DE69535704T2

DE69535704T2 - EXPRESSIONSPLASMIDE, DURCH EINEN osmB PROMOTER REGULIERT

Info

Publication number: DE69535704T2
Application number: DE69535704T
Authority: DE
Inventors: Meir Fischer
Original assignee: Ferring International Center SA
Current assignee: Ferring International Center SA
Priority date: 1994-03-22
Filing date: 1995-03-22
Publication date: 2009-02-12
Anticipated expiration: 2015-03-23
Also published as: EP0764202B1; EP0764202A4; ATE386101T1; JP2006068019A; US5795776A; ZA952056B; AU2126695A; JPH10500565A; IL113031A; US5945304A; JP3878207B2; WO1995025785A1; DE69535704D1; EP0764202A1; IL113031A0

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Durch diese Patentschrift hindurch wird auf verschiedene Veröffentlichungen durch arabische Zahlen in Klammern bezug genommen. Die vollständigen Quellenangaben für diese Verweise können an dem Ende dieser Patentschrift direkt vor den Ansprüchen gefunden werden. Die Offenbarungen dieser Veröffentlichungen sind in ihrer Gesamtheit hier durch Verweis in dieser Patentschrift mit eingeschlossen, um den Stand der Wissenschaft, für den diese Erfindung von Bedeutung ist, vollständiger zu beschreiben.
Diese Anmeldung richtet sich auf neuartige Expressionsplasmide für die Expression von Proteinen unter der Kontrolle eines modifizierten E. coli osmB-Promotors.
Eine Anzahl von E. coli-Promotoren sind bekannt und wurden angewendet, um bakterielle Expression von Proteinen zu erhalten. Häufig verwendete Promotoren sind die λ-Bakteriophagen-Promotoren λP_L oder λP_R, die durch den thermolabilen Repressor cI⁸⁵⁷ reguliert wurden. Obwohl sie für das Antreiben der Expression von geklonten Genen hoch effizient sind, erfordert das System die Gegenwart, in dem Wirt oder in dem Plasmid, des thermolabilen Repressors cI⁸⁵⁷. Solche Systeme werden durch die Inkubation der Zellkultur bei 42°C induziert. Die erhöhte Induktionstemperatur kann die Proteinfehlfaltung steigern und kann zu der Bildung von unlöslichen Proteinaggregaten in der Form von Einschlusskörpern führen.
Anderer Promotoren, wie die tac-, lac- oder trp-Promotoren, erfordern die Induktion durch Zugabe von teuren chemischen Induktoren zu dem Medium. Mit der Ausnahme des tac-Expressionssystems sind die anderen Promotoren schwächer und weniger effizient als λP_L.
Ein anderer bekannter Promotor ist der E. coli-deo-Promotor. Dies ist ein konstitutiver Promotor, der einer variable Promotion in der Abwesenheit von Glukose zeigt.
Das osmB-Gen wurde durch Jung et al. (1989) (1) und Jung et al. (1990) (2) beschrieben. Das osmB-Gen, lokalisiert an der Position 28 min auf dem E. coli-Chromosom, kodiert ein Lipoprotein der äußeren Membran, das 49 Aminosäuren enthält. Ein Signalpeptid, das das Protein zu der äußeren Membran dirigiert, besteht aus 23 Aminosäuren. Das Signalpeptid und das reife osmB-Genprodukt sind in vielerlei Hinsicht dem lpp-Genprodukt von E. coli (1) ähnlich. Die Expression dieser Peptide wird durch osmotischen Druck (Hyperosmolarität) und den Alterungsprozess, sprich durch Eintritt in die stationäre Phase des Wachstums, gefördert. Beide Ereignisse kontrollieren die Expression auf dem Level der Transkription. Zwei Transkriptions-Startorte wurden durch RNase-Schutz der in vivo-Nachricht identifiziert. Die zwei Startorte werden als P1 und P2 bezeichnet. Der Ort P2 liegt 150 Basenpaare stromabwärts von P1 und ist der primäre Ort der Regulierung, der entweder auf erhöhte Osmolarität oder das Wachstumsphasensignal reagiert. Der P1-Promotor wird nur aktiviert, wenn sowohl osmotische wie auch Wachstumsphasen-Signale simultan vorliegen. Es wurde eine 7 Basenpaarsequenz stromaufwärts von P2 als das cis-wirkende regulatorische Element identifiziert, das für die osmotische Stimulation von osmB-Expression essentiell ist. Die Expression von osmB in der stationären Phase wird direkt von P2 (2) ausgelöst. Die Nukleotidsequenz der Promotorregion von osmB wird in 1 dargestellt, wie durch Jung et al. (1) beschrieben wird. Jung et al. (8) lehrt, dass osmB-Promotor-Delektionsmutanten eine osmotische Reaktion aufweisen, die stark verringert oder aufgehoben ist.
Der Anmelder hatte Erfolg bei der Herstellung von rekombinanten Plasmiden, die einen modifizierten osmB-Promotor, wie weiter in Anspruch 2 definiert wird, enthalten. Diese Plasmide sind neue Expressionssysteme, die zuvor nicht offenbart wurden, und sie können verwendet werden, um hohe Spiegel einer großen Bandbreite an rekombinanten Polypeptiden unter der Kontrolle des osmB-Protomors herzustellen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Diese Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten eukaryonten Polypeptids durch Verwendung eines Plasmids bereit, umfassend

(a) einen modifizierten E. coli osmB-Promotor, worin ein oder mehr Nukleotide zu entweder dem 3'-, dem 5'-Ende oder beiden addiert oder von diesem (diesen) deletiert wurde(n) und/oder worin Substitutionen an der Sequenz durchgeführt wurden und wobei der Promotor auf eine osmotische Induktion reagiert und eine heterologe Proteinexpression antreiben kann, wobei der modifizierte E. coli osmB-Promotor zu einer der SEQ ID Nr. 8 bis 11 modifiziert wurde und wobei die E. coli osmB-ribosomale Bindungsstelle durch die deo-ribosomale Bindungsstelle durch das in 4 beschriebene Verfahren ersetzt wurde, und
(b) DNA, codierend das rekombinante eukaryontische Polypeptid; wobei das Verfahren die Kultivierung eines Mikroorganismus umfaßt, transformiert durch das Plasmid unter Bedingungen, die die Expression des rekombinanten eukaryontischen Polypeptids und die Gewinnung des so erzeugten rekombinanten eukaryontischen Polypeptids erlauben, wobei die Wirtszellen Sphi930 (ATCC Zugangsnummer 67706), Sphi732 (ATCC Zugangsnr. 67362) und MC1655 (ATCC Zugangsnr. 69339) sind.

