resistente Kolonien ausgewählt. Plasmid-DNA wurde aus 8 Klonen (Holmes und Quigley) hergestellt und die Gegenwart der RP4 tetR- und A-Gene durch Restriktionsanalyse bestätigt. Eines dieser Isolate wurde als pTB344 bezeichnet.
Die Tetracyclin-Resistenzgene wurden dann in pICI 0019 (oben beschrieben) durch Austausch eines EcoRI/PstI-Fragments aus pICI 0019 gegen das entsprechende Fragment aus pTB344 insertiert. Dies resultiert im Austausch des Großteils des Ampicillin-Resistenzgens in pICI 0019 gegen die Tetracyclin- Resistenzgene. Nach Verdauung und Ligation der Plasmid-DNAs, gefolgt von Transformation von E. coli C600, wurden Kolonien auf der Basis des Phänotyps, d. h. TcR und ApS, ausgewählt. Plasmid-DNA wurde aus 4 solchen Klonen hergestellt und mit einer Kombination von Enzymen verdaut, z. B. BamHI/PstI/SstI, EcoRI/SalI, SamI, StvI/SalI und AvaI/PstI. Alle 4 Klone erzeugten Restriktionsmuster, die mit dem gewünschten Konstrukt konsistent sind. Einer davon wurde als pTB351 bezeichnet.
Summers und Sherratt (Cell 36, S. 1097-1103, 1984) haben gezeigt, daß die Stabilität von aus ColEI (z. B. pAT153) abgeleiteten Plasmiden aufgrund des Verlusts einer Sequenz mit 283 bp, cer, besteht, die im Stammplasmid vorliegt. Diese Sequenz hilft die Bildung von Plasmid-Oligomeren zu verhindern, wobei letztere die Plasmidverteilung in einer noch nicht definierten Weise zu zerreißen scheinen. Die cer- Sequenz (D. Summers et al., MGG 201, S. 334-338, 1985) wurde freundlicherweise von Prof. D. Sherratt in Form eines in pUC18 klonierten Fragments (pKS492) bereitgestellt. pKS492- Plasmid-DNA wurde mit BamHI und TagI zur Freisetzung eines cer-haltigen Fragments mit 289 bp verdaut. Plasmid-pTB351-DNA (isoliert aus dem dam&supmin;-Wirt E. coli GM48 - J. A. Arraj und M. G. Marinus, J. Bact. 153, S. 562-565, 1983) wurde vollständig mit BamHI und ClaI verdaut und mit der verdauten pKS492-DNA ligiert. Nach Transformation des kompetenten E. coli C600 mit ligierter DNA wurden Tetracyclin-resistente Kolonien ausgewählt. Restriktionsanalyse von Plasmid-DNA aus mutmaßlichen Klonen mit den Enzymen Aval, MluI und PvuI wurde zur Bestätigung der Gegenwart von cer verwendet. Ein Isolat mit der korrekten Struktur wurde als pICI 0042 bezeichnet.
Die Konstruktion dieser Plasmide ist in Fig. 2 und 3 umrissen.

5. c) pICI 1079

Der Plasmid-Vektor pICI 1079 ist ein Ampicillin-resistentes, aus pAT153 stammendes Plasmid, das die folgenden Elemente zwischen den EcoRI- und StyI-Restriktionsstellen enthält:
(i) ein CI857-Gen aus dem Phagen λ;
(ii) einen λPL-Promotor;
(iii) eine synthetische Ribosom-Bindungsstelle;
(iv) eine synthetische Interferon-α2-Gensequenz;
(v) eine synthetische Transkriptions- Terminatorsequenz, abgeleitet aus dem Phagen T4, zwischen den SalI- und StyI-Restriktionsstellen. Die DNA-Sequenz dieses Transkriptionsterminators ist in Fig. 13 gezeigt. pICI 1079 ist in Fig. 14 veranschaulicht.
pICI 1079 wurde gemäß dem Budapester Vertrag hinterlegt. Die Hinterlegung erfolgte bei NCIMB, 23 St Machaer Drive, Aberdeen, Schottland.
Dieses Plasmid wurde verwendet, um eine Quelle des T4- Transkriptionsterminators für die Erzeugung des Ricin-A- exprimierenden Klons pICI 1185 bereitzustellen (siehe 7.d unten). Der Ausgangspunkt für die Erzeugung dieses Plasmids war pICI 1043. pICI 1043 ist ein auf pICI 0020 (siehe 3.a oben) beruhendes Plasmid, in dem eine Expressionskassette, die einen λPL-Promotor und ein Interferon-α2-Gen enthält (Edge et al., Nuc. Acids Res., 11, S. 6419-6435, 1983), zwischen den EcoRI- und SalI-Stellen vorliegt.
Ein komplementäres Paar von Oligonukleotiden wurde zur Erzeugung des Transkriptionsterminators aus Gen 32 des Bacteriophagen T4 mit 5'-SalI- und 3'-SphI-kohäsiven Enden erzeugt. Dieses Fragment wurde mit einem Plasmid-Fragment ligiert, das aus pICI 1043 isoliert wurde, das vollständig mit SalI und SphI verdaut worden war. Das so erzeugte intermediäre Plasmid (pICI 1078) enthielt hintereinanderliegend sowohl die T4-Terminator- als auch trp- Attenuatorsequenzen.
Ein zweites Paar komplementärer Oligonukleotide wurde dann zum Austausch der trp-Attenuatorsequenz (und des verbleibenden Teils des Tetracyclin-Resistenzgens) durch Insertion zwischen den SphI- und StyI-Stellen von pICI 1078 verwendet. Eine besondere BamHI-Stelle wurde innerhalb dieses synthetischen Fragments eingeführt.
Diese Manipulationen sind in Fig. 4 umrissen.

