HUT64596A - Recombinant vaccine against swine pleuropneumonie - Google Patents
Recombinant vaccine against swine pleuropneumonie Download PDFInfo
- Publication number
- HUT64596A HUT64596A HU9201413A HU141392A HUT64596A HU T64596 A HUT64596 A HU T64596A HU 9201413 A HU9201413 A HU 9201413A HU 141392 A HU141392 A HU 141392A HU T64596 A HUT64596 A HU T64596A
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- pleuropneumoniae
- antigen
- hemolysin
- dna sequence
- appa
- Prior art date
Links
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 title abstract description 19
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 title description 10
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 title description 2
- 229940124551 recombinant vaccine Drugs 0.000 title description 2
- 241000606748 Actinobacillus pleuropneumoniae Species 0.000 claims abstract description 75
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 59
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 59
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 59
- 239000003228 hemolysin Substances 0.000 claims abstract description 56
- 108010006464 Hemolysin Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 55
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 44
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 34
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 40
- 101150050411 appA gene Proteins 0.000 claims description 34
- 101100148259 Actinobacillus pleuropneumoniae apxIIA gene Proteins 0.000 claims description 28
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 25
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 19
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 18
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 17
- 241000282887 Suidae Species 0.000 claims description 16
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 13
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 11
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 claims description 7
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims description 7
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 claims description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims 1
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 abstract description 13
- 201000006509 pleuropneumonia Diseases 0.000 abstract description 13
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 abstract description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 abstract description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 18
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 17
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 14
- 101150070943 appC gene Proteins 0.000 description 14
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 13
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 11
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 11
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 11
- 230000002949 hemolytic effect Effects 0.000 description 10
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 10
- 101150015540 apxIIC gene Proteins 0.000 description 9
- 241001293418 Mannheimia haemolytica Species 0.000 description 8
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 8
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- FBUKMFOXMZRGRB-UHFFFAOYSA-N Coronaric acid Natural products CCCCCC=CCC1OC1CCCCCCCC(O)=O FBUKMFOXMZRGRB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 101710170970 Leukotoxin Proteins 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 6
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 5
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 5
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 5
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 4
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 4
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 4
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 4
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 4
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 241000178944 Actinobacillus pleuropneumoniae serovar 5 Species 0.000 description 3
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 3
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 3
- 101710112752 Cytotoxin Proteins 0.000 description 3
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 3
- 230000000753 anti-hemolysin Effects 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 description 3
- 239000002619 cytotoxin Substances 0.000 description 3
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 3
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 3
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 3
- QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-L (5-bromo-4-chloro-1h-indol-3-yl) phosphate Chemical compound C1=C(Br)C(Cl)=C2C(OP([O-])(=O)[O-])=CNC2=C1 QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 2
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 206010018910 Haemolysis Diseases 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- 239000006180 TBST buffer Substances 0.000 description 2
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 2
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008588 hemolysis Effects 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 235000020030 perry Nutrition 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 241000606750 Actinobacillus Species 0.000 description 1
- 208000030090 Acute Disease Diseases 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 108700003860 Bacterial Genes Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000252095 Congridae Species 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- 241000606790 Haemophilus Species 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 241001625930 Luria Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000002151 Pleural effusion Diseases 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 210000001132 alveolar macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000013602 bacteriophage vector Substances 0.000 description 1
- 239000007621 bhi medium Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 description 1
- WORJEOGGNQDSOE-UHFFFAOYSA-N chloroform;methanol Chemical compound OC.ClC(Cl)Cl WORJEOGGNQDSOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000006266 hibernation Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000002126 nonhaemolytic effect Effects 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 1
- 238000012261 overproduction Methods 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 208000008423 pleurisy Diseases 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000003825 pressing Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000000384 rearing effect Effects 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 208000023504 respiratory system disease Diseases 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000007423 screening assay Methods 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 125000003831 tetrazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 239000000304 virulence factor Substances 0.000 description 1
- 230000007923 virulence factor Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/285—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Pasteurellaceae (F), e.g. Haemophilus influenza
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Oncology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
KIVONAT
A találmány Actinobacillus pleuropneumoniae hemolizin(eke)t kódoló DNS-szekvenciákra, a fenti szekvenciát tartalmazó rekombináns vektorokra és sejtekre, valamint az A. pleuropneumoniae hemolizin antigén rekombináns sejtekből való előállítására szolgáló eljárásra vonatkozik.
A hemolizin antigén vakcinák hatóanyagaként alkalmazható, sertések pleuropneumonia elleni védő immunizálására.
74972-1459
KÖZZÉTÉTELI
Képviselő: PÉLDÁNY
DANUBIA SZABADALMI ÉS VÉDJEGY IRODA KFT.
SERTÉS PLEUROPNEUMONIA ELLENI REKOMBINÁNS VAKCINA
THE TEXAS A&M UNIVERSITY SYSTEM, College Station, Texas,
Amerikai Egyesült Államok
| Feltalálók: | ||
| STRUCK Douglas K. , | College | Station, Texas, |
| YOUNG Ryland F. , | College | Station, Texas, |
| CHANG Yung-fu, | Ithaca, | New York, |
| Amerikai Egyesült Államok |
Bejelentés napja: 1990. 10. 31.
Elsőbbsége: 1989. 10. 31. (429 273)
Amerikai Egyesült Államok
Nemzetközi bejelentés száma: PCT/US90/06350
Nemzetközi közzététel száma: WO 91/06653
74972-1459
A találmány az Actinobacillus pleuropneumoniae (A. pleuropneumoniae) antigénjeit kifejező gén klónozására, továbbá a fenti antigének előállítására szolgáló eljárásra, valamint a fenti antigének sertések pleuropneomonia elleni vakcinálására való alkalmazására vonatkozik.
A sertések Haemophilus pleuropneumonia fertőzése nagyon ragályos légzőszervi betegség, amelyet egy gram-negatív baktérium, az A. pleuropneumoniae okoz. Az utóbbi években - részben a belterjes és intenzívebb tenyésztés felé való eltolódás miatt - lényegesen megnőtt a betegség előfordulásának gyakorisága, és napjainkban ez a legfőbb oka az ipari méretű sertéstenyésztésben mutatkozó gazdasági veszteségeknek. A heveny betegség kitörése során a pusztulás elérheti a 100 %-ot a kismalacok és a 25 %-ot a hízósertések között. A fertőzött sertésekben lokálisan kiterjedt, akut lebenyes tüdőgyulladás fejlődhet ki, fibrines mellhártyagyulladással társulva, vagy krónikus, lokalizált tüdőszövetelhalás, mellhártyagyulladásos lenövésekkel. Az A. pleuropneumoniae 8 szerotípusát azonosították, de az 5-ös szerotípus messze a leggyakoribb.
Úgy tűnik, hogy az A. pleuropneumoniae virulencia-faktorainak egyike egy szekretált citotoxin. Ezt támasztja alá az a tény, hogy az A. pleuropneumoniae sejttenyészetének felülúszója citotoxikus hatást fejt ki sertés alveoláris makrofágokra és perifériás monocitákra [Bendixin és munkatársai, Infect. Immun. 33, 673-676 (1981)]. Ezenkívül kimutatták azt is, hogy mind az ultrahanggal kezelt baktériumok, mind a tenyészet steril felülószója lokalizált tüdőgyulla dást okoz, ami hasonlít a természetesen fertőzött sertésekben megfigyelt tüdőgyulladáshoz [Rosendal és munkatársai, Proc. Int. Pig. Vet. Soc. Congr. 5 221 (1980)].