Diese Erfindung stellt weiter ein Plasmid bereit, das bei der Einführung in eine geeignete Wirtszelle den Wirt dazu befähigt, die Expression von DNA zu bewirken, die ein gewünschtes eukaryontes Polypeptid kodiert, und dadurch die Herstellung des Polypeptids zu bewirken, das in 5' zu 3'-Reihenfolge das folgende umfasst:
Plasmid, das bei Einführung in eine geeignete Wirtszelle den Wirt dazu befähigt, eine Expression von DNA zu bewirken, die ein gewünschtes eukaryontisches Polypeptid codiert und dadurch Bewirkung der Produktion des eukaryontischen Polypeptids, umfassend in 5' zu 3' Reihenfolge das folgende:

(a) DNA, die einen modifizierten E. coli osmB-Promotor beinhaltet, worin ein oder mehr Nukleotide zu entweder dem 3'-, dem 5'-Ende oder beiden addiert oder von diesem (diesen) deletiert wurde(n) und/oder worin Substitutionen an der Sequenz durchgeführt wurden und wobei der Promotor auf eine osmotische Induktion reagiert und eine heterologe Proteinexpression antreiben kann, wobei der modifizierte E. coli osmB-Promotor zu einer der SEQ ID Nr. 8 bis 11 modifiziert wurde und wobei die E. coli osmB-ribosomale Bindungsstelle durch die deo-ribosomale Bindungsstelle durch das in 4 beschriebene Verfahren ersetzt wurde,
(b) ein ATG-Initiationscodon und
(c) DNA, codierend das eukaryontische Polypeptid in Phase mit dem ATG-Initiationscodon; und zusätzlich beinhaltend eine DNA-Sequenz, umfassend einen Replikationsursprung von einem bakteriellen Plasmid, das zu autonomer Replikation in der Wirtszelle in der Lage ist, und eine DNA-Sequenz, die ein Gen enthält, das mit einem selektierbaren oder identifizierbaren Merkmal assoziiert ist, das manifestiert wird, wenn das Plasmid in der Wirtszelle vorliegt, wobei die Wirtszellen Sphi930 (ATCC Zugangsnr. 67706), Sphi732 (ATCC Zugangsnr. 67362) und MC1655 (ATCC Zugangsnr. 69339) sind.

KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
Die Restriktionskarten für jedes der Plasmide, die in den 3 bis 10 gezeigt werden, identifizieren nicht alle Restriktionsorte, die auf jedem Plasmid vorliegen. In einigen Fällen werden Restriktionsorte in einer Figur gezeigt, aber nicht in einer anderen. Es werden jedoch in allen Fällen diejenigen Restriktionsorte gezeigt, die notwendig sind, um einen Fachmann auf dem Gebiet in die Lage zu versetzen, die Erfindung auszuüben. Die relativen Größen der verschiedenen Plasmide sind nicht maßstabsgetreu gezeichnet und es können keine Rückschlüsse betreffend der Größe der Plasmide oder irgendwelcher Insertionen aus den Figuren gezogen werden.
1: Nukleotidsequenz der Promotorregion von osmB (nicht erfindungsgemäß)
Es wird die Nukleotidsequenz (SEQ ID Nr. 7) der Promotorregion von osmB, wie sie durch Jung et al. (1) beschrieben wird, dargestellt. Die Anmerkungen "21" und "22" beziehen sich auf die Transkriptionsstartorte.
2: Modifizierte synthetische Nukleotidsequenz der Promotorregion von osmB (nicht erfindungsgemäß)
Es wird eine synthetische osmB-Sequenz dargestellt (SEQ ID Nrn. 8 bis 11). Diese Sequenz enthält den osmB-P2-Promotor und den osmB-ribosomalen Bindungsort (modifiziert) und weist u. a. die folgenden Restriktionsenzymorte auf: XmnI (Nukleotide 221 bis 225) und AflII (Nukleotide 287 bis 292).
Die Nummerierung der Nukleotide in 2 korrespondiert zu der Nummerierung in Jung et al. (1).
3: Konstruktion von Plasmid pMFO-12 (nicht erfindungsgemäß)
Plasmid pMFO-12 wurde durch Ligation eines großen Fragmentes, das die Kodierungsregion für Kupfer-Zink-Superoxid-Dismutase (CuZnSOD), erhalten durch BamHI und NdeI-Verdau von Plasmid pMFAT-5534, enthält, mit der synthetischen Sequenz, die die modifizierte osmB-Promotorregion, die in 2 und Beispiel 1 beschrieben wird, kodiert, konstruiert.
Plasmid pMFAT-5534 ist Plasmid pMF-5534 (ATCC-Zugangsnummer 67703) sehr ähnlich. Plasmid pMFAT-5534 enthält den deo-Promotor in der entgegengesetzten Orientierung im Vergleich zu dem Plasmid pMF-5534. Der Verdau des Plasmids pMFAT-5534 mit BamHI, gefolgt durch Religation, wird die zwei Orientierungen in einem 1:1-Verhältnis erzeugen. Zusätzlich weist Plasmid pMFAT-5534 eine TrpA-Transkriptions-Terminierungssequenz, flankiert durch XhoI, auf, welche im Plasmid pMF-5534 fehlt (Wu et al., PNAS 75: 5442–5446 (1978)).
4: Konstruktion von Plasmid pMFO-551
Plasmid pMFAT-5534 wurde mit AvrII gespalten und das 5'-Ende durch Behandlung mit E. coli-DNA-Polymerase (Klenow-Fragment) gefüllt. Das lineare pMFAT-5534 wurde dann mit HindIII gespalten. Ein 600 bp-Fragment, das den deo-ribosomalen Bindungsort und die Kodierungsregion für CuZnSOD enthielt, wurde erhalten.
Plasmid pMFO-551 (ATCC-Zugangsnummer 69339) wurde durch Ligation des 600 bp-Fragmentes, erhalten aus Plasmid pMFAT-5534, wie oben beschrieben wurde, mit dem großen Fragment des Plasmids pMFO-12, erhalten durch Spaltung mit AflII, Ausfüllung des 5'-Endes mit E. coli-DNA-Polymerase und dann Spaltung mit HindIII konstruiert. In dem resultierenden Plasmid pMFO-551 liegt der deo-ribosomale Bindungsort genau stromaufwärts des NdeI-Ortes.
5: Konstruktion von Plasmid pMFOA-18
Plasmid pMFOA-18 (ATCC-Zugangsnummer 69340) wurde durch Ligation eines 1.900 bp-Fragments, das die Kodierungsregion für Acetylcholinesterase (AChE) enthielt, erhalten durch NdeI- und HindIII-Verdau von pAIF-51, mit dem großen Fragment von NdeI- und HindIII-verdauten pMFO-551 konstruiert.
Das AChE-Fragment könnte ähnlich aus Plasmid pAIF-34 (ATCC-Zugangsnummer 68638) erhalten werden, da beide Plasmide pAIF-51 und pAIF-34 dasselbe AChE-Fragment enthalten (6, 7).
6: Konstruktion von Plasmid phGH/pBR-N1 (nicht erfindungsgemäß)
Plasmid phGH/pBR-N1 wurde durch dreischichtige Ligation des großen Fragmentes von PvuI- und ScaI-verdautem Plasmid pchGH77 (ATCC-Zugangsnummer 69359) mit dem großen Fragment von EcoRV- und BglII-verdautem pchGH77 und mit dem folgenden synthetischen Oligomer (SEQ ID Nr. 1):
konstruiert.
7: Konstruktion von Plasmid pMFO/hGH-9
Plasmid pMFO/hGH-9 (ATCC-Zugangsnummer 69360) wurde durch Ligation des großen Fragmentes von NdeI- und HindIII-verdautem Plasmid pMFOA-18 (welches den osmB-Promotor trägt) mit dem kleinen Fragment von NdeI- und HindIII-verdautem Plasmid phGH/pBR-N1 konstruiert.
8: Konstruktion von Plasmid pBR-HBV-N (nicht erfindungsgemäß)
Plasmid pSP-HBV-3 wurde mit EcoRI verdaut und das EcoRI-EcoRI-700 bp-Fragment wurde isoliert und mit XhoI gespalten. Das XhoI-EooRI-341 bp-Fragment, das HBV-PreS1 kodiert, wurde isoliert.
Plasmid pBR-HBV-N wurde durch dreischichtige Ligation des XhoI-EcoRI-341 bp-Fragments, erhalten wie oben beschrieben wurde, mit dem großen Fragment von NdeI-, AvaI- und EcoRI-verdautem pBR-322 (ATCC-Zugangsnummer 37017) und mit den folgenden synthetischen Oligomeren (SEQ ID Nrn. 2 und 3):
konstruiert.
9: Konstruktion von Plasmid pHBV/BASA (nicht erfindungsgemäß)
Plasmid pHBV/BASA wurde durch dreischichtige Ligation des großen Fragments von NdeI- und BamHI-verdautem Plasmid pBASA mit dem PreS1-Fragment von Plasmid pBR-HBV-N, verdaut mit NdeI und EcoRI und mit den folgenden synthetischen Oligomeren (SEQ ID Nrn. 4 und 5):
konstruiert.
10: Konstruktion von Plasmid pMFO/PreS1
Plasmid pMFO-PreS1 (ATCC-Zugangsnummer 69358) wurde durch Ligation des große Fragments von NdeI- und BamHI-verdautem Plasmid pMFOA-18 (welches den osmB-Promotor kodiert) mit dem kleinen Fragmente von NdeI- und BglII-verdautem Plasmid pHBV/BASA konstruiert.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Plasmide pMFO-551 und pMFOA-18 wurden in E. coli gemäß den und in Erfüllung von den Erfordernissen des Budapester Vertrages über die Internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren bei der American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 unter den ATCC-Zugangsnummern 69339 bzw. 69340 am 29. Juni 1993 hinterlegt.
Die Plasmide pchGH77, pMFO/hGH-9 und pMFO/PreS1 wurden in E. coli gemäß den und in Erfüllung der Erfordernisse des Budapester Vertrages über die Internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren bei der American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 unter den ATCC-Zugangsnummern 69359, 69360 bzw. 69358 am 26. Juni 1993 hinterlegt.
Die Erfindung stellt neue Expressionsplasmide für die Expression von Polypeptiden (Proteine) unter der Kontrolle des obigen osmB-Promotors bereit.
Der Begriff "E. coli-osmB-Promotor", der hier verwendet wird, umfasst den modifizierten osmB-Promotor, synthetischen osmB-Promotor und synthetische Derivate des osmB-Promotors, vorausgesetzt, dass solche modifizierten oder synthetischen Derivate die Promotoraktivität des natürlich auftretenden osmB-Promotors von E. coli aufweisen und unter den Umfang von Anspruch 1 fallen.
Synthetische Derivate des osmB-Promotors und/oder modifizierter osmB-Promotor, wie er hier verwendet wird, umfasst eine DNA-Sequenz, die der natürlich vorkommenden DNA-Sequenz, die den E. coli-osmB-Promotor kodiert, ähnlich ist, zu der ein oder mehr Nukleotide an entweder dem 3'-Ende oder dem 5'-Ende oder beiden zugefügt wurden und/oder bei der Substitutionen und/oder Deletionen an der Sequenz durchgeführt wurden und die die fördernde Wirkung des natürlich auftretenden osmB-Promotors und weiter die Merkmale, wie sie in Punkt (a) aus Anspruch 1 definiert wurden, aufweist.
Die Plasmide der vorliegenden Erfindung können eukaryontische Polypeptide (Proteine) exprimieren und herstellen.
Beispiele für Polypeptide (Proteine), die durch die Plasmide der vorliegenden Erfindung exprimiert und hergestellt werden können, sind Säuger-Hypophysenhormone, wie Wachstumshormone, Prolaktine und andere Hypophysenhormone, Enzyme, wie Superoxiddismutase und Acetylcholinesterase (AChE), Antigene, wie Hepatitis-Antigen und andere.
Der Begriff "Polypeptid", der hier verwendet wird, umfasst Homologe des natürlich auftretenden Polypeptids.