6. Erzeugung eines Ricin-A-exprimierenden Klons

6. a) Herstellung von pUC8RA-Plasmid-DNA

Ein Klon (pUC8RA) wurde erzeugt, der die cDNA für Ricin A enthält. Dieser Klon enthält A-Kette-cDNA von Basenzahl -74 in der Leitsequenz bis zur BamHI-Stelle innerhalb der B-Kette (Basenzahl 857) gemäß der veröffentlichten cDNA-Sequenz (I. F. Lamb, L. M. Roberts, J. M. Lord, Eur. J. Biochem., 1985, 148, S. 265-270) im Plasmid pUC8 (J. Vieira und M. Messing, Gene, 19, S. 259, 1982). Zusätzlich wurde eine stellengerichtete Mutagenese zur Erzeugung eines Translations-Terminierungskodons direkt 3' zum Endkodon des reifen Ricin A verwendet (wie berichtet in M. O'Hare, et al., FEBS Letts, 1987, 216, S. 73-78). Die gesamte A-Kette- kodierende Region ist in einem BamHI-Fragment aus diesem Klon eingeschlossen.
Eine kleine Menge pUC8Ra-Plasmid-DNA wurde von den Schöpfern erhalten. Für zukünftige Vorräte wurde ein Verdünnung dieser DNA zur Transformierung von E. coli DHSα-kompetenten Zellen (Bethesda Research Laboratories) verwendet und eine Ampicillin-resistente Transformante ausgewählt. Plasmid-DNA aus diesem Klon wurde mit einem modifizierten Birnboim-Doly- Verfahren (Maniatis, Kapitel 1, S. 25) hergestellt. Proben dieser DNA wurden mit BamHI und BanI separat verdaut und mit entsprechenden Verdauungen der ursprünglichen DNA-Probe nach Elektrophorese an einem Agarose-Gel verglichen. Keine Unterschiede im Restriktionsmuster wurden beobachtet, und auf dieser Grundlage wurden die zwei DNA-Proben als identisch angenommen.

6. b) Subklonieren in M13

BamHI-Verdauungen von pUC8RA-Plasmid-DNA und RF- (replikative Form) DNA aus dem Stamm K19 des Phagen M13 (Anglian Biotechnology) wurden unter Verwendung von Standardbedingungen "shotgun"-ligiert (Maniatis, Kapitel 1, S. 68). Kontroll-Ligationen wurden ebenfalls durchgeführt. Die ligierten DNAs wurden zur Transformierung des E. coli- Stammes TG1 (Gibson, 1984/Anglian) verwendet, der durch die CaCl&sub2;-Methode kompetent gemacht wurde (Maniatis, Kapitel 1, S. 82).
Die Transformationshäufigkeiten zeigten eine wirksame Ligation an und rekombinante Phagen wurden im Abkömmling erwartet. Von den rekombinanten Phagen wurde vorhergesagt, daß sie klare Beläge auf IPTG · X-gal (BRL) enthaltenden Platten aufgrund des lacZ- (β-Galactosidase-) Gens erzeugen. Phagen vom Wild-Typ erzeugen blaue Beläge aufgrund der Konvertierung des X-gal durch β-Galactosidase.
Mehrere klare Beläge wurden zur Herstellung von einsträngiger DNA ausgewählt. Direkte Gel-Elektrophorese von lysierten Phagen-Suspensionen zeigte, daß ein Phagen-Klon eine beträchtliche Insertion enthielt, von der durch Sequenzierung bestätigt wurde, daß sie die Ricin-A-Kettekodierende Sequenz ist. Nur 182 Basen der reifen Ricin-A-kodierenden Sequenz wurden bestätigt, aber dieses wurde als ausreichender Nachweis für die Gegenwart des gesamten Ricin-A-Gens gewertet. Dieser Klon wurde als M13K19RA bezeichnet.

