FI102248B - Menetelmä rokotteen valmistamiseksi Lymen tautia vastaan - Google Patents
Menetelmä rokotteen valmistamiseksi Lymen tautia vastaan Download PDFInfo
- Publication number
- FI102248B FI102248B FI904597A FI904597A FI102248B FI 102248 B FI102248 B FI 102248B FI 904597 A FI904597 A FI 904597A FI 904597 A FI904597 A FI 904597A FI 102248 B FI102248 B FI 102248B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- burgdorferi
- antigen
- dsm
- recombinant dna
- antibody
- Prior art date
Links
- 208000016604 Lyme disease Diseases 0.000 title claims abstract description 22
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 15
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 26
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 36
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 36
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 36
- 108700006640 OspA Proteins 0.000 claims abstract description 26
- 241000589969 Borreliella burgdorferi Species 0.000 claims abstract description 24
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims abstract description 7
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 claims description 54
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims description 22
- 241000448699 Borrelia burgdorferi ZS7 Species 0.000 claims description 14
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 14
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 14
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 claims description 12
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 10
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 claims description 10
- 238000010171 animal model Methods 0.000 claims description 9
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims description 9
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 8
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 7
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 7
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 claims description 7
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 6
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 6
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 6
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims description 6
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 claims description 4
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 claims description 4
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 4
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 claims description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 3
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 claims description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 2
- 210000001503 joint Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 claims description 2
- 241000831652 Salinivibrio sharmensis Species 0.000 claims 3
- 208000018937 joint inflammation Diseases 0.000 claims 2
- 208000018191 liver inflammation Diseases 0.000 claims 2
- 239000013543 active substance Substances 0.000 claims 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 claims 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 claims 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 claims 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 claims 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 11
- 239000000945 filler Substances 0.000 abstract description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 abstract 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 16
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 14
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 14
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 13
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 13
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 13
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 12
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 12
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 11
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 9
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 8
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 6
- 241000589970 Spirochaetales Species 0.000 description 6
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 6
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 6
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 5
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 5
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 5
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 5
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 5
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 5
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 5
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 5
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 5
- 208000009525 Myocarditis Diseases 0.000 description 4
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 4
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 4
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 4
- 241000238876 Acari Species 0.000 description 3
- 241000276440 Borrelia burgdorferi B31 Species 0.000 description 3
- 108010040721 Flagellin Proteins 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 3
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 3
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 3
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000589968 Borrelia Species 0.000 description 2
- 101100283604 Caenorhabditis elegans pigk-1 gene Proteins 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- 241000238681 Ixodes Species 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 2
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 2
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- WHLPIOPUASGRQN-UHFFFAOYSA-N butyl 2-methylprop-2-enoate;methyl 2-methylprop-2-enoate Chemical compound COC(=O)C(C)=C.CCCCOC(=O)C(C)=C WHLPIOPUASGRQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 238000005534 hematocrit Methods 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 2
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 2
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 2
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 2
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 2
- 101150045801 ospA gene Proteins 0.000 description 2
- 229940099789 ospa protein Drugs 0.000 description 2
- 231100000915 pathological change Toxicity 0.000 description 2
- 230000036285 pathological change Effects 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108010039206 Biotinidase Proteins 0.000 description 1
- 102100026044 Biotinidase Human genes 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 108050006400 Cyclin Proteins 0.000 description 1
- 102000016736 Cyclin Human genes 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N Fluorouracil Chemical compound FC1=CNC(=O)NC1=O GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002738 Giemsa staining Methods 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 206010019668 Hepatic fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-M Methacrylate Chemical compound CC(=C)C([O-])=O CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 108010090127 Periplasmic Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 240000000528 Ricinus communis Species 0.000 description 1
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N [4-(4-hydrazinylphenyl)phenyl]hydrazine Chemical compound C1=CC(NN)=CC=C1C1=CC=C(NN)C=C1 SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 230000002917 arthritic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- PXXJHWLDUBFPOL-UHFFFAOYSA-N benzamidine Chemical compound NC(=N)C1=CC=CC=C1 PXXJHWLDUBFPOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 229940009976 deoxycholate Drugs 0.000 description 1
- KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N deoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 210000001174 endocardium Anatomy 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 229960002949 fluorouracil Drugs 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 208000019622 heart disease Diseases 0.000 description 1
- 210000003405 ileum Anatomy 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 238000009399 inbreeding Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002346 musculoskeletal system Anatomy 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000004165 myocardium Anatomy 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920002113 octoxynol Polymers 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 210000003516 pericardium Anatomy 0.000 description 1
- 210000001428 peripheral nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 210000003699 striated muscle Anatomy 0.000 description 1
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 210000002437 synoviocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 210000001835 viscera Anatomy 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/20—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Spirochaetales (O), e.g. Treponema, Leptospira
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
- C07K16/1203—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria
- C07K16/1207—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria from Spirochaetales (O), e.g. Treponema, Leptospira
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
102248
Menetelmä rokotteen valmistamiseksi Lymen tautia vastaan
Lymen borrelioosi on yleisin punkkien välittämä infektiosai-5 raus lauhkeilla leveyksillä. Sitä aiheuttaa spirokeetta Bor-relia burgdorferi, jota ihmisiin välittävät ennen kaikkea Ixodes-kannan punkit. Tauti on krooninen etenevä infektio, joka koskee useita elimiä, kuten ihoa, keskus- ja ääreishermostoa, sydäntä, maksaa, munuaisia ja lihas/luusto-jär-10 jestelmää. Koska tämän taudin varma terapia antibiooteilla on vaikeaa, tehdään nykyisin paljon ponnisteluja aiheuttajan itsensä ja isännän Borrelia burgdorferi-infektion vastaisen vasteen tutkimiseksi. Lymen tautiin sairastuneilla henkilöillä havaitaan tosin suuri B. burgdorferi n vastaisten vasta-ai-15 neiden tiitteri, joka ei kuitenkaan vaikuta infektiota vastaan suojaavasti. Oletetaan, että aiheuttaja siirtyy verenkierrosta hyvin nopeasti kudokseen, eikä siellä enää ole immuunijärjestelmän välittömästi tavoitettavissa. Tämä merkitsisi, että suoja vasta-aineilla olisi mahdollinen vain välit-20 tömästi infektion alkamisen jälkeen niin pitkään kuin aiheuttaja on vielä verenkierrossa.
;'· Se tosiseikka, että luonnollinen infektio B. burgdorferi]1 a . havaittiin erilaisissa eläinlajeissa, on johtanut tutkimuk- • · » siin Lymen taudin laboratoriomallien muodostamiseksi. Tämäkin • · · ”\S5 onnistui rajallisella menestyksellä. Niinpä kokeissa, joissa oli tarkoituksena indusoida B. burgdorferi]1 e spesifinen im- • · ’”·* muunivaste hiiressä, keksittiin, että umpisiitoshiirikantojen • · · V ’ infektio jo pitkään kasvatetulla B. burgdorferi-i soiaatin a johti kohtuullisiin, mutta merkittäviin patomorfologisiin • · ϊ,ϊ,δΟ muutoksiin erilaisissa elimissä, kuten aivoissa, sydämessä, :T: keuhkoissa ja munuaisissa, jotka muutokset olivat verratta- vissa Lymen tautia sairastavilla potilailla havaittaviin (Schaible ah ai., Infect. Immun. 1 (1988) 41). Ensimmäisen taudinkuvan kehittyminen eläimillä estyi oletettavasti joko ':"35 isännän immuunitorjunnasta ja/tai pitemmän ajan in vitro kas-vatettujen spirokeettojen alentuneesta tartuttavuudesta joh- 2 102248 tuen (Johnson b£ al. , J. Clin. Microbiol. 2Ώ. (1984) 747; Schwan at al., Infect, and Immun. 5£ (1988) 1837).
Keksintö koskee Lymen taudin vastaisen tehokkaan rokotteeen valmistamista. Tähän vaaditaan kuitenkin ensin sopivan labo-5 ratorioeläinmallin kehittämistä. Nyt ehdotetaan, että hiiri-kanta ilman toimintakykyisiä T- ja B-soluja, niin kutsuttu Scid-hiiri (Bosma el al., Nature 1H (1983) 52) voi toimia koe-eläimenä, koska Scid-hiirellä kehittyy patogeenisellä B. burgdorferi -i soiaaHΊ1 a infektoitaessa multisysteeminen sai-10 raus ja pääasiassa usean nivelen tulehdus (Polyarthrithis) ja sydäntulehdus. Vasta tällä eläinmallilla tulee mahdolliseksi tutkia rokotteiden vaikutusta Lymen tautia vastaan.
Keksinnön mukaisella menetelmällä saadaan passiivinen rokote Lymen tautia vastaan, joka rokote sisältää yhtä tai useampaa 15 B. burgdorferin 31-kD antigeenille (OspA) tai/ja 34-kD antigeenille (OspB), erityisesti B. burgdorferi-kantojen B31 (ATCC 35210) tai/ja ZS7 (DSM 5527) OspA- tai/ja OspB-spesifi-siä monoklonaalisia vasta-aineita. Edullinen on rokote, joka sisältää luokan IgG, erityisen edullisesti alaluokan IgG2b 20 tai IgGl vasta-ainetta. Keksinnön mukaisesti saadun vasta-aineen antaminen vaikuttaa yllättävällä tavalla vastakohtana • ’* toisen vasta-aineen, esimerkiksi B. hnrgdorferin 41-kD pinta- *·* ' antigeenin (flagelliini) antamiselle immuunikatoisissa koe- : eläimissä, edullisesti Scid-hiirissä, jotka infektoitiin ..*•^5 elinkykyisellä patogeenisellä B. hnrgdorferi 11a, edullisesti • · · B. burgdorferi ZS7:llä, niin, että niveltulehduksen, sydäntu-ΓΓ: lehduksen ja maksatulehduksen kehittyminen estyy täysin tai ainakin pitkälle.
• « • · « ***** Keksinnön mukaisesti valmistettu rokote, joka sisältää vai-
··· ' J
• · · *·* 30 kuttavana aineena vasta-aineita, voi mahdollisesti sisältää vielä myös tavallisia väli-, täyte- ja apuaineita.
;* Edelleen keksintö koskee myös menetelmää Lymen taudin vastai- sen passiivisen rokotteen talteenottamiseksi koe-eläimen imu-soluista tai pernasoluista, edullisesti hiiren, joka on immu- 3 102248 nisoitu B. burgdorferi-eliöillä tai niiden osilla, edullisesti täydellisillä B. burgdorferi B31 tai/ja ZS7 -eliöillä, jolloin immunisoidun eläimen imusoluista tai pernasoluista saadaan solujen fuusiolla hybridooma, joka tuottaa keksinnön 5 mukaista monoklonaalista vasta-ainetta.
Keksintö koskee myös hybridoomasolulinjaa (ECACC 89091302), joka tuottaa keksinnön mukaista vasta-ainetta LA-2 OspArta vastaan (IgG2b). Edelleen keksintö koskee myös OspA:n vastaista vasta-ainetta LA-26.1 (IgGl) tuottavaa hybridoomasolu-10 linjaa ECACC 90050406, samoin kuin vasta-aineita LA-25.1 tai LA-27.1 OspBrtä (IgG2b tai IgGl) tuottavia hybridoomasolulin-joja ECACC 90050405 tai ECACC 90050407.
