CZ284616B6 - Očkovací látka, antigen, kódová rekombinantní DNA pro tento antigen, rekombinantní vektor a způsob výroby antigenu - Google Patents
Očkovací látka, antigen, kódová rekombinantní DNA pro tento antigen, rekombinantní vektor a způsob výroby antigenu Download PDFInfo
- Publication number
- CZ284616B6 CZ284616B6 CZ95970A CZ97095A CZ284616B6 CZ 284616 B6 CZ284616 B6 CZ 284616B6 CZ 95970 A CZ95970 A CZ 95970A CZ 97095 A CZ97095 A CZ 97095A CZ 284616 B6 CZ284616 B6 CZ 284616B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- antigen
- monoclonal antibody
- burgdorferi
- ospa
- antibody specific
- Prior art date
Links
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims abstract description 55
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims abstract description 55
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims abstract description 55
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims abstract description 19
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 8
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 title claims description 7
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 title 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 title 1
- 241000589969 Borreliella burgdorferi Species 0.000 claims abstract description 40
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 17
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims abstract description 4
- 108700006640 OspA Proteins 0.000 claims description 34
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 25
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 19
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 15
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 8
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 7
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims description 5
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 claims description 3
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 claims description 2
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 claims description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims 2
- 239000002131 composite material Substances 0.000 claims 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 21
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 17
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 12
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 12
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 12
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 11
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 10
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 10
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 9
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 241000448699 Borrelia burgdorferi ZS7 Species 0.000 description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 7
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 6
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 6
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 5
- 210000001503 joint Anatomy 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000589970 Spirochaetales Species 0.000 description 4
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 4
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 4
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 241000238876 Acari Species 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000016604 Lyme disease Diseases 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 3
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 3
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 3
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 3
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 3
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 3
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 3
- 208000018937 joint inflammation Diseases 0.000 description 3
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 3
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010062746 Carditis Diseases 0.000 description 2
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 2
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- 241000238681 Ixodes Species 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 2
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 2
- 208000009525 Myocarditis Diseases 0.000 description 2
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 2
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 2
- WHLPIOPUASGRQN-UHFFFAOYSA-N butyl 2-methylprop-2-enoate;methyl 2-methylprop-2-enoate Chemical compound COC(=O)C(C)=C.CCCCOC(=O)C(C)=C WHLPIOPUASGRQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 238000005534 hematocrit Methods 0.000 description 2
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 2
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 2
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 208000021646 inflammation of heart layer Diseases 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 2
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 2
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 2
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 229940099789 ospa protein Drugs 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 2
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;hydron;chloride Chemical compound Cl.NCC(O)=O IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001552669 Adonis annua Species 0.000 description 1
- 108010039206 Biotinidase Proteins 0.000 description 1
- 102100026044 Biotinidase Human genes 0.000 description 1
- 241000589968 Borrelia Species 0.000 description 1
- 241000276440 Borrelia burgdorferi B31 Species 0.000 description 1
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241001288713 Escherichia coli MC1061 Species 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 108010040721 Flagellin Proteins 0.000 description 1
- GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N Fluorouracil Chemical compound FC1=CNC(=O)NC1=O GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010093031 Galactosidases Proteins 0.000 description 1
- 238000002738 Giemsa staining Methods 0.000 description 1
- 206010019668 Hepatic fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-M Methacrylate Chemical compound CC(=C)C([O-])=O CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 206010036030 Polyarthritis Diseases 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 240000000528 Ricinus communis Species 0.000 description 1
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 1
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 101000874347 Streptococcus agalactiae IgA FC receptor Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N [4-(4-hydrazinylphenyl)phenyl]hydrazine Chemical compound C1=CC(NN)=CC=C1C1=CC=C(NN)C=C1 SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- PXXJHWLDUBFPOL-UHFFFAOYSA-N benzamidine Chemical compound NC(=N)C1=CC=CC=C1 PXXJHWLDUBFPOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003541 chymotrypsin inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000012050 conventional carrier Substances 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 229940009976 deoxycholate Drugs 0.000 description 1
- KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N deoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 1
- 210000001174 endocardium Anatomy 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002949 fluorouracil Drugs 0.000 description 1
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 1
- 229960001269 glycine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 210000003128 head Anatomy 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 230000000521 hyperimmunizing effect Effects 0.000 description 1
- 206010020718 hyperplasia Diseases 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 208000018191 liver inflammation Diseases 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000003387 muscular Effects 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000004165 myocardium Anatomy 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 210000003516 pericardium Anatomy 0.000 description 1
- 210000001428 peripheral nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000030428 polyarticular arthritis Diseases 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 210000003240 portal vein Anatomy 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000009589 serological test Methods 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 210000003699 striated muscle Anatomy 0.000 description 1
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 208000016523 tick-borne infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 108020005087 unfolded proteins Proteins 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- 210000001835 viscera Anatomy 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/20—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Spirochaetales (O), e.g. Treponema, Leptospira
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
- C07K16/1203—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria
- C07K16/1207—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria from Spirochaetales (O), e.g. Treponema, Leptospira
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Řešení se týká očkovací látky proti boreliose, která jako účinnou složku obsahuje antigen, imunologicky reagující s monoklovální protilátkou, specifickou pro B. burgdorferi. Řešení se týká rovněž antigenu, který je složkou, podmiňující účinek této očkovací látky, ko'dové DNA pro tento antigen a rovněž rekombinantního vektoru, který takouvou DNA obsahuje. Součástí řešení je také způsob výroby uvedeného antigenu.ŕ
Description
Očkovací látka, antigen, kódová rekombinantni DNA pro tento antigen, rekombinantni vektor a způsob výroby antigenu
Oblast techniky
Vynález se týká očkovací látky, antigenu, kódové rekombinantni DNA pro tento antigen, rekombinantního vektoru a způsobu výroby antigenu.
Dosavadní stav techniky
Borreliose-Lyme je v současné době nejčastějším infekčním onemocněním, které se přenáší klíšťaty. Toto onemocnění je vyvoláváno spirochetou Borrelia burgdorferi, tento mikroorganismus se přenáší na člověka především klíšťaty kmene Ixodes. Onemocnění je chronická progresivní infekce, napadající řadu orgánů, jako jsou kůže, centrální a periferní nervový systém, srdce, játra, ledviny a svalový a kostní systém. Vzhledem k tomu, že dostatečná léčba tohoto onemocnění antibiotiky je obtížná, je v současné době prováděna celá řada výzkumů změnit a zvýšit imunologickou odpověď na infekci uvedeným mikroorganismem. U lidí s tímto onemocněním byl zjištěn vysoký titr protilátek proti B. burgdorferi, tato skutečnost však nebyla žádným ukazatelem ochrany proti infekci. Je pravděpodobné, že původce infekce přechází velmi rychle z krevních cest do tkání, kde již není pro imunologický systém bezprostředně dosažitelný. To znamená, že ochrana protilátky je možná pouze bezprostředně po začátku infekce, kdy mikroorganismus se nachází ještě v krevních cestách.
Skutečnost, že přirozená infekce B. burgdorferi byla nalezena u řady živočišných druhů, vedla k pokusům vytvořit laboratorní modely pro uvedené onemocnění, až dosud s omezeným úspěchem. Při některých pokusech se specifickou odpovědí proti B. burgdorferi u myši bylo prokázáno, že infekce u inbredních myších kmenů, pěstovaných již delší dobu s izolátem B. burgdorferi, vedla k mírným, avšak významným patomorfologickým změnám různých orgánů, jako je mozek, srdce, plíce a ledviny, přičemž tyto změny byly srovnatelné se změnami u lidí s tímtéž onemocněním, jak bylo uvedeno v publikaci Schaible a další, 1988, Infect. Immun., 1, 41. Skutečnost, že se vytvořily pouze mírné změny, byla způsobena patrně poklesem schopnosti vyvolat protilátky a sníženou virulencí mikroorganismu, již dlouho pěstovaného in vitro, nebo schopnostmi myší vyvinout dostatečnou imunologickou odpověď, jak bylo popsáno v publikacích Johnson a další, 1984, J. Clin. Microbiol., 20, 747, Schwan a další, 1988, Infect. and Immun. 56, 1837.