Wie hier verwendet, ist der Begriff "Homolog" eins Polypeptids ein Polypeptid, das im wesentlichen die gleiche Aminosäuresequenz und im wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie das natürlich vorkommende Polypeptid aufweist. Daher kann sich ein Homolog von dem natürlich auftretenden Polypeptid durch die Addition, Deletion oder Substitution von einem oder mehreren nicht-essentiellen Aminosäureresten unterscheiden, vorausgesetzt, dass resultierende Polypeptid die biologische Aktivität des natürlich vorkommen Polypeptids behält. Personen, die auf dem Fachgebiet bewandert sind, können einfach bestimmen, welche Aminosäurereste addiert, deletiert oder substituiert werden können (einschließlich mit welchen Aminosäuren solche Substitutionen durchgeführt werden können), wobei gut bekannte Verfahren verwendet werden, einschließlich z. B. konventionellen Verfahren für das Design und die Herstellung von DNA-Sequenzen, die bakterielle Expression von Polypeptidhomologen kodieren, der Modifikation von cDNA und Genomsequenzen durch ortsgerichtete Mutagenesetechniken, die Konstruktion von rekombinanten Polypeptiden und Expressionsvektoren, die bakterielle Expression der Polypeptide und die Messung der biochemischen Aktivität der Polypeptide unter Verwendung von konventionellen biochemischen Assays.
Beispiele für Homologe, die durch die Plasmide der vorliegenden Erfindung exprimiert werden, sind Deletionshomologe, die weniger als alle Reste enthalten, die das natürlich auftretende Polypeptid umfasst, Substitutionshomologe, worin ein oder mehrere Reste durch andere Reste ersetzt wurden, und Additionshomologe, worin ein oder mehrere Aminosäurereste zu einem terminalen oder mittleren Anteil des Polypeptids zugefügt wurden, wobei alle von ihnen die biologische Aktivität des natürlich auftretenden Polypeptids aufweisen.
Substitutionen von Aminosäuren können in Übereinstimmung mit den homologen oder Äquivalenzgruppen entworfen werden, wie durch z. B. Albert L. Lehninger, Biochemistry, Second Edition, Worth Publishers Inc. (1975), Kapitel 4 oder Margaret O. Dayhoff, Atlas of Protein Sequence and Structure, Bd. 5, The National Biomedical Research Foundation (1972), Kapitel 9, beschrieben wird.
Die DNA kann durch Verfahren, die den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind, mutiert werden, z. B. Bauer et al. (1985), Gene 37: 73–81. Die mutierte Sequenz kann in geeignete Expressionsvektoren, die hier beschrieben werden, inseriert werden, die in Zellen eingeführt werden, die dann so behandelt werden, dass die mutierte DNA die Expression des Polypeptidhomologs lenkt.
Die Plasmide der vorliegenden Erfindung, umfassend eine Sequenz die ein Polypeptid kodiert, sind für die Expression in den Wirtszellen, wie in Anspruch 1 definiert wird, adaptiert. Die Plasmide müssen zusätzlich die Regulationselemente umfassen, die für die Expression des geklonten Gens in den Bakterien, Hefen oder Säugerzellen notwendig sind, und die relativ zu der Nukleinsäure, die das Polypeptid kodiert, so lokalisiert sind, dass die Expression davon ermöglicht wird. Regulationselemente, die für die Expression erforderlich sind, beinhalten osmB-Promotorsequenzen, um die RNA-Polymerase zu binden, und einen ribosomalen Bindungsort für die Ribosombindung.
Diejenigen, die auf dem Fachgebiet bewandert sind, werden verstehen, dass Plasmide, die im Zusammenhang mit dieser Anmeldung hinterlegt sind, durch bekannte Techniken (z. B. durch ortsgerichtete Mutagenese oder durch die Insertion von Linkern) einfach geändert werden können, um die Expression von Homologen zu kodieren und zu fördern. Solche Techniken werden z. B. in Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, beschrieben. Die Plasmide können auch verändert werden, um die Expression von anderen Polypeptiden zu kodieren und zu fördern.
Die geeigneten Regulationselemente sind in dem Plasmid relativ zu der DNA, die das Polypeptid kodiert, so positioniert, um die Expression des Polypeptids in einer geeigneten Wirtszelle hervorzurufen. In bevorzugten Ausführungsarten der Erfindung sind die Regulationselemente nahe und stromaufwärts der DNA, die das Polypeptid kodiert, positioniert.
Die ribosomalen Bindungsorte (RBSs), die die mRNA, die aus DNA, die ein erwünschtes Polypeptid kodiert, transkribiert wurde, in die Lage versetzt, an Ribosome innerhalb der Wirtszelle zu binden, ist auch in die vorliegende Erfindung mit eingeschlossen, wie der deo-RBS.
Die Plasmide der Erfindung enthaltend auch ein ATG-Startkodon. Die DNA, die das erwünschte Polypeptid kodiert, befindet sich in Phase mit dem ATG-Startkodon.
Die Plasmide der Erfindung beinhalten auch eine DNA-Sequenz, umfassend einen Replikationsursprung auf einem bakteriellen Plasmid, das zur autonomen Replikation in der Wirtszelle in der Lage ist. Geeignete Replikationsursprünge können aus zahlreichen Quellen erhalten werden, wie aus Plasmid pBR322 (ATCC-Zugangsnummer 37017).
Die Plasmide der vorliegenden Erfindung beinhalten auch eine DNA-Sequenz, die ein Gen enthält, assoziiert mit einem detektierbaren oder identifizierbaren phänotypischen Merkmal, der sich manifestiert, wenn das Plasmid in der Wirtszelle vorlieget, wie ein Medikamenten-Resistenzgen, z. B. Resistenz gegenüber Ampicillin, Chloramphenicol oder Tetracyclin.
Die bakteriellen Wirtszellen sind E. coli-Zellen, namentlich Stämme Sϕ930 (ATCC-Zugangsnummer 67706) oder Sϕ732 (ATCC-Zugangsnummer 67362) oder MC1655 (ATCC-Zugangsnummer 69339).
All die beschriebenen E. coli-Wirtsstämme können von den Plasmiden, die sie beherbergen, durch Verfahren, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind, "geheilt" werden, z. B. das Ethidiumbromidverfahren, das durch R. P. Novick in Bacteriol. Review 33, 210 (1969) beschrieben wird.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten eukaryonten Polypeptids durch die Verwendung eines Plasmids bereit, umfassend den obigen osmB-Promotor, stammend von E. coli, und DNA, die das rekombinante Polypeptid kodiert.
Die vorliegende Erfindung stellt weiter ein Plasmid bereit, welches bei der Einführung in eine geeignete Wirtszelle den Wirt in die Lage versetzt, die Expression von DNA, die ein erwünschtes eukaryontes Polypeptid kodiert, zu bewirken und dadurch die Herstellung des Polypeptids, wie in Anspruch 2 definiert wird, zu bewirken.
Der ribosomale Bindungsort stammt von dem E. coli-deo-Operon.
In bevorzugten Ausführungsarten wird das Polypeptid aus der Gruppe ausgewählt, die aus menschlicher Kupfer-Zink-Superoxiddismutase, Acetylcholinesterase, menschlichem Wachstumshormon und pre-S1-Hepatitisantigen besteht.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsart ist die E. coli-Zelle E. coli MC1655, das Plasmid pMEO-551 enthält, hinterlegt unter der ATCC-Zugangsnummer 69339.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Plasmid für die Herstellung von menschlicher Kupfer-Zink-Superoxiddismutase, bezeichnet als pMEO-551, hinterlegt unter der ATCC- Zugangsnummer 69339, und ein Plasmid für die Herstellung von menschlicher Acetylcholinesterase, bezeichnet als pMFOA-18, hinterlegt unter der ATCC-Zugangsnummer 69340, und ein Plasmid für die Herstellung von menschlichem Wachstumshormon, bezeichnet als pMFO/hGH-9, hinterlegt unter der ATCC-Zugangsnummer 69360, ein Plasmid für die Herstellung von PreS1-Hepatitisantigen, bezeichnet als pMFO-PreS1, hinterlegt unter der ATCC-Zugangsnummer 69358, bereit.
Die vorliegende Erfindung stellt weiter ein Wirt-Plasmidsystem für die Herstellung eines rekombinanten Polypeptids, umfassend ein Plasmid der vorliegenden Erfindung in der obigen Wirtszelle bereit.
In einer bevorzugten Ausführungsart ist die E. coli-Zelle E. coli-Stamm MC1655.
Die vorliegende Erfindung stellt weiter ein Verfahren zur Herstellung von CuZnSOD bereit, welches das Züchten eines Wirt-Plasmidsystems der vorliegenden Erfindung unter Bedingungen, die die Herstellung des CuZnSODs und die Gewinnung des CuZnSODs erlauben, umfasst.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung von AChE bereit, welches das Züchten eines Wirts-Plasmidsystems der vorliegenden Erfindung unter Bedingungen, die die Herstellung von AChE und die Gewinnung des AChEs erlauben, umfasst.
Die vorliegende Erfindung stellt zusätzlich ein Verfahren zur Herstellung von hGH bereit, welches das Züchten eines Wirt-Plasmidsystems der vorliegenden Erfindung unter Bedingungen, die die Herstellung des hGHs und die Gewinnung des hGHs erlauben, umfasst.
Die vorliegende Erfindung stellt darüber hinaus ein Verfahren zur Herstellung von PreS1-Hepatitisantigen bereit, welches das Züchten eines Wirts-Plasmidsystems der vorliegenden Erfindung unter Bedingungen, die die Herstellung des PreS1-Hepatitisantigens und die Gewinnung des PreS1-Hepatitisantigens erlauben, umfasst.
Zusammengefasst haben die Anmelder ein neues Expressionssystem unter Verwendung des obigen osmB-Promotors hergestellt, das Vorteile gegenüber existierenden Promotoren aufweist, wie in Tabelle I unten gezeigt wird. Diese Tabelle stellt einen Vergleich der allgemeinen Vorteile eines osmB-Promotor-Expressionssystems gegenüber anderen Promotor-Expressionssystemen bereit.

