DE3875043T2

DE3875043T2 - Immunogenes produkt, erhalten durch expression in einer rekombinanten hefe, und verfahren zu seiner reinigung.

Info

Publication number: DE3875043T2
Application number: DE8888904772T
Authority: DE
Inventors: J Barr; Victor Nussenzweig
Original assignee: New York University NYU; Chiron Corp
Current assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc; New York University NYU
Priority date: 1987-03-30
Filing date: 1988-03-30
Publication date: 1993-02-25
Anticipated expiration: 2008-03-31
Also published as: EP0307472B1; IL85906A0; US4826957A; DE3875043D1; HK112693A; DK665688A; AU1791488A; WO1988007550A1; NZ224088A; ES2009588A6; PH27079A; DK665688D0; AU615451B2; JPH01503517A; ZA882269B; EP0307472A1; EP0307472A4; ATE81136T1

Description

Erfindungsgebiet

Diese Erfindung betrifft ein immunogenes Polypeptid, das von einer rekombinanten Hefe exprimiert wird und eine Aminosäuresequenz umfaßt, die einen Teil des P. vivax- Circumsporozoiten (CS)-Proteins, der die Region des wiederholten immundominanten Epitops dieses Proteins einschließt, eingebaut hat, und ein Verfahren zum Reinigen dieses Polypeptids.
Die immunogenen Eigenschaften des P. vivax-CS-Proteins und insbesondere die einer Teilsequenz dieses Proteins sind in Arnot, D.E. et al. Science 230, 815-818, 1985 (eingefügt durch Bezugnahme) zuvor beschrieben worden.
In der Tat ist das gesamte P. vivax-CS-Gen identifiziert und seine Sequenz in den oben erwähnten Dokumenten beschrieben worden. Wie darin beschrieben, umfaßt das P. vivax-CS-Protein eine zentrale Region aus 19 Tandem-Wiederholungen der Sequenz:
Asp-Arg-Ala-Asp/Ala-Gly-Gln-Pro-Ala-Gly
oder, in einer anderen Schreibweise:
D R A D/A G Q P A G
Diese Region enthält das wiederholte immundominante Epitop des P. vivax-CS-Proteins.
(Zwischen den beiden Schreibweisen besteht folgender
Zusammenhang: A = Alanin, C = Cystein, D = Asparaginsäure, E = Glutaminsäure, F = Phenylalanin, G = Glycin, H = Histidin, I = Isoleucin, H = Lysin, L = Leucin, M = Methionin, N = Asparagin, P = Prolin, Q = Glutamin, R = Arginin, S = Serin, T = Threonin, V = Valin, W = Tryptophan und Y = Tyrosin.) Synthetische Peptide, die im wesentlichen aus 18 Aminosäureresten bestehen (d. h. zwei Wiederholungen der oben stehenden Wiederholungssequenz und deren zyklische Permutationen, wie etwa Asp-Gly-Gln-Pro-Ala-Gly-Asp- Arg-Ala) werden von Antikörpern gegen das native P. vivax-CS-Protein erkannt und erzeugen ihrerseits (wenn sie in Säugetiere injiziert werden) Antikörper, die das native CS-Protein erkennen und daran binden. Folglich sind solche Peptide in einem Impfstoff gegen Malaria von Nutzen.
Ein mögliches Vorgehen zur Herstellung eines Impfstoffs gegen P. vivax-Malaria wäre die Synthese von immunogenen Peptiden, die eine Sequenz einschließen, die der des immundominanten Epitops des P. vivax-CS-Proteins entspricht (d. h. eine von vorzugsweise 2 oder mehr Sequenzwiederholungen enthält). Da die Sequenz der Wiederholungseinheit des CS-Proteins ziemlich lang ist (im Gegensatz zu der von P. falciparum), ist im Fall von P. vivax jedoch auf die klassische Peptidsynthese kein Verlaß. Die Anwendung klassischer Synthesemethoden für die Herstellung längerer Peptide ist besonders beschwerlich bei der Durchführung im großen Maßstab, wie es zur Herstellung eines Malaria-Impfstoffs nötig wäre, der an Millionen von Menschen in der ganzen Welt verabreicht werden würde.
Darüber hinaus wäre das Verknüpfen des synthetisierten Peptids mit einem größeren Molekül, das als Träger oder Hilfsstoffs auftreten würde, nötig. Dazu kommt, daß in den meisten Fällen nur ein kleiner Teil der Antikörper gegen ein synthetisches Peptid die gleiche Sequenz in einem nativen Protein erkennt. D.h., selbst wenn das an ein Trägerprotein gebundene synthetische Peptid sich als immunogen erweist, verleihen möglicherweise die meisten der produzierten Antikörper keine schützende Immunität gegen das Pathogen. In dieser Hinsicht ist das synthetische Peptid (NANP)&sub3;, das zur Herstellung eines Impfstoffs gegen P. falciparum in Frage kommt, außergewöhnlich, da mindestens 70% der Antikörper fegen dieses Peptid die Malaria-Sporozoiten erkennen. Die Erklärung für diese ungewöhnliche Tatsache ist wahrscheinlich, daß das (NANP)&sub3;-Peptid viel Prolin (P) und Asparagin (H) enthält, Aminosäuren, die häufig in Umkehrschleifen (reverse turns) des Proteinmoleküls vorkommen. Möglicherweise ahmt in diesem Fall eine bevorzugte Konfiguration von (NANP)&sub3; in Lösung die der gleichen Sequenz in dem nativen CS-Protein nach. Nach einer Betrachtung der Aminosäuresequenz der P. vivax-Sequenzwiederholungen erscheint es jedoch nicht als wahrscheinlich, daß ein P. vivax-Peptid sich ähnlich wie (NANP)&sub3; verhalten wird.
Aus diesen Gründen wurde nach einer alternativen Methode zur Herstellung eines immunogenen Peptids, welches als Impfstoff gegen P. vivax-Malaria verwendet werden könnte, gesucht. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung wandten sich rekombinanter DNA und gentechnologischen Methoden zu, um immunogene Polypeptide zu exprimieren, die dazu verwendet würden, um Säugetieren Immunität gegen P. vivax-Malaria zu verleihen.
Obwohl die Technologie für die Herstellung rekombinanter Bakterien, die einen Teil oder die gesamte sich wiederholende Aminosäuresequenz des P. vivax-Proteins exprimieren würden, zur Verfügung stand, suchten die Erfinder der vorliegenden Erfindung aus folgenden Gründen nach einem alternativen Expressionssystem:
Erstens sollte das Expressionssystem zuverlässig und in der Lage sein, das in Betracht kommende Polypeptid beständig und mit einer guten Ausbeute zu erzeugen. Bakterien können, wenn sie in Massenkultur produziert werden, schwierig zu handhaben sein und ein fremdes Protein überexprimieren.
Zweitens, und was von größerer Bedeutung ist, sind Expressionsprodukte von Bakterien oft schwierig von pyrogenen Verunreinigungen und anderen entzündlichen und toxischen Wirkstoffen, die entweder durch die Bakterien coexprimiert werden oder notwendige Zusätze zum bakteriellen Nährmedium sind, zu befreien.
Drittens sind Expressionsprodukte von Bakterien sehr oft Fusionsproteine, d. h., sie enthalten zusätzliche nichtrelevante Sequenzen, die von den Genen stammen, die den Bakterien angehören.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung wandten sich Hefe-Expressionssystemen zu, die durch neuere Fortschritte auf dem Gebiet der Technologie rekombinanter DNA wesentlich verbessert worden sind. Hefen sind ausdauerndere Organismen als Bakterien und können viel leichter in Massenkultur gehalten werden. Darüber hinaus haben neuere Fortschritte auf dem Gebiet der Hefe-Genetik und -Clonierung die Ausbeuten von Expressionssystemen erhöht.
Die Reinigung von Expressionsprodukten rekombinanter Hefesysteme ist nicht von vornherein komplizierter als die Reinigung von Produkten von bakteriellen rekombinanten Systemen und hängt vor allem von den Eigenschaften des speziellen Proteins, das gereinigt werden soll, ab. Dennoch ist eine solche Reinigung im allgemeinen komplizierter als die eines Peptids oder Proteins, das durch klassische Peptidsynthesemethoden erzeugt wurde.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung wählten ein allgemeines Hefe-Expressionssystem aus, das der Gegenstand der US-Patentanmeldung mit der Serien-Nummer 868,639, die am 29.05.1986 im Namen von R.L. Burke et al. und der Chiron Corporation übertragen, eingereicht wurde, ist. Diese Anmeldung ist hier durch Bezugnahme eingefügt. Ein Teil des P. vivax-Gens, der die gesamte Tandem-Wiederholungssequenz und ein anderes Segment, welches der Sequenzwiederholungsregion vorangeht (wenn die Sequenz vom Amino-Ende zum Carboxyl-Ende gelesen wird), enthielt, wurde (zum Einbau in die Hefeorganismen) ausgewählt. Dieses Segment enthält eine Sequenz, die in allen Malaria-Arten hochkonservativ ist und die zuvor als für sich allein immunogen erkannt wurde (siehe US-Patentanmeldung Serien-Nummer 649,903 von V. Nussenzweig et al., eingereicht am 18.09.1984, der New York Universität übertragen und hier durch Bezugnahme eingefügt).

