JPH05501956A - 豚胸膜肺炎用ワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 豚胸膜肺炎用ワクチン 合衆国政府は、研究契約ＵＳＤＡ　Ｎｏ、　６１４６−０１に基づき本発明に関 して一定の権利を有する。

本発明は、アクチノバチルス・プリューロニューモニア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉ ｌｌｕｓ　ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａ）　（んブリューロニューモニア） の抗原を発現する遺伝子に関する。

さらに、これらの遺伝子を製造する方法及びこれらの抗原を用いて豚胸膜肺炎に 対して豚にワクチンを予防接種する方法に関する。

豚のへモフィルス・プリエーロニューモニア（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｐｌｅ ｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａ）は、グラム陰性菌、Ａ、プリューロニューモニアに より引き起こされる伝染性の高い呼吸器疾患である。近年、生産の局限化及び強 化指向がその一つの理由となって、この疾患の発病率か著しく高くなり現在では 養豚産業における経済的損失の主要因となっている。この急性疾患が発生すると 、その死亡率は、子豚では１００％、肥育豚では２５％に達する。感染豚は、繊 維素性胸膜炎又は胸膜癒着を伴う慢性の局所的肺壊死を伴った急性局所拡張性肺 炎を起こす。Ａ、プリューロニューモニアの８種の血清型が同定されているが、 これまでのところ、血清型５が最も流行っている。

Ａ、ブリエーロニューモニアの毒性要因の一つは、分泌された細胞毒であると考 えられている。このことは、Ａ、プリューロニューモニアの細胞培養物上清か、 豚肺胞マクロファージ及び末梢単球に対して細胞毒性を有するという事実によっ て支持される（Ｂｅｎｄｉｘｉｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｔａｏｕ ｎ、　３３．６７３−６７６（１９８１））。さらに、超音波処理した菌及び滅 菌した培養物上清が、自然感染豚に観察される肺炎に似た局所肺炎を引き起こす ことが報告されている（Ｒｏｓｅｎｄａｌ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｉｎ ｔ。

Ｐｉｇ、　Ｖｅｔ、　Ｓｏｃ、　Ｃｏｎｇｒ、　５：２２１（１９８０））。

Ａ、プリエーロニューモニアの細胞毒は、すべてではないにしてもその大半がＡ 。

プリューロニューモニア血清型が産生した細胞外溶血素であると考えられる。こ の溶血素の性質は殆ど知られていない。種々の血清型のＡ、プリューロニューモ ニアが熱安定性の炭水化物（Ｋｕｍｅ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉａ ｎｕｎ、　５１．５６３−５７０（１９８６））又は熱に対して不安定な蛋白質 （Ｍａｕｄｓｅｌｙ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃａｎ、　Ｊ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、 　３２．８０Ｉ−８０５（１９８６））を産生することが報告されている。また 、んブリューロニューモニアの血清型１．　２．　３．　５．　６及び７の溶血 素がＲＮＡを要求することも報告されている（Ｍａｒｔｉｎ　ｅｔ　ａｌ、、　 Ｃａｎ、　Ｊ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　３１．４５６−４６２（１９８５）） 　ｏこれまでに２種の溶血素、すなわち、血清型２から得られる熱安定性の溶血 素（Ｋｕｍｅ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｉｎｆｅｃｔ、　１ｍｍｕｎ、　５１．５６３−５７０（１９８６））及び血清 型１が分泌する１０５ｋＤのポリペプチド（Ｆｒｅｙ　ｅｔ　ａ、１．、Ｉｎｆ ｅｃｔ、Ｉｏ＋ｕｎ、　５６．２５７０−２５７５（１９８８））　、が同定さ れている。本発明前、Ａ、プリューロニューモニア溶血素のアミノ酸配列は全く 知られていない。

豚の胸膜肺炎に対するワクチンは現在のところ市販されていない。加熱殺菌又は ホルマリンで固定した菌を用いて免疫処置が試みられたが、これらの免疫原の有 効性は臨床的には証明されていない。Ａ、ブリューロニューモニアの溶血素を、 豚胸膜肺炎に対する豚の保護免疫原として使用することができることが期待され る。

最も包括的かつ全般的な範囲において、本発明はＡ、プリューロニューモニア溶 血素抗原をコードするＤＮＡ配列を開示する。本発明はさらに、そのＤＮＡ配列 を含む組換えベクター及び組換え細胞、並びにこの組換え細胞を用いてＡ、ブリ エーロニューモニア溶血素抗原を製造する方法を提供するものである。本発明は さらに、豚胸膜肺炎に対して豚をワクチン予防接種するためのＡ、ブリエーロニ ューモニア溶血素抗原の使用を開示する。

さらに具体的には、本発明は図１に示すａｐｐＣＡアミノ酸配列又はａｐｐＡア ミノ酸配列、又は実質的に同一のアミノ酸配列と生物活性を有するポリペプチド をコードするＤＮＡ配列を提供するものである。一実施態様において本発明は、 図１に示すａｐｐＣＡ及びａｐｐＡヌクレオチド配列、又はその対立変種をコー ドするＤＮＡ配列を提供するものである。本発明はまた、Ａ、プリエーロニュー モニア溶血素の抗原決定基をコードするＤＮＡ配列を提供するものである。好ま しい実施態様において本発明は、ＡＴＣＣ寄託Ｎｏ、６８１３５に含まれている ものに相当するＤＮＡ配列を提供するものである。