Zusätzlich ist ein überraschendes Merkmal des osmB-Promotorsystems in Expressionsplasmiden der hohe Spiegel an Polypeptid, der unter seiner Kontrolle produziert wird. TABELLE 1

osmB-Promotor	λP_L	Deo	Tac, Lac, Trp
Expression gefördert durch billiges NaCl oder Alterung¹.	Thermo-induzierbar bei 38°C bis 42°C.	Variable "Promotion" in der Abwesenheit von Glukose.	Teure chemische Induktoren.
Wachstum und Expression bei irgendeiner Temperatur zwischen 28°C bis 42°C.	Erfordert Temperaturmanipulationen für Wachstum und Expression bei 30°C bis 32°C.	Wachstum und Expression bei jeder Temperatur zwischen 30°C und 42°C.	Wachstum und Expression bei 28°C bis 42°C: chemische Manipulationen erforderlich.
Kein Bedarf an spezialisiertem Wirt	Erfordert spezialisierten Wirt	Spezialisierter Wirt bevorzugt
ökonomisch.	weniger ökonomisch aufgrund höherer Energieerfordernisse	weniger ökonomisch aufgrund von Glycerolverwendung.	überhaupt nicht ökonomisch aufgrund teurer chemischer Induktoren.

Der osmB-Promotor ist ein "förderbarer" konstitutiver Promotor.
BEISPIELE
Die folgenden Beispiele werden bereitgestellt, um die Erfindung zu veranschaulichen, aber sollen in keinster Weise den Umfang der Erfindung, wie er durch die Ansprüche, die folgen, definiert wird, begrenzen, und sollten auch nicht so aufgefasst werden.
Die Beispiele beinhalten nicht ausführliche Beschreibungen für konventionelle Verfahren, die bei der Konstruktion von Vektoren, der Insertion von Genen, die Polypeptide kodieren, in solche Vektoren oder die Einführung der resultierenden Plasmide in Wirte angewendet werden. Die Beispiele beinhalten auch nicht eine detaillierte Beschreibung von konventionellen Verfahren, die für den Assay der Polypeptide, die durch solche Wirts-Vektorsysteme hergestellte werden, oder die Bestimmung der Identität solcher Polypeptide durch Aktivitätsfärbung von isoelektrischen Fokussierungs (IEF)-Gelen verwendet werden. Solche Verfahren sind denjenigen mit normaler Bewanderung auf dem Fachgebiet gut bekannt und werden in zahlreichen Veröffentlichungen beschrieben, deren Offenbarungen hier durch Verweis in dieser Patentschrift mit eingeschlossen sind, einschließlich beispielhalt den Folgenden:

Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.
J. M. McCord and I. Fridovich (1969), J. Biol. Chem. 244: 6049–55.
C. Beauchamp and I. Fridovic (1971), Anal. Biochem. 44: 276–287.

BEISPIEL 1: KONSTRUKTION VON SOD-EXPRESSIONSPLASMID
Ein Vektor, der einen Promotor enthält, der von dem osmB-Promotor stammt, wurde durch Konstruktion unter Verwendung von Verfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, einer synthetischen Sequenz von ungefähr 100 Basenpaaren, die ein verändertes 3'-Ende, relativ zu der natürlich auftretenden Nukleotidsequenz enthielt, hergestellt.
Die vier synthetischen Sequenz A bis D, die in 2 gezeigt werden, wurden hergestellt.
Die Oligonukleotide B und C wurden an dem 5'-Ende durch Polynukleotidkinase phosphoryliert und dann mit dem komplementären Strang gemischt, um zwei Doppelstränge zu erzeugen, wie oben gezeigt wird. Es wurden dann ungefähr 25 pmol von jedem der Doppelstränge gemischt und mit T4-DNA-Ligase ligiert. Die ligierten Oligonukleotide wurden in Plasmid pMFAT-5534, gespalten mit NdeI-BamHI, inseriert (3). Das resultierende Plasmid, bezeichnet als pMFO-12, enthält die synthetische osmB-Sequenz, die den osmB-P2-Promotor enthält, und den ribosomalen Bindungsort, der mit dem menschlichen CuZnSOD-Gen fusioniert ist. Plasmid pMFO-12 wurde in Escherichia coli MC1061 eingeführt und auf Expression von menschlichem CuZnSOD getestet.
Der Gesamtzellextrakt des Wirts, enthaltend das osmB-getriebene Expressionssystem, wurde durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese analysiert. Das erhaltene Zymogramm enthüllte eine Proteinbande, die zu der Größe von CuZnSOD korrespondierte. Die Expression wurde auf ungefähr 1 bis 2% des Gesamtzellproteins geschätzt.
BEISPIEL 2: VERBESSERTES osmB-EXPRESSIONSPLASMID
Der Expressionsgrad von Plasmid pMFO-12 betrugt 1 bis 2% des Gesamtproteins. In einem Versuch, den Expressionsgrad zu verbessern, wurde der osmB-ribosomale Bindungsort durch den deo-ribosomalen Bindungsort durch das Verfahren, das in 4 beschrieben wird, ersetzt. Das resultierende Plasmid, bezeichnet als pMFO-551 (4, ATCC-Zugangsnummer 69339), enthaltend das menschliche CuZnSOD-Gen unter Kontrolle des osmB-Promotors und den deo-ribosomalen Bindungsort, wurde in E. coli-prototrophische Wirte Sϕ930 (ATCC-Zugangsnummer 67706), W2637 (E. coli Genetic Stock Center, Yale University, New Haven, Connecticut), Sϕ732 (ATCC-Zugangsnummer 67362) und MC1655 (ATCC-Zugangsnummer 69339) eingeführt.
Um den Einfluss des Wirtes auf die Expression von CuZnSOD durch Plasmid pMFO-551 zu bestimmten, wurden die vier Wirte, auf die oben Bezug genommen wird, die Plasmid pMFO-551 enthielten, in LB-Medium, das mit 1 × M9-Salzen und 0,1 bis 0,2 Glucose ergänzt worden war, bei 37°C für 18 Stunden gezüchtet. 1 ml der Kulturen wurde geerntet und die Gesamtzelllysate wurden SDS-PAGE-Analyse unterworfen.
Die Ergebnisse der SDS-PAGE zeigten, dass die Expression von CuZnSOD durch den osmB-Promotor Wirt-abhängig ist. In W2637 war der Grad der CuZnSOD-Expression nicht höher als 1 des Gesamtzellproteins, während der Expressionsgrad in Sϕ930 und Sϕ732 ungefähr 15 betrug. Den höchsten Expressionsgrad von ungefähr 25 des Gesamtzellproteins erhielt man mit MC1655.
BEISPIEL 3: VERGLEICH DER EXPRESSION VON CuZnSOD UNTER KONTROLLE VON osmB-, deo- UND λP_L-Promotoren
Ein Vorteil des osmB-Promotors wurde durch die Beobachtung von gesteigerten Expressionsgraden von Protein unter Kontrolle des osmB-Promotors in Vergleich zu der Expression von Protein unter Kontrolle des λP_L-Promotors und des deo-Promotors bestimmt.
Bakterielles Wachstum wurde gemäß den Verfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, durchgeführt, im wesentlichen wie durch Hartman et al. (3, 5) und Fischer et al. (4) beschrieben.
Die getesteten Stämme waren:

1. E. coli A4255, enthaltend Plasmid pSODβ₁T₁₁ (λP_L-Promotor, ATCC-Zugangsnummer 53468).
2. E. coli Sϕ930, enthaltend Plasmid pMF-5534 (deo-Promotor, ATCC-Zugangsnummer 67703).
3. E. coli MC1655, enthaltend Plasmid pMFO-551 (osmB-Promotor, ATCC-Zugangsnummer 69339).