Vynález si klade za úkol připravit účinnou očkovací látku proti uvedenému onemocnění. K tomuto účelu je zapotřebí nejprve získat vhodný laboratorní model. Bylo nyní navrženo užít kmen myší bez funkčních T- a B-buněk, tzv. kmen Scid—myší, popsaný v publikaci Bosma a další, 1983, Nátuře, 10, 52, protože tyto myši vyvinou po infekci B. burgdorferi ve formě izolátu vícesystémové onemocnění a převážně polyarthritis a karditis. Na tomto modelu je poprvé možno zkoušet účinnost očkovacích látek proti uvedenému onemocnění.
Podstata vynálezu
Podstatu vynálezu tvoří očkovací látka proti borelióze, která jako účinnou složku obsahuje alespoň jeden antigen, imunologicky reagující s monoklonální protilátkou, specifickou pro antigen OspA a/nebo Osp/B Borrelia burgdorferi.
Předmětem vynálezu je rovněž antigen, reagující s monoklonálními protilátkami podle vynálezu. Jde o antigen, který obsahuje celý řetězec aminokyselin OspA nebo OspB nebo jeho imuno
-1 CZ 284616 B6 logicky účinnou část (immunogenní epitop). Potenciální imunogenní epitop může zjistit bez obtíží každý odborník strukturní analýzou OspA (například podle Chou-Fassmannovy metody), pak je možno tyto fragmenty zkoumat a zjišťovat jejich účinnost.
Předmětem vynálezu je rovněž rekombinantní antigen, reagující s protilátkou podle vynálezu, přičemž kódový řetězec DNA pro antigen je uložen v rekombinantním vektoru, s výhodou prokaryotického původu, vhodném pro expresi bílkovin.
Zvláštním předmětem vynálezu je antigen z B. burgdorferi ZS7, specificky reagující s protilátkou podle vynálezu, s řetězcem aminokyselin z obr. 1 nebo s imunogenním epitopem tohoto řetězce. Vynález se rovněž týká rekombinantní DNA, která obsahuje 1) řetězec na obr. 1, nebo 2) řetězec nukleových kyselin, získaných z tohoto řetězce degenerací genetického kódu, všechny tyto řetězce jsou kódem pro antigen 31 kD z B. burgdorferi ZS7 nebo jeho imunogenní epitop.
Zvláště výhodný je antigen podle vynálezu, který je rekombinantní bílkovinou s beta-galaktosidázovým genem, a to s fúzí nebo bez ní.
Vynález se rovněž týká rekombinantního vektoru s obsahem jedné nebo většího počtu kopií rekombinantní DNA podle vynálezu. Může jít o prokaryotický nebo/a eukaryotický vektor, s výhodou prokaryotický vektor. Rekombinantní vektor může být uložen v buňce mimo chromozomy, například plazmid, nebo může být integrován do genomu buňky, například bakteriofág lambda. S výhodou jde o plazmid a zejména o rekombinantní vektor pZS-7/31-2, DSM 5528.
Vynález se rovněž týká způsobu získávání uvedených antigenů sledováním genové banky B. burgdorferi při použití protilátek podle vynálezu s izolací klonů, poskytujících pozitivní imunologickou reakci s použitou protilátkou.
Protože antigen podle vynálezu je možno použít také jako takový k aktivní imunizaci, tj. k indukci tvorby protilátek v organismu, týká se vynález také aktivní očkovací látky, obsahující jako účinnou složku uvedený antigen a popřípadě běžné nosiče a pomocné látky. S výhodou se tento antigen získá cestou genetické technologie.
Bylo možno prokázat, že podání nativního nebo rekombinantního OspA normálním myším vyvolá tvorbu protilátek, které po pasivním přenosu na Sci-myši chrání tyto myši před onemocněním. Zvláště bylo prokázáno, že rekombinantní OspA, vyvolává imunologickou odpověď, srovnatelnou s odpovědí na nativní OspA, takže je možno tuto látku užít pro výrobu vakcíny proti uvedenému onemocnění u lidí.
Vynález bude dále osvětlen příkladovou částí v souvislosti s přiloženými výkresy.
Přehled obrázků na výkresech
Na obr. 1 je znázorněna DNA a řetězec aminokyselin antigenů 31 kD, OspA zB. burgdorferi ZS7.
Na obr. 2 je uvedena imunologická charakteristika rekombinantní bílkoviny rZS7/31-2.
-2CZ 284616 B6
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Indukce arthritis, karditis a hepatitis u Scid-myší infekcí kmenem B. burgdorferi ZS7
Infekce myší B. burgdorferi
Dospělé myši kmene C.B-17 Scid (homozygot pro Sci-mutaci) a C.B-17 se infikují podkožní injekcí 1 x 505, 5 x 105, 1 x 106 nebo 1 x 108 životaschopných nebo usmrcených (UV-světlo) B. burgdorferi do kořene ocasu.
Izolace B. burgdorferi z klíšťat a myší
Výzkumy byly prováděny sjiž dlouho pěstovaným kmenem B. burgdorferi B31, ATCC 35210 a s čerstvým izolátem ZS7, DSM 5527, který byl izolován z klíštěcí samice kmene Ixodes rizinus. Všechny kmeny B. burgdorferi byly pěstovány v modifikovaném Kellyho prostředí z publikace Barbour a další, 1983, Switzerland. Curr. Microbiol. 8, 123, Organismy, izolované ze středního střeva klíšťat, sterilizovaných ethanolem, nebo z krve infikovaných myší byly zpočátku pěstovány v Kellyho prostředí s přidáním 8 mikrogramů/ml kanamycinu a 230 mikrogramů/ml fluoruracilu podle publikace Johnson a další, 1984, J. Clin. Microbiol., 1, 81.
Sérologické testy
Zjištění specifických protilátek proti B. burgdorferi se provádí běžným testem ELISA podle publikace Justus a další, 1988, Wehrmed. Mschr., 32, 263. Standardní křivka pro obsah imunoglobulinu (Ig) byla získána převrstvením vyhloubení Ig myším (ředění 1 : 500 roztoku séra, Paesel, Frankfurt, SNR) a titrací obsahu celkového množství IgG nebo IgM proti myši (Calbiochem, LaJolla, USA). Obdobným způsobem byl měřen celkový obsah IgM a IgG v séru. Koncentrace těchto specifických protilátek se udává v mikrogramech/ml séra, vztaženo na Ig.
Imunofluorescence a barvení podle Giemsy mikrolitrů krve se napipetuje do zkumavek hematokritu (Becton a Dickinson, Heidelberg, NSR) a pak se odstředí při 5000 g v odstředivce pro hematokrit (ECCO, NSR). Zkumavky se rozříznou ve fázi mezi sérem a erythrocyty a 5 mikrolitrů séra se nanese na nosič (Superior, Bad Mergentheim, NSR). Nosič se vzorkem séra se suší na vzduchu a pak se fixuje 100% ethanolem 1 minutu při -20 °C. Po inkubaci 1 hodinu s králičím hyperimunním sérem proti B. burgdorferi v ředění 1 : 100 při teplotě místnosti se nosič pětkrát promyje PBS a pak se jednu hodinu barví při použití kozího antiséra proti králíkům, konjugovaného s FITC (ředění 1 :20, Jackson Lab., West Grove, USA). Pak se nosič promyje, uloží do směsi glycerolu a želatiny (Měrek, Darmstadt, NSR) a okamžitě se sleduje ve fluorescenčním mikroskopu. Neošetřené kapky krve se usuší na vzduchu, fixují v methanolu, barví se podle Giemsy (0,1 %, Měrek, Darmstadt, NSR), odbarví v PBS a uloží do prostředku Entellan (Měrek, Darmstadt, NSR).