本発明はまた、上記ＤＮＡ配列を含む組換えベクターを提供するものである。

さらに詳細には、本発明はその組換えベクターが細菌性プラスミドであり、その ＤＮＡ配列が強いプロモーター配列に機能的に結合している組換えベクターを提 供するものである。さらに本発明は、上記ＤＮＡ配列を含む組換え細胞、最も好 ましくは細菌細胞を提供するものである。本発明はまた、ａｐｐＡ遺伝子又はそ の対立変種がコードするんプリエーロニューモニア抗原、又は実質的に同一のア ミノ酸配列及び生物活性を有するポリペプチドを提供するものである。

Ａ、ブリエーロニューモニア溶血素抗原は、上記組換え細胞を培養し、処理する ことにより製造することができ、本発明はＡ、プリエーロニューモニア抗原の製 造方法を提供するものである。本発明はさらに、この抗原を含む組成物、及びこ の抗原を豚胸膜肺炎に対するワクチンとして使用する方法を提供するものである 。

図１は、ａｐｐｃＡ領域のヌクレオチド配列、及びａｐｐＣ及びａｐｐＡ蛋白質 の予想アミノ酸配列を示す。ａｐｐＣ遺伝子に隣接するプロモータ一様領域は、 ヌクレオチド配列のすぐ下の記号△で示されている。ａｐｐＣに先行する潜在的 リポソーム結合配列ａｐｐＡ及びａｐｐＡの直後のものは下線がつけである。

図２は、Ａ、プリューロニューモニア溶血素クローンの制限地図を示す。このベ クター由来のＥｃｏＲ１部位が各クローンの挿入物の両側にある。ｙｆｃ５以外 の各クローンは、１１０ｋＤのポリペプチドを発現し、ウェスタンブロッティン グにより検出された。配列分析により見出されたａｐｐＣ及びａｐｐＡで示され る２つのオープン読み枠の位置は次のように表されている　Ｃ，Ｃ１ａｎ；　Ｅ ｖ、声遼ＲＶ；　Ｈ，ＨｉｎｄｒＩＩ；　Ｐ。

Ｐｓｔｌ　；　Ｓ、５ａｃｌ；　Ｘ、　５ｂａｌ；　Ｘｏ、Ｘｈｏｒ　。

本発明のＤＮＡ配列及びんプリエーロニューモニア溶血素抗原は、豚の胸膜肺炎 に対して豚を免疫するための有効なワクチンを効果的かつ経済的に製造する方法 を提供するものである。本発明が提供するＤＮＡ配列を各種の発現系で使用して 、高濃度のんプリエーロニューモニア溶血素抗原を製造することができる。

好ましい方法においては、このＤＮＡ配列は強い細菌プロモーターの下流に配置 され、最大の収率を可能とする。次いで、この細菌が産生じた抗原を単離、精製 し、胸膜肺炎に対するワクチンとして豚に導入することができる。

本発明により単離、クローン化されたＤＮＡ配列はＡ６プリユーロニユーモニア 溶血素をコードする。これらは、さらに詳細には、Ａ、プリエーロニューモニア 血清型５由来の１１０　ｋＤ溶血素をコードする。本発明の最も好ましい実施態 様は、図１に示すＤＮＡ配列である。もちろん、このＤＮＡ配列が遺伝コードの 縮退により変化し得るものであることは当業者の理解するところである。図１に 示すＡ、プリエーロニューモニア抗原をコードするすべてのＤＮＡ配列は、本発 明に包含される。さらに、このＤＮＡ配列がコードするポリペプチドの抗原性又 はアミノ酸配列をそれほど変化させないような対立変種がこのＤＮＡ配列に起こ り得ることも、当業者の理解するところである。これらの対立変種も本発明に包 含される。

本発明は、ａｐｐＣ及びａｐｐＡと指定される２種の異なる遺伝子を提供するも のである。これらの遺伝子はそれぞれ１５９個及び９５７個のアミノ酸からなる ポリペプチドをコートする。ａｐｐＡ！伝子は、溶血活性を持たないａｐｐＡ抗 原と呼ばれる蛋白質をコードする。Ａ、プリューロニューモニア溶血素の正常な 溶血活性には、ａｐｐＡ及びａｐｐＣ遺伝子の両者の発現が必要である。これら ２種の遺伝子により製造される蛋白質はａｐｐＣＡ抗原と呼ばれる。ａｔ）Ｉ） ＣＡ及びａｐｐＡ抗原はいずれも、天然のＡ４ブリ二−ロニューモニア溶血素に 対する抗体からの抗体応答を生じる。ａｐｐＡ及びａｐｐＣＡ抗原の両者を利用 して豚における免疫応答を引き出し、胸膜肺炎を予防することができることが期 待される。従って、ａｐｐＣＡ及びａｐｐＡ抗原の両者をコードするＤＮＡ配列 は、本発明に包含される。

さらに、図１に示す天然のＡ、プリューロニューモニア溶血素ポリペプチドに類 似し、且つ実質的に同一の溶血作用及び抗原性を有するアミノ酸配列が存在し得 ること、又はこれを構築し得ることに留意されたい。例えば、その作用特性を変 化させることなく、特定のペプチドの生物活性を増大し、又は減少させるような アミノ酸配列の変化を起こすことができることは、当業者の認識するところであ る。これらのペプチドをコードするＤＮＡ配列も本発明に包含される。

ａｐｐＡ及びａｐｐＣＡ抗原が、Ａ、ブリューロニューモニア溶血素に対して産 生じた天然抗体により認識され得る種々の抗原決定基（エピトープ）を有するこ とも当業者に自明のことである。これらの抗原決定基を単独で又はハプテンとし て使用して、豚における免疫応答を引き出し、胸膜肺炎に対して豚を保護するこ とができる。ハブテンを利用する方法の１つは、これをアルブミンのようなキャ リアーに結合することである。本発明はさらにＡ、ブリエーロニューモニア溶血 素の抗原決定基を含むアミノ酸配列をコードするすべてのＤＮＡ配列を包含する 。好ましい実施態様は、図１に示すようなアミノ酸配列、又はＡ、プリエーロニ ューモニア溶血素の抗原決定基を含む実質的に同一の配列をコードするＤＮＡ配 列である。