6. c) Mutagenese von M13K19RA

Zur Erzeugung einer KpnI-Stelle, die mit pICI- Expressionsvektoren kompatibel ist, am Beginn von reifem Ricin A, sind die folgenden Veränderungen (unterstrichen) notwendig:
verändert zu:
und resultieren in einem ATG-Kodon, das mit einer KpnI-Stelle überlappt. Ein Ricin A, das ein KpnI-Fragment enthält, kann aus der Mutante ausgeschnitten und in die ICI-Expressions- Vektorserie insertiert werden. Zwei N-terminale Aminosäure- Modifikationen werden gemacht (ile-phe zu met-val).
Die aus M13K19RA hergestellte einsträngige DNA war die Schablone für den Mutageneseschritt für jede Mutationsstrategie. Ein einzelnes Oligonukleotid (DTR16), das alle Mutationsänderungen für diese Strategie einführt, wurde synthetisiert.
DTR16 5' AACAACATGGTACCCAAACAA 3' SEQ. ID NO 3
Verschiedene Protokolle bestehen für die Einführung spezifischer DNA-Sequenzänderungen durch stellengerichtete Mutagenese. Die unten umrissenen Verfahren wurden unter Verwendung der Methode von Eckstein et al. erreicht (Nuc. Acid Res., 1985, 13, S. 8749-8764 und 1986, 14, S. 9679-9698), bereitgestellt in Kit-Form (Amersham International) und gemäß Herstelleranweisungen verwendet.
Das Prinzip dieser Methode ist es, die einsträngige DNA- Schablone mit dem mutagenen Oligonukleotid zu primen und den komplementären Strang zu synthetisieren, wobei dATPαS anstelle von dATP eingeführt wird. Die Verwendung dieses Nukleotids resultiert in der Bildung von Phosphorthioat- Bindungen, die nicht durch bestimmte Restriktionsenzyme (z. B. NciI) gespalten werden. Nach der Synthese des zweiten Stranges wird NciI verwendet, um den Stammstrang einzuschneiden ("nick"), und Exonuklease III hinzugegeben, um zurück bis hinter den Mutationspunkt zu verdauen. DNA- Polymerase I erlaubt dann die Resynthese des Stammstranges. Entsprechend agiert das mutagene Oligonukleotid als Schablone zur Resynthese, und die Mutation wird in beide Stränge vor der Transformation eingeführt. Mutationshäufigkeiten von bis zu 96% des gesamten Abkömmlings werden beansprucht, und eine Durchmusterung wird durchgeführt, indem einfach zufällig Beläge zur DNA-Sequenzanalyse gepickt werden.
In unseren Experimenten waren 4 von 4 gepickten Belägen korrekt mutiert.
Nach Wahl eines Mutanten (MRA16) wurde RF-DNA hergestellt und auf Gegenwart des neu erzeugten Restriktionsfragmentes, d. h. KpnI, überprüft.

6. d) Klonieren, Expression und Anfangs-Charakterisierung

Die pICI-Serien von Expressionsvektoren (siehe Abschnitt 5) können DNA-Fragmente akzeptieren, die in eine besondere KpnI- Restriktionsstelle kloniert sind, die benachbart zum Trp- Promotor ist. Die KpnI-Stelle überlappt mit dem Translations- Startkodon (ATG), das sich 8 bp stromabwärts der Shine- Dalgarno-Stelle (AGGA) des Promotors befindet.
Nach Bestätigung der Sequenz von MRA16 wurde eine KpnI- Verdauung im großen Maßstab US (~5 ug RF-DNA) durchgeführt und das relevante Ricin-A-kodierende DNA-Fragment aus einem Agarosegel (Nu-Sieve GTG Agarose, FMC Bioproducts) durch Phenol-Extraktion einer ausgeschnittenen Gel-Scheibe gemäß Herstelleranweisungen isoliert.
pICI 0020 (siehe 5a) wurde mit KpnI verdaut und dann unter Verwendung von alkalischer Kalbdarm-Phosphatase (CIP - Boehringer Mannheim) dephosphoryliert. Die letztere Behandlung verhindert die Rezirkularisierung des Vektors nach Ligation, was zur einem hohen Anteil von Eltern im Transformationsabkömmling führen würde.
Ligationen wurden für die verschiedenen Strategien mit Verhältnissen von Plasmid-Vektor zu isoliertem Fragment von 8 : 1 (G/G) bis 1 : 3 aufgestellt. Kontroll-Ligation zur Untersuchung der Wirksamkeit der Phosphatase-Behandlung, der Ligase-Aktivität etc. wurden eingeschlossen. Die Ligationsbedingungen waren geeignet für die verwendete Quelle der T4-DNA-Ligase (New England Biolabs oder Amersham). Die Reaktionen wurde allgemein bei 15ºC über Nacht inkubiert.
50% jeder Ligationsreaktion (5 ul) wurde auf 100 ul mit 1 · TNW (50 mM Tris, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA) verdünnt und mit 200 ul von kompetentem E. coli DS410 versetzt. Nach einem Standard-Transformationsprotokoll (Maniatis, Kapitel 1, S. 74) wurden die Zellen auf L-Agar plus Streptomycin (25 ug/ml) und Ampicillin (100 ug/ml) plattiert und bei 37ºC über Nacht inkubiert. E. coli DS410 besitzt ein chromosomales Streptomycin-Resistenzgen.
Die Transformationsplatten wurden nach Inkubierung untersucht. Allgemein wurden 5- bis 10-mal mehr Kolonien in Ligationen im Vergleich zu Kontrollen ohne Ligase festgestellt. In manchen Fällen trat eine geringe Differenz in der Anzahl von Kolonien auf, die in Gegenwart oder Abwesenheit von Ligase erzeugt wurden, was eine unvollständige Verdauung des Vektors oder schlechte Ligase- Aktivität andeutet.
Die Transformanten plus die relevanten Kontrollen wurden auf Nitrocellulose-Filter gepickt, die zur Hybridisierungsdurchmusterung auf L-Agar-Platten plaziert wurden (basierend auf der Methode von Grunstein und Hogness, beschrieben in Maniatis, Kapitel 1, S. 98). Nach Inkubierung wurden die Kolonien in situ unter Verwendung von 10% SDS und 1 M NaOH lysiert, unter Verwendung von 1 M Tris (pH 7,5) neutralisiert und im Vakuum bei 80ºC für 2 h getrocknet.
Hybridisierungssonden wurden erzeugt durch ³²P-Markierung der Mutationsoligonukleotide unter Verwendung von T4- Polynukleotidkinase. Die Filter wurde bei Raumtemperatur sondiert und dann in Schritten bis zu 55 bis 65C zur Entfernung nicht-spezifisch gebundener Impulse vor der Autoradiographie gewaschen. Spezifische Hybridisierung zeigte mutmaßliche Klone an, die Ricin-A-DNA enthielten.
DNA-Zubereitungen im kleinen Maßstab (durch die Methoden von Holmes und Quigley oder Birnboim-Doly, angegeben in Maniatis, Kapitel 1, S. 25) wurden aus positiv hybridisierenden Klonen hergestellt. Die DNAs wurden mit den relevanten Restriktionsenzymen, z. B. KpnI und EcoRI/BglII, verdaut und durch Elektrophorese auf Agarosegelen analysiert. Vektor-DNAs und mutierte RF-DNAs wurden mit den gleichen Enzymen geschnitten, um die für die korrekten Klone erwarteten Fragmentgrößen zu zeigen.
Plasmid-DNA-Zubereitungen in größerem Maßstab (Birnboim-Dvly) eines jeden Klons wurden für einen detailliertere Restriktionsanalyse verwendet, z. B. ClaI, HindIII, BamHI, EcoRI/BglII, KpnI und SacI. Auf Agarosegelen zeigten diese Verdauungen die Größe des insertierten Fragments, eine Angabe ihrer Orientierung und den Gewinn einiger besonderer Ricin-A- Kette-Enzymstellen.