Histologické preparáty a postupy při barvení
Různé vnitřní orgány, jako mozek, srdce, plíce, játra, ledviny, slezina a klouby myší, infikovaných B. burgdorferi, se v různé době po infekci odstraní a uschovají buď v kapalném dusíku pro přípravu zmrazených řezů, nebo v 5% formaldehydu v PBS pro uložení do parafínu nebo methakrylátu. Pak se vytvářejí řezy o tloušťce 4 až 7 mikrometrů, které se barví HematoxylinemEosin a pak se ukládají do prostředku Entellan (Měrek AG, Darmstadt, NSR). Imunohistologické
-3 CZ 284616 B6 sledování se provádí při použití systému s obsahem streptavidinu, biotinu a peroxidázy podle publikace Kramer a další, 1989, Eur. J. Immunol, 19, 151.
Následující tabulka 1 ukazuje, že organismy B. burgdorferi, izoláty ZS7 a B31, bylo možno 5 zjistit v krvi Scid-myší, naočkovaných životaschopnými mikroorganismy, po celou dobu pokusu.
Jinak bylo možno rekultivovat pouze spirochety kmene ZS7, avšak nikoliv kmene B31 in vitro. Při srovnání rekultivovaných organismů s primárním izolátem ZS7 nebylo možno prokázat žádné změny v oblasti bílkovin nebo v profilu plazmidu. Po celou dobu pozorování bylo možno u Scidmyší, infikovaných B. burgdorferi, prokázat jen velmi malý nebo žádný titr irelevantních ío protilátek. Nebylo možno prokázat žádné protilátky typu IgM- nebo IgG, specifické proti uvedenému mikroorganismu. Naproti tomu docházelo u kontrolních myší C.B-17, rovněž infikovaných, k expresi velkého množství celkových protilátek Ig a současně bylo možno prokázat vysoký titr specifických protilátek IgM a IgC proti B. burgdorferi. Mezi 7 a 22 dnem po infekci izolátem ZS7 bylo možno pozorovat u Scid-myší první klinické příznaky zánětů kloubů, 15 a to zčervenání a otok obou tibioterálních kloubů, stav se zhoršoval. Nebylo však možno pozorovat žádné takové příznaky u Scud-myší, infikovaných izolátem ZS7 po jeho ozáření UVsvětlem, nebo izolátem B31, a to životaschopným, ani u kontrolních myší C.B-17, infikovaných životaschopným izolátem ZS7.
Také histopatologicky bylo možno prokázat kloubní změny u Scid-myší, infikovaných životaschopným izolátem ZS7, jak je zřejmé z tabulky 1. Bylo možno prokázat těžké poškození kloubů, které se projevovalo zánětlivou hyperplasií synoviální výstelky, spojenou s rozpuštěním chrupavky a/nebo kosti. Dále byl zjištěn zánět celého srdce s průnikem mononukleámích buněk do endokardu, myokardu a perikardu. Dále bylo možno pozorovat progresivní zánět jater, 25 přičemž bylo možno pozorovat vznik jatemí fíbrózy, infiltrace mononukleámích buněk byla omezena na oblast portální žíly a velkých žil. Mimoto bylo možno pozorovat menší poškození hlavy, plic, mozku a příčně pruhovaných svalů.
-4CZ 284616 B6
-A Ά c c
O Φ
E
Sb zi.
o
u. cu bů
=L oo MD
I I I I I m o I I eo o CM — MD CM CM
MD 00 O cn —
TT
I •A -A c c
CN
CN in
CN
CN
Infekce Scid-myší C.B-17 a kontrolních myší C.B-17, reizolace spirochety, titr protilátek, arthritis
ώ o o
C3
Q. O
5Λ
c o Ξ
CQ OQ CQ + + +
I + ffl + -A -A c c
JD
C
JĎ e
o cu
+ -A -A c c
| Ό | Os | θ'- | CN | θ' | C- 1 | Ό Ό (Ί | CS | CN | O | o | |
| ’ςΤ | CN | CN | CN | 00 1 | 1 — CN | CN | CN | CN | — CN |
4>
X-> o cu
o
Té rC/0
N r-~-r~~
CZ)(Z)
NN r—
CZ) >
cz>
N <<·>
OQ o
Té r~ co N 1 — ca 12 II r O C UJ [Λ l f-T ffl II O S *: Giemsovo barvení nebo imunofluorescence,xx: izolace z krve (B) nebo kloubů (G) °: + znamená zrudnutí a otok tibiotarsálních kloubů, °°: - znamená méně než 7,5 pg/ml séra n.b.: nebylo provedeno
Příklad 2
Klonování a exprese antigenu 31kD (OspA) z B. burgdorferi ZS7
Příprava DNA
Vysokomolekulámí DNA z kmene B. burgdorferi ZS7 byla čištěna po kultivaci v modifikovaném Kellyho prostředí. Spirochety byly peletovány odstředěním při 10 000 g a třikrát promyty PBS-pufrem. Usušená peleta byla znovu suspendována v 10 ml TE s obsahem 10 mmol/1 tris a 1 mmol/1 EDTA při pH 4, pak byl na 15 minut při teplotě 30 °C přidán lysozym v množství 5 mg/ml, načež byla DNA uvolněna přidáním 1 ml 20% SDS. Po přidání 1,5 ml roztoku NaCl s obsahem 5 mol/1 byl roztok extrahován stejným objemem fenolu a pak chloroformem. DNA pak byla vysrážena přidáním dvou objemů absolutního ethanolu s následnou inkubací přes noc při teplotě -20 °C. Po odstředění byl zbytek rozpuštěn v 0,5 ml TE, pak byl inkubován s DNA-ázou, prostou RNA-ázy A (20 mikrogramů/ml) po dobu 45 minut při teplotě 55 °C, načež byla na jednu hodinu při teplotě 37 °C přidána proteináza K v množství 0,1 mikrogramů/ml. Pak byl přidán NaOAc do koncentrace 0,3 mol/1 a směs byla jako svrchu extrahována fenolem a chloroformem. Po vysrážení ethanolem byla DNA znovu uvedena do roztoku v TE.
Příprava genové banky
Vysokomolekulámí DNA byla statisticky rozdělena na menší části působením ultrazvuku podobu 3 sekundy. Pak byla užita T4-DNA-polymeráza (30 minut při 37 °C) a Kenowův enzym (5 minut při 20 °C) k vyrovnání zakončení vzniklých fragmentů. Vzniklá DNA byla pak navázána do místa štěpení enzymu BamHI vektoru pro expresi pUEXl při použití strategie klonování použitím adaptéru podle publikace Bresan und Stanley, 1987, Nucl. Acid. Res., str. 1056. Po selekci podle velikosti při použití chromatografie s molekulárním sítem a prostředku Sephacryl S-1000 a po transformaci kompetentních buněk E. coli MC 1061 byl podíl rekombinantních jednotek pro tvorbu plaků (pfu) stanoven následujícím způsobem. Náhodně zvolené kolonie byly odebrány a pěstovány ve 2 ml selekčního prostředí LB s 25 mikroorganismy/ml ampicilinu až do nasycení. DNA plazmidu byla pak izolována běžným rozpuštěním za alkalických podmínek a pak byla rozštěpena enzymem BamHI. Více než 50 % analyzovaného plazmidu obsahovalo včleněné řetězce DNA se středním průměrem > 1,5 kb.