Samoin keksintö sisältää patogeenisen B. burgdorferi-kannan ZS7 (DSM 5527).
15 Edelleen keksintö koskee menetelmää antigeenin valmistamiseksi, joka immunoreagoi keksinnön mukaisen monoklonaalisen vasta-aineen kanssa. Sillä tarkoitetaan antigeeniä, joka sisältää koko OspA:n tai OspBrn aminohapposekvenssin tai myös vain OspA:n tai OspB:n immunogeenisesti vaikuttavan osasekvenssin 20 (immunogeenisen epitoopin). Ammattimies voi saada selville ♦ • näiden proteiinien mahdolliset immunogeeniset epitoopit ilman : vaikeuksia OspA-proteiinin rakenneanalyysillä (esimerkiksi • ;*· Chou-Fassmann-analyysillä) ja testata niiden tehokkuuden sit- • « » « .:. ten kokeellisesti.
• ♦· * • « · • · *•••*25 Keksintö koskee myös erityisesti yhdistelmä-DNA-antigeeniä, * joka immunoreagoi keksinnön mukaisten vasta-aineiden kanssa, jolloin antigeeniä koodittava DNA-sekvenssi sijaitsee yhdis-ί#:#: telmä-DNA-vektorissa, edullisesti prokarioottisessa vektoris- sa, joka soveltuu proteiiniekspressioon.
« · ; *·*30 Erityisesti keksinnössä valmistetaan antigeeniä B. hnrgdorfp-* · « ri ZS7:stä, joka immunoreagoi spesifisesti keksinnön mukaisen vasta-aineen ja kuvassa 1 esitetyn aminohapposekvenssin tai • « tämän sekvenssin immunogeenisen epitoopin kanssa. Sen mukai- • « sesti keksintö koskee myös yhdistelmä-DNA:ta, joka sisältää 4 102248 (1) kuvassa 1 esitetyn, (2) sitä geneettisen koodin degeneraation puitteissa vastaavan nukleiinihapposekvenssin tai (3) (1):stä tai/ja (2):sta olevan sekvenssin kanssa ankarissa (stringent) olosuhteissa hybridisoituvan sekvenssin, joka 5 koodittaa 31-kD antigeeniä B. burgdorferi ZS7:stä tai sen im-munogeenistä epitooppia. Käsite "ankarat olosuhteet" on tällöin ymmärrettävä, kuten käsikirjassa: Maniatis et ai.; Molecular Cloning. A Laboratory Manual (1982), Cold Spring Harbor Laboratory, New York.
10 Erityisen edullinen on antigeeni, joka on yhdistelmä-DNA-ei-fuusioproteiini tai S-galaktosidaasi-fuusioproteiini.
Edelleen keksintö koskee myös yhdistelmä-DNA-vektoria, joka sisältää yhden tai useampia kopioita keksinnön mukaisista yh-distelmä-DNA:ista. Keksinnön mukainen vektori voi olla proka-15 rioottinen tai/ja eukarioottinen vektori, edullisesti se on prokarioottinen vektori. Yhdistelmä-DNA-vektori voi olla isäntäsolussa ekstrakromosomaalisesti (esimerkiksi plasmidi) tai se voi myös integroitua isäntäsolun genomin kanssa (esimerkiksi bakteriofagi lambda). Edullisesti keksinnön mukainen 20 vektori on plasmidi. Erityisen edullinen on yhdistelmä-DNA-vektori pZS-7/31-2 (DSM 5528).
•
« « I
Keksintö koskee myös menetelmää keksinnön mukaisten antigee-; .·. nien hankkimiseksi tutkimalla B. burgdorferi -geenipankki a yh-
«Il I
.·. dellä tai useammalla keksinnön mukaisella vasta-aineella, *1112 5 jolloin eristetään klooneja, joilla havaitaan käytetyillä • · vasta-aineilla positiivinen immuunireaktio.
t · « # · <
Koska myös itse keksinnön mukaisesti saatua antigeeniä voi- :*:*· daan käyttää aktiiviseen immunisointiin, ts. vasta-aineenmuo-• ♦ dostuksen indusointiin eliössä, käsitellään hakemuksessa si- • · · ,/30 ten myös Lymen taudin vastaista aktiivista rokotetta, joka • · : *’ sisältää vaikuttavana aineena keksinnön mukaisesti saatua an- • M « · ·...' tigeeniä, mahdollisesti tavallisten väli-, täyte- ja apuai- ·;··· neiden kanssa. Yhdessä edullisessa suoritusmuodossa keksinnön .··*. mukaista antigeeniä valmistetaan geeniteknologisesti.
5 102248
Voitiin todellakin osoittaa, että natiivi- tai yhdistelmä-DNA-OspA:n anto indusoi normaaleissa hiirissä suojaavien vasta-aineiden muodostuksen, jotka passiivisen siirron jälkeen Scid-hiiriin suojasivat nämä Lymen borrelioosia vastaan. Eri-5 tyisesti havaitaan, että yhdistelmä-DNA-OspA indusoi natiivi-OspA:n kanssa verrattavissa olevan immuunivasteen, ja siten se on paljon lupaava ehdokas Lymen borrelioosin vastaista rokotetta varten ihmiselle.
Edelleen keksintö koskee menetelmää Lymen taudin vastaisen 10 passiivisen rokotteen hankkimiseksi, jolloin koe-eläimiä, edullisesti hiiriä, immunisoidaan keksinnön mukaisella antigeenillä, ja immunisoiduista koe-eläimistä kerätään tavallisella tavalla suojaavia, polyklonaalisia tai monoklonaalisia vasta-aineita.
15 Lopulta keksintö koskee vielä menetelmää patogeenisten B. burgdorferi-eliöiden eristämiseksi ja uudelleenkasvattamisek-si, jolle menetelmälle on tunnusomaista, että immuunikatoi-sista koe-eläimistä, edullisesti hiiristä, jotka on ennestään infektoitu aiheuttajalla, kerätään aiheuttaja, jolloin aihe-20 uttajan patogeenisuus säilyy. Erityisen edullinen on menetelmä, jossa patogeenisiä B. burgdorferi ZS7 (DSM 5527)-eliöitä : *·· kerätään infektoitujen Scid-hiirien verestä tai/ja nivelistä.
: .·. Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa pa-
• · I
”V tenttivaatimuksissa.
• · · • •ti • · · •..,25 Keksinnön lähempi selitys tapahtuu seuraavien esimerkkien ja : ? : kuvien 1 ja 2 avulla.
. . Kuvissa: • · · • · · • · V · Kuvassa 1 esitetään B. burgdorferi ZS7:n 31-kD antigeenin (OspA) DNA- ja aminohapposekvenssi, • « · • ·« • · · • · • · 6 102248
Kuvassa 2 esitetään yhdistelmä-DNA-proteiinin rZS7/31-2 immunologinen karakterisointi.
Esimerkki 1 5 Niveltulehduksen, svdäntulehduksen ia maksatulehduksen indusointi Scid-hiirissä B. buradorferi-kannalla ZS7 indusoimalla.
Hiirten käsittely B. burodorferillä 10 Täysikasvuisia kantojen C.B-17 Scid (homotsygootti Scid- mutaation suhteen) ja C.B-17 hiiriä injisoitiin ihonalaisesti hännäntyveen lxlO5, 5xl05, lxlO6 tai lxlO8 elinkykyisellä tai tapetulla (UV-säteily) B. burodorferi-eliöllä.
15 B. burodorferin eristys punkeista ia hiiristä
Tutkimukset suoritettiin jo kauan kasvatetulla B. burodor-feri-kannalla B31 (ATCC 35210) ja tuoreella isolaatilla B. burgdorferi ZS7 (DSM 5527), joka eristettiin naaraspuolisesta Ixodes rizinus-punkista. Kaikkia B. burodorferi-kantoia 20 kasvatettiin modifioidussa Kellyn väliaineessa (Barbour et ai.. Switzerland. Curr. Microbiol. 8 (1983) 123). B. burg-dorferi-eliöitä. jotka kerättiin etanolilla steriloitujen punkkien välisuolesta tai infektoitujen hiirien verestä, kasvatettiin aluksi Kellyn väliaineessa lisäten 8 pg/ml 25 kanamysiiniä ja 230 pg/ml fluoriurasiilia (Johnson et ai..
J. Clin. Microbiol. 1 (1984) 81).
·*» “ ' ' ' • · · • · · «
Serologiset testit B. burodorferi-spesifisten vasta-aineiden havaitseminen 30 suoritettiin tavanomaisella ELISA-menetelmällä (Justus et ai. Wehrmed. Mschr. 32 (1988) 263). Immunglobuliini (Ig)- Γ! pitoisuuden vakiokäyrä saatiin päällystämällä astia anti- • · *\ . hiiri-Igillä (l:500-laimennos seerumiliuoksesta yhtiöstä
Paesel, Frankfurt, SLT) ja titraamalla kokonais-hiiri-IgG-35 tai IgM-pitoisuus (Calbiochem., LaJolla, USA). Seunalla tavalla mitattiin kokonaisseerumi-IgM ja -IgG. B. burodor-... feri-spesifisten IgM- tai IgG-vasta-aineiden konsentraatio ilmoitetaan yksikössä pg Ig/ml seerumia.
7 102248
Immunofluoresenssi ia Giemsa-väriävs 50 μΐ verta pipetoitiin hematokriittipikkuputkeen (Becton und Dickinson, Heidelberg, SLT) ja sentyrifugoitiin 5000 g:llä hematokriittisentrifugissa (ECCO, SLT). Pikkuputket 5 leikattiin seerumi- ja punasolujfaasien välisellä rajalla, ja 5 μΐ seerumia lisättiin objektilasille (Superior, Bad Mergentheim, SLT). Objektilasit, jolle oli lisätty seeruminäytteitä, kuivattiin ilmassa, ja kiinnitettiin 1 min ajan 100-% etanolissa -20 °C:ssa. 1 tunnin inkuboinnin jälkeen 10 kani-anti-B. burqdorferi-hvperimmuuniseerumilla (1:100 laimennos) huoneenlämpötilassa ogjektilasit pestiin viidesti PBSsssä ja väritettiin sitten FITC-konjugoidulla vuohi-antikani-antiseerumilla (1:20 laimennos, Jackson Lab., West Grove, USA) 1 tunnin ajan. Objektilasit pestiin ja upotet-15 tiin Kaiserin glyseriinigelatiiniin (Merck, Darmstadt, SLT) ja tutkittiin heti fluoresenssimikroskopialla. Käsittelemättömät veripisarat kuivattiin ilmassa, kiinnitettiin metano-lissa, värjättiin Giemsa'lla (0,1 % Merck, Darmstadt, SLT), poistettiin väri PBS:ssä, ja upotettiin Entellan'iin (Merck, 20 Darmstadt, SLT).
Kudosvalmisteet ia värimenetelmä . Aikaisemmin B. burodorferillä infektoiduista hiiristä pois tettiin vaihtelevilla ajanhetkillä infektion jälkeen erilai-25 siä sisäelimiä (aivot, sydän, keuhkot, maksa, munuaiset, ’ 111 perna ja nivelet) ja säilytettiin joko nestemäisessä typessä jäädytettyjen leikkeiden preparointia tai 5-% formaldehydis- • · '·* * sä (PBS:ssä) parafiiniin tai metakrylaattiin upotusta var ten. Valmistettiin 4 - 7 μιη:η leikkeitä, värjättiin hematok-30 syliini/eosiinilla ja upotettiin Entellan'iin (Merck AG,
Darmstadt, SLT). Immuunihistologia suoritettiin käyttämällä streptavidiini/biotiini/peroksidaasi-järjestelmää (Kramer :Y et ai., Eur. J. Immunol. 19 (1989) 151).
