SI9011773A

SI9011773A - Cepivo proti lajmski bolezni, postopek za pridobivanje tega cepiva, monoklonsko protitelo, antigen, rekombinantna DNA, rekombinanten vektor in postopek za pridobivanje antigena

Info

Publication number: SI9011773A
Application number: SI9011773A
Authority: SI
Inventors: M. Markus Simon; E. Ulrich Schaible; Klaus Eichmann; Michael Kramer; Wallich Reinhard
Original assignee: Max-Planck-Gesellschaft Zur Foerderung Der Wissenschaften E.V.; Deutsches Krebsforschungszentrum
Priority date: 1989-09-19
Filing date: 1990-09-18
Publication date: 1998-04-30
Also published as: EP0861664A2; NO20014624D0; ES2129551T3; HU211228A9; DE59010903D1; HRP940545A2; IE903377A1; JPH03209400A; KR910005889A; PT95349B; DE4015911A1; DE59010863D1; DE59010888D1; PL170229B1; NO315905B1; JP2001069969A; HU905816D0; DK0633028T3; KR100205462B1; EP0633313A1

Abstract

Izum se nanaša na pasivno cepivo proti lajmski bolezni, ki vsebuje enega ali več monoklonskih protiteles, specifičnih za 31 kD antigen (OspA) ali/in 34 kD antigen (OspB) B.burgdorferi, ter v poskusnih živalih s pomankljivo imunostjo, ki smo jih inficirali z vitalnimi patogenimi organizmi B. burgdorferi, preprečimo izoblikovanje artritisa, pankarditisa in hepatitisa. Izum se nadalje nanaša tudi na postopek za pridobivanje cepiva v smislu izuma, na hibridomske celične linije ECACC 89 09 1302, ECACC 90050405, ECACC 90050406 in ECACC 90050407, ki izločajo protitelesa v smislu izuma, ter na patogeni B. burgdorferi, ki imunsko reagira s protitelesom v smislu izuma, postopek za pridobivanje antigenov v smislu izuma, kot tudi aktivnih cepiv proti lajmski bolezni, ki vsebujejo antigen v smislu izuma kot bistveno sestavino. Izum se nanaša končno na postopek za izolacijo in ponovno kultiviranje patogenih B. burgdorferi iz poskusnih živali s pomankljivo imunostjo.ŕ

Description

1. MAX-PLANCK-GESELLSCHAFT zur Forderung der Wissenschaften e.V.

2. Deutsches Krebsforschungszentrum

Cepivo proti lajmski bolezni, postopek za pridobivanje tega cepiva, monoklonsko protitelo, antigen, rekombinantna DNA, rekombinanten vektor in postopek za pridobivanje antigena

Tehnično področje

Izum je s področja genske tehnologije. Nanaša se na cepivo proti lajmski bolezni, postopek za pridobivanje tega cepiva, monoklonsko protitelo, antigen, rekombinantno DNA rekombinanten vektor in postopek za pridobivanje antigena.

Stanje tehnike

Lajmska borelioza je najpogostejša infekcijska bolezen v zmernih širinah, ki jo prenašajo klopi. Izzove jo spiroheta Borrelia burgdorferi, ki se prenaša predvsem s klopi rodu Ixodes na človeka. Bolezen je kronična progresivna infekcija, ki napade številne organe kot kožo, centralni in periferni živčni sistem, srce, jetra, ledvice in muskuloskeletalni sistem. Ker je zanesljivo zdravljenje te bolezni s terapijo z antibiotiki težavno, si dandanes močno prizadevajo, da bi raziskovali povzročitelja samega in imunski odgovor gostitelja na infekcijo z B.burgdorferi. Pri osebah, prizadetih z lajmsko boleznijo, sicer ugotavljajo visok titer protiteles proti B.burgdorferi, kar pa ne izzove nobene zaščite pred infekcijo. Domnevajo, da povzročitelj zelo hitro prehaja iz krvne poti v tkivo in ga imunski sistem tam ne more več neposredno doseči. To pa bi pomenilo, da je zaščita s protitelesi možna samo neposredno po pričetku infekcije, torej, dokler se povzročitelji še nahajajo v krvnem obtoku.

Dejstvo, da so našli naravno infekcijo z B. burgdorferi v različnih živalskih vrstah, je vodilo do poskusa, da bi vzpostavili laboratorijske modele za lajmsko bolezen. To se je z omejenim uspehom tudi posrečilo. Tako so ugotovili pri poskusih, s katerimi so nameravali inducirati pri miši imunski odgovor, specifičen za B. burgdorferi, da je infekcija bližnje sorodnih (inbred) mišjih rodov z dolgotrajno kultiviranim izolatom B.

-2.burgdorferi, vodila do zmernih, vendar signifikantnih patomorfoloških sprememb v različnih organih kot možganih, srcu, pljučih in ledvicah, ki so bili primerljivi z onimi, ki se jih opaža pri pacientih z lajmsko boleznijo (Schaible et al., (1988) Infect. Immun. 1,41). Izoblikovanje resnejše bolezenske slike pri živalih prepreči domnevno bodisi imunski odgovor gostitelja in/ali reducirana virulenca spirohet, dalj časa kultiviranih in vitro (Johnson et al., (1984), J. Ciin. Microbiol. 20, 747; Schwan et al., (1988), Infect. and Immun. 56, 1837). Predloženi izum se nanaša na pridobivanje nove vakcine proti lajmski bolezni in to je zagotovljeno s pripravo monoklonskih protiteles, ki identificirajo nove antigene. Pri izdelavi vakcine, lahko uporabimo monoklonska protitelesa, da povzročimo pasivno imunost ali lahko uporabimo nove antigene, da zvišamo aktivni imunski odziv. Predloženi izum nadalje zagotavlja rekombinantne DNA molekule in vektorje, ki omogočajo, da se proizvajajo novi antigeni v komercialnem merilu. Nasprotno stanje tehnike ne navaja priprave vakcine, osnovane na katerikoli podenoti organizma, ki povzroča lajmsko bolezen niti priprave monoklonskega protitelesa, ki bi ga lahko uporabili pri pasivni imunizaciji. Pred predloženim izumom je bila edina vakcina proti tej bolezni osnovana na uporabi celotnih uničenih bakterij. Kot je zgoraj navedeno je to popolnoma v nasprotju s stanjem predloženega izuma, ki zagotavlja uporabo podenot bakterij.

Tehnični problem

Izum sloni na nalogi, nuditi učinkovito cepivo proti lajmski bolezni. Pri tem je najprej potreben razvoj primernega živalskega laboratorijskega modela. Sedaj predlagamo, da kot poskusna žival lahko rabi rod miši brez funkcijsko sposobnih T- in B- celic, Scid-miš (Bosma et al., (1983) Nature 10, 52), ker Scid-miši pri infekciji s patogenim izolatom B. burgdorferi razvijejo multi sistemsko bolezen in sicer v glavnem poliartritis in karditis. Šele s tem živalskim modelom je možno preizkusiti učinek cepiv proti lajmski bolezni.