Pěstování na plotnách a screening genové banky B. burgdorferi SZ7
Buňky byly naneseny na desku s rozměrem 24 x 24 cm v množství 7000 pfu na jedné desce a byly inkubovány přes noc při teplotě 30 °C. Po přenosu kolonií na nitrocelulózový filtr (NC) byla indukována exprese složené bílkoviny s obsahem beta-galaktosidázy dvouhodinovou inkubací při teplotě 42 °C. Filtr byl přenesen na papír Whatman 3MM, předem zpracovaný 5% SDS a papír byl inkubován 25 minut při teplotě 95 °C. Pak byly bílkoviny podrobeny elektroblotu při použití běžného zařízení k provedení metody Western blot při použití částečně usušeného materiálu. Po zpracování NC-filtrů DNA-ázou byly imunoreaktivní klony identifikovány za použití monoklonálních protilátek. Nespecifická vazná místa na NC-filtrech byla vysycena čtyřhodinovou inkubací s PBS s obsahem 0,2 % hmotnostních želatiny a 3 mmol/1 MaN3 při teplotě místnosti. Nakonec byly filtry inkubovány 18 hodin za stálého protřepávání se supematanty kultury anti-31 kD monoklonálního klonu LA-2. Po důkladném promytí (PBS + 1 % objemové Tritonu X-100), pak PBS + 0,5 mol/1 chloridu sodného a nakonec PBS + 1 mol/1 chloridu sodného, každý stupeň trvá 10 minut, byly filtry inkubovány 1,5 hodiny při teplotě místnosti za stálého protřepávání s králičí protilátkou proti myšímu IgG, značenou peroxidázou F(ab)2 v ředění 1 : 10 000. Filtry byly znovu promyty jako svrchu a pak byly
-6CZ 284616 B6 inkubovány s diaminobenzidinem jako substrátem pro peroxidázu. Z 104 rekombinantních pfu reagovalo 20 klonů s monoklonální protilátkou LA-2.
Analýza řetězce antigenu 31 kD (OspA)
Běžným způsobem byla izolována včleněná DNA rekombinantního kmene E. coli, klonu s pozitivní reakcí s protilátkou LA-2. Včleněná DNA tohoto klonu obsahovala gen OspA, který je kódem pro antigen 31 kD B. burgdorferi v celé jeho délce. Plazmid, který obsahoval tento řetězec, byl označen pZS-7/31-2 a byl označen podle budapešťské úmluvy a uložen do veřejné sbírky pod číslem DSM 5528.
Rekombinantní bílkovina, produkovaná tímto pozitivním klonem, byla označena rZS7/31-2 a byl stanoven kódový řetězec DNA genu OspA. Tento řetězec je uveden na obr. 1 společně s odvozeným řetězcem aminokyselin pro bílkovinu OspA.
Z obr. 1 je rovněž zřejmé, že antigen 31 kD zB. burgdorferi je bílkovina, která obsahuje 273 aminokyselin.
Příprava nesložené bílkoviny
a) Klon, u nějž dochází k expresi imunoreaktivní bílkoviny rZS7/31-2, byl pěstován přes noc při 30 °C v 10 ml prostředí LB s ampicilinem. 1 ml kultury byl pak přidán ke 100 ml selekčního prostředí a materiál byl pěstován při 30 °C za provzdušňování až do hustoty 8 x 107 buněk v 1 ml (Αβοο + 0,2). Exprese rekombinantních bílkovin bylo dosaženo přenesením buněk do teploty 42 °C. Po zchlazení a odstředění byly buňky promyty pufrem STE, který obsahoval 10 mmol/1 tris, 100 mmol/1 chloridu sodného a 1 mmol/1 EDTA při pH 8,0 a získaný materiál byl znovu uveden do suspenze v 0,6 ml pufru pro rozrušení buněk s obsahem 25 % sacharózy a 50 mmol/1 tris při pH 8,0. Po přidání 150 mikrolitrů roztoku s obsahem 10 mg/ml lysozymu byla směs inkubována 15 minut v ledu a pak ještě dalších 15 minut v ledu za přítomnosti 18 mikrolitrů roztoku s obsahem 10 mg/ml DNA-ázy 1 za přítomnosti 5 mikrolitrů 1 mol/1 chloridu hořečnatého. Pak bylo přidáno 250 mikrolitrů 4x směsi smáčedel (1 % Triton X-100, 0,5% Deoxycholátu, 0,1 mol/1 NaCl, 10 mmol/1 tris, o pH 7,4) a směs byla znovu inkubována 5 minut v ledu. Po odstředění byla usazenina dvakrát promyta pufrem A (50 mmol/1 tris, 50 mmol/1 NaCl, 1 mmol/1 EDTA o pH 8,0) a pak byl materiál znovu uveden do suspenze v devíti objemech pufru A s obsahem 8 M močoviny a směs byla jednu hodinu inkubována při teplotě místnosti. Pak byl vzorek zředěn devíti díly pufru B (50 mmol/1 dihydrogenofosforečnanu a hydrogenfosforečnanu draselného, 50 mol/1 NaCl, 1 mmol/1 EDTA o pH 10,7), směs se ještě 30 minut míchá při teplotě místnosti a pH se udržuje hydroxidem draselným na hodnotě 10,7. Pak se pH roztoku upraví na 7,0 přidáním kyseliny chlorovodíkové a vzorek se dialyzuje přes noc proti pufru A při teplotě 4 °C, pak 10 minut při teplotě 4 °C, načež se odstřeďuje 10 minut při teplotě 4 °C a 10 000 ot/min (rotor SS34). Supematant s obsahem rekombinantní bílkoviny se uchovává při -20 °C.
b) Vzhledem ktomu, že tento klon vylučuje imunoreaktivní bílkovinu rZS7/31-2 také do živného prostředí, je možné čištění afinitní chromatografíe přímo ze supematantu kultury.
Příprava rekombinantní nesložené bílkoviny OspA a čištění afinitní chromatografii
Rekombinantní bílkoviny pak byly čištěny afinitní chromatografii. K tomuto účelu byly na aktivovanou Sepharose CL 4B kovalentně vázány čištěné monoklonální protilátky LA-2. Dialyzovaný extrakt močoviny byl s rekombinantní bílkovinou navázán na Sepharose CL 4B s myším IgG a nakonec byla tato směs přidána do sloupce LA-2-Sepharosy CL 4B. Po intenzivním promytí byla vázaná rekombinantní bílkovina podrobena eluci směsí 0,1 mol/1 glycinhydrochloridu a 0,1 mol/1 NaCl o pH 2,5. Pak bylo pH této frakce neutralizováno
-7CZ 284616 B6 okamžitým přidáním 1/10 objemu 0,5 mol/1 K2HPO4. Frakce s obsahem bílkoviny byly koncentrovány a dialyzovány. Pomocí elektroforézy na SDS-polyakrylamidovém gelu byl stanoven stupeň čistoty.
Imunologická charakteristika rekombinantní bílkoviny rZS7/31-2
Rekombinantní bílkoviny tZS7/31-2 byla imunologicky zkoumána. Pro srovnání byla užita rekombinantní bílkovina rB31/41—9 (povrchový antigen 41 kD B. burgdorferi).
Mikrotitrační plotny s plochým dnem byly převrstveny extraktem rekombinantní bílkoviny rZS7/31-2 a rB31/41-9 s použitím extraktu močoviny, popřípadě extraktem kmene E. coli MC 1061, který byl použit k expresi genu. Nespecifická vazná místa byla blokována 0,2% želatinou v roztoku chloridu sodného s obsahem fosfátového pufru. Do vyhloubení takto připravených mikrotitračních ploten byly přidány monoklonální protilátky LA-2 (anti-31 kD, Osp-A), La-1 (anti-41 kD, Flagellin) a ACHT-2 (anti-alfai-Antichymotrypsin).
Vázané monoklonální protilátky byly uvedeny do reakce s imunoglobuliny, specifickými proti myším a značenými peroxidázou. Vázané protilátky, značené peroxidázou, byly kvantitativně stanoveny pomocí artofenylendiaminů jako substrátů pro peroxidázu. Absorpce při 492 nm (A492) byla stanovena přímo na mikrotitrační plotně pomocí automatizovaného fotometru. Velikost absorpce je přímo úměrná množství vázané monoklonální protilátky.
Monoklonální protilátka LA-2 specificky reaguje s bílkovinou rZS7/31-2, avšak nikoliv s MC 1061 nebo rB31/41-9. Kontrolní reakce monoklonální protilátky LA-1 je specifická pro rB31/41-9. Monoklonální protilátka ACHT-2 (negativní kontrola) se neváže na žádnou z uvedených bílkovin.
