FI107334B - Menetelmä rokotteen valmistamiseksi Lymen taudin estämiseksi - Google Patents
Menetelmä rokotteen valmistamiseksi Lymen taudin estämiseksi Download PDFInfo
- Publication number
- FI107334B FI107334B FI923175A FI923175A FI107334B FI 107334 B FI107334 B FI 107334B FI 923175 A FI923175 A FI 923175A FI 923175 A FI923175 A FI 923175A FI 107334 B FI107334 B FI 107334B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- protein
- burgdorferi
- polypeptide
- immunogen
- vaccine
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 61
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims description 30
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 13
- 208000016604 Lyme disease Diseases 0.000 title abstract description 30
- 230000002265 prevention Effects 0.000 title description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims abstract description 24
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims abstract description 15
- 241000589969 Borreliella burgdorferi Species 0.000 claims abstract description 11
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 52
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 52
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 51
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 15
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 14
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 14
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 7
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 claims description 7
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 6
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 4
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 4
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical group [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 2
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 claims description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 85
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 79
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 abstract description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 43
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 20
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 19
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 18
- 101150045801 ospA gene Proteins 0.000 description 18
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 18
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 17
- 241000700146 Gerbillus Species 0.000 description 16
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 14
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 13
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 13
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 13
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 12
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 11
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 11
- 101150107960 ospB gene Proteins 0.000 description 11
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 11
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 10
- 101150005926 Pc gene Proteins 0.000 description 9
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 9
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 8
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 8
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 8
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 7
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 7
- RLMISHABBKUNFO-WHFBIAKZSA-N Ala-Ala-Gly Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(O)=O RLMISHABBKUNFO-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 6
- 101710175625 Maltose/maltodextrin-binding periplasmic protein Proteins 0.000 description 6
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 241000589968 Borrelia Species 0.000 description 5
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 5
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 5
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 5
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 5
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 5
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 5
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 5
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 5
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 5
- 238000012872 hydroxylapatite chromatography Methods 0.000 description 5
- 238000001597 immobilized metal affinity chromatography Methods 0.000 description 5
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 5
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 5
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 5
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 5
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 4
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 4
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 4
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 4
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 description 4
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 description 4
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 description 4
- -1 aluminum compound Chemical class 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 4
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 4
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 4
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 4
- 210000003932 urinary bladder Anatomy 0.000 description 4
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 4
- 125000000022 2-aminoethyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])N([H])[H] 0.000 description 3
- 241000238876 Acari Species 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- 108700006640 OspA Proteins 0.000 description 3
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 3
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 3
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 3
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 3
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 3
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 description 3
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 description 3
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 3
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 3
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 3
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 3
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 3
- 210000001503 joint Anatomy 0.000 description 3
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 3
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 3
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 3
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 3
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 3
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 3
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 3
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000856 Amylose Polymers 0.000 description 2
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 241000589970 Spirochaetales Species 0.000 description 2
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 2
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 description 2
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 2
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 230000003302 anti-idiotype Effects 0.000 description 2
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 2
- 125000002057 carboxymethyl group Chemical group [H]OC(=O)C([H])([H])[*] 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 2
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 2
- 210000003495 flagella Anatomy 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 2
- 108010015792 glycyllysine Proteins 0.000 description 2
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 2
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 2
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N hexadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 108010064235 lysylglycine Proteins 0.000 description 2
- 108010054155 lysyllysine Proteins 0.000 description 2
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 2
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 231100000489 sensitizer Toxicity 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 2
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 2
- 208000007089 vaccinia Diseases 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- FXKNPWNXPQZLES-ZLUOBGJFSA-N Ala-Asn-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O FXKNPWNXPQZLES-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- VCSABYLVNWQYQE-UHFFFAOYSA-N Ala-Lys-Lys Natural products NCCCCC(NC(=O)C(N)C)C(=O)NC(CCCCN)C(O)=O VCSABYLVNWQYQE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SAHQGRZIQVEJPF-JXUBOQSCSA-N Ala-Thr-Lys Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN SAHQGRZIQVEJPF-JXUBOQSCSA-N 0.000 description 1
- RZVVKNIACROXRM-ZLUOBGJFSA-N Asn-Ala-Asp Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N RZVVKNIACROXRM-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- QQEWINYJRFBLNN-DLOVCJGASA-N Asn-Ala-Phe Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 QQEWINYJRFBLNN-DLOVCJGASA-N 0.000 description 1
- PCKRJVZAQZWNKM-WHFBIAKZSA-N Asn-Asn-Gly Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(O)=O PCKRJVZAQZWNKM-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- RAQMSGVCGSJKCL-FOHZUACHSA-N Asn-Gly-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O RAQMSGVCGSJKCL-FOHZUACHSA-N 0.000 description 1
- HPBNLFLSSQDFQW-WHFBIAKZSA-N Asn-Ser-Gly Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(O)=O HPBNLFLSSQDFQW-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- JBDLMLZNDRLDIX-HJGDQZAQSA-N Asn-Thr-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O JBDLMLZNDRLDIX-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 1
- PDECQIHABNQRHN-GUBZILKMSA-N Asp-Glu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O PDECQIHABNQRHN-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- DTNUIAJCPRMNBT-WHFBIAKZSA-N Asp-Gly-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O DTNUIAJCPRMNBT-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- WMLFFCRUSPNENW-ZLUOBGJFSA-N Asp-Ser-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O WMLFFCRUSPNENW-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- VNXQRBXEQXLERQ-CIUDSAMLSA-N Asp-Ser-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N VNXQRBXEQXLERQ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M Bisulfite Chemical compound OS([O-])=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 206010061591 Borrelia infection Diseases 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 101100377790 Caenorhabditis elegans aat-6 gene Proteins 0.000 description 1
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000483002 Euproctis similis Species 0.000 description 1
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 1
- 108010040721 Flagellin Proteins 0.000 description 1
- 210000000712 G cell Anatomy 0.000 description 1
- MXOODARRORARSU-ACZMJKKPSA-N Glu-Ala-Ser Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N MXOODARRORARSU-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- RDPOETHPAQEGDP-ACZMJKKPSA-N Glu-Asp-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O RDPOETHPAQEGDP-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- IVGJYOOGJLFKQE-AVGNSLFASA-N Glu-Leu-Lys Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N IVGJYOOGJLFKQE-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- GJBUAAAIZSRCDC-GVXVVHGQSA-N Glu-Leu-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O GJBUAAAIZSRCDC-GVXVVHGQSA-N 0.000 description 1
- BPLNJYHNAJVLRT-ACZMJKKPSA-N Glu-Ser-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O BPLNJYHNAJVLRT-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- YQAQQKPWFOBSMU-WDCWCFNPSA-N Glu-Thr-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O YQAQQKPWFOBSMU-WDCWCFNPSA-N 0.000 description 1
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 1
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 1
- MFVQGXGQRIXBPK-WDSKDSINSA-N Gly-Ala-Glu Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O MFVQGXGQRIXBPK-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- QIZJOTQTCAGKPU-KWQFWETISA-N Gly-Ala-Tyr Chemical compound [NH3+]CC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C([O-])=O)CC1=CC=C(O)C=C1 QIZJOTQTCAGKPU-KWQFWETISA-N 0.000 description 1
- IKAIKUBBJHFNBZ-LURJTMIESA-N Gly-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CN IKAIKUBBJHFNBZ-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- 241001481828 Glyptocephalus cynoglossus Species 0.000 description 1
- 101000985215 Homo sapiens 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase Proteins 0.000 description 1
- 101000780643 Homo sapiens Protein argonaute-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000854936 Homo sapiens Visual system homeobox 1 Proteins 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 241000880493 Leptailurus serval Species 0.000 description 1
- LESXFEZIFXFIQR-LURJTMIESA-N Leu-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O LESXFEZIFXFIQR-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- OXRLYTYUXAQTHP-YUMQZZPRSA-N Leu-Gly-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O OXRLYTYUXAQTHP-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- ZRHDPZAAWLXXIR-SRVKXCTJSA-N Leu-Lys-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O ZRHDPZAAWLXXIR-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- WXUOJXIGOPMDJM-SRVKXCTJSA-N Leu-Lys-Asn Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O WXUOJXIGOPMDJM-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- OVZLLFONXILPDZ-VOAKCMCISA-N Leu-Lys-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O OVZLLFONXILPDZ-VOAKCMCISA-N 0.000 description 1
- JVTYXRRFZCEPPK-RHYQMDGZSA-N Leu-Met-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N)O JVTYXRRFZCEPPK-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 1
- DRWMRVFCKKXHCH-BZSNNMDCSA-N Leu-Phe-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C([O-])=O)CC1=CC=CC=C1 DRWMRVFCKKXHCH-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- FZIJIFCXUCZHOL-CIUDSAMLSA-N Lys-Ala-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN FZIJIFCXUCZHOL-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- HQVDJTYKCMIWJP-YUMQZZPRSA-N Lys-Asn-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(O)=O HQVDJTYKCMIWJP-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- ULUQBUKAPDUKOC-GVXVVHGQSA-N Lys-Glu-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O ULUQBUKAPDUKOC-GVXVVHGQSA-N 0.000 description 1
- ISHNZELVUVPCHY-ZETCQYMHSA-N Lys-Gly-Gly Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)NCC(O)=O ISHNZELVUVPCHY-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- WRODMZBHNNPRLN-SRVKXCTJSA-N Lys-Leu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O WRODMZBHNNPRLN-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- AHFOKDZWPPGJAZ-SRVKXCTJSA-N Lys-Lys-Cys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N AHFOKDZWPPGJAZ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- YKBSXQFZWFXFIB-VOAKCMCISA-N Lys-Thr-Lys Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O YKBSXQFZWFXFIB-VOAKCMCISA-N 0.000 description 1
- 206010026749 Mania Diseases 0.000 description 1
- 241001676573 Minium Species 0.000 description 1
- YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-leucine Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 101710160107 Outer membrane protein A Proteins 0.000 description 1
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000021314 Palmitic acid Nutrition 0.000 description 1
- PTDAGKJHZBGDKD-OEAJRASXSA-N Phe-Thr-Lys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=CC=C1)N)O PTDAGKJHZBGDKD-OEAJRASXSA-N 0.000 description 1
- APKRGYLBSCWJJP-FXQIFTODSA-N Pro-Ala-Asp Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O APKRGYLBSCWJJP-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- AMBLXEMWFARNNQ-DCAQKATOSA-N Pro-Asn-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 AMBLXEMWFARNNQ-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 238000011579 SCID mouse model Methods 0.000 description 1
- HJEBZBMOTCQYDN-ACZMJKKPSA-N Ser-Glu-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O HJEBZBMOTCQYDN-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- VMLONWHIORGALA-SRVKXCTJSA-N Ser-Leu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H]([NH3+])CO VMLONWHIORGALA-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- YUJLIIRMIAGMCQ-CIUDSAMLSA-N Ser-Leu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YUJLIIRMIAGMCQ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- CRJZZXMAADSBBQ-SRVKXCTJSA-N Ser-Lys-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](N)CO CRJZZXMAADSBBQ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- SQHKXWODKJDZRC-LKXGYXEUSA-N Ser-Thr-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O SQHKXWODKJDZRC-LKXGYXEUSA-N 0.000 description 1
- NADLKBTYNKUJEP-KATARQTJSA-N Ser-Thr-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O NADLKBTYNKUJEP-KATARQTJSA-N 0.000 description 1
- PMTWIUBUQRGCSB-FXQIFTODSA-N Ser-Val-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O PMTWIUBUQRGCSB-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- MFEBUIFJVPNZLO-OLHMAJIHSA-N Thr-Asp-Asn Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O MFEBUIFJVPNZLO-OLHMAJIHSA-N 0.000 description 1
- OHAJHDJOCKKJLV-LKXGYXEUSA-N Thr-Asp-Ser Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O OHAJHDJOCKKJLV-LKXGYXEUSA-N 0.000 description 1
- HJOSVGCWOTYJFG-WDCWCFNPSA-N Thr-Glu-Lys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N)O HJOSVGCWOTYJFG-WDCWCFNPSA-N 0.000 description 1
- GFRIEEKFXOVPIR-RHYQMDGZSA-N Thr-Pro-Lys Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O GFRIEEKFXOVPIR-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 1
- VUXIQSUQQYNLJP-XAVMHZPKSA-N Thr-Ser-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N)O VUXIQSUQQYNLJP-XAVMHZPKSA-N 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YFOCMOVJBQDBCE-NRPADANISA-N Val-Ala-Glu Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N YFOCMOVJBQDBCE-NRPADANISA-N 0.000 description 1
- IJGPOONOTBNTFS-GVXVVHGQSA-N Val-Lys-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O IJGPOONOTBNTFS-GVXVVHGQSA-N 0.000 description 1
- PZTZYZUTCPZWJH-FXQIFTODSA-N Val-Ser-Ser Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N PZTZYZUTCPZWJH-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N [CH2]CN(CC)CC Chemical group [CH2]CN(CC)CC MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000004523 agglutinating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002009 allergenic effect Effects 0.000 description 1
- KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N alpha-L-glutamyl-L-glutamic acid Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003208 anti-thyroid effect Effects 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 229940043671 antithyroid preparations Drugs 0.000 description 1
- 108010010430 asparagine-proline-alanine Proteins 0.000 description 1
- 108010038633 aspartylglutamate Proteins 0.000 description 1
- 108010092854 aspartyllysine Proteins 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000007434 bsk-medium Substances 0.000 description 1
- AIXAANGOTKPUOY-UHFFFAOYSA-N carbachol Chemical compound [Cl-].C[N+](C)(C)CCOC(N)=O AIXAANGOTKPUOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 1
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 230000006957 competitive inhibition Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001446 dark-field microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 230000002939 deleterious effect Effects 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 150000002009 diols Chemical class 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 235000019634 flavors Nutrition 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 108010080575 glutamyl-aspartyl-alanine Proteins 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 108060003552 hemocyanin Proteins 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010040030 histidinoalanine Proteins 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M hydroxide Chemical compound [OH-] XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 230000004957 immunoregulator effect Effects 0.000 description 1
- 229960003444 immunosuppressant agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 description 1
- 108010030727 lens intermediate filament proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 238000011866 long-term treatment Methods 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 108010025153 lysyl-alanyl-alanine Proteins 0.000 description 1
- 108010009298 lysylglutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 101150106875 malE gene Proteins 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N n-Pentadecanoic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)=O WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004789 organ system Anatomy 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 229940099789 ospa protein Drugs 0.000 description 1
- 229910052763 palladium Inorganic materials 0.000 description 1
- KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N palladium Substances [Pd] KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 102000014187 peptide receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010011903 peptide receptors Proteins 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 239000003223 protective agent Substances 0.000 description 1
- 229960000856 protein c Drugs 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003906 pulsed field gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 210000000664 rectum Anatomy 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 230000001932 seasonal effect Effects 0.000 description 1
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 229930188929 simonin Natural products 0.000 description 1
- ZEDAGFBWUVYFQU-UHFFFAOYSA-M sodium;3-morpholin-4-ylpropane-1-sulfonate;hydrate Chemical compound [OH-].[Na+].OS(=O)(=O)CCCN1CCOCC1 ZEDAGFBWUVYFQU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000005476 soldering Methods 0.000 description 1
- 239000002195 soluble material Substances 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 238000000856 sucrose gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 210000001179 synovial fluid Anatomy 0.000 description 1
- 235000013616 tea Nutrition 0.000 description 1
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 1
- 150000003536 tetrazoles Chemical class 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001005 tuberculin Drugs 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 108010073969 valyllysine Proteins 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/20—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Spirochaetales (O), e.g. Treponema, Leptospira
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/82—Proteins from microorganisms
- Y10S530/825—Bacteria
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Public Health (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
Description
'N
107334
Menetelmä rokotteen valmistamiseksi Lymen taudin estämiseksi
Esillä oleva keksintö koskee menetelmää rokotteen 5 valmistamiseksi Lymen borrelioosia vastaan. Rokotetta voi daan käyttää Lymen taudin kehittymisen hidastamiseksi tai estämiseksi.