Opis rešitve tehničnega problema

Predmet izuma je pasivno cepivo proti lajmski bolezni, ki vsebuje enega ali več specifičnih monoklonskih protiteles za 31kD antigen (OspA) in/ali 34 kD antigen (OspB) B. burgdorferi, zlasti OspA in/ali OspB B. burgorferi, rodov B31 (ATCC 35210) in/ali ZS7 (DSM 5527). Prednostno je cepivo, ki vsebuje protitelo iz razreda

IgG, zlasti prednostno iz podrazreda IgG2B ali IgGl, v smislu izuma. Dajanje protitelesa v smislu izuma izzove presentljivo v nasprotju z dajanjem nekega drugega protitelesa, naprimer proti 41 kD površinskemu antigenu B. burgodrferi (Flagelin) pri imundeficientnih poskusnih živalih, zlasti Scid-miših, ki so bile inficirane z življensko sposobnimi patogenimi B. burgdorferi, prednostno B. burgdorferi ZS7, da je izoblikovanje artritisa, karditisa in hepatitisa popolnoma ali vsaj pretežno preprečeno.

V danem primeru lahko cepivo v smislu izuma vsebuje s protitelesom kot učinkovino še običajne nosilce, polnila in pomožne snovi.

Nadalje obsega izum tudi postopek za pridobivanje pasivnega cepiva proti lajmski bolezni iz limfocitov ali vraničnih celic poskusne živali, prednostno miši, imunizirane z organizmi B. burgdorferi ali njihovimi deli, prednostno s popolnimi organizmi B. burgdorferi B31 in/ali ZS7, pri čemer iz limfocitov ali vraničnih celic imunizirane živali pridobimo s celično fuzijo hibridom, ki proizvaja monoklonsko protitelo v smislu izuma.

Predmet izuma je torej tudi hibridomska celična linija (ECACC 89 091302), ki proizvaja protitelo LA-2 proti OspA (IgG2b) v smislu izuma. Nadalje je predmet izuma tudi hibridomska celična linija ECACC 90050406, ki proizvaja protitelo LA-26.1 proti OspA (IgGl), kot tudi hibridomska celična linija ECACC 90050405 oziroma ECACC 90050407, ki proizvajata protitelesi LA-25.1 oziroma LA-27.1 proti OspB (IgG2b oziroma IgGl).

Prav tako obsega izum patogeni B. burgdorferi-soj ZS7 (DSM 5527).

Predmet izuma je nadalje antigen, ki imuno reagira z monoklonskim protitelesom v smislu izuma. S tem razumemo antigen, ki vsebuje celotno aminokislinsko cekvenco OspA oziroma OspB ali tudi samo eno imunogensko učinkovito delno sekvenco (imunogeni epitop) OspA oziroma OspB. Potencialno imunogene epitope teh proteinov lahko strokovnjak brez težav ugotovi s strukturno analizo OspA-proteina (naprimer Chou-Fassmannova analiza) in nato eksperimentalno testirana učinkovitost.

-kPredmet izuma je tudi zlasti rekobinanten antigen, ki imuno reagira s proti telesom v smislu izuma, pri čemer se DNA-sekvenca, ki kodira za antigen, nahaja na rekombinantnem vektorju, prednostno prokariontskem vektorju, ki je primeren za izražanje proteina.

Predmet izuma je zlasti antigen iz B. burgdorferi ZS7, ki specifično imuno reagira s protitelesom v smislu izuma ter vsebuje na sliki 1 prikazano aminokislinsko sekvenco ali imunogen epitop iz te sekvence. Po tem takem se izum nanaša tudi na rekombinantno DNA, ki vsebuje (1) na sliki 1 prikazano, (2) v okviru degeneracije genetske kode ustrezno sekvenco nukleinske kisline, ali (3) sekvenco, ki hibridizira s sekvenco iz (1) ali/in (2) pri ostrih pogojih hibridizirno sekvenco, ki kodira za 31 kD-antigen B. burgdorferi ZS7 ali za njen imunogen epitop. Pojem ostri hibridizirni pogoji je pri rem treba razumeri tako, kot v Maniatis et al., Molecular Cloning. Laboratory Manual (1982), Cold Spring Harbor Laboratory, New York.

Posebno prednosten je antigen v smislu izuma, ki je rekombinanten ne-fuzijski protein ali /3-galaktozidaza-fuzijski protein.

Nadalje obsega izum tudi rekombinanten vektor, ki vsebuje eno ali več kopij rekombinantne DNA v smislu izuma. Vektor v smislu izuma je lahko prokariontski ali/in evkariontski vektor, prednostno pa je prokariontski vektor. Rekombinantni vektor lahko nastopa ekstra kromosomalno v celici gostitelja (npr. plazmid), ali pa se lahko vključi (integrira) tudi v genom celice gostitelja (napr. bakteriofag lambda). Prednostno pa je vektor v smislu izuma plazmid. Posebno prednostno je rekombinanten vektor pZS-7/31-2 (DSM 5528).

Predmet izuma je tudi postopek za pridobivanje atigenov v smislu izuma s preiskavo genske banke B. burgdorferi z enim ali več protiteles v smislu izuma, pri čemer izoliramo klone, ki pokažejo z uporabljenimi protitelesi pozitivno imunsko reakcijo.

Ker se da antigen v smislu izuma tudi sam uporabiti za aktivno imunizacijo, to je za sproženje tvorbe protiteles v organizmu, obsega izum potemtakem tudi aktivno cepivo proti lajmski bolezni, ki vsebuje kot učinkovino antigen v smislu izuma, v danem primeru z običajnimi nosilnimi, polnilnimi in pomožnimi snovmi. Prednostna izvedbena oblika je, če pridobimo antigen v smislu izuma na gen tehnološki način.

V resnici se je dalo pokazati, da dajanje nativne oz. rekombinantne OspA v normalnih miših sproži tvorbo zaščitnih protiteles, ki po pasivnem prenosu v Scid-miši le te ščitijo pred lajmso boreliozo. Zlasti pa ugotavljamo, da rekombinantni OspA sproži zaščitni imunski odgovor, primerljiv z onim pri naravnem OspA, in za to predstavlja mnogo obetujoč kandidat za cepivo proti lajmski boreliozi pri človeku.

Predmet izuma je nadalje postopek za pridobivanje pasivnega cepiva proti lajmski bolezni, pri katerem poskusne živali, prednosto miši, imuniziramo z antigenom v smislu izuma in iz imunizirane poskusne živali na običajen način pridobimo zaščitna, poliklonska ali monoklonska protitelesa.

Končno obsega izum še postopek za izolacijo in rekultiviranje patogenih organizmov B. burgdorferi, ki je označen s tem, da iz imuno deficientnih poskusnih živali, prednostno miši, katere smo predhodno inficirali s povzročiteljem, pridobimo povzročitelja, pri čemer ostane patogenost povzročitelja ohranjena. Posebno prednosten je postopek, pri katerem pridobimo patogene organizme B. burgdorferi ZS7 (DSM 5527) iz krvi ali/in sklepov inficiranih Scid-miši.

Izum pojasnujemo z naslednjimi primeri in slikami 1 in 2.