さらに本発明は、Ａ、ブリエーロニューモニアが天然に産生じない抗原性ポリペ プチドを提供するものである。上述のとおり、ａｐｐＡ遺伝子がコードするａｐ ｐＡ抗原は溶血性ではな（、Ａ、プリエーロニューモニアが天然に産生ずるもの ではない。

しかし、このａｐｐＡ抗原は免疫応答を引き出し、ワクチンとして使用すること ができる。従って、本発明は、ａｐｐＡ遺伝子がコートするａｐｐＡ抗原を包含 する。本発明の目的において、Ａ、ブリエーロニューモニア溶血素抗原という用 語は、Ａ、プリエーロニューモニア溶血素、ａｐｐＡ抗原、ａｐｐＣＡ抗原、及 びＡ、プリエーロニューモニア溶血素の抗原決定基を含む任意のアミノ酸配列を 包含する。

Ａ、プリエーロニューモニア溶血素の遺伝チは、種々の血清型味、又はアクチノ バチルス感染豚から単離された株から、Ａ、プリエーロニューモニアＤＮＡをま ず単離することによりクローン化される。例示のため、本発明者はＡ、プリエー ロニューモニア血清型５を使用した。血清型のうちこれがもっとも流行っており 、かつ最も毒性の強いものの１つである、という理由でこれが選ばれた。しかし 、豚の胸膜肺炎を引き起こすことができる実質的にいかなる株も使用することが できる。本発明では、Ａ、プリエーロニューモニア染色体ＤＮＡのゲノムライブ ラリーを作成することが好ましい。このようなライブラリーを作成する種々の方 法が知られており、この方法において種々の組換えベクターと制限酵素を使用す ることかできることは当業者に自明のことである。好ましくは、Ａ、プリエーロ ニューモニア染色体ＤＮＡの消化物を、標準的な方法によりバクテリオファージ ライブラリーにクローン化する。

血清型５の溶血素は、同定も配列分析もされていなかったので、この溶血素遺伝 子を単離し、選別する方法を開発しなければならなかった。多数のグラム陰性病 原菌が、大腸菌の溶血素と免疫学的に、かつ遺伝子的に関連する高分子量（１０ ５〜１１０ｋＤ）の細胞を溶解する毒物を分泌することがわかっていた（Ｃｈａ ｎｇ　ｅｔ　ａｌ、　、　ＦＥＭＳ　Ｌｅｔｔ、、　６０．１６９−１７４（１ ９８９）、及び’Ｋｏｒａｎａｋｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉ ｏｌ、　P６９゜ ］、５０９−１．５１５（１９８７））。Ａ、ブリエーロニューモニアか分泌し た溶血素がＲＴＸ細胞毒ファミリーの一員であるかどうかを決定するため、Ｐ、 ヘモリティカ、んプリエーロニューモニア及びｐｓＦ４０００を含む大腸菌の培 養物上清を、Ｐ、ヘモリティカのロイコトキシンに対して生じた抗血清を用いた ウェスタンブロッティングにより分析した。ロイコトキシンの見掛は分子量より 僅かに大きく、大腸菌の溶血素とほぼ同一の、Ｍｒ＝ＩＩＱ、０００の交差反応 性ポリペプチド種が検出された。

これは、Ａ、プリエーロニューモニア溶血素がＰ、ヘモリティカロイコトキシン と同一ファミリーにあることを示している。従って、Ｐ、ヘモリティカの１ｋｔ ｃＡ遺伝子の公表されている配列の一部をプローブとして使用し、目的のクロー ンを単離した。さらに本発明では、Ａ、プリエーロニューモニア溶血素に対する 抗体を調製し、バクテリオファージライブラリーの免疫スクリーニングに使用し た。これらのスクリーニング方法は標準的な方法により実施した。陽性を示した プラークをとり、再度スクリーニングを行い、増幅した。次いで選択されたファ ージ挿入物からの制限断片を、マクサム−ギルバート法、サンが−のジ−デオキ シ鎖末端法を初めとする種々の方法により配列分析を行った。

本発明において、抗体スクリーニングにより、単一の陽性クローンを同定したく 図２参照）。Ｐ、ヘモリティカ由来のＤＮＡプローブを用いた同じライブラリー のスクリーニングにより８個のクローンを同定した。これらは相互に重複し、抗 体スクリーニングにより単離されたクローンと重複した（図２参照）。本発明で クローン化したＤＮＡは、ａｐｐＡ抗原の全読み枠及びトキシン蛋白質を活性化 するより小さなａｐｐＣ蛋白質の読み枠を含む３．８　ｋｂの断片であった。こ れら２つの遺伝子は全体で、溶血活性を有する全ｆｌＯｋＤ　ａｐｐＣＡ抗原を コードするａｐｐＣＡ遺伝子である。ａｌ）ｐＣＡ領域のヌクレオチド配列並び にａｐｐＣ及びａｐｐＡ蛋白質の予想アミノ酸配列を表１に示す。