Na obr. 2 je znázorněno, že dochází k expresi antigenního epitopu na rekombinantní bílkoviny rZS7/31-2 po klonování zgenomu B. burgdorferi ZS7, přičemž tento antigenní epitop je specificky rozpoznáván monoklonální protilátkou LA-2.
Získání monoklonální protilátky
Při imunizaci myši s neporušeným imunologickým systémem dochází při infekci B. burgdorferi k expresi polyklonálních protilátek, specifických pro B. burgdorferi, jak je zřejmé z tabulky 1.
Myší samice imbredního kmene BALB/c ve stáří 10 týdnů byly imunizovány B. burgdorferi, kmenem B31, ATCC 35 210, kmen byl homogenizován ultrazvukem. Imunizace byla prováděna následujícím způsobem:
Den 0: 200 mikrogramů Borrelia v úplném Freundově pomocném prostředku podkožně.
Den 21, 35, 49, 63: dalších 100 mikrogramů antigenu intraperitoneálně ve fyziologickém roztoku chloridu sodného, obsahujícím fosfátový pufr.
Den 66: vyjmutí sleziny a získání suspenze jednotlivých buněk.
Imunní slezinné buňky byly podrobeny fůzí s myelomovou buněčnou linií Ag8-PAI standardním způsobem při použití polyethylenglykolu podle publikace J. H. Peters, H. Baumgarten, M. Schulze, Monoklonale Antikórper, Springer-Verlag, Heidelberg.
Produkty fúze byly naočkovány do desek s 96 vyhloubeními. Po osmi dnech byly supematanty kultury sledovány zkouškou ELISA v pevné fázi na přítomnost specifických monoklonálních protilátek proti B. burgdorferi podle svrchu uvedené publikace J. H. Peters a dalších.
-8CZ 284616 B6
Buňky hybridomu z kultur, produkujících protilátky, byly po zředění dále klonovány. Supematanty kultur jednotlivých klonů byly znovu vyšetřeny zkouškou ELISA v pevné fázi, analýzou Westem-Blot a immunifluorescencí. Monoklonální protilátky LA-2 podtřídy IgG2b byly produkovány monoklonální linií hybridomu a touto linií rovněž vylučovány a reagovaly při zkoušce Westem-Blot se strukturou 31 kDa (Osp-A) všech vyšetřovaných kmenů B. burgdorferi, mimo jiné také izoláty ZS7 a B31. Tyto protilátky byly děleny elektroforeticky na SDS-gelu a také zkouškou Westem-blot pomocí bílkoviny B. burgdorferi přeneseny na membránu. Monoklonální protilátky LA-26.1C (anti-OapA IgGl), LA 25.1 (anti-OspB, 34 kDa antigen, IgG2b) a La 27.1 (anti OspB, 34 kDa antigen, IgGl) je možno získat a charakterizovat analogickým způsobem.
Příklad 3
Vliv antiséra myší, imunizovaných OspA, na průběh onemocnění u Scid-myší
V tomto pokuse bylo prokazováno, že podání nativního OspA, izolovaného z B. burgdorferi ZS7, nebo rekombinantního OspA, izolovaného z bakterií E. coli, transformovaných rekombinantním plazmidem pZS-7/31-2, DSM 5528, vyvolává u normálních myší kmene C57BL/6 tvorbu ochranných polyklonálních protilátek. V případě, že tyto protilátky jsou podány Scidmyším, chrání proti onemocnění. Bylo tedy možno prokázat, že rekombinantní OspA vyvolává ochrannou imunologickou odpověď, srovnatelnou s odpovědí na nativní OspA. Výsledky a podrobnosti pokusu jsou uvedeny v tabulce 2.
Získání rekombinantního OspA je uvedeno v příkladu 2.
Získání nativního OspA a imunizace myší tímto materiálem bude dále popsána.
Získání nativního 3 lkDa OspA
3,2 x 1010 spirochet se míchá dvě hodiny při 4 °C v 5 ml PBS/7,5 ml n-butanolu za přítomnosti inhibitoru proteázy (5 mmol/1 EDTA, 5 mmol/1 benzamidinu a 0,5 mmol/1 PMSF) při použití magnetického míchadla. Pak se směs odstřeďuje 90 minut s 10 000 ot/min a 4 °C v odstředivce (Sorvall). Vodná fáze s obsahem povrchové bílkoviny se izoluje a třikrát promyje chloroformem. Obsah bílkoviny se zjistí extinkcí při 280 nm nebo testem BCA.
V gelu s obsahem stříbra nebo metodou Western blot s králičím sérem proti B. burgdorferi lze prokázat pro kmen ZS7 hlavní pás s molekulovou hmotností 31 kj a slabší pásy při 20, 34 a 65 až 68 kj. Ve směsi butanolu a vody poskytuje kmen B31 hlavní pás při 31 kj a slabší pásy 20 a 34 kj.
Imunizace myší nativním a rekombinantním OspA
Myši C57BL6 a myši C.B-17 byly očkovány třikrát v odstupu 7 až 10 dnů podáním 5 mikrogramů nativního OspA kmene B31 nebo 10 mg nativního OspA kmene ZS7 nebo rekombinantního OspA téhož kmene ve 100 mikrolitrech pomocného prostředku (ABM3, Fa. Sebak, Aidenbach, NSR) podkožně v oblasti kořene ocasu. Nejdříve 3 týdny po posledním podání bylo možno odebírat sérum 3 až 4 měsíce. Obsah specifických protilátek byl stanoven metodou ELISA.
-9CZ 284616 B6
Tabulka 2
Vliv specifických monoklonálních a polyklonálních protilátek proti B. burgdorferi na spirochetózu a vývoj zánětu kloubů u infikovaných Scid-myší.
Scid-myší ošetření vývoj zánětu kloubů průkaz
C.B-17 týdny B. burgdorferi
2 3
| n = 6 | PBS (negativní kontrola) | + | + | + | 6/6 |
| n = 6 | LA-2 | - | - | - | 0/3 |
| n = 2 | anti OspA (nativní) IMS | - | - | - | 0/2 |
| n = 3 | anti OspA (rekomb.) IMS | — | — | — | 0/3 |
První dávka protilátky byla podána intraperitoneálně v objemu 100 μΐ ve dni 0, tj. současně s infekcí B. burgdorferi ZS-7,1 x 108 organismů podkožně do oblasti kořene ocasu.
Další dávky protilátek byly podány ve dnech 4 (100 μΐ), 7 (200 μΐ), 11 (200 μΐ), 14 (300 μΐ), 18 (300 μΐ), vždy intraperitoneálně.
Claims (25)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Očkovací látka proti borelióze, vyznačující se tím, že jako účinnou složku obsahuje alespoň jeden antigen, imunologicky reagující s monoklonální protilátkou, specifickou pro antigen OspA a/nebo OspB Borrelia burgdorferi.
- 2. Očkovací látka podle nároku 1, vyznačující se tím, že obsahuje antigen, imunologicky reagující s monoklonální protilátkou, specifickou pro OspA Borrelia burgdorferi.
- 3. Očkovací látka podle nároku 1, vyznačující se tím, že obsahuje antigen, imunologicky reagující s monoklonální protilátkou, specifickou pro OspA kmenů ZS7-DSM 5527 a/nebo B31-ATCC 35 210 Borrelia burgdorferi.
- 4. Očkovací látka podle nároku 1, vyznačující se tím, imunologicky reagující s monoklonální protilátkou, specifickou ZS7-DSM 5527 nebo/a B31-ATCC 35 210 Borrelia burgdorferi.že obsahuje antigen, pro OspB kmenů
- 5. Očkovací látka podle nároku 3, vyznačující se tím, že obsahuje antigen, imunologicky reagující s monoklonální protilátkou, specifickou ze skupiny IgG, s výhodou podskupiny IgG2b nebo IgGl.
