PL170229B1 - Sposób wytwarzania antygenów PL PL - Google Patents
Sposób wytwarzania antygenów PL PLInfo
- Publication number
- PL170229B1 PL170229B1 PL90307358A PL30735890A PL170229B1 PL 170229 B1 PL170229 B1 PL 170229B1 PL 90307358 A PL90307358 A PL 90307358A PL 30735890 A PL30735890 A PL 30735890A PL 170229 B1 PL170229 B1 PL 170229B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- burgdorferi
- antigen
- antibodies
- ospa
- antibody
- Prior art date
Links
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims abstract description 49
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims abstract description 49
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims abstract description 49
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 29
- 241000589969 Borreliella burgdorferi Species 0.000 claims abstract description 45
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 26
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 claims abstract description 7
- 108700006640 OspA Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 19
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 15
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 10
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 7
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 7
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 6
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 6
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 claims description 3
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims description 3
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N beta-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N 0.000 claims 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 6
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 58
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 17
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 16
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 16
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 15
- 241000448699 Borrelia burgdorferi ZS7 Species 0.000 description 14
- 208000016604 Lyme disease Diseases 0.000 description 14
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 13
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 12
- 241000589970 Spirochaetales Species 0.000 description 11
- 210000001503 joint Anatomy 0.000 description 11
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 10
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 9
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 9
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 9
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 9
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 9
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 8
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 7
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 7
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 7
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 7
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 6
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 6
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 5
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 5
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- 108010040721 Flagellin Proteins 0.000 description 4
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 4
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 4
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 4
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 4
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 4
- 241000238876 Acari Species 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 3
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 3
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 3
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000276440 Borrelia burgdorferi B31 Species 0.000 description 2
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 2
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 2
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 2
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 2
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 2
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000588258 Taenia solium Paramyosin Proteins 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- WHLPIOPUASGRQN-UHFFFAOYSA-N butyl 2-methylprop-2-enoate;methyl 2-methylprop-2-enoate Chemical compound COC(=O)C(C)=C.CCCCOC(=O)C(C)=C WHLPIOPUASGRQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 2
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 2
- 238000005534 hematocrit Methods 0.000 description 2
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 238000009413 insulation Methods 0.000 description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 2
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 2
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 2
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 2
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 101150045801 ospA gene Proteins 0.000 description 2
- 229940099789 ospa protein Drugs 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001552669 Adonis annua Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N Fluorouracil Chemical compound FC1=CNC(=O)NC1=O GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002738 Giemsa staining Methods 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 241000238681 Ixodes Species 0.000 description 1
- 241001480843 Ixodes ricinus Species 0.000 description 1
- CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-M Methacrylate Chemical compound CC(=C)C([O-])=O CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010090127 Periplasmic Proteins Proteins 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 206010036030 Polyarthritis Diseases 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N [4-(4-hydrazinylphenyl)phenyl]hydrazine Chemical compound C1=CC(NN)=CC=C1C1=CC=C(NN)C=C1 SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- PXXJHWLDUBFPOL-UHFFFAOYSA-N benzamidine Chemical compound NC(=N)C1=CC=CC=C1 PXXJHWLDUBFPOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N chloroform;phenol Chemical compound ClC(Cl)Cl.OC1=CC=CC=C1 YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003541 chymotrypsin inhibitor Substances 0.000 description 1