Feltehetőleg az A. pleuropneumoniae citotoxin az A. pleuropneumoniae szerotípusok többsége vagy mindegyike által termelt extracelluláris egy vagy több hemolizin. A hemolizin(ek) tulajdonságai igen kevéssé ismertek. Ismert, hogy az A. pleuropneumoniae különféle szerotípusai vagy hőstabil szénhidrátokat [Kume és munkatársai, Infect. Immun. 51, 563-570 (1986)], vagy hőre érzékeny proteineket [Maudsely és munkatársai, Can. J. Microbiol. 32., 801-805 (1986)] termelnek. Azt is leírták már, hogy az 1-es, 2-es, 3-as, 5-ös,
6-os és 7-es szerotípusú A. pleuropneumoniae hemolizinjei RNS-t igényelnek [Martin és munkatársai, Can. J. Micorbiol.
31. 456-462 (1985)]. Ezidáig csak két hemolizint jellemeztek, az egyik egy, a 2-es szerotítusból származó hőstabil hemolizin [Kume és munkatársai, Infect. Immun. 51, 563—570 (1986)], a másik pedig egy, az 1-es szerotípus által szekretált 105 kD polipeptid [Frey és munkatársai, Infect. Immun. 56, 2570-2575 (1988)]. Azonban egyetlen A. pleuropneumoniae hemolizin aminosavszekvenciája sem ismert a technika állásából .
Sertés pleuropneumonia elleni vakcina napjainkig még nem került kereskedelmi forgalomba. Megkísérelték az immunizálást hővel elölt vagy formaiinnal fixált baktériumokkal, de ezeknek az immunogéneknek a hatékonyságát klinikailag nem bizonyították. Várhatólag az A. pleuropneumoniae hemolizin (ek) protektív immonogénként alkalmazhatók sertések ese- tében sertés pleuropneumonia ellen.
A találmány tárgya legáltalánosabb megközelítésben az A. pleuropneumoniae hemolizin antigént kódoló DNS-szekvencia. A találmány tárgyát képezik továbbá a fenti DNS-szekvenciákat tartalmazó rekombináns vektorok és rekombináns sejtek, valamint a rekombináns sejtek alkalmazásával az
A. pleuropneumoniae hemolizin antigénjének előállítására szolgáló eljárás is. A találmány az A. pleuropneumoniae hemolizin antigén alkalmazására is vonatkozik, sertések pleuropneumonia elleni vakcinálására.
Közelebbről, a találmány szerinti DNS-szekvenciák az 1. ábrán látható appCA aminosavszekvenciát vagy appA aminosavszekvenciát, vagy lényegében a fenti aminosavszekvenciákkal és biológiai aktivitással rendelkező polipeptideket kódolják. A találmány egyik specifikus megvalósítási módja szerint a találmány szerinti DNS-szekvenciák az 1. ábrán látható appCA és appA nukleotidszekvenciákat, vagy ezek alléi változatait jelentik. A találmány az A. pleuropneumoniae hemolizin antigén determinánsát kódoló DNS-szekvenciákra is vonatkozik. Az előnyös megvalósítási mód szerint ez az ATCC 68135 számon letétbe helyezett DNS-szekvenciának felel meg.
A találmány szerinti rekombináns vektorok a fent említett DNS-szekvenciákat tartalmazzák. Közelebbről, a találmány szerinti rekombináns vektorok bakteriális plazmidok, amelyekben a DNS-szekvenciák működőképesen kötődnek egy erős promoter szekvenciához. Ezenkívül a találmány a fenti DNS-szekvenciákat tartalmazó rekombináns sejtekre is vonatko- 5 zik, amelyek legelőnyösebben bakteriális sejtek. A találmány tárgyát képezi ezenkívül az appA gén vagy annak alléi változata által kódolt A. pleuropneumoniae antigén, vagy az azzal lényegében azonos aminosavszekvenciával és biológiai aktivitással rendelkező polipeptid is.
Az A. pleuropneumoniae hemolizin antigént a fent említett rekombináns sejtek tenyésztésével és feldolgozásával állíthatjuk elő, és a találmány tárgyát képezi az A. pleuropneumoniae antigén előállítására szolgáló eljárás is. A találmány továbbá az antigént tartalmazó kompozícióra és az antigén vakcinaként! alkalmazására is vonatkozik, sertés pleuropneumonia ellen.
Az 1. ábra mutatja az appCA régió nukleotidszekvenciáját, ás az appC és appA proteinek ebből következtetett aminosavszekvenciáját. Az appC gén melletti promoterszerű régiókat közvetlenül a nukleotidszekvencia alatt szimbólumokkal jelöltük. Az lehetséges riboszóma-kötő szekvenciákat az appC és appA előtt és közvetlenül az appA után aláhúzással jelöltük.
A 2. ábra az A. pleuropneumoniae kiónok restrikciós térképét mutatja. A vektorból származó EcoRI helyek határolják az egyes kiónokba inszertált szakaszokat. Az yfc5 klón kivételével mindegyik klón egy 110 kD polipeptidet expreszszál, amelyet Western biot analízissel detektálunk. A szekvenciaanalízissel megállapított két nyitott leolvasási keret - amelyet appC-nek illetve appA-nak nevezünk - elhelyezkedésének jelölése: C, Clal; Ev, EcoRV; H, HindlII; P, PstT; S, SacI, X, Sbal, Xo, Xhol.
- 6 A találmány szerinti DNS-szekvenciák és A. pleuropneumoniae hemolizin antigének segítségével hatékonyan és gazdaságosan állíthatunk elő sertések sertés-pleuropneumonia elleni immunizálására alkalmas vakcinát. A találmány szerinti DNS-szekvenciákat különféle expressziós rendszerekben alkalmazhatjuk A. pleuropneumoniae hemolizin antigének nagy mennyiségekben való előállítására. A találmány szerinti eljárás egyik előnyös megvalósítási módja szerint a DNS-szekvenciát az erős bakteriális promotertől lefelé (3'-irányban) elhelyezve kapjuk a lehető legmagasabb hozammal, a kívánt antigént. A baktérium által termelt antigént ezután izolálhatjuk és tisztíthatjuk, majd sertéseknek pleuropneumonia elleni vakcinaként beadhatjuk.
A találmány szerinti eljárással izolált és klónozott DNS-szekvenciák A. pleuropneumoniae hemolizint kódolnak. Közelebbről, ezek a DNS-szekvenciák az 5-ös szerotípusú A. pleuropneumoniae 110 kD hemolizinjét kódolják. A találmány szerinti legelőnyösebb kiviteli alakok az 1. ábrán látható DNS-szekvenciák. Szakemberek számára természetesen magától értetődő, hogy a DNS-szekvenciák a genetikus kód degeneráltsága miatt eltérőek lehetnek. A találmány tárgykörébe tartozik az összes DNS-szekvencia, amely az 1. ábra szerinti A. pleuropneumoniae antigéneket kódolja. Szakember számára az is magától értetődő, hogy a DNS-szekvenciában alléi változatok is lehetnek, amelyek alapvetően nem változtatják meg az antigén aktivitását vagy a DNS-szekvencia által kódolt polipeptid aminosavszekvenciáját. A fenti alléi változatok szintén a találmány tárgykörébe tartoznak.