Ilmaisut "Lymen tauti" ja "Lymen borreliosis" merkitsevät yleisesti punkin kantamia tartuntoja, jotka ai-10 heuttaa spirokeetta Borrelia burgdorferi ja jotka ovat yleisimpiä punkin välittämiä sairauksia sekä Yhdysvalloissa että Euroopassa. Lymen tauti muistuttaa kuppaa, koska ne vaikuttaa moniin elimiin, tavallisimmin ihoon, hermostoon, sydämeen ja niveliin, ja koska se kehittyy vaiheissa 15 ja voi muuttua krooniseksi.
Koska Lymen tauti voi muistuttaa muita sairauksia, tarvitaan tarkkoja diagnostisia työvälineitä, etenkin vaikeissa tapauksissa, joissa kliininen kuva ei ole sitova.
Tarvitaan myös menetelmiä sairauden hoitamiseksi tai estä-20 miseksi. Antibioottiterapia saattaa olla tehokas, jos se aloitetaan pian tartunnan jälkeen, mutta pitkäaikainen hoito suurilla annostuksilla on välttämätön taudin jo . edettyä. Niinikään antibioottiterapia ei aina ole menes- tyksekäs. Katso Preac Mursic et ai. , Infection 18 (1990) • " 25 332 - 341. Täten rokote Lymen taudin estämiseksi on toi- « vottava.
·· · • V Useita EL. burgdorferi -antigeenejä tunnetaan. Kahta tärkeätä B^_ burgdorferi -ulkopintaproteiinia, ospA (31 kD:tä) ja ospB (34 kD:tä) , kuvaa Barbour, Clin.Microbiol. -30 Revs. 1. (1988) 399 - 414. OspA:ta esiintyy useimmissa kan- ·'....: noissa mutta se on heterogeeninen, toisin sanoen ospA-pro- • · ,···^ teiinit eri kannoista voivat poiketa toisistaan molekyyli- « painoltaan sekä serologiselta reaktiivisuudeltaan.
OspB ei esiinny kannoissa niin laajalti kuin ospA, 35 mutta kuten ospA se esiintyy erilaisissa serologisissa 1 « · • · - ................
107384!
2 I
muodoissa ja molekyylipainomuodoissa. Plasmidin kooditta - ; mat ospA- ja ospB-geenit on kloonattu, sekventoitu ja ij - ! mennetty Eh_ colissa. Katso Barbour et ai. , Rev. Inf .Di.e . ’ 11:6 (1989) S1470 - 1474; Bergström et. ai. . Mol. Microbiol . ; 5 3 (1989) 479 - 486.
B. burgdorf erin pC-proteiini (24 kD:tä) on sanul.r - ; kaltainen kuin ospA ja ospB joissain suhteissa. Myös se en : lipoproteiini ja osoittaa heterogeenisyyttä molekyylipcii - : nossa ja serologisissa ominaisuuksissa sekä on paljaina ; 10 solupinnalla (se on käytettävissä solupinnalla agglutinoij - i van vasta-aineen sitomiseksi ja soluliitteinen pC tulee ; herkästi pilkotuksi proteaasien vaikutuksesta) . pC-prot(.e - : iinin ilmentävät kannat ovat tavallisia Euroopassa. 40 $ - ; 50 % 28 eurooppalaisesta isolaatista, jotka Wilske et aj^., i 15 N.Y.Acad.Sei. 539 (1988) 126 - 143, testasivat, oli pos: - j tiivisia pC-proteiinin suhteen, joskin tämä saattaa olla : aliarvio, koska pC-ilmennys vaihtelee.
Muita B_;_ burgdorferi -antigeenejä ovat 60 kl>:n ; alueella esiintyvä ulkopintaproteiini, Barbour et a1^., 20 supra; flagellarakenneproteiini 41 kD:n alueella, Gassne n | et ai., Nucleic Acids Res. 17 (1989) 3590; 39 kD:n alueen : proteiini, Simpson et ai., J.Clin.Microb. 28 (1990) 1329 - i , 1337; ja noin 94 kD:n proteiini, Fuchs et ai. , "4th Inter- ; ; national Conference on Lyme Borreliosis", 1990.
; " 25 Erilaisia puhdistusmenetelmiä on käytetty antigese - * 1 nien valmistamiseksi jatkotutkimuksiin ja -karakterisoin- ! * 1 1 • V tiin tässä yhteydessä. Esimerkiksi Wilske et ai. , Zb].. -
Bakt.Hyq. 263 (1986) 92 - 102, kohdistivat kokonaisiin :1·1; Borrelia-soluihin SDS-PAGE-ohjelman, jossa proteiinit de- ; 30 naturoitiin lämmöllä ja altistamalla detergentille ne.t - ; riumdodesyylisulfaatti (SDS) ja 2-merkaptoetanolille . I Hansen et ai. , J.Clin.Microbiol. 26:2 (1988) 338 - 34 6 , j julkistivat B^_ burgdorferi -flagellan puhdistuksen. VK - | • lm ’ patenttihakemusjulkaisussa nro 90/04411, Bergström et aJU., j • · · « « · • « · » « : ; 107334 3 selostetaan ei-denaturoiva menetelmä Borrelia burgdorferi -fraktioiden osittaiseksi puhdistamiseksi.
Tutkimuksia on myös kohdistettu erilaisten antigeenien valmistukseen ja karakterisointiin diagnostisten tes-5 tien kehittämistarkoituksessa. Täten diagnostinen menette ly B_;_ burgdorferin epäsuoraksi toteamiseksi määrittämällä spesifinen vasta-ainetuotanto vasteena tartuntaan julkistetaan edellä mainitussa Bergströmin et ai. patenttihake-musjulkaisussa sekä US-patentissa 5470712 (Simpson ja 10 Schwan).
Coleman et ai., J. Infect.Dis. 155 (1987) 756 - 765, julkistavat niinikään B^. burgdorferi -fraktioiden tuotannon käsittelemällä kokonaisia spirokeettoja denaturoivalla SDS-detergentillä protoplasmasylinteri- (bakteeri, josta 15 on poistettu proteiinikuori) fraktion saamiseksi, jota jatkokäsittelyn jälkeen voidaan käyttää antigeeninä.
Wilske et ai., "4th International Conference on Lyme Borreliosis", 1990, raportoivat identifioineensa im-muunidominantteja Borrelia-proteiineja, joiden sanotaan 20 olevan käyttökelpoisia Lymen borreliosisin diagnostisoi miseksi. Nämä tutkijat päättelevät, että kaksi proteiinia, pC ja plOO, saattaa olla erityisen merkityksellistä siinä mielessä, että ne antavat osoituksen sairauden varhaisista : ja vastaavasti myöhäisistä vaiheista.
*’ 25 Vaikka tunnetaan erilaisia antigeenejä, suojatehoa « ei voida ennustaa antigeenin kyvystä synnyttää immuunivas- • · · • te luonnollisen tai kokeellisen tartunnan puitteissa. Esi-merkiksi 41 kD:n flagellaproteiini indusoi immuunivasteen, ·’·1; mutta ei suojaa. Katso Simon et ai. . Immunology Today 12 30 (1991) 11 - 16. 94 kD:n proteiini samoin ei pysty antamaan ; suojaa kuten raportoidaan jäljempänä esimerkissä 3. Itse • · #... asiassa hakijat ovat havainneet, että suojaavat antigeenit « ovat suhteellisen harvinaisia. Siten suuri osa immuunivas- ..]1 teestä kohdistuu antigeeneihin, jotka eivät ole oleellisia 35 suojaukselle, jolloin päin vastoin jotkut mahdollisesti « « « · · 411 4 · • · · / .............. “ ~ i j 10733k ; 4 suojaavat antigeenit eivät ehkä kykene synnyttämään rilt - ; tävää immuunivastetta. Täten käyttökelpoisuutta rokote- I ainesosana ei voida päätellä antigeenin kyvystä synnyttää ; vasta-ainevaste.
5 Tämän vuoksi on olemassa tarve jatkaa tutkimuks: a i sopivan rokotteen kehittämiseksi Lymen borreliosisia v;i£ - ; taan. Kiinnostava tässä suhteessa on US-patenttijulka:.£ u : nro 4 721 617 (Johnson) , jossa julkistetaan Lymen horre- : liosisia vastaan rokote, joka käsittää kokonaisia B^_ bujrcy. ; 10 dorferi -soluja, jotka on inaktivoitu kylmäkuivaamai;(.c .
Nojautuen taudinaiheuttajan talteenottoon munuaisesta ttc.i ; pernasta Johnson osoittaa annoksesta riippuvaisen vähei- j nyksen immunoitujen hamsterien alttiudessa saada virulei -tin EL. burgdorferi -kannan aiheuttama tartunta. Vaikutti s 15 oli kuitenkin lyhytaikainen ja eläimet, joille annettiin herkiste 90 päivän kuluttua rokottamisesta, olivat epätl.y-dellisesti suojattuja.
EP-patenttihakemusjulkaisussa nro 418 827 (Simon ep. ai.) kuvataan rokotetta vastaan burgdorferiä. etenkin | 20 kantoja B31 tai ZS7, joka rokote käsittää monoklonaalisia : vasta-aineita, jotka tunnistavat 31 kD:n ospA-proteiinir. Simonin et ai. edellä mainitun EP-patenttihakemus julkaisit n , mukaan SCID-hiirten passiivinen immunointi näillä vasta- 1 aineilla inhiboi Borrelia-indusoitujen oireiden kehityk- ί : " 25 sen. (Suoja määritellään tartunnan sekä niveltulehduksen ·*** kehityksen vastustuksena.) Tässä EP-patenttihakemusjt|l- \
·*·* I
• kaisussa julkistetaan myös yhdistelmä-DNA-S-galaktosida|a|- : si/ospA-fuusioproteiinin ilmennys EL. colissa. Julkistetut ; monoklonaaliset vasta-aineet synnytetään immunoimalla ke- ; 30 konaisten bakteerien soluproteiineilla tai yhdistelmä-DN,A- ; antigeeniproteiineilla.
• · .···. Fikrig et ai. . Science 250 (1990) 553 - 556, doku- l mentoivat hiirten (C3H/HeJ) passiivisen suojauksen tapet- : tujen IL. burgdorferi -solujen tai ospA:n ilmentävän j
:..y 35 colin vastaisella polyklonaalisella seerumilla, tai osp.A: - I
• · • · · • · i ! ! ] 5 107334 lie spesifisellä monoklonaalisella vasta-aineella. Tutkijat osoittavat myös, että hiiret tulivat aktiivisesti suojatuiksi immunoimalla puhdistetulla yhdistelmä-DNA-os-pA/glutationi-S-transferaasifuusioproteiinilla. Suojaus 5 mitattiin immunogeenin kykynä estää tartunta tai poistaa sairauden histopatologiset ilmentymät.
Bergström et ai. (WO 90/04411) esittävät myös mahdollisuuden, että immunogeenisesti aktiivisia burgdorferi -fraktioita voitaisiin käyttää rokotteina. Mitään 10 tietoja ei kuitenkaan esitetä julkistettujen fraktioiden joko immunogeenisyyden tai suojatehon osoittamiseksi.
Tämän vuoksi esillä olevan keksinnön päämääränä on antaa käyttöön menetelmä tehokkaan rokotteen valmistamiseksi Lymen tautia vastaan nisäkkäissä. Keksinnön mukai-15 selle menetelmälle on tunnusomaista se, mitä patenttivaa timuksessa 1 esitetään.
Tässä kuvataan myös ei-denaturoiva menetelmä B. burgdorferi -proteiinien puhdistamiseksi, sekä diagnostinen aine ja sitä käyttävä menetelmä B_^ burgdorferi -vasta-20 aineen läsnäolon ruumiinnesteessä toteamiseksi.
Edelleen esitetään immunogeeni, joka käsittää (a) määrän materiaalia, joka valitaan ryhmästä, jonka muodostavat B_;_ burgdorferi -pC:n yksi tai useampi serologinen ;;· : muoto homogeenisessa muodossa, pC-variantti ja pC-mimeet- • " 25 ti, jolloin materiaali muistuttaa rakenteeltaan riittäväs- « * · ti natiivia pC:tä indusoidakseen suojäävien vasta-aineiden ·· ♦ • V tuotannon, ja (b) fysiologisesti hyväksyttävän täyteaineen sille, jolloin immunogeenia on läsnä riittävä määrä syn- ♦*·*: nyttämään immuunivasteen, joka suojaa altistuvaa nisäkästä • 30 Lymen borreliosisilta. Edullisessa suoritusmuodossa im- munogeeni käsittää lisäksi apuaineen, kuten aluminiumhyd- • · ··. roksidia.