- 6. Očkovací látka podle nároku 4, vyznačující se tím, že obsahuje antigen, imunologicky reagující s monoklonální protilátkou, specifickou ze skupiny IgG, s výhodou podskupiny IgG2b nebo IgGl.
- 7. Očkovací látka podle nároků 3a 4, vyznačující se tím, že obsahuje rekombinantní antigen, získaný genetickou technologií.- 10CZ 284616 B6
- 8. Očkovací látka podle nároku 4, vyznačující se tím, že obsahuje rekombinantní antigen, získaný genetickou technologií.
- 9. Antigen, imulogicky reagující s monoklonální protilátkou, specifickou pro OspA Borrelia burgdorferi.
- 10. Antigen podle nároku 9, imunologicky reagující s monoklonální protilátkou, specifickou pro OspA kmenů ZS7 nebo/a B13 Borrelia burgdorferi.
- 11. Antigen podle nároku 9 nebo 10, imunologicky reagující s monoklonální protilátkou ze skupiny IgG, s výhodou IgG2b nebo IgGl.
- 12. Antigen, specificky reagující s monoklonální protilátkou, specifickou pro OspB Borrelia burgdorferi.
- 13. Antigen podle nároku 12, imunologicky reagující s monoklonální protilátkou, specifickou pro OspA kmenů ZS7 nebo/a B13 Borrelia burgdorferi.
- 14. Antigen podle nároku 12 nebo 13, imunologicky reagující s monoklonální protilátkou ze skupiny IgG, s výhodou IgG2b nebo IgGl.
- 15. Antigen podle nároku 9, jehož kódový řetězec DNA je uložen ve vektoru, s výhodou prokaryotickém vektoru, vhodném pro expresi bílkoviny.
- 16. Antigen podle nároku 12, jehož kódový řetězec DNA je uložen ve vektoru, s výhodou prokaryotickém vektoru, vhodném pro expresi bílkoviny.
- 17. Antigen podle nároků 9 až 11 nebo 15, obsahující následující řetězec aminokyselin nebo imunogenní epitop, který je částí tohoto řetězce:
M K K Y L L G I G L I L A L I A C K Q N V S s L D E K N S V s V D L P G E M N V L V s K E K N K D G K Y D L I A T V D K L E L K G T S D K N N G S G v L E G V K A D K S K V K L T I s D D L G Q T T L E V F K E D G K T L V s K K. V T s K D K S S T E E K F N E K G E V s E K I I T R A D G T R L E Y T E I K s D G s G K A K E V L K S Y V L E G T L T A E K T T L V V K E G T V T L S K N I s K S G E v S V E L N D T D S S A A T K K T A A W N S G T S T L T I T V N S K K T K D L V F T K E N T I T V Q Q Y D s N G T K L E G S A V E I T K L D E I K N A L K * - 18. Antigen podle některého z nároků 9 až 17 ve formě složené bílkoviny, jejíž část tvoří betagalaktosidáza, nebo ve formě nesložené bílkoviny.
- 19. Rekombinantní DNA, obsahující dále uvedený řetězec nukleových kyselin, který je kódem pro některý zantigenů, uvedených v nárocích 9 až 11, 15, 17 nebo 19, nebo řetězec, vzniklý z tohoto řetězce v rámci degenerace genetického kódu:- 11 CZ 284616 B6 atgaaaaaatatttattgggaataggtctaatattagccttaatagcatgtaagcaaaat gttagcagccttqacqagaaaaacagcgtttcagtagatttgcctggtgaaatgaacgtt cttgtaagcaaagaaaaaaacaaagacggcaagtacgatctaattgcaacagtagacaag cttgagcttaaaggaacttctgataaaaacaatggatctggagtacttgaaggcgtaaaa gctgacaaaagtaaagtaaaattaacaatttctgacgatctaggtcaaaccacacttgaa cttttcaaagaagatggcaaaacactagtatcaaaaaaagtaacttccaaagacaagtca tcaacagaagaaaaattcaatgaaaaaggtgaagtatctgaaaaaataataacaagagca gacggaaccagacttgaatacacagaaattaaaagcgatggatctggaaaagctaaagag gttttaaaaagctatgttcttgaaggaactttaactgctgaaaaaacaacattggtggtt aaagaaggaactgttactttaagcaaaaatatttcaaaatctggggaagtttcagttgaa cttaatgacactgacagtagttgctgctactaaaaaaactgcagcttggaattcaggcact tcaactttaacaattactgtaaacagtaaaaaaactaaagaccttgtgtttacaaaagaa aacacaattacagtacaacaatacgactcaaatggcaccaaattagaggggtcagcagtt gaaattacaaaacttgatgaaattaaaaacgctttaaaataa
- 20. Rekombinantní vektor s obsahem alespoň jedné kopie rekombinantní DNA podle nároku 19.
- 21. Rekombinantní vektor podle nároku 20 ve formě prokaryotického vektoru.
- 22. Rekombinantní vektor podle nároku 21 ve formě plazmidu.
- 23. Rekombinantní vektor podle nároku 20, pZS-7/31-2, DSM 5528.
- 24. Způsob výroby antigenu podle nároků 9 až 11, 15, 17 a 18, vyznačující se tím, že se genová banka B. burgdorferi zkoumá pomocí alespoň jedné monoklonální protilátky, specifické pro OspA nebo OspB B. burgdorferi a izolují se klony, poskytující s protilátkou nebo protilátkami pozitivní imunologickou reakci.
- 25. Způsob výroby antigenu podle nároků 12, 13, 14 a 15, v y z n a č uj í c í se tím, že se genová banka B. burgdorferi zkoumá pomocí alespoň jedné monoklonální protilátky, specifické pro OspA nebo OspB B. burgdorferi a izolují se klony, poskytující s protilátkou nebo protilátkami pozitivní imunologickou reakci.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3931236 | 1989-09-19 | ||
| DE4015911A DE4015911A1 (de) | 1989-09-19 | 1990-05-17 | Impfstoff gegen die lyme-krankheit |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ97095A3 CZ97095A3 (en) | 1995-09-13 |
| CZ284616B6 true CZ284616B6 (cs) | 1999-01-13 |
Family
ID=25885304
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ95970A CZ284616B6 (cs) | 1989-09-19 | 1990-09-19 | Očkovací látka, antigen, kódová rekombinantní DNA pro tento antigen, rekombinantní vektor a způsob výroby antigenu |
| CS904560A CZ284538B6 (cs) | 1989-09-19 | 1990-09-19 | Očkovací látka proti boreliose, způsob její výroby a monoklonální protilátky |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS904560A CZ284538B6 (cs) | 1989-09-19 | 1990-09-19 | Očkovací látka proti boreliose, způsob její výroby a monoklonální protilátky |
Country Status (24)
| Country | Link |
|---|---|
| US (6) | US5178859A (cs) |
| EP (5) | EP0633028B1 (cs) |
| JP (3) | JP3205932B2 (cs) |
| KR (2) | KR100205462B1 (cs) |
| AT (4) | ATE186646T1 (cs) |
| AU (1) | AU651560B2 (cs) |
| CA (1) | CA2025597C (cs) |
| CZ (2) | CZ284616B6 (cs) |
| DE (5) | DE4015911A1 (cs) |
| DK (4) | DK0418827T3 (cs) |
| ES (4) | ES2145077T3 (cs) |
| FI (1) | FI102248B (cs) |
| GR (3) | GR3018995T3 (cs) |
| HK (2) | HK1002405A1 (cs) |
| HR (1) | HRP940545B1 (cs) |
| HU (2) | HU212716B (cs) |
| IE (1) | IE903377A1 (cs) |
| NO (2) | NO311767B1 (cs) |
| NZ (1) | NZ235260A (cs) |
| PL (2) | PL170229B1 (cs) |
| PT (1) | PT95349B (cs) |
| SI (1) | SI9011773B (cs) |
| SK (3) | SK283088B6 (cs) |
| YU (2) | YU48250B (cs) |
Families Citing this family (45)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK590288D0 (da) * | 1988-10-24 | 1988-10-24 | Symbicom Ab | Kemiske forbindelser |
| US7094391B1 (en) * | 1988-10-24 | 2006-08-22 | The University Of Texas System | Compositions and methods for administering Borrelia burgdorferi antigens |
| US5777095A (en) * | 1988-10-24 | 1998-07-07 | Symbicom Aktiebolag | Osp A and B Sequence of Borrelia burgdonferi strains ACA1 and IP90 |
| US6143872A (en) * | 1988-10-24 | 2000-11-07 | Symbicom Aktiebolag | Borrelia burdorferi Osp A and B proteins and immunogenic peptides |
| DE4015911A1 (de) * | 1989-09-19 | 1991-03-28 | Max Planck Gesellschaft | Impfstoff gegen die lyme-krankheit |