Pri tem kažeta:

slika 1 DNA - in aminokislinsko sekvenco 31 kD antigena (OspA) iz B.

burgdorferi ZS7, slika 2 imunološko karakterizacijo rekombinantnega proteina rZS7/31-2.

Primer 1

Induciranje artritisa, karditisa in hepatitisa v Scid-miših z infekcijo z B. burgdorferi sojem ZS7

Obdelava miši z B. burgdorferi

Odraslim mišim rodov C.B-17 Scid (homozigot za Scid-mutacijo) in C.B-17 smo inicirali 1χ10₅, 5xl0⁵, lxlO⁶ ali ΙχΙΟ⁸ za preživetje sposobnih ali usmrčenih (UVobsevanje) organizmov B. burgdorferi subkutano v repni koren.

Izolacija B. burgdorferi iz klopov in miši

Preiskave smo izvedli na že dolgo kultiviranem B. burgdorferi soju B31 (ATCC 35210) in svežem izolatu B. burgdorferi ZS7 (DSM 5527), izoliranim iz samice klopa Ixodes rizinus. Vse B. burgdorferi soje smo kultivirali v modificiranem Kelly’s mediju (Barbour et al., (1983) Switzerland. Curr. Microbiol. 8, 123). B. burgdorferi organizme, ki smo jih pridobili iz srednjega črevesa klopov, steriliziranih z etanolom, ali iz krvi inficiranih miši smo najprej kultivirali v Kelly’s mediju ob dodatku 8 μ-g/ml Kanamicina in 230 p-g/ml Fluoruracila (Johnson et.al., (1984) J. Ciin. Microbiol. 1, 81.).

Serološki testi

Detekcijo B. burgdorferi specifičnih protiteles smo izvedli po konvencionalnem ELISA-postopku, (Justus et al., (1988) Wehrmed. Mschr. 32, 263). Standardno krivuljo za vsebnost imunglobulina (Ig) smo dobili s preslojenjem skledice z antimišjim Ig (1:500 razredčina serumske raztopine Paesel, Frankfurt, ZRN) in titracijo celokupne vsebnosti mišjega IgG ali IgM (Calbiochem., LaJolla, ZDA) celokupni serum IgM in IgG smo izmerili podobno. Koncentracija B. burgdorferi specifičnih IgM ali IgG protiteles je navedena v mikrogramih Ig/ml seruma.

-9'

Imunflorescenca in Giemsa-obarvanje μ\ krvi smo pipetirali v hepatokritno epruvetko (Becton in Dickinson, Heidelberg, ZRN) in pri tem centrifugirali s 5000 g v hematokritni centrifugi (ECCO, ZRN). Epruvetke smo prerezali na vmesni fazi med serumom in eritrociti ter 5 μ.1 seruma nanesli na objektni nosilec (Superior, Bad Mergentheim, ZRN). S serumskimi vzorci obložene objektne nosilce smo sušili na zraku ter fiksirali v 100% etanolu eno minuto pri -20°C. Po enourni inkubaciji s kunčjim hiperimun serumom anti B. burgdorferi (1:100 razredčina) pri sobni temperaturi, smo objektne nosilce pet krat izprali v PBS ter nato eno uro barvali s FITC konjugiranim kozjim-antikunčjim-antiserumom (1:20 razredčina, Jackson Lab., West Grove, ZDA) objektne nosilce smo isprali ter vklopili v Kaiser glicerin-želatino (Merck, Darmstadt, ZRN) ter takoj fluorescenčno mikroskopsko preiskali. Neobdelane kapljice krvi smo sušili na zraku, fiksirali v metanolu, obarvali po Giemsa (0,1% Merck, Darmstadt, ZRN), razbarvali v PBS ter vgradili v Entellam (Merck, Darmstadt, ZRN).

Histološke priprave in barvanja postopki

Različne notranje organe (možgane, srce, pljuča, jetra, ledvice, vranico in sklepe) miši, predhodno inficiranih z B. burgdorferi, smo odstranili v različnih razdobjih po infekciji in shranili bodisi v tekočem dušiku za pripravo kriostatskih rezin, ali v 5% formaldehidu (v PBS) za vklopitev v parafin ali metakrilat. Pripravili smo rezine z 4 do 7 μτη jih obarvali s hematoksilin-eozinom in vklopili v Entellan (Merk AG, Darmstadt, ZRN). Izvedli smo imunohistologijo ob uporabi sistema strept-avidinbiotin-perioksidaze (Kramer et al., (1989) Eur. J. Immunol. 19, 151). Tabela 1 kaže, da se da B. burgdorferi organizme izolatov ZS7 in B31 dokazati v celotnem poskusnem razdobju v krvi Scid-miši, ki so bile predhodno cepljene z življensko sposobnimi organizmi. Vsekakor pa se je dalo ponovno kultivirati in vitro samo spirohete Soja ZS7, ampak nobenega soja B31. Pri primerjavi ponovno kultiviranih organizmov s primarnim izolatom B. burgdorferi ZS7 nismo mogli ugotoviti nobenih sprememb vsebnosti proteinov ali plazmidnega profila. Dokazati nismo mogli nobenega ali pa skrajno neznatne titre irelevantnih protiteles v Scid-miših, inficiranih z B. Burgdorferi, med celotnim trajanjem opazovanja. V teh živalih nismo našli nobenih IgM- ali IgG- protiteles, specifičnih za B. burgdorferi (tabela 1). Nasprotno pa so izražale vse C. Β-17-kontrolne miši, ki so bile inficirane z B. burgdorferi, velike množine celokupnega Ig in povišane titre za IgM- in IgG protitelesa, specifična za B. burgdorferi. Sedem do dvajset dni po infekciji z B.burgdorferi ZS7 so pokazale Scid-miši prve klinične simptome artritisa (pordečitev in otekanje obeh tibiotarzalnih sklepov), ki so se sčasoma povečevali. Nasprotno pa nismo našli nobenih simptomov artritisa na Scid-miših, ki so bile inficirane bodisi z UV-obsevanimi B. burgdorferi ZS7 ali z življensko sposobnimi B. burgdorferi B31 organizmi, ter pri C.B-17-kontrolnih miših, ki so bile inficirane z življensko sposobnimi B. burgdorferi ZS7 organizmi.

Tudi histopatološko smo dokazali artitične spremembe sklepov pri Scid-miših, inficiranih z življensko sposobnimi B. burgdorferi ZS7 (tabela 1). Ugotovili smo teške poškodbe sklepov, značilne po prisotnosti hiperplastično vnetih sinovialnih ovojnih celicah, povezanih z erozijo in uničenjem hrustančnega tkiva in/ali kosti. Nadalje smo ugotovili pankarditis z infiltracijo mononuklearnih celic v endokardij, miokardij ter perikardij. Prav tako smo ugotovili progresivno vnetje jeter, pri čemer smo opazili infiltracijo mononukleranih celic, ki je bila omejena na področje vena portae in na centralno veno, granulomatozne reakcije in končno pojav jetrne fibroze. Dodatno smo ugotovili neznatnejše poškodbe ledvic, pljuč, možgan in progastega mišičja. * χ» > .1 1..