• «
Altistuvan nisäkkään immunoimiseksi Lymen borre- liosisia vastaan nisäkkäälle annetaan immunologisesti te- 35 hokas määrä edellä kuvatun mukaista immunogeenia.
« ·
- j I
} 1073:11 6
Edelleen esitetään tutkimuksissa käytetty menetelmä B. burgdorferi -proteiinien puhdistamiseksi, jolloin meilu telmän vaiheina (a) B^_ burgdorferi -solu rikotaan ja Rikottu solu fraktioidaan membraani- ja solulimaosiin; (b) I 5 membraaniosa uudelleenlietetään ei-denaturoivaan det^r- genttiin, jolloin saadaan liukoiseksi tehty proteiini ; a ; liukenematonta materiaalia, minkä jälkeen mainittu liukoiseksi tehty proteiini erotetaan mainitusta liukenematto- i masta materiaalista; (c) liukoiseksi tehdyllä proteiinilla i 10 suoritetaan ioninvaihtokromatografia proteiinifraktioide:n i tuottamiseksi; ja (d) proteiinifraktiot määritetään niiden ; fraktioiden tunnistamiseksi, jotka sisältävät kiinnostavia : proteiineja. Tämän menetelmän vaihetta (d) saattaa seurata i joko hydroksyyliapatiittikromatografia ja/tai immobilisoi- : 15 tu metalli -affiniteettikromatografia kiinnostavien prote iinien konsentroimiseksi ja edelleen puhdistamiseksi.
Kuvaukseen kuuluu vielä diagnostinen aine Ed. burc - i dorferi -vasta-aineiden toteamiseksi näytteestä, jolloin : mainittu aine käsittää Ed. burgdorferi -proteiinia, joka en 20 tuotettu edeltävälläpuhdistusmenetelmällä. Ainetta voidaen |
käyttää menetelmässä Ed. burgdorferi -vasta-aineiden läsnl-olon toteamiseksi näytteestä, jolloin menetelmän mukcic n I , näytettä inkuboidaan edeltävällä diagnostisella aineella I
1" 1 ja todetaan inkuboinnista saadun sitoutuneen vasta-aineen ; < " 25 läsnäolo. j
• Kuvio 1 on valokuva, joka esittää tuloksia elektre - I
* · · • V foreettisesta analyysistä antigeeneistä, jotka on puhdas - ! • o tettu Orth-l:stä käyttäen tässä kuvattuja menetelmiä, j
Kuvio 2 on valokuva, joka esittää SDS-PAGE:ea Bj. ; • — 30 burgdorferi -soluista, joita on inkuboitu trypsiinillä (vyöhykkeet 2, 6 ja 10), proteinaasi-K: 11a (vyöhykkeet 3, i • « #·... 7 ja 11) tai ilman proteaaseja (vyöhykkeet 1, 5 ja S) \
'1* verrattuna puhdistettuun pC-proteiiniin (vyöhykkeet 4 ja I
• ? 8). Elektroforeettisesti erotetut proteiinit karakteri - j * * * j •‘,./ 35 soitiin kultavärjäyksellä kultavärillä (vyöhykkeet 1-4), j • » i 'j : : : il « * » « ,j \ • · · 3
• · | I
I ! 7 107334
Western blot -analyysillä käyttäen pC-spesifistä monoklo-naalista vasta-ainetta (Mab35, vyöhykkeet 5 - 8) ja lipo-proteiinit fluorografisesti (3H-palmitiinihappoleimaus, vyöhykkeet 9 - 11).
5 Vaikka useita erilaisia EL. burgdorferi -antigeenejä on identifioitu ja karakterisoitu vaihtelevissa määrin, pC-proteiinia ei ole aiemmin tunnistettu suoja-aineeksi Lymen tautia vastaan. Avainnäkökohta tässä havainnossa oli toteamus, että optimaalisen suojatehon saamiseksi olisi 10 välttämätöntä säilyttää pC-proteiinin konformaatio niin lähellä alkuperäistä kuin mahdollista. Tämän vuoksi kehitettiin uusi menetelmä homogeenisen pC-proteiinin tuottamiseksi, joka menetelmä jättää proteiinin natiivin konfiguraation oleellisesti muuttumattomaksi, jolloin pC:tä 15 voidaan käyttää immunogeenina Lymen borreliosisia vastaan.
Tämä ei-denaturoiva puhdistusmenetelmä soveltuu Borrelia-antigeenien tuotantoon käytettäviksi Lymen taudin toteamisessa .
Ei-denaturoidun pC-proteiinin suojavaikutus osoi-2 0 tetaan helposti GerbiUus-jyrsiiässä, jota ei ole tähän mennessä tunnistettu ylivertaiseksi eläinmalliksi tietyn antigeenin, kuten pC:n, tehon arvioimiseksi Lymen taudin . vastaisten suojaavien vasta-aineiden tuotannossa. Kuiten- ;;· · kin on todettu, että Gerbillus-ivrsiiä soveltuu erityisen 4 4 • ** 25 hyvin tällaisiin arviointeihin osittain, koska borreliosis «
Gerbillus-jyrsijässä jäljittelee tätä sairautta ihmisessä ·· · • V useissa tärkeissä näkökohdissa. Täten sekä Gerbillus-jyr- : sijässä että ihmisessä • · (l) tartunta on multisysteeminen vaikuttaen moniin m 30 erilaisiin elimiin, kuten ihoon, niveliin, hermostoon, pernaan, sydämeen, rakkoon ja munuaiseen; • ♦ ... (2) tauti voi olla krooninen; B. burgdorferi on * « “ - otettu talteen Gerbillus-jyrsijästä yli vuoden kuluttua herkisteestä; 4 4 4 • 4 4 4 1 • 4 4 « · • · 107334 8 (3) niveltulehdusta muistuttava nivelten turpoami- ; nen voi kehittyä, sekä Gerbillus-ivrsiiassa että ihmisessä ; ja (4) nesteimmuunivaste on samankaltainen vasteen ; 5 spesifisyyteen ja ajalliseen kehitykseen nähden; esimen- j kiksi on todettu, että tartunnan saaneet Gerbillus-ivrsi -jät sekä ihmiset tuottavat vähäisen immunologisen vasteen, j jos tuottavat sitä laisinkaan, ospA- ja ospB-proteiine.il- ; le. Itse asiassa vastoin kuin hiirissä ospA- ja ospB-vas-10 ta-aineet ovat harvinaisia Gerbillus-ivrsiiässä sekä ihmi sessä.
Rokote
Esillä oleva keksintö kohdistuu menetelmään rokotteen valmistamiseksi Lymen borreliosisia vastaan, jossa ' 15 rokotteessa immunogeeni käsittää B^_ burgdorferi -pC-prote- iinin. pC-proteiini on solupinta-antigeeni, minkä osoittaa I sen tuleminen proteolyyttisesti pilkotuksi ehyistä Jb^ : burgdorferi -soluista. Sille on edelleen karakteristinei molekyylipaino noin 24 kD:tä, joskin eri kannoista peräi-20 sin olevat pC-proteiinit voivat osoittaa heterogeenisyyttä molekyylipainossa ja serologisissa ominaisuuksissa. Käyn - i tämällä tavanomaista hybridoomametodologiaa on valmistetiu , 11 monoklonaalista vasta-ainetta (Β^_ burgdorferi -monb i I I j
‘ klonaalivasta-aineet 22, 28, 29, 34 - 39 mukaan lukien I
• ** 25 rajanumerot, 42 ja 45), jotka sitoutuvat pCrhen Bj_ burn · * e dorferi -kannasta Orth-1 ja useista muista kannoista.
* * * '] • V Lisäksi suoj atutkimuksissa käytetyn B^ burgdorfe:r:. j * * j ί#*.ί -pC-proteiinin täydellinen DNA-sekvenssi ja siitä päätelty i
;*·*; aminohapposekvenssi ovat seuraavat: I
·ί··; j ·***: ! t « · i| : I 1 « t » j • · \ i : i • * '! * ’ li 3 ; \ 1 j : j ] i t j 107334 9 I Met Lvs Lvs Asn Thr Leu Ser Ala He Leu Met Thr Leu Phe Leu Phe lie Ser Cvs Asn 2 1 ATG AAA AAG AAT ACA TTA AGT GCG ΑΤΑ TTA ATG ACT TTA TTT TTA TTT ATA TCT TGT AAT 6 b 21 Asn Ser Gly Lys Gly Gly Asp Ser Ala Ser Thr Asn Pro Ala Asp Glu Ser Ala Lys Gly 4 61 AAT TCA OGO AAA GGT GGA GAT TCT GCA TCT ACT AAT CCT GCT GAC GAG TCT GCG AAA GGA 12
41 Pro Asn Leu Thr Glu He Ser Lys Lys He Thr Asp Ser Asn Ala Phe Vai Leu Ala Val 6 121 CCT AAT CTT ACA GAA ATA AGC AAA AAA ATT ACA GAT TCT AAT GCA TTT GTA CTG GCT GTT IS
IQ 61 Lys Glu Val Glu Thr Leu Val Ser Ser lie Asp Glu Leu Ala Thr Lys Ala He Gly Lys 8 IS1 AAA GAA GTT GAG ACT TTG GTT TCA TCT ATA GAT GAA CTT GCT ACT AAA GCT ATT GGT AAA 24 81 Lys He Gin Gin Asn Asn Gly Leu Gly Ala Asn Ala Asp Lys Asn Gly Ser Leu Leu Ala 10 241 AAA ATA CAA CAA AAT AAT GGT TTA OGC GCC AAT GCG GAT AAA AAC GGA TCA TTG TTA GCA .30 101 Gly Ala Tyr Ala He Ser Thr Leu lie Thr Glu Lys Leu Lys Ala Leu Lys Asn Ser Gly 12 301 GGA GCT TAT GCA ATA TCA ACC CTA ATA ACA GAA AAA TTA A\G GCA TTG AAA .AAT TCA GGA 36 15 121 Glu Leu Lys Ala Lys lie Glu Asp Ala Lys Lys Cys Ser Glu Asp Phe Thr Lys Lys Leu 14 361 GAA TTA AAG GCA AAA ATT GAA GAT GCT AAG AAA TGT TCT GAA GAT ΤΤΓ ACT AAA AAA CTA 42 141 Ala Ala Gly His Ala Gin Leu Gly He Asp Gly Ala Thr Asp Asn Asp Ser Lys Glu Ala 16 421 GCT GCT GGO CAT GCA CAG CTT GGT ATA GAC GGA GCT ACT GAT AAT GAT TCA AAA GAA GCA 48 161 lie Leu Lys Thr Asn Gly Thr Lys Thr Lys Gly Ala Glu Glu Leu Val Lys Leu Ser Glu 18 2 0 481 ATT ™ AAA ACA AAT GGG ACT AAA ACT AAG GGT GCT GAA GAA CTT GTA AAG TTA TCT GAA 34 181 Ser Val Ala Ser Leu Ser Lys Ala Ala Gin Glu Ala Ser Ala Asn Ser Val Lys Glu Leu 20 541 TCA GTA GCA AGC TTG TCA ΑΛΛ GCG GCT CAA GAA GCA TCA GCT ΑΛΤ TCA GTT AAA GAG CTT « 201 Thr Ser Pro Val Val Ala Glu Thr Pro Lys Lys Pro *** 21 :::: 601 aca agt cct gtt gta gca gaa actcca aaa aaa ccttaa 63 • · : ’·· 25 « • · :1·1: Rokotteessa käytettävä pC-proteiini voi käsittää ♦ · seoksen luonnollisesti esiintyvän pC-proteiinin erilaisia • · serologisia muotoja. B_;_ burgdorferi -soluista jäljempänä 30 kuvatun mukaisesti saadun pC-proteiinin ohella voidaan ;φ . käyttää yhdistelmä-DNA-pC:tä, variantteja luonnollisesti • · ... esiintyvästä molekyylistä ("pC-variantit" ) sekä "mimeette- • · - ';· jä", joissa yhdisteissä on mimotooppeja, jotka jäljittele- vät pC-epitooppeja .
« · · • · • · * · · • » • · · ♦ · · ♦ · · · · • · · • · · • ·
107331 I
j
ίο M
pC-varianttien ryhmään kuuluu esimerkiksi oligopep- ; tidejä ja polypeptidejä, jotka vastaavat immunogeenis:.ä : osia pC-molekyylistä, ja mitä tahansa ei-proteiiniluontel- i siä immunogeenisiä osia pC-molekyylistä. Täten variant:.n ; 5 tarkoitetaan käsittävän polypeptidin, joka on homologinen : luonnolliseen pC-molekyyliin nähden ja jolla on tallella sen keskeiset immunologiset piirteet. Tässä suhteessa kauden sekvenssin välinen "homologia" merkitsee identtisyydestä uupumaan jäävää samankaltaisuutta, joka osoitin.a , 10 ensimmäisen sekvenssin olevan johdetun toisesta. Esimer kiksi polypeptidi on "homologinen" pC:hen nähden, jos s:e sisältää aminohapposekvenssin, joka vastaa epitooppia, jonka tunnistavat pC-spesifiset vasta-aineet tai T-solut. ] Tällainen sekvenssi voi olla vain muutaman aminohapon m] 15 täinen ja se voi olla lineaarinen määre tai määre, joka j syntyy, kun aminohappoja lineaarisen sekvenssin erillis:.s - j tä osista on tilallisesti limittynyt proteiinin laskosti- j misen jälkeen tai sen kovalenttisten sidosten modifioinnjn J jälkeen. Rokotteen tarkoituksiin aminohapposekvenssit, j 2 0 jotka ovat antigeenimääreitä, voidaan varmistaa esimerk:.} - j i si alalla tunnetuilla monoklonaalikartoitusanalyysiteknxi - ] koilla. Katso Regenmortel, Immunology Today 10 (1989) 2£6 j , - 272, ja Berzofsky et ai. , Immunological Reviews jji j ..: : ~ "j ;;· · (1987) 9 - 52. Tämän kaltaisen samankaltaisuuden määritys j • " 25 voidaan niinikään suorittaa käyttämällä kilpailevan inhi- ’·**· bition tutkimusta vasta-aineiden kohdalla, tai T-solt- • · · j • *.* lisääntymisellä. j pC-varianteiksi näiden kriteerien mukaan kelpaavia | polypeptidejä voidaan valmistaa käyttämällä tavanomaisia j « i 30 käänteisiä geneettisiä tekniikoita, eli suunnittelemalla j ja rakentamalla geenisekvenssi aminohapposekvenssin nojali- • * j la tai käyttämällä tavanomaisia geenilohkomistekniikoita.