• · • · « · 35 Taulukossa 1 esitetään, että isolaattien ZS7 ja B31 B.
. . burodorferi-eliöitä osoitettiin Scid-hiirien veressä koko kokeen keston ajan, jotka hiiret oli aikaisemmin siirrostet-tu elinkykyisillä eliöillä. Kuitenkin vain kannasta ZS7 8 102248 voitiin kasvattaa uudelleen spirokeettoja in vitro, muttei lainkaan kannasta B31. Verrattaessa uudelleenkasvatettuja eliöitä primäärisen B. burgdorferi ZS7-isolaatin kanssa ei proteiinisisällössä tai plasmidiprofiilissa voitu osoittaa 5 mitään muutoksia. B. burgdorferillä infektoiduissa Scid-hiirissä ei osoitettu koko tarkkailun aikana lainkaan epäoleellisia vasta-aineita tai vain erittäin vähäisiä tiitte-reitä. Näistä eläimistä ei löytynyt lainkaan B. burgdor-feri-spesifisiä IgM- tai IgG-vasta-aineita (taulukko 1).
10 Sitä vastoin kaikki B. burgdorferillä infektoidut C.B-17-kontrollihiiret ekspressöivät suuria määriä kokonais-Ig:tä ja kohonneita tiittereitä B. burgdorferi-spesifisiä IgM-ja IgG-vasta-aineita. Välillä 7 ja 20 päivää B. burgdorferi ZS7:llä infektoinnin jälkeen Scid-hiirissä nähtiin ensim-15 mäiset kliiniset oireet niveltulehduksesta (punoitusta ja turvotusta molemmissa sääri-nilkka-nivelissä), jotka lisääntyivät ajan myötä. Sitävastoin Scid-hiirissä, jotka oli infektoitu joko UV-säteilytetyllä B. burgdorferi ZS7- tai elinkykyisillä B. burgdorferi B31-eliöilläf ja C.B-17-kont-20 rollihiirissä, jotka oli infektoitu elinkykyisillä B. burgdorferi ZS7-eliöillä, ei havaittu lankaan niveltulehdusoi- • reita.
Niveltulehdusmuutoksia osoitettiin myös histopatologisesti II· · 25 Scid-hiirissä, jotka oli infektoitu elinkykyisellä B. burg-.··· dorferi ZS7:llä (taulukko 1). Osoitettiin vaikeita nivelvau- ,·,· rioita, joille oli luonteenomaista hyperplastisesti tulehtu- • · neiden nivelnestevuoraussolujen läsnäolo, joihin liittyy rustokudoksen ja/tai luun kuluminen ja tuhoutuminen. Edel-30 leen osoitettiin sydämen kaikkien osien tulehdus, johon liittyi yksitumaisten solujen tunkeutuminen sydämen sisäkal-’··. voon, sydänlihakseen ja sydänpussiin. Samoin osoitettiin
t I
·.’· etenevä tulehdus maksassa, jossa havaittiin yksitumaisten • · .... solujen porttilaskimoalueelle ja keskuslaskimoon rajoittunut .... 35 tunkeutuminen, granulomatoosireaktioita ja lopulta maksafib- • · roosin esiintymistä. Lisäksi osoitettiin vähäisiä vaurioita munuaisissa, keuhkoissa, aivoissa ja juovikkaissa lihaksis- • · $ sa.
9 102248 σ>
H
„ I I I I I I I I I < I * 1 r «5 1 *
Co c tn o' a> o a) C — C η n •H H -H . .
g, ·? 5 CB
-P 0 to +J 3 ®a. I I I I I I I I 1 * I 1 1 1 00 ^ 1 •H « & ησ ·* A « ,* m ~ o +j o M 0) β § H OH^CO^H I I I 1 Γ* 1 5 2 « S 2 S :_S ® 'd JL cn cn n o in · · m ** JS ό 2 IS +* to id to ,_ι n n co co co σ\ o)
X I -H . . £ vo ro ^ -H
C <d id c e ή τι 4-) c a) ·- 43 01 o >
Id Φ «0 -*3. I I I I I I I I I I v I I «ί^ΐη^β -H
HH > O llllllll I « ΐη^ΟΗ p H3 X Shciin •H 4-> pj tN «- HH ~ ai ai n «H > I — M -H m I O . .
0 C C O H C n _Q :<d a m 40 to 4-> c ee to Μ ·η 4) -Η (d ·Η a) c r-ι a a tn μ A ·Η C 0) μ 4-> o > • <u r-f ie CQI4J 4) ·Η Q> to 0.¾ £ 3 -H .+ + + + + + + + + +I·'»'.'·' £ -H-H c x c to
4J 4-) -H
x <i) μ 4) C 4) H4 -H I * C Id JOJ * [it n n ·· •H ' -rj -£5 I sin I pi ms · · + I I 1 1 1 i1 11 : <d μ to 4) ++ + + 0Q c c C 4-) 4) -H C + ^ ^ 4) ID Ή μ -H ((] p id μ tn e ,.3 · >—I μ > o IJ to
•Η Ό * Ij C
; J O *H ··* O I C :<d 3 +j
• X 43 it) μ 4-) 4) to ,. SO
t ^ H4J S-HCtO no c> ..· c rHto Λ (d-H 4) + + + + + + + +.^+1++11 |ll · : .'. c o to · <d a> a> M s 44 ·, . id μ ,χ e 43 to t> r EH 4J O o to ; · C Ό p-ro .. : o c c 5 ... .x x o S « : I -h c o3 ··· r~ to :id -P © e 4->
.·.· H>, ad^g 5 -H
• > I -P > © -X r^voo>t-.n_.ow^,lvoion,cncso>vo»d'll g O
* CQ to -HWH fr)'^ {NXJCN00,,^r-iJJCSCNfS^(N EC
• ·Η :<d C :td £ C
U μ Οι·Η ·η 04
0) .rJ
<d-H 3 c id
•m c μ :<d Jj 4) *H
4) 4) μ 4-) E
Id 4) 4-1 :(d in m co <t » . ® a a «< H 3 •rirH μ :cd I <d o oo o o o ° o o ;_: © μ
. iH O E -X <0 r-l rHrH HHHHh r-l I I LJ > <U
·... C 4) -a 3 4) to X X X χχχΧχ x «·Η ©
. © T3 Ο ,Χ Ή O in »H rH HHHHh rH mCW
. . 4J c μ c c-h 2 I
·.· μ C c Η -H 44 u Id rH
•H 43 i .£x E
.... Ή C <d > :®,x^ 43 a> *4J r* r- r- a [?h O' 1 -Π ffl c to tow W r- «Η I I r* II -2-H3.
Ό O Id N NN N W co w C
• -H 44 4X N ffl N I I in ..0+) ij -H » w 4) S μ r-~ •; · , 4) g :id
f* X I r·* i" 5 :id V
··· Ή Ο ·Η id t—I - rH —- .3 to ; I μ μ -p I ό rH i r- iί ·· m-H ή c m-π n n n u ·· i •Oi-Hid »OC *c ..+° OW AX u 10« «βο 10 102248
Esimerkki 2 B« burgdorferi 31-kD antigeenille spesifisen monoklonaalisen vasta-aineen vaikutus Lvmen borrelioosin etenemiseen Scid-hiirissä 5
Monoklonaalisen vasta-aineen valmistus
Immunisoitaessa B. burodorferi-eliöillä hiirtä, jolla on koskematon immuunijärjestelmä, ekspressöitiin polyklonaali-sia vasta-aineita, jotka ovat B. burodorferi-spesifisiä 10 (katso taulukko 1).
10 viikkoa vanhoja naarashiiriä sukusiitoskannasta BALB/c immunisoitiin siirrostamalla (Beschallung) homogenisoiduilla borrelioilla (B. burgdorferi, kanta B31; ATCC 35210).
15
Immunisisointimuistiinpanot: päivä 0: 200 pg borrelia-antigeeniä täydellisessä Freundin adjuvantissa ihonalaisesti päivä 21, 35, 49, 63: altistus 100 pg:lla borrelia-antigee-20 niä fosfaattpuskuroidussa suolaliuoksessa i.p.
päivä 66: pernan ottaminen ja yksittäissolususpension valmistus.
Immuunit pernasolut fuusioitiin vakiomenetelmillä Ag8-PAI 25 myeloomasolulinjan kanssa polyetyleeniglykolia käyttäen (J.H. Peters, H. Baumgarten, M. Schulze "Monoklonale Antikörper" Springer-Verlag, Heidelberg) .
Fuusiotuotteet levitettiin 96-kaivoisiin kudosviljelmälevyi-30 hin. 8 päivän kuluttua soluviljelyssä eloonjääneet solut ... tutkittiin B. buradorferi-soesifisten monoklonaalisten vasta-aineiden läsnäollessa kiintofaasi-ELISAn avulla (J.H.
♦ · · ’ Peters et ai., katso edellä).
·;··· 35 Hybridoomasoluja vasta-aineita tuottavista viljelmistä kloonattiin rajalaimennusmenetelmällä. Yksittäisten kloonien ... eloon jääneet solut karakterisoitiin seuraavaksi uudelleen kiintofaasi-ELISAssa samoin kuin "Western-Blot"-analyysillä u 102248 ja immunofluoresenssitutkimuksilla. Monoklonaalisessa hybri-doomasolulinjassa tuotetaan alaluokan IgG2b monoklonaalisla vasta-aineita LA-2 ja erotettiin ja saatettiin reagoimaan "Western-Blot"-analyysissä kaikkien tutkittujen B. burador-5 feri-kantojen (mm. isolaattien ZS7 ja B31) 31 kDa:n rakenteen, (Osp-A) kanssa kontaktissa elektroforeettisesti SDS-geelillä erotettujen ja "Westernblot"-menetelmällä membraa-nille siirrettyjen B. burodorferi-proteiinien kanssa. Monoklonaaliset vasta-aineet LA-26.1C (anti-ospA IgGl), LA 25.1 10 (anti-OspB (34-kDa antigeeni); IgG2b) ja LA 27.1 (anti-OspB (34-kDa antigeeni, IgGl) valmistettiin analogisella tavalla ja karakterisoitiin.
Hiirten infektoiminen B. burodorferi ZS7tllä 15 C.B-17 Scid-hiiret infektoitiin 1x10® elinkykyisellä B.
burgdorferi ZS7-eliöllä ihonalaisesti hännäntyveen.
Hiirten käsittely vastaseerumeilla
Infektoidut Scid-hiiret käsiteltiin kahdesti viikossa eri-20 laisilla vastaseerumeilla. Ensimmäinen ryhmä käsiteltiin NMS:llä (normaali hiiriseerumi), toinen ryhmä IMS:llä (immuuni hiiriseerumi) ja kolmas ryhmä monoklonaalisella vasta-aineella LA-2 (B. buradorferin 31-kD vasta-ainetta vastaan). Annettujen vastaseerumien annos oli ensimmäisellä viikolla 25 100 μΐ tai 100 μς LA-2:lla, toisella viikolla 200 μΐ tai 200 μφ LA-2:lla, ja kolmannella viikolla 300 μΐ tai 300 μg ::: LA-2:lla.