次に、ａｐｐＣＡ遺伝子を含むＤＮＡ断片を、プラスミドのような適当な組換え ベクター又はバクテリオファーンウイルスベクターにサブクローン化することが できる。当業者には、ｐＢＲ３２２，ｐＡＲ系列、　ｐＫＫ２２３−３及びｐＵ Ｒ系列のような多数のベクター、並びにこれらの組換えベクターを構築するため のさらに多数の方法があることは、明らかである。ベクター選択のパラメーター としては、使用する発現系の種類、及びＤＮＡ挿入物の大きさが挙げられる。ａ ｐｌ）ＣＡ遺伝子は細菌遺伝子であり、好ましい発現ベクターは細菌細胞である ので、好ましい組換えベクターは細菌ベクター、最も好ましくは細菌プラスミド である。本発明においては、バクテリオファージクローンｙｆｃ７及びｙｆｃ８ からａｐｐｃＡ領域をベクターｐＨＧ１６５にサブクローン化した。

次にこの組換えベクターを、選択した発現系に、その系に適した方法により導入 する。細菌発現系力体発明において最も商業的に実行可能なものであるが、真核 系も使用できる。適切な発現系の例としては、Ｅ、ｃｏｌｉ　ＪＭ１０３．　Ｅ 、ｃｏｌｉ　Ｃ６００゜Ｅ、ｃｏｌｉ　ＣＯ４及ｎ、ｃｏｌｉ　ＤＨ２０が挙げ られる。本発明に使用した発現系はＥ、ｃｏｌｉＴＢＩであった。

ａｐｐＣＡ遺伝子は、天然のＡ、プリエーロニューモニアプロモーターを使用し た組換え系で発現できるが、ａｐｐＣＡ遺伝子は適当な強いプロモーター及び／ 又は増幅遺伝子より下流に配置することが望ましい。プロモーター及び／又は増 幅の種類は組換えＤＮＡ及び発現系によって決められる。本発明において好まし いプロモーターはＩａｃ又はｔｒｙｐプロモーターのような強い細菌プロモータ ーである。使用可能な他のプロモーターの例としては、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ プロモーター及びｔａｃプロモーターが挙げられる。これは、かなり高濃度の抗 原を発現させる。上記ＤＮＡ配列を含む組換えベクター並びにＡ、プリエーロニ ューモニア抗原を製造するのに使用することができるこれらのＤＮＡ配列を含む 組換え細胞は本発明に包含される。

細胞は、抗原を産生ずるような条件下で培養される。多種の方法、培地及び誘発 条件があり、宿主株及び組換えプラスミドに応じて使用されることは当業者に明 らかなところである。次に、抗原を培養混合物から単離する。本発明では、ａｐ ｐＡ及びａｐｐＣＡ抗原が大腸菌宿主中で高濃度で発現するため、不溶性の封入 体を形成するものと思われる。この現象は多種の過剰生産された蛋白質により起 こることが知られている（Ｓｃｈｏｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈ ｎｏｌｏｇｙ　３：１５１−１５４（１９８５））。封入体の精製は比較的容易 である。例えば、細菌細胞を、超音波により、又はフレンチプレッシャーセルを 通して破砕する。次に封入体を遠心分離により集め、低濃度の尿素及びノニオン 性洗剤で抽出して混じっている細菌の破砕物を除去する。次に封入体を変性剤塩 酸グアニジンで可溶化し、希釈により塩酸グアニジン濃度を低くすることにより 、抗原を復元する。上記方法は、Ｅ、ｃｏｌｉが発現した蛋白質を精製する唯一 の標準的な方法である。この方法及びＡ、プリエーロニューモニア抗原を製造す る他の方法は本発明に包含される。

治療的に活性な量のＡ、プリエーロニューモニア抗原を適当なキャリアーと混合 してワクチンを調製する。多種の適切なキャリアーが存在し、このようなすべて の組成物が本発明に包含されることは当業者の理解するところである。好ましい 組成物は不完全アジュバント中、粗抗原０．５−１．０■を含む。Ａ、プリエー ロニューモニア抗原は精製された形態で、又は組成物の形態で豚に投与され、豚 を胸膜肺炎に対してワクチン予防する。

ａｐｐＣＡ遺伝子を含む好ましい組換えベクター、プラスミドｐＹＦＣ３７、は アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに１９８９年１０月１９８ｉこ 寄託され、受託番号６８１３５が与えられた。

細菌株、培地及び培養条件 んブリ二　〇−ニーモニア血清型５をＣ，Ｐｊｊｏａｎ、　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔ ｙ　ｏｆ　Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ。

Ｓｔ、　Ｐａｕｌより入手した。Ａ、プリエーロニューモニア培養物を、０．１ ％ＮＡＤを加えたブレーンハート浸出ブロス（ＢＨｌ、　Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂｏ ｒａｔｏｒｉｅｓ）で成育させた。すべての８．ｃｏｌｉ株の培養には、ＬＢ、 　Ｌｕｒｉａ　Ｂｒｏｔｈ　（Ｍｉｌｌｅｒ、　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｉｎ 　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒＧｅｎｅｔｉｃｓ、　ｐ、　４３３　（１９７２））を用 いた。バクテリオファージクローニングベクターラムダ−ダッシュはＳｔｒａｔ ｅｇｅｎｅ　（Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、　ＣＡ）から入手した。組換えバクテリオフ ァージライブラリーの最初の宿主はＰ２３９２．　Ｅ、ｃｏｌｉ株ＬＥ３９２の Ｐ２溶原菌であった。

一般的方法 以下に述べる方法は当業者が本発明を実施するのに充分な詳細を含んでいるもの と考えるが、市販されている技術マニュアル”Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉ ｎｇ”　（Ｍａｎｉａｔｉｓｅｔ　ａｌ、　、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａ ｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、 　Ｎｅｗ@Ｙｏｒｋ）が本 発明のある局面の実施をするのに使用する追加の詳細を提供することができる。

