DE69016671T2

DE69016671T2 - Rekombinanter impfstoff gegen schweinepleuropneumonie.

Info

Publication number: DE69016671T2
Application number: DE69016671T
Authority: DE
Inventors: Yung-Fu Chang; Douglas Struck; Ryland Young
Original assignee: Texas A&M University System
Current assignee: Texas A&M University System
Priority date: 1989-10-31
Filing date: 1990-10-31
Publication date: 1995-08-10
Anticipated expiration: 2010-11-01
Also published as: WO1991006653A1; DK0617128T3; EP0500736A1; HUT64596A; JP3236610B2; AU644829B2; CA2071863A1; CA2071863C; GR3015878T3; EP0500736B1; DE69033999T2; DE69033999D1; ES2181695T3; ES2069099T3; EP0617128B1; DK0500736T3; EP0617128A1; ATE118038T1; JPH05501956A; ATE223487T1

Description

Die US-Regierung hat möglicherweise bestimmte Rechte an der vorliegenden Erfindung gemäß Forschungsvertrag USDA Nr. 6146-01.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Klonierung des Antigene von Actinobacillus pleuropneumoniae (A. pleuropneumoniae) exprimierenden Gens. Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung dieser Antigene und die Verwendung der Antigene zur Impfung von Schweinen gegen Schweine-Pleuropneumonie.
Haemophilus pleuropneumoniae des Schweins stellt eine stark ansteckende Erkrankung der Atemwege dar, die durch das gram-negative Bakterium A. pleuropneumoniae hervorgerufen wird. In den letzten Jahren wurde zum Teil aufgrund der Tendenz zu einer beengten und intensiven Tierhaltung eine erhebliche Zunahme dieser Krankheitsfälle beobachtet. Sie stellt derzeit die Hauptursache für wirtschaftliche Verluste in der Schweinezuchtindustrie dar. Beim Ausbruch der akuten Erkrankung kann die Mortalitätsrate bei Ferkeln 100% und bei Mastschweinen 25% betragen. Infizierte Schweine entwickeln eine akute lokale extensive Pneumonie, begleitet von einer fibrinösen Pleuritis oder chronischen lokalisierten pulmonalen Nekrose mit pleuritischen Adhäsionen. Es wurden acht Serotypen von A. pleuropneumoniae identifiziert, wobei Serotyp 5 bei weitem überwiegt.
Offensichtlich handelt es sich bei einem der Virulenzfaktoren von A. pleuropneumoniae um ein sekretiertes Cytotoxin. Dies wird durch die Tatsache gestützt, daß Zellkulturüberstände von A. pleuropneumoniae sich nachweislich als zytotoxisch für alveoläre Schweinemakrophagen und periphere Monozyten erwiesen haben (Bendixin et al., Infect. Immun., Bd. 33 (1981), S. 673-676). Zusätzlich wurde berichtet, daß mit Ultraschall behandelte Bakterien und sterile Kulturüberstände eine lokalisierte Pneumonie induzieren, die ähnlich der bei natürlich infizierten Schweinen beobachteten Pneumonie ist (Rosendal et al., Proc. Int. Pig. Vet. Soc. Congr., Bd. 5 (1980), S. 221).
Es wird angenommen, daß es sich bei dem A. pleuropneumoniae-Cytotoxin um ein oder mehrere extrazelluläre Hämolysine handelt, die zum Großteil oder ganz von A. pleuropneumoniae-Serotypen gebildet werden. Über die Art des oder der Hämolysine ist wenig bekannt. Es wurde berichtet, daß die verschiedenen Serotypen von A. pleuropneumoniae entweder wärmestabile Kohlenhydrate (Kume et al., Infect. Immun., Bd. 51 (1986), S. 563-570) oder wärmelabile Proteine (Maudsely et al., Can. J. Microbiol., Bd. 32 (1986), S. 801-805) bilden. Ferner wurde berichtet, daß die Hämolysine von A. pleuropneumoniae-Serotypen 1, 2, 3, 5, 6, und 7 RNA benötigen (Martin et al., Can. J. Microbiol., Bd. 31 (1985), S. 456-462). Bisher wurden nur zwei Hämolysine charakterisiert, ein wärmestabiles Hämolysin aus Serotyp 2 (Kume et al., Infect. Immun., Bd. 51 (1986), S. 563-570) und ein 105 kD-Polypeptid, das vom Serotyp 1 sekretiert wird (Frey et al., Infect. Immun., Bd. 56 (1988), S.2570-2575). Die Aminosäuresequenz von beliebigen A. pleuropneumoniae-Hämolysinen ist bis zum Zeitpunkt der vorliegenden Erfindung unbekannt geblieben.
Frey et al., FEMS Microbiology Letters, Bd. 55 (1988), S. 41-46, beschreiben die Reinigung und partielle Charakterisierung von durch Actinobacillus pleuropneumoniae Typ Stamm 4074 gebildetem Hämolysin. Actinobacillus pleuropneumoniae Serotyp Stamm 4074, Serotyp 1, sekretiert ein starkes Hämolysin. Dieses Hämolysin ist thermolabil und wird durch Proteinase K inaktiviert. Unter Anwendung der Ammoniumsulfatfällung und Gelfiltration wurde ein monomeres 105 kDa-Protein mit hämolytischer Aktivität aus dem Überstand von A. pleuropneumoniae Typ Stamm 4074 gereinigt. Es wurden keine anderen Hämolysine nachgewiesen.
Im Abstract B-37 des Annual Meeting of the American Society of Microbiology, Bd. 88 (1988), S. 35 (Fedorka-Cray et al.), wird die Wirksamkeit von Hämolysin als schützendes Antigen gegen Actinobacillus pleuropneumoniae beschrieben. Eine mäßige Fibrillenreaktion wurde für 1 Tag bei Impfung mit dem Hämolysin und den handelsüblichen Bakterien beobachtet.
Derzeit steht kein im Handel erhältlicher Impfstoff gegen Schweine- Pleuropneumonie zur Verfügung. Impfungen wurden durch mit Hitze abgetötete oder mit Formalin fixierte Bakterien versucht, jedoch wurde die Wirksamkeit dieser Immunogene klinisch nicht bewiesen. Es wird erwartet, daß A. pleuropneumoniae-Hämolysin(e) als schützende Immunogene für Schweine gegen Schweine-Pleuropneumonie verwendet werden können.