• · ·
Taulukko 2 osoittaa, että käsittelemättömillä tai NMS:llä 30 käsitellyillä Scid-hiirillä kehittyi 12 päivän kuluttua kliinisiä ja histopatologisia merkkejä niveltulehduksesta • · · tai sydäntulehduksesta ja maksatulehduksesta. Sitävastoin • · : sai monoklonaalisen vasta-aineen LA-2 anto Scid-hiirillä aikaan oireiden merkittävän vähenemisen. Kliinisesti oli 35 havaittavissa ainoastaan lieviä nivelten punoittumisia ja . . histopatologisesti vain merkityksettömiä muutoksia. IMStllä käsitellyillä hiirillä ei havaittu lainkaan kliinisiä nivel-tulehduslöydöksiä.
12 102248 B. burgdorferi-tarttuttaian osoitus in vitro-kasvatuksella onnistui vain hiirillä, jotka olivat joko käsittelemättömiä tai NMS:llä käsiteltyjä. LA-2:lla tai IMS:llä käsitellyillä hiirillä ei voitu osoittaa B. burqdorferia (taulukko 2).
5 1 · · • · · • · 13 102248 e
•H
H
0)
<H
M — O 0) Ό 3 0 01 X 1-1 3 id 3 X > Λ-Η to ++ I I O id • to M ffl O -
\ to co 3 3 Ό Ό XI X
<u <u g I—1 i—I I (1) 3 3 Id β +) X Or1
id c id o cn + + I I
h sid to x o
Η MH
•H >1 id -H O
0) to g X X
s 3
M
0) 3 a) ·— I a> to c id G o id <D ft-H o
4J 0) O O' + + I I
CO M X O
Id tO r—I 10 r-l
> 3 :id ·1 O
Ό ·Γ-ιΧ X
id x
•r- ® G
Had C id 3 > <D
r-i x·1 a
I—I rH Sid -H O
•η φ ft e ++i I
Η > -H
V -H CN -H
<4-1 CHH
... O
. . TJ
... o :.:: u 3 id
X H
.... rH
, · · · CN · -rH
_ Λ E CN
... o S>i3 W 03 I
• : - « > hh I s a < .·· « ιΗ φ Φ z H X to
D Φ 4J Φ O
X X X to X
P X -Η -H 3 < -H 01 X tO 3 E1 to sid fi 3 5
sid ^ id H
^ U G
a) so
... 3 3 X
Φ 3 to *...1 -Η TJ ft to
H -H M
l C ·ΗΟ Sid >1
• -H to > X
X Φ Ή
I Γ- -H M
Ό Ή H H
•H Id I Φ
..... O xm mcocsnCS
W 3 · 0)
Id U II II II II H C
P-44 Φ ·Η »H.H id C3CC>id I M X ·Η > CQ ·Η 3 c • ·Η id β U AM © o 14 102248
Esi mprkki ^ B. burgdorferj—ZS7;n 31-kD antigeenin (OspA) ekspressinklnn-nans
DNA-valmi ahP
5 Suurirnolekyylistä DNA: ta B. bnrgrinrferi -kannasta ZS7 puhdistettiin modifioidulla Kellyn väliaineella kasvatuksen jälkeen. Spirokeetit pelletöitiin sentrifugoimalla 10000 gtllä ja pestiin kolmesti PBS-puskurissa. Kuivattu pelletti suspen-doitiin uudelleen 10 ml:aan TE:tä (10 mmol/1 Tris, 1 mmol/1 10 EDTA, pH 7,4), käsiteltiin 15 min ajan lysotsyymillä (5 mg/ml) 30 C:ssa, ja DNA vapautettiin lisäämällä 1 ml 20-% SDS:ää. Kun oli lisätty 1,5 ml NaCl:ää (5 mol/1), liuos uutettiin samalla tilavuudella fenolia, jota seurasi uutto kloroformilla. Sitten DNA saostettiin lisäämällä 2 tilavuutta 15 absoluuttista etanolia ja inkuboimalla yön yli -20 °C:ssa.
Sentrifugoinnin jälkeen jäännös liuotettiin 0,5 ml:aan TE:tä ja inkuboitiin 45 minuuttia 55 °C:ssa DNAasivapaalla RNAasi A:11a (20 mg/ml), jota seurasi 1 tunnin käsittely proteinaasi K:11a (0,1 mg/ml) 37 C:ssa. Liuos säädettiin 0,3 mol/1 NaO-20 Ac:tä, ja uutettiin edellä kuvatulla tavalla fenoli/klorofor-milla. Etanolilla saostuksen jälkeen DNA otettiin jälleen TE:hen.
: Ceeni pankin valmistus ·,· · Suurirnolekyylistä DNA:ta hienonnettiin 3 s ajan ultraääniaal- ^:25 loilla tilastollisesti (statistisch). Lisäksi käytettiin T4-DNA-polymeraasia (30 min 37 °C:ssa) ja K1enow-entsyymiä (5 • · · min 20 °C:ssa) valmistettujen DNA-fragmenttien päiden tekemiseksi tylppäpäisiksi. Tylpät päät omaava DNA liitettiin eks-pressiovektorin pUEXl BamHI-kohtaan käyttämällä adaptorikloo- • · « ^.130 nausstrategiaa (Bresan ja Stanley, Nucl. Acid. Res. (1987) s. 1056). Molekyyliseulakromatografiällä Sephacryl S-1000:lla « · • *·· suoritetun kokovalintavaiheen ja kompetenttien Escherichia coli (MC 1061) -isäntäsolujen transformoinnin jälkeen määri- ] . tettiin yhdistelmä-DNA:n täplänmuodostusyksikköjen (pfu) • · ,,.35 osuus seuraavalla tavalla: poimittiin satunnaisesti välit- • · tuja kolonioita ja kasvatettiin kylläisyyteen 15 102248 asti 2 inlissa valintaväliainetta (LB, jossa oli 25 pg/ml ampisilliinia). Plasmidi-DNA eristettiin tavanomaisella alkalisella lysointimenetelmällä, ja katkaistiin seuraavaksi BamHI:llä. Yli 50 % analysoiduista plasmideista sisälsi 5 keskimäärin a 1,5 kb pitkiä DNA-insertioita.
B. burgdorferi 2S7-geenipankin siirtäminen levyille ia seulonta
Solut siirrettiin leyille, jotka olivat kooltaan 24x24 cm, 10 tiheyteen 7000 pfu/levy, ja inkuboitiin yön yli 30 °C:ssa.
Kolonioiden siirtämisen jälkeen nitroselluloosasuodattimille (NC) 8-galaktosidaasifuusioproteiinien ekspressio indusoitiin inkuboimalla 2 tuntia 42 °C:ssa. Suodattimet siirrettiin Whatman 3MM-paperille, joka oli käsitelty 5-% SDSrllä, 15 ja inkuboitiin noin 25 min 95 °C:ssa. Sitten proteiinit käsiteltiin "electroblotting"-menetelmällä käyttäen tavallista puolikuivan "Westernblotting"-menetelmän suorittamiseen tarkoitettua laitetta. Immuunireagoivat kloonit tunnistettiin NC-suodattimien DNAasi-käsittelyn jälkeen ekspres-20 sioseulonnalla monoklonaalisia vasta-aineita käyttäen. NC-suodattimien ei-spesifiset sitoutumiskohdat tyydytettiin inkuboinnilla useita tunteja huoneenlämpötilassa PBS:llä, joka sisälsi 0,2 % (paino/tilavuus) gelatiinia ja 3 mmol/1 NaN3:a. Seuraavaksi suodattimia inkuboitiin kasvatuksesta 25 eloonjääneen anti-31-kD monoklonaalisen vasta-ainekloonin LA-2 kanssa 18 tuntia sekoittaen jatkuvasti. Perusteellisen • · · pesun jälkeen (PBS + 1 % (tilavuus/tilavuus) Triton X-100; PBS + 0,5 mol/1 Natriumkloridia; PBS + 1 mol/1 Natriumklo- ridia; kukin vaihe 10 min) suodattimia inkuboitiin 1,5 30 tuntia huoneenlämpötilassa 1:10000-laimennoksen kanssa ... peroksidaasimerkittyä F (ab) 2 “valmistetta kani-anti-hiiri- '··· IgG-vasta-aineita sekoittaen jatkuvasti. Suodattimet pestiin * · V jälleen edellä kuvatulla tavalla, ja inkuboitiin sitten diaminobentsidiinin kanssa peroksidaasisubstraattina.
·:··; 35 10^:stä yhdistelmä-DNA-PFU:sta 20 kloonia reagoi monoklonaa lisen vasta-aineen LA-2 kanssa.
ie 102248 31-kD vasta-aineen (OspAI sekvenssianalyysi LA-2:n kanssa vasta-ainereaktiossa positiivisen yhdistelmä-DNA-E. coli-kloonin insertoitunut DNA eristettiin tavallisella tavalla. Tämän kloonin DNA-insertio sisälsi B. buro-5 dorferin 31-kD vasta-ainetta koodittavan ospA-geenin koko pituuden. Insertion sisältävä plasmidi nimettiin pZS-7/31-2:ksi, ja tallennettiin Budapest-sopimuksen mukaisesti kansainväliseen DSM-laitokseen (numerolla DSM 5528).
10 Tämän immuunipositiivisen kloonin tuottama yhdistelmä-DNA-proteiini nimettiin rZS7/31-2:ksi. Määritettiin ospA-geenin koodittava DNA-sekvenssi. Se esitetään yhdessä siitä johdetun OspA-proteiinin aminohapposekvenssin kanssa kuvassa 1.
15 Kuvasta 1 käy myös selville, että B. buradorferin 31-kD antigeeni vastaa proteiinia, jossa on 273 aminohappoa.
Ei-fuusioproteiinien valmistus a) Kloonia, joka ekspressöi immunoreaktiivista proteiinia 20 rZS7/31-2, kasvatettiin yön yli 30 °C:ssa 10 ml:ssa LB:tä ampisilliinin kanssa. 1 ml viljelmää lisättiin 100 ml:aan valikoivaa väliainetta, ja kasvatettiin 30 eC:ssa hyvin ilmastaen tiheyteen 8x10^ solua/ml (A600-0,2). Yhdistelmä-DNA-proteiinin ekspressio saavutettiin siirtämällä isäntä-"V 25 solut 42 °C:een. Solut pestiin jäähdytyksen ja sentrifugoin-;;; nin jälkeen STE-puskurissa (10 mmol/1 Tris, 100 mmol/1 natriumkloridia, 1 mmol/1 EDTA, pH 8,0), ja jäännös suspen-*·* ' doitiin uudelleen 0,6 ml:aan lysointipuskuria (25 % sak karoosia, 50 mmol/1 Tris, pH 8,0). Kun oli lisätty 150 μΐ 30 lysotsyymiä (10 mg/ml), seosta inkuboitiin 15 min ajan jäällä, ja sitten inkuboitiin edelleen (15 min jäällä) 18 μ1:η kanssa DNAasi l:tä (10 mg/ml) 5 μΐ 1 mol/1 magnesium-•V kloridin läsnäollessa. Lopulta lisättiin 250 μΐ 4x deter- genttiseosta (1 % Triton X 100, 0,5 % deoksikolaattia, 0,1 35 mol/1 NaCl, 10 mmol/1 Tris, pH 7,4), ja inkuboitiin 5 min ajan jäällä. Sentrifugoinnin jälkeen jäännös pestiin kahdesti puskurilla A (50 mmol/1 Tris, 50 mmol/1 NaCl, 1 mmol/1 EDTA, pH 8,0), ja suspendoitiin uudelleen 9 tilavuuteen • · · 17 102248 puskuria A, joka sisälsi lisäksi 8 M ureaa, ja inkuboitiin 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Koetin laimennettiin 9 osalla puskuria B (50 mmol/1 KH2PO4/K2HPO4, 50 mol/1 NaCl, 1 mmol/1 EDTA, pH 10,7), ja sekoitettiin 30 min huoneenläm-5 pötilassa, jolloin pH pidettiin K0H:ta lisäten pH-arvossa 10,7. Kun liuoksen pH oli säädetty pH-arvoon 7,0 lisäämällä HCl:ää, koetinta dialysoitiin yön yli puskuria A vastaan (4 °C:ssa) ja sentrifugoitiin 10 min ajan 4 °C ja 10000 r/min:llä SS34-roottorissa. Yläkerros, joka sisältää yhdis-10 telmä-DNA-proteiinin, säilytettiin -20 eC:ssa.
b) Koska klooni erittää proteiinia rZS7/31-2 myös kasvatus-väliaineeseen, on puhdistus (affiniteettikromatografia) mahdollinen suoraan kasvatuksen päällä olevasta nesteestä.