従って、このマニュアルは引用によりここに編入された。以下のクローニング系 は、んブリ二−ロニューモニア溶血素に関する知識の欠如を考慮して例示及び必 要のため本発明者が使用したものであり、そのヌクレオチド配列が開示されたの で実質的にいかなるクローニング系も使用できることが理解される。

豚の抗−Ａ、プリエーロニューモニア血清の調製Ｇｕｎｎａｒｓｓｏｎ　（Ａｍ 、　Ｊ、　Ｖｅｔ、　Ｒｅｓ、　４０．　ｐ、　１５６４　（１９７９））記載 の方法によりＡ、プリエーロニューモニアに対する抗血清を調製した。これらの ワクチン化豚の血清はＡ、ブリエー〇ニューモニア血清型５からの培養上清中の 溶血素を中和することがＡ、プリエーロニューモニアの５００　ｍｌ培養物を、 ０．１％　ＮＡＤを添加したＢＨＩ中で初期定常期まで成育させた。細胞を含ま ない培養物を、限外濾過により１０倍に濃縮し、溶血素蛋白質（約１■）を５倍 容の冷アセトンで沈澱させた。沈澱物を５ＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液中沸騰 により再溶解し、予備５ＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。１０５　ｋＤ溶血素バンドを 櫂酢酸ナトリウムにより可視化しくＨｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　 Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎＥｎｚｙｍｏｌ、　９１．　ｐ、　２２７　（１９８３） ）　、削り取り、溶血素蛋白質を電気泳動によりニトロセルロースに転写した（ Ｔｏｗｂｉｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ 、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　７６゜１）、　４３５０　（１，９７９））、転写後、ニド ｏ−ｔ＝ルｏ−ス片を、３％セラチンを含むＴＢＳＴ　（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ− ＨＣＩ、　ｐＨ７，５，１，５０ｒｒＭ　ＮａＣ１，０，０５％　Ｔｉｖｅｅｎ 　２０）中で、インキュベートした。次にこの片を粗抗−Ａ、プリエーロニュー モニア血清１００１を含む同じ緩衝液５ｍｌ中、室温で４時間インキュベートし 、ＴＢＳＴで４回洗浄し未結合抗体を除去した。特異的に結合した抗体は、０． １■／ｍｌの牛血清アルブミンを含む５ｍｌの０．１Ｍグリシン、ｐＨ２，５中 での５分間のインキュベーションにより溶出した。溶出液は１！／ｒｒｉｓ塩基 で直ちに中和した。

ラムダ−ダッシュにおけるＡ、プリエーロニューモニアＤＮＡのクローンバンク の！！ Ａ、ブリュ　Ｏ−ニーモニア染色体ＤＮＡを５ｉｌｈａｖｅｙ　ｅｔ　ａｌ、　 （Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｗｉｔｈＧｅｎｅ　Ｆｕｓｉｏｎ、　ｐ、　８９． 　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　（１９８４））により精製し、ＳＡ Ｄ　３Ａで部分消化した。消化したＤＮＡを１０−４０％ツユクロースグラジェ ントによる沈降分離により分画しくＭａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｏ１ ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　！ｌ１ａｎｕａ ｌA　ｐｐ。

２７５−２７７　（１９８２））　、アガロースゲル電気亦動により判定し、９ −２０ｋｂｐ断片を含む両分を集めアルコール沈澱により最終濃度１００μｇ／ ｍｌまで濃縮した。ラムダーダッンユをＢａｍＨＩで開裂しアルカリ性フォスフ ァターゼで処理して末端フォスフェートを除去した。フェノール抽出し、エタノ ール沈澱により濃縮した後、ベクターＤＮＡを大きさを選択したＡ、ブリエーロ ニューモニアＤＮＡとモル比ｌ：４で混合しＴ４ＤＮＡリガーゼで１５℃、１８ 時間処理した。結合したＤＮＡ混合物を市販のインビトロパッケージングキット （Ｇｉｇａｐａｃｋ　ｐｌｕｓ、　Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ 、　ＣＡ）を用いてラムダ粒子にパッケージした。ファーシカ価をＰ２３９２で 測定した。組換えファージをＰ２３９２でプレートストックとして増幅した。

このバクテリオファージライブラリーを、アフイニテイ精製した抗溶血素抗体を 用い、Ｐ、ヘモリティカ由来のＩｋｔＣＡ遺伝子を含むプローブを用いたノーイ ブリダイセーションによりスクリーニングした。抗体スクリーニングのため、こ のライブラリーを＋５０　Ｘ　１０　［１のプレートにプレート当たり５０００ プラークの密度で培養した。プラークをニトロセルロースに転写し、各フィルタ ーを標準的な方法を用いアフィニティ精製した抗体１ｍｌでプローブした（Ｈｕ ｙｎｈ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｉｎ　ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃ ａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ、　Ｖｏｌ、１．　ｐ、　４９．　Ｇｌｏｖｅｒ　Ｅｄ 、（１９８５））。陽性プラークを、アルカリフォスファターゼ結合したヤギ抗 −豚１ｇＧ　（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ　ａｎｄ　ＰｅｒｒｙＬａｂｏｒａｔｏｒ ｉｅｓ、　Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、　ＭＤ）第２抗体により同定し、基質、 ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）及び５−ブロモ−４−クロロ−３−イン ドリルフォスフニー　ト（ＢＣｒＰ）、で発色させた（Ｈａｗｋｅｓ　ｅｔ　ａ ｌ、、　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　１１９．　ｐ、　１４２（１９８Q ））。