| US5582829A (en) * | 1990-04-05 | 1996-12-10 | Rx Technologies, Inc. | Sonicated borrelia burgdorferi vaccine |
| JPH06501382A (ja) | 1990-06-15 | 1994-02-17 | エール ユニバーシティ | ライム病の予防および診断に用いる組成物および方法 |
| EP0465204B1 (en) * | 1990-07-06 | 2000-09-20 | American Home Products Corporation | Vaccine against Lyme disease |
| CA2057536C (en) * | 1990-12-21 | 1999-10-26 | John J. Dunn | Cloning and expression of borrelia lipoproteins |
| US6221363B1 (en) * | 1991-07-11 | 2001-04-24 | Baxter Aktiengesellschaft | Vaccine for the prevention of lyme disease |
| US6872550B1 (en) | 1991-07-11 | 2005-03-29 | Baxter Vaccine Ag | Immunogenic formulation of OspC antigen vaccines for the prevention and treatment of lyme disease and recombinant methods for the preparation of such antigens |
| US6676942B1 (en) | 1991-08-15 | 2004-01-13 | Smithkline Beecham Biologicals (S.A.) | Osp a proteins of Borrelia burgdorferi subgroups, encoding genes and vaccines |
| EP0878545A3 (en) * | 1991-08-15 | 1998-12-16 | SMITHKLINE BEECHAM BIOLOGICALS s.a. | OSP a protein of borrelia burgdorferi subgroups, encoding genes and vaccines |
| EP0620860A4 (en) * | 1991-10-18 | 1997-05-02 | Connaught Lab | Preparation of recombinant borrelia proteins. |
| AU2903892A (en) * | 1991-10-22 | 1993-05-21 | Symbicom Aktiebolag | Improvement in (borrelia burgdorferi) diagnosis and prophylaxis |
| US6303129B1 (en) * | 1992-07-28 | 2001-10-16 | Rx Technologies | Production of borrelia burgdorferi vaccine, product produced thereby and method of use |
| US5656451A (en) * | 1993-07-30 | 1997-08-12 | Yale University | OspE, OspF, and S1 polypeptides in borrelia burgdorferi |
| US6716591B1 (en) | 1993-07-30 | 2004-04-06 | Yale University | B. burgdorferi polypeptides |
| US7008625B2 (en) | 1993-11-01 | 2006-03-07 | Research Foundation Of The State University Of New York | Recombinant constructs of Borrelia burgdorferi |
| US5558993A (en) * | 1994-06-17 | 1996-09-24 | The Regents Of The University Of California | Cloned Borrelia burgdorferi virulence protein |
| GB9511909D0 (en) * | 1995-06-12 | 1995-08-09 | Microbiological Res Authority | Vaccine |
| ATE301716T1 (de) * | 1996-02-21 | 2005-08-15 | Univ Texas | Vmp-ähnliche sequenzen von pathogener borrelia |
| DE19632862B4 (de) * | 1996-08-14 | 2006-08-03 | Mikrogen Molekularbiologische Entwicklungs-Gmbh | Immunologisch aktive Proteine von Borrelia burgdorferi, dafür kodierende Nukleinsäuren sowie deren Verwendung in Testkits und als Impfstoffe |
| US6458555B1 (en) * | 1996-08-21 | 2002-10-01 | Gerd Bach | Cytologic method of examining mucous membranes |
| US6060082A (en) * | 1997-04-18 | 2000-05-09 | Massachusetts Institute Of Technology | Polymerized liposomes targeted to M cells and useful for oral or mucosal drug delivery |
| DE19740735A1 (de) * | 1997-09-16 | 1999-03-18 | Max Planck Gesellschaft | Arzneimittel zur Therapie einer manifesten Lyme-Borreliose |
| US6306623B1 (en) | 1998-02-24 | 2001-10-23 | The University Of California | Leptospiral major outer membrane protein LipL32 |
| ATE386805T1 (de) | 1998-07-31 | 2008-03-15 | Gundersen Lutheran Medical Fou | Verwendungen eines borreliaziden epitops des aussermembranproteins c von borrelia burgdorferi (ospc) als impstoff |
| WO2000056298A2 (en) * | 1999-03-19 | 2000-09-28 | Luitpold Pharmaceuticals, Inc. | Treatment of lyme disease with polysulfated glycosaminoglycan formulations |
| US6592875B1 (en) | 1999-06-21 | 2003-07-15 | Milkhaus Laboratory, Inc. | Method for treatment of lyme disease |
| WO2002016421A2 (en) | 2000-08-18 | 2002-02-28 | Research Foundation Of The State University Of New York | Altered ospa of borrelia burgdorferi |
| EP1572714A4 (en) | 2002-12-20 | 2006-08-09 | Univ Texas | SEQUENCES OF SPECIES AND STRAINS OF I BORRELIA / I PATHOGENIC VMP TYPE |
| KR101192127B1 (ko) | 2006-11-03 | 2012-10-17 | 쉐링-프라우 리미티드 | 개 라임병 백신 |
| WO2008116468A2 (en) | 2007-03-26 | 2008-10-02 | Dako Denmark A/S | Mhc peptide complexes and uses thereof in infectious diseases |
| EP3023436A1 (en) | 2007-07-03 | 2016-05-25 | Dako Denmark A/S | Improved methods for generation, labeling and use of mhc multimers |
| EP2197908A2 (en) | 2007-09-27 | 2010-06-23 | Dako Denmark A/S | Mhc multimers in tuberculosis diagnostics, vaccine and therapeutics |
| US10968269B1 (en) | 2008-02-28 | 2021-04-06 | Agilent Technologies, Inc. | MHC multimers in borrelia diagnostics and disease |
| WO2010009735A2 (en) | 2008-07-23 | 2010-01-28 | Dako Denmark A/S | Combinatorial analysis and repair |
| GB0817244D0 (en) | 2008-09-20 | 2008-10-29 | Univ Cardiff | Use of a protein kinase inhibitor to detect immune cells, such as T cells |
| US10369204B2 (en) | 2008-10-02 | 2019-08-06 | Dako Denmark A/S | Molecular vaccines for infectious disease |
| US11992518B2 (en) | 2008-10-02 | 2024-05-28 | Agilent Technologies, Inc. | Molecular vaccines for infectious disease |
| EP2501719B1 (en) * | 2009-11-17 | 2015-11-04 | Abaxis, Inc. | Peptides and methods for the detection of lyme disease antibodies |
| US8758772B2 (en) | 2011-11-04 | 2014-06-24 | Abaxis, Inc. | Peptides and methods for the detection of lyme disease antibodies |
| PL223175B1 (pl) | 2012-10-22 | 2016-10-31 | Inst Chemii Bioorganicznej Polskiej Akademii Nauk | Szczepionka przeciw boreliozie, konstrukt genetyczny, rekombinowane białko, sposób otrzymywania konstruktu genetycznego, sposób otrzymywania szczepionki, sposób otrzymywania rekombinowanych białek, zastosowanie rekombinowanych białek do wytwarzania szczepionki przeciwko boreliozie |
| US9610336B1 (en) * | 2014-07-16 | 2017-04-04 | Amiram Katz | Immunotherapy for lyme disease |
Family Cites Families (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK590288D0 (da) * | 1988-10-24 | 1988-10-24 | Symbicom Ab | Kemiske forbindelser |
| US4772464A (en) | 1985-08-01 | 1988-09-20 | Miles Laboratories, Inc. | Protective antibodies to serotypic determinants of flagellar antigens |
| US4888276A (en) * | 1986-06-26 | 1989-12-19 | Minnesota Mining And Manufacturing Company | Method and composition for the diagnosis of Lyme disease |
| US4721617A (en) | 1986-08-14 | 1988-01-26 | Regents Of The University Of Minnesota | Vaccine against lyme disease |
| US5034515A (en) * | 1987-09-22 | 1991-07-23 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Staphylococcal fibronectin receptor, monoclonal antibodies thereto and methods of use |
| DE4015911A1 (de) * | 1989-09-19 | 1991-03-28 | Max Planck Gesellschaft | Impfstoff gegen die lyme-krankheit |
| DE59010422D1 (de) * | 1989-12-22 | 1996-08-22 | Mikrogen Molekularbiol Entw | Immunologisch aktive proteine von borrelia burgdorferi, zusammenhängende testkits und impfstoff |