9. p: ~:

I I I sOTf I I in σι ii c

I I I oo KO I Μ Ο μ· η •Η h

Φ

ΜΊ

Μ

Ο

Ό

Μ

Λ ¥

;Φ ο

.Ρ to <

KI

Ti

Tj·

Ol

o

r-l

KO KO

CO

Tj· r- B

1

>

* b-

1 r— xr

Ό

O*

O

in

>

CJ

OJ

οι σι

o

m o·

•

K)

n* ko

Ch

O)

m

σι

o

m

·-

Λ

m

>

•

Ol

•

»

m

KO

m

r—1

4)

C

¹ H

m

Tj· KO

CO

•

1

1 1

t

1 . 1

1

»

» Ό

1 1 Tj·

Tj·

o

r-l

<M

m

Wl

r-l

n

ΓΜ

K

m ΟΙ ¢3 c

J ω

ra

Η

ra	Φ		1
	•o		o
n	β		p
	rt		n
•H >ra •p	> o Λ! •P	n •P +> __I	•H 32 O*
a χ:	<P ',O	•H P χ;	1 •P
•P	N	P i .	β
β p—1	•H	M	•P r-l
0	C		Istf
P	•H

C	n
o	Φ
Λί	rp		1

£Χ>—I β ' >Ο '

4)

Χ>

•Η

-Ρ

Ο

Ρ

Ο.

Ρ <υ

-Ρ •Η

-Ρ

-Η

Ρ φ

κρ ρ

ο

Ό

Ο

Ρ

Λ (0 . r—I Λ ο r~> ν.ή Η ο

Λ ο + + +·» + + + +CC+.I + + ++ +♦ + +♦ + ♦ to oo m + + + ffl +

ο · · '•Χ XI J3 ♦ ο ra · · + + c c ►

Ρ λ:

<ο •ο •Ρ

Ο rt (Ρ ο

Ν >Μ •Η a

ι

Ό •Η w

<ϋ >

•Η λ;

\ρ

Ν •Ρ

-Ρ α>

χ:

ο

Ρ •Ρ

Ο.

η.

<ο rt Ό •Η Ή Ο Ο.

Φ <ρ C •Η

Ρ φ

4-1

Ρ ο

Ό σ

ρ λ

I >

·Ρ φ « >

ρ-^ρ Φ ·Η μ α ο ι

. φ •P β η-, > Ή <0 Ο G Ο Λί Q Ο,

I φ ο <Ρ κο σι σι κ-ΓΩ rj σκ rm tj· m οι ra οι co ό ό m σι οι σι •β ο* I .- — <\ιΟ1Ο1ΟΙ.τΟΙ ο

ο c

φ ο

η • Φ t α·

I« >

Φ

-Ρ α

Ή ιθ Ό τΡ Η ·_χp ο m ai;

£Κ «Ο ο

eo

Ο

ΙΛ Ό CQ (Ο 00 Ο Ο Ο ο Ο Η Η Η «- Η 8 8 8x8

Ο •Ρ Φ

Γ-) Ό (0 C rt «» >—Ι

Ο

Ν

		O~	O»	θ'	r»	*.«P	0»
•		ra	w	W	W	> m	w
ra	o	N	N	CS)	N	3 ra	1 1 N
	O					o·
	CO					W
			-			N

rt.

c >

ο c

ο ra >η *Ρ ο a <Ζ)

I Ό «Ρ

Λ-Ρ II • O c

OV9 —

I 0> m ιι ♦ c ο — m 8 rt g Φ Β S -P 3 O P O Q> O cco q,-H B > c s-s > >o

Š$n •s IL· o t>3 0-»y ·· I + o o o ~70~

Primer 2

Učinek monoklonskega protitelesa, specifičnega za B. burgdorferi 31kD antigen, na potek lajmske borelioze pri Scid-miših

Priprava monoklonskega protitelesa

Pri imunizaciji miši, ki ima intakten imunski sistem, z organizmi B. burgdorferi, se izražajo poliklonska protitelesa, specifična za B. burgdorferi (glej tabelo 1).

Deset tednov stare samice miši iz bližnjega sorodniškega soja (inbred) BALB/c smo imunizirali z borelijami, homogeniziranimi z ultrazvokom (B. burgdorferi, soj B31; ATCC 35 210).

Imunizacijski protokol :

Dan 0 : 200 jctg borelijskega antigena v popolnem Freundovem adjuvansu, subkutano Dan 21, 35, 49, 63 : izzvanje reakcije i.p. s 100 μ-g borelijskega anitgena v slanici, zapufrani s fosfatom *

Dan 66 : odvzem vranice in priprava enocelične suspenzije.

imune vranične celice smo fuzionirali z Ag8-PAI mielomsko celično linijo po standardnih metodah ob uporabi polietilen glikola (J. H. Peters, H. Baumgarten, M. Schulze Monoklonale Antikorper Springer-Verlag, Heidelberg).

Fuzijske produkte smo zasejali v 96 jamic v ploščah iz tkivne kulture. Po osmih dneh smo pregledali supernatante celičnih kultur glede na prisotnost monoklonskih protiteles, specifičnih za B. burgdorferi, s pomočjo ELISA-trdne faze (J. H. Peters et al., s.o.).

Hibridomske celice iz kultur, ki proizvajajo protitelo, kloniramo po metodi mejnih razredčin. Supernatante kultur individualnih klonov zatem ponovno karakteriziramo v ELISA-trdni fazi kot tudi z Western-Blot analizo in z imuno fluorescenčnimi preiskavami. Monoklonsko protitelo LA-2 podrazreda IgG2b proizvaja in secernira monoklomska hibridomska linija ter reagira pri Western-Blot s strukturo 31kDa (Osp-A) vseh pregledanih sojev B. burgdorferi (med drugim izolatov ZS7 in B31), pri

-AAstiku s B-burgdorferi proteini, odločenimi elektroforetsko preko SDS gela ter prenešenimi s pomočjo Westren-Blot na membrano. Monoklonska protitelesa LA26.1C (anti-OspA IgGl), LA 25.1 (anti-OspB (34 kDa antigen); IgG2b) in LA 27.1 (anti-OspB (34 kDa antigen), IgGl) smo pripravili in karakterizirali na analogen način.

Infekcija miši z B. burgdorferi ZS7

C.B-17 Scid-miši smo subkutano inficirali v repni koren z ΙΟχΙΟ⁸ vitalnimi B. burgdorferi ZS7 organizmi.

Obdelava miši z antiserumi

Inficirane Scid-miši smo dvakrat tedensko obdelali z različnimi antiserumi. Eno skupino smo obdelali z NMS (normalni mišji serum), drugo skupino z IMS (imuni mišji serum) in tretjo skupino z monoklonskim protitelesom LA-2 (proti 31 kD antigenu B. burgdorferi). Doza dajanih antiserumov je znašala prvi teden 100/tl oz. 100 jug pri LA-2, drugi teden 200 /tl oz. 200 /tg pri LA-2 in tretji teden 300 /tl oz. 300 /tg pri LA-2.