Ganz allgemein beschreibt die Erfindung DNA-Sequenzen, die für A. pleuropneumoniae-Hämolysin-appA-Antigen kodieren. Ferner stellt die Erfindung rekombinante Vektoren und rekombinante Zellen mit einem Gehalt an den DNA-Sequenzen sowie ein Verfahren zur Herstellung von A. pleuropneumoniae-Hämolysin-appA-Antigen unter Verwendung der rekombinanten Zellen bereit. Außerdem beschreibt die Erfindung die Verwendung des A. pleuropneumoniae-Hämolysin-appA-Antigens zur Impfung von Schweinen gegen Schweine-Pleuropneumonie.
Insbesondere betrifft die Erfindung DNA-Sequenzen, die für die in Fig. 1 gezeigte appA-Aminosäuresequenz oder für Polypeptide mit im wesentlichen den gleichen Aminosäuresequenzen und biologischer Aktivität kodieren. In einer speziellen Ausführungsform stellt die Erfindung DNA- Sequenzen für in Fig. 1 gezeigte appA-Nucleotidsequenzen oder allele Variationen davon bereit. Ferner stellt die Erfindung DNA-Sequenzen bereit, die für eine antigene Determinante von A. pleuropneumoniae-Hämolysin kodieren. Die appA-DNA-Sequenz ist in der ATCC-Hinterlegung Nr. 68135 enthalten.
Ferner stellt die Erfindung rekombinante Vektoren mit einem Gehalt an den vorstehend beschriebenen DNA-Sequenzen bereit. Insbesondere wird erfindungsgemäß festgestellt, daß die rekombinanten Vektoren bakterielle Plasmide sind und daß die DNA-Sequenzen operativ mit einer starken Promotorsequenz verknüpft sind. Ferner werden erfindungsgemäß rekombinante Zellen mit einem Gehalt an den vorstehend beschriebenen DNA-Sequenzen, vorzugsweise bakterielle Zellen, bereitgestellt. Außerdem wird ein A. pleuropneumoniae-Antigen, das durch das appA-Gen oder eine allele Variation davon kodiert wird, oder ein Polypeptid mit im wesentlichen der gleichen Aminosäuresequenz und mit biologischer Aktivität bereitgestellt. A. pleuropneumoniae-Hämolysin appA-Antigen kann durch Züchten und Verarbeiten der vorstehend beschriebenen rekombinanten Zellen hergestellt werden. Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung des A. pleuropneumoniae-Antigens bereit. Ferner stellt sie eine Zusammensetzung bereit, die das Antigen enthält, sowie ein Verfahren zur Verwendung des Antigens als Impfstoff gegen Schweine-Pleuropneumonie.
Fig. 1 stellt die Nucleotidsequenz der appCA-Region und die vorhergesagten Aminosäuresequenzen des appC-Proteins und des appA-Proteins gemäß der vorliegenden Erfindung dar. Promotorähnliche Regionen proximal zum appC-Gen sind durch das Symbol direkt unterhalb der Nucleotidsequenzen gekennzeichnet. Potentielle Ribosomenbindungssequenzen vor appC und appA sowie unmittelbar nach appA sind durch Unterstreichung gekennzeichnet.
Fig. 2 stellt die Restriktionskarten der A. pleuropneumoniae-Hämolysinklone dar. EcoRI-Stellen, die sich vom Vektor ableiten, flankieren die Inserts der einzelnen Klone. Mit Ausnahme von yfc5 exprimiert jeder Klon ein durch Western-Blotting nachgewiesenes 110 kD-Polypeptid. Die Stellungen der beiden offenen Leserahmen appC und appA, die durch Sequenzanalyse gefunden wurden, sind angegeben: C, ClaI; Ev, EcoRV; H, HindIII; P, PstI; S, SacI; X, SbaI; Xo, XhoI.
Die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen und A. Pleuropneumoniae-Hämolysin-Antigene stellen ein wirksames und wirtschaftliches Mittel zur Herstellung eines wirksamen Impfstoffs zum Immunisieren von Schweinen gegen Schweine-Pleuropneumonie dar. Die erfindungsgemäß bereitgestellten DNA- Sequenzen können in verschiedenen Expressionssystemen zur Herstellung von hohen Konzentrationen an A. pleuropneumoniae-Hämolysin-Antigen verwendet werden. Gemäß einem bevorzugten Verfahren werden die DNA-Sequenzen flußabwärts von starken bakteriellen Promotoren positioniert, um die höchstmögliche Materialausbeute zu gewährleisten. Das durch die Bakterien gebildete Antigen kann isoliert und gereinigt sowie Schweinen als Impfstoff gegen Pleuropneumonie verabreicht werden.
Die isolierten und klonierten DNA-Sequenzen kodieren für das A. pleuropneumoniae-Hämolysin. Sie kodieren insbesondere für ein 110 kD-Hämolysin aus A. pleuropneumoniae-Serotyp 5. Die besonders bevorzugte Ausführungsform der Erfindung besteht in der appA-DNA-Sequenz von Fig. 1. Der Fachmann erkennt selbstverständlich, daß die DNA-Sequenz aufgrund einer Degeneration des genetischen Codes variieren kann. Sämtliche DNA-Sequenzen, die für das in Fig. 1 gezeigte A. pleuropneumoniae-appA-Antigen kodieren, fallen unter die vorliegende Erfindung. Ferner erkennt der Fachmann, daß allele Variationen in den DNA-Sequenzen auftreten können, die nicht in signifikanter Weise die antigene Aktivität oder die Aminosäuresequenz der Polypeptide, für die die DNA-Sequenzen kodieren, verändern. Diese allelen Variationen fallen ebenfalls unter die Erfindung.
Die vorliegende Erfindung stellt das als appA bezeichnete Gen bereit. Dieses Gen kodiert für ein Polypeptid mit 957 Aminosäuren. Das appA-Gen kodiert für ein als appA-Antigen bezeichnetes Protein, das keine hämolytische Aktivität aufweist. Die Expression sowohl des erfindungsgemäßen appA-Gens als auch des appC-Gens ist für die normale hämolytische Aktivität des A. pleuropneumoniae-Hämolysins erforderlich. Das durch diese beiden Gene gebildete Protein wird als appCA-Antigen bezeichnet. Sowohl die appCA- als auch appA-Antigene rufen eine Antikörper-Antwort der Antikörper gegen natürliches A. pleuropneumoniae-Hämolysin hervor. Es wird erwartet, daß sowohl das appA- als auch das appCA-Antigen zur Auslösung einer Immunantwort in einem Schwein, die Pleuropneumonie verhindert, verwendet werden kann. Daher umfaßt die Erfindung die für das appA-Antigen kodierenden DNA-Sequenzen.