15
Yhdistelmä-DNA-OsnA (ei-fuusio)-proteiinin valmistus ia affiniteettikromatoorafinen puhdistus
Seuraavaksi yhdistelmä-DNA-proteiinit puhdistettiin affini- teettikromatografiällä. Tähän tarkoitukseen puhdistettuja 20 monoklonaalisia vasta-aineita LA-2 sidottiin kovalenttisesti aktivoituun Sepharose CL 4B:hen. Yhdistelmä-DNA-proteiinin sisältävä dialysoitu ureauute absorboitiin hiiri-IgG-
Sepharose CL 4B;lle ja lisättiin seuraavaksi LA-2-Sepharose CL 4B-pylvään päälle. Intensiivisen pesun jälkeen sitoutunut 25 yhdistelmä-DNA-proteiini eluoitiin 0,1 mol/1 glysiini/HCl il; 0,1 mol/1 NaCl, pH 2,5:llä. Kerättyjen jakeiden pH säädet- « » **··* tiin neutraaliin pH-arvoon lisäämällä heti 1/10-tilavuus *·* 0,5 mol/1 K2HP04:ää. Proteiinia sisältävät jakeet konsent roitiin ja dialysoitiin. Puhdistusaste määritettiin SDS-30 polyakryyliamidigeelielektroforeesin avulla.
t”* Yhdistelmä-DNA-proteiinin rZS7/31-2 immunologinen karak- terisointi \ Yhdistelmä-DNA-proteiini rZS7/31-2 tutkittiin immunologises- .35 ti. Vertailuun otettiin yhdistelmä-DNA-proteiinia rB31/41- 1 < 4 9 (B. burgdorferin 41-kD pinta-antigeeni).
« · < · * * * · · ie 102248
Tasapohjaisia mikrotiitterilevyjä päällystettiin yhdistelmä-DNA-proteiinien rZS7/31-2 ja rB31/41-9 ureauutteilla tai geeniekspressioon käytetyn E. coli-kannan MC 1061 ureauut-teella. Epäspesifiset sitoutumiskohdat estettiin 0,2 % 5 gelatiinilla fosfaattipuskuroidussa keittosuolaliuoksessa. Mäin esivalmisteltujen mikrotiitterilevyjen kaivot sekoitettiin ilmoitettujen monoklonaalisten vasta-aineiden LA-2 (anti-31 kD, Osp-A), LA-1 (anti-41 kD, flagelliini) tai ACHT-2 (anti-ai-antikymotrypsiini) kanssa.
10
Sitoutuneet monoklonaaliset vasta-aineet saatettiin reagoimaan peroksidaasimerkittyjen lajispesifisten anti-hiiri-im-munoglobuliinien kanssa. Sitoutuneet peroksidaasimerkityt vasta-aineet kvantisoitiin peroksidaasisubstraatti ortofeny-15 leenidiamiinia käyttäen. Absorptio aallonpituudella 492 nm (A492) määritettiin suoraan mikrotiitterilevyllä automatisoidun levyfotometrin avulla. Absorption voimakkuus on mitta sitoutuneiden monoklonaalisten vasta-aineiden määrästä.
20 Monoklonaalinen vasta-aine LA-2 reagoi spesifisesti rZS7/31-2:n, muttei MC 1061:n tai rB31/41-9;n kanssa. Monoklonaali-sen vasta-aineen LA-1 kontrollireaktio on ΓΒ31/41-9:lle spesifinen. Monoklonaalisella kontrollivasta-aineella ACHT-2 (negatiivinen kontrolli) ei ole merkittävää reaktiota 25 millään proteiineista.
;*·' Kuvassa 2 esitetään, että monoklonaalisen vasta-aineen LA- • · 2 spesifisesti tunnistama antigeeniepitooppi ekspressöityy yhdistelmä-DNA-proteiinilla rZS7/31-2, joka kloonattiin B.
30 burgdorferi ZS7:n genomista.
: Esimerkki 4 • · · :Y 31-kD (OsnA)- tai 34-kD antigeenille (OsnBl spesifisten ‘ vasta-aineiden vertailu vasta-aineiden kanssa, jotka ovat 35 spesifisiä 41-kD antigeenille fflagelliini)
Monoklonaaliset vasta-aineet LA-2 ja LA-26.1 tunnistavat 1: * 31-kD antigeenin OspA, ja ovat isotyyppiä IgG2b tai IgGl.
’ Monoklonaaliset vasta-aineet LA-25.1 ja LA-27.1 tunnistavat 19 102248 34-kD antigeenin OspB, ja ovat isotyyppiä IgG2b tai IgGl. Monoklonaaliset vasta-aineet LA-10 ja LA-21 ovat spesifisiä B. burgdorferin flagelliin liittyvälle 41-kD periplasmaat-tiselle proteiinille, ja ne ovat isotyyppiä IgG2a tai IgGl.
5 Kaikki edellä mainitut vasta-aineet saatiin esimerkissä 2 kuvatun menetelmän mukaisesti. Tässä kokeessa oli määrä ottaa selville, voivatko muuta B. buradorferi-antiaeeniä vastaan suunnatut monoklonaaliset vasta-aineet saada Scid-hiirissä aikaan suojan Lymen borrelioosin kliinisiä oireita 10 vastaan.
Polyklonaalinen anti-B31-immuuniseerumi (IMS) kerättiin C57BL/6-hiiristä 91 päivää ihonalaisen siirrostuksen jälkeen 1x10** B. burgdorferi B31-eliöillä. Polyklonaalinen anti-15 ZS7-IMS kerättiin C57BL/6-hiiristä 68 päivää ihonalaisen siirrostuksen jälkeen 1x10** B. burgdorferi ZS7:llä. Molemmat seerumit sisälsivät 60 μg/ml spesifisiä vasta-aineita ELISA-järjestelmällä määritettynä (Schaible et ai., J. Exp. Med. 170 (1989) 1427-1432). Normaali hiiriseerumi (NMS) saatiin 20 infektoimattomista C57BL/6-hiiristä.
Siirrostushetkellä ja sitä seuraavin 4-päiväisin aikavälein ilmoitetut vasta-aineet, IMS, NMS tai PBS-puskuri siirrettiin passiivisesti vatsaontelonsisäisesti Scid-hiiriin '··/ 25 seuraavan pöytäkirjan mukaisesti: ·;;; päivä 0 ja päivä 3: 100 μΐ, '·.·* päivä 7 ja päivä 10: 200 μΐ, : päivä 13 ja päivä 17: 300 μΐ.
30 Scid-hiirissä, jotka käsiteltiin joko anti-ZS7IMS:llä, anti-B31IMS:llä tai monoklonaalisilla vasta-aineilla LA-2, ei havaittu lainkaan näkyviä kliinisiä oireita niveltulehduk- • · · sesta, ts. sääri-nilkka-nivelissä ei esiintynyt lainkaan punoitusta ja turvotusta 21 tarkkailupäivän aikana. Myöskään 35 sydäntulehduksesta tai maksatulehduksesta ei havaittu lainkaan merkkejä. Histopatologisissa tutkimuksissa nivelissä, sydämessä ja maksassa ei havaittu lainkaan muutoksia Scid- 20 102248 hiirissä, jotka oli käsitelty joko anti-ZS7-IMSillä, anti-B31-IMS:llä tai monoklonaalisella vasta-aineella LA-2.
Myös toinen OspA-spesifinen monoklonaalinen vasta-aine LA-5 26.1 isotyypiltään IgGl sannoin kuin OspB-spesifiset vasta- aineet LA-25.1 ja LA-27.1 pystyivät lieventämään niveltulehduksen, sydäntulehduksen ja maksatulehduksen kliinisiä oireita. Tällöin tutkituissa elimissä nähtiin lieviä patologisia muutoksia.
10
Vastakohtana tälle nähtiin Scid-hiirissä, joille oli annettu joko PBS-puskuria, NMSrää tai monoklonaalisia vasta-aineita flagelliinia vastaan (LA-10 tai LA-21), kliinisiä merkkejä niveltulehduksesta, käsittelemättömille Scid-hiirille tyy-15 pillisiä, patologisia muutoksia (taulukko 3). Vaikeat oireet viimeksi mainituissa eläimissä olivat ajan kuluessa siirros-tuksen jälkeen kasvavia, eivätkä heikentyneet koko tarkkailun aikana. Scid-hiiristä, jotka oli käsitelty etukäteen joko anti-ZS7-IMS:llä tai vasta-aineella LA-2, ei voitu 20 eristää lainkaan spirokeettoja. Vastakohtana tälle oli spirokeettojen osoitus mahdollista immuno£luoresenssilla ja kasvattamalla Scid-hiirien verestä, jotka hiiret oli käsitelty PBS-puskurilla, NMSillä tai monoklonaalisilla vasta-aineilla LA-25.1, LA-26.1, LA-27.1, LA-10 tai LA-21.