ハイブリダイゼーションによるスクリーニングのため、１．ｋｔＣＡ遺伝子を含 むｐＹＦｃ１９　（Ｃｈａｎｇ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉａａｕｎ 、、　５５．　ｐ、　２３４８　（１９８７））由来のＤＮＡf 片をニック翻訳により”Ｐ−ｄＡＴＰ及び”Ｐ−ｄＣＴＰによりラベルした。次 いでフィルターを室温で、２　Ｘ　５ＳＣ−０，Ｉ％ＳＤＳで２回、０．２　Ｘ 　５ＳＣ−０，１％ＳＤＳで２回洗浄した。

いずれかの方法で陽性を示したプラークを取り出し、再度スクリーニングし、Ｐ ２３９２で増幅した。

５ＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロッティングＡｌｔｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、（ Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉａｌ、　１５５．　ｐ、　１１３０　（１９８３））記載 の方法により、５ＤＳ−ＰＡＧＥを行った。ウェスタンブロッティング分析（Ｔ ｏｗｂｉｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、 　ＵＳＡ　７６、４３５０−４３５４　（１９７９））により、上述のとおり（ Ｃｈａｎｇ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ、　５５．２３４８ −２３５４　（１９８７））　、免疫反応性蛋白質を検出した。第１抗体は牛抗 −ロイコトキンン（Ｃｈａｎｇ　ｅｔ　ａｌ、、Ｔｎｆｅｃｔ、　Ｉａｎｕｎ、 　５５．２３４８−２３５４　（１９８７））、又は豚抗−溶血素であった。豚 ■顧に対する第２抗体は、Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ　ａｎｄ　ＰｅｒｒｙＬａｂｏ ｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、　ＭＤから購入したアルカリ 性フォスファターゼコンシュケートであった。

バクテリオファージクローンが発現した蛋白質を分析するために、５ｍｌの溶菌 液を調製し、細菌不溶物を遠心分離により除去した。次に、きれいな上清を脱塩 し、クロロホルム−メタノール抽出により脱脂した（Ｗｅｓｓｅｌ　ｅｔ　ａｌ 、、　Ａｎａｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｉ、　１３８．　ｐ、　１４１．　（＋９８４））。変性蛋白質残 渣を遠心分離により集め、５Ｏ３−ＰＡＧＥサンプル緩衝液中沸騰させて溶解し た。ベクター、ラムダ−ダッシュを用いて同様にして対照溶菌液を調製した。Ｐ 、ヘモリティカ、んプリューロニューモニ乙及び完全なｈ＋ｙ決定基を発現する ｐＳＦ４０００を含むＥ、ｃｏｌｉ　（Ｆｅｌｍｌｅｅ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１６３．８８−９３　（１９８５））の細胞を含 まない培養物上清を、ロイコトキシン及び溶血素抗原のソースとした。

サザンブロツティング Ａ、ブリエーロニューモニアの染色体ＤＮＡを含む液を、Ｐｓｔ　Ｌ　Ｘｂａ　 １．又はＸｈ。

Ｉで消化し、０．７ｘアガロースゲルを用いて電気泳動を行い、ニトロセルロー ス膜に転写した（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、、　９８． 　ｐ、　５０３　（１９７５））。ハイブリダイゼーション用プローブは、バク テリオファージクローンｙｆｃ５　（図２）由来のａｐｐＣ及びａｐｐＡＪ伝子 の一部を含む１．６　ｋｂｐ　Ｘｂａ　Ｉ断片であった。このプロットを、３２ Ｐ標識したプローブを用い、４　ｘ　ＳＥＴ　（ｌｉｌａｓｏｎ　ａｎｄ　Ｗｉ ｌｌｉａｍｓ、　１９８５）及び５　Ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ　５ｏｌｕｔｉ ｏｎ　（変性子牛胸腺１００　ｇ／ｍｌ、ｐｏｌｙＡ　５０　ｇ／ｍｌ及びｐｏ ｌｙｃ　１０　ｇ／ｍｌを含む）中、６５℃で１２時間、ハイブリダイゼーショ ンを行った。フィルターを室温で４　Ｘ５ＥＴにより洗浄し、次に６５℃で、４ 　ｘＳＥＴ　、２　Ｘ５ＥＴ　、１　ｘＳＥＴ及び０．３ＸＳＥＴにより洗浄し た。

ＤＮＡ配列分析 ＤＮＡ配列分析を、ジ−デオキシ鎖末端法（Ｓａｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐ ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、、　７４．　ｐ、　５４６３　（１９７７））により行 った。バクテリオファージクローンｙｆｃ５及びｙｆｄ２のＡ、ブリ、：Ｌ　Ｏ ニューモニア挿入ＤＮＡから適当な領域をＭ１３ｍｐ１８又はＭ］３＋＋＋ｐ１ ．９の多重クローニング部位にサブクローニングし、一本鎖ファージＤＮＡを標 準法（Ｍｅｓｓｉｎｇ、　Ｉｎ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　１０１． 　ｐ、　２０．　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ（１９８３））により調製した 。配列分析反応には、３２Ｐ−ｄＡＴＰ　（８００Ｃｉ／ｍｏｌ、　Ｎｅｗ　Ｅ ｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ、　Ｂｏｓｔｏｎ、　ＭＡ）、Ｔ７　ＤＮＡポリ メラーゼ、及び市販の５ｅｑｕｅｎａｓｅキツト（Ｕｎｉｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ 　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、　Ｃ１ｅｖｅｌａｎｄ、　ＯＨ）を用いた。ＤＮ Ａ合成用のプライマーとしては、Ｉａｃユニバーサルプライマー又は既に配列分 析した領域に相補的な他のプライマーを使用した。後者は、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂ ｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　３８０Ａ　ＤＮＡ　５ｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ　（Ｆｏｓｔ ｅｒ　Ｃ１ｔｙ、　ＣＡ）で合成した。クローン化したＤＮＡの二本鎖の両方に ついて完全に配列分析を行った。このＤＮＡ配列は、ＰＣＧｅｎｅ　ＤＮＡ　ａ ｎｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｐｒｏｇｒａｍｓ　（ｒｎｔｅｌｌ ｉＧｅｎｅｔｉｃｓ　Ｃｒｏｐ、、　Ｍｏｕｎｔａｉｎ　Ｖｉｅｗ、　ＣＡ）を 用いてsっ た。