- 210000004081 cilia Anatomy 0.000 description 1
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 1
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000012050 conventional carrier Substances 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 229940009976 deoxycholate Drugs 0.000 description 1
- KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N deoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 210000001174 endocardium Anatomy 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 230000003628 erosive effect Effects 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 229960002949 fluorouracil Drugs 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 238000005469 granulation Methods 0.000 description 1
- 230000003179 granulation Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000005745 host immune response Effects 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000001969 hypertrophic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007124 immune defense Effects 0.000 description 1
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 208000018937 joint inflammation Diseases 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000004165 myocardium Anatomy 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 101150015886 nuc-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 1
- 229920002113 octoxynol Polymers 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000915 pathological change Toxicity 0.000 description 1
- 230000036285 pathological change Effects 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 210000003516 pericardium Anatomy 0.000 description 1
- 210000001428 peripheral nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 150000002978 peroxides Chemical class 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- QKFJKGMPGYROCL-UHFFFAOYSA-N phenyl isothiocyanate Chemical compound S=C=NC1=CC=CC=C1 QKFJKGMPGYROCL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 208000030428 polyarticular arthritis Diseases 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 208000037920 primary disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 210000003699 striated muscle Anatomy 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 210000002437 synoviocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 208000016523 tick-borne infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- 210000001835 viscera Anatomy 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/20—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Spirochaetales (O), e.g. Treponema, Leptospira
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
- C07K16/1203—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria
- C07K16/1207—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria from Spirochaetales (O), e.g. Treponema, Leptospira
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
1. Sposób wytwarzania antygenów, które daja reakcje immunologiczna z przeciwcialem przeciw OspA, znamienny tym, ze pule genów B. burgdorferi przeszukuje sie za pomoca jednego Iub wiecej przeciwcial monoklonalnych swoistych dla antygenu 31 kD (OspA) Borrellia burgdorferi i izoluje sie klony, które z przeciwcialem Iub przeciwcialami daja dodatnia reakcje immunologiczna i eksprymuje sie DNA kodujacy te antygeny wyizolowany z dodatnich klonów 7. Sposób wytwarzania antygenów, które daja reakcje immunologiczna z przeciwcialem przeciw OspB, znamienny tym, ze pule genów B. burgdorferi przeszukuje sie za pomoca jednego Iub wiecej przeciwcial monoklonalnych swoistych dla antygenu 34 kD (OspB) Borrellia burgdorferi i izoluje sie klony, które z przeciwcialem Iub przeciwcialami daja dodatnia reakcje immunologiczna i eksprymuje sie DNA kodujacy te antygeny wyizolowany z dodatnich klonów. PL PL
Description
Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania antygenów, które dają reakcje immunologiczne z przeciwciałem przeciw OspA lub z przeciwciałem przeciw OspB B. burgdorferi. Antygeny takie mogą być użyte do czynnego uodparniania przeciw chorobie Lyme, tj. do indukowania wytwarzania przeciwciał przez organizm oraz mogą służyć do uodparniania zwierząt doświadczalnych, z których w zwykły sposób otrzymuje się przeciwciała poliklonalne lub monoklonalne przeciw OspA i/lub OspB.
Borelioza Lyme jest najczęstszą przenoszoną przez kleszcze chorobą zakaźną w umiarkowanych szerokościach geograficznych. Wywołuje ją krętek Borrellia burgdorferi, przenoszony na człowieka przede wszystlkm przez kleszcze rodzaju Ixodes. Chorobajest przewlekłym postępującym zakażeniem obejmującym liczne narządy, jak skóra, ośrodkowy i obwodowy układ nerwowy, serce, wątrobę, nerki i układ mięśni szkieletowych. Ponieważ skuteczne leczenie tego schorzenia antybiotykami jest trudne, podejmuje się duże wysiłki dla zbadania samego zarazka oraz odpowiedzi immunologicznej gospodarza na zakażenie B.burgdorferi. Wprawdzie u osób dotkniętych chorobą Lyme stwierdza się wysokie miano przeciwciał przeciw B.burgdorferi, nie stanowi ono jednak ochrony przeciw zakażeniu. Przyjmuje się, że zarazek bardzo szybko przechodził z krążenia krwi do tkanek, gdzie staje się niedostępny bezpośrednio dla układu immunologicznego. Znaczyłoby to, ze ochrona poprzez przeciwciała jest możliwa tylko na samym początku po zakażeniu, tak długo, jak długo zarazek krąży jeszcze we krwi.
Fakt, ze naturalne zakażenie B.burgdorferi stwierdzono u różnych gatunków zwierząt, doprowadził do prób ustalenia modelu laboratoryjnego choroby Lyme. Dały one ograniczone powodzenie. W doświadczeniach, których celem było wywołanie swoistej odpowiedzi immunologicznej myszy na B.burgdorferi stwierdzono, że zakażenie wsobnych szczepów myszy izolatem B.burgdotferi hodowanym przez dłuższy czas prowadzi do umiarkowanych, ale wyraźnych zmian patomorfologicznych w różnych narządach, takich jak mózg, serce, płuca i nerki. Zmiany te były porównywalne ze zmianami obserwowanymi u pacjentów z chorobą Lyme (Schaible i in., 1988, Infect. Immun. 1, 41). Rozwój pierwotnego obrazu choroby u zwierzątjest przypuszczalnie hamowany przez obronę immunologiczną gospodarza i/lub na skutek zmniejszonej zjadliwości krętków hodowanych przez dłuższy czas in vitro (Johnson i in., 1984, J. Clin. Microbiol. 20,747, Schwan i in., 1988, Infect, and Immun. 56, 1837).