A találmány két különböző, appC-nek és appA-nak nevezett génre vonatkozik. Ezek egy 159, illetve 957 aminosavból álló polipeptidet kódolnak. Az appA gén kódolja az appA antigénnek nevezett proteint, amely nem rendelkezik hemolitikus aktivitással. Az A. pleuropneumoniae hemolizin normális hemolitikus aktivitásához mind az appA, mind az appC gén expressziója szükséges. A fenti két gén által expresszált proteint appCA antigénnek nevezzük. Mind az appCA, mind az appA antigén kiváltja az antitest-választ természetes A. pleuropneumoniae hemolizinnel szembeni antitestekből. Várhatólag mind az appA, mind az appCA antigén alkalmazható olyan immunválasz kiváltására sertésekben, amellyel a sertés pleuropneumonia megelőzhető. Ezért a találmány mind az appCA, mind az appA antigént kódoló DNS-szekvenciára vonatkozik.
Ezenkívül megjegyezzük, hogy az 1. ábra szerinti természetes A. pleuropneumoniae hemolizin polipeptid szekvenciájához lényegében hasonló aminosavszekvenciák is léteznek vagy konstruálhatok, amelyek lényegében azonos hemolitikus és antigén funkciókkal rendelkeznek. Szakemberek számára kézenfekvő, hogy olyan aminosavszekvencia-változtatások is végrehajthatók, amelyek hatására az adott peptid biológiai aktivitása fokozódik vagy csökken, anélkül, hogy funkciójának jellege megváltozna. A fenti peptideket kódoló DNS-szekvenciák szintén a találmány tárgykörébe tartoznak.
Szakemberek számára az is kézenfekvő, hogy az appA és appCA antigének különféle antigén determinánsokat (epitópokat) is tartalmazhatnak, amelyeket az A. pleuropneumoniae
·..·: · · ·” • . : : ··· · .
·· ····..··..·
- 8 hemolizinnel szemben termelt természetes antitestek felismerhetnek. Ezek az antigén determinánsok vagy önmagukban, vagy haptének formájában alkalmazhatók olyan immunválasz kiváltására sertésekben, amely pleuropneumonia elleni védelmet ad. A haptén alkalmazásának egyik módja az, hogy hordozóhoz, például albuminhoz kapcsoljuk. A találmány tárgykörébe tartoznak azok a DNS-szekvenciák is, amelyek az A. pleuropneumoniae hemolizin egy antigén determinánsát tartalmazó aminosavszekvenciát kódolnak. Egy előnyös megvalósítási mód szerint ez a DNS-szekvencia egy, az 1. ábrán látható aminosavszekvenciát, vagy egy ahhoz alapvetően hasonló szekvenciát kódol, amely az A. pleuropneumoniae hemolizin egy antigén determinánsát tartalmazza.
A találmány ezenkívül olyan antigén polipeptidekre is vonatkozik, amelyeket az A. pleuropneumoniae nem termelne természetes körülmények között. Amint fent említetük, az appA gén által kódolt appA antigén nem hemolizáló tulajdonságú, és ezt az A. pleuropneumoniae természetes körülmények között nem termeli. Az appA antigén azonban képes az immunválasz kiváltására, és vakcinálásra használható. Ennek megfelelően a találmány az appA gén által kódolt appA antigénre is vonatkozik. A találmány értelmében A. pleuropneumoniae hemolizin antigén alatt értendő az A. pleuropneumoniae hemolizin, az appA antigén, az appCa antigén és bármely olyan aminosavszekvencia, amely az A. pleuropneumoniae hemolizin valamely antigén determinánsát tartalmazza.
Az A. pleuropneumoniae hemlizint kódoló gének klónozása céljából először izoláljuk az A. pleuropneumoniae DNS-t • ·
- 9 a különféle szerotipusú törzsekből vagy az Actinobacillussal fertőzött sertésekből izolált törzsekből. Példaként jelen esetben egy 5-ös szerotipusú A. pleuropneumoniae törzset alkalmazunk. Választásunk azért esett erre törzsre, mivel a leggyakoribb szerotípusba tartozik, és egyike a legvirulensebb törzseknek. Azonban bármely olyan törzs alkalmazható, amely képes sertés pleuropneumoniát okozni. A találmány értelmében előnyösen az A. pleuropneumoniae kromoszomális DNS-éből egy genomtárat állítunk elő. A fenti tár előállítására számos különféle módszer ismert, és szakemberek számára nem okoz problémát az eljárásban alkalmazható különféle rekombináns vektorok és restrikciós enzimek megválasztása. Előnyösen az A. pleuropneumoniae kromoszomális DNS-ének egy emésztési termékét klónozzuk standard módszerek alkalmazásával egy bakteriofág könyvtárba.
Mivel az 5-ös szerotipusú hemolizint eddig még nem jellemezték vagy szekvenálták, ki kellett dolgozni egy módszert a hemolizin gén izolálására és szelektálására. Ismert volt, hogy számos patogén Gram-negatív organizmus szekretál nagy moltömegű (105-110 kD) lítikus toxinokat, amelyek immunológiailag és genetikailag hasonlítanak az Escherichia coli hemolizinjéhez [Chang és munkatársai, FEMS Lett., 60, 169174 (1989), és Kornakis és munkatársai, J. Bacteriol. 169, 1509-1515 (1987)]. Annak eldöntésére, hogy az A. pleuropneumoniae által szekretált hemolizin az RTX citotoxin család egyik tagja-e, Western biot analízissel, P. haemolytica leukotoxin ellen termelődött antiszérum alkalmazásával megvizsgáltuk a P. haemolytica, A. pleuropneumonie és egy pSF4000-t hordozó E. coli törzs tenyészetének felülúszóját. Kimutattunk egy, a leukotoxin látszólagos moltömegénél alig nagyobb, és az E. coli hemolizinnel közel azonos, Mr=110000 moltömegű, keresztreakciót adó polipeptidet.
Ebből arra következtettünk, hogy az A. pleuropneumoniae hemolizin ugyanabba a családba tarozik, mint a P. haemolytica leukotoxin. Ezért a P. haemolytica ismert szekvenciájú iktCA génjének egy szakaszát használtuk próbaként a kívánt kiónok izolálására. Ezenkívül a találmány értelmében A. pleuropneumoniae hemolizinnel szembeni antitesteket állítottunk elő, és ezeket használtuk a bakteriofág géntár immunológiai szűrővizsgálatára. A fenti szűrővizsgálatokat standard eljárásokkal végeztük. A pozitív jeleket mutató plakkokat kiemeltük, újravizsgáltuk és sokszoroztuk. Ezután a szelektált fág-inszertekből származó restrikciós fragmenseket különféle módszerekkel, például Maxam és Gilbert eljárásával vagy Sanger didezoxi-láncterminációs eljárásával szekvenálhatjuk.