25 • · »I • « · ·1· • · · • · · I · · · · M» 102248 .5 I·* g i m s E m 2 03 3 m e to c n Ή β·Η CS ο β e *^J ·Η M -H 3 © :9 O g 3 M + + + I I + + + + +^3 Ή ό <o *n 3 2 *d O 4J M 2 9 M 4J 2 O £ £ 3.H33 £ >i JQ O +J rH 9 to 3 m ·* 3 . 0 > 0 . 01 mi « β I to
1 (0 -H
Λ + 3 — +> J· ·Η to :3 ,¾ 3 > +) Ό | 3 3 ·£ * * * ^ Η +>
® + + I I I + + +1 Ή +1 -H
ιΗ ·Η (Q
3 Λ to +> to
3 -H
«0 I 44 „ I 'Ο Ή <0 \ >i *· (0 ·*» « £ * cn , 3 9 4J 2 <0c Ή dj 3 44 3
O [JO * SB
«ti ® + +,,ι+ + Ή+,+,«3 o .3 a 3 -P μ +> -H -0 2 3 τί 0> 43 d aP <0
Ä > IE
“’β »1 3 H ·· (0
Ό Ή I—I
r. Λ -PH
£(i) μ ·η 2* <o w
5 3 > M
’d +J 3 3 .5 rH ++1 I I + + +1 +l +1 <0 ® 'j m M to > 3 3
•*4 β MO
3
•H 3 rH
CU 3 <H
,04 Λ 3 Λ 3 O
Λ >·, fSCNiHr-ICNiH+>C
— — ® g Η-P -P -H -Hi 3 i—I rH ·Η b
;.; rH i—I rH O *H
. CO 3 O O E
... MM — ·~~· r-l -P
...: O +> +> -H -H -MS
...44 3 3 3 3 *H
: : 44 oo *h -H 3 -h
•••3 44 44 *rl ·Η +» O
"· I—I rH I—I -— —" —- M
::· 3 33 rHrHriJfflOB-H
’ 3 >, 3 3 CO CO 33Ο4Ο4Ο4 3
Eh H eeSS — O'O'MMMB
3 ·Μ·γΗΗΗι<330003Μ 4J >> I I O4 1—It—I — — to 3
Jj -Η ·Η rH Ρ» ffl «H »H 44 +>
r| -H -rl PO CO O '— —'rHrHi—( 0‘H
to HJHJCQOH*-' ·*·+>0 :(3 3311 0 rH VO if) 3 to M 0'0'-r|-r|CH«HCNCNCNCN3 0
.··. 3 3 +> +> I I I I I I E
·;·: 5£g§a3a3ä3c-5
3 M
CO CO M3
CQ S *H *H
Ό PH 2 O' M
•rl OO
3 0 — rH T3 p CO :3 0*0
3 3 M +> 3 M
3 r* 3 :3 3 3 3 44 t-π 4J :3 co co to cn vo co co co co co CLi44 Λ
-M I M E II II II II II II II II II II O *H
M · -H 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 +> 3 · •H CQ ·Μ 44 M > CQ| •H · 43 3 -r| 43 U '—-H W + 0 22 1 0 2 2 4 8
Esimerkki 5
OspArlla immunisoiduista hiiristä olevan antiseerumin vaikutus Lvmen borrelioosin etenemiseen Scid-hiirissä Tässä kokeessa voitiin osoittaa, että natiivin OspA:n (eris-5 tetty B. burgdorferi ZS-7:stä) tai yhdistelmä-DNA-OspA:n (eristetty E. coli-bakteereista, jotka on transformoitu yhdistelmä-DNA-plasmidilla pZS-7/31-2 (DSM 5528)) antamisella voitiin normaaleissa hiirissä (hiirikanta C57BL/6) indusoida suojaavien polyklonaalisten vasta-aineiden muodos-10 tuminen. Jos näitä vasta-aineita annetaan Scid-hiirille, saadaan aikaan suoja Lymen borrelioosia vastaan. Täten osoitetaan, että yhdistelmä-DNA-OspA indusoi natiivin OspA:n kanssa verrattavissa olevan suojaavan immuunivasteen. Kokeen suorituksen tulokset ja yksityiskohdat tässä kokeessa esi-15 tetään taulukossa 4.
Yhdistelmä-DNA-OspA:n valmistus on esitetty esimerkissä 3.
Natiivin OspA:n valmistus samoin kuin hiirten immunisointi 20 OspA:lla tapahtui seuraavalla tavalla:
Natiivin 31-kDa OspA:n rikastua 3,2x10*0 spirokeettia sekoitettiin 2 tuntia 4 °C:ssa 5 mlsssa PBS/7,5 ml n-butanolia proteaasi-inhibiittorien (5 25 mmol/1 EDTA, 5 imnol/1 bentsamidiini ja 0,5 mmol/1 PMSF) läsnäollessa magneettisekoittimella. Tämän jälkeen seosta sent- I · · · .···. rifugoitiin 90 min 10000 r/min ja 4 °C Sorvall-sentrifuugis- • » » sa (vakiokulmaroottori) . Vesifaasi, joka sisältää pintapro- • · · teiinit, poistetaan ja pestään kolmesti kloroformilla.
30
Proteiinipitoisuus määritetään ekstinktiolla aallonpituudella 280 nm tai BCA-testillä.
• · · • • · · * * "Silbergel"- tai "Westernblot"-analyysillä havaittiin anti-35 B. burqdorferi-kaninseerumilla kannalle ZS7 päävyöhyke molekyylipainoalueella 31 kDa samoin kuin heikkoja vyöhykkeitä kohdilla 20, 34 ja 65-68 kDa. B. buradorferi-kannan B31 butanoli/vesi-valmiste antoi tulokseksi päävyöhykkeen 23 1 0 2 2 4 8 31 kDa:lla, samoin kuin heikot vyöhykkeet kohdilla 20 ja 34 kDa.
Hiirien immunisointi natiivi- ia vhdistelmä-DNA-OspA;lla 5 C57BL6- tai C.B-17-hiirille annettiin kolmesti 7-10 päivän etäisyydellä 5 pq (natiivi-OspA:ta kannasta B31) tai 10 pq (natiivi-OspAita kannasta ZS7, yhdistelmä-DNA-OspAsta ZS7:stä) 100 piisaa adjuvanttia (ABM3; yhtiö Sebak, Aiden-bach, SLT) ihonalaisesti hännäntyveen. Aikaisintaan 3 viikon 10 kuluttua viimeisestä immunisoinnista voitiin 3-4 kuukauden ajan ottaa seerumia. Spesifisten vasta-aineiden pitoisuus määritetään ELISA-j ärj estelmässä.
| t | 1 « • · · · • · · » · • · • · · • « « • · t • · · * « · · • · • « Ψ Ψ t 24 1 .S i t 102248 O M :<d
0 ®c ft J
P MH <1) _ 1-1 0) PC vo CO CN co C , Μ O *P \ \ \ \ (U ·? Ο OS voooo w 2
P O <0 'P J
•Η Ρ +> § Λ
Gi fl +> <0 ^ « Λ -P +» O 01 ^ 01 . 01 0 3 m o p n -P Wl p a s ·ρ o 4d -p o
•H ® <N
<0 — > :C C «1 οι ai i-ι £ 01 C Ή ή JS *Ρ *Ρ 3.¾ g, 7 > 2 ·Ρ -Ρ W ;Ρ 5 Λ -Ρ CO +111 Ν :5 ”1 ι ·ρ ft ? Ό Λ ·Ρ L *η ο) ρ *; <ο M yj (ΰ Ρ w +1 -Η 2 c Ρ 3.
®ίβ 0) 3 CN +111 ο 0 - οι Λί +> σ ® S ·ρ s -ρ ρ ™ 2 3 Ό 3 g "m Ό pC ιΗ Λ r~ .2-Η 0) 3
Jo rH X pH +1111 · :«J
d +j 3 mi >
2 44 +> 3 w -P
Sd) rl O :<ö
5 +i 0) 44 o G
% 3 >-P
u ·Η ·Η ·Η *<d ** tl c > > -7
J1 (0 *P pH
^ pH :<e a 2 r-ι — G _ λ·ρ -ρ 2 (rt P pH —· 2 -p, <1> H M ·“* ή o w a ^ a ρ p w a P< o O -P SH o -* +j Ό 3 H f ° :(Ö ..·. O W O 0 I — *“· >
^ ” p 44 - < ~ -P
. 44 ,—i 3 *P 25 :(rt ::: J ^ g > Q * a
... pH (ή 0) -Hl G
. 3 c·, C ·Ρ · · +> •: · 3 o ml -h +> ό ·ρ οι ···· E-· rH >1 > <Ö -C .to .···. „14 G pH -P G >1 01 .. O®® *P — — ^C3 ··· cc-Ρ -p ^ +J§+1 — .·.·. o -Ρ -P <0 < < « s 01 · ·.· · g g -H en G G P S; o ft oi di tool p g. ρ * e-Ρ :« e OO Ρ ί ρ·Ρ 0) +> 44 Il -P e -P ^ +) ·Ρ <Ν ·Ρ ·Ρ -P ;(rt ·ρ to +: (ΩΙΡ+) ®c®*“ ρ β) m <s g g o> a g MH 44 G H «J <d C;5 Q)p •Ρ 'Ρ χ· <U ft ... tn G G e
. - O 01 :3 I . -H O
*...' g ® p «0 n (0 o
10 44 :<Ö +J , CO
‘.5 :2 M ® ^ Ρ Ό g «j +) • p +3 3 > v oi ® ....: 0)0) Ό 44 -(0¾1-1 MH pH -P 3 G 3 ^ P 3 3 O pH 2:0 . =!? ... : o +» -P w e .2 +J > ’ TJP CC *p rJ JO *p cd) «n d) :«J flj > :3
μ> 44 pH +> g w (β G
;··. C-P -Ρ I P VO VO ΓΜ CO g oo 3
Xl C P · -P *POp * ,· ·. -P m-P il il il il top s-
• «3 -p · xs CX0)pH
mi*n Λ u —’ e e e e mho) a
Claims (18)
1. Menetelmä rokotteen valmistamiseksi Lymen tautia vastaan koe-eläimen, edullisesti hiiren, lymfosyytteistä tai pernasoluista, joka eläin on immunisoitu Borrelia burgdorferi -orga- 5 nismilla tai sen osilla, tunnettu siitä, että tuotetaan lymfosyyteistä tai pernasoluista solufuusiolla hybridooma, joka sisältää monoklonaalista vasta-ainetta, joka on spesifinen B. burgdorferi -kannan ZS7 (DSM 5527) 31kD-antigeenille (OspA) tai 34kD-antigeenille (OspB) ja estää niveltulehduksen, sydän-10 tulehduksen ja maksatulehduksen kehittymisen immuunikatoisissa koe-eläimissä, jotka on infektoitu elinkykyisillä patogeeni-silla B. burgdorferi -organismeilla.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, 15 että vasta-aine on spesifinen B. burgdorferi -kannan ZS7 (DSM 5527) antigeenille.
3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että se sisältää vaikuttavana aineena luokan IgG, edullisesti 20 alaluokan IgG2b tai igGl, monoklonaalista vasta-ainetta.
4. Patenttivaatimuksen 1, 2 tai 3 mukainen menetelmä, tun- nettu siitä, että se estää niveltulehduksen, sydän tulehduksen ja maksatulehduksen kehittymisen immuunikatoisissa Scid-hii- : .·25 rissä, jotka on infektoitu elinkykyisillä B. burgdorferi-eli-« · · ”*·' öillä, kanta ZS7. • · · 1 • · · · • · · • ·
5 ZS7 (DSM 5527) eristämiseksi ja uudelleenkasvattamiseksi, tunnettu siitä, että aiheuttaja otetaan talteen immuunikatoisista koe-eläimistä, edullisesti hiiristä, jotka on edeltä käsin in-fektoitu aiheuttajalla, jolloin aiheuttajan patogeenisuus säilyy. 10
5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, • · · *·’ * että monoklonaalinen vasta-aine on LA2 OspA:ta vastaan, jota 30 vasta-ainetta erittää hybridoomasolulinja ECACC 89091302. • · « i i · • · • · · ί,ί
: 6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, ;·* että monoklonaalinen vasta-aine on LA 26.1 OspA:ta vastaan, \..t jota vasta-ainetta erittää hybridoomasolulinja ECACC 90050406. :’35 26 102248
7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että monoklonaalinen vasta-aine on LA 25.1 OspB:tä vastaan, jota vasta-ainetta erittää hybridoomasolulinja ECACC 90050405.