U podstaw wynalazku leży zadanie przygotowania skutecznej szczepionki przeciw chorobie Lyme. W tym celu jednak potrzebne jest opracowanie odpowiedniego zwierzęcego modelu laboratoryjnego. Założono obecnie, że szczep myszy pozbawionych czynnych komórek B i T, tak zwane myszy Scid (Bosma i in., 1983, Nature 10, 52), mogą służyć jako model zwierzęcy, ponieważ u tych myszy po zakażeniu patogennym B.burgdorferi izolatem rozwija się choroba wieloukładowa, a mianowicie głównie zapalenie wielostawowe i stan zapalny serca. Na tym modelu zwierzęcym stało się dopiero możliwe wypróbowanie działania szczepionek przeciw chorobie Lyme.
170 229
Według wynalazku sposób wytwarzania antygenów, które dają reakcje immunologiczne z przeciwciałem przeciw OspA lub z przeciwciałem przeciw OspB B burgdorferi, polega na tym, ze pule genów B. burgdorferi przeszukuje się za pomocą jednego lub więcej przeciwciał monoklonalnych swoistych dla antygenu 31 kD (OspA) lub dla antygenu 34 kD (OspB) Borrellia burgdorferi i izoluje się klony, które z przeciwciałem lub przeciwciałami dają dodatnią reakcję immunologiczną i ekspryrnuje się DNA kodujący te antygeny wyizolowany z dodatnich klonów.
Antygen wytworzony na drodze rekombinacji DNA zawiera następującą sekwencję aminokwasów lub immunogenny epitop tej sekwencji:
| M | K | K | Y | L | L | G | I | G | L | I | L | A | L | I | A | C | K | Q | N |
| V | S | S | L | D | E | K | N | S | V | S | V | D | L | P | G | E | M | N | V |
| L | V | S | K | E | K | N | K | D | G | K | Y | D | L | I | A | T | V | D | K |
| L | E | L | K | G | T | S | D | K | N | N | G | S | G | V | L | E | G | V | K |
| A | D | K | S | K | V | K | L | T | I | S | D | D | L | G | Q | T | T | L | E |
| V | F | K | E | D | G | K | T | L | V | S | K | K | V | T | S | K | D | K | S |
| S | T | E | E | K | F | N | E | K | G | E | V | S | E | K | I | I | T | R | A |
| D | G | T | R | L | E | Y | T | E | I | K | S | D | G | S | G | K | A | K | E |
| V | L | K | S | Y | V | L | E | G | T | L | T | A | E | K | T | T | L | V | V |
| K | E | G | T | V | T | L | S | K | N | I | S | K | S | G | E | V | S | V | E |
| L | N | D | T | D | S | S | A | A | T | K | K | T | A | A | V | N | S | G | T |
| S | T | L | T | I | T | V | N | S | K | K | T | K | D | L | V | F | T | K | E |
| N | T | I | T | V | Q | Q | Y | D | S | N | G | T | K | L | E | C | S | A | V |
| E | I | T | K | L | D | E | I | K | N | A | L | K | * |
Szczególnie istotny jest antygen, który jest rekombinowanym białkiem sprzężonym z beta-galaktozydazą lub niesprzężonym. Do przeszukiwania stosuje się przeciwciało monoklonalne swoiste dla antygenu 31 kD lub antygenu 34 kD szczepów ZS7 (DSM 5527) i/lub B31 (ATCC 35210) B. burgdorferi, zwłaszcza przeciwciało monoklonalne klasy IgG, a zwłaszcza podklasy IgG2b lub IgG1.
Sekwencja DNA kodująca antygen znajduje się w wektorze prokariotycznym i/lub eukariotycznym, w szczególności w wektorze prokariotycznym.
Rekombinantowy wektor może być zlokalizowany w komórce gospodarza pozachromosomalnie (na przykład plazmid), albo może być zintegrowany z genomem komórki gospodarza (na przykład bakteriofag Lambda). Szczególnie istotny jest rekombinowany wektor pZS-7/31 -2 (DSM 5528).