« |
Esimerkiksi pC-variantteja voidaan tuottaa tekniikoilla, j joissa käytetään paikkaohjattua mutatointia tai oligonuk- | 35 leotidiohjattua mutatointia. Katso esimerkiksi "Mu·:a- \ *1* * * i • · · j 107334 11 genesis of Cloned DNA" (suom. "Kloonatun DNA:n mutatoin-ti") julkaisussa "Current Protocols in Molecular Biology", 8.0.3. et sea.. Ausubel et al.. toim., 1989 ("Ausubel").
Muita tarkoituksenmukaisia pC-variantteja ovat mo-5 lekyylit, jotka vastaavat osaa pCrstä, tai jotka käsittä vät osan pC:stä mutta eivät ole yhdenmukaisia luonnolliseen molekyyliin nähden, ja jotka osoittavat pC:n im-munogeenistä aktiivisuutta esitettyinä yksinään tai vaihtoehtoisesti kantajaan kytkettyinä. Tämän kaltainen pC-10 variantti voisi edustaa todellista fragmenttia luonnolli sesta molekyylistä tai se voisi olla polypeptidi, joka on syntetisoitu de novo tai yhdistelmä-DNA-teknisesti.
Silmällä pitäen käyttöä pC:n tai pC-variantin yh-distelmä-DNA-teknisessä ilmennyksessä tällaista molekyyliä 15 koodittava polynukleotidimolekyyli käsittäisi edullisesti haluttua aminohapposekvenssiä vastaavan nukleotidi sekvenssin, joka on optimoitu valitulle isännälle kodonikäytän-nön, luennan aloituksen ja kaupallisesti käyttökelpoisten määrien pC:tä tai haluttua pC-varianttia ilmennyksen osal-20 ta. Samoin vektorin, joka valitaan valitun isäntäorganis- min transformoimiseksi tällaisella polynukleotidimolekyy-lillä, tulisi sallia polypeptidiä koodittavan sekvenssin tehokas ylläpito ja kopiointi. Koodittava polynukleotidi-! molekyyli voi koodittaa kimeeristä proteiinia; eli siinä : 25 voi olla nukleotidisekvenssi, joka koodittaa pC-molekyy- listä immunologista osaa, ja joka on operatiivisesi kyt- • · · ! \l ketty ei-pC-osan koodisekvenssiin, kuten isäntäsolun sig- :*·.· naalipeptidi.
• *j*. pC-molekyyliä koodittavan DNA-segmentin eristämi- 30 seksi kokonais-B. burgdorferi -DNA voidaan valmistaa jul- ..... kaistujen menetelmien mukaan. Katso esimerkiksi Maniat is • · ... et ai. , "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold ' Spring Harbor Laboratory, N.Y., 1982; Baess, Acta Path- ol.Microbiol. Scand. (osa B) 82. (1974) 780 - 784. Näin 35 saatu DNA voidaan pilkkoa osittain restriktioentsyymillä • · • · · « « · « « · • « ------------------------------------------H-.....τ------ ' ) 107354 12 : enemmän tai vähemmän satunnaisen genomifragmenttivalikoi- man saamiseksi; entsyymi, jossa on tetranukleotiditunnrs- tuskeskus, kuten Sau3A (Mbol), sopii tähän tarkoitukseen. j Tällaisesta osittaisesta pilkkomisesta saadut fragmentit ; 5 voidaan sitten fraktioida koon mukaan, esimerkiksi käyt! - täen sakkaroosigradienttisentrifugointia (katso Maniat:., supra) tai sykäyskenttägeelielektroforeesia (katso Anne ,
Trends in Genetics, 1986 (marraskuu) 278 - 283), fragment!- ; tien saamiseksi, jotka pituudeltaan vastaavat pC-molekyy- i 10 liä koodattavaa DNA:ta.
Tunnettujen menetelmien mukaan, joita kuvaa e^J - ; merkiksi Ausubel julkaisussa 5.0.1. et seq., valitut fräc - mentit voidaan kloonata sopivaan kloonausvektoriin. Näin saatu DNA voitaisiin insertoida esimerkiksi pUC18-klcj>c - i 15 nausvektorin BamHI-keskukseen. Kimeeriset plasmidit tci fagit, jotka on tuotettu esimerkiksi liittämällä koon pe- j rusteella valitut fragmentit kloonuasvektoriin, voida.ön j sitten transformoida Ek. coliin tai muihin isäntäsoluihir, ] jotka seulotaan sitten kooditetun proteiinin ilmennyksen j 20 suhteen. Lukuisia erilaisia menetelmiä voidaan käyttää | kirjastojen seulomiseksi pC-geenin sisältävän kloorin ] tunnistamiseksi. Näitä menetelmiä on seulominen pC:]le j spesifisellä hybridisaatiokoettimella, kuten oligonuklec- j : tidikoettimella, tai seulominen pC-antigeeni-ilmennyksen j : " 25 suhteen käyttäen pC:lle spesifistä immunologista reager.s- | *·**· siä. Viimemainittu voidaan tehdä esimerkiksi suorittamalla 1 ·· · j Σ kirjaston blot-immuunianalyysi käyttäen anti-pC-morc- j klonaalivasta-aineita tai spesifistä polyklonaalista vas- j * * < ·*;*. ta-ainetta, joka on valmistettu puhdistetulla pC:llä :irr- * i 30 munoiduista eläimistä. Kun pC:tä koodittavaa DNA:ta si- sältävä klooni on tunnistettu kirjastosta, DNA voidaan er-
* * I
istää ja pC-proteiinia koodittava alue täysin karakteri- j '!' soida (esimerkiksi sekventoimalla) , minkä jälkeen DNA: ta j voidaan käyttää pC-ilmennysvektorien valmistamiseksi, jet- j : : i
4 · « I
* ] • · Ί : ! • · 1 • · · :i ·. : \ ! i ί : i 107334 13 ka sopivat proteiinin valmistukseen, jolla on pC-aktiivi-suutta.
Kuten aiemmin mainittiin, jotta saataisiin tehokas immunogeeni, yhdistelmä-DNA-teknisesti ilmennetyn pC-pro-5 teiinin rakenteen tulisi olla riittävän samankaltainen kuin natiivin (ei-denaturoidun) pC:n siten, että proteiini indusoi suojaavien vasta-aineiden tuotannon. Tähän pääsemiseksi pC:tä koodittava DNA ilmennetään edullisesti siten, että vältetään ilmennystuotteen solunsisäinen prote-10 olyysi ja aggregaatio denaturoidussa muodossa. Yksi tapa näiden ongelmien välttämiseksi on tuottaa pC yhdistelmä-DNA-teknisesti isäntävektorisysteemissä, jossa pC tulee eritetyksi isäntäsolusta, edullisesti suoraan kasvualustaan. Yksi tällainen systeemi voidaan muodostaa Bacillus 15 subtiUkseen. Sopiva ilmennysvektori voidaan rakentaa Ba cillus subtilikselle kytkemällä B_;_ amvloliquefaciens a-amylaasisignaalisekvenssi, katso Young et ai. . Nucleic Acids Res. 11 (1983) 237 - 249, Bacillus-plasmidi vektori in pUBHO kuten kuvaavat Ulmanen et ai. . J.Bacteriol. 162 20 (1985) 176 - 182. Tämän lähestymistavan mukaan vieraspro- teiinin koodisekvenssi kloonataan alavirtaan promoottorista, ribosomisitoutumiskeskuksesta ja signaalisekvenssistä oc-amylaasille. pC:n kopiointi ja luenta on a-amylaasipro-“· · moottorin ja luentakoneiston säätelyssä tässä rakenteessa, : 1' 25 ja pC:n erityksen isäntäsolusta hoitaa a-amylaasisignaali- *·2· sekvenssi. Samankaltaisia vektoreita hiivassa käytettävik- • · · • si on kuvattu ja pC:n ilmennyseritykseen hiivassa näitä vektoreita käyttäen voitaisiin päästä.
• · ·'·1; Edelleen toinen lähestymistapa pC:n ilmentämiseksi 30 isäntävektorisysteemissä, jolla vältetään proteolyysi, ,,,,· aggregaatio ja denaturoituminen, on käyttää lehmänrokko- • · virusta vektorina, joka kykenee ilmennykseen lukuisissa c ‘C erilaisissa nisäkäsisäntäsoluissa, jotka ovat alttiita le- hmänrokkotartunnalle. Tämän lähestymistavan mukaan valmis-35 tettaisiin yhdistelmä-DNA-lehmänrokkovirusperäinen vekto- * · ♦ 1 · • · · * « « · · « · · • i 1 2 « ·
---—-— ........- -- - ' ----- .......- I
S
j Ί j 107334
14 I I
; ri, jossa pC-geeni on sijoitettu promoottorin säätelyyn, j luenta- ja erityssignaalien ohella, jotka kykenevät ilmen- tämään pC-proteiinin lehmänrokkotartunnan saaneessa isän- ; nässä. Kuten kuvataan US-patenttijulkaisussa nro 4 <>(i3 5 112, plasmidi käsittäisi myös 5'-suuntaan kopioinninsääte- : lyalueista ja 3 1-suuntaan 3'-päätös- ja polyadenylaat:.o- ; signaaleista sivuavia sekvenssejä, jotka johtavat homoko- j giseen DNA-yhdistymiseen villityypin lehmänrokkogenomiin
Kun tämän kaltainen rakenne viedään lehmänrokko- ; 10 tartunnan saaneeseen isäntäsoluun, sivuavat sekvenssi t i ohjaavat plasmidivektorin ja lehmänrokkoviruksen välistä DNA-yhdistymistä sillä seurauksella, että kloonattu nfc - kennesekvenssi (joka tässä koodittaa pC:tä) tulee osaksi lehmänrokkovirusta, lisääntyy sekä tuleee ilmennetyksi se n 15 kanssa. Edullisesti sivuavien sekvenssien välinen ali .e sisältää myös valikointimerkin, jolloin valikointikasvi-
alustassa eloon jäävät vain ne solut, jotka sisältävät I
yhdistelmä-DNA:ta käsittävän lehmänrokkoviruksen (ja tässä yhteydessä sekvenssin, joka koodittaa polypeptidiä, jo]]a i 20 on pC-aktiivisuutta). j Tällä tavalla tuotettua yhdistelmä-DNA-lehmänrck- j kokantaa voidaan käyttää nisäkässolujen, kuten VeRo-so.lu- j jen tai CVl-solujen, tartuttamiseksi, jotka soveltuvat j * * 1 : korkean tiheyden fermentointikasvatukseen. Näissä soluissa « · j : ** 25 ilmennetty proteiini, jolla on pC-aktiivisuutta, tulisi e * i *·*’· fermentoinnissa eritetyksi fermentointikasvualustaan, jos- j • \S ta se puhdistettaisiin tavanomaisella metodologialla. j
Luonnollisen pC:n ja pC-varianttien ohella rokota j j*j*j voi käsittää yhdisteitä ("mimeettej ä") , jotka jäljittele- j 30 vät pC-epitooppeja ("mimotooppeja"). Yksi esimerkki mimeel·· tistä on anti-idiotyyppinen vasta-aine, eli vasta-aine, * · j j ... joka tuotetaan immunoimalla eläin vasta-aineella, joka • j *.** sitoutuu spesifisesti epitooppiin antigeenissä. Antit idiotyyppinen vasta-aine tunnistaa yhdistymiskeskuksep | 35 ensimmäisessä vasta-aineessa ja sopii siihen. Tämän vuoksi j ! 1 • · · j
1 I
i ! ί ( ] 107334 15 sen yhdistysmiskeskuksen muoto muistuttaa likeisesti epi-tooppia, joka sopii ensimmäisen vasta-aineen yhdistymis-keskukseen. Koska anti-idiotyyppisessä vasta-aineessa on yhdistymiskeskus, joka muodoltaan jäljittelee alkuperäistä 5 antigeeniä, sitä voidaan käyttää rokotteena vasta-aineiden muodostamiseksi, jotka reagoivat alkuperäisen antigeenin kanssa. Katso Fineberg ja Ertl, CRC Critical Reviews in Immunology 7 (1987) 269 - 284. Sopivia mimeettejä voitaisiin identifioida seulomalla pC-vasta-aineella, jotta to-10 dettaisiin, mitkä yhdisteet sitoutuvat siihen, tai niitä voitaisiin tuottaa molekyylimallituksen avulla. Katso Morgan et ai. , "Approaches to the Discovery of Non-Peptide Ligands for Peptide Receptors and Peptidases" (suom. "Lähestymistapoja ei-peptidiligandien löytämiseksi peptidi-15 reseptoreille ja peptidaaseille") julkaisussa "Annual Re ports in Medicinal Chemistry", Academic Press, 1989, ss. 234 et seq..
Esillä olevan keksinnön mukaisesti valmistettu rokote on tarkoitettu alttiin nisäkkään, mukaan lukien ihmi-20 sen, immunointiin Lymen tautia vastaan. Ilmaisulla "im- munogeeni" tarkoitetaan antigeeniä, joka synnyttää spesifisen immuunivasteen, joka johtaa neste- tai soluvälittei-. seen immuniteettiin tässä tapauksessa Borrelia-tartuntaa · vastaan. "Immuniteetilla" tarkoitetaan täten yksilön kykyä • » • ’ 25 vastustaa tai voittaa tartunta helpommin kuin ei im- ***** munoidut yksilöt, tai sietää tartunta saamatta kliinisiä ·♦ ♦ • *.· oireita.