Aufgaben der Erfindung

Dementsprechend ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein immunogenes, in Hefe gentechnologisch hergestelltes Polypeptid zur Verfügung zu stellen, das immunochemisch reaktiv gegen monoclonale Antikörper gegen das P. vivax-Circumsporozoiten (CS)-Protein und in der Herstellung eines Impfstoffpräparats gegen Malaria verwendbar ist.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung des erwähnten immunogenen Polypeptids, das im großen Maßstab und mit einer hohen Ausbeute durchgeführt werden kann.
Eine andere Aufgabe ist die zur Verfügungstellung eines immunogenen Polypeptids, das zum Einbau in ein Impfstoffpräparat gegen Malaria geeignet ist.
Eine andere Aufgabe ist, ein immunogenes Polypeptid zur Verfügung zu stellen, das zur Verwendung in einem Impfstoffpräparat gegen Malaria geeignet ist, ohne an einen Träger gebunden zu sein.
Eine andere Aufgabe ist die Bereitstellung eines Verfahrens zum Reinigen des erwähnten in Hefe gentechnologisch hergestellten Polypeptids aus einer verunreinigten Präparation, die lysiertes Hefezellenmaterial und Hefenährmedien umfaßt.
Diese und andere Aufgaben der Erfindung werden dem Fachmann durch die vorliegende Beschreibung, die dazugehörigen Ansprüche und die Zeichnungen im Anhang deutlich werden.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Abbildung 1 ist ein Diagramm der Konstruktion des Hefe-Expressionsvektors, der in der vorliegenden Erfindung verwendet wird.
Abbildung 2 ist eine Karte des Hefeplasmids pAB24.
Abbildung 3 ist ein Polyacrylamidgel, das unter Verwendung von Lysaten von mit P. vivax/pAB24 transformierter Hefe und Kontrollhefe erhalten wurde.
Abbildung 4 ist eine Western-Blot-Analyse von Lysaten von mit dem P. vivax/pAB24-Vektor transformierter Hefe.
Abbildung 5 ist eine graphische Darstellung von
(a) dem optischen Dichteprofil des erfindungsgemäß gereinigten Materials (durchgezogene Linie);
(b) der Leitfähigkeit des Elutionspuffers (durchgezogene Linie-schwarze Punkte); und
(c) der prozentualen Aktivität der eluierten Fraktionen bezüglich der Inhibierung der Antikörperbindung an das native CS-Protein.
Abbildung 6 ist eine Autoradiographie eines SDS-PAGE-Gels, die die Reinheit des gentechnologisch hergestellten Polypeptids zeigt, wenn es gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt und gereinigt wurde.
Abbildung 7 ist eine Autoradiographie eines isoelektrischen Fokussierungsgels, die das gentechnologisch hergestellte Polypeptid der vorliegenden Erfindung zeigt.
Abbildung 8 ist eine Eichkurve für einen kompetitiven Radioimmunoassay und zeigt die Inhibierung der Bindung von markiertem, gentechnologisch hergestelltem CS-Polypeptid an Antikörper gegen vivax-CS-Protein durch die Gegenwart von unmarkiertem, gentechnologisch hergestelltem Polypeptid der vorliegenden Erfindung.
Abbildung 9 ist eine graphische Darstellung der Menge von radioaktiv markiertem Ziegen-Anti-Maus-IgG, das an gentechnologisch hergestelltes CS-Polypeptid gebundene Maus-Antiseren erkennt, als Funktion der Verdünnung des Mausserums.
Abbildung 10 ist eine graphische Darstellung der Bindung von markierten Maus-Antiseren (gegen das gentechnologisch hergestellte Peptid) an immobilisiertes synthetisches 18-Aminosäuren(Wiederholungssequenz)-vivax-CS-Peptid, als Funktion der Antikörperkonzentration.
Abbildung 11 ist eine graphische Darstellung der Inhibierung der Bindung von Maus-Antiseren an immobilisiertes gentechnologisch hergestelltes CS-Polypeptid, das gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt und gereinigt wurde, durch synthetisches vivax-CS-Wiederholungssequenz-Peptid, als Funktion der Konzentration des synthetischen (inhibierenden) Peptids.
Abbildung 12 ist eine graphische Darstellung der Bindung von Maus-Antiseren an immobilisiertes synthetisches Nicht-Wiederholungssequenz- Peptid, als Funktion der Antiseren-Verdünnung.