Ferner ist darauf hinzuweisen, daß Aminosäuresequenzen vorliegen oder konstruiert werden können, die im wesentlichen dem in Fig. 1 gezeigten natürlichen A. pleuropneumoniae-Hämolysin-Polypeptid ähnlich sind und die im wesentlichen die gleichen hämolytischen und antigenen Funktionen ausüben. Der Fachmann erkennt, daß Veränderungen der Aminosäuresequenz vorgenommen werden können, die beispielsweise die biologische Aktivität eines speziellen Peptids erhöhen oder vermindern, ohne daß die Art seiner Funktion verändert wird.
Ferner ist es für den Fachmann offensichtlich, daß die appA- und appCA-Antigene verschiedene antigene Determinanten (Epitope) enthalten können, die von den natürlichen, gegen A. pleuropneumoniae-Hämolysin gebildeten Antikörpern erkannt werden können. Diese antigenen Determinanten können entweder allein oder als Haptene zur Auslösung einer Immunantwort in einem Schwein, die einen Schutz gegen Pleuropneumonie bietet, verwendet werden. Ein Verfahren zur Verwendung des Haptens besteht in dessen Kupplung an einen Träger, wie Albumin. Die Erfindung umfaßt ferner beliebige DNA-Sequenzen, die für eine Aminosäuresequenz mit einem Gehalt an einer appA-antigenen Determinante von A. pleuropneumoniae-Hämolysin kodieren. Eine bevorzugte Ausführungsform besteht in einer DNA-Sequenz die für eine Sequenz von Aminosäuren für appA-Antigen gemäß der Darstellung in Fig. 1 kodiert oder in einer im wesentlichen ähnlichen Sequenz, die eine antigene Determinante von A. pleuropneumoniae-Hämolysin enthält.
Ferner werden erfindungsgemäß antigene Polypeptide bereitgestellt, die nicht natürlicherweise durch A. pleuropneumoniae erzeugt werden. Wie vorstehend erwähnt, ist das appA-Antigen, für das das appA-Gen kodiert, nicht hämolytisch und wird nicht in natürlicher Weise durch A. pleuropneumoniae gebildet. Das appA-Antigen löst jedoch eine Immunantwort aus und kann als ein Impfstoff verwendet werden. Daher umfaßt die Erfindung das appA-Antigen, für das das appA-Gen kodiert. Für die Zwecke der Erfindung umfaßt der Ausdruck A. pleuropneumoniae-Hämolysin-Antigen das appA- Antigen und beliebige Aminosäuresequenzen, die eine antigene Determinante von A. pleuropneumoniae-Hämolysin enthalten.
Die Gene für das A. pleuropneumoniae-Hämolysin werden kloniert, indem man zunächst A. pleuropneumoniae-DNA aus den verschiedenen Serotyp-Stämmen oder aus von mit Actinobacillus infizierten Schweinen isolierten Stämmen isoliert. Beispielsweise haben die Erfinder einen A. pleuropneumoniae-Serotyp 5 verwendet. Dieser wurde gewählt, da er bei den Serotypen überwiegt und einer der virulentesten Serotypen ist. Jedoch können praktisch beliebige Stämme eingesetzt werden, die zur Auslösung von Schweine Pleuropneumonie befähigt sind. In der vorliegenden Erfindung ist es bevorzugt, eine Genombibliothek der chromosomalen A. pleuropneumoniae-DNA herzustellen. Verschiedene Verfahren zur Herstellung von derartigen Bibliotheken sind verfügbar, und für den Fachmann ist es ersichtlich, daß verschiedene rekombinante Vektoren und Restriktionsenzyme in diesem Verfahren herangezogen werden können. Vorzugsweise wird ein Verdauungsprodukt der chromosomalen A. pleuropneumoniae-DNA unter herkömmlichen Techniken zu einer Bakteriophagenbibliothek kloniert.
Da das Serotyp 5-Hämolysin nicht charakterisiert oder sequenziert worden ist, mußte ein Verfahren zum Isolieren und Selektieren des Hämolysin-Gens entwickelt werden. Es ergab sich, daß eine Anzahl von gram-negativen pathogenen Organismen lytische Toxine mit hohem Molekulargewicht (105-110 kD) sekretieren, die immunologisch und genetisch mit dem Hämolysin von Escherichia coli verwandt sind (Chang et al., FEMS Lett., Bd. 60 (1989), S. 169-174 und Koranakis et al., J. Bacteriol., Bd. 169 (1987), S. 1509-1515). Zur Feststellung, ob das sekretierte Hämolysin von A. pleuropneumoniae ein Mitglied der RTX-Cytotoxinfamilie ist, wurden Kulturüberstände von P. haemolytica, A. pleuropneumoniae und einem E. coli- Stamm, der pSF4000 trug, durch Western-Blot unter Verwendung von Antiserum gegen P. haemolytica-Leukotoxin analysiert. Eine kreuzreagierende Polypeptidspezies mit Mr = 110 000, was geringfügig größer als das scheinbare Molekulargewicht von Leukotoxin und nahezu identisch mit dem von E. coli-Hämolysin ist, wurde nachgewiesen.
Dies zeigte, daß A. pleuropneumoniae-Hämolysin zur gleichen Familie wie das P. haemolytica-Leukotoxin gehört. Daher wurde ein Teil der veröffentlichten Sequenz des lktCA-Gens aus P. haemolytica als Sonde zur Isolierung der gewünschten Klone verwendet. Ferner wurden erfindungsgemäß Antikörper gegen A. pleuropneumoniae-Hämolysin hergestellt und zum immunologischen Screening der Bakteriophagenbibliothek verwendet. Diese Screeningverfahren wurden unter Heranziehung üblicher Techniken durchgeführt. Plaques, die positive Signale ergaben, wurden aufgenommen, einem erneuten Screening unterzogen und amplifiziert. Die Restriktionsfragmente von selektierten Phageninserts können sodann durch verschiedene Verfahren unter Einschluß des Verfahrens von Maxam und Gilbert und des Didesoxy- Kettenterminationsverfahrens von Sanger sequenziert werden.