6. e) Expressionsstudien

Die positiv durch Hybridisierung und Restriktionsdurchmusterung identifizierten Klone wurden auf Expression von Ricin A durch SDS-PAGE-Analyse von Vollzell- Lysaten untersucht. Die Standardbedingungen für Expressionsstudien waren:
1) Impfe 10 ml L-Bouillon + Antibiotikum (Antibiotika) mit einer einzelnen Kolonie und züchte bei 37ºC über Nacht unter vorsichtigem Schütteln.
2) Nimm 750 ul der Über-Nacht-L-Bouillon und pelletiere die Zellen in einer Mikrozentrifuge (1 min bei 6500 U.p.M.).
3) Resuspendiere das Pellet in 300 ul M9-Medium (Maniatis, Anhang A.3) + 0,02% Casein-Hydrolysat + 0,2% Glucose + 50 ug/ml Thiamin und überimpfe in 10 ml desselben.
4) Inkubiere für 7 h oder über Nacht bei 37ºC unter vorsichtigem Schütteln.
5) Nach der Inkubierung messe OD&sub5;&sub4;&sub0;, Pelletiere die Zellen und resuspendiere auf OD&sub5;&sub4;&sub0; = 10 pro ml in Laemmli- Probenpuffer (Maniatis, Kapitel 18, S. 53). Koche für 15 min.
6) Lade 20 ul Vollzell-Lysat auf SDS-Polyacrylamid-Gel, führe Elektrophorese durch, färbe mit Coomassieblau an, entfärbe und visualisiere.
Von den durch SDS-PAGE untersuchten Klonen zeigte nur einer eine zusätzliche Bande mit äquivalentem Molekulargewicht von ~29 kD (äquivalent dem abgeschätzten für nichtglycosyliertes, reifes Ricin A). Gelscans zeigten, daß der Expressionsgrad im Bereich von 5 bis 10% des Gesamtzellproteins war. Dieser Klon wurde als pICI 1102 bezeichnet.
Die Konstruktion von pICI 1102 ist in Fig. 5 umrissen. Ergebnisse der Expressionsstudien sind in Fig. 6 und 7 gezeigt.