| JPH06501382A (ja) * | 1990-06-15 | 1994-02-17 | エール ユニバーシティ | ライム病の予防および診断に用いる組成物および方法 |
| EP0465204B1 (en) * | 1990-07-06 | 2000-09-20 | American Home Products Corporation | Vaccine against Lyme disease |
| CA2057536C (en) * | 1990-12-21 | 1999-10-26 | John J. Dunn | Cloning and expression of borrelia lipoproteins |
| EP0878545A3 (en) * | 1991-08-15 | 1998-12-16 | SMITHKLINE BEECHAM BIOLOGICALS s.a. | OSP a protein of borrelia burgdorferi subgroups, encoding genes and vaccines |
| JP3246603B2 (ja) * | 1991-08-27 | 2002-01-15 | ノボザイムス アクティーゼルスカブ | 洗 剤 |
| EP0620860A4 (en) * | 1991-10-18 | 1997-05-02 | Connaught Lab | Preparation of recombinant borrelia proteins. |
| AU681572B2 (en) * | 1991-10-21 | 1997-09-04 | Med Immune, Inc. | Bacterial expression vectors containing DNA encoding secretion signals of lipoproteins |
-
1990
- 1990-05-17 DE DE4015911A patent/DE4015911A1/de not_active Withdrawn
- 1990-09-07 HU HU905816A patent/HU212716B/hu not_active IP Right Cessation
- 1990-09-11 NZ NZ235260A patent/NZ235260A/xx unknown
- 1990-09-12 AU AU62444/90A patent/AU651560B2/en not_active Ceased
- 1990-09-18 NO NO19904062A patent/NO311767B1/no unknown
- 1990-09-18 EP EP94112145A patent/EP0633028B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-09-18 ES ES94112144T patent/ES2145077T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-09-18 EP EP94112143A patent/EP0643974B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-09-18 DE DE59010863T patent/DE59010863D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-09-18 SI SI9011773A patent/SI9011773B/sl not_active IP Right Cessation
- 1990-09-18 ES ES94112143T patent/ES2129551T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-09-18 FI FI904597A patent/FI102248B/fi not_active IP Right Cessation
- 1990-09-18 PL PL90307358A patent/PL170229B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1990-09-18 AT AT94112145T patent/ATE186646T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-09-18 PL PL90286918A patent/PL169804B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1990-09-18 DK DK90117943.2T patent/DK0418827T3/da active
- 1990-09-18 YU YU177390A patent/YU48250B/sh unknown
- 1990-09-18 AT AT90117943T patent/ATE131732T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-09-18 AT AT94112143T patent/ATE175576T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-09-18 DK DK94112145T patent/DK0633028T3/da active
- 1990-09-18 DE DE59009978T patent/DE59009978D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-09-18 DE DE59010903T patent/DE59010903D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-09-18 ES ES90117943T patent/ES2082812T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-09-18 EP EP94112144A patent/EP0633313B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-09-18 DE DE59010888T patent/DE59010888D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-09-18 ES ES94112145T patent/ES2141182T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-09-18 EP EP98105444A patent/EP0861664A3/de not_active Withdrawn
- 1990-09-18 AT AT94112144T patent/ATE191499T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-09-18 DK DK94112143T patent/DK0643974T3/da active
- 1990-09-18 DK DK94112144T patent/DK0633313T3/da active
- 1990-09-18 EP EP90117943A patent/EP0418827B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-09-18 IE IE337790A patent/IE903377A1/en not_active IP Right Cessation
- 1990-09-18 CA CA002025597A patent/CA2025597C/en not_active Expired - Fee Related
- 1990-09-19 CZ CZ95970A patent/CZ284616B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1990-09-19 SK SK1510-98A patent/SK283088B6/sk unknown
- 1990-09-19 SK SK4560-90A patent/SK280285B6/sk unknown
- 1990-09-19 KR KR1019900014814A patent/KR100205462B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1990-09-19 PT PT95349A patent/PT95349B/pt active IP Right Grant
- 1990-09-19 SK SK1511-98A patent/SK283089B6/sk unknown
- 1990-09-19 JP JP24765090A patent/JP3205932B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1990-09-19 US US07/585,310 patent/US5178859A/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-09-19 CZ CS904560A patent/CZ284538B6/cs not_active IP Right Cessation
-
1993
- 1993-05-27 US US08/068,063 patent/US5434077A/en not_active Expired - Fee Related
-
1994
- 1994-09-15 HR HR940545A patent/HRP940545B1/xx not_active IP Right Cessation
-
1995
- 1995-03-20 US US08/407,350 patent/US5686267A/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-03-20 US US08/406,623 patent/US5780030A/en not_active Expired - Fee Related
- 1995-04-24 HU HU95P/P00108P patent/HU211228A9/hu unknown
-
1996
- 1996-02-14 GR GR960400397T patent/GR3018995T3/el unknown
-
1997
- 1997-03-12 YU YU9097A patent/YU49370B/sh unknown
-
1998
- 1998-02-13 HK HK98101147A patent/HK1002405A1/xx not_active IP Right Cessation
- 1998-02-23 US US09/027,843 patent/US5856447A/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-08-29 KR KR1019980035375A patent/KR100202128B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1998-12-23 HK HK98114958A patent/HK1013620A1/xx not_active IP Right Cessation
-
1999
- 1999-10-07 US US09/413,858 patent/US6613331B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1999-11-30 GR GR990403104T patent/GR3032010T3/el unknown
-
2000
- 2000-06-14 GR GR20000401362T patent/GR3033675T3/el not_active IP Right Cessation
- 2000-07-26 JP JP2000225341A patent/JP3328644B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2000-12-11 JP JP2000376159A patent/JP3418171B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2001
- 2001-09-24 NO NO20014624A patent/NO315905B1/no unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ284616B6 (cs) | Očkovací látka, antigen, kódová rekombinantní DNA pro tento antigen, rekombinantní vektor a způsob výroby antigenu | |
| US5747294A (en) | Compositions and methods for the prevention and diagnosis of lyme disease | |
| JP2907813B2 (ja) | コクシジウム症予防用抗原性蛋白質およびそれを含有するワクチン | |
| IE83320B1 (en) | Vaccine against lyme disease | |
| US5656451A (en) | OspE, OspF, and S1 polypeptides in borrelia burgdorferi | |
| US4521334A (en) | Synthetic polypeptide fragments | |
| PL177219B1 (pl) | Szczepionka do ochrony świń przed zakażeniem Streptococcus suis | |
| US5879952A (en) | 43 Kd protein vaccine and method for the production thereof | |
| AU673912B2 (en) | Vaccine against lyme disease | |
| US6716591B1 (en) | B. burgdorferi polypeptides | |
| IE83340B1 (en) | Vaccine against lyme disease |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| IF00 | In force as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20050919 |