Erfindungsgemäß wurde durch Antikörperscreening ein einzelner positiver Klon (vgl. Fig. 2) identifiziert. Ein Screening der gleichen Bibliothek mit von P. haemolytica abgeleiteten DNA-Sonden führte zur Identifikation von 8 Klonen, die miteinander und mit dem durch Antikörperscreening isolierten Klon überlappten (vgl. Fig. 2). Bei der erfindungsgemäß geklonten DNA handelte es sich um ein 3,8 kb-Fragment mit einem Gehalt an dem gesamten Leserahmen für das appA-Antigen (und auch mit dem Leserahmen für das kleinere appC-Protein, das das Toxinprotein aktiviert). Diese beiden Gene zusammen stellen die appCA-Gene dar, die für das gesamte 110 kD-appCA-Antigen mit hämolytischer Aktivität kodieren. Die Nucleotidsequenz der appCA-Region und die vorhergesagte Aminosäuresequenz der appC- und appA-Proteine sind in Tabelle 1 gezeigt.
Das die appCA-Gene enthaltende DNA-Fragment kann zu einem geeigneten rekombinanten Vektor subkloniert werden, beispielsweise zu einem Plasmidvektor oder einem viralen Bakteriophagenvektor. Der Fachmann erkennt, daß es zahlreiche Vektoren gibt, die verwendet werden können, z. B. pBR322, die pAR-Reihe, pKK223-3 und die PUR-Reihe. Noch zahlreicher sind die Techniken für die Konstruktion dieser rekombinanten Vektoren. Einige der für die Vektorwahl ausschlaggebenden Parameter sind die Art des zu verwendenden Expressionssystems und die Größe des DNA-Inserts. Da es sich bei den appCA-Genen um bakterielle Gene handelt und der bevorzugte Expressionsvektor eine bakterielle Zelle ist, handelt es sich beim bevorzugten rekombinanten Vektor um einen bakteriellen Vektor, insbesondere um ein bakterielles Plasmid. Die appCA-Regionen der Bakteriophagenklone yfc7 und yfc8 wurden in den Vektor pHG16S subkloniert.
Der rekombinante Vektor wird sodann durch ein für das System geeignetes Verfahren in das gewählte Expressionssystem eingeführt. Während ein bakterielles Expressionssystem für die gewerbliche Anwendung der Erfindung besonders geeignet ist, kann auch ein eukariontisches System verwendet werden. Beispiele für geeignete Expressionssysteme sind E. coli JM103, E. coli C600, E. coli CO4 und E. coli DH20. Bei dem in der vorliegenden Erfindung verwendeten Expressionssystem handelt es sich um E. coli TBI.
Obgleich das appA-Gen im rekombinanten System unter Verwendung des natürlichen A. pleuropneumoniae-Promotors exprimiert werden kann, ist es bevorzugt, das appA-Gen flußabwärts von einem geeigneten starken Promotor und/oder einem Amplifikationsgen zu plazieren. Der Typ des Promotors und/oder Amplifikators hängt vom rekombinanten Vektor und vom Expressionssystem ab. Bei erfindungsgemäß bevorzugten Promotoren handelt es sich um starke bakterielle Promotoren, wie die lac- oder tryp-Promotoren. Beispiele für andere Promotoren, die verwendet werden können, sind der T7RNA-Polymerase-Promotor und der tac-Promotor. Dies führt zu erheblich höheren Graden der Expression des Antigens. Die rekombinanten Vektoren mit einem Gehalt an den vorstehend beschriebenen DNA-Sequenzen und die rekombinanten Zellen mit einem Gehalt an diesen DNA-Sequenzen, die zur Bildung von A. pleuropneumoniae-appA-Antigenen verwendet werden können, werden von der Erfindung umfaßt.
Die Zellen werden unter Bedingungen gezüchtet, die die Bildung des Antigens erlauben. Für den Fachmann ist es offensichtlich, daß es zahlreiche unterschiedliche Verfahren, Medien und Induktionsbedingungen gibt, die je nach dem Wirtsstamm und dem rekombinanten Plasmid herangezogen werden können. Das Antigen wird sodann aus dem Kulturgemisch isoliert. Erfindungsgemäß wird erwartet, daß das appA-Antigen aufgrund des hohen Expressionsgrads im Escherichia coli-Wirt unlösliche Einschlußkörper bildet. Es wurde gezeigt, daß diese Erscheinung bei zahlreichen im Übermaß gebildeten Proteinen auftritt (Schoner et al., Bio/Technology, Bd. 3 (1985), S. 151-154). Die Reinigung von Einschlußkörpern ist relativ einfach. Beispielsweise werden bakterielle Zellen durch Ultraschallbehandlung oder durch Passage durch eine French-Druckzelle aufgebrochen. Einschlußkörper werden sodann durch Zentrifugation gewonnen, und verunreinigende bakterielle Zellbruchstücke werden durch Extraktion mit geringen Konzentrationen an Harnstoff und einem nicht-ionogenen Detergens entfernt. Die Einschlußkörper werden sodann mit dem Denaturierungsmittel Guanidin-Hydrochlorid solubilisiert, und das Antigen wird durch Verringerung der Konzentration an Guanidin-Hydrochlorid durch Verdünnung renaturiert. Das vorstehende Verfahren stellt nur eine der Standardtechniken für die Reinigung von durch E. coli exprimierten Proteinen dar. Diese und andere Verfahren zur Herstellung eines A. pleuropneumoniae-appA-Antigens werden von der vorliegenden Erfindung umfaßt.
Eine therapeutisch wirksame Menge des A. pleuropneumoniae-appA-Antigens kann zur Herstellung eines Impfstoffs mit einem geeigneten Träger vermischt werden. Der Fachmann erkennt, daß es zahlreiche geeignete Träger gibt, wobei alle diese Zusammensetzungen von der vorliegenden Erfindung umfaßt werden. Eine bevorzugte Zusammensetzung enthält 0,5-1,0 mg rohes Antigen in einem inkompletten Adjuvans. Das A. pleuropneumoniae-Antigen in gereinigter Form oder in einer Zusammensetzung kann sodann einem Schwein verabreicht werden, um es gegen Pleuropneumonie zu impfen.