Zusammenfassung der Erfindung

Diese Erfindung betrifft ein in Hefe gentechnologisch hergestelltes (yeast engineered) Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die im wesentlichen aus der Aminosäuresequenz:
besteht, ein Verfahren zu seiner Herstellung, das die folgenden Schritte umfaßt:
(a) Gewinnung eines 15 kb großen BglII Restriktionsendonucleasefragmentes von P. vivax- CS-DNA in einem geeigneten Vektor;
(b) Subclonieren des Fragmentes in einen geeigneten Vektor;
(c) Gewinnung eines 4,1 kb großen P. vivax- DNA-Fragments, das für die Aminosäuresequenz codiert;
(d) Einbauen des Fragments in einen Hefe-Expressionsvektor;
(e) Transformieren von Hefe mit diesem Expressionsvektor;
(f) Kultivieren der Hefe unter Bedingungen, die die Expression des von dem Vektor codierten Proteins ermöglichen; und
(g) Ernten des Mediums, welches das exprimierte Protein enthält,
und einen Anti-Malaria-Impfstoff, der das in Hefe gentechnologisch hergestellte Polypeptid und ein physiologisch akzeptables Medium enthält.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Das P. vivax-CS-Gen wird nachfolgend (zusammen mit der Aminosäuresequenz, für die es codiert) dargestellt.
(Amino-Ende)
(carboxyl-Ende) Das zum Einbau in den Hefe-Wirt ausgewählte DNA-Fragment war:
Dieses Fragment enthält die gesamte Tandem-Wiederholungssequenz sowie eine Region, die im wesentlichen mit der Region I von Dame, et al., Science 225:628 (1984), übereinstimmt, der Sequenzwiederholungsregion vorangeht und für die Aminosäuresequenz A E P K N P R E N K L K Q P G codiert.
Diese Sequenz schließt die Teilsequenz K L K Q P ein, die in allen Malaria-Arten, die bis jetzt untersucht wurden, erhalten bleibt.
Das obenstehende DNA-Fragment wurde aus dem gesamten Gen durch Subclonieren eines 15kb BglII-Fragments erhalten, das wie von Arnot et al. (US-Patentanmeldung Serien-Nummer 754,645 und Science, 230:815-818, 15. November 1985) (beide durch Bezugnahme eingefügt) beschrieben, isoliert wurde. Es wurde dann in die DNA des modifizierten Hefe-Plasmids pAB24, wie nachstehend in Beispiel 1 beschrieben, eingebaut.
Zur Expression des P. vivax-CS-Antigens in Hefe wurde ein Hybridpromotor verwendet, der den starken Hefe-Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase- und den Glucose-regulierbaren Alkohol-Dehydrogenase-2 (ADH-2)- Promotor umfaßt. Die Fusion dieses Promotors an heterologe Gene ermöglicht das Wachstum von Hefekulturen bis zu großer Dichte unter Verwendung von Glucose als Kohlenstoffquelle. Der Verbrauch der Glucose in dem Medium während des fermentativen Wachstums führt zu einer damit einhergehenden Induktion der Expression des heterologen Proteins. Der Einbau des Plasmids in selbständig replizierende Hefeplasmide mit hoher Kopienzahl und die Transformation von Hefezellen erzeugte Stämme, die in der Lage sind, große Mengen an CS-Proteinen nach der Induktion zu exprimieren.
Die Hefe wurde in YEP-Medium (1% w/v Hefeextrakt, 2% Pepton) mit 1% Glucose, wie nachfolgend in Beispiel 1 beschrieben, kultiviert. So wurden 200 l Hefematerial erhalten und bei -80ºC gelagert.
Das so erhaltene Hefematerial enthielt eine komplexe Mischung verschiedener Hefeproteine sowie Zusätze des Kulturmediums. Eine Gelelektrophorese dieses Materials auf einem 7,5% Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gel gab einen Hinweis auf seine Heterogenität (siehe Abbildung 6, Bahn 1). Der Expressionsvorgang und die Plasmidkonstruktion sind in Abbildung 1 skizziert und in dem nachfolgenden Beispiel 1 beschrieben.
Es war beobachtet worden, daß alle Antikörper gegen das P. knowlesi-CS-Protein die immundominante Epitop-Region dieses Proteins selbst dann noch erkannten, wenn das CS-Protein 30 Minuten auf 100ºC erhitzt worden war oder durch eine Behandlung mit 6M Guanidin und 1% beta-Mercaptoethanol vollständig denaturiert worden war (Gysin J. et al. J. Exn. Med., 160:935 (1984); Godson, G.N., et al. Nature, 305:29 (1983).
Diese Beobachtung betraf das gesamte P. knowlesi-CS- Protein und gab keine Gewißheit, daß entweder das P. vivax-CS-Protein ein ähnliches Verhalten beim Erhitzen aufweist oder daß Teile davon, die im wesentlichen aus dem hier eingesetzten Polypeptid bestehen und die Epitop-Region umfassen, immunochemisch reaktiv gegen Anti-P. vivax-Protein-Antikörper bleiben würden, nachdem sie Temperaturbedingungen unterworfen worden waren, die normalerweise zur Denaturierung von Proteinen führen. Ein anderer Unsicherheitsfaktor war, daß in der vorliegenden Erfindung das Fragment des CS-Proteins mit sehr großen Mengen von unwichtigen Materialien vermischt war. Das Erwärmen der Mischung könnte zur Bildung von Aggregaten mit anderen Polypeptiden und der Maskierung der Epitope und/oder gemeinsamer Ausfällung führen. Es war auch nicht bekannt, ob solche Fragmente immunogen bleiben würden, nachdem sie der oben erwähnten Wärmebehandlung unterworfen worden waren.