J^*,: Edellä mainittu immunogeeni voi edelleen käsittää :***; hyväksyttävää fysiologista kantajaa. Tällaiset kantajat 30 ovat alalla hyvin tunnettuja ja niihin kuuluvat makromole- kyylikantajat. Esimerkkejä sopivista kantajista nisäkkäis- • · ·.. sä ovat tuberkuliini-PPD, nautaseerumialbumiini, muna-al- burniini tai avaimenreikä-maljakotilohemosyaniini . Kantajan ..!;* tulisi edullisesti olla ei-myrkyllinen ja ei-allergeeni- 35 nen.
• · • * « « · » ♦ » * * » 4 • · * 1073ο 4 16
Immunogeeni voi edelleen käsittää apuainetta kuten I aluminumyhdistettä, vesi- ja kasvi- tai mineraaliöljy- ; emulsioita (esim. Freundin apuaine), liposomeja, ISCOM : a 1 (immuunistimuloiva kompleksi), vesiliukoisia laseja, ijx>-5 lyanioneja (esim. poly-A:U, dekstraanisulfaatti, lenttd- naani), ei-myrkyllisiä lipopolysakkaridianalogeja, mu±c- i 3 myylidipeptidiä ja immuunisääteleviä aineita (esim. ri.rj terleukiinit 1 ja 2) tai mainittujen yhdistelmiä. Edulli- j nen apuaine on aluminiumhydroksidi. Immunogeeni syyt. t ä 10 voidaan myös tehostaa nisäkkäissä, joille on annettu ele- i viä heikennettyjä bakteerivektoreita, kuten Salmonellc-tai Mvcobacterium-lai ei a. tai virusvektoreita kut e n j
Vaccinia-vektoreita, jotka ilmentävät polypeptidin, jo]j]|a ! on pC-aktiivisuutta.
15 Tekniikat tällaisten immunogeenien muodostamiseksi ovat alalla hyvin tunnettuja. Immunogeeni voidaan esimeu - ; kiksi kylmäkuivata sitten rehydratoitavaksi täyteaineeseen ; kuten suolaliuokseen tai muuhun fysiologiseen liuokseen . '
Joka tapauksessa rokote valmistetaan keksinnön mukaisesti : 20 sekoittamalla immunologisesti tehokas määrä pC:tä täyteöl- ; neeseen määränä, joka johtaa rokotteen immunogeenisesti tehokkaan ainesosan haluttuun pitoisuuteen. Immunogeer. 1 - : sesti tehokkaan ainesosan määrä rokotteessa riippuu imin;- ; - noitavasta nisäkkäästä, jolloin huomiota kohdistetaan kcb- . " 2 5 teen ikään sekä painoon sekä rokotteen sisältämän immur.c- ; ***** geenisen ainesosan immunogeenisyyteen. Useimmissa tapauk- ; • · · • sissa immunogeeni sen ainesosan määrä rokotteessa on 1 - j :1·.: 100 annoksessa, ja on edullisesti 10 - 50 ptg annokses- : ♦“1· sa. ! • « · « 30 Esillä olevan keksinnön edelleen seuraavassa suo- ritusmuodossa immunogeeni koostuu pC:stä, pC-variantista i • · tai pC-mimeetistä ja yhdestä tai useammasta muusta ; *” burgdorferi -antigeenistä.
.."1 Menetelmät edellä kuvattujen rokotteiden valmista- : 35 miseksi on suunniteltu sen varmistamiseksi, että spesifis- ; « · • 1 · · « 107334 17 ten molekyylien identiteetti ja immunologinen teho säilytetään, ja että mukaan ei joudu mitään epätoivottavia mik-robiepäpuhtauksia. Lopputuotteet jaetaan ja säilytetään aseptisissa olosuhteissa.
5 Menetelmän mukaan nisäkkään immunoimiseksi Lymen tautia vastaan nisäkkäälle annetaan tehokas määrä edeltävää immunogeenia. Annossa voidaan käyttää mitä tahansa alalla hyvin tunnetuista menettelyistä. Esimerkiksi sopivan antosuunnitelman mukaan ehkä edellä kuvattua rokotetta 10 annetaan nisäkkäille, joiden tiedetään olevan alttiina B.
burgdorferia kantaville punkeille, noin 6 kuukaudesta 1 vuoteen ennen tiedettyä tai ennakoitua altistumista. Mitä tahansa immunointitietä, joka tulee kyseeseen tai jonka on osoitettu tuottavan tarkoituksenmukaisen immuunivasteen, 15 voidaan käyttää esillä olevan keksinnön mukaan, vaikkakin anto ruoansulatuskanavan ulkopuolisesti on edullista. Sopivia antomuotoja ovat ihonalaisesti, ihonsisäisesti tai lihaksensisäisesti ruiskuttamalla tai valmisteet, jotka sopivat annettaviksi suun kautta, nenän kautta tai pe-20 räsuolen kautta.
Puhdi s tu smene telmä
On kehitetty uusi, ei-denaturoiva menetelmä erilaisten B_j_ burgdorferi -antigeenien puhdistamiseksi eri- 4 4 : laisista B^_ burgdorferi -kannoista. Antigeenejä ovat mai- « « 1 *·· 25 nittuihin kuitenkaan rajoittumatta ospA, ospB, pC, flagel- *·**ϊ larakenneproteiini ja proteiinit, joiden likimääräiset molekyylipainot ovat 21, 56, 60 ja 63 kD:tä. Nämä menette- •\« lyt edustavat parannusta alan teknisen tason mukaisiin • · .*i*. menetelmiin, jotka ovat joko denaturoivia tai spesifisiä 30 vain tietyn tyyppiselle antigeenille tai johtavat vain . osittaiseen puhdistukseen. Edullinen puhdistusmenetelmä • · ... käsittää seuraavat vaiheet: • · *;'* (a) B_^ burgdorferi -solut rikotaan ja fraktioidaan « sentrifugoimalla "membraani"- ja "sytoplasma"-osiin;
I I I
• I
4 4
• « 4 I
• 4 I I 4 • 4 · III 4 1 * 14« • 4 4 • 4 18 107331 (b) membraanifraktiota uutetaan ei-denaturoivat .a; detergentillä, minkä jälkeen sentrifugoidaan liukoiseksi tehdyn proteiinin käsittävän supernatantin saamiseksi sekä’ ei-liukoisen materiaalin poistamiseksi pellettinä; ja 5 (c) liukoiseksi tehdyt antigeenit fraktioidaan Jlo- ; ninvaihtokromatografisesti (dietyyliaminoetyyli- eli :
"DEAE"-hartsi), jolloin adsorboidut antigeenit eluoidaan käyttäen NaCl-gradienttia. i I
Puhdistusmenetelmään voi kuulua antigeenien k<£>il- : 10 sentrointia ja edelleen puhdistamista seuraavasti: | (a) hydroksyyliapatiittikromatografia, jossa adsor- ; hoidut antigeenit eluoidaan nostamalla puskurin fosfaatti-pitoisuutta; ja/tai (b) immobilisoitu metalli -affiniteettikromatogr*.- i 15 fia, jossa adsorboidut antigeenit eluoidaan imidatsolilla. ;
Muita alalla tunnettuja eluointimenetelmiä oya t : eluointi laskemalla pH:ta tai nostamalla ammoniumkloridir, histidiinin tai muun aineen, jolla on affiniteettia kelcU - : tin muotoon saatetulle metallille, pitoisuutta.
20 Solut voidaan rikkoa tuottamalla niihin lyysi ra vistamalla niitä lietteenä solumyllyssä, jossa on pier.iä i lasihelmiä, käsittelemällä ultraäänellä tai käyttäen rans- ! kalaista painekennoa. Vaihtoehtoisesti antigeenit voidaan ; ::: : uuttaa suoraan organismin solupinnasta käsittelemällä se- *·· 25 lua detergentillä, muuttamalla solun ympäristön ionivsl:- i *:·*: vuutta tai muuttamalla hieman lämpötilaa. Vaihtoehtoisesti ; ·*·’; voidaan käyttää lähtömateriaalia, joka koostuu soluista i * « : vapautetuista membraanirakkuloista. ; ♦ ·
Membraanifraktiota voidaan uuttaa detergentillä!, ; • * · 30 jolla edullisesti on hyvä liuotuskyky, joka on ei-denatu- ;
. roiva ja joka sopii ioninvaihtokromatografiän yhteyteen. I
Edullinen detergentti on kahtaisionidetergentti 3-14 Cal- ; •y' biochem-valmistajalta, vaikka mitä tahansa detergentti! | ·.·· tai orgaanista liuotinta, jolla on edeltävät ominaispiir- 35 teet, voidaan käyttää. Detergenttiä käytetään tyypillji- • i • · · il • « « ] • · « · i '1 | : ]
: J
j
II
Ϊ ! 107334 19 sesti pitoisuutena 1 % (w/v), mutta se olisi vaihtelevassa määrin tehokas pitoisuuksissa 0,01 - 10 % (w/v) . De- tergenttiuutto suoritetaan lämpötilassa 0-60 °C, edullisesti 37 °C, ja sen tulisi kestää 10 minuutista 8 tun-5 tiin, edullisesti 1 tunnin ajan. Kaootrooppisia aineita kuten ureaa voitaisiin käyttää detergentin lisäksi liuo-tusmenettelyn tehostamiseksi.
Detergentillä liukoiseksi tehdyt antigeenit fraktioidaan sitten DEAE-kromatografisesti. Edullisesti käy-10 tetään DEAE-ioninvaihtohartsia, mutta muitakin anionisia tai kationisia ioninvaihtohartseja voidaan käyttää sen asemesta tai toistensa yhteydessä. Esillä olevan keksinnön mukaan ioninvaihtohartsi käsittää ei-liukoisen matriisin, johon on kytketty varattuja ryhmiä. Anioninvaihtoon käy-15 tettyjä funktionaalisia ryhmiä ovat aminoetyyli- (AE-), dimetyyliaminoetyyli- (DEAE-) ja kvaternaarinen aminoetyyli - (QAE-) ryhmät. Kationinvaihtajissa voi olla karboksi-metyyli- (CM-), fosfo- tai sulfopropyyli- (SP-) ryhmiä. Vaikka näytteet panostetaan kolonniin Tris-puskurissa, 20 joka sisältää kahtaisionidetergenttiä 3-14 (1 %) , ja anti geenit eluoidaan käyttäen NaCl-gradienttia, muutkin yhdistelmät voivat olla yhtä tehokkaita.
Antigeenit voidaan konsentroida sitomalla ne hyd-: roksyyliapatiittiin alalla hyvin tunnettujen menetelmien
• I
• '·. 2 5 mukaan. Vaihtoehtoinen tai täydentävä menettely, jolla ·;··; antigeenejä voidaan edelleen konsentroida/puhdistaa, on ·*·*: immobilisoitu metalli -af f initeettikromatograf iaa. Tämä t · : viimemainittu menetelmä on edullisempi kuin hydroksyyli- • « apatiittikromatografia pC:n puhdistamiseksi, koska pääs- • · « 30 tään parempaan erotukseen ospA:sta ja ospB:stä.
Edellä kuvatun ei-denaturoivan puhdistusmenetelmän etu on, että proteiinin 3-dimensionaalinen konformaatio • « säilytetään, jolloin säilytetään niinikään kaikki natii-··· vissa proteiinissa esiintyvät vasta-ainesitoutumiskeskuk- .***. 35 set, mukaan lukien suojaukseen liittyvät. Jos proteiini on • · • « • · · • · 2 0 ||
: I
ϊ ! I i 10733¾ ! denaturoitu, sitoutumiskeskukset voivat tulla osittain tai! j täysin tuhotuiksi, jolloin antigeenin kyky indusoida vag-j ta-aineita antigeenikeskuksille laskee vastaavasti. Näin; muuttuneet proteiinit olisivat täten epäsopivia rokottei3-5 sa käytettäviksi.
Edeltävän puhdistusmenetelmän etu kokosolumenetlelL- j
mään kuten Johnsonin (1988) selostamaan nähden on, et ;ä j sillä saadaan homogeeninen proteiini, joka ei sisälLäj myrkyllisiä osia, jolloin vähennetään haitallisen reaktion] 10 todennäköisyyttä. "Homogeeninen" tässä yhteydessä tarkoi J
taa, että ainakin 80 % (w/v) proteiinista on täysin kosdi-matonta pC:tä, jolloin lähes koko loppuosa koostuu pC:n; hajoamistuotteista. Täten epäpuhtauksia väliainerakenie- ; osien ja muiden Borrelia-proteiinien muodossa on läsnä; 15 vain hivenmäärinä, jos laisinkaan. Homogeeninen pC Voi ] koostua pC: n useammasta kuin yhdestä serologisesta rrijio- : dosta. ] ' : Tällä tavalla on mahdollista poistaa epätoivotpa- i vat, mahdollisesti immunogeeniset proteiinit, jotka v<t>:.- ' 2 0 sivat indusoida autovasta-aineita ja aiheuttaa haitallis: a i autoimmuunireaktioita immunoidussa nisäkkäässä. Samoin | edellä kuvatulla puhdistusmenetelmällä varmistetaan nii-n- ; ikään toistettavuus erästä toiseen rokotetuotannossa. Suojaus : " 25 Sen perusteella, että todettiin Gerbillus-ivrsi~ i.n ) • | *·’” kelvollisuus eläinmallina tässä yhteydessä, suoritettu.: n ] • · · } j kokeita sen vahvistamiseksi, että immuniteettia burc- ; i’·.: dorferi -tartuntaa vastaan voitiin saada. Näitä kokeitl a ' « e ;’j‘; käsitellään jäljempänä esimerkissä 3. Vaikka ospA, ospE , ; 30 pC, 63 kD:n ulkopintaproteiini, 21 kD:n ja 94 kD:n pre- : ..... teiinit B^_ burgdorferi -kannasta Orth-1 testattiin myös , * · t... vain pC-proteiini osoitti selviä merkkejä suojavaikutil - ! *;* sesta. j
• · · J
"''j j *. ·: i : ;i j | 107334 21
Toteamismenetelmä
Edeltävällä puhdistusmenettelyllä valmistetut antigeenit sopivat käytettäviksi diagnostisissa testeissä, kuten Bj_ burgdorferi -vastaisten vasta-aineiden toteami-5 seksi nisäkkäistä peräisin olevasta ruumiinnesteestä.