Beispiele

Hinterlegung des rekombinanten Plasmids mit einem Gehalt an dem appCA-Gen

Der bevorzugte rekombinante Vektor mit einem Gehalt an den appCA-Genen, nämlich das Plasmid pYFC37 wurde bei der American Type Culture Collection am 19. Oktober 1989 unter der Hinterlegungsnummer 68135 hinterlegt.

Bakterielle Stämme, Medien und Züchtungsbedingungen

A. pleuropneumoniae-Serotyp 5 wurde freundlicherweise von C. Pijoan, University of Minnesota, St. Paul, zur Verfügung gestellt. A. pleuropneumoniae-Kulturen wurden in Hirn-Herz-Infusionsbrühe (BHI, Difco Laboratories), die mit 0,1% NAD supplementiert war, gezüchtet. LB, Luria Broth (Miller, Experiments in Molecular Genetics, (1972), S. 433) wurde zur Züchtung sämtlicher E. coli-Stämme verwendet. Der Bakteriophagen-Klonierungsvektor Lambda-Dash wurde von Stratagene (La Jolla, CA) erhalten. Der ursprüngliche Wirt für die rekombinante Bakteriophagenbibliothek war P2392, ein P2-Lysogen des E. coli Stamms LE392.

Allgemeine Verfahren

Obgleich angenommen wird, daß die in der nachstehenden Methodik beschriebenen Einzelheiten für den Fachmann ausreichen, die vorliegende Erfindung auszuführen, können dem im Fachhandel erhältlichen Handbuch mit dem Titel Molecular Cloning, Maniatis et al., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, zusätzliche Einzelheiten entnommen werden, die die praktische Durchführung von einigen Aspekten der Erfindung unterstützen können. Die nachstehenden Klonierungssysteme wurden von den Erfindern nur für Erläuterungszwecke und aufgrund des Fehlens von Kenntnissen über A. pleuropneumoniae-Hämolysine herangezogen. Es ist aber ersichtlich, daß praktisch beliebige Klonierungssysteme verwendet werden können, nachdem nunmehr die Nucleotidsequenz offenbart worden ist.

Bildung von anti-A. pleuropneumoniae-Serum in Schweinen

Das Serum gegen A. pleuropneumoniae wurde gemäß den Angaben von Gunnarsson hergestellt (Am. J. Vet. Res., Bd. 40 (1979), S. 1564). Von Serum aus diesen geimpften Schweinen wurde gezeigt, daß es das Hämolysin in Kulturüberständen aus A. pleuropneumoniae-Serotyp 5 neutralisiert.

Affinitätsreinigung von anti-Hämolysin-Antiseren

Eine 500 ml-Kultur von A. pleuropneumoniae wurde bis zur frühen stationären Phase in mit 0,1% NAD supplementierter BHI gezüchtet. Der zellfreie Kulturüberstand wurde 10-fach durch Ultrafiltration konzentriert, und das Hämolysin-Protein (etwa 1 mg) wurde mit 5 Volumenteilen kaltem Aceton gefällt. Der Niederschlag wurde durch Sieden in SDS-PAGE-Probenpuffer erneut in Lösung gebracht und einer präparativen SDS-PAGE unterworfen. Die 105 kD-Hämolysinbande wurde mit 4 M Natriumacetat sichtbar gemacht (Hunkapiller et al., Methods in Enzymol., Bd. 91 (1983), S. 227), und herausgeschnitten, und das Hämolysin-Protein wurde elektrophoretisch auf Nitrocellulose übertragen (Towbin et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U. S. A., Bd. 76 (1979), S. 4350). Nach der übertragung wurde der Nitrocellulosestreifen in TBST (20 mM Tris-HCl, PH-Wert 7,5, 150 mM NaCl, 0,05% Tween 20) mit einem Gehalt an 3% Gelatine inkubiert. Sodann wurde der Streifen in 5 ml des gleichen Puffers mit einem Gehalt an 100 ul der rohen anti-A. pleuropneumoniae-Seren 4 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert, wonach sich zur Entfernung von ungebundenem Antikörper vier Waschvorgänge mit TBST anschlossen. Spezifisch gebundener Antikörper wurde durch eine 5-minütige Inkubation in 5 ml 0,1 M Glycin, PH-Wert 2,5, mit einem Gehalt an 0,1 mg/ml Rinderserumalbumin eluiert. Das Eluat wurde sofort mit 1 M Tris-Base neutralisiert.