6. f) Western-Übertragungen und Immunnachweis von rekombinantem Ricin A

Die Authentizität von rekombinantem Ricin-A-Ketten-Protein, ursprünglich beobachtet durch Coomassieblau-Anfärbung von SDS-Polyacrylamid-Gelen, wurden wurde durch Western-Blotting bestätigt. Die Proteinbanden wurden auf Nitrocellulose-Filter übertragen und unter Verwendung eines Ricin-A-spezifischen Antikörpers, gefolgt von Peroxidase-markierten Antiglobulinen nachgewiesen.
15% SDS-PAGE-Gele wurden über Nacht bei 8 mA laufen gelassen und dann für wenigstens 30 min Transferpuffer äquilibriert.
Proteinbanden auf den Gelen wurden dann auf Nitrocellulose- Membranen (Hybond-C, Amersham) elektrophoretisch in einem Bio-Rad Trans-Blot-Apparat bei 70 V für 3 h übertragen. Die Filter konnten nach Trocknen in versiegelten Plastikbeuteln bei -20ºC gelagert werden.
Ricin A.1 war ein in Kaninchen herangezogener polyklonaler Antikörper gegen ein synthetisches Peptid-Fragment von Ricin A. Vorläufige Studien zeigten eine gute Affinität für Ricin A, aber beträchtliche Nebenreaktionsfähigkeit mit vielen E. coli-Proteinen. Um den hohen Hintergrund zu überwinden, der durch dieses Nebenreaktivität verursacht wurde, wurde der Antikörper mit einem E. coli-Lysat vorinkubiert.
Daher wurde eine 10 ml L-Bouillon-über-Nacht-Kultur des E. coli-Stammes DS410 bei 4000 U.p.M. für 10 min zur Pelletierung der Zellen zentrifugiert. Das Pellet wurde in 5 ml Bakterienpuffer resuspendiert und bei 4 bis 6 u für 6 · 10-sekündige Stöße mit 30-sekündigen Abkühlintervallen auf Eis ultraschallbehandelt.
0,5 ml des ultraschallbehandelten Materials wurden dann mit 0,5 ml Ricin A.1-Antiserum vermischt und bei Raumtemperatur für 90 min inkubiert. Zelltrümmer wurden bei 13000 U.p.M. für 5 min ausgeschleudert und der Überstand bei -20ºC gelagert.
Die Nitrocellulose-Filter aus Western-Übertragungen wurden durch Inkubierung über Nacht bei Raumtemperatur in 5% BSA-PBS/Tween blockiert. (PBS Tween = 5 ml Tween 20 pro 1 l PBS).
Gewaschen 3 · 3 min in PBS/Tween.
Inkubiert 2 h (oder über Nacht) bei Raumtemperatur mit einer 1/4000-Verdünnung von "blockiertem" Ricin A.1-Antikörper in 0,5% BSA-PBS/Tween.
Gewaschen 3 · 3 min in PBS/Tween.
Inkubiert 1 h mit einer 1/1000-Verdünnung von Ziege-Anti- Kaninchen-Antiserum in 0,5% BSA-PBS/Tween bei Raumtemperatur.
Gewaschen 3 · 3 min in PBS/Tween.
Inkubiert 1 h mit einer 1/5000-Verdünnung von Kaninchenperoxidase-Anti-Peroxidase-Antiserum in 0,5% BSA/PBS/Tween bei Raumtemperatur.
Gewaschen 3 · 3 min in PBS/Tween.
Entwickelt durch Eintauchen in eine Lösung aus 4- Chlornaphthol (60 mg) in 20 ml Methanol, aufgefüllt auf 120 ml mit PBS und 12 ul Wasserstoffperoxid enthaltend. Die Membran wurde aus der Lösung entfernt, sobald Banden sichtbar waren, getrocknet und photographiert.
Eine typische Western-Blot-Analyse ist in Fig. 8 gezeigt.

6. g) Biologischer Assay auf rekombinantes Ricin-A-Protein

Das Ziel war hier die Einrichtung von Bedingungen, unter denen Proben, die während der Ricin-A-Kettenreinigung aus E. coli-Zellen erzeugt wurden, auf biologische Aktivität in einem zellfreien in vitro-Protein-Synthese-Assay getestet werden können.
Kaninchen-Retikulozyten-Lysate wurden gemäß der Methode von Allen und Schweet (J. Biol. Chem. (1962), 237, 760-767) hergestellt. Der Assay zeigt die Inhibierung der Protein- Synthese in einem zellfreien System aufgrund eines Mangels an Einbau von ¹&sup4;C-markiertem Leucin in neu synthetisiertes Protein.

6. g. i) Das Assay-Protokoll

Vorratslösung: 1 mM Aminosäure-Mischung minus Leucin. Eine Lösung, die alle L-Aminosäuren mit 1 mM außer Leucin enthält (eingestellt auf pH 7,4 mit NaOH und gelagert bei -70ºC).

Lösung A

40 mM Magnesiumacetat
2 M Ammoniumacetat
0,2 M Tris
(pH 7,4 mit HCl, gelagert bei 4ºC)

Lösung B

ATP (Sigma A5394) 246 mg/ml
GTP (Sigma G8752) 24,4 mg/ml.

Assay-Mischung:

1 ml Aminosäure-Mischung
1 ml Lösung A
0,1 ml Lösung B
103 mg Creatinphosphat
1 mg Creatinkinase
510 ul H&sub2;O
600 ul (60 uCl) L-¹&sup4;C-Leucin (New England Nuclear, NEC-279E)

Reaktionsmischung:

Testprobe 25 ul
Assay-Mischung 12,5 ul
Kaninchen-Retikulozyten-Lysat 25 ul
Blindwertlösung war 2 mg/ml BSA in PBS
Alle Assays wurden doppelt ausgeführt
12,5 ul Assay-Mischung in steriles Reagenzglas gefüllt, 25 ul BSA in PBS in jedes der ersten vier Reagenzgläser als Blindprobe gegeben,
25 ul der Testproben zum Rest der Reagenzgläser hinzugegeben, 1 ml 0,1 M KOH zu den ersten zwei Reagenzgläsern hinzugegeben (Hintergrund-Blindwert),
Reagenzgläser in einem Wasserbad auf 28ºC äquilibriert, 25 ul Kaninchen-Retikulozyten-Lysat (von Temperatur des flüssigen Stickstoffs auftauen gelassen) wurden zu jedem Reagenzglas in Intervallen von 20 s hinzugegeben. Als das erste Reagenzglas für 12 min inkubiert war, wurde 1 ml 0,1 M KOH wieder in Intervallen von 20 s zu jedem Reagenzglas hinzugegeben, so daß alle Reagenzgläser 12 min Inkubierung aufwiesen. Zwei Tropfen von 20%igem Wasserstoffperoxid wurden zu jedem Reagenzglas hinzugegeben, gefolgt von 1 ml 20% TCA. Die Reagenzgläser wurden vermischt und für wenigstens 1 h oder über Nacht bei 4ºC stehen gelassen. Die Niederschläge wurden auf 2,5 cm GFC-Scheiben abfiltriert, mit 3 · 4 ml 5% TCA gewaschen, in Szintillations-Ampullen überführt und mit 10 ml Szintillationsmittel (Ready-Solv. MP, Beckman) versetzt. Nach 1 h wurden die Ampullen geschüttelt und gezählt.