A találmány szerinti eljárás során végzett antitestszűréssel egyetlen pozitív klón azonosítottunk (lásd 2. ábrát) . Ugyanezen géntár P. haemolyticából származó DNS-próbákkal való szűrésével 8 kiónt azonosítottunk, amelyek egymással és az antitest-szűréssel izolált klónnal átfedésben voltak (lásd 2. ábrát). A találmány szerint klónozott DNS egy 3,8 kb fragmens, amely az appA antigén teljes leolvasási keretét és a toxin proteint aktiváló kisebb appC protein leolvasási keretét is tartalmazza. Ez a két gén együtt alkotja az appCA gént, amely a hemolitikus aktivitással rendelkező « · • · « • · • · · «
teljes 110 kD appCA antigént kódolja. Az appCA szakasz nukleotidszekvenciája és az appC ás appA protein abból következtetett aminosavszekvenciája az 1. táblázatban látható.
Ezután az appCA gént tartalmazó DNS-fragmenst megfelelő rekombináns vektorba, például egy plazmidba vagy virális bakteriofág vektorba szubklónozhatjuk. Szakemberek számára nyilvánvaló, hogy számos lehetséges vektor létezik, amelyek alkalmazhatók, ilyen például a pBR322, a pAR-sorozat, a pKK223-3 és a pUC-sorozat, és még több különféle módszer van a fenti rekombináns vektorok előállítására. A vektor megválasztását befolyásoló számos paraméter közül például az alkalmazandó expressziós rendszer típusát és az inszertálandó DNS-szakasz méretét említjük. Mivel az appCA gének bakteriális gének, és az előnyös expressziós vektor egy baktériumsejt, az előnyös rekombináns vektor is egy bakteriális vektor lesz, legelőnyösebben egy bakteriális plazmid. A találmány megvalósítása során az yfc7 és yfc8 bakteriofág kiónokból származó appCA régiókat szubklónozzuk a pHG165 vektorba.
A rekombináns vektort ezután a beépítjük a kiválasztott expressziós rendszerbe, a rendszernek megfelelő módszer segítségével. Noha a találmány szerinti megoldásban gazdaságosság szempontjából legéletképesebb egy bakteriális expressziós rendszer, eukariota rendszert szintén alkalmazhatunk. Megfelelő expressziós rendszer például az E. coli JM103, E. coli C600, E. coli Co4 és E. coli DH20. A találmány szerinti megoldásban E. coli TB1 expressziós rendszert alkalmaztunk.
• ·
- 12 Noha az appCA gének expresszálhatók rekombináns rendszerben természetes A. pleuropneumoniae promoter alkalmazásával, előnyösebb, ha az appCA gént egy megfelelően erős promotertől és/vagy sokszorozó géntől lefelé (3'-irányban) helyezzük el. A promoter és/vagy sokszorozó gén típusa a rekombináns vektortól és az expressziós rendszertől függ. A találmány szerinti megoldásban előnyös promoterek például a lac vagy tryp promoterek. Az alkalmazható promoterekre további példaként említhetjük a T7 RNS-polimeráz promotert és a tac promotert. Ezek segítségével az antigén lényegesen nagyobb koncentrációban expresszálódik. A találmány tárgykörébe tartoznak a fent említett DNS-szekvenciákat tartalmazó rekombináns vektorok és a fenti DNS-szekvenciákat tartalmazó rekombináns sejtek, amelyek az A. pleuropneumoniae antigének előállítására alkalmazhatók.
A sejteket olyan körülmények között tenyésztjük, amelyek lehetővé teszik az antigén képződését. Szakemberek számára nyilvánvaló, hogy számos külünböző módszer, közeg és indukáló körülmény létezik, amelyet a gazda törzstől és a rekombináns plazmidtól függően alkalmazhatunk. Az antigént ezután izoláljuk a tenyészléből. A találmány szerinti megoldásban az appA és az appCA antigének várhatóan oldhatatlan inklúziós testeket képeznek az Escherichia coli gazdában való nagy mértékű expresszálódás következtében. Ez a jelenség gyakran előfordul különféle protein-túltermelés esetén [Schoner és munkatársai, Bio/Technology 3,z 151-154 (1985)]. Az inklúziós testek tisztítása viszonylag egyszerű. Például a baktériumsejteket ultrahanggal vagy French-nyomószűrön át4 « nyomva elroncsoljuk. Az inklúziós testeket ezután centrifugálással összegyűjtjük és a szennyező bakteriális sejttörmeléket alacsony koncentrációjú karbamiddal és neminonos detergenssel extrahálva eltávolítjuk. Az inklúziós testeket ezután guanidin-hidrogén-klorid denaturálószerrel szolubilizáljuk és az antigént a guanidin-hidrogén-klorid koncentráció hígítással való csökkentésével renaturáljuk. A fenti módszer csak egyike az E. coli által expresszált proteinek tisztítására szolgáló standard eljárásoknak. A találmány a fenti eljárásra és az A. pleuropneumoniae előállítására alkalmas egyéb eljárásokra is vonatkozik.
Vakcina előállítására az A. pleuropneumoniae antigén gyógyászatilag hatásos mennyiségét megfelelő hordozóanyaggal elegyítjük. Szakemberek számára magától értetődő, hogy számos megfelelő hordozóanyag létezik, és a találmány tárgykörébe tarttoznak az összes ilyen készítmények. A készítmények előnyösen 0,5-1,0 mg nyers antigént tartalmaznak nem-komplett adjuvánsban. Az A. pleuropneumoniae antigéneket vagy tisztított formában, vagy készítmény formájában adagolhatjuk sertéseknek, az állatok pleuropneumonia elleni vakcinálása céljából.
A találmányt közelebbről - a korlátozás szándéka nélkül - az alábbi példákkal kívánjuk ismertetni.
Az appCA gént tartalmazó rekombináns plazmid letétbe helyezése
Az appCA gént tartalmazó előnyös rekombináns vektort, a pYFC37 plazmidot az American Type Culture Collection-nél
1989. 10. 19-én helyeztük letétbe, letéti száma 68135.
Baktériumtörzsek, tápközegek és tenyésztési körülmények
Az 5-ös szerotípusú A. pleuropneumoniae törzset C. Pijoantól kaptuk (University of Minnesota, St. Paul, USA). Az A. pleuropneumoniae törzset 0,1 % NAD-dal kiegészített agy-szív infúziós tápközegben (BHI, Difco Laboratories) tenyésztettük. Az E. coli törzsek tenyésztésére Luria tápközeget [LB, Miller, Experiments in Molecular Genetics, 433. oldal (1972)] alkalmaztunk. A Lambda-Dash bakteriofág klónozó vektort a Strategene-től (La Jolla, CA) kaptuk. A rekombináns bakteriofág géntárhoz kiindulási gazdaként P2392-t alkalmaztunk, amely az E. coli LE392 törzs egy P2 lizogénje.
Általános módszerek
Noha a módszereket az alábbiakban olyan részletesen ismertetjük, amely szakember számára megfelelő kitanítást nyújt a találmány megvalósításához, a kereskedelmi forgalomból beszerezhető, Molecular Cloning c. kézikönyv (Maniatis és munkatársai, Cold Spring Harbor Laborytory, Cold Spring Harbor, New York) további útmutatást ad a találmány bizonyos részeinek gyakorlati kivitelezéséhez. Ezért a fenti kézikönyvre a leírásban hivatkozunk. Noha a találmány megvalósítát példaszerűen az alább ismertetett klónozó rendszerekkel ismertetjük, szakemberek számára nyilvánvaló, hogy az A. pleuropneumoniae hemolizinek nukleotidszekvenciájának felderítése után bármely más klónozó rendszer is alkalmazható.