Konstruktion einer Klonbank von A. Pleuropneumoniae-DNA in Lambda-Dash

Chromosomale A. pleuropneumoniae-DNA wurde gemäß Silhavey et al. (Experiments with Gene Fusion, S. 89, Cold Spring Harbor (1984)) gereinigt und partiell mit SAU 3A verdaut. Die verdaute DNA wurde durch Sedimentation in einem 10-40% Saccharosegradienten fraktioniert (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (1982), S. 275-277), und Fraktionen mit 9-20 kbp-Fragmenten, beurteilt durch Agarose-Gelelektrophorese, wurden vereinigt und durch Alkoholfällung auf eine Endkonzentration von 100 ug/ml eingeengt. Lambda-Dash wurde mit BamHI gespalten und mit alkalischer Phosphatase zur Entfernung von endständigen Phosphaten behandelt. Nach Phenolextraktion und Einengen durch Ethanolfällung wurde die Vektor-DNA mit größenselektierter A. pleuropneumoniae-DNA in einem Molverhältnis von 1:4 vermischt und mit T4-DNA-Ligase 18 Stunden bei 15ºC behandelt. Das ligierte DNA-Gemisch wurde unter Verwendung eines handelsüblichen in vitro-Packungskits (Gigapack plus, Stratagene, La Jolla, CA) in Lambda-Teilchen gepackt. Die Phagentiter wurden an P2392 bestimmt. Die rekombinante Phage wurde als Plattenmaterial an P2392 amplifiziert.

Screening von Phagenbibliotheken für das A. pleuropneumoniae-Hämolysin-Gen

Die Bakteriophagenbibliothek wurde einem Screening unter Verwendung des affinitätsgereinigten Anithämolysin-Antikörpers und durch Hybridisierung einer Sonde mit einem Gehalt an den lktCA-Genen von P. haemolytica unterzogen. Für das Antikörperscreening wurde die Bibliothek auf 150 x 10 mm-Platten in einer Dichte von 5000 Plaque pro Platte ausgestrichen. Die Platten wurden auf Nitrocellulose übertragen, und jeder Filter wurde mit 1 ml affinitätsgereinigtem Antikörper unter Anwendung von Standardverfahren untersucht (Huynh et al., in DNA Cloning: A Practical Approach Bd. I, (1985), S. 49, Hrsg. Glover). Positive Plaques wurden mit einem mit alkalischer Phosphatase konjugierten Ziegen-anti-Schwein-IgG (Kirkegaard und Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) -Sekundärantikörper identifiziert, wonach sich die Farbentwicklung mit den Substraten Nitroblau-Tetrazolium (NBT) und 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-phosphat (BCIP) gemäß Hawkes et al., Anal. Biochem., Bd. 119 (1982), S. 142 anschloß.
Zum Screening durch Hybridisierung wurde ein DNA-Fragment aus pYFC19 (Chang et al., Infect. Immun., Bd. 55 (1987), S. 2348) mit einem Gehalt an den lktCA-Genen mit ³²P-dATP und ³²P-dCTP durch Nick-Translation markiert. Die Filter wurden sodann 2 mal mit 2X SSC-0,1% SDS und 2 mal mit 0,2X SSC-0,1% SDS bei Raumtemperatur gewaschen. Der endgültige Waschvorgang erfolgte mit 0,16 X SSC-0,1% SDS bei 42ºC. Plaques, die positive Signale mit beiden Verfahren ergaben, wurden aufgenommen, einem erneuten Screening unterworfen und an P2392 amplifiziert.

SDS-PAGE und Western-Blotting

SDS-PAGE wurde gemäß den Angaben von Altman et al. (J. Bacteriol., Bd. 155 (1983), S. 1130) durchgeführt. Immunoreaktive Proteine wurden durch Western-Blot-Analyse (Towbin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 76 (1979), S. 4350-4354) gemäß den früheren Angaben (Chang et al., Infect. Immun., Bd. 55 (1987), S. 2348-2354) durchgeführt. Beim ersten Antikörper handelte es sich entweder um Rinder-anti-Leukotoxin (Chang et al., Infect. Immun., Bd. 55 (1987), S. 2348-2354) oder um Schweine-anti- Hämolysin. Bei den zweiten Antikörpern gegen Schweine-IgG handelte es sich um alkalische Phosphatase-Konjugate, die von Kirkegaard und Perry Laboratories, Gaithersburg, MD, bezogen wurden.
Zur Analyse von Proteinen, die von den Bakteriophagenklonen exprimiert worden waren, wurden 5 ml-Lysate hergestellt, und Bakterienbruchstücke wurden durch Zentrifugation entfernt. Die geklärten überstände wurden sodann durch Chloroform-Methanol-Extraktion entsalzt und entfettet (Wessel et al., Anal. Biochem., Bd. 138 (1984), S. 141). Der denaturierte Proteinrückstand wurde durch Zentrifugation gewonnen und in siedendem SDS-PAGE-Probenpuffer gelöst. Kontrollysate wurden auf identische Weise unter Verwendung des Vektors Lambda-Dash hergestellt. Zellfreie Kulturüberstände von P. haemolytica, A. pleuropneumoniae und E. coli mit pSF4000, das die vollständige hly-Determinante exprimiert (Felmlee et al., J. Bacteriol., Bd. 163 (1985), S. 88-93) wurden als Quellen für das Leukotoxin- und Hämolysin-Antigen verwendet.

Southern-Blotting

Aliquotanteile von chromosomaler DNA aus A. pleuropneumoniae wurden getrennt mit PstI, XbaI oder XhoI verdaut, der Elektrophorese an 0,7% Agarosegel unterzogen und auf eine Nitrocellulosemembran gemäß früheren Angaben übertragen (Southern, J. Mol. Biol., Bd. 98 (1975), S. 503). Bei der Sonde für die Hybridisierung handelte es sich um das 1,6- kbp-XbaI- Fragment mit einem Gehalt an Bereichen der appC- und appA-Gene aus dem Bakteriophagenklon yfc5 (Fig. 2). Der Blot wurde mit der mit 32P-markierten Sonde in 4X SET (Mason und Williams, 1985) und 5X Denhardt-Lösung mit einem Gehalt an 100 ug/ml denaturierter Kälberthymus-DNA, 50 ug/ml polyA und 10 ug/ml polyC 12 Stunden bei 65ºC hybridisiert. Der Filter wurde mit 4X SET bei Raumtemperatur und sodann nacheinander mit 4X SET, 2X SET, 1X SET und 0,3X SET bei 65ºC gewaschen.