Tabela 2 pokaže, da neobdelane ali z NMS obdelane Scid-miši pokažejo po 12 dneh klinične in histopatološke znake artritisa oz. karditisa ter hepatitisa. Nasprotno pa dajanje monokionskega protitelesa LA-2 pri Scid-miših izove razločno zmanjšanje simptomov. Klinično se je dalo ugotoviti le neznatne pordečitve sklepov ter histopatološko le obrobne spremembe. Miši obdelane z IMS, niso kazale nobenih kliničnih znakov artritisa.

Dokaz povzročitelja B. burgdorferi z in vitro gojenjem se je posrečil le pri miših, ki so bile bodisi neobdelane ali obdelane z NMS. Pri miših obdelanih z LA-2 ali IMS, se B. burgdorferi ni dalo dokazati (tabela 2).* ο ο

ώ	P
3	3
B	tr
O O	3 3
σ	V
3	0
o	3
xr	O.
3	Φ
3	O<
.1	P
co.	c*
x>	Φ
3 Φ S Φ	£
B	P
er	Φ
3	X) 3

a 3 3 η ιι η ιι ω υ ω ω

Ω ίο ω

ο

Ο.

-J B

P

Μ Μ<

Ο Η·

Ρ£Χ

P H	Z 1	φ
> S	s	3
ι ω	ω	c
KJ		B

<

Ν

I» Ο 3 σ <Τ ο. P Φ to P

X Ρ “Ο

Ρ Ο £»

3

P C+

Ο< 3 >_»' Ρ

Ο μ rr σ 3 ο.

Ο Ρ 3

P C0 Φ

Ο «+ 3· + + tfl< Ο ;

χ··σ Ο 3

/.*ea »«,

P X	X	ρς
O P	Φ	3
ω<ω	Ό	3
K Ct	3	O.
-O O	rF	P·
3	P	P
3	«r	ρ-
er	P	ω
O	CO

l·

CD

<	—
N	Ω.
	O
o	x
Cj*	3 .
O	N

tr c

K iO

Φ

H

Pο σ

ο.

φ

Ρ

Ω ω

Ρ ω

Ω ρ· οι

Β ρω« ϊ' ι

Μ

Ρ tt ρω φ

C

S

ΡCD

Μ r· >

tsj

Primer 3

Ekspresiisko kloniranje 31kD antigena (OspA) B. burgdorferi ZS7

Priprava DNA

Visoko molekulsko DNA iz B. burgdorferi soja ZS7 smo očistili po gojenju v modificiranem Kelly mediju. Spirohete smo peletirali s centrifugiranjem pri 10.000 g in trikrat izprali v PBS pufru. Sušene peletke smo ponovno suspendirali v 10 ml TE (10 mmol/1 Tris, 1 mmol/1 EDTA, pH 7,4), obdelovali 15 minut pri 30°C z lisocimom (5 mg/ml) ter sprostili DNA z dodatkom 1 ml 20% SDS. Po dodatku 1,5 ml NaCl (5 mol/1) smo raztopino ekstrahirali z enakim volumnom fenola, čemur je sledila ekstrakcija s kloroformom. DNA smo nato oborili z dodatkom dveh volumnov absolutnega etanola in inkubacijo pri -20°C preko noči. Po centrifugiranju smo ostanek raztopili v 0,5 ml TE ter inkubirali z DNAzo proste RNAze A (20 μ-g/ml) 45 minut pri 55°C, čemur je sledila enourna obdelava s proteinazo K (0,1 μ-g/ml) pri 37 °C. Raztopino smo nastavili na 0,3 mol/1 NaOAc ter ekstrahirali s fenolom-kloformom tako, kot je zgoraj opisano. Po obarjanju z etanolom smo DNA ponovno prevzeli v TE.

Priprava genske banke

Visoko molekulsko DNA smo tri sekunde statistično drobili z ultrazvočno obdelavo. T4-DNA-polimerazo (30 minut pri 37°C) in Klenow encim (5 minut pri 20°C) smo uporabili zato, da smo zgladili konce proizvedenih DNA-fragmetnov. DNA z gladkimi konci smo povezali na BamHI-mestu ekspresijskega vektorja pUEXl ob uporabi strategije adapterskega kloniranja (Brešan in Stanley (1987) Nucl. Acid. Res. str. 1056). S stopnjo selekcioniranja po velikosti s pomočjo kromatografije z molekulskim sitom preko Siphacryl S-1000 in s pretvorbo kompetentnih celic gostitelja E. coli (MC 1061) smo določili delež enot, ki tvorijo rekombinantni plak (pfu), kot sledi ; pobrali smo naključno izbrane kolonije ter jih gojili do nasičenja v 2 ml selekcijskega medija (LB s 25 μ-g/ml ampicelina). Plazmidno DNA smo izolirali po običajni metodi alkalnega liziranja in zatem rezali z BamHI. Nad 50% analiziranih plazmidov je dobilo povprečno > 1,5 kb dolge vključke DNA.

-AANanašanje na plošče in skrining B. burgdorferi ZS7-genske banke

Celice smo nanesli na 24x24 cm plošče z gostoto 7000 pfu na ploščo ter inkubirali preko noči pri 30°C. Po prenosu kolonij na filter iz nitroceluloze (NC) smo sprožili izražanje /3-glaktozidaze-fuzijskih proteinov z 2 urno inkubacijo pri 42°C. Filtre smo prenesli na Whatman 3MM-papir, ki je bil obdelan z 5% SDS, ter inkubirali z okoli 25 minut pri 95°C. Za tem smo proteine elektro-blotirali ob uporabi običajne aparature za pol suhi Western bloting. Po obdelavi NC-filtrov z DNAzo smo identificirali imun reaktivne klone z ekspresijskim skriningom ob uporabi monoklonskih protiteles. Nespecifična vezivna mesta na NC-filtrih smo nasitili s 4 urno inkubacijo pri sobni temperaturi s PBS, ki vsebuje 0,2% (masa na volumen) želatine in 3 mmol/1 NaN_y Zatem smo filtre inkubirali s supernatanti kulture anti-31 kD monoklonskega klona protitelesa LA-2 v teku 18 ur ob kontinuirnem stresanju. Po temeljitem ispiranju (PBS + 1% vol/vol Triton Χ-100; PBS + 0,5 mol/1 Na-klorida; PBS + 1 mol/1 Na-klorida; vsaka stopnja 10 minut) smo filtre inkubirali z 1:10.000 razredčino s peroksidazo markiranega F (ab)₂-pripravka kunčjih-anti-mišjih-IgG-protiteles za 1,5 ur pri sobni temperaturi ob kontinuirnem stresanju. Filtre smo ponovno isprali na zgoraj opisani način ter nato inkubirali z diaminobenzidinom kot peroksidaznim substratom. Od 10⁴ rekombinantnih pfu je 20 klonov reagiralo z monoklonskim protitelesom LA-2.