Plasmid pMF-5534 und pMFO-551 stellen konstitutive Expression im Gegensatz zu Plasmid pSODβ₁T₁₁ bereit, welches die Induktion durch Erhitzung auf 42°C benötigt.
Die Wirt-Plasmidsysteme E. coli A4255, enthaltend Plasmid pSODβ₁T₁₁, und E. coli Sϕ930, enthaltend Plasmid pMF-5534, wurden für die Expression von CuZnSOD optimiert.
Die Basiswachstumsmedien enthielten:

Trypton 10 g

Hefeextrakt 5 g

NaCl 5 g

Glukose* 1 g

Entionisiertes H₂O 1 g

* Zugegeben aus steriler Vorratslösung nach Autoklavierung

Das Basismedium enthält auch die folgenden Zusätze, die notwendige Co-Faktoren für den Erhalt von enzymatischer Aktivität des spezifischen Polypeptids, das durch diese drei Stämme hergestellt wird (CuZnSOD) sind.

CuSO₄·5H₂O 0,48 g

ZnSO₄·7H₂O 0,009 g
Das vollständige Medium enthält daher 123 ppm Cu⁺⁺ und 2 ppm Zn⁺⁺. Das geeignete Antibiotikum wurde unter sterilen Bedingungen nach Autoklavierung zugegeben. Doppelte Kulturen von E. coli A4255, enthaltend Plasmid pSODβ₁T₁₁, unter Kontrolle des Lambda-Promotors, wurden in der Gegenwart von 12,5 mg/l Tetracyclin bei 30°C bis die O.D.₆₆₀ 1,1 erreichte, kultiviert. Die Kultur wurde dann durch Erhitzung bei 42°C für 15 Minuten, gefolgt von 75 Minuten bei 38°C induziert.
Die Kulturen wurden an dem Ende der Induktionsperiode beprobt.
Doppelte Kulturen von E. coli-Stamm Sϕ930, enthaltend Plasmid pMF-5534, und E. coli-Stamm MC1655, enthaltend Plasmid pMFO-551, wurden bei 30°C in der Gegenwart von 100 mg/l Natriumampicillin kultiviert. Die Kulturen wurden von Startern beimpft, über Nacht inkubiert und am folgenden Morgen beprobt.
Für jede Probe wurde die optische Dichte der Kultur bei 660 nm gemessen und die Trockenzellgewichte (DCW) unter Verwendung der Formel 1 O.D.-Einheit = 0,38 g/l DCW.
Die Proben wurden in einer Eppendorf-Tischzentrifuge (14.000 UPM) für 10 Minuten zentrifugiert und die Überstände verworfen. Die Pellets wurden bis zur Analyse gefroren gelagert.
Die Pellets wurden sowohl durch SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen und durch SOD-Aktivitätsbestimmung unter Verwendung des Xanthin-Xanthin-Oxidaseverfahres von McCord and Fridovich (J. Biol. Chem. 244: 6049–6055) analysiert. Die spezifische Produktivität von CuZnSOD entspricht mg von aktiven CuZnSOD pro mg Trockenzellgewicht (DCW).

Ein Vergleich der CuZnSOD-Enzymaktivität, die aus diesen drei Wirt-Plasmidsystemen erhalten wird, wird in Tabelle 2 dargestellt. TABELLE 2 Vergleich von CuZnSOD-Produktivitätsdaten in drei E. coli-Expressionssystemen in reichen Medien

Kultur Nr.	Stamm	Promotor	O.D. (660 nm)	DCW (mg/l)	SOD-Aktivität (mg/l)	Spezifische Produktivität (mg aktives CuZnSOD/mg DCW)	durchschnittliche spezifische Produktivität
1	A4255 pSODβ₁T₁₁	λP_L	1,94	737	16,0	0,022	0,021
2	A4255 pSODβ₁T₁₁	λP_L	1,86	707	17,0	0,024	0,021
3	Sϕ930 pMF-5534	deo	2,16	821	16,0	0,019	0,025
4	Sϕ930 pMF-5534	deo	2,0	760	23,9	0,031	0,025
5	MC1655 pMFO-551	osmB	2,49	946	78,0	0,082	0,085
6	MC1655 pMFO-551	osmB	2,75	1.045	91,7	0,088	0,085

Die Ergebnisse zeigen klar, dass die höchste spezifische Produktivität von CuZnSOD in den getesteten Stämmen mit Plasmid pMFO-551 unter Kontrolle des osmB-Promotors erhalten wurde und 3- bis 4-fach höher war als der Grad, der durch die anderen zwei Plasmide erreicht wurde.
BEISPIEL 4: EXPRESSION VON CuZnSOD UNTER KONTROLLE DES osmB-PROMOTORS IN MINIMALMEDIUM

Um die Eigenschaften des osmB-Promotors weiter zu untersuchen, wurde ein weiterer Vergleich der zwei konstitutiven Stämme, die oben beschrieben werden, tragend die osmB- bzw. deo-Promotoren, in Minimalmedium durchgeführt. GLUKOSE-MINERALSALZE-MEDIUM

K₂HPO₄	9 g
KH₂PO₄	1 g
NaCl	5 g
NH₄Cl	1 g
MgSO₄·7H₂O	0,2 g
FeNH₄-Zitrat	0,01 g
Spurenelemente	1 ml
Biotin	0,5 mg
Hefeextrakt	0,1 g
Glukose*	2 g
Natriumampicillin*	0,1 g
Entionisiertes Wasser	1 l

* Zugegeben nach Autoklavierung aus steriler Vorratslösung

Eine sterile Lösung, die das Folgende enthielt, wird pro Liter steriles Medium nach Autoklavierung zugegeben:

CuSO₄·5H₂O 0,48 g

Trinatriumzitrat 0,69 g

ZnSO₄·7H₂O 0,009 g
Diese Ergänzung führt dazu, dass das Medium 123 ppm Cu⁺⁺ und 2 ppm Zn⁺⁺ enthält.

Das Experiment wurde im wesentlichen wie in Beispiel 3 beschrieben durchgeführt und die Ergebnisse werden in Tabelle 3 bereitgestellt. In diesem Falle wurde ebenfalls das Wirt-Plasmidsystem E. coli Sϕ930, das Plasmid pMF-5534 enthielt, für die Expression von CuZnSOD optimiert. TABELLE 3 Vergleich von CuZnSOD-Produktivitätsdaten in zwei Expressionssystemen in Minimalmedium

Kultur Nr.	Stamm	Promotor	O.D. (660 nm)	DCW (mg/l)	SOD-Aktivität (mg/l)	Spezifische Produktivität (mg aktives CuZnSOD mg DCW)	durchschnittliche spezifische Produktivität
7	Sφ930 pMF-5534	deo	3,03	1.151	41,0	0,036	0,039
8	Sφ930 pMF-5534	deo	3,15	1.197	50,0	0,042	0,039
9	MC1655 pMFO-551	osmB	2,75	1.045	67,0	0,064	0,060
10	MC1655 pMFO-551	osmB	2,80	1.064	61,0	0,057	0,060