Anti-A. pleuropneumoniae szérum előállítása sertésben
Az A. pleuropneumoniae elleni antiszérumot Gunnarsson módszere szerint állítjuk elő [Am. J. Vet. Rés. 40, 1564 (1979)]. A vakcináit sertésekből kapott fenti szérumról kimutatható, hogy semlegesíti az 5-ös típusú A. pleuropneumoniae tenyészetének felülúszójában a hemolizint.
Anti-hemolizin antiszérum affinitásos tisztítása
500 ml 0,1 % NAD-dal kiegészített BHI tápközegben közel stacioner fázis eléréséig tenyésztjük az A. pleuropneumoniaet. A tenyészet sejtmentes felülúszóját ultraszüréssel 10-szeresére koncentráljuk, és a mintegy 1 mg hemolizin proteint 5 térfogat hideg acetonnal kicsapjuk. A csapadékot SDS-PAGE minta-pufferben forralással újraoldjuk, és preparatív SDS-PAGE eljárással tisztítjuk. A 105 kD hemolizin-sávot 4 mol/1 nátrium-acetáttal előhívjuk [Hunkapiller és munkatársai, Methods in Enzymology, 91, 227 (1983)], kivágjuk és a hemolizin-proteint elektroforetikusan nitrocellulózra átvisszük [Towbin és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S.A. 76, 4350 (1979)]. Az átvitel után a nitrocellulóz csíkot zselatint tartalmazó TBST-ben (20 mmol/1 Tris-HCl, pH 7,5, 150 mmol/1 NaCl, 0,05 % Tween 20) inkubáljuk. Ezután a csíkot szobahőmérsékleten 4 órán keresztül 5 ml azonos pufferben inkubáljuk, amely 100:1 nyers anti-A. pleuropneumoniae szérumot tartalmaz, majd a nem kötődő antitestet TBST-vel négyszer mosva eltávolítjuk. A specifikusan kötődött antitestet 0,1 mg/ml marha-szérumalbumint tartalmazó 5 ml 0,1 mol/1 koncentrációjú glicinnel (pH 2,5) 5 percen kérész16 tüli inkubálással eluáljuk. Az eluátumot 1 mol/1 koncentrációjú Tris bázissal azonnal semlegesítjük.
A. pleuropneumonia DNS klón-bank előállítása Lambda-Dash-ben
Az A. pleuropneumoniae kromoszóma-DNS-t Silhavey és munkatársai módszere szerint tisztítjuk [Experiments with Gene Fusion, 89. oldal, Cold Spring Harbor (1984)] és SAU 3A-val részlegesen emésztjük. Az emésztett DNS-t 10-40 % szacharóz-gradiensen keresztüli szedimentálással frakcionáljuk [Maniatis és munkatársai, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 275-277. oldal (1982)] és az agaróz-gél-elektroforézis szerint 9-20 kbp fragmenseket tartalmazó frakciókat összegyűjtjük és alkoholos kicsapással 100 Mg/ml végkoncentrációra koncentráljuk.
A Lambda-Dash-t BamHI-gyel hasítjuk és alkalikus foszfatázzal kezelve eltávolítjuk a terminális foszfátcsoportokat. Fenolos extrahálás és etanolos kicsapással végzett koncentrálás után a vektor DNS-t méret szerint szelektált A. pleuropneumoniae DNS-sel elegyítjük 1:4 mólarányban, és 15 ’C-on 18 órán keresztül T4 DNS-ligázzal kezeljük. A ligáit DNS-elegyet lambda-részecskékbe pakoljuk, kereskedelmi forgalomban kapható in vitro pakoló kit alkalmazásával (Gigapack plus, Stratagene, La Jolla, CA). A fág-titert P2392-n határozzuk meg. A rekombináns fágokat P2392-n törzslemezként sokszoroz zuk.
Fág-könyvtár szűrővizsgálata A. pleuropneumoniae hemolizin génre
A bakteriofág géntárat az affinitással tisztított • · ·
- 17 antihemolizin antitest alkalmazásával, és P. haemolytica-ból származó IktCA géneket tartalmazó próba alkalmazásával, hibridizálással szűrjük.
Az antitesttel való szűrésre a géntárat 150 x 10 mm-es lemezeken szélesztjük 5000 plakk/lemez sűrűséggel. A plakkokat nitrocellulózra visszük át és minden egyes szűrőt 1 ml affinitással tisztított antitesttel tesztelünk, standard módszerek alkalmazásával [Huynh és munkatársai, In DNA Cloning: A Practical Approach, I. kötet, 49. oldal, Glover Ed. (1985)]. A pozitív plakkokat alkalikus foszfatázzal konjugált kecske anti-sertés IgG [Kirkegaard és Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) második antitesttel azonosítjuk, majd nitro-kék-tetrazólium (NBT) és 5-bróm-4-klór-3-indolil-foszfát (BCIO) szubsztrátokkal színreakciót hozunk létre [Hawkes és munkatársai, Anal. Biochem. 119, 142 (1982)].
A hibirdizálással való szűrésre az IktCA géneket tartalmazó, pYFC19-ből származó DNS-fragmenst [Chang és munkatársai, Infect. Immun. 55, 2348 (1987)] 32P-dATP-vel és 32p_dcTP-vel jelezzük, nick-transzlációval. A szűrőket ezután szobahőmérsékleten kétszer mossuk 2xSSC-0,l% SDS-sel, és kétszer 0,2xSSC-0,l% SDS-sel. Az utolsó mosást 0,16XSSC-0,1% SDS-sel végezzük 42 °C-on.
A fenti módszerek bármelyikével nyert, pozitív jeleket adó plakkokat izoláljuk, újra szűrjük és P2392-ben sokszorozzuk.
SDS-PAGE és Western biot analízis
Az SDS-PAGE-t Altman és munkatársai módszere szerint végezzük [J. Bacteriol. 155, 1130 (1983)]. Az immunreakciót • ·
- 18 ~ adó proteineket Western biot analízissel [Towbin és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 4350- 4354 (1979)] detektáljuk, Chang és munkatársai eljárása szerint [Infect. Immun. 55, 23248-2354 (1987)]. Az első antitest vagy marha anti-leukotoxin [Chang és munkatársai, Infect. Immun. 55. 2348-2354 (1987)], vagy sertés anti-hemolizin. A sertés IgG-vel szembeni második antitest alkálikus foszfatáz konjugátum (gyártja Kirkegaard és Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) .