Sekvenčna analiza 31 kD antigena (OspA)

Vključeno DNA rekombinantnega klona E. coli s pozitivno reakcijo na protitelo z LA-2 smo izolirali na običajen način. DNA-vključek tega klona je vseboval ospA-gen, ki koodira za B. burgdorferi 31 kD antigen, v celotni dolžini. Plazmid, ki je vseboval vključek, smo označili s pZS-7/31-2 ter deponirali v smislu Budimpeštanske Konvencije pri DSM (pod številko DSM 5528).

Protein, ki ga proizvaja ta imun pozitivni klon, smo označili kot rZS7/31-2. Določili smo kodirno DNA-sekvenco ospA-gena. Skupaj z aminokislinsko sekvenco OspA proteina, izvedeno iz nje, je prikazana na sliki 1.

Iz slike 1 je razvidno, da 31 kD antigen B. burgdorferi ustreza proteinu z 273 aminokislinami.

Priprava nefuzijskih proteinov

a) Klon, ki izraža imun reaktivni protein rZS7/31-2, smo preko noči gojili pri 30°C v 10 ml LB z ampicilinom. 1 ml kulture smo vnesli v 100 ml selekcijskega medija ter pri 30°C gojili ob dobrem zračenju do gostote 8xl0⁷ celic/ml (A600=0,2). Izražanje rekombinantnega proteina smo dosegli s prenosom celic gostitelja na 42°C. Po ohlajenju in centrifugiranju smo celice isprali v STE pufru (10 mmol/1 Tris, 100 mmol/1 natrijevega klorida, 1 mmol/1 EDTA, pH 8,0) ter preostanek ponovno suspendirali v 0,6 ml Lysis pufra (25% saharoze, 50 mmol/1 Tris, pH 8,0). Po dodatku 150 μ\ lizocima (10 mg/ml) smo zmes inkubirali za 15 minut na ledu, čemur je sledila nadaljna inkubacija (15 minut na ledu) z 18 μ\ DNAze 1 (10 mg/ml) v prisotnosti 5 μ\ 1 mol/1 magnezijevega klorida. Končno smo dodali 250 μϊ 4x detergentne mešanice (1% Triton X 100, 0,5% Deoxiholata, 0,1 mol/1 NaCl, 10 mmol/1 Tris, pH 7,4) ter inkubirali za 5 minut na ledu. Po centrifugiranju smo preostanek dvakrat isprali s pufrom A (50 mmol/1 Tris, 50 mmol/1 NaCl, 1 mmol/1 EDTA, pH 8,0) ter ponovno suspendirali v 9 volumnih pufra A, ki vsebuje dodatno 8 M sečnine, ter eno uro inkubirali pri sobni temperaturi. Vzorec smo razredčili z 9 deli pufra B (50 mmol/1 KH^C^/K^HPO^ 50 mol/1 NaCl, 1 mmol/1 EDTA, pH 10,7) ter 30 minut mešali pri sobni temperaturi, pri čemer smo pH vrednost vzdrževali na 10,7 z dodajanjem KOH. Po nastavitvi vrednosti pH razstopine na 7,0 z dodatkom HC1 smo vzorec čez noč dializirali proti pufru A (pri 4°C) ter 10 minut centrifugirali pri 4°C in 10.000 obratih na minuto (obr/min) v SS34-rotorju. Vrhnji sloj, ki je vseboval rekombinantni protein, smo shranili pri -20°C.

b) Ker klon secernira izloča imun reaktivni protein rZS7/31-2 tudi v gojilni medij je možno čiščenje (afinitetna kromatografija) direktno iz vrhnjega sloja supernatanta kulture.

Priprava rekombinantnega OspA (ne-fuzijskega) proteina in afinitetnokromatografsko čiščenje

Rekombinantne proteine smo za tem afinitetno-kromatografsko očistili.

—λ(0—

V ta namen smo očiščena monoklonska protitelesa LA-2 kovalentno vezali na aktivirano Sepharozo-CL 4B. Dializirani sečninski ekstrakt z rekombinantnim proteinom smo adsorbirali na mišji IgG-Sepharoze CL4B ter za tem dali na kolono LA-2-Sepharoze CL 4B. Po intenzivnem ispiranju smo eluirali vezani rekombinantni protein z 0,1 mol/l glicina/HCl-0,1 mol/1 NaCl, pH 2,5. PH vrednost zbranih frakcij smo neutralizirali s takojšnim dodatkom 1/10 vol. 0,5 mol/1 K^HPO^ Protein vsebujoče frakcije smo koncentrirali in dializirali. S pomočjo SDS-poliakril amid gelne elektroforeze smo določili stopnjo očiščenja.

Imunološka karakterizacija rekombinantnega proteina rZS7/31-2

Rekombinantni protein rZS7/31-2 smo imunološko preiskali. Za primerjavo smo pritegnili rekombinantni protein rB31/41-9 (B. burgdorferi 41 kD površinski antigen).

Mikro titrirne plošče z ravnim dnom smo preslojili s sečninskimi ekstrakti rekombinantnih proteinov rZS7/31-2 in rB31/41-9 oz. sečninskim ekstraktom za gensko izražanje uporabljenega E. coli soja MC 1061. Nespecifična vezivna mesta smo blokirali z 0,2 želatine v raztopini kuhinjske soli, zapufrani z fosfatom. Vdolbine tako pripravljenih mikro titritnih plošč samo spravili v nastavek z navedenimi monoklonskimi protitelesi LA-2 (anti-31 kD, Osp-A), LA-1 (anti-41 kD, flagelin) oz. ACHT-2 (anti-aj-antikimotripsin).

Vezana monoklonska protitelesa smo pustili reagirati s proti-mišjimi imun globulini, specifičnimi za vrsto ter markiranimi s peroksidazo. Vezana, s peroksidazo markirana, proti telesa smo kvantificirali ob uporabi peroksidaznega substrata ortofenilen diamina. Absorpcijo pri 492 nm (A₄₉₂) smo določili direktno v mikro titrirni plošči s pomočjo avtomatiziranega ploščnega fotometra. Jakost absorpcije je merilo za množino vezanih monoklonskih protiteles.

Monoklonsko protitelo LA-2 reagira na specifičen način z rZS7/31-2 ne pa z MC 1061 oz. rB31/41-9. Kontrolna reakcija monoklonskega protitelesa LA-1 je specifična za rB31/41-9. Monoklonsko kontrolno protitelo ACHT-2 (negativna kontrola) ne kaže signifikantne reakcije na nobenega izmed proteinov.

-44Slika 2 kaže, da je antigeni epitop, ki ga na specifičen način razpozna monoklonsko protitelo LA-2, izražen v rekombinantnem proteinu rZS7/31-2, katerega smo klonirali iz genoma B. burgdorferi ZS7.