Dennoch wendeten die Erfinder der vorliegenden Erfindung einen Wärmeschritt als Anfangsschritt der Reinigung des gentechnologisch hergestellten P. vivax-CS-Polypeptids in Hefe an. (So wie es in dieser Patentanmeldung verwendet wird, bezieht sich "Polypeptid" auf ein relativ langes Proteinfragment, "Protein" auf das gesamte Protein und "Peptid" auf ein relativ kurzes Peptid, z. B. eines, das 30 oder weniger Aminosäuren enthält. Was die Verwendung des Wortes "Sequenz" angeht, versteht sich, daß Polypeptide und Peptide gemäß der vorliegenden Erfindung funktionell gleichwertig sind, wenn sie die gleiche Sequenz haben, egal ob die Sequenz vom Amino- zum Carboxyl-Ende oder vom Carboxyl- zum Amino-Ende hin angegeben wird).
Die Mischung wurde anschließend auf 100ºC erwärmt, was zu einer massiven Ausfällung von lysiertem Hefezellenmaterial führte. Der Überstand wurde abgetrennt, getrocknet und lyophilisiert. Der lyophilisierte Überstandsrest wies gegenüber dem Hefeextrakt eine wesentlich größere Reinheit auf (siehe Abbildung 6, Bahn 4).
Eine Lösung des lyophilisierten Materials wurde dann nacheinander durch (a) Ionenaustauschchromatographie unter Verwendung eines Elektrolytgradienten, um das gentechnologisch hergestellte CS-Polypeptid zu eluieren, und
(b) Molekularsieb-Chromatographie weiter gereinigt.
Die Fraktionen, die CS-Polypeptid-Aktivität enthielten, wurden mit einem Radioimmunoassay nachgewiesen. Eine kleine Menge von hochgereinigtem Hefematerial wurde mit ¹²&sup5;I hoher spezifischer Aktivität radioaktiv markiert. Jede Fraktion wurde mit einem klassischen Radioimmunoassay auf ihre Fähigkeiten getestet, die Bindung des markierten Materials an immobilisierte monoclonale Anti-P. vivax-Antikörper, die gegen das repetitive Epitop des P. vivax-Proteins gerichtet sind, zu inhibieren.
Ein wesentlicher Vorteil des Reinigungsverfahrens der vorliegenden Erfindung ist seine Einfachheit und seine leichte Anpassung an einen größeren Maßstab. Das so gereinigte gentechnologisch hergestellte P. vivax-CS-Polypeptid tritt in der SDS-PAGE und isoelektrischen Fokussierung homogen auf und es wird deshalb erwartet, daß es im wesentlichen frei ist von pyrogenen, entzündlichen und toxischen Verunreinigungen, die mit dem lysierten Hefezellenmaterial und Hefekulturmedien einhergehen können.
Die Ausbeute der Kombination des Verfahrens zur Expression in Hefe und des Reinigungsverfahrens der vorliegenden Erfindung betrug 13 mg reines CS-Polypeptid pro Liter Hefekultur. In Anbetracht der Tatsache, daß 200 l dieser Kultur in 3 Tagen unter Verwendung von Apparaturen im Technikumsmaßstab (250 l Fermentationsbehälter) hergestellt wurden, wird deutlich, daß große Mengen des gentechnologisch hergestellten CS-Polypeptids in kurzer Zeit zur Verfügung gestellt werden können.
Ein 200 Liter-Vorrat an Hefeextrakt enthält genügend gentechnologisch hergestelltes CS-Polypeptid, um etwa 25 000 Menschen gegen P. vivax zu immunisieren, wenn pro Person 100 mg Polypeptid verwendet werden.
Wesentliche Vorteile des gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellten CS-Polypeptids schließen ein, daß das gentechnologisch hergestellte Polypeptid:
(a) in großem Maßstab, frei von Verunreinigungen und nicht-relevanten Antigenen, hergestellt werden kann;
(b) ein großes Fragment des nativen CS-Moleküls darstellt;
(c) sich in Nagetieren als sehr immunogen erwiesen hat, wobei Aluminiumhydroxid als Adjuvans verwendet wurde;
(d) die hergestellten Antikörper sowohl mit den "Sequenzwiederholungen" als auch einer beibehaltenen Region des CS-Moleküls reagieren.
Es ist gezeigt worden, daß Antikörper gegen die "Sequenzwiederholungen" die Injektivität des Parasiten sehr wirksam neutralisieren. Antikörper gegen ein Peptid, das diese beibehaltene Region enthält, neutralisieren ebenfalls die Injektivität des Parasiten, aber die inhibitorische Aktivität konnte nicht genau bestimmt werden (Vergara et al. J. Immunol., 134: 3445-3448, (1985)). Darüber hinaus läßt die Tatsache, daß die Sequenz KLKQP, die ein Teil des Peptids ist, in allen CS-Proteinen vorhanden ist, darauf schließen, daß diese Region eine wichtige Funktion hat.
Die vorliegende Erfindung wird nun im folgenden durch spezifische Beispiele ausführlich beschrieben, die dazu bestimmt sind, die Erfindung zu erläutern, ohne ihren Umfang einzuschränken.