溶血素活性の検定 指示試料の一部を、０．２ｘヤギ赤血球のカルシウム−塩水懸濁液（１０ｔｒＭ 　ＣａＣｌ！。

０．８５Ｘ　ＮａＣ１１０ｒｒｊＡ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、　ｐＨ７，５）中、３ ７℃で１時間インキュベートした。

インキュベーションの最後に試料を５００ｇで１０分間遠心分離し、溶血の程度 を上清のＡ、４．により評価した。完全溶血に相当するＡ、４．値が、赤血球を Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００で溶菌することにより得られた。赤血球を除いた他は 同一の混合物についてバックグラウンド吸収を測定した。血清の中和については 、試料を、適当な血清５０μｌとともに室温で１時間予備インキュベートした。

１１０　ｋｍ原に対するアフィニティ精製した抗血清による抗体スクリーニング により、１４ｋｂの挿入物を有する１個の陽性クローンが同定された（図２）。

１ｋｔｃＡ座を有するプラスミド、Ｉ）ＹＦＣ１９（Ｃｈａｎｇ　ｅｔ　ａｌ、 　１９８７）由来のＤＮＡプローブを用いた同じライブラリーのスクリーニング により、８個のクローンが同定された（図２）。この８個のクローンは相互に重 複するとともに、免疫スクリーニングにより単離されたクローンとも重複した（ 図２）。これら９個のクローンは１個を除いてすべてが１１０　ｋＤポリペプチ ドを発現し、抗−Ａｐｐ溶血素抗体又は抗−ロイコトキシン抗体を用いたウェス タンブロッティングにより検出された。１個のクローン、ｙｆｃ５、は１１．Ｏ ｋＤポリペプチドの先端が切り取られた８０にの先端が切り取られたポリペプチ ドを産生じた。このクローンが先端が切り取られたトキシンを発現するという事 実により、クローン化ＤＮＡ内の推急ｐｐ座の位置及び向きがわかった（図２） 。ＤＮＡ配列分析により決定されたトキシン決定基に位置するＸｂａ　Ｉ断片を 用いたサザンブロツティング分析は、このクローニング操作中、検出可能な再配 置は起こらなかったことを示した。さらに、この分析は、この配列がＡ、プリエ ーロニューモニアゲノムにおける唯一のコピーであることを示した。

完全長の溶血素を産生ずる８個のクローンが同定されたという事実にもかかわら ずどのファーン溶菌液にも溶血活性は検出されなかった。

ａｐｐＣＡ遺伝子のＤＮＡ配列 切り取られたクローンが示す領域をＤＮＡ配列分析にかけた。３．８ｋｂ領域の 配列を図１に示す。トキシン読み枠に先行する１８．５ｋＤのポリペプチドをコ ードする１５９コドンの小さい０ＲＦ（読み枠）、おそら＜　ａｐｐＣ遺伝子と 、１０．５ｋＤのポリペプチドをコードする９５７コドンの大きいＯＲＦ　、お そら＜　ａｐｐＡＩＬ伝子がある（図１）。

このＤＮＡ配列を、ホモフジ−スコア法を用いてＥ、ｃｏｌｉプロモータ一様配 列についてスクリーニングした。ａｐｐＣに隣接して、ＴＡＴＡＡＴ共通プロモ ーター配列（−ＩＯ領領域に類似した３個の配列と、ＲＮＡポリメラーゼ結合部 位、ＴｒＧＡＣＡ　（Ｒｅｚｎｊｋｏｆｆ　ａｎｄ　Ｇｏｌｄ、　Ｉｎ　Ｍａｘ ｉｍｉｚｉｎｇ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｏｒｅｓｓｉｏｎ、　ｐ、　ｌ、　Ｂｏｓｔｏ ｎｉ　Ｂｕ狽狽■窒翌盾窒狽■ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ　（１９８６））に類似した２個の配列があった。ａｐ ｐＣ遺伝子は２つのメチオニン開始コドンを持ち、それぞれその上流に適当なＳ ｈｉｎｅ−Ｄａ１ｇａｒｎｏ配列が配置されている。簡単にするため、第１ＡＵ ＧコドンをａｐｐＣ遺伝子開始コドンとして選択した。ａｐｐＡの開始コドンの 上流のリポソーム結合部位（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａ１ｇａｒｎｏ配列）と、ａ、ｐｐ Ａの下流のＥ、ｃｏｌｉのρ非依存転写ターミネーターに極めて類似する配列も 観察された（図Ｉ）。このような潜在的終了配列はＥ、ｃｏｌｉとＰ、ヘモリテ ィカのそれぞれ溶血素及びロイコトキシンの類似位置に見出される（Ｌｏ　ｅｔ 　ａｌ、、　１９８７；　Ｈｉｇｈｌａｎｄｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８９； 　Ｗｅｌｃｈ　ａｎｄ　Ｐｅ１ｌｅｔ、　１９８８）。ａｐｐＡ蛋白質もそのカ ルボキン末端の近（に、９個のグリシンに富んだヘキサペプチドの繰り返しを含 んでいる。同様の繰り返しはＨ１ｙＡ＆Ｄ１．ｋｔＡ蛋白質にも見出され（Ｓｔ ｒａｔｈｄｅｅ　ａｎｄ　Ｌｏ、　Ｊ。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１７１．９１６−９２８　（１９８７））　、ＲＴＸ（ 繰り返しトキシン）指定のベースである（ＳｔｒａｔＭｅｅ　ａｎｄ　Ｌｏ、　 １９８９）。