Esimerkiksi ei-denaturoitua, homogeenista proteiinia, joka on valmistettu edeltävällä menetelmällä, voidaan inkuboida ruumiinnestenäytteen kanssa tällaisesta inkuboinnista saatavan sitoutuneen vasta-aineen läsnäolon toteamiseksi. II-10 maisun "ruumiinneste" tarkoitetaan käsittävän mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta aivo-selkäydinnesteen, nivelnesteen, virtsan, ruumiinontelonesteen, veren, seerumin, siemennesteen ja syljen. Tällaiset testit, vaikkakin ne ovat alalla hyvin tunnettuja, paranisivat huomattavasti puhdis-15 tettujen antigeenien herkkyyden ja spesifisyyden ansiosta.
Esillä olevaa keksintöä kuvataan yksityiskohtaisemmin seuraavissa esimerkeissä, jotka ovat havainnollistavia ja joiden ei mitenkään tarkoiteta rajoittavan keksinnön kattavuutta.
20 Esimerkki 1
Proteiinin puhdistus Membraanifraktioiden valmistus
Borrelia burgdorferi -solut otettiin talteen sent-jj; · rifugoimalla (7 000 g, 20 minuuttia, 4 °C) , solupelletti . ·1 25 pestiin kahdesti PBS:ssä, jossa oli pitoisuus 5 mM MgCl2, ja määritettiin solujen märkäpaino. Pestyt solut uudel- • leenlietettiin sitten 100 mM Tris-HCl-puskuriin, pH 7,5 (suhteessa 1 g soluja/2 ml puskuria), ja liete lisättiin * · lasihelmiin (0,17 - 0,18 mm halkaisija, 5 g helmiä kohden 30 1 g solutahnaa) metalliastiassa. Soluihin tuotettiin sit- * ten lyysi ravistelemalla seosta VibrogenR-solumyllyssä • · (malli V14, Buehler) . Peräkkäin suoritettiin 3 minuutin « ravistelukierroksia jäähdyttäen (4 °C) , kunnes lyysi oli .. ‘ 1 yli 99-%risesti täydellinen määritettynä pimeäkenttämik- • · « * t « « · · • · « · « 1 · • « · 22 10733^ roskooppisesti. Lysaatti suodatettiin sitten lasisintte- j risuodattimella lasihelmien poistamiseksi ja talteenkerS-tyt helmet pestiin puskurilla bakteeriantigeenisaanncn suodoksessa parantamiseksi.
5 Lysaattia sentrifugoitiin 20 minuutin ajan 7 5jC0 j g:ssä 4 °C:ssa raakamembraanifraktion tuottamiseksi ("ls|j" j alhaisen nopeuden pelletti). Supernatantti a sentrifugoitiin edelleen 30 minuutin ajan 100 000 g:^£ä j 4 °C:ssa toisen membraanifraktion saamiseksi ("hsp" - k<j>i - : 10 kean nopeuden pelletti). Molemmat mebraanifraktiot pe£ -tiin kahdesti 100 mM Tris-HCl-puskurilla (pH 7,5) kävi -täen alkuperäisiä sentrifugointiolosuhteita. Kumpaa tahansa membraanifraktiota olisi voitu käyttää lähtömateriaalina pC:n (tai muiden membraaniliitteisten antigeo- i 15 nien) puhdistamiseksi, mutta hsp-fraktio sisälsi vähemijien epäpuhtauksina läsnä olevia proteiineja.
Membräänien detergenttiuutto
Membraanit uudelleenlietettiin pitoisuudeksi no: n j 10 mg proteiinia/ml 10 mM Tris-HCl-puskuriin (pH 7,!5 , 20 joka sisälsi 1 %:n (w/v) kahtaisionidetergenttiä 3-:.4 j (Serva). Yhden tunnin inkuboinnin 37 °C:ssa jälkeen ei:.- ] liukoinen materiaali sentrifugoitiin eroon (100 000 g, l>0 i min, 4 °C).
: DEAE-ioninvaihtokromatografia • " 25 Detergentillä liukoisiksi tehdyt antigeenit fral:- ; » | tioitiin DEAE-kromatografisesti kuten seuraavassa mallina i • esitetään:
kolonni: Protein-PAK DEAE 5PW -puolipreparatiivi-kolonni (halkaisija 21,5 mm, pituus 150 mm) valmistajatpa 30 Waters; J
näyte: 20 ml (4 x 5 ml) detergentillä liukoiseksi I
• · I 5 tehtyä antigeenivalmistetta (10 mg/ml); j virtausnopeus: 4 ml/min; j puskuri A: 10 mM Tris-HCl, pH 7,5/ 1 % (w/v) kah- : 4 I < 35 taisionivalmistetta 3-14; j • I j • · j • · · ! * · · · i
! I
• · \ ] i ! i i 23 107334 puskuri B: A + 1 M NaCl; gradientti: O % B:tä 35 minuutin ajan; O - 30 % B:tä 90 minuutin ajan; 30 - 65 % B:tä 45 minuutin ajan; 65 - 100 % B:tä 10 minuutin ajan.
5 Kolonnia tasapainoitettiin puskurilla A ja anti geenit eluoitiin käyttäen kasvavia määriä NaCl:ää. Kiinnostavaa antigeeniä sisältävien fraktioiden identifioimiseksi 8 ml;n fraktioiden muodostamat näyte-erät saostet-tiin lisäämällä asetonia ja pelletit analysoitiin SDS-10 PAGE:11a ja/tai blot-immuunimäärityksellä.
Hydroksyyliapatiittikromatografia
Kiinnostavan antigeenin, kuten pC:n, suhteen rikastetut fraktiot yhdistettiin pooliksi, jota dialysoi-tiin puskuria C vastaan, minkä jälkeen se panostettiin 15 hydroksyyliapatiittikolonniin. Sitoutunut antigeeni eluoitiin käyttäen kasvavia määriä fosfaatti-ioneja, esim. puskurilla D. Tällä tavalla laimeita antigeeniliuoksia voitiin konsentroida ja voitiin päästä antigeenin edel-leenerotukseen epäpuhtauksista. Tämän menettelyn tekniset 20 spesifikaatiot ovat seuraavat: kolonni: Bio-Gel HPHT-kolonni (halkaisija 7,8 mm, pituus 100 mm) valmistajalta Bio-Rad; näyte: pooliksi yhdistetyt pC:tä sisältävät fraktiot edeltävästä vaiheesta (esim. fraktiot 20 - 22) dia-25 lyysin (4 x 5 ml) vastaan puskuria C jälkeen; virtausnopeus; 0,5 ml/min; ·· · • V puskuri C: 10 mM MOPS-NaOH (3-N-morfolinopropaani- : sulfonihappo), pH 6,8/1 mM Na(P04)3'/0,01 mM CaCl2/l % (w/v) kahtaisionivalmistetta 3-14; 30 puskuri D: C + 400 mM Na(P04)3·; gradientti: 0 % D:tä 60 minuutin ajan; 0 - 100 % • · D:tä 20 minuutin ajan.
Fraktiot analysoitiin kuten kuvattiin ioninvaihto-kromatografiavaiheessa.
• » • « · « · • « « * 1 · · · 1 \ 5 j 107334 |
24 I
Immobilisoitu metalli -affiniteettikromatografiti Fraktiot, jotka oli rikastettu kiinnostavan anid -geenin suhteen, kuten pC-fraktiot DEAE-ioninvaihtokromc- j j tografiaerotuksista, yhdistettiin pooliksi ja puskia! I 5 säädettiin (esim. pC-proteiinia sisältäviin ioninvaihto-kromatografiafraktioihin lisättiin NaClrää loppupitoism-teen 150 mM). Suodatettu antigeeniliuos (0,2 pm) panos- j tettiin immobilisoitu metalli -af f initeettikromatografi.i - j kolonniin (esipanostettu Cu++:lla valmistajan kuvauksen j 10 mukaan ja tasapainoitettu puskurilla A), pestiin puskia rilla A ja sidottu antigeeni eluoitiin imidatsolipitcd-sella puskurilla B. Tällä tavalla laimeita antigeeid-liuoksia voitiin konsentroida ja päästä antigeenin edo]-leenerotukseen epäpuhtauksista.
15 Tämän menettelyn tekniset spesifikaatiot pC-prc- teiinille mallina esitettyinä ovat seuraavat: kolonni: kelatoiva Superose HR 16/5 -kolonni (ho]-kaisija 16 mm, pituus 50 mm) valmistajalta Pharmacia/Lii; : näyte: pooliksi yhdistetyt pC:tä sisältävät friil·- ; 20 tiot DEAE-ioninvaihtokromatografiästä; lisätään NaClicä (150 mM); puskuri A: 20 mM Tris/asetaatti, pH 7,5/150 n M : , NaCl/1 % (w/v) kahtaisionidetergenttiä 3-14; · puskuri B: 20 mM Tris/asetaatti, pH 7,0/150 n M i
• " 25 NaCl/1 % (w/v) kahtaisionidetergenttiä 3-14/50 mM imidi.1- I
soli; • 1 · ; 1.· virtausnopeus: 2 ml/min; ί#\: gradientti: A 30 minuutin ajan; 0 - 100 % B:tä 40 minuutin ajan.
30 pC:tä sisältävät fraktiot identifioitiin kuten Jc- ninvaihtokromatografiavaiheessa. ; | • · e»· • · ! »M ^
♦ I S
41,1 ! ! « I · « 4 | ; <44 2 2 4· 4 « 11« 107334 25
Esimerkki 2
Tulokset puhdistusmenettelystä
Seuraavia antigeenejä, jotka valmistettiin käyttäen edellä hahmoteltuja menettelyjä, karakterisoidaan 5 kuvioon 1 viitaten seuraavasti: 63 kD:n ulkopintaproteiini (vyöhyke 7) 60 kD:n proteiini (vyöhyke 8) 56 kD:n proteiini (vyöhyke 9) flagellarakenneproteiini (vyöhyke 10) 10 ospB (vyöhyke 11) ospA (vyöhyke 12) pC (vyöhyke 13) 21 kD:n proteiini (vyöhyke 14).
Puhdistusmenetelmän ensimmäiset 3 vaihetta olivat 15 oleellisesti identtiset riippumatta puhdistettavasta pro teiinista, vaikka tarvittaessa voitiin tehdä modifikaatioita erotuksen optimoimiseksi. pC-proteiinin puhdistuk-sessa/konsentroinnissa käytetyllä hydroksyyliapatiitti-kromatografiavaiheella on laajaa käyttöä, koska lähes 20 kaikki kiinnostavat proteiinit sitoutuvat hydroksyyliapa-tiittiin puskurissa C.
Esimerkki 3 Suojaustutkimuksia «
Koska aktiivisessa tartunnassa hankittu immuni-
I I
< 25 teetti on tavallisesti parempi kuin rokottamalla saatu i ’·**· immuniteetti, 10 Gerbillus-jyrsi jän ryhmälle annettiin • V vatsaontelon sisäisesti haasteena 2 x 107 virulenttia burgdorferi -solua kannasta Orth-1, sen osoittamiseksi, että suojaimmuniteetti Lymen borreliosisilta on realisti-30 nen päämäärä. Tämän annoksen arvioitiin jälkikäteen vas-taavan noin 1 000-kertaisesti tartuttavaa annosta, joka • · .···, tarvitaan tartuttamaan 50 % eläimistä. 3 viikon kuluttua < eläimille alettiin antaa antibiootteja 1 viikon ajan tar- « tunnan parantamiseksi. 17 päivän lepojakson antibioottien « < 4 35 poistumisen mahdollistamiseksi jälkeen eläimille annet- • i 4 « a 4 4« 4 ♦ 4 4 1 · 4 4 4 • 4 4 * 4 26 107324 tiin uusi haaste edellä kuvatun mukaisesti. 2 viikkoa myöhemmin eläimet tapettiin ja rakkoa, pernaa, munuaisia :a | sydäntä viljeltiin. Kaikki nämä eläimet olivat suojattuja, j sillä burgdorferia ei kyetty toteamaan mistään elinviif] -5 jelmästä, vaikka viljelmiä tarkasteltiin säännöllisesti. 8 i viikon aikana. Sitä vastoin 80 % verrokki-Gerbillus-ivrsi- : joista, joille ei ollut annettu alkuperäistä "immunoivaa ί haastetta", oli saanut tartunnan. Vertailukelpoisuuden ; testieläimiin varmistamiseksi myös näitä verrokkeja oli i 10 hoidettu antibiooteilla. Tämä varmisti, että suoja tutljn - : musryhmässä johtui hankitusta immuniteetista eikä antityi - oottien säilymisestä kudoksissa.
Seuraavassa koesarjassa arvioitiin kuvatuilla nj\€ - ! netelmillä Eh. burgdorferistä puhdistettujen antigeenien j 15 suojatehoa. Gerbillus-ivrsii ät imrrvunoitiin vatsaontelon j sisäisesti kahdesti käyttäen 2 viikon väliaikaa immunoir- : tien välillä sekä määrää 10 μg antigeeniä, jossa oli alv- ; miniumhydroksidia lisäaineena. Kahden viikon kuluttua jlil- kimmäisestä immunoinnista kyseisille eläimille sekä φ- ! 20 immunoidulle verrokkiryhmälle annettiin haasteena vatsa- i ontelon sisäisesti 2 x 107 virulenttia IL. burgdorferi -ka^r - i nan Orth-1 solua. 2 viikon kuluttua eläimet tapettiin ja ! rakkoa, pernaa, munuaisia ja sydäntä viljeltiin spirokeet- ; , : : tojen löytämiseksi. Viljelmiä tarkasteltiin säännöllisesti i 25 8 viikon aikana.
<
OspA, ospB, pC ja 63 kD:n ulkopintaproteiini, jotka ! kaikki ovat haastekannasta Orth-1, testattiin. Vain pc- ! : .1 i . . proteiinilla immunoidut eläimet osoittivat selviä merkkejä | suojavaikutuksesta. Vaikka absoluuttista suojaa ei oscil- j • · · ί • · · * 30 tettu, pC:llä immunoitujen eläinten tartunta oli vahemnän | voimakas, jolloin harvempi elin oli saanut tartunnan. In- j * 1 munoiduista eläimistä saadut sydän- ja munuaisviljeln|ät * » · olivat negatiivisia B_j_ burgdorferille, kun taas verrokeis-sa tartuntatiheys oli noin 50 %. Vastaavasti tartunta- !