Beispiel 1

Restriktion des P. vivax-CS-Gens, Ligierung in einen Vektor, Transformation der Wirts-Hefezellen und Expression
In der folgenden Beschreibung sind alle Restriktionsendonucleasen und Enzyme von Pharmacia Fine Chemical Co., (Piscataway, N.J), New England Biolabs (Beverley, MA), Boehringer Mannheim (Indianapolis, IN) oder Bethesda Research Laboratories, Inc. (Gaithersburg, MD) kommerziell erhältlich und werden den Anweisungen der Hersteller entsprechend verwendet.
Ein pUC9-Vektor (Pharmacia Fine Chemical Co., Piscataway, NJ), der das P. vivax-CS-Protein-Gen enthält, wurde durch Subclonieren eines 15-kb BglII-Fragments, das in die BamHI-Stellen von EMBL3, einen Bakteriophagen lambda-Vektor, eingebaut war (wie in Arnot et al., US-Patentanmeldung, Serien-Nummer 754,645 offenbart und durch Bezugnahme eingefügt), enthalten. Der Clon pUC9Ci wurde mit BglII und XBaI verdaut und gel-gereinigt, um ein 4,1 kb-Fragment zu erhalten, das für die gesamten Wiederholungssequenzen codiert (Arnot et al., Science, 230:815-818 (1985), durch Bezugnahme eingefügt). Dieses gel-gereinigte Fragment wurde dann mit FokI und BanI verdaut und mit den folgenden 5'-phosphorylierten synthetischen Linkern verknüpft, die durch das Phosphoramidit-Verfahren unter Verwendung von DNA Synthesizern des Applied Biosystems' 380A hergestellt wurden.
NcoI Komplementär zum FokI-Überhang
Linker I stellt eine NcoI-Stelle, Linker II einen SalI- Überhang zur Verfügung.
Das die Linker enthaltende Fragment wurde mit NcoI und SalI verdaut, durch Gelelektrophorese isoliert und in pBS100 cloniert, das mit NcoI/SalI verdaut worden war (die Herstellung wird unten beschrieben). Das resultierende Plasmid wird mit pAG/P. vivax 1 bezeichnet. pBS100 ist ein von pPBR322 abgeleitetes Plasmid, das den ADH-2-regulierten GAPDH (Glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase) -Promotor (1200bp) und GAPDH-Terminator (900bp) enthält (siehe Abbildung 1) und seine Herstellung wird nachstehend beschrieben.
Der ADH-2-Teil des Promotors wurde durch das Schneiden eines Plasmids, welches das Wildtyp-ADH-2-Gen enthält (Plasmid pADR2, siehe Beier und Young, Nature, 300: 724-728 (1982), durch Bezugnahme eingefügt), mit dem Restriktionsenzym EcoR5, das an der +66-Position, bezogen auf das ATG-Startcodon, sowie an zwei anderen Stellen in pADR2, außerhalb der ADH-2-Region schneidet, hergestellt. Die resultierende Mischung aus einem Vektorfragment und zwei kleineren Fragmenten wurde mit Bal31 Exonuclease verdaut, um etwa 300pb zu entfernen. Synthetische XhoI-Linker mit der Sequenz
C C T C G A G G
G G A G C T C C
wurden durch chemische Synthese erzeugt und an die mit Bal31 behandelte DNA ligiert. Das resultierende DNA-Linker-Vektorfragment (etwa 5kb) wurde von den Linkern durch Säulenchromatographie (Sepharose CL4B von Pharmacia) getrennt, mit dem Restriktionsenzym XhoI geschnitten, religiert und verwendet, um E. coli durch Transformation Ampicillin-Resistenz zu verleihen. Die Positionen der angehängten XhoI-Linker wurden durch DNA-Sequenzanalyse unter Verwendung von bekannten Standardmethoden bestimmt. Ein Plasmid, das einen in der 5'-nicht-transkribierten Region des ADH-2-Gens gelegenen XhoI-Linker enthielt (Position -232 von ATG aus), wurde mit dem Restriktionsenzym XhoI geschnitten, mit der einzelstrangspezifischen S1-Nuclease behandelt und anschließend mit dem Restriktionsenzym EcoRI behandelt, um ein lineares Vektormolekül zu erzeugen, das ein glattes Ende an der Stelle des XhoI-Linkers und ein EcoRI-Ende hat.
Der GAP-Teil des Promotors wurde durch Schneiden des Plasmids pPGAP (wie in der europäischen Patentanmeldung Nr. 164,556 der Chiron Corporation offenbart, die am 3. Mai 1985 eingereicht wurde, durch Bezugnahme eingefügt ist und der das Anmeldedatum einer entsprechenden U.S.- Anmeldung, Serien-Nummer 609,540, eingereicht am 11. Mai 1984, zuerkannt wurde) mit den Enzymen BamHI und EcoRI, gefolgt von der Isolierung des 0,4Kbp DNA-Fragments, hergestellt. Das Plasmid pPGAP ist ein Hefeplasmid, das einen Hefe-GAPDH-Promotor und Terminatorsequenzen mit flankierenden NcoI und SalI Restriktionsendonuclease-Stellen enthält. Das gereinigte Fragment wurde teilweise mit dem Enzym AluI verdaut, um ein glattes Ende nahe der BamHI-Stelle zu erzeugen, und zu der Herstellung von Plasmid pJS104 verwendet.
Das Plasmid pJS104 wurde durch die Verknüpfung des AluI-EcoRI GAP-Promotor-Fragments mit dem ADH-2-Fragment, das sich auf dem oben beschriebenen linearen Vektor befindet, hergestellt.