溶血活性のＥ、ｃｏｌｉにおける発現 バクテリオファーツクローンｙｆｃ７とｙｆｃ８のａｐｐＡ領域（図２）をＥｃ ｏＲＩ−Ｘｈｏ　Ｉ断片としてベクターｐＨＧ１６５　（Ｓｔｅｍｒｔ　ｅｔ　 ａｌ、、　Ｐｌａｓｍｉｄ、　１５．　ｐ、　１７２　（１９８６））にサブク ローニングし、それぞれプラスミドｐＹＦＣ３８（ａｐｐＡ　）とＩ）ＹＦＣ３ ７（ａｐｌ）ＣＡ）を得た。これにより、ｐＹＦＣ３８のａｐｐＡ遺伝子かベク ターのＩａｃプロモーターの制御下に置かれた。ｐＹＦＣ３７のａｐｐＣＡ遺伝 子は、んプリエーロニューモニアプロモーターとベクターのｌａｃプロモーター から発現されると考えられる。これらのプラスミドをＥ、ｃｏｌｉ宿主、ＴＢＩ 、に形質転換し、形質転換体を初期定常期まで成育させ１１０　ｋＤ蛋白質の発 現と溶血活性を調べた。１１０　ｋＤ蛋白質は両クローンがら発現されたが、抗 原濃度はｐＹＦＣ３８を含む形質転換体の方がかなり高がった。しかし、溶血活 性は完全なａｐｐＣ遺伝子を含む構築物とのみ関連を持っていた。

この溶血活性は、んプリエーロニューモニアがら分泌された溶血素の場合と同様 に、豚抗−Ａｐｐ溶血素抗血清、又はＰ、ヘモリティカロイコトキシンに対して つくられたウサギ抗血清により中和することができた。

国際調査報告 ｂｍｍｍｅ＋ａ−＋ｉｅ＊””ＰＣＴ／ＵＳ９０１０６３５０１ｎｍｍ１ｗ＋を 横ＩＡｅｅ’１ｌｌ１６ｅＮａ、ＰＣＴ／ＵＳ９０１０６３５０

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. １．Ａ．プリューロニューモニア溶血素をコードするＤＮＡ配列を含む精製単離 されたＤＮＡ配列又はその対立変種。
2. ２．ＤＮＡ配列がさらに図１に示すａｐｐＣＡヌクレオチド配列を含むものとし て定義される請求の範囲１記載のＤＮＡ配列又はその対立変種。
3. ３．ヌクレオチド配列がさらに図１に示すａｐｐＣＡアミノ酸配列又はこのアミ ノ酸と実質的に同一の配列及び生物活性を有するポリペプチドをコードするもの として定義される請求の範囲１記載のＤＮＡ配列。
4. ４．ヌクレオチド配列かさらに図１に示すａｐｐＡアミノ酸配列又はこのアミノ 酸と実質的に同一の配列及び生物活性を有するポリペプチドをコードするものと して定義される請求の範囲１記載のＤＮＡ配列。
5. ５．ヌクレオチド配列がさらに図１に示すａｐｐＡヌクレオチド配列又はその対 立変種を含むものとして定義される請求の範囲１記載のＤＮＡ配列。
6. ６．Ａ．プリューロニューモニア溶血素の抗原決定基をコードする請求の範囲１ 記載のＤＮＡ配列。
7. ７．ＡＴＣＣ受託Ｎｏ．６８１３５に含まれる配列に生物学的に対応するＡ．プ リューロニューモニア抗原をコードする請求の範囲１記載のＤＮＡ配列。
8. ８．ＡｐｐＡ遺伝子又はその対立変種がコードするアミノ酸配列、又は実質的に 同じアミノ酸配列及び生物活性を有するポリペプチドを含むＡ．プリューロニュ ーモニア溶血素抗原。
9. ９．適当なキャリアー中に生物学的活性量のＡ．プリューロニューモニア溶血素 抗原を含む組成物。
10. １０．請求の範囲１、２、３、４、５、６又は７記載のＤＮＡ酸例を含む組換え ベクター。
11. １１．組換えベクターか総換えプラスミドである請求の範囲１０記載の組換えベ クタ。
12. １２．ＤＮＡ配列が強いプロモーター配列に機能的に結合している請求の範囲１ ０記載の組換えベクター。
13. １３．請求の範囲１、２、３、４、５、６又は７記載のＤＮＡ配列を含む組換え 細胞。
14. １４．組換え細胞が細菌である請求の範囲１３記載の組換え細胞。
15. １５．以下の工程を含むＡ．プリューロニューモニア溶血素抗原の製造方法：請 求の範囲１４記載の組換え細胞を提供する工程、該細胞が該抗原を産生するよう な条件下で該細胞を培養混合物として培養する工程、及び 培養混合物から抗原を単離する工程。
16. １６．生物学的活性量のＡ．プリューロニューモニア溶血素抗原を豚に導入する 工程を含む豚胸膜肺炎に対して豚をワクチン予防接種する方法。
17. １７．Ａ．プリューロニューモニア溶血素抗原がａｐｐＡ抗原である請求の範囲 １６記載の方法。
18. １８．Ａ．プリューロニューモニア溶血素抗原がａｐｐＣＡ抗原である請求の範 囲１６記載の方法。