«III
,···, 35 tiheys pernassa, joka oli noin 70 %, oli laskenut lähes ; * · 3 III :) • · « !| I · « · j i \ 3 I i 1 i 107334 27 puoleen. Vain herkimmän elimen, rakon, kohdalla ei ollut merkittävää muutosta tartunnan saaneiden viljelmien lukumäärässä. OspA, ospB ja 63 kD:n proteiini olivat täysin tehottomia. Näiden kokeiden tulokset esitetään seu- 5 raavassa taulukossa 1.
Taulukko 1
Kpl tartunnan saaneita GerbiUus-eläimiä/-10 Koe Immunogeeni kpl testattuja eläimiä
Immunoidut Verrokit1 25 elävät bakteerit2 0/10 4/5 20 tapetut bakteerit3 6/10 10/10 23 tapetut bakteerit3 7/8 10/10 15 30 tapetut bakteerit1 2 8/9 10/10 yhteensä 21/27 30/30 33 pC-proteiini 8/9 10/10 37 ospB 10/10 9/9 20 38 63 kD:n osp 10/10 9/9 41 ospA 10/10 10/10 1 Verrokki-, eli ei-immunoitu, Gerbillus-jyrsijä 2 Haasteena elävät B^ burgdorferi -solut, hoito 25 antibiooteilla ja uusi haaste suojan, eli "luonnollisen ·;··· immuniteetin", arvioimiseksi.
3 Formaliinilla tapetut B^_ burgdorferi -solut (kaksi • · .·. ; 25 pg:n annosta proteiinina laskettuna).
• · « • · • · · • · e • · < 30 Seuraava koe suoritettiin käyttäen samaa menette- . lyjärjestelyä kuin kuvattiin edellä lukuunottamatta, että
*/ haasteannos laskettiin 103 organismiksi. Immunoinnissa pC
- < « antoi kiistattoman suojan. Sitä vastoin todisteita suo-··· jasta ei ollut immunoinnin ospA: 11a, 21 kD:n tai 94 kD:n «44« ;,,4: 35 proteiinilla jälkeen. Kuten esitetään taulukossa 2, kaik- 4 4 4 4 4 « 4 « I 4 « 114 4 · 2 I · · 3 4 · · ................“T“l ; 1 3 ! 107334| 28 ] ki pC:llä immunoidut Gerbillus-jyrsijät osoittivat suo; c- j 3 vaikutusta, kun taas yhdessäkään ospA:lla, 21 kD:n tai <4 ] 5 kD:n proteiinilla immunoiduista Gerbillus-jyrsijöistä € i | järin ilmennyt vaikutuksia. ] 5 -Taulukko 2 i
Kpl tartunnan saaneita Gerbillus-eläimiä/η j - j
Koe Xmmunogeeni kpl testattuja eläimiä j
10 Immunoidut Verrokit1 S
46 pC-proteiini 0/10 9/10 i 94 kD:n proteiini 8/9 47 ospA 10/10 10/10 | j 21 kD:n proteiini 10/10 | 15 il
Ib J
1 Verrokki-, eli ei-immunoidut, Gerbillus-jyrsijät j \ ! 1
Esimerkki 4 j pC-proteiinin karakterisointi lipoproteiinina j 20 burgdorferi -solut, joita kasvatetaan 3H-paliud - j 5 tiinihapon läsnä ollessa, sisällyttävät tämän radioaktj.d - j visesti leimatun rasvahapon lipoproteiineihinsa. Nämä r<- | dioleimatut lipoproteiinit erotetaan SDS-PAGE-elektrof<- 1
‘ J
reesilla ja identifioidaan fluorografisesti. Yhdellä t{il — j 25 laisella lipoproteiinilla, joka on identifioitu kannat itä j *:··· Orth-1, on sama näennäinen molekyylipaino (noin 24 kD:1;« ) j ·*·*· kuin pC-proteiinilla tästä kannasta. Kun 3H-palmitiinihc - ] . «* i : polla radioleimattuja kokonaisia burgdorferi Ortii-1 j -soluja käsiteltiin trypsiinillä, minkä jälkeen suoritet - e · · 30 tiin niiden SDS-PAGE-analyysi, todettiin karakteristim n j . kaksoisnauha, joka vastaa osittain pilkottua pC-proted.d - j • · ] nia. Tämän materiaalin Western blot -analyysi käytti li n j pC:lle spesifisiä monoklonaalisia vasta-aineita vahvisti, j että nämä nauhat todella vastasivat pC-proteiinia. Tlir ä j 35 dubletti, joka on diagnostinen pC-proteiinille, todettiin j < 3 * . ‘ , ( 3 - . I j « . « 3 '· *: Ϊ 3 i i 107334 29 myös trypsiinillä käsitellyn materiaalin fluorografisesta analyysistä. Analogisessa kokeessa käyttäen proteinaasi-K:ta, joka oleellisesti vähentää soluliitteisen pC-pro-teiinin määrää, tapahtui 24 kD:n lipoproteiinin lähes 5 täydellinen menetys. Nämä tiedot kuviossa 2 esitetyn mukaisesti vahvistavat, että pC-proteiini on lipoproteiini. Metodologisia yksityiskohtia B. burgdorferi -solujen radioleimaus B, burgdorferi Orth-1 -soluja (3,5 ml:n viljelmä, 10 joka sisältää 1,6 x 107 solua/ml) kasvatettiin BSK-kasvu-alustassa, jota oli täydennetty radioleimatulla palmitii-nihapolla (70 μΐ 3H-palmitiinihappoa, 55 Ci/mmol; 1 mCi/-ml) 48 tunnin ajan 33 °C:ssa, ne pestiin kahdesti PBS-puskurilla, joka sisälsi pitoisuuden 5 mM MgCl2, ja kukin 15 erä uudelleenlietettiin 190 μΐ: aan PBS/MgCl2-puskuria. Proteolyyttinen pilkkominen 190 pilaan solulietettä lisättiin 10 μΐ joko PBS/-MgCl2-puskuria (verrokki), 62,5 μg trypsiiniä 1 mM HClissä tai 62,5 pg proteinaasi-K:ta vedessä. Näytteitä inkuboi-20 tiin ravistellen 25 °C:ssa 50 minuutin ajan (proteinaasi-K) tai 100 minuutin ajan, minkä jälkeen lisättiin 2 μΐ PMSFiää (50 mg fenyylimetyylisulfonyylifluoridia/ml etanolia). Solut pelletoitiin (10 min, 8 000 g) ja pestiin kahdesti 500 piillä PBS-puskuria, jossa olivat pitoisuudet . '· 25 5 mM MgCl2 ja 0,5 mg/ml PMSFiää, pilkkomistuotteiden pois- *:**: tamiseksi.
:*·*: Näytteiden analyysi • · SDS-PAGE ja Western blot -analyysi suoritettiin • · tavanomaisten menetelmien mukaan. Fluorografiassa käytet- • · · 30 tyjä geelejä inkuboitiin 1 tunnin ajan EN3HANCE-valmis- teessa (NEN), niitä pestiin 30 minuutin ajan vedellä ja • · kuivattiin 65 °C:ssa 2 tunnin ajan, minkä jälkeen ne valotettiin Hyperfilm MP -filmille (Amersham) -80 °C:ssa.
Iti ll| 107334 ί ;ί ί 3 30 ί
Esimerkki 5
Yhdi s telinä-DNA-pC-proteiinin ilmennys DNA uutettiin burgdorferi Orth-1 -kannasta ja se j pilkottiin osittain Sau3A:lla, pilkkomistuote fraktioi-5 tiin koon mukaan ja tuote kloonattiin pUC18:n BamHI-kes-kukseen. Seulonta suoritettiin käyttäen oligonukleotidi-hybridisaatiokoetinta ja todettu geeni sekventoitiin.
pC-geeniä vahvistettiin sitten PCRillä ennen kloonaamista ilmennysvektoriin.
10 Käytetyt PCR-alukkeet olivat: j
Aluke 1, joka vastaa pC:n avoimen lukualueen alku - j kohtaa (aloituskodoni on merkitty): i 5'ATGAAAAAGAATACATTAAGTGCGATATTA3'
15 IM
Aluke 2, j oka vastaa pC:n avoimen lukualueen lcftc- ! pua (lopetuskodoni on merkitty): j 5’ATTÄAGGTTTTTTTGGAGTTTCTG3’ j j 20 PCR-reaktio suoritettiin noudattaen valmistajan ohjeita käyttäen VentR DNA-polymeraasia (New England Bic- labs). Alukkeiden juottaminen templaatti-DNAihan (yhdis- telmä-DNA-pUC18-plasmidi, jossa on B^ burgdorferi -perii- | 25 nen DNA-fragmentti, joka sisältää pC-geenin sekä sivuavaa ·;··· DNA:ta) suoritettiin 57 °C:ssa ja alukkeita laajennettiin j*.\ 74 °C:ssa. Kaikkiaan 25 kierrosta, joista kukin kesti 1 • ♦ .·. : minuutin, suoritettiin, minkä jälkeen näytettä kuumennet;-
• * < J
·..* tiin 50 °C:ssa 5 minuutin ajan. ! I
*·* * S
30 pC-proteiini on ilmennetty maltoosisitomisproteii- j , nin (MBP) fuusioproteiinina käyttäen kaupallisesti saata- j * * vana olevaa ilmennyssysteemiä (New England Biolabs).
Fuusioplasmidien rakentaminen j PCR:llä vahvistettu pC-geeni insertoitiin alavirl· j
35 taan ilmennysvektoriplasmideissa pMAL-p2 ja pMAL-o2 I
S
: il i 31 107334 esiintyvästä malE-geenistä (100 ng plasmidi-DNArta pilkottiin restriktioentsyymillä Xmnl ja pilkkomistuote li-gatoitiin 20 ng:aan PCR-tuotetta, eli pC-geeniä). Liga-toidulla DNA:11a transformoitiin a-komplementaarinen 5 coli -isäntä (esim. TB1 tai DH5a) ja pC-geenin sisältävät kloonit valikoitiin LB-agarilla, joka sisälsi ampisillii-niä ja X-gal:ia. pC-geenin insertointi kloonausvektoriin, joka tuottaa ampisilliiniresistenssin, katkaisee malE-lacZa-fuusion, jolloin tuloksena on muutos pesäkefenotyy-10 pissä (sinisestä valkoiseen) valituissa koeolosuhteissa.
Rakenteet, joissa oli pC-geeni oikeassa suunnassa vektorin tac-promoottoriin nähden, ilmensivät pC-MBP-fuusio-proteiinin, mikä vahvistettiin Western blot -analyysillä käyttäen pC:lle spesifisiä monoklonaalisia vasta-aineita. 15 pC-MBP-fuusioproteiinia tuotettiin sekä fuusioproteiinin periplasmaan ohjaavan signaalipeptidin käsittävänä (pMAL-p2) sekä vailla signaalisekvenssiä, missä tapauksessa fuusioproteiini j ää sytoplasmaan (pMAL-c2). Sytoplas-mailmennys oli korkeampi kuin periplasmailmennys, mutta 20 viimemainitun mahdollisena etuna on, että saadaan liukoinen tuote.
Yhdistelmä-DNA-pC:n puhdistus
Periplasmassa ja sytoplasmassa ilmennettyä pC-MBP:tä sisältävät raakauutteet valmistettiin valmis-25 tajän kuvauksen mukaan. Fuusioproteiinia puhdistettiin ·;··· affiniteettikromatografisesti käyttäen hyväksi MBP:n spe- sifistä sitoutumista amyloosiaffiniteettihartsiin. MBP-.·. ; osa tulee lohkaistuksi pC-MBP-fuusioproteiinista, jolloin • t #Γ..* jäljelle jää täydellinen pC-proteiini, koska fuusioprote- • ♦ ♦
30 iini sisältää yhden yksittäisen tunnistuskeskuksen prote-aasitekijälle Xa, joka sijaitsee pC-aminohapposekvenssin alkukohdan vieressä. Tässä prosessissa vapautettu MBP sekä mahdollinen pilkkomatta jäänyt fuusioproteiini poistetaan j. käyttämällä tuote amyloosihartsissa (MBP sitoutuu mutta pC
.·*. 35 ei). Muitakin menetelmiä, joiden tiedetään sopivan pC:n « « «
"*! I
] j 107$ 34 j 32 puhdistukseen, olisi niinikään voitu käyttää, esim. ionj.r -vaihtokromatografiaa, hydroksyyliapatiittikromatografific , immobilisoitu metalli -affiniteettikromatografiaa.
Tämän menetelmän mukaan tuotettu pC-proteiini c n j 5 täydellinen. Kuitenkin myös typistettyjä muotoja pC-prc- j teiinista (esim. vailla oletettua johtosekvenssiä olevic) voidaan tuottaa käyttämällä tarkoituksenmukaisia pO!.- j
alukkeita. J
j i ) » <
I I I
(I
* I
• · · · · • ♦ [ • · ·
• · t I
• · • <
• t I
• · · • · « t < • · h • · ·
• I
• · 1 * « * · 4 · · « • · ·
Claims (10)
1. Menetelmä rokotteen valmistamiseksi Lymen bor-relioosia vastaan, tunnettu siitä, että sekoitetaan 5 immunogeenia yhden tai useamman B. burgdorferi pC-polypep-tidin serologisen muodon ryhmästä adjuvantin kanssa määrä, joka on tehokas immunisoimaan alttiin nisäkkään Lymen bor-relioosia vastaan, joka määrä on alueella 1 - 100 μg immu-nogeeniä annosta kohden.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että pC-polypeptidi on erilaisten denaturoimattomien serologisten muotojen seos.
3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että siihen lisätään myös yksi tai 15 useampi B. burgdorferi 1 in ei-pC-antigeeni.
4. Jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että adjuvantti on alumiinihydroksidi .
5. Jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukainen mene-20 telmä, tunnettu siitä, että määrä on alueella 10 - 40 μg immunogeeniä annosta kohden.
6. Jonkin patenttivaatimuksen 1-5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että nisäkäs on ihminen.
7. Jonkin patenttivaatimuksen 1-6 mukainen mene-25 telmä, tunnettu siitä, että immunogeeni on homogee- *Σ**ί nisessa muodossa ja sisältää vähintään 80% (paino/tila- :**]: vuus) rakenteellisesti vahingoittumatonta pC-polypeptidiä. ;1·,·
8. Jonkin patenttivaatimuksen 1-7 mukainen mene- • 1 .‘it telmä, tunnettu siitä, että pC-polypeptidi on 30 transformoidussa isäntäsolussa tuotettu yhdistelmäpolypep-tidi.