Das BamHI-NcoI ADH-GAP-Promotor-Fragment wurde aus dem Plasmid pJS103 erhalten, welches das gleiche ist wie pJS104 (oben), außer daß das GAP-Fragment des ADH-GAP- Promotors etwa 200 bp in pJS103 und 400 bp in pJS104 groß ist. Die Herstellung des pJS103 war die gleiche wie die von pJS104, außer daß das 0,4 kb BamHI-EcoRI- Fragment mit AluI vollständig verdaut (statt teilweise im Fall von pJS104) und ein 200 bp Fragment isoliert wurde.
Die gesamte obere Region, die den Promotor, das P. vivax- Segment und den Terminator enthält, (von nun an als "Expressionskassette" bezeichnet), wurde durch Verdauung mit BamHI herausgeschnitten, durch Gelelektrophorese gereinigt und in das mit BamHI verdaute pAB24 cloniert. Eine Restriktionskarte dieses Plasmids ist in Abbildung 2 gezeigt.
pAB24 ist ein Hefe-Expressionsvektor (Abbildung 2), der die vollständigen 2 u-Sequenzen, die für eine selbständige Replikation in Hefe nötig sind (Broach, in: Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, 1:445, Cold Spring Harbor Press, 1981) und pBR322-Sequenzen enthält. Es enthält auch das URA3-Hefegen, das von dem Plasmid YEp24 abgeleitet ist (Botstein et al., Gene (1979), 8:17 durch Bezugnahme eingefügt) und das LEU2d-Hefegen, das von dem Plasmid pC1/1 abgeleitet ist (siehe europäische Patentanmeldung, Serien-Nummer 116,201, eingereicht am 22. August 1984 im Namen der Chiron Corporation, durch Bezugnahme eingefügt). Das Einbauen der Expressionskassette fand an der BamHI-Stelle von pBR322 statt, wodurch das Gen für die bakterielle Resistenz gegen das Tetracyclin unterbrochen wurde.

Expression von P. vivax-CS-Proteinen

Der von der Chiron Corporation isolierte Saccharomyces cerevisiae-Stamm AB110 (Mat, leu2-04 oder sowohl leu2-3 als auch leu2-112, pep4-3, his4-580, cir*) wurde mit pAB24/P. vivax1-5 nach Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1929-1933 (1978) transformiert. Kolonien aus einzelnen Transformanten, die GAP-regulierte Vektoren in sich trugen, wurden in 2 ml von leu&supmin; (Leucin-Mangel)- Sektionsmedien bis zur späten logarithmischen oder stationären Phase gezüchtet. Nur Hefe, die das Plasmid enthält, kann in diesem Medium wachsen. Die Kulturen wurden anschließend 1:20 (v/v) in YEP (1% w/v Hefeextrakt, 2% w/v Pepton) mit 1% Glucose verdünnt und bis zur maximalen Dichte (etwa 36 h) in diesem Medium gezüchtet. Die Zellen wurden in Gegenwart von Natriumdodecylsulfat (SDS) und Dithiothreitol (DTT) lysiert und die Lysate wurden durch Zentrifugieren geklärt. Die geklärten Lysate wurden einer Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterzogen (Laemmli, U.K., Nature, 277:680, 1970). Nach der Anfärbung mit mit Coomassie Blue, wurde eine starke Bande von etwa 38kD in Extrakten von Transformanten beobachtet, die das P. vivax-Plasmid enthielten (Abbildung 3). Diese Bande wurde in den Zellen nachgewiesen, die mit dem Epressionsvektor transformiert wurden, während sie in Extrakten aus Zellen, die Kontrollplasmide (pCl/1) enthielten, nicht vorhanden war. Das Fusionsprotein macht über 10% des gesamten Zellproteins aus. Der Grund für das abweichende Zellwanderungsverhalten (38kD gegenüber nach der DNA-Konstruktion vorhergesagten 23kD) kann möglicherweise einer Anomalie der SDS-Bindung, wahrscheinlich aufgrund des geringen Anteils an hydrophoben Resten, zugeschrieben werden, wie sie zuvor von P. knowlesi-CS- Proteinen berichtet wurde (Ozaki et al., Cell, 34:185, 1983).
Um die Identität der 38kD-Bande zu bestätigen, wurden von Hefe synthetisierte Proteine auch einer Western- Blot-Analyse unterzogen. Geklärte Hefelysate, die wie oben beschrieben hergestellt wurden, wurden auf Polyacrylamid-Gelen elektrophoretisch aufgetrennt (Laemmli, oben) und die Proteine wurden anschließend durch Elektroblotting auf Nitrocellulosefilter übertragen (Towbin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:3450, 1979). Der Filter wurde eine Stunde mit 1% (BSA) in PBS vorinkubiert und anschließend mit einem monoclonalen Antikörper gegen das P. vivax-CS-Protein 12 Stunden lang bei 40% behandelt. Die Filter wurden mit 1% BSA/PBS gewaschen und ein zweiter, mit Meerrettich-Peroxidase konjugierter Ziegen-Anti-Maus- Antikörper (BioRad Laboratories, Richmond, California) zugegeben. Schließlich wurden die Filter mit Meerrettich- Peroxidase-Farbentwicklungsreagenz (Bio-Rad, Richmond, CA) inkubiert und gewaschen. Die Western-Blot-Analyse zeigte, daß das Fusionsprotein mit den monoclonalen Antikörpern reagierte. (Abbildung 4)