Die spezifische Produktivität von CuZnSOD, exprimiert unter Kontrolle des osmB-Promotors, ist im Durchschnitt 1,5-fach höher als diejenige, die unter Kontrolle des deo-Promotors exprimiert wird.
Unter Verwendung des Expressionsplasmide, die den modifizierten osmB-Promotor der vorliegenden Erfindung beherbergen, wurde die Produktion von CuZnSOD unter Verwendung von Verfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, vergrößert, um eine ähnlich hochgradige Expression in 500 Liter-Fermentoren herzustellen.
BEISPIEL 5: KONSTRUKTION VON osmB-EXPRESSIONSPLASMID FÜR
DIE EXPRESSION VON MENSCHLICHER ACETYLCHOLINESTERASE (AChE)
Das menschliche Acetylcholinesterase (AChE)-Gen wurde isoliert und unter Kontrolle des osmB-Promotors gestellt, wie in 5 gezeigt wird. Das resultierende Plasmid, bezeichnet als pMFOA-18 (ATCC-Zugangsnummer 69340) enthielt das AChE-Gen unter Kontrolle des osmB-Promotors und deo-ribosomalen Bindungsort. Plasmid pMFOA-18 wurde in E. coli-Wirte MC1061 (ATCC-Zugangsnummer 67364), MC1655 (ATCC-Zugangsnummer 69339), W3110 (ATCC-Zugangsnummer 67705) und MG294 (E. coli Genetic Stock Center, Yale University, New Haven, Connecticut) eingeführt. Isolierte Kolonien wurden in LB-Medium, das M9-Salze und 0,1 bis 0,2% Glukose enthielt, gesät. Die Kulturen wurden bei 37°C für 18 Stunden gezüchtet, geerntet und SDS-PAGE-Analyse unterworfen. Wie in dem Fall von CuZnSOD variierten die Expressionsgrade abhängig von dem Wirt. MC1061, das pMFOA-18 beherbergte, exprimierte AChE in hohen Spiegeln von ungefähr 10 bis 15% Gesamtzellprotein, während alle anderen Stämme AChE in Spiegeln von ungefähr 2 bis 5% Gesamtzellprotein exprimierten. Da AChE extrem hydrophob ist, akkumulierte das Protein in Form von aggregiertem Material in Einschlusskörpern. Die Expression von AChE unter Kontrolle des osmB-Promotors übertraf den Expressionsgrad, der mit dem λP_L-Promotor unter geeigneten Bedingungen für jedes Promotorsystem erhalten wurde.
Das AChE-Gen kann von diesem Plasmid, z. B. durch NdeI- und HindIII-Verdau oder durch andere auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren entfernt und durch eine DNA-Sequenz ersetzt werden, die ein anderes Polypeptid kodiert, um die Expression dieses anderen Polypeptids unter der Kontrolle des osmB-Promotors zu erhalten. Beispiele für dieses Verfahren sind Ersatz des AChE-Gens durch ein hGH-Gen, wie in Beispiel 6 beschrieben wird, und der Ersatz des AChE-Gens durch ein Gen, das preS1 kodiert, wie in Beispiel 7 beschrieben wird. So kann das osmB-Promotorsystem, das hier beschrieben wird, verwendet werden, um eine große Bandbreite an Polypeptiden zu exprimieren.
BEISPIEL 6: KONSTRUKTION EINES osmB-EXPRESSIONSPLAMIDS FÜR DIE EXPRESSION VON MENSCHLICHEM WACHSTUMSHORMON
a. Einführung eines NdeI-Ortes an der N-terminalen Sequenz des reifen hGH.
Um ein Startkodon, ATG, und einen einzigen Restriktionsort, NdeI (CATATG), an der N-terminalen Aminosäure, Phe, des reifen menschlichen Wachstumshormon (hGH)-Proteins einzuführen, wurde ortsgerichtete Mutagenese unter Verwendung des hGH-cDNA-Plasmids pchGH77 (ATCC-Zugangsnummer 69359) durchgeführt (6):
Zwei Aliquots von DNA von pchGH77 wurden mit den folgenden Endunukleasen verdaut:

Aliquot A: PvuI + ScaI

Aliquot B: EcoRV + BglII
Die großen DNA-Fragmente von jeder der obigen Endonukleaseverdauungen wurden isoliert, gemischt und in der Gegenwart des folgenden synthetischen Oligomers (SEQ ID Nr. 6) wieder verbunden:
Die Annealing-Reaktion (2,5 Minuten bei 95°C, 60 Minuten bei 40°C und 60 Minuten bei 4°C) wurde von DNA-Polymerase-Klenow-Reaktion in der Gegenwart von allen vier (4) dnTP's und T4-DNA-Ligase gefolgt.
Die Ligationsmischung wurde verwendet, um E. coli MC106l (ATCC-Zugangsnummer 67364)-kompetente Zellen zu transformieren.
Die Klone wurden auf den mutierten NdeI-Ort durch in situ-Filterhybridisierung gescreent, wobei als eine Sonde das radiomarkierte synthetische Oligomer E bei hoch-stringenten Hybridisierungsbedingungen verwendet wurde.
Klone, die bei Hybridisierung positiv waren, wurden durch Restriktionsenzymverdau (NdeI) und durch DNA-Sequenzierung weiter analysiert. Einer dieser positiven Klone wurde als Plasmid phGH/pBR-N1 bezeichnet.
b. KONSTRUKTION EINES osmB-EXPRESSIONSPLASMIDS FÜR DIE EXPRESSION VON hGH
Wie in 7 gezeigt wird, wurde das hGH-Gen aus Plasmid phGH/pBR-N1 isoliert und unter Kontrolle des osmB-Promotors gestellt. Das resultierende Plasmid, das als pMFO/hGH-9 (ATCC-Zugangsnummer 69360) bezeichnet wird, enthielt das hGH-Gen unter Kontrolle des osmB-Promotors und deo-ribosomalen Bindungsort (7).
c. EXPRESSION VON hGH
Plasmid pMFO/hGH-9 wurde verwendet, um E. coli MC1061 (ATCC-Zugangsnummer 67364), E. coli W3110 (ATCC-Zugangsnummer 67705) und E. coli W2637 (E. coli Genetic Stock Center, Yale University, New Haven, Connecticut)-kompetente Zellen zu transformieren.
Zellen der E. coli-Stämme MC1061, W3110 und W2637, die Plasmid pMFO/hGH-9 beherbergten, wurden in LB-Medium bei 37°C auf eine O.D.₆₆₀ = 1,0 gezüchtet. Die Zellen wurden zentrifugiert, lysiert und die bakteriellen Gesamtproteine wurden durch SDS-PAGE-Elektrophorese analysiert. Eine Haupt-hGH-Proteinbande, die zu einem Molekulargewicht von 22 kD korrespondiert, wurde bei Coomassie-Blau-Färbung nachgewiesen. E. coli MC1061 und W3110 exprimierten hGH in Spiegeln von mindestens 20% Gesamtzellprotein.
BEISPIEL 7: KONSTRUKTION VON osmB-EXPRESSIONSPLASMID FÜR DIE EXPRESSION VON PreS1-HBV
a. Rekonstruktion von N-terminalen Aminosäuren
Die HBV-PreS1-Region wurde aus Plasmid pSP-HBV-3 isoliert und mit den synthetischen Oligomeren F und G, wie in 8 beschrieben wird, ligiert.
Um die N-terminalen Aminosäuren von PreS1, einschließlich NdeI, benachbart zu dem Startkodon ATG, zu rekonstruieren, wurde diese Ligation in der Gegenwart des großen DNA-Fragments EcoRI-NdeI, erhalten aus Plasmid pBR322 (ATCC-Zugangsnummer 37017), verdaut mit EcoRI-, NdeI- und AvaI-Endonukleasen, durchgeführt. Das neu erhaltene Plasmid wurde als pBR-HBV-N bezeichnet.
b. Einführung eines Stoppkodons
pHBV/BASA wurde, wie in 9 gezeigt wird, konstruiert, um ein Translations-Stoppkodon einzuführen.
c. Konstruktion von osmB-Expressionsplasmid für die Expression von PreS1-HBV
Das HBV-PreS1-Fragment wurde isoliert und unter die Kontrolle des osmB-Promotors gestellt, wie in 10 gezeigt wird. Das resultierende Plasmid, das als pMFO/PreS1 (ATCC-Zugangsnummer 69358) bezeichnet wird, enthielt die PreS1-kodierende Region unter Kontrolle des osmB-Promotors und den deo-ribosomalen Bindungsort.
d. Expression von PreS1
Plasmid pMFO/PreS1 wurde verwendet, um E. coli-Stamm MC1061-kompetente Zellen zu transformieren.
E. coli MC1061-Zellen, die das Plasmid pMFO/PreS1 beherbergten, wurden in LB-Medium bei 37°C auf eine O.D.660 = 1,0 gezüchtet. Die Zellen wurden dann zentrifugiert, lysiert und die bakteriellen Gesamtproteine wurden durch SDS-PAGE-Elektrophorese analysiert. Eine PreS1-Proteinbande, die zu einem Molekulargewicht von 14 kD korrespondierte, wurde durch Coomassie-Blaufärbung nachgewiesen.
QUELLENVERZEICHNIS