8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että monoklonaalinen vasta-aine on LA 27.1 OspB:tä vastaan, jota vasta-ainetta erittää hybridoomasolulinja ECACC 90050407.
9. Patogeeninen B. burgdorferi -kanta ZS7, DSM 5527. 10
10. Yhdistelmä-DNA, tunnettu siitä, että se koodittaa patent tivaatimuksessa 1 esitettyä antigeeniä, ja sisältää (1) seu-raavaksi esitetyn nukleiinihapposekvenssin tai (2) sitä geneettisen koodin degeneraation puitteissa vastaavan sekvens- 15 sin: atgaaaaaatatttattgggaataggtctaatattagccttaatagcatgtaagcaaa at gttagcagccttgacgagaaaaacagcgtttcagtagatttgcctggtgaaatgaacg tt cttgtaagcaaagaaaaaaacaaagacggcaagtacgatctaattgcaacagtagaca ag 20 cttgagcttaaaggaacttctgataaaaacaatggatctggagtacttgaaggcgtaaaa gctgacaaaagtaaagtaaaattaacaatttctgacgatctaggtcaaaccacacttgaa gttttcaaagaagatggcaaaacactagtatcaaaaaaagtaacttccaaagacaagtca :' .. tcaacagaagaaaaattcaatgaaaaaggtgaagtatctgaaaaaataataacaagag ca :' j'; gacggaaccagacttgaatacacagaaattaaaagcgatggatctggaaaagctaaag ag : .'25 gttttaaaaagctatgttcttgaaggaactttaactgctgaaaaaacaacattggtgg tt • · « · aaagaaggaactgttactttaagcaaaaatatttcaaaatctggggaagtttcagttg aa [11!^ cttaatgacactgacagtagtgctgctactaaaaaaactgcagcttggaattcaggca et • · III tcaactttaacaattactgtaaacagtaaaaaaactaaagaccttgtgtttacaaaag aa • · · *·* ' aacacaattacagtacaacaatacgactcaaatggcaccaaattagaggggtcagcag tt 3. gaaattacaaaacttgatgaaattaaaaaege11taaaataa.
• « • · « • · · • · ··« · 11. Yhdistelmä-DNA-vektori, tunnettu siitä, että se sisältää :·. yhden tai useampia kopioita patenttivaatimuksen 10 mukaista .···. yhdistelmä-DNA: ta. 35
:12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen yhdistelmä-DNA-vektori, :...· tunnettu siitä, että se on prokarioottinen vektori. 27 102248
13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen yhdistelmä-DNA-vektori, tunnettu siitä, että se on plasmidi.
14. Yhdistelmä-DNA-vektori pZS-7/31-2 (DSM 5528). 5
15. Menetelmä patenttivaatimuksessa 1 tai 12 esitetyn antigeenin valmistamiseksi, joka antigeeni sisältää seuraavan aminohapposekvenssin tai tämän sekvenssin immunogeenisen epi-toopin: 10 MKKYLLGIGLILALIACKQN VSSLDEKNSVSVDLPGEMNV LVSKEKNKDGKYDLIATVDK LELKGTSDKNNGSGVLEGVK 15 ADKSKVKLTISDDLGQTTLE VFKEDGKTLVSKKVTSKDKS STEEKFNEKGEVSEKIITRA DGTRLEYTEIKSDGSGKAKE VLKSYVLEGTLTAEKTTLVV 20 KEGTVTLSKNISKSGEVSVE LNDTDSSAATKKTAAWNSGT STLTITVNSKKTKDLVFTKE NTITVQQYDSNGTKLEGSAV EITKLDEIKNALK1, : .'25 tunnettu siitä, että B. burgdorferi -kannan ZS7 (DSM 5527) • · · « geenipankki tutkitaan yhdellä tai useammalla jossain patentti- [Hl vaatimuksessa 1-7 esitetyllä vasta-aineella ja eristetään "I klooni, jolla nähdään vasta-aine(id)en kanssa positiivinen im- • · · ’·1 1 muunireaktio. 30 • ♦ :.v
16. Menetelmä rokotteen valmistamiseksi Lymen tautia vastaan, ··· : tunnettu siitä, että B. burgdorferin kannan ZS7 (DSM 5527) Os- pA-geeniä koodaava DNA-sekvenssi viedään Escherichia coli .···. -soluun, jota transformoitua E. coli -solua viljellään sopi- 35 vissa olosuhteissa viljelyväliaineessa, ja että otetaan tai- 28 102248 teen DNA-sekvenssin koodaama geenituote ei-fuusioproteiinin tai β-galaktosidaasi-fuusioproteiinin muodossa.
17. Menetelmä patogeenisten B. burgdorferi -eliöiden kannan
18. Patenttivaatimuksen 17 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että patogeenisiä B. burgdorferi ZS7 (DSM 5527) -eliöitä otetaan talteen infektoitujen Scid-hiirien verestä tai/ja nivelistä . 15
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3931236 | 1989-09-19 | ||
| DE3931236 | 1989-09-19 | ||
| DE4015911A DE4015911A1 (de) | 1989-09-19 | 1990-05-17 | Impfstoff gegen die lyme-krankheit |
| DE4015911 | 1990-05-17 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI904597A0 FI904597A0 (fi) | 1990-09-18 |
| FI102248B1 FI102248B1 (fi) | 1998-11-13 |
| FI102248B true FI102248B (fi) | 1998-11-13 |
Family
ID=25885304
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI904597A FI102248B (fi) | 1989-09-19 | 1990-09-18 | Menetelmä rokotteen valmistamiseksi Lymen tautia vastaan |
Country Status (24)
| Country | Link |
|---|---|
| US (6) | US5178859A (fi) |
| EP (5) | EP0633313B1 (fi) |
| JP (3) | JP3205932B2 (fi) |
| KR (2) | KR100205462B1 (fi) |
| AT (4) | ATE131732T1 (fi) |
| AU (1) | AU651560B2 (fi) |
| CA (1) | CA2025597C (fi) |
| CZ (2) | CZ284538B6 (fi) |
| DE (5) | DE4015911A1 (fi) |
| DK (4) | DK0633028T3 (fi) |
| ES (4) | ES2082812T3 (fi) |
| FI (1) | FI102248B (fi) |
| GR (3) | GR3018995T3 (fi) |
| HK (2) | HK1002405A1 (fi) |
| HR (1) | HRP940545B1 (fi) |
| HU (2) | HU212716B (fi) |
| IE (1) | IE903377A1 (fi) |
| NO (2) | NO311767B1 (fi) |
| NZ (1) | NZ235260A (fi) |
| PL (2) | PL169804B1 (fi) |
| PT (1) | PT95349B (fi) |
| SI (1) | SI9011773B (fi) |
| SK (3) | SK456090A3 (fi) |
| YU (2) | YU48250B (fi) |
Families Citing this family (45)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK590288D0 (da) | 1988-10-24 | 1988-10-24 | Symbicom Ab | Kemiske forbindelser |
| WO1993008306A1 (en) * | 1991-10-22 | 1993-04-29 | Symbicom Aktiebolag | Improvement in borrelia burgdorferi diagnosis and prophylaxis |
| US5777095A (en) * | 1988-10-24 | 1998-07-07 | Symbicom Aktiebolag | Osp A and B Sequence of Borrelia burgdonferi strains ACA1 and IP90 |
| US6143872A (en) * | 1988-10-24 | 2000-11-07 | Symbicom Aktiebolag | Borrelia burdorferi Osp A and B proteins and immunogenic peptides |
| US7094391B1 (en) * | 1988-10-24 | 2006-08-22 | The University Of Texas System | Compositions and methods for administering Borrelia burgdorferi antigens |
| DE4015911A1 (de) * | 1989-09-19 | 1991-03-28 | Max Planck Gesellschaft | Impfstoff gegen die lyme-krankheit |
| US5582829A (en) * | 1990-04-05 | 1996-12-10 | Rx Technologies, Inc. | Sonicated borrelia burgdorferi vaccine |
| CA2084413A1 (en) | 1990-06-15 | 1991-12-16 | Richard A. Flavell | Compositions and methods for the prevention and diagnosis of lyme disease |
| DK0465204T3 (da) * | 1990-07-06 | 2000-10-09 | American Home Prod | Vaccine mod Lyme sygdom |
| CA2057536C (en) * | 1990-12-21 | 1999-10-26 | John J. Dunn | Cloning and expression of borrelia lipoproteins |
| US6221363B1 (en) * | 1991-07-11 | 2001-04-24 | Baxter Aktiengesellschaft | Vaccine for the prevention of lyme disease |
| US6872550B1 (en) | 1991-07-11 | 2005-03-29 | Baxter Vaccine Ag | Immunogenic formulation of OspC antigen vaccines for the prevention and treatment of lyme disease and recombinant methods for the preparation of such antigens |
| EP0874051A3 (en) * | 1991-08-15 | 1998-11-04 | SMITHKLINE BEECHAM BIOLOGICALS s.a. | OSP a protein of borrelia burgdorferi subgroups, encoding genes and vaccines. |
| US6676942B1 (en) * | 1991-08-15 | 2004-01-13 | Smithkline Beecham Biologicals (S.A.) | Osp a proteins of Borrelia burgdorferi subgroups, encoding genes and vaccines |
| JPH06511154A (ja) * | 1991-10-18 | 1994-12-15 | コノート ラボラトリーズ インコーポレイテッド | 組換えＢｏｒｒｅｌｉａタンパクの製造法 |
| US6303129B1 (en) * | 1992-07-28 | 2001-10-16 | Rx Technologies | Production of borrelia burgdorferi vaccine, product produced thereby and method of use |
| US6716591B1 (en) | 1993-07-30 | 2004-04-06 | Yale University | B. burgdorferi polypeptides |
| US5656451A (en) * | 1993-07-30 | 1997-08-12 | Yale University | OspE, OspF, and S1 polypeptides in borrelia burgdorferi |
| US7008625B2 (en) | 1993-11-01 | 2006-03-07 | Research Foundation Of The State University Of New York | Recombinant constructs of Borrelia burgdorferi |
| US5558993A (en) * | 1994-06-17 | 1996-09-24 | The Regents Of The University Of California | Cloned Borrelia burgdorferi virulence protein |
| GB9511909D0 (en) * | 1995-06-12 | 1995-08-09 | Microbiological Res Authority | Vaccine |
| EP0894143B2 (en) | 1996-02-21 | 2012-04-18 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Vmp-like sequences of pathogenic borrelia |
| DE19632862B4 (de) | 1996-08-14 | 2006-08-03 | Mikrogen Molekularbiologische Entwicklungs-Gmbh | Immunologisch aktive Proteine von Borrelia burgdorferi, dafür kodierende Nukleinsäuren sowie deren Verwendung in Testkits und als Impfstoffe |
| US6458555B1 (en) * | 1996-08-21 | 2002-10-01 | Gerd Bach | Cytologic method of examining mucous membranes |
| US6060082A (en) * | 1997-04-18 | 2000-05-09 | Massachusetts Institute Of Technology | Polymerized liposomes targeted to M cells and useful for oral or mucosal drug delivery |
| DE19740735A1 (de) * | 1997-09-16 | 1999-03-18 | Max Planck Gesellschaft | Arzneimittel zur Therapie einer manifesten Lyme-Borreliose |
| US6306623B1 (en) | 1998-02-24 | 2001-10-23 | The University Of California | Leptospiral major outer membrane protein LipL32 |
| ATE386805T1 (de) | 1998-07-31 | 2008-03-15 | Gundersen Lutheran Medical Fou | Verwendungen eines borreliaziden epitops des aussermembranproteins c von borrelia burgdorferi (ospc) als impstoff |
| WO2000056298A2 (en) * | 1999-03-19 | 2000-09-28 | Luitpold Pharmaceuticals, Inc. | Treatment of lyme disease with polysulfated glycosaminoglycan formulations |
| WO2000078345A1 (en) * | 1999-06-21 | 2000-12-28 | Milkhaus Laboratory, Inc. | Method for treatment of lyme disease |
| WO2002016421A2 (en) | 2000-08-18 | 2002-02-28 | Research Foundation Of The State University Of New York | Altered ospa of borrelia burgdorferi |
| US7847084B2 (en) | 2002-12-20 | 2010-12-07 | Board Of Regents, The University Of Texas System | VMP-like sequences of pathogenic Borrelia species and strains |