A bakteriofág klónokból expresszálódott proteinek analízise céljából 5 ml-es lizátumokat készítünk, és a bakteriális törmeléket centrifugálással eltávolítjuk. A tisztított felülúszókat ezután sómentesítjük és kloroform-metanol eleggyel extrahálva eltávolítjuk a lipideket [Wessel és munkatársai, Anal. Biochem. 138. 141 (1984)]. A denaturált protein-maradékot centrifugálással összegyűjtjük és SDS-PAGE minta-pufferben való forralással újra feloldjuk. A kontroll lizátumokat azonos módon készítjük el, Lambda-Dash vektort alkalmazva. A P. haemolytica, A. pleuropneumoniae és a teljes hly determinánst expresszáló pSF4000-et tartalmazó E. coli sejtmentes tenyészet-felülúszói [Felmlee és munkatársai, J. Bacteriol. 163. 88-93 (1985)] szolgálnak a leukotoxin és hemolizin antigén forrásául.
Southern biot analízis
Az A. pleuropneumoniae kromoszomális DNS-ének alikvotjait Pstl-gyel, Xbal-gyel illetve Xhol-gyel emésztjük, 0,7 %-os agaróz-gélen elektroforetizáljuk, majd nitrocellulóz membránra visszük át Southern módszere szerint [J. Mól.
• ·
- 19 Bioi. 98, 503 (1975)]. Hibridizációs próbaként az 1,6 kbp Xbal fragmenst használjuk, amely az yfc5 bakteriofág klónból az appC és appA gének részeit tartalmazza (2. ábra). A foltot 65 °C-on 12 órán keresztül 32P-jelzett próbával hibridizáljuk 4-szeres töménységű SET-ben (Mason és Williams, 1985) és 100 g/ml denaturált borjú-timusz DNS-t, 50 g/ml poliA-t és 10 g/ml poliC-t tartalmazó 5-szörös töménységű Denhardtoldatban. A szűrőt szobahőmérsékleten 4-szeres töménységű SET-vel mossuk, majd 65 °C-on egymás után 4-szeres töménységű SET-vel, kétszeres töménységű SET-vel, egyszeres töménységű SET-vel és 0,3-szoros töménységű SET-vel mossuk.
DNS-szekvenálás és analízis
A DNS-szekvencia meghatározását didezoxi-lánc-terminációs módszerrel [Sanger és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 74., 5463 (1977)] végezzük. Az A. pleuropneumoniae-ból származó DNS-inszertek megfelelő régióit az yfc5 és yfcl2 bakteriofág kiónokban az M13mpl8 vagy M12mpl9 többszörös klónozó helyeire szubklónozzuk, és standard eljárás alkalmazásával [Messing, In Methods Enzymol. 101. 20. oldal, Academic Press (1983)] előállítjuk az egyszálú fág-DNS-t. A szekvenáló reakciókban 32P-dATP-t (800 Ci/mol, New England Nuclear, Boston, MA), T7 DNS-polimerázt és kereskedelmi forgalomból beszerezhető Seguenase kit-et (United States Biochemicals, Cleveland, OH) alkalmazunk. A DNS-szintézisben primerként lac univerzális prímért vagy a már szekvenált régiókkal komplementer más primereket alkalmazunk. Az utóbbiakat Applied Biosystems 380A DNS Synthesizer-ben (Foster City, CA) szintetizáljuk. A klónozott DNS mindkét szálát tel20 jes egészében szekvenáljuk. A DNS-szekvenciát PCGene DNS és protein analízis programmok alkalmazásával analizáljuk (IntelliGenetics Crop., Mountain View, CA).
Hemolítikus aktivitás vizsgálata
A megadott minták alikvotjait 37 °C-on 1 órán keresztül kalcium-sóoldattal (10 mmol/1 CaC12, 0,85 % NaCl, 10 mmol/1 Tris-HCl, pH 7,5) készült 0,2 % kecske-eritrocita-szuszpenzióval inkubáljuk. Az inkubálás befejezése után a mintákat 10 percen keresztül 500 g-vel centrifugáljuk és a hemolízis mértékére a felülúszó A545 értékéből következtetünk. A teljes hemolízisnek megfelelő A545 értéket az eritrociták Triton Χ-100-zal végzett lízisável kapjuk. A háttér-abszorpciót eritrocitát nem tartalmazó, egyébként azonos összetételű elegyekkel határozzuk meg. Az antiszérum neutralizálására a mintákat 50 μΐ megfelelő szérummal szobahőmérsékleten, 1 órán keresztül előinkubáljuk.
Eredmények
Az App lókusz klónozása
A 110 kD antigénnel szembeni affinitással tisztított antiszérummal végzett antitest-szűrővizsgálattal egyetlen, 14 kb inszertet tartalmazó pozitív kiónt azonosítottunk (2. ábra). Ugynezen könyvtárat pYFC19-ből származó DNS-próbákkal szűrve egy IktCA lókuszt hordozó plazmid (Chang és munkatársai, 1987) nyolc kiónt ismert fel (2. ábra). A nyolc klón egymással és az immunológiai szűréssel izolált kiónnal is átfedésben van (2. ábra). A fenti kilenc klón - egy kivételével - egy 110 kD polipeptidet expresszál, amelyet az antiApp hemolizin antitesttel vagy az anti-leukotoxin antitest• ·
· a
- 21 tel végzett Western biot analízissel detektáltunk. Egy klón, az yfc5 egy 80 kD csonka polipeptidet expresszál, amely a 110 kD polipeptid egy megrövidített változata. Abból a tényből, hogy ez a klón egy csonka toxint expresszált, következtetni lehet a feltételezetten valódi App lókusz helyére és orientációjára a klónozott DNS-ben (2. ábra).
Az Xbal fragmens alkalmazásával végzett Southern biot analízis - amelyet a toxin determináns feltérképezésére végeztünk - a DNS-szekvenálásból megítélve azt mutatta, hogy a klónozási eljárás során nem ment végbe kimutatható átrendeződés. Ezenkívül a fenti analízis szerint ez a szekvencia egyetlen példányként van jelen az A. pleuropneumoniae genomban. Annak ellenére, hogy nyolc olyan kiónt azonosítottunk, amely a teljes hosszúságú hemolizint expresszálja, a fenti fág-lizátumok egyikében sem lehetett hemolitikus aktivitást kimutatni.
Az appCA gének DNS-szekvenciája
A csonka kiónnal kimutatott régiót DNS-szekvenálással analizáltuk. A 3,8 kb régió szekvenciáját az 1. ábra mutatja. A toxin leolvasási keret előtt található egy rövid, 159 kodonból álló ORF, amely egy 18,5 kD polipeptidet kódol, ez valószínűleg az appC gén, és egy 957 kodonból álló nagy ORF, amely egy 10,5 kD polipeptidet kódol, ez valószínűleg az appA gén (1. ábra).