1. Jung. J. U. et al., J. Bacteriol, 171: 511–520 (1989).
2. Jung, J. U. et al., J. Biol. Chem., 265: 10574–10581 (1990)
3. Hartman, Y. et al. PNAS (USA) 83, 7142–7146, (1986).
4. Fischer, M. et al. App. Microbiol. Biotechnol. 33, 424–428 (1990).
5. Hartman et al., US-Patent-Nr. 4,742,004 .
6. Fischer Meir, US-Patent-Nr. 5,248,604 .
7. PCT-Patentanmeldung Nr. 92/06106, veröffentlicht als WO 93/10830 vom 4. Februar 1993.
8. Jung. J. U. et al. (1990), J. Biol. Chem. 265 (18): 10574.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zur Erzeugung eines rekombinanten eukaryontischen Polypeptids durch Verwendung eines Plasmids, umfassend: (a) einen modifizierten E. coli osmB-Promotor, worin ein oder mehr Nukleotide zu entweder dem 3'-, dem 5'-Ende oder beiden addiert oder von diesem (diesen) deletiert wurde(n) und/oder worin Substitutionen an der Sequenz durchgeführt wurden und wobei der Promotor auf eine osmotische Induktion reagiert und eine heterologe Proteinexpression antreiben kann, wobei der modifizierte E. coli osmB-Promotor zu einer der SEQ ID Nr. 8 bis 11 modifiziert wurde und wobei die E. coli osmB-ribosomale Bindungsstelle durch die deo-ribosomale Bindungsstelle durch das in 4 beschriebene Verfahren ersetzt wurde, und (b) DNA, codierend das rekombinante eukaryontische Polypeptid; wobei das Verfahren die Kultivierung eines Mikroorganismus umfaßt, transformiert durch das Plasmid unter Bedingungen, die die Expression des rekombinanten eukaryontischen Polypeptids und die Gewinnung des so erzeugten rekombinanten eukaryontischen Polypeptids erlauben, wobei die Wirtszellen Sphi930 (ATCC Zugangsnr. 67706), Sphi732 (ATCC Zugangsnr. 67362) und MC1655 (ATCC Zugangsnr. 69339) sind.
Plasmid, das bei Einführung in eine geeignete Wirtszelle den Wirt dazu befähigt, eine Expression von DNA zu bewirken, die ein gewünschtes eukaryontisches Polypeptid codiert und dadurch Bewirkung der Produktion des eukaryontischen Polypeptids, umfassend in 5' zu 3' Reihenfolge das folgende: (a) DNA, die einen modifizierten E. coli osmB-Promotor beinhaltet, worin ein oder mehr Nukleotide zu entweder dem 3'-, dem 5'-Ende oder beiden addiert oder von diesem (diesen) deletiert wurde(n) und/oder worin Substitutionen an der Sequenz durchgeführt wurden und wobei der Promotor auf eine osmotische Induktion reagiert und eine heterologe Proteinexpression antreiben kann, wobei der modifizierte E. coli osmB-Promotor zu einer der SEQ ID Nr. 8 bis 11 modifiziert wurde und wobei die E. coli osmB-ribosomale Bindungsstelle durch die deo-ribosomale Bindungsstelle durch das in 4 beschriebene Verfahren ersetzt wurde, (b) ein ATG-Initiationscodon und (c) DNA, codierend das eukaryontische Polypeptid in Phase mit dem ATG-Initiationscodon; und zusätzlich beinhaltend eine DNA-Sequenz, umfassend einen Replikationsursprung von einem bakteriellen Plasmid, das zu autonomer Replikation in der Wirtszelle in der Lage ist, und eine DNA-Sequenz, die ein Gen enthält, das mit einem selektierbaren oder identifizierbaren Merkmal assoziiert ist, das manifestiert wird, wenn das Plasmid in der Wirtszelle vorliegt, wobei die Wirtszellen Sphi930 (ATCC Zugangsnr. 67706), Sphi732 (ATCC Zugangsnr. 67362) und MC1655 (ATCC Zugangsnr. 69339) sind.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der modifizierte E. coli osmB-Promotor SEQ ID Nr. 8 umfaßt, weiter modifiziert wie in Anspruch 1 angegeben.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der modifizierte E. coli osmB-Promotor SEQ ID Nr. 10 umfaßt, weiter modifiziert wie in Anspruch 1 angegeben.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 und 3 oder 4, wobei das Polypeptid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus der menschlichen Kupfer-Zinksuperoxid-Dismutase, Acetylcholinesterase, menschlichem Wachstumshormon und pre-S1 Hepatitis-Antigen.
Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei das Plasmid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Plasmid pMFO-551 (ATCC Zugangsnr. 69339), Plasmid pMFOA-18 (ATCC Zugangsnr. 69340), Plasmid pMFO/hGH-9 (ATCC Zugangsnr. 69360) und Plasmid pMFO-PreS1 (ATCC Zugangsnr. 69358).
Wirtszelle, umfassend ein Plasmid gemäß einem der Ansprüche 2 bis 6, wobei die Wirtszellen Sphi930 (ATCC Zugangsnr. 67706), Sphi732 (ATCC Zugangsnr. 67362) oder MC1655 (ATCC Zugangsnr. 69339) sind.
E. coli-Wirtszelle gemäß Anspruch 7, wobei es sich um E. coli-Stamm MC1655 handelt.
Plasmid gemäß Anspruch 2, wobei der modifizierte E. coli osmB-Promotor SEQ ID Nr. 8 umfaßt, weiter modifiziert wie in Anspruch 1 angegeben.
Plasmid gemäß Anspruch 2, wobei der modifizierte E. coli osmB-Promotor SEQ ID Nr. 10 umfaßt, weiter modifiziert wie in Anspruch 1 angegeben.
Plasmid gemäß den Ansprüchen 2, 10 oder 11, wobei das Polypeptid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus der menschlichen Kupfer-Zinksuperoxid-Dismutase, Acetylcholinesterase, menschlichem Wachstumshormon und pre-S1 Hepatitis-Antigen.
Plasmid gemäß Anspruch 12, wobei das Plasmid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Plasmid pMFO-551 (ATCC Zugangsnr. 69339), Plasmid pMFOA-18 (ATCC Zugangsnr. 69340), Plasmid pMFO/hGH-9 (ATCC Zugangsnr. 69360) und Plasmid pMFO-PreS1 (ATCC Zugangsnr. 69358).