6. g. ii) Einrichtung der Technik zur Verwendung mit E. coli- Lysaten

10 ml L-Bouillon-über-Nacht-Kulturen wurden bei 37ºC herangezogen. 400 ul Aliguote wurden bei 13000 U.p.M. für 30 s pelletiert und der Großteils des Überstands abdekantiert.
Die Pellets wurden zwei Durchläufen von Schockgefrieren in Trockeneis/EtOH, gefolgt von Auftauen bei 37ºC unterworfen. 12 ul 25% Saccharose in 50 mM Tris HCl pH 8,0 wurden hinzugegeben, gefolgt von 4 ul einer 10 mg/ml Lösung von Lysozym.
Nach Inkubierung auf Eis für 15 min wurden 8 ul 0,25 M EDTA hinzugegeben und die Inkubierung für 15 min fortgesetzt. Die Lyse wurde osmotisch eingeleitet, indem die Proben mit Wasser auf 400 ul verdünnt wurden. Dieses Verfahren erzeugte Zählungen von lebensfähigen Zellen von 80 bis 100 pro ml.
Als eine 25 ul-Aliquote dieses Lysats zur Assay- Reaktionsmischung hinzugegeben wurde, betrug der Grad des Einbaus von ¹&sup4;C-Leucin in neu synthetisiertes Protein ~10% der Blindprobe ohne Lysat. Dies war ein ähnlicher Inhibierungsgrad zu dem durch 8 ng/ml Ricin A erzeugten. Verdünnungen des E. coli-Lysats wurden dann hergestellt und der Assay wiederholt. Das Ergebnis zeigte deutlich, daß eine mindestens 16-fache Verdünnung erforderlich war, um die Wirkung des Lysats auf die der Blindprobe zu reduzieren.
Um so sicher wie möglich zu sein, daß die Lyse von E. coli und E. coli-Lysaten nicht die Ricin-A-Toxizität beeinträchtigen würde, wurden zwei Kontroll-Assays durchgeführt. Der erste fügte aus Pflanzen stammendes Ricin A zu einem 16-fach verdünnten E. coli-Zellpellet hinzu, um eine Endkonzentration von 8 ng/ml in der Assay-Mischung nach der Zell-Lyse zu ergeben. Diese beiden Kontrollen zeigten keine nachteilige Wirkung aus den Lysaten oder dem Lyse-Verfahren auf die Inhibierungswirkung von Ricin A.
Diese Techniken wurden verwendet, um die Synthese von biologisch aktivem, rekombinantem Ricin A aus pICI 1102 und den unten beschriebenen Klonen zu bestätigen.

6. h) DNA-Sequenzanalyse

Plasmid-DNA-Sequenzierung wurde zur Analyse von pICI 1102 verwendet. Das gewählte Protokoll wurde von Zagursky et al. (Gene Analysis Techniques Band 2, Nr. 5) modifiziert und beinhaltet die alkalische Denaturierung von doppelsträngiger Plasmid-DNA vor der Primer-Verschmelzung und Sequenzierung durch ein Standardverfahren, wie durch das in Kit-Form von verschiedenen Anbietern bereitgestellte, z. B. Sequenase (United States Bioscience). Unter Verwendung eines Oligonukleotids zum Primen am 3'-Ende von β-Lactamase und verschiedener interner A-Ketten-Primer war eine Sequenzierung beider Stränge des Promotors und des Ricin-A-Gens möglich.
Die Anfangs-Sequenzierungsdaten zeigten ein unerwartetes Ergebnis darin, daß ein zusätzliches KpnI-Fragment zwischen dem Promotor und der Ricin-A-Kodierungssequenz vorlag, d. h.: SEQ. ID NO 4
Das zusätzliche KpnI-Fragment stammt aus M13K19RA und enthält Restriktionsenzymstellen plus den aus pUC8RA klonierten Teil der Ricin-Leitsequenz. Die 5'-Region der Ricin-A-Kette enthält die während der Mutagenese induzierten Basenänderungen.
Eine Untersuchung dieser Sequenz zeigt, daß das erste Translations-Startkodon (ATG) aus dem Rahmen gegenüber demjenigen der Ricin-A-kodierenden Region ist. Ebenfalls gibt es ein Stop-Kodon (TAG) im Rahmen vor dem Ricin-A-Startkodon und eine mutmaßliche Shine-Dalgarno-Sequenz (AGGA), die die Translation vom zweiten ATG erneut starten könnte.
Anschließende Untersuchungen zeigten, daß dieses zusätzliche DNA-Fragment überraschend einen zuträglichen Vorteil bezüglich des Anreicherungsgrades der Ricin-A-Kette in E. coli im Vergleich zu Klonen verursachte, aus denen es herausgeschnitten worden war.
Die vollständige DNA-Sequenz des in pICI 1102 enthaltenen Ricin-A-Gens ist in Fig. 9 gezeigt.