Beispiel 2:

Reinigung des Circumsporozoiten-Polypeptids des Plasmodium vivax.

Die Hefekulturen, die einen Teil des Circumsporozoiten-Polypeptids exprimieren, wurden wie im Beispiel 1 hergestellt. Das exprimierte Polypeptid bestand aus 234 Aminosäuren, die die gesamte Sequenzwiederholungs- Domäne und eine konservative Region, nämlich die Region I von Dame, J.B et al., Science, 225;628 (1984), enthielten. Die N-terminale Aminosäure des exprimierten Polypeptids ist Alanin in den Nucleotid-Positionen Nr. 385-7 (GCA) und die C-terminale Aminosäure ist Prolin in den Nucleotid-Positionen Nr. 1084-1086 (CCA); Arnot et al., Science, 230:815-818, 1985. Der erste Reinigungsschritt des von der Hefe exprimierten Peptidfragments bestand darin, die Extrakte Temperaturen von 100ºC auszusetzen. Die Reinigung wurde wie folgt durchgeführt:
Extrakte von Hefepellets aus 20 Litern Hefekultur wurden in einem Kugelrührwerk hergestellt, wobei die Hefe in einem gleichen Volumen aus 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,3, 0,1% Triton-X, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF (Phenylmethylsulfonylfluorid) und 1 Mikrogramm/ml Pepstatin verdünnt wurde. Der Extrakt (370 ml) wurde zu 200 ml kochendem Wasser gegeben, das 1 mM PMSF und 1 Mikrogramm/ml Leupeptin enthielt. Die Mischung wurde auf die Temperatur von 100ºC gebracht und 10 Minuten lang bei ständigem Rühren auf dieser Temperatur gehalten. Die Mischung wurde auf 0ºC gekühlt und bei 18 000 Umdrehungen pro Minute in einer Beckman Ultrazentrifuge Rotor TI-19 (Beckman Instruments, Palo Alto, CA) 15 Minuten lang zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und dann lyophilisiert.
Das trockene Material wurde in 120 ml Wasser gelöst, zentrifugiert, um eine kleine Restmenge von unlöslichem Material zu entfernen, gegen destilliertes Wasser 48 Stunden lang ausgiebig dialysiert und erneut lyophilisiert. Das Pulver wurde in 3 mM Natriumkaliumphosphatpuffer, pH 7,5, gelöst, und die Leitfähigkeit mit Wasser wurde auf 0,58 mS eingestellt. Die Lösung wurde zentrifugiert, um unlösliches Material zu entfernen, und wurde einer Ionenaustauschchromatographie auf einer (5 cm·24 cm) DEAE-Sephacel-Säule (Pharmacia Fine Chemical Co., Piscataway, N.J.), die mit dem gleichen Puffer equilibriert worden war, unterworfen. Die Flußrate wurde auf 100 ml pro Stunde eingestellt und es wurden 21 ml pro Reagenzglas aufgefangen. Die Säule wurde dann mit 500 ml des gleichen Puffers, d. h. mit etwa einem Säulenvolumen, gewaschen. Die Elution wurde mit einem linearen Puffergradienten, in dem 1500 ml des Ausgangspuffers mit 1500 ml des gleichen Puffers, der auch noch 0,75 M NaCl enthielt, allmählich vermischt wurden, fortgesetzt. Die Anwesenheit des Circumsporozoiten-Polypeptids in den verschiedenen von der Circumsporozoiten-Polypeptids in den verschiedenen von der Säule kommenden Fraktionen wurde unter Verwendung eines kompetitiven Radioimmunoassays, wie unten beschrieben, nachgewiesen.
Die positiven Fraktionen eluierten zwischen den Fraktionen Nr. 65-90 in einer symmetrischen Bande mit Leitfähigkeiten zwischen 2 und 10 mS (Abbildung 5). Die gesamten Fraktionen 65-90 wurden lyophilisiert, in 60 ml von 0,3 M NaCl wieder gelöst und gegen 0,3 M NaCl bei Raumtemperatur mehrere Stunden lang dialysiert. Das Dialysat wurde zentrifugiert, um eine kleine Menge unlösliches Material zu entfernen, und ein Drittel, d. h. 20 ml, wurde einer Molekularsieb-Chromatographie auf mit 0,3 M Natriumchlorid equilibriertem Sephadex G-200 (Pharmacia) unterzogen. Das Sephadex war superfein und die Säule hatte einen Durchmesser von 5 cm und eine Länge von 100 cm. 21 ml-Proben pro Reagenzglas wurden von der Säule aufgefangen. Das CS-Polypeptid eluierte in einer scharfen symmetrischen Bande zwischen den Reagenzgläsern 51-57. Kleinere Mengen von Material mit höherem und niedrigerem Molekulargewicht waren jedoch in Reagenzgläsern vor und nach dieser Bande verteilt. Die Inhalte der Reagenzgläser 51-57 wurden vereinigt, ausgiebig gegen destilliertes Wasser dialysiert und lyophilisiert. Eine Gesamtmenge von 89 mg reine Circumsporozoiten-Polypeptide wurde erhalten. Auf dieser Basis berechneten wir, daß die Ausbeute aus 20 Litern Hefe 89·3, d. h. 267 mg reines Protein oder etwa 13 mg pro Liter Hefekultur, beträgt. Die Reinheit des erhaltenen Circumsporozoiten-Polypeptids wurde durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Geleletrophorese (SDS-PAGE) und durch isoelektrische Fokussierung unter denaturierenden Bedingungen bestimmt. Bei Konzentrationen von 2 mg pro ml wurde eine einzige Bande mit einem isoelektrischen Punkt von 4,3 durch isoelektrische Fokussierung nachgewiesen (Abbildung 7). Durch SDS-PAGE wurde eine Doppelbande mit einem Molekulargewicht zwischen 43 000 und 45 000 nachgewiesen (Abbildung 6). Der Extinktionskoeffizient von Lösungen des CS-Polypeptids, die 1 mg Protein pro ml enthielten, betrug 0,2 bei 280 Nanometern. Eine Probe des Polypeptids wurde einer teilweisen N-terminalen Sequenzanalyse unterzogen und die Hauptsequenz war, wie erwartet, Alanin-Glutaminsäure-Prolin-Lysin-Asparagin-Prolin.
Eine andere Probe wurde mit ¹²&sup5;I radioaktiv markiert und mit für das CS-Protein von Plasmodium vivax spezifischen monoclonalen Antikörpern immunpräzipitiert. Zwischen 75 und 85% der Impulse wurden von dem Antikörper spezifisch erkannt.
Ein festkörpergebundener kompetitiver Radioimmunoassay wurde verwendet, um das gentechnologisch hergestellte CS-Polypeptid während des Reinigungsverfahrens nachzuweisen. Die Eichkurve, die die Antigendosis mit dem in dem Radioimmunoassay erhaltenen Signal korreliert, wurde wie folgt erhalten. Das gereinigte, gentechnologisch hergestellte CS-Polypeptid wurde mit einer spezifischen Aktivität von etwa 2·10&sup6; Impulsen pro Minute pro Mikrogramm Protein mit ¹²&sup5;I radioaktiv markiert, wobei das bekannte Iodogen-Verfahren angewandt wurde. Mischungen, die eine konstante Menge von radioaktiv markiertem gentechnologisch hergestelltem CS-Polypeptid und verschiedene Mengen von gereinigtem kalten (d. h. unmarkiertem) gentechnologisch hergestelltem CS-Polypeptid (in einem gesamten Volumen von 100 Mikrolitern) enthielten, wurden hergestellt. 30 Mikroliter der Mischungen wurden in die Vertiefungen von Mikrotiterplatten gegeben, die bereits mit monoclonalen Antikörpern gegen das Circumsporozoiten-Protein von Plasmodium vivax (2F2) beschichtet waren. Dieser monoclonale Antikörper reagiert mit dem repetitiven Epitop des Circumsporozoiten-Proteins. (Nardin, E.H. et al., J. Exp. Med., 156:20, 1982). Die inhibitorische Wirkung des kalten Peptids auf die Bindung des markierten Peptids an den Boden der Vertiefungen war proportional zu der Konzentration des kalten Peptids. Dieser Assay konnte das kalte Peptid noch in Konzentrationen von 5 Nanogramm pro ml nachweisen (Abbildung 8). Die Untersuchung der Säulenfraktionen und der Extrakte wurde genau wie oben beschrieben durchgeführt und das erhaltene Ausmaß der Inhibierung wurde mit der Eichkurve (Abbildung 8) in Beziehung gesetzt, um die Konzentration des CS-Protein-Peptids zu berechnen. Alle Verdünnungen und das Waschen in diesem Assay wurden in einer Phosphatpuffer-Salzlösung (PBS), die 1,0% Rinderserumalbumin (BSA) und 0,1% Natriumazid enthielt, durchgeführt.
Auf der Basis der Ergebnisse dieser Assays rechneten wir aus, daß die Hefekulturen etwa 60 mg Circumsporozoiten-Protein pro Liter enthalten und daß die Ausbeute an gereinigtem Material etwa 20% des gesamten Materials betrug. Es traten keine Verluste in dem Anfangsschritt der Reinigung auf, d. h. nach dem Kochen der Extrakte entfernte dieser Schritt mehr als 90% der nicht-relevanten Proteinbanden, die in der SDS-PAGE der ursprünglichen Extrakte zu sehen waren.