Primer 4

Primerjava protiteles, specifičnih za 31kD (OspA) oz. 34 kD antigen (OspB), s protitelesi, specifičnimi za 41 kD antigen (flagelin)

Monoklonski protitelesi LA-2 in LA-26.1 spoznata 31 kD antigen Osp A ter sta izotipa IgG2B oz. IgGl. Monoklonski protitelesi LA-25.1 in LA-27.1 spoznata 34 kD antigen OspB ter sta izo-tipa IgG2b oz. IgGl. Monoklonski protitelesi LA-10 in LA21 sta specifični za flagelen-asociran 41 kD periplazmatski protein B-burgdorferi ter sta izo-tipa IgG2b oz. IgGl. Vsa zgoraj navedena proti telesa smo dobili po postopku, opisanem v primeru 2. Pri tem poskusu je treba ugotoviti, ali povzroče tudi monoklonska protitelesa proti nekemu drugemu B. burgdorferi antigenu pri Scidmiših zaščito pred kliničnimi simptomi lajmske borelioze.

Poliklonski anti-B31-imun serum (IMS) smo odvzeli C57BL/6-mišim 91 dni po subkutani inokulaciji z ΙχΙΟ⁸ B. burgdorferi B31-organizmi. Poliklonski anti-ZS7 IMS smo odvzeli C57BL/6-mišim 68 dni po subkutani inokulaciji z ΙχΙΟ⁸ B. burgdorferi ZS7. Oba seruma sta vsebuvala 60 μ,g/m I specifičnih protiteles, kot so določena v ELISA-sistemu (Schaible et.al., J. Exp. Med. 170 (1989), 1427-1432). Serum iz normalne miši (NMS) smo odvzeli neinficiranim C57/BL/6-mišim.

V trenutku inokulacije in za tem v 4-dnevnih intervalih smo prenesli navedena protitelesa IMS, NMS ali PBS-pufer pasivno intra peritonealno v Scid-miši po naslednjem protokolu:

Dan Oin dan 3 : 100 μΐ,

Dan 7 in dan 10 : 200 μΐ,

Dan 13 in dan 17 : 300 μΐ.

Scid-miši, ki so bile obdelane bodisi z anti-ZS7IMS, anti-B31IMS ali z monoklonskim protitelesom LA-2, niso pokazale nobenih vidnih kliničnih simptomov artritisa, kar pomeni, da se ni pojavila rdečica in oteklina na tibioltarzalnih sklepih v teku 21 dni opazovanja. Prav tako se ni dalo ugotoviti nobenih simptomov karditisa in hepatitisa. Histopatološke preiskave niso pokazale nobenih sprememb sklepov, srca in jeter pri Scid-miših, ki so bile obdelane bodisi z anti-ZS7-IMS, anti-B31-IMS ali z monoklonskim protitelesom LA-2.

Tudi druga OspA specifična monoklonska protitelesa LA-26.1 izo-tipa IgGl kot tudi OspB specifična protitelesa LA-25.1 in LA-27.1 so bila sposobna, da olajšajo klinične simptome artritisa, karditisa in hepatitisa. Tukaj so se pokazale lahne patološke spremembe na pregledanih organih.

Nasprotno pa so pokazale Scid-miši, katerim smo bili dajali bodisi PBS-pufer, NMS ali monoklonska protitelesa proti flagelinu (LA-10 ali LA-21), klinične znake artritisa, patološke spremembe, značilne za neobdelane Scid-miši (tabela 3). Težavnost simptomov pri zadnje navedenih živalih je naraščala z daljšanjem razdobja po inokulaciji ter ni bila oslabljena med celotnim obdobjem opazovanja. Iz Scid-miši, ki so bile predhodno obdelane bodisi z anti-ZS7IMS ali s proti telesom LA-2, se ni dalo izolirati spirohet. Nasprotno pa je bil možen dokaz spirohet z imunflorescenco in z gojenjem iz krvi Scid-miši, ki so bile obdelane z PBS-pufrom, NMS ali z monoklonskimi protitelesi LA-25.1, LA-26.1, LA-27.1, LA-10 ali LA-21. * —4 3·

f)okaz B. burgdorferi z imunofluorescenco ni bil možen e> ’0 *O 3 ‘

C-i.

rt

B er

O n

m er

O p»

O co<

χ· rt ω

Ό rt

3' rt σ

rt

I

CU.

rt >

m rt

o.

rt

9» χo er

B

P» rt *o <

to a

cr

TS

T o

0Q

H rt

CL m

H· o

ω c»

X

P3 βΑ) rt

B &

χ· o<

g *· +

I rt §

er rt

N<

fr jmmiH χΐϋΐσιΗΟ » i • · · —- n ta ' „

Q M CJ _w g ‘'J*·® iskrmi

3,3 * χ· fr8

-et

O P P· rt rt

Umi-¹ w w σ p» σ

H- 1+ 1+ + + I I , _{+ +}

H· H- + + I | | + + *

1+ 1+ 1+ I + I I I + ₊* * *

B' P S 3 to H rt . , Cfl<

< I Cj.

Ϊ3Λ ° f? o 3 £· CL p. CL '

B<

P·

O σ a rt P* rt < rt N

Ό h
oi& CL O	►3
1
er	>
P- x
•σ ρ*	to
P-
rt 3	m
3 P-
er O<	c
3 3
P- P-	>
er
P-
B
rt Ό X	CJ
<3 rt p-
er 3 B
3 P- er

p·» o er 3 Ό P· cr rt B 3 er P- O er p> P· O B OP fr

2.

er ρω

Cj.

rt

-W

Primer 5

Učinek anti seruma iz miši, imuniziranih z OspA, na potek lajmske borelioze pri

Scid-miših

Pri tem poskusu se je dalo pokazati, da dajanje naravnega OspA (izoliranega iz B. burgdorferi ZS-7) ali rekombinantnega OspA (izoliranega iz bakterij E. coli, transformiranih z rekombinantnim plazmidom pZS-7/31-2 (DSM 5528)) pri normalnih miših (rod miši C57BL/6) sproži tvorbo zaščitnih poliklonskih protiteles. Če taka protitelesa dajemo Scid-mišim, dosežemo zaščito pred lajmsko boreliozo. Pri tem ugotavljamo, da rekombinantni OspA sproži protektiven imunski odgovor, ki se ga da primerjati z onim pri naravnem OspA. Rezultat in podrobnosti izvidbe tega poskusa sta navedena v tabeli 4.

Pridobivanje rekombinantnega OspA je navedeno v primeru 3.

Pridobivanje naravnega OspA kot tudi imunizacija miši z OspA, sta potekala kot sledi:

Obogatitev naravnega 31 kDa OspA

3,2xlO¹⁰ spirohet smo mešali 2 uri pri 4°C v 5 ml PBS/7,5 ml n-butanola v prisotnosti inhibitorjev proteaze (5 mmol/1 EDTA, 5 mmol/1 bentamidina in 0,5 mmol/1 PMSF) z magnetnim mešalom. Zatem centrifugiramo zmes 90 minut pri 10.000 obr/min pri 4°C v Sorvallovi centrifugi (rotor s fiksnim kotom). Vodno fazo, ki vsebuje površinske proteine, odvzamemo in tri krat isperemo s kloroformom.

Vsebnost proteina določimo z ekstinkcijo pri 280 nm oz. z BCA-testom.