7. Erzeugung anschließender Ricin-A-exprimierender Klone

7. a.) Mutation von Ricin-A-Klon pICI 1102 zum Zulassen der Subklonierung

Zum Subklonieren der zwei KpnI-Fragmente aus dem zufällig erzeugten pICI 1120 in der korrekten Orientierung zur Ricin- A-Expression wäre schwierig. Entsprechend planten wir, die interne KpnI-Erkennungsstelle durch eine einzelne Basen- Substitution (A zu T) zu ändern. Dies würde die KpnI-Spaltung an dieser Stelle verhindern und das Subklonieren eines einzelnen KpnI-Fragments in die Reihe von trp/RBS-Vektoren zulassen. Durch Austausch des Adenins der KpnI- Erkennungsstelle (GGTACC) gegen Thymin (d. h. GGTTCC) ist der erste Rest von Ricin-A unverändert (GTA/GTT = Val). Das heißt:
Das zur Erzeugung dieser Veränderung synthetisierte Oligonukleotid hat die Sequenz:
5' ATAACAACATGGTTCCCAAACAATAC 3'
worin die unterstrichene Base die Mutationsveränderung darstellt.
Wir planten, das mutierte Ricin-A-Fragment in eine Reihe von trp-Expressionsvektoren für vergleichende Expressionsuntersuchungen zu klonieren. Das Klonieren in pICI 0020 liefert einen Vergleich gegenüber pICI 1102, um die Wirkungen der einzelnen Basensubstitution auf die Expression, falls überhaupt, zu bestimmen.

7. b) Mutagenese

Die Schablone zur Mutagenese war MRA16, das der M13-Klon ist, der die zwei KpnI-Fragmente enthält, die in pICI 1102 vorliegen. Nach der Mutagenese wurden die Isolate, die die gewünschten Mutationen trugen, durch zufällige Probenentnahme und DNA-Sequenzbestimmung über die Region identifiziert, an die das mutagene Oligonukleotid spezifisch bindet.
Eine mutierte Schablone wurde als MRA22 bezeichnet. Diese wurde weiter durch DNA-Sequenzbestimmung der gesamten Ricin- A-kodierenden Sequenz analysiert, um die Abwesenheit nicht- spezifischer Mutationen zu bestätigen.

7. c.) Subklonierung

Die mutierten, einsträngigen DNAs wurden zur Transformierung kompetenter E. coli-TG1-Zellen zur Erzeugung einzelner Beläge verwendet. Individuelle Beläge wurden dann gepickt und die replikative form (RF, doppelsträngig) von DNA durch Banding auf Caesiumchlorid/Ethidiumbromid-gestützten Dichtegradienten gereinigt. Die gereinigte RF-DNA wurde vollständig mit KpnI verdaut. Die Klonierung wurde durch "shotgun"-Ligation der verdauten RF-DNA mit dem geeigneten KpnI-geschnittenen und phosphatierten Expressionsvektor oder durch spezifische Ligation des Ricin-A-Fragments nach seiner Reinigung aus einem Agarosegel erreicht. Ligierte DNA wurde in E, coli TG1 oder HB101 transformiert.
Ricin-A-haltige Klone wurden durch Hybridisierungsdurchmusterung unter Verwendung einer ³²P- markierten Ricin-A-Sonde identifiziert, die durch statistisches Hexanukleotid-Primen eines KpnI-Fragments erzeugt wurde, das aus einem anderen Ricin-A-haltigen Klon (pICI 1121) isoliert wurde. Positive Hybridisierung zeigende Kolonien wurden weiter durch Restriktionsanalyse von Plasmid- DNA unter Verwendung einer KpnI-Einfachverdauung und einer EcoRI/BalII-Doppelverdauung durchmustert. KpnI identifiziert die Größe des insertierten Fragments, und EcoRI/BglII bestimmt die Orientierung des Fragments.
Die Klone, in denen die richtige Orientierung des Ricin-A- Fragments zur Expression bestätigt worden war, wurden einer Klon-Selektionszüchtung und Analyse durch SDS-PAGE unterworfen, gefolgt von Coomassie-Anfärbung und Western- Blotting der doppelten Gele. Der Grad der Ricin-A- Anreicherung in diesen Klonen war äquivalent zu den aus pICI 1102 nachgewiesenen.
Ein Isolat wurde ausgewählt und als pICI 1131 bezeichnet.

7. d) Verwendung eines alternativen Transkriptions- Terminatorelements

In diesen Experimenten wurden der trp-Promotor und das Ricin- A-Fragment aus pICI 1131 durch Verdauung mit den Enzymen EcoRI und SalI ausgeschnitten. Das letztere Enzym spaltete zwischen dem 3'-Terminus der Ricin-A-kodierenden Sequenz und dem trpA-Transkriptions-Terminator. Das resultierende Fragment wurde aus einem Agarosegel (2% NuSieve GTG Agarose, FMC Bioproducts) geschnitten und durch Phenol- und Chloroform-Extraktionen, gefolgt von Ethanol-Ausfällung gereinigt. Das gereinigte Fragment wurde mit pICI 1079, geschnitten mit EcoRI und SalI, ligiert. Dieses letztere Plasmid enthält den T&sub4;-Terminator zwischen besonderen SalI- und SphI-Stellen.
Ligierte DNA wurde zur Transformierung von kompetentem E. coli HB101 (BRL) verwendet und Hybridisierungsdurchmusterung zum Nachweis der Gegenwart von Ricin-A-DNA wie in den vorhergehenden Experimenten verwendet. Positiv hybridisierende Klone wurde für die Plasmid-DNA-Zubereitung ausgewählt, gefolgt von Restriktionsanalyse mit EcoRI und SalI zusammen, um die Gegenwart eines Fragments richtiger Größe zu zeigen.
Ein Isolat mit der korrekten Konstruktion wurde identifiziert und als pICI 1185 bezeichnet.