Beispiel 3:

Immunisierung von Mäusen mit dem in Hefe gentechnologisch hergestellten P. vivax-Polypeptid.
Das gereinigte gentechnologisch hergestellte CS-Polypeptid wurde dann als Antigen zum Immunisieren von Mäusen verwendet. 10 ausgewachsenen weiblichen, 8 bis 12 Wochen alten Swiss-Webster-Mäusen wurden 50 Mikrogramm des gereinigten Peptids, das auf Aluminiumhydroxid adsorbiert war, injiziert. 3 und 6 Wochen später wurde den Mäusen erneut die gleiche Dosis des Antigens injiziert, wobei wiederum Aluminiumhydroxid als Hilfsstoff verwendet wurde. 10 Tage später wurde den Mäusen Blut entnommen und die Seren wurden mit einem immunoradiometrischen Assay analysiert, um Antikörper gegen das CS-Polypeptid nachzuweisen. In diesem Assay sind die Vertiefungen von Mikrotiterplatten mit gereinigtem, gentechnologisch hergestelltem CS-Polypeptid beschichtet (10 Mikrogramm/ml in PBS) und werden mit 30 Mikrolitern von verschiedenen Verdünnungen des Maus-Serums in PBS-BSA inkubiert. Die Vertiefungen wurden dann erneut gewaschen und gezählt.
Alle Seren reagierten mit dem gentechnologisch hergestellten CS-Polypeptid bei einer Verdünnung von 1:10 000 oder mehr. Die Ergebnisse einer Titration der vereinigten Seren sind in Abbildung 9 gezeigt. Daß diese Seren große Mengen von Antikörpern gegen die "Sequenzwiederholungen" des P. vivax-CS-Proteins enthielten, wurde in zwei Experimenten gezeigt, die unten beschrieben sind.
1) Ein synthetisches 18-Aminosäuren-Peptid (18-mer), welches die Sequenz (Asp-Gly-Gln-Pro-Ala-Gly-Asp-Arg-Ala)&sub2; umfaßt und zwei Tandem-Sequenzwiederholungen des P. vivax-CS-Proteins darstellt, wurde synthetisiert, wie in
(a) der laufenden U.S.-Patentanmeldung, Serien-Nummer 754,645, eingereicht am 9. Juli 1985 und durch Bezugnahme in die vorliegende Anmeldung eingefügt; und
(b) Arnot et al., Science, 230:815, 1985, beschrieben. Dieses Peptid wurde verwendet, um die Vertiefungen von Mikrotiterplatten zu beschichten und die Antikörpergehalte der Seren wurde durch den oben beschriebenen Radioimmunoassay nachgewiesen. Die nach der zweiten Antigen-Auffrischungsinjektion erhaltenen Ergebnisse der Titrationen der vereinigten Seren werden in Abbildung 10 gezeigt.
2) Das synthetische 18-Aminosäuren-Peptid wurde auch verwendet, um die Bindung von Antikörpern, die in dem vereinigten Antiserum vorhanden sind, an die Vertiefungen von Kunststoffplatten, die mit dem gentechnologisch CS-Polypeptid beschichtet sind, zu inhibieren. In diesen Experimenten inkubierten wir zunächst Proben einer 1:3000 Verdünnung des vereinigten Serums der Mäuse (erhalten nach der zweiten Auffrischungsinjektion) mit zunehmenden Konzentrationen des oben beschriebenen 18-Aminosäuren-Peptids. Zur Kontrolle wurden Proben des Serums mit der gleichen Konzentration eines anderen 18-mer Peptids mit einer verschiedenen und nicht verwandten Aminosäurensequenz inkubiert. Nach einer Inkubation von 1 Stunde bei Raumtemperatur wurden 30 Mikroliter der Mischungen in die Vertiefungen von Platten gegeben, die mit dem gentechnologisch hergestellten CS-Polypeptid beschichtet worden waren. Die Vertiefungen wurden dann gewaschen, mit radioaktiv markiertem Ziegen-Anti-Maus-Immunoglobulin, wie oben beschrieben, inkubiert, wieder gewaschen und gezählt. Die in Abbildung 11 gezeigten Ergebnisse zeigten, daß das "Sequenzwiederholungs"-Peptid (aber nicht das Kontrollpeptid) etwa 50% der Reaktion zwischen den Antikörpern und dem CS-Protein inhibierte. Alle Verdünnungen und Waschungen in diesen Experimenten wurden mit PBS-BSA durchgeführt.
Die gleichen Seren wurden auch auf das mögliche Vorhandensein von Antikörpern gegen die Region 1 von Dame et al., oben, hin untersucht. Zu diesem Zweck verwendeten wir als immobilisiertes Antigen ein kleines synthetisches Peptid NH&sub2;-Cys-Tyr-Asn-Glu-Lys-Ile-Glu-Arq-Asn-Asn-Lys-Leu-Lys-Gln-Pro-COOH. Dieses Peptid schließt eine Sequenz von 5 Aminosäuren ein, die in allen CS-Proteinen von allen bisher untersuchten Malaria-Parasiten auftreten, Lys-Leu-Lys-Gln-Pro (Dame et al., Science, 225:593, 1984 und Enea, V., persönliche Mitteilung). Die ersten beiden Aminosäuren (Cys und Tyr) sind dem CS-Protein fremd und wurden angefügt, um das Peptid an ein Trägerprotein anzukoppeln und es mit ¹²&sup5;I radioaktiv zu markieren. Dieses Peptid wurde verwendet, um die Vertiefungen von Mikrotiterplatten zu beschichten und die Antikörpergehalte in den Seren wurden, wie oben beschrieben, nachgewiesen. Nach der zweiten Auffrischung erkannten alle Seren dieses kleine Peptid bei Verdünnungen von 1:2000 oder mehr. Die Ergebnisse der Titrationen einer Mischung dieser Seren sind in Abbildung 12 gezeigt.
Die Seren wurden auch durch indirekte Immunfluoreszenz unter Verwendung des Sporozoiten von P. vivax als Antigen getestet. Alle Seren waren bei Verdünnungen von 1:1000 oder mehr positiv.
Schließlich zeigte ein weiteres Experiment, daß relativ geringe Antikörper-Gehalte gegen das gentechnologisch hergestellte CS-Protein die Infektiosität von P. vivax Sporozoiten neutralisieren. Der Assay wurde so durchgeführt, wie in S. 21, Zeile 22 J. Immunol. 132:909, 1984 (durch Bezugnahme eingefügt) beschrieben, wobei die menschliche Hepatoma-Zellinie Hep 62 als Ziel des Parasitenangriffs verwendet wurde. Die in der nachstehenden Tabelle I angegebenen Ergebnisse zeigen, daß ein signifikantes Maß an Inhibierung bei Serum-Verdünnungen von 1:5000 erhalten wurde. Die Prozentsätze der Inhibierung wurden wie folgt berechnet: 100-[(Mittel der experimentellen Werte/Mittel der Kontrollwerte)·100]. Die Kontrollen bestanden aus Sporozoiten, die mit äquivalenten Konzentrationen von normalem (prä-immunem) Mausserum inkubiert wurden.

Tabelle 2

Inhibierung von P. Vivax-Sporozoiten in Hepatocyten in vitro durch Antikörper gegen das in Hefe gentechnologisch hergestellte CS-Protein
(Serumverdünnung)&supmin;¹ % Inhibierung
50 91
250 91
1000 77
5000 42

Claims

1. Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die im wesentlichen aus:

besteht.

2. Verfahren zur gentechnologischen Herstellung eines Peptids nach Anspruch 1 in Hefe, das die folgenden Schritte umfaßt:

(a) Gewinnung eines 15 kb großen BglII Restriktionsendonucleasefragmentes von P. vivax- CS-DNA in einem geeigneten Vektor;

(b) Subclonieren des Fragments in einen geeigneten Vektor;

(c) Gewinnung eines 4,1 kb großen P. vivax- DNA-Fragments, das für die Aminosäuresequenz codiert;

(d) Einbauen des Fragments in einen Hefe-Expressionsvektor;

(e) Transformieren von Hefe mit diesem Expressionsvektor;

(f) Kultivieren der Hefe unter Bedingungen, die die Expression des von dem Vektor codierten Proteins ermöglichen; und

(g) Ernten des Mediums, welches das exprimierte Protein enthält.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei der geeignete Vektor für das Subclonieren des Fragments pUC9 ist.

4. Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Hefe-Expressionsvektor das Plasmid pAB24, das das 4,1 kb große P. vivax-DNA-Fragment enthält, ist.

5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei der Expressionsvektor außerdem einen Alkoholdehydrogenase-2- und Glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase-Hybridpromotor und einen Glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase-Terminator enthält.

6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei der Hybridpromotor aus dem Plasmid pSJ103 erhalten wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6, das außerdem Hefe-2 u- Sequenzen enthält.

8. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die transformierte Hefe der Stamm AB110 ist.

9. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die transformierte Hefe in Leucinmangel-Nährmedien kultiviert wird.

10. Impfstoff gegen Malaria, der ein Polypeptid nach Anspruch 1 und ein physiologisch akzeptables Medium umfaßt.