DNA-Sequenzierung und -Analyse

Die DNA-Sequenzierung wurde gemäß dem Didesoxy-Kettenterminationsverfahren durchgeführt (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., Bd. 74 (1977), S. 5463). Geeignete Regionen aus der A. pleuropneumoniae-Insert-DNA in den Bakteriophagenklonen yfc5 und yfc12 wurden in die Mehrfachklonierungsstellen von M13mp18 oder M13mp19 subkloniert, und einzelsträngige Phagen-DNA wurden nach Standardverfahren hergestellt (Messing, in Methods Enzymol., Bd. 101 (1983), S. 20, Academic Press). Die Sequenzierungsreaktionen verwendeten ³²P-dATP (800 Ci/Mol, New England Nuclear, Boston, MA), T7-DNA-Polymerase und das handelsübliche Sequenase-Kit (United States Biochemicals, Cleveland, OH). Als Primer für die DNA-Synthese wurden der universale lac-Primer oder andere Primer, die zu bereits sequenzierten Regionen komplementär waren, verwendet. Die letztgenannten Primer wurden an einem Applied Biosystems 380A-DNA-Synthesizer (Foster City, CA) synthetisiert. Beide Stränge der klonierten DNA wurden in ihrer Gesamtheit sequenziert. Die DNA-Sequenz wurde unter Verwendung der PCGene-DNA- und Protein-Analyseprogramme (IntelliGenetics Corp., Mountain View, CA) analysiert.

Bestimmung der hämolytischen Aktivität

Aliquotanteile der angegebenen Proben wurden mit einer Suspension von 0,2% Ziegenerythrozyten in Calcium-Kochsalzlösung (10 mM CaCl&sub2;, 0,85% NaCl, 10 mM Tris-HCl, PH-Wert 7,5) 1 Stunde bei 37ºC inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Proben 10 Minuten bei 500 g zentrifugiert. Das Ausmaß der Hämolyse wurde aus dem A&sub5;&sub4;&sub5;-Wert des überstands bestimmt. Der A&sub5;&sub4;&sub5;-Wert, der einer vollständigen Hämolyse entspricht, wurde durch Lysis der Erythrozyten mit Triton X-100 erhalten. Die Hintergrundabsorption wurde mit identischen Gemischen gemessen, bei denen aber die Erythrozyten weggelassen wurden. Zur Neutralisation von Antiseren wurden Proben mit 50 ul des entsprechenden Serums 1 Stunde bei Raumtemperatur vorinkubiert.

Ergebnisse

Klonierung des App-Locus

Durch Antikörper-Screening mit affinitätsgereinigten Antiseren gegen das 110 kD-Antigen wurde ein einzelner positiver Klon mit einem Insert von 14 kb (Fig. 2) identifiziert. Durch Screening der gleichen Bibliothek mit DNA-Sonden, die von pYFC19 abgeleitet waren, einem den 1ktCA-Locus (Chang et al., 1987) tragenden Plasmid, wurden 8 Klone identifiziert (Fig. 2). Die 8 Klone überlappen miteinander und auch mit dem durch immunologisches Screening isolierten Klon (Fig. 2). Alle diese 9 Klone mit Ausnahme von einem exprimierten ein 110 kD-Polypeptid, das durch Western- Blotting mit dem anti-App-Hämolysin-Antikörper oder dem anti-Leukotoxin-Antikörper nachgewiesen wurde. Ein Klon, nämlich yfc5, bildete ein verkürztes Polypeptid von 80 K, bei dem es sich um die verkürzte Version des 110 kD-Polypeptids handelte. Die Tatsache, daß dieser Klon ein verkürztes Toxin exprimierte, lieferte Angaben über die Stellung und Orientierung für den mutmaßlichen App-Locus innerhalb der klonierten DNA (Fig. 2). Die Southern-Blot-Analyse unter Verwendung eines XbaI-Fragments, das die Toxin-Determinante gemäß DNA-Sequenzierung umfaßt, zeigte, daß keine nachweisbare Umlagerung während des Klonierungsverfahrens erfolgte. Ferner zeigte diese Analyse, daß es sich bei der Sequenz um eine einzelne Kopie im A. pleuropneumoniae-Genom handelte. Trotz der Tatsache, daß 8 Klone identifiziert wurden, die das Hämolysin von voller Länge bildeten, konnte in keinem der Phagenlysate eine hämolytische Aktivität nachgewiesen werden.

DNA-Sequenz der appGA-Gene

Die durch den verkürzten Klon angegebene Region wurde der DNA-Sequenzanalyse unterzogen. Die Sequenz einer 3,8 kb-Region ist in Fig. 1 gezeigt. Es gibt einen kleinen ORF von 159 Codons, der für ein Polypeptid von 18,5 kD kodiert und dem Toxin-Leserahmen vorausgeht, vermutlich das appC-Gen, und einen großen ORF von 957 Codons, der für ein Polypeptid von 105 kD kodiert, vermutlich das appA-Gen (Fig. 1).
Die DNA-Sequenz wurde für E. coli-promotorähnliche Sequenzen unter Verwendung des Homologiebewertungsverfahrens abgesucht. Es gab 3 Sequenzen, die mit der TATAAT-Consensuspromotorsequenz (-10-Region) ähnlich waren und 2 Sequenzen, die der RNA-Polymerase-Bindungsstelle, TTGACA (Reznikoff und Gold, in Maximizing Gene Expression, (1986), S. 1, Bostoni Butterworth Publication) ähnlich waren, proximal zu appC. Das appC-Gen weist 2 potentielle Methionin-Startcodons mit jeweils einer vernünftigen, flußaufwärts angeordneten Shine-Dalgarno-Sequenz auf. Der Einfachheit halber wurde das erste AUG-Codon als der appC-Genstart gewählt. Eine Ribosomen-Bindungsstelle (Shine-Dalgarno-Sequenz) flußaufwärts vom Initiationscodon von appA und eine mit dem rho-unabhängigen, transkriptionellen Terminator von E. coli ähnliche Sequenz flußabwärts von appA wurden ebenfalls beobachtet (Fig. 1). Eine derartige potentielle Terminationssequenz wird an einer analogen Stelle in den Hämolysin- und Leukotoxin-Determinanten von E. coli bzw. von P. haemolytica gefunden (Lo et al., 1987; Highlander et al., 1989; Welch und Pellet, 1988). Das appA-Protein enthält 9 glycinreiche Hexapeptid-Wiederholungen nahe seinem Carboxy-Terminus. Abnliche Wiederholungen werden in den HlyA- und LktA-Proteinen gefunden (Strathdee und Lo, J. Bacteriol., Bd. 171 (1987), S. 916-928) und stellen die Basis der RTX (Wiederholungstoxin)-Bezeichnung dar (Strathdee und Lo, 1989).