| NZ576564A (en) | 2006-11-03 | 2012-03-30 | Schering Plough Ltd | Canine lyme disease vaccine |
| WO2008116468A2 (en) | 2007-03-26 | 2008-10-02 | Dako Denmark A/S | Mhc peptide complexes and uses thereof in infectious diseases |
| EP2167537A2 (en) | 2007-07-03 | 2010-03-31 | Dako Denmark A/S | Compiled methods for analysing and sorting samples |
| US10611818B2 (en) | 2007-09-27 | 2020-04-07 | Agilent Technologies, Inc. | MHC multimers in tuberculosis diagnostics, vaccine and therapeutics |
| US10968269B1 (en) | 2008-02-28 | 2021-04-06 | Agilent Technologies, Inc. | MHC multimers in borrelia diagnostics and disease |
| WO2010009735A2 (en) | 2008-07-23 | 2010-01-28 | Dako Denmark A/S | Combinatorial analysis and repair |
| GB0817244D0 (en) | 2008-09-20 | 2008-10-29 | Univ Cardiff | Use of a protein kinase inhibitor to detect immune cells, such as T cells |
| US11992518B2 (en) | 2008-10-02 | 2024-05-28 | Agilent Technologies, Inc. | Molecular vaccines for infectious disease |
| US10369204B2 (en) | 2008-10-02 | 2019-08-06 | Dako Denmark A/S | Molecular vaccines for infectious disease |
| AU2010322085B2 (en) * | 2009-11-17 | 2016-09-15 | Zoetis Services Llc | Peptides and methods for the detection of Lyme disease antibodies |
| US8758772B2 (en) | 2011-11-04 | 2014-06-24 | Abaxis, Inc. | Peptides and methods for the detection of lyme disease antibodies |
| PL223175B1 (pl) | 2012-10-22 | 2016-10-31 | Inst Chemii Bioorganicznej Polskiej Akademii Nauk | Szczepionka przeciw boreliozie, konstrukt genetyczny, rekombinowane białko, sposób otrzymywania konstruktu genetycznego, sposób otrzymywania szczepionki, sposób otrzymywania rekombinowanych białek, zastosowanie rekombinowanych białek do wytwarzania szczepionki przeciwko boreliozie |
| US9610336B1 (en) * | 2014-07-16 | 2017-04-04 | Amiram Katz | Immunotherapy for lyme disease |
Family Cites Families (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK590288D0 (da) * | 1988-10-24 | 1988-10-24 | Symbicom Ab | Kemiske forbindelser |
| US4772464A (en) | 1985-08-01 | 1988-09-20 | Miles Laboratories, Inc. | Protective antibodies to serotypic determinants of flagellar antigens |
| US4888276A (en) * | 1986-06-26 | 1989-12-19 | Minnesota Mining And Manufacturing Company | Method and composition for the diagnosis of Lyme disease |
| US4721617A (en) | 1986-08-14 | 1988-01-26 | Regents Of The University Of Minnesota | Vaccine against lyme disease |
| US5034515A (en) * | 1987-09-22 | 1991-07-23 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Staphylococcal fibronectin receptor, monoclonal antibodies thereto and methods of use |
| DE4015911A1 (de) * | 1989-09-19 | 1991-03-28 | Max Planck Gesellschaft | Impfstoff gegen die lyme-krankheit |
| ES2092560T5 (es) * | 1989-12-22 | 2004-09-16 | Mikrogen Molekularbiologische Entwicklungs-Gmbh | Proteinas inmunologicamente activas de borrelia burgdorferi, estuches de ensayo relacionados y vacuna. |
| CA2084413A1 (en) * | 1990-06-15 | 1991-12-16 | Richard A. Flavell | Compositions and methods for the prevention and diagnosis of lyme disease |
| DK0465204T3 (da) * | 1990-07-06 | 2000-10-09 | American Home Prod | Vaccine mod Lyme sygdom |
| CA2057536C (en) * | 1990-12-21 | 1999-10-26 | John J. Dunn | Cloning and expression of borrelia lipoproteins |
| EP0874051A3 (en) * | 1991-08-15 | 1998-11-04 | SMITHKLINE BEECHAM BIOLOGICALS s.a. | OSP a protein of borrelia burgdorferi subgroups, encoding genes and vaccines. |
| ATE174378T1 (de) * | 1991-08-27 | 1998-12-15 | Novo Nordisk As | Waschmittelzusammensetzungen |
| JPH06511154A (ja) * | 1991-10-18 | 1994-12-15 | コノート ラボラトリーズ インコーポレイテッド | 組換えＢｏｒｒｅｌｉａタンパクの製造法 |
| JPH07502646A (ja) * | 1991-10-21 | 1995-03-23 | メディミューン，インコーポレーテッド | リポタンパク質の分泌シグナルをコード化するｄｎａを含む細菌発現ベクター |
-
1990
- 1990-05-17 DE DE4015911A patent/DE4015911A1/de not_active Withdrawn
- 1990-09-07 HU HU905816A patent/HU212716B/hu not_active IP Right Cessation
- 1990-09-11 NZ NZ235260A patent/NZ235260A/xx unknown
- 1990-09-12 AU AU62444/90A patent/AU651560B2/en not_active Ceased
- 1990-09-18 DE DE59010888T patent/DE59010888D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-09-18 PL PL90286918A patent/PL169804B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1990-09-18 EP EP94112144A patent/EP0633313B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-09-18 DE DE59010863T patent/DE59010863D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-09-18 DE DE59009978T patent/DE59009978D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-09-18 EP EP94112145A patent/EP0633028B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-09-18 AT AT90117943T patent/ATE131732T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-09-18 DK DK94112145T patent/DK0633028T3/da active
- 1990-09-18 EP EP98105444A patent/EP0861664A3/de not_active Withdrawn
- 1990-09-18 EP EP94112143A patent/EP0643974B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-09-18 DK DK90117943.2T patent/DK0418827T3/da active
- 1990-09-18 DK DK94112143T patent/DK0643974T3/da active
- 1990-09-18 ES ES90117943T patent/ES2082812T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-09-18 IE IE337790A patent/IE903377A1/en not_active IP Right Cessation
- 1990-09-18 FI FI904597A patent/FI102248B/fi not_active IP Right Cessation
- 1990-09-18 PL PL90307358A patent/PL170229B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1990-09-18 AT AT94112143T patent/ATE175576T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-09-18 DK DK94112144T patent/DK0633313T3/da active
- 1990-09-18 ES ES94112144T patent/ES2145077T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-09-18 NO NO19904062A patent/NO311767B1/no unknown
- 1990-09-18 YU YU177390A patent/YU48250B/sh unknown
- 1990-09-18 AT AT94112145T patent/ATE186646T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-09-18 DE DE59010903T patent/DE59010903D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-09-18 CA CA002025597A patent/CA2025597C/en not_active Expired - Fee Related
- 1990-09-18 EP EP90117943A patent/EP0418827B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-09-18 ES ES94112143T patent/ES2129551T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-09-18 ES ES94112145T patent/ES2141182T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-09-18 AT AT94112144T patent/ATE191499T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-09-18 SI SI9011773A patent/SI9011773B/sl not_active IP Right Cessation
- 1990-09-19 JP JP24765090A patent/JP3205932B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1990-09-19 SK SK4560-90A patent/SK456090A3/sk unknown
- 1990-09-19 PT PT95349A patent/PT95349B/pt active IP Right Grant
- 1990-09-19 CZ CS904560A patent/CZ284538B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1990-09-19 SK SK1511-98A patent/SK283089B6/sk unknown
- 1990-09-19 KR KR1019900014814A patent/KR100205462B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1990-09-19 US US07/585,310 patent/US5178859A/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-09-19 CZ CZ95970A patent/CZ284616B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1990-09-19 SK SK1510-98A patent/SK283088B6/sk unknown
-
1993
- 1993-05-27 US US08/068,063 patent/US5434077A/en not_active Expired - Fee Related
-
1994
- 1994-09-15 HR HR940545A patent/HRP940545B1/xx not_active IP Right Cessation
-
1995
- 1995-03-20 US US08/406,623 patent/US5780030A/en not_active Expired - Fee Related
- 1995-03-20 US US08/407,350 patent/US5686267A/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-04-24 HU HU95P/P00108P patent/HU211228A9/hu unknown
-
1996
- 1996-02-14 GR GR960400397T patent/GR3018995T3/el unknown
-
1997
- 1997-03-12 YU YU9097A patent/YU49370B/sh unknown
-
1998
- 1998-02-13 HK HK98101147A patent/HK1002405A1/xx not_active IP Right Cessation
- 1998-02-23 US US09/027,843 patent/US5856447A/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-08-29 KR KR1019980035375A patent/KR100202128B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1998-12-23 HK HK98114958A patent/HK1013620A1/xx not_active IP Right Cessation
-
1999
- 1999-10-07 US US09/413,858 patent/US6613331B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1999-11-30 GR GR990403104T patent/GR3032010T3/el unknown
-
2000
- 2000-06-14 GR GR20000401362T patent/GR3033675T3/el not_active IP Right Cessation
- 2000-07-26 JP JP2000225341A patent/JP3328644B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2000-12-11 JP JP2000376159A patent/JP3418171B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2001
- 2001-09-24 NO NO20014624A patent/NO315905B1/no unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI102248B (fi) | Menetelmä rokotteen valmistamiseksi Lymen tautia vastaan | |
| US5747294A (en) | Compositions and methods for the prevention and diagnosis of lyme disease | |
| IE83320B1 (en) | Vaccine against lyme disease | |
| US5807685A (en) | OspE, OspF, and S1 polypeptides in Borrelia burgdorferi | |
| US5911996A (en) | 43 Kd protein vaccine and method for the production thereof | |
| AU673912B2 (en) | Vaccine against lyme disease | |
| IE83340B1 (en) | Vaccine against lyme disease | |
| MXPA00002577A (en) | Hepatitis b virus polypeptides |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FG | Patent granted |
Owner name: MAX-PLANCK-GESELLSCHAFT ZUR FOERDERUNG DER WISSENS Owner name: DEUTSCHES KREBSFORSCHUNGSZENTRUM |
|
| MA | Patent expired |