A DNS-szekvenciát E. coli promoterszerű szekvenciákra szűrtük, homológia pontozásos módszert alkalmazva. Három szekvencia volt, amely hasonlított a TATAAT konszenzus promoter szekvenciához (-10 régió) és kettő, amely a TTGACA » Λ » · · * * · » · • · ·· · « ·· « • · · · · · ·· ·· ·*
- 22 ~
RNS-polimeráz kötőhelyhez hasonlított [Reznikoff és Gold, In Maximizing Gene Expression, 1. oldal, Bostoni Butterworth publication (1986)] az appC középpontjához közel. Az appC génben két lehetséges metionin strat-kodon van, és mindkettőtől felfelé (5'-irányban) egy elfogadható Shine-Dalgarno szekvencia helyezkedik el. Egyszerűség kedvééért az első AUG kodont választottuk ki az appC gén start-kodonjaként. Felismertünk továbbá egy riboszóma-kötőhelyet (Shine-Dalgarno szekvenciát) az appA iniciáló kodonjától felfelé, és egy, az
E. coli rho-függő transzkripciós terminátorához nagyon hasonló szekvenciát az appA-tól lefelé (1. ábra). Ilyen lehetséges terminátor szekvencia van analóg helyzetben az E. coli hemolizin illetve a P. haemolytica leukotoxin determinánsaiban is (Lo és munkatársai, 1987; Highlander és munkatársai, 1989; Welch és Pellet, 1988). Az AppA protein kilenc, glicinben gazdag hexapeptid ismétlődő egységet is tartalmaz, karboxil-terminálisához közel. Hasonló ismétlődő egységek találhatók a HlyA és LktA proteinekben is [Strathdee és Lo, J. Bacteriol. 171, 916-928 (1987)], innen származik az RTX (repeat toxin) elnevezés (Strathdee és Lo, 1989).
Hemolitikus aktivitás expressziója E. coliban
Az yfc7 és yfc8 bakteriofág klónokból származó appA régiókat (2. ábra) pHG165 vektorba [Stewart és munkatársai, Plasmid, 15, 172 (11986)] szubklónozzuk EcoRI-XhoI fragmensként, így pYFC38 (appA) és pYFC37 (appCA) plazmidot kapunk. Ezzel a módszerrel a pYFC38 appA génjét a vektor lac promoterével szabályozzuk. A pYFC37 appCA génjei valószínűleg egy A. pleuropneumoniae promoterből és a vektor lac promoteréből • · ·«
- 23 expresszálódnak. Ezeket a plazmidokat E. coli TB1 gazdába transzformáljuk, és a transzformánsokat a stacioner fázis elejéig tenyésztjük, majd megvizsgáljuk a 110 kD protein expressz iój át és a hemolitikus aktivitást. Mindkét klón expresszálja a 110 kD proteint, de az antigén koncentrációk lényegesen magasabbak a pYFC38-at hordozó transzformánsokban. Hemolitikus aktivitást azonban csak az érintetlen appC gént tartalmazó termék mutatott.
Ezt a hemolitikus aktivitást - az A. pleuropneumoniae-ból szekretált hemolizinhez hasonlóan - sertés anti-App hemolizin antiszérummal vagy P. haemolytica leukotoxin elleni nyúl antiszérummal lehetett semlegesíteni.
Claims (18)
- Szabadalmi igénypontok1. Tisztított, izolált DNS-szekvencia, azzal jellemezve, hogy amely egy A. pleuropneumoniae hemolizint vagy annak alléi változatát kódoló DNS-szekvenciát tartalmaz.
- 2. Az 1. igénypont szerinti DNS-szekvencia, azzal jellemezve, hogy az 1. ábra szerinti appCA nukleotidszekvenciát, vagy annak egy alléi változatát tartalmazza.
- 3. Az 1. igénypont szerinti DNS-szekvencia, azzal jellemezve, hogy 1. ábra szerinti appCA aminosavszekvenciát, vagy egy lényegében azonos aminsavszekvenciájú és biológiai aktivitású polipeptidet kódol.
- 4. Az 1. igénypont szerinti DNS-szekvencia, azzal jellemezve, hogy az 1. ábra szerinti appA aminosav szekvenciát, vagy egy lényegében azonos aminsavszekvenciájú és biológiai aktivitású polipeptidet kódol.
- 5. Az 1. igénypont szerinti DNS-szekvencia, azzal jellemezve, hogy az 1. ábra szerinti appA nukleotidszekvenciát vagy annak egy alléi változatát tartalmazza.
- 6. Az 1. igénypont szerinti DNS-szekvencia, azzal jellemezve, hogy az A. pleuropneumoniae hemolizin egy antigén determinánsát kódolja.
- 7. Az 1. igénypont szerinti DNS-szekvencia, azzal jellemezve, hogy biológiailag az ATCC • < · ·* *4·9 » · · · 4 *· « ·«· » · » · · • <· · ·· ·v v·««68135 számon letétbe helyezett plazmidban lévő szekvenciának felel meg, amely egy A. pleuropneumoniae antigént kódol.
- 8. A. pleuropneumoniae hemolizin antigén, azzal jellemezve, hogy az AppA gén vagy annak egy alléi változata által kódolt aminosavszekvenciát, vagy lényegében azonos aminosavszekvenciával és biológiai aktivitással rendelkező polipeptidet tartalmaz.
- 9. Gyógyászati készítmény, azzal jellemezve , hogy az A. pleuropneumoniae hemolizin antigén biológiailag hatásos mennyiségét tartalmazza megfelelő hordozóanyagban.
- 10. Rekombináns vektor, azzal jellemezve, hogy az 1 - 7. igénypontok bármelyike szerinti DNS-szekvenciát tartalmazza.
- 11. A 10. igénypont szerinti rekombináns vektor, azzal jellemezve, hogy az egy rekombináns plazmid.
- 12. A 10. igénypont szerinti rekombináns vektor, azzal jellemezve, hogy a DNS-szekvencia működőképesen kapcsolódik egy erős promoter szekvenciához.
- 13. Rekombináns sejt, azzal jellemez- v e , hogy az 1 - 7. igénypontok bármelyike szerinti DNS-szekvenciát tartalmazza.
- 14. A 13. igénypont szerinti rekombináns sejt, azzal jellemezve, hogy az egy baktérium.
- 15. Eljárás A. pleuropneumoniae hemolizin antigén előállítására, azzal jellemezve, hogy- előállítunk egy 14. igénypont szerinti rekombináns sejtet,- a sejtet tápközegben tenyésztjük az antigén expressziójára alkalmas körülmények között, és- a tenyészetből izoláljuk az antigént.
- 16. Eljárás sertések vakcinálására sertés pleuropneumoniae ellen, azzal jellemezve, hogy a sertéseknek beadjuk az A. pleuropneumoniae hemolizin antigén biológiailag hatásos mennyiségét.
- 17. A 16. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az A. pleuropneumoniae hemolizin antigén az appA antigén.