Pri Silbergel oz. Westernblot z anti-B. burgdorferi kunčjim serumom smo ugotovili za soj ZS7 glavni trak v območju molekulske mase 31 kDa kot tudi šibke trakove pri 20, 34 in 65-68 kDa. Pripravek butanola/vode B. burgdorferi soja B31 je dal glavni trak pri 31 kDa, kot tudi šibke trakove pri 20 in 34 kDa.

-Μ

Imunizacija miši z naravnim in rekombinantnim OspA

C57BL6 oz. C.B-17 mišim smo 3x v razdobju 7 do 10 dni dajali 5 /ig (naravni OspA soja B31) oz. 10 /zg (naravni OspA soja ZS7, rekombinanten OspA soja ZS7) v 100 /zl adjuvansa (ABM3; Fa. Sebak, Aidenbach, ZRN) subkutano v repni koren. Najhitreje 3 tedne po zadnji imunizaciji smo lahko odvzeli za 3 do 4 mesece seruma. Vsebnost specifičnih protiteles določimo v ELISA-sistemu.

Nadaljni prenosi protiteles na dan o

T os (U □

p·

N

O <

to o

V. ....

< : . : it .n

p.........tj

T o

O (0

TJ

T

O ri

<	P* ri
3	(0
<i>	ri
TJ	(0
3	to
P·	P·
x	•
0	0
3	•
(0
3	z—X.

o o

-e

LO iV

3--.3		0	s
- - .	a<	•	ri
it *: ir.	C*	ta	to<
	(D	•	Ci.
σι ri	C	1	ri
	P·
	ri	-4	3
	O		O
		ca	a.
	3	o
	P·	p.
	to<	a

P·

(0	(0	ra	TJ	O
3	3	x»	ta	cr
«π-	ri	1	ca	a
ρ-	P-	iv		(0
				ri
ο	O		3	(B
to	to		(0	<
TJ	TJ		0)	(0
X»	>		(0
			ri	N
3	3		ri
<0	0>		<
X	3		3
O	0>		V>
3	<
cr	(0		x
•	3		O
			3
ri	ri		ri
2	S		3
Ca	ca		O

H

0) ' · f 1+

I I » + ' ' f + tj ra o 0>

N ct < Λ O O. C_i.

Λ) 3 C OJ · ri 3 3 v-' P·

LO rito (U

O	O	O	ri	ta • cr c	O O X OJ N
		-v	-s.	3
LO	iV	LO	ri	os CL 0 3 ri) (0 3 P·

P- G 3 O< ri

3 (0 (0 N X <

o ta

C_i. · «u cr 3 c ri- 3 3 Λ p. CL ri- O P- 3 tO »3 cu n

TJ ri 3 ri to TJ ca o o o o, m,

3 O<	ri
P· 3
to<ri P· 3-	►
fir - 3	ta
O ri 3	ra
3 O ril X	ra
p- ri 0 O ri 3	x»
3 to » χ·

p·

Claims

1. Postopek za pridobivanje cepiva proti lajmski bolezni iz limfocitov ali vraničnih celic poskusne živali, prednostno miši, ki je imunizirana z organizmi B. burgdorferi ali njihovimi deli, označen s tem, da iz limfocitov ali celične fuzije vraničnih celic pridobimo hibridom, ki proizvaja monoklonsko protitelo specifično za 31kD antigen (OspA) ali 34kD antigen (OspB) B. burgdorferi.

2. Postopek po zahtevku 1, označen s tem, da za imunizacijo uporabimo popolne organizme B. burgdorferi B31 ali/in ZS7.

3. Monoklonsko protitelo LA-2 proti OspA, ki ga izloča hibridomska celična linija ECACC 89 091302.

4. Monoklonsko protitelo LA 26.1 proti OspA, ki ga izloča hibridomska celična linija ECACC 90050406.

5. Monoklonsko protitelo LA 25.1 proti OspB, ki ga izloča hibridomska celična linija ECACC 90050405.

6. Monoklonsko protitelo LA 27.1 proti OspB, ki ga izloča hibridomska celična linija ECACC 90050407.

7. Patogenski B. burgdorferi soj ZS7, DSM 5527.

8. Antigen, označen s tem, da imunsko reagira s protitelesom proti OspA kot je definirano v zahtevku 1.

9. Antigen, označen s tem, da imunsko reagira s protitelesom proti OspB kot je definirano v zahtevku 1.

10. Antigen po zahtevku 8 ali 9, označen s tem, da se zanj kodirajoča sekvenca DNA nahaja na vektorju, prednostno prokarionskem vektorju, kije primeren za izražanje proteina.

11. Antigen po zahtevku 8 ali 10, označen s tem, da vsebuje naslednjo aminokis linsko sekvenco ali imunogen epitop iz te sekvence :

MKKYLLGIGLILALIACKQN

VSSLDEKNSVSVDLPGEMNV

LVSKEKNKDGKYDLIATVDK

LELKGTSDKNNGSGVLEGVK

ADKSKVKLT1SDDLGOTTLE

VFKEDGKTLVSKKVTSKDKS

STEEKF NEKGEVSEKIITRA

DGTRLEYTE1KSDGSGKAKE

KEGTVTLSKNISKSGEVSVE

LNDTDSSAATKKTAAWNSGT

STLT1TVNSKKTKDLVFTKE

NTITVQQYDSNGTKLEGSAV

EITKLDE1KNALK*

12. Antigen po enem izmed zahtevkov 8 do 11, označen s tem, da je fuzijski ali nefuzijski protein /3-galaktozidaze.

13. Rekombinantna DNA, označena s tem, da kodira za antigen po enem izmed zahtevkov 8, 10, 11 ali 12 ter vsebuje (1) v nadaljevanju prikazano sekvenco nukleinskih kislin, (2) sekvenco, ki ji ustreza v okviru degeneracije genetske kode, ali (3) sekvenco, ki hibridizira s sekvenco iz (1) ali/in (2) pri ostrih pogojih;

atgaaaaaatatttattgggaataggtctaatattagccttaatagcatgtaagcaaaat gttagcagccttgacgagaaaaacagcgtttcagtagatttgcctggtgaaatgaacgtt cttgtaagcaaagaaaaaaacaaagacggcaagtacgatctaattgcaacagtagacaag cttgagcttaaaggaacttctgataaaaacaatggatctggagtacttgaaggcgtaaaa gctgacaaaagtaaagtaaaattaacaatttctgacgatctaggtcaaaccacacttgaa gttttcaaagaagatggcaaaacactagtatcaaaaaaagtaacttccaaagacaagtca tcaacagaagaaaaattcaatgaaaaaggtgaagtatctgaaaaaataataacaagagca gacggaaccagacttgaatacacagaaattaaaagcgatggatctggaaaagctaaagag gttttaaaaagctatgttcttgaaggaactttaactgctgaaaaacaacattggtggtt aaagaaggaactgttactttaagcaaaaatatttcaaaatctggggaagtttcagttgaa cttaatgacactgacagtagtgctgctactaaaaaaactgcagcttggaattcaggcact tcaactttaacaattactgtaaacagtaaaaaaactaaagaccttgtgtttacaaaagaa aacacaattacagtacaacaatacgactcaaatggcaccaaattagaggggtcagcagtt