7. e) Die Verwendung eines alternativen Plasmid-Hintergrundes

Plasmid-DNA wurde wurde aus pICI 1185 hergestellt und mit EcoRI und SphI zusammen verdaut, um eine Expressionskassette auszuschneiden, die den trp-Promotor/RBS1/Ricin-A (MRA22) Fragment/T4-Terminator enthält. Diese Fragment wurde durch die in 6.d umrissene Methode isoliert und mit pICI 0042, geschnitten mit EcoRI und SphI, ligiert.
Ligierte DNA wurde zur Transformierung von E. coli HB101 verwendet. HB101-Transformationen wurden auf L-Agar + Tetracyclin plattiert, bei 37ºC über Nacht inkubiert und Kolonien durch Hybridisierung mit einer ³²P-markierten Ricin- A-DNA-Sonde durchmustert.
In beiden Fällen wurden positiv identifizierte Kolonien durch Restriktionsanalyse von Plamid-DNA unter Verwendung von EcoRI/SphI- und EcoRI/BglII-Verdauungen bestätigt. Drei Isolate wurden identifiziert, von denen eines (pICI 1187) in den oben beschriebenen Fermentationen verwendet wurde. Fig. 10 umreißt die Konstruktion von pICI 1187.

SEQUENZLISTE

(1) ALLGEMEINE ANGABEN:
(i) ANMELDER: Imperial Chemical Industries PLC
(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: Fermentationsverfahren
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 4
(iv) BRIEFADRESSE:
(A) ADRESSAT: Legal Department: Patents
(B) STRASSE: Bessemer Road
(C) ORT: Welwyn Garden City
(D) BUNDESLAND: Hertfordshire
(E) LAND: United Kingdom
(F) POSTLEITZAHL: GB-AL7 1HD
(vi) DATEN DER JETZIGEN ANMELDUNG:
(A) ANMELDENUMMER:
(B) ANMELDETAG:
Das Folgende ist eine Liste der in der Anmeldung bezeichneten Sequenzen. Die Sequenzen sind im herkömmlichen 5'- nach 3'- Sinn geschrieben.

SEQ ID NO: 1

LÄNGE: 21 Basen
TYP: Nukleotid
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
GATAACAACA TATTCCCCAA A 21

SEQ ID NO: 2

LÄNGE: 21 Basen
TYP: Nukleotid
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
GATAACAACA TGGTACCCAA A 21

SEQ ID NO: 3

LÄNGE: 21 Basen
TYP: Nukleotid
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
AACAACATGG TACCCAAACA A 21

SEQ ID NO: 4

LÄNGE: 86 Basen
TYP: Nukleotid
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear

Claims

1. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, wobei das Verfahren umfaßt: Kultivieren eines zur Expression des Polypeptids fähigen Wirtes in einem Wachstumsmedium und Kultivieren des Wirtes für einen Anfangszeitraum bei einem ersten pH-Wert, der das Wachstum des Wirtes begünstigt, so daß Polypeptid erzeugt wird; Einstellen des pH auf einen zweiten Wert, der die Anreicherung von löslichem Polypeptid begünstigt, und Kultivieren des Wirtes für einen weiteren Zeitraum bei dem zweiten pH- Wert; und gegebenenfalls Reduzieren der Temperatur des Wachstumsmediums während des Endbereiches der Kultivierung; so daß lösliches Polypeptid erhalten werden kann.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, worin der pH eingestellt wird, indem sein Wert von einem ersten Wert auf einen zweiten Wert abgesenkt wird.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, worin der pH von einem Wert von ca. 6,7 auf niedrigeren Wert eingestellt wird, der größer als 5,5 und kleiner als 6,7 ist.

4. Verfahren gemäß Anspruch 1, 2 oder 3, worin das Verfahren eine Fermentation des Fed-Batch-Typs ist und worin der pH eingestellt wird, bevor Fed-Batch- Bedingungen erreicht sind.

5. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, worin der Wirt E, coli umfaßt und das Polypeptid Ricin A oder ein Analogon davon umfaßt.

6. Verfahren gemäß Anspruch 5, worin der Wirt E. coli DS410 umfaßt.

7. Verfahren gemäß Anspruch 1, worin ein zur Expression von Ricin A oder einem Analogon davon fähiger Wirt in einem Wachstumsmedium kultiviert wird und ein Ergänzungsmittel, das Hefeextrakt einschließt, zum Wachstumsmedium während der Kultivierung hinzugegeben wird.

8. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Temperatur von einem ersten Wert von ca. 37ºC auf einen Wert unterhalb ca. 25ºC verringert wird.

9. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Temperatur von einem ersten Wert von ca. 37ºC auf einen Wert unterhalb ca. 25ºC verringert wird.

10. Verfahren zur Herstellung von Ricin A, welches eine Fermentation des Fed-Batch-Typs umfaßt, worin ein E. coli-Wirt, der zu Expression von Ricin A fähig ist, in einem Wachstumsmedium bei einem pH von 6,7 kultiviert wird, der pH auf einen Wert, der größer als 5,5 und niedriger als 6,7 ist, reduziert wird und für einen weiteren Zeitraum kultiviert wird und gegebenenfalls die Temperatur des Wachstumsmediums während des Endbereiches der Kultivierung reduziert wird und das Ricin A während des Endbereiches geerntet wird.