• · ... 9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että pC-polypeptidi sisältää oligo-nukleotidialukeparilla 5' ATG AAA AAG AAT ACA TTA AGT GCG 35 ATA TTA 3' ja 5' ATT AAG GTT TTT TTG GAG TTT CTG 3' poly- « i i I % < « I · < I · « I · · · • · · • » · « · 34 : 10733k! meraasiketjureaktiolla vahvistettavissa olevan DNA-sek-venssin koodaaman aminohapposekvenssin.
10. Jonkin patenttivaatimuksen 1-9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että immunogeeni on puh-5 distettu ioninvaihdolla. • · o· · • · ·· · • · f • · • t • · · • ( » • b • · · • · l • Ob • ; i ·:··: j | j • o · ] .... I <\ : 1 T I : .·. ] » « · I « < · < · « * · ! * · · * « | i i 107334
Applications Claiming Priority (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US72724591A | 1991-07-11 | 1991-07-11 | |
| US72724591 | 1991-07-11 | ||
| US82416192A | 1992-01-22 | 1992-01-22 | |
| US82416192 | 1992-01-22 | ||
| US07/903,580 US6221363B1 (en) | 1991-07-11 | 1992-06-25 | Vaccine for the prevention of lyme disease |
| US90358092 | 1992-06-25 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI923175A0 FI923175A0 (fi) | 1992-07-09 |
| FI923175A FI923175A (fi) | 1993-01-12 |
| FI107334B true FI107334B (fi) | 2001-07-13 |
Family
ID=27419096
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI923175A FI107334B (fi) | 1991-07-11 | 1992-07-09 | Menetelmä rokotteen valmistamiseksi Lymen taudin estämiseksi |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6221363B1 (fi) |
| EP (1) | EP0522560B2 (fi) |
| JP (1) | JP2611095B2 (fi) |
| AT (1) | ATE198489T1 (fi) |
| AU (1) | AU660178B2 (fi) |
| CA (1) | CA2073486C (fi) |
| CZ (1) | CZ280743B6 (fi) |
| DE (1) | DE69231619T3 (fi) |
| DK (1) | DK0522560T4 (fi) |
| ES (1) | ES2154633T3 (fi) |
| FI (1) | FI107334B (fi) |
| HR (1) | HRP950174B1 (fi) |
| HU (1) | HU219772B (fi) |
| MX (1) | MX9204078A (fi) |
| NO (1) | NO304546B1 (fi) |
| SI (1) | SI9200143B (fi) |
| SK (1) | SK279250B6 (fi) |
Families Citing this family (29)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6872550B1 (en) * | 1991-07-11 | 2005-03-29 | Baxter Vaccine Ag | Immunogenic formulation of OspC antigen vaccines for the prevention and treatment of lyme disease and recombinant methods for the preparation of such antigens |
| US6303129B1 (en) * | 1992-07-28 | 2001-10-16 | Rx Technologies | Production of borrelia burgdorferi vaccine, product produced thereby and method of use |
| EP0701612B1 (en) * | 1993-04-29 | 1998-01-21 | IMMUNO Aktiengesellschaft | IMMUNOGENIC FORMULATION OF OspC ANTIGEN VACCINES FOR THE PREVENTION AND TREATMENT OF LYME DISEASE AND RECOMBINANT METHODS FOR THE PREPARATION OF SUCH ANTIGENS |
| US6248562B1 (en) | 1993-11-01 | 2001-06-19 | Research Foundation State University Of New York | Chimeric proteins comprising borrelia polypeptides and uses therefor |
| US7008625B2 (en) | 1993-11-01 | 2006-03-07 | Research Foundation Of The State University Of New York | Recombinant constructs of Borrelia burgdorferi |
| CA2187535C (en) | 1994-04-11 | 2011-09-13 | Jon B. Korshus | Borrelia burgdorferi bacterin |
| US6087097A (en) * | 1994-05-12 | 2000-07-11 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | PCR detection of Borrelia burgdorferi |
| ZA964896B (en) * | 1995-06-07 | 1997-01-08 | Connaught Lab | Expression of lipoproteins |
| WO1997011093A2 (en) * | 1995-09-22 | 1997-03-27 | Connaught Laboratories Limited | Parainfluenza virus glycoproteins and vaccines |
| EP0880543A4 (en) * | 1995-10-26 | 2000-08-02 | Rhode Island Education | ANTIGENS AS VACCINE CANDIDATES FROM SPIROCHETE (BORRELIA BURGDORFERI) OF LIVE DISEASE INDUCED BY A SALT OF A TICK VECTOR (IXODES SCAPULARIS) |
| US6045804A (en) * | 1996-03-07 | 2000-04-04 | Mayo Foundation For Medical Educational Research | Method for detecting B. burgdorferi infection |
| US6716574B2 (en) | 1996-05-02 | 2004-04-06 | Dako A/S | Osp-C derived peptide fragments |
| US6969520B2 (en) * | 1997-10-20 | 2005-11-29 | Acambis Inc. | Active immunization against clostridium difficile disease |
| GB9811219D0 (en) * | 1998-05-26 | 1998-07-22 | Smithkline Beecham Biolog | Novel process |
| AU4654500A (en) * | 1999-04-21 | 2000-11-02 | Boston Medical Center Corporation | Prevention, diagnosis and treatment of lyme disease |
| ES2272296T3 (es) * | 1999-06-18 | 2007-05-01 | Research Foundation Of State University Of New York | Grupos de borrelia burgdorferi que producen la enfermedad de lyme en humanos. |
| DE60131982T2 (de) | 2000-08-18 | 2008-12-11 | Brookhaven Science Associates Llc | Veränderte borrelia burgdorferi ospa |
| US7442391B2 (en) | 2002-01-25 | 2008-10-28 | Integrated Botanical Technologies, Llc | Bioactive botanical cosmetic compositions and processes for their production |
| US8277852B2 (en) | 2002-01-25 | 2012-10-02 | Akzo Nobel Surface Chemistry Llc | Bioactive botanical cosmetic compositions and processes for their production |
| EP2491939B1 (en) | 2004-01-12 | 2017-09-20 | ISP Investments LLC | Bioactive compositions from theacea plants and processes for their production and use |
| CN101818840B (zh) | 2006-01-19 | 2013-05-29 | 东洋制罐株式会社 | 联结器以及燃料电池用的燃料盒 |
| KR101192127B1 (ko) | 2006-11-03 | 2012-10-17 | 쉐링-프라우 리미티드 | 개 라임병 백신 |
| US8293876B2 (en) | 2007-02-22 | 2012-10-23 | Baxter International Inc. | Method of purification of hydrophobic proteins |
| WO2009131665A1 (en) * | 2008-04-22 | 2009-10-29 | Research Foundation Of State University Of New York | Borrelia burgdorferi cell envelope protein array |
| JP2013511530A (ja) * | 2009-11-17 | 2013-04-04 | アバクシス， インコーポレイテッド | ライム病抗体の検出のためのペプチドおよび方法 |
| SI2699587T1 (sl) | 2011-04-22 | 2019-08-30 | Wyeth Llc | Sestavek, povezan z mutantskim clostridium difficile toksinom, in metode omenjenega sestavka |
| US8758772B2 (en) | 2011-11-04 | 2014-06-24 | Abaxis, Inc. | Peptides and methods for the detection of lyme disease antibodies |
| BR122016023101B1 (pt) | 2012-10-21 | 2022-03-22 | Pfizer Inc | Polipeptídeo, composição imunogênica que o compreende, bem como célula recombinante derivada de clostridium difficile |
| KR102451333B1 (ko) * | 2018-10-22 | 2022-10-06 | 주식회사 엘지화학 | 마이크로비드 및 그 제조방법 |
Family Cites Families (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK590288D0 (da) | 1988-10-24 | 1988-10-24 | Symbicom Ab | Kemiske forbindelser |
| US4603112A (en) * | 1981-12-24 | 1986-07-29 | Health Research, Incorporated | Modified vaccinia virus |
| US4767622A (en) * | 1983-08-19 | 1988-08-30 | University Of Illinois | Method and materials for development of immunological responses protective against malarial infection |
| US4601903A (en) * | 1985-05-01 | 1986-07-22 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Vaccine against Neisseria meningitidis Group B serotype 2 invasive disease |
| US4888276A (en) * | 1986-06-26 | 1989-12-19 | Minnesota Mining And Manufacturing Company | Method and composition for the diagnosis of Lyme disease |
| US4721617A (en) | 1986-08-14 | 1988-01-26 | Regents Of The University Of Minnesota | Vaccine against lyme disease |
| US5192540A (en) * | 1988-04-19 | 1993-03-09 | American Cyanamid Company | Haemophilus influenzae type b oxidized polysaccharide-outer membrane protein conjugate vaccine |
| DE3818013A1 (de) | 1988-05-27 | 1989-11-30 | Henkel Kgaa | Gewebeweichmachungsmittel |
| IT1223777B (it) * | 1988-08-18 | 1990-09-29 | Gevipi Ag | Rubinetto a due uscite con inversore a depressione |
| DE4015911A1 (de) * | 1989-09-19 | 1991-03-28 | Max Planck Gesellschaft | Impfstoff gegen die lyme-krankheit |
| DE3942728C1 (en) | 1989-12-22 | 1991-05-23 | Mikrogen Molekularbiologische Entwicklungs-Gmbh, 8000 Muenchen, De | New immunologically active proteins derived from Borelia burgdorferiensity polyethylene vessel and a high density polyethylene sealing cap - useful as vaccine and for quick accurate diagnosis of Borelia infections |
| AU7058691A (en) * | 1989-12-22 | 1991-07-24 | Mikrogen Molekularbiologische Entwicklungs-Gmbh | Immunologically active proteines from borrelia burgdorferi, related test kits and vaccine |
| WO1991013630A1 (en) | 1990-03-05 | 1991-09-19 | The United States Of America, Represented By The Secretary, United States Department Of Commerce | ANTIGENIC PROTEINS OF $i(BORRELIA BURGDORFERI) |
| ATE196425T1 (de) * | 1990-07-06 | 2000-10-15 | American Home Prod | Impfstoff gegen die lyme-krankheit |
-
1992
- 1992-06-25 US US07/903,580 patent/US6221363B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-07-01 AU AU19349/92A patent/AU660178B2/en not_active Ceased
- 1992-07-08 CA CA002073486A patent/CA2073486C/en not_active Expired - Fee Related
- 1992-07-09 DE DE69231619T patent/DE69231619T3/de not_active Expired - Fee Related
- 1992-07-09 ES ES92111713T patent/ES2154633T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1992-07-09 DK DK92111713T patent/DK0522560T4/da active
- 1992-07-09 FI FI923175A patent/FI107334B/fi not_active IP Right Cessation
- 1992-07-09 EP EP92111713A patent/EP0522560B2/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-07-09 AT AT92111713T patent/ATE198489T1/de not_active IP Right Cessation
- 1992-07-10 HU HU9202289A patent/HU219772B/hu not_active IP Right Cessation
- 1992-07-10 NO NO922746A patent/NO304546B1/no not_active IP Right Cessation
- 1992-07-10 JP JP4207392A patent/JP2611095B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1992-07-10 SI SI9200143A patent/SI9200143B/sl not_active IP Right Cessation
- 1992-07-10 MX MX9204078A patent/MX9204078A/es unknown
- 1992-07-10 SK SK2172-92A patent/SK279250B6/sk unknown
- 1992-07-10 CZ CS922172A patent/CZ280743B6/cs not_active IP Right Cessation
-
1993
- 1993-03-12 US US08/031,295 patent/US5530103A/en not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-03-30 HR HR950174A patent/HRP950174B1/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI107334B (fi) | Menetelmä rokotteen valmistamiseksi Lymen taudin estämiseksi | |
| EP0445135A1 (en) | BORRELIA BURGDORFERI FRACTIONS WITH IMMUNOGENIC ACTION. | |
| SI9011773A (sl) | Cepivo proti lajmski bolezni, postopek za pridobivanje tega cepiva, monoklonsko protitelo, antigen, rekombinantna DNA, rekombinanten vektor in postopek za pridobivanje antigena | |
| JPH06501382A (ja) | ライム病の予防および診断に用いる組成物および方法 | |
| US5807685A (en) | OspE, OspF, and S1 polypeptides in Borrelia burgdorferi | |
| DK2450054T3 (en) | New virulence factors of Streptococcus pneumoniae | |
| WO2002016422A2 (en) | Recombinant constructs of borrelia burgdorferi | |
| EP0500736B1 (en) | Recombinant vaccine for porcine pleuropneumonia | |
| KR0170752B1 (ko) | 혈호균속 인플루엔자용 백신과 진단검사법 | |
| US6015889A (en) | Protein rib, a cell surface protein that confers immunity to many strains of the group B streptococcus: process for purification of the protein, reagent kit and pharmaceutical composition | |
| ES2203704T3 (es) | Proteinas de membrana de leptospira. | |
| AU771376B2 (en) | Lawsonia derived gene and related FlgE polypeptides, peptides and proteins and their uses | |
| AU750792B2 (en) | 76 kDa, 32 kDa, and 50 kDa helicobacter polypeptides and corresponding polynucleotide molecules | |
| RU2102081C1 (ru) | Иммуногенная композиция против боррелиоза лайма, способ иммунизации млекопитающего против боррелиоза лайма, способ получения белка pc borrelia burgdorferi, диагностический агент для обнаружения b.burgdorferi и способ обнаружения антител к b.burgdorferi | |
| CA2399276A1 (en) | Novel therapeutic compositions for treating infection by lawsonia spp | |
| US6716591B1 (en) | B. burgdorferi polypeptides | |
| JP2000510339A (ja) | インビボで発現されるＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉポリペプチド | |
| CA2592156A1 (en) | Vaccines against neisseria meningitidis | |
| CA2239226A1 (en) | Transferrin binding proteins of pasteurella haemolytica and vaccines containing same | |
| CA2634911A1 (en) | Neisseria meningitidis vaccines and their use |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MA | Patent expired |