- 18. A 16. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az A. pleuropneumoniae hemolizin antigén az appCA antigén.A meghatalmazott:c&ulj JdaNUBIA 6s V&ljegy Iroda Kft.Aktaszámunk: 74972-1459Ügyintézőnk: dr. Kiss Ildikó4/1
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/429,273 US5641653A (en) | 1989-10-31 | 1989-10-31 | DNA encoding Actinobacillus pleuropneumoniae hemolysin |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUT64596A true HUT64596A (en) | 1994-01-28 |
Family
ID=23702554
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9201413A HUT64596A (en) | 1989-10-31 | 1990-10-31 | Recombinant vaccine against swine pleuropneumonie |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5641653A (hu) |
| EP (2) | EP0617128B1 (hu) |
| JP (1) | JP3236610B2 (hu) |
| AT (2) | ATE223487T1 (hu) |
| AU (1) | AU644829B2 (hu) |
| CA (1) | CA2071863C (hu) |
| DE (2) | DE69016671T2 (hu) |
| DK (2) | DK0500736T3 (hu) |
| ES (2) | ES2181695T3 (hu) |
| GR (1) | GR3015878T3 (hu) |
| HU (1) | HUT64596A (hu) |
| WO (1) | WO1991006653A1 (hu) |
Families Citing this family (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE69110082T2 (de) * | 1990-04-20 | 1995-11-09 | Akzo Nobel Nv | Untereinheit-Impfstoff gegen Actinobacillus Pleuropneumoniae. |
| US5994525A (en) * | 1991-06-28 | 1999-11-30 | Kamp; Elbarte Margriet | Nucleic acid encoding Actinobacillus pleuropneumoniae cytolytic proteins |
| US5417971A (en) * | 1991-10-22 | 1995-05-23 | University Of Saskatchewan | Vaccines for Actinobacillus pleuropneumoniae |
| AUPN631395A0 (en) * | 1995-11-02 | 1995-11-23 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Vaccine and biological vector(II) |
| AUPN631495A0 (en) * | 1995-11-02 | 1995-11-23 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Vaccine and biological vector(I) |
| US5925354A (en) * | 1995-11-30 | 1999-07-20 | Michigan State University | Riboflavin mutants as vaccines against Actinobacillus pleuropneumoniae |
| US6770275B1 (en) | 1996-05-31 | 2004-08-03 | Akzo Nobel N.V. | Live attenuated RTC-producing bacteria of the family |
| EP0810283A3 (en) * | 1996-05-31 | 1997-12-10 | Akzo Nobel N.V. | Live attenuated RTX-procucing bacteria of the family Pasteurellaceae |
| WO1998046260A1 (en) * | 1997-04-15 | 1998-10-22 | Baylor College Of Medicine | Pasteurella haemolytica vaccine |
| US6669940B2 (en) * | 2000-04-25 | 2003-12-30 | Kansas University Research Foundation | Recombinant fusobacterium necrophorum leukotoxin vaccine and preparation thereof |
| AU5913801A (en) * | 2000-04-25 | 2001-11-07 | Univ Kansas State | Recombinant fusobacterium necrophorum leukotoxin vaccine and preparation thereof |
| WO2004078965A1 (ja) * | 2003-03-05 | 2004-09-16 | Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute | 大腸菌における異種蛋白質の製造方法 |
| CN109453371A (zh) * | 2018-11-23 | 2019-03-12 | 中国兽医药品监察所 | 一种羊痘、山羊传染性胸膜肺炎二联灭活疫苗及其生产方法 |
| WO2021229721A1 (ja) | 2020-05-13 | 2021-11-18 | 三菱電機株式会社 | 空中ハプティクス制御装置、空中ハプティクスシステム及び空中ハプティクス制御方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NL8802007A (nl) * | 1988-08-12 | 1990-03-01 | Centraal Diergeneeskundig Inst | Vaccin, geschikt voor de profylaxe respectievelijk de bestrijding van de door haemophilus pleuropneumoniae teweeggebrachte ziekte bij varkens alsmede werkwijze voor het winnen van extracellulair eiwitachtig materiaal van haemophilus pleuropneumonie, geschikt voor toepassing in dergelijke vaccins. |
-
1989
- 1989-10-31 US US07/429,273 patent/US5641653A/en not_active Expired - Lifetime
-
1990
- 1990-10-31 DE DE69016671T patent/DE69016671T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-10-31 AT AT94108311T patent/ATE223487T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-10-31 JP JP50047491A patent/JP3236610B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1990-10-31 HU HU9201413A patent/HUT64596A/hu unknown
- 1990-10-31 DK DK90917398.1T patent/DK0500736T3/da active
- 1990-10-31 DK DK94108311T patent/DK0617128T3/da active
- 1990-10-31 EP EP94108311A patent/EP0617128B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-10-31 AT AT90917398T patent/ATE118038T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-10-31 AU AU67513/90A patent/AU644829B2/en not_active Ceased
- 1990-10-31 DE DE69033999T patent/DE69033999T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-10-31 ES ES94108311T patent/ES2181695T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-10-31 CA CA002071863A patent/CA2071863C/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-10-31 WO PCT/US1990/006350 patent/WO1991006653A1/en active IP Right Grant
- 1990-10-31 ES ES90917398T patent/ES2069099T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-10-31 EP EP90917398A patent/EP0500736B1/en not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-04-19 GR GR950401014T patent/GR3015878T3/el unknown
-
1997
- 1997-05-02 US US08/850,379 patent/US5804190A/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO1991006653A1 (en) | 1991-05-16 |
| DK0617128T3 (da) | 2002-12-02 |
| EP0500736A1 (en) | 1992-09-02 |
| DE69016671T2 (de) | 1995-08-10 |
| JP3236610B2 (ja) | 2001-12-10 |
| AU644829B2 (en) | 1993-12-23 |
| CA2071863A1 (en) | 1991-05-01 |
| CA2071863C (en) | 2007-08-07 |
| GR3015878T3 (en) | 1995-07-31 |
| EP0500736B1 (en) | 1995-02-01 |
| DE69033999T2 (de) | 2003-07-31 |
| DE69033999D1 (de) | 2002-10-10 |
| ES2181695T3 (es) | 2003-03-01 |
| ES2069099T3 (es) | 1995-05-01 |
| EP0617128B1 (en) | 2002-09-04 |
| DK0500736T3 (da) | 1995-05-08 |
| EP0617128A1 (en) | 1994-09-28 |
| ATE118038T1 (de) | 1995-02-15 |
| JPH05501956A (ja) | 1993-04-15 |
| ATE223487T1 (de) | 2002-09-15 |
| AU6751390A (en) | 1991-05-31 |
| US5641653A (en) | 1997-06-24 |
| DE69016671D1 (de) | 1995-03-16 |
| US5804190A (en) | 1998-09-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0462210B1 (en) | Vaccines for nontypable haemophilus influenzae | |
| CA2104014C (en) | Structural gene of pneumococcal protein | |
| US5753463A (en) | Structural gene of pneumococcal protein | |
| US6040427A (en) | Vaccine | |
| JP5566684B2 (ja) | Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｄｉｆｆｉｃｉｌｅに対する、組換え毒素Ａ／毒素Ｂワクチン | |
| AU721954B2 (en) | Expression of lipoproteins | |
| HU212716B (en) | Method for the preparation of vaccine against lyme disease | |
| EP0695803A2 (en) | Epitopic regions of pneumococcal surface protein A | |
| HUT64596A (en) | Recombinant vaccine against swine pleuropneumonie | |
| US6939548B2 (en) | Methods to produce high levels of C. difficile toxins | |
| Purcell et al. | Molecular cloning and characterization of the 15-kilodalton major immunogen of Treponema pallidum | |
| US6538118B1 (en) | Expression of lipoproteins | |
| JPH09500537A (ja) | Ｂ型インフルエンザウイルス由来のタンパク質ｐ２の発現および精製方法 | |
| US6994854B1 (en) | Protective epitopes of adenyl cyclase-haemolysin (AC-Hly), their application to the treatment or to the prevention of bordetella infections | |
| IE904274A1 (en) | Novel vaccine | |
| AU667668C (en) | Structural gene of pneumococcal protein | |
| EP0419997A1 (en) | Cloning of the gene which codes for the pilinic subunit FIM3 of Bordetella pertussis |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| DFC4 | Cancellation of temporary protection due to refusal |