Expression von hämolytischer Aktivität in E. coli

Die appA-Regionen der Bakteriophagenklone yfc7 und yfc8 (Fig. 2) wurden in den Vektor pHG165 (Stewart et al., Plasmid, Bd. 15 (1986), S. 172) als EcoRI-XhoI-Fragmente subkloniert, wodurch man die Plasmide pYFC38 (appA) bzw. pYFC37 (appCA) erhielt. Diese Strategie brachte das appA-Gen von pYFC38 unter die Kontrolle des lac-Promotors des Vektors. Die appCA- Gene von pYFC37 werden vermutlich ausgehend von einem A. pleuropneumoniae-Promotor sowie vom lac-Promotor des Vektors exprimiert. Diese Plasmide wurden in den E. coli-Wirt TB1 transformiert, und die Transformanten wurden bis zur frühen stationären Phase gezüchtet und auf die Expression des 110 kD-Proteins und auf hämolytische Aktivität geprüft. Das 110 kD- Protein wurde von beiden Klonen exprimiert, wobei die Antigenkonzentrationen bei Transformanten mit pYFC38 erheblich höher lagen. Jedoch war die hämolytische Aktivität nur mit dem Konstrukt mit dem intakten appC- Gen verbunden.
Diese hämolytische Aktivität konnte wie im Fall des von A. pleuropneumoniae sekretierten Hämolysins mit Schweine-anti-App-Hämolysin-Antiseren oder Kaninchen-Antiseren, die gegen das P. haemolytica Leukotoxin erzeugt worden waren, neutralisiert werden.

Claims

1. Gereinigte isolierte DNA-Sequenz, die für ein A. pleuropneumoniae-Hämolysin kodiert, umfassend eine Nucleotidsequenz, die dadurch definiert ist, daß sie für ein der in Fig. 1 gezeigten appA-Aminosäuresequenz entsprechendes Protein, das der appA-Nucleotidsequenz 519-3386 entspricht, Oder ein funktionell äquivalentes Polypeptid davon mit einer ähnlichen biologischen Aktivität kodiert.

2. DNA-Sequenz nach Anspruch 1, wobei die Nucleotidsequenz ferner dadurch definiert ist, daß sie die in Fig. 1 dargestellte appA-Nucleotidsequenz, die der appA-Nucleotidsequenz 519 bis 3386 entspricht, oder ein funktionelles Äquivalent davon mit ähnlicher biologischer Aktivität umfaßt.

3. Nicht-hämolytisches A. pleuropneumoniae-Hämolysin-Antigen, umfassend eine Aminosäuresequenz, die kodiert wird durch das der in Fig. 1 gezeigten appA-Aminosäuresequenz entsprechende appA-Gen, entsprechend der appA-Nucleotidsequenz 519 bis 3386, oder ein funktionelles Äquivalent davon mit einer ähnlichen biologischen Aktivität.

4. Zusammensetzung, umfassend eine biologisch wirksame Menge eines nicht-hämolytischen A. pleuropneumoniae-Hämolysin-appA-Antigens, umfassend eine Aminosäuresequenz, die kodiert wird durch das der in Fig. 1 gezeigten appA-Aminosäuresequenz entsprechende appA-Gen, entsprechend der appA-Nucleotidsequenz 519 bis 3386, oder ein funktionelles Äquivalent davon mit einer ähnlichen biologischen Aktivität, in einem geeigneten Träger.

5. Rekombinanter Vektor, umfassend die DNA-Sequenz nach Anspruch 1 oder 2.

6. Rekombinanter Vektor nach Anspruch 5, wobei es sich bei dem rekombinanten Vektor um ein rekombinantes Plasmid handelt.

7. Rekombinanter Vektor nach Anspruch 5, wobei die DNA- Sequenzen funktionell mit einer starken Promotorsequenz verknüpft sind.

8. Rekombinante Zelle, enthaltend die DNA-Sequenzen nach Anspruch 1 oder 2.

9. Rekombinante Zelle nach Anspruch 8, wobei es sich bei der rekombinanten Zelle um ein Bakterium handelt.

10. Verfahren Zur Herstellung von A. pleuropneumoniae- Hämolysin-appA-Antigen, umfassend folgende Stufen:

Bereitstellen einer rekombinanten Zelle gemäß der Definition in Anspruch 9;

Züchten der Zellen als ein Kulturgemisch unter Bedingungen, die der Zelle die Bildung des Antigens ermöglichen; und Isolieren des Antigens aus dem Kulturgemisch.

11. Zusammensetzung, enthaltend A. pleuropneumoniae-Hämolysin, umfassend das appA-Antigen mit der Aminosäuresequenz, die durch die Nucleotide 519 bis 3386 von Fig. 1 kodiert wird, zur Verwendung in einem Verfahren zum Impfen von Schweinen gegen Schweine-Pleuropneumonie.