DNA kodujący antygen 31 kD B. burgdorferi ZS7 lub jego immunogenny epitop zawiera (1) sekwencję kwasów nukleinowych przedstawioną na fig. 1.1-1.5, (2) odpowiadającą jej sekwencją wynikającą z degeneracji kodu genetycznego lub (3) sekwencję, która hybrydyzuje w ostrych warunkach hybrydyzacji z sekwencją (1) i/lub (2). Pojęcie ostre warunki hybrydyzacji należy rozumieć według Maniatisa i in., Molecular Cloning, A laboratory Manual (1982) Cold Spring Harbor Lab., New York.
Antygen wytwarzany sposobem według wynalazku może stanowić substancję czynną szczepionki do czynnego uodpamiania przeciwko chorobie Lyme. Szczepionka taka zawiera także konwencjonalny nośnik, wypełniacz i substancje pomocnicze.
Wykazano, ze podanie natywnego względnie rekombinowanego OspA normalnym myszom indukowało wytwarzanie ochronnych przeciwciał, które po przeniesieniu na myszy Scid
170 229 chroniły je biernie przeciw chorobie Lyme. W szczególności stwierdza się, ze rekombinowany OspA indukuje ochronną odpowiedź immunologiczną porównywalną z odpowiedzią na natywny OspA, stąd tez jest on obiecującym kandydatem do szczepionki przeciw boreliozie Lyme u ludzi.
Podane poniżej przykłady oraz fig. 1.1-1.5 i fig. 2 objaśniają wynalazek. Figury 1.1-1.5 SekwencjaDNA i sekwencja aminokwasów antygenu 31 KD (OspA) B. burgdorferi ZS7. Figura 2 - Charakterystyka immunologiczna rekombinantowego białka rZS7/31-2.
Przykład I. Wywoływanie zapalenia stawów, stanu zapalnego serca i zapalenia wątroby u myszy Scid przez zakażenie szczepem ZS7, B. burgdorferi.
Traktowanie myszy B. burgdorferi.
Dorosłym myszom C.B-17 Scid (homozygotyczne pod względem mutacji Scid) i C.B-17 wstrzyknięto podskórnie u nasady ogona dawki 1x105, 5x105, 1x106 lub 1x108 żywych lub zabitych (promienie UV) komórek B. burgdorferi.
Izolacja B. burgdorferi z kleszczy i myszy.
Badania przeprowadzono używając hodowanego przez dłuższy czas szczepu B31 (ATCC 35210) oraz szczepu ZS7 (DSM 5527) B. burgdorferi świeżo izolowanego z samicy kleszcza Ixodes ricinus. Wszystkie szczepy B. burgdorferi hodowano w zmodyfikowanym podłożu Kelly (Barbour i in., 1983, Switzerland Curr. Microbiol., 8, 123). Komórki B. burgdorferi, izolowane z przewodu pokarmowego kleszczy uprzednio wyjałowionych etanolem lub z krwi zakażonych myszy, hodowano początkowo w podłożu Kelly z dodatkiem 8 fil/ml kanamycyny i 230 (tg/ml fluorouracylu (Johnson i in., 1984, J. Clin. Microbiol. 1, 81).
Odczyny serologiczne,
Swoiste przeciwciała przeciw B. burgdorferi wykrywano konwencjonalną metodą ELISA (Justus i in., 1988, Wehrmed. Mschr. 32, 263). Krzywą standardową dla zawartości immunoglobulin (Ig) otrzymywano przez powlekanie płytki anty-mysią IgG (rozcieńczenie 1:500, roztwór surowicy firmy Paesel, Frankfurt, RFN) i miareczkowanie całkowitej zawartości mysiej IgG Iub IgM (Calbiochem, LaJolla, USA). Całkowitą IgM i IgG w surowicy oznaczano podobnie. Stężenie przeciwciał IgM Iub IgG swoistych dla B. burgdorferi podano w pg/ml.
Barwienie immunofluoroscencyjne i metodą Giemsy.
Porcje po 50 pl krwi umieszczano pipetą w probówkach hematokrytowych (Bector-Dickinson, Reidelberg, RFN) i wirowano w wirówce hematokrytowej przy 5000 g (ECCO, RFN). Probówki przecinano na granicy między surowicą i erytrocytami i 5 pi i surowicy nakładano na szkiełko podstawowe (Superior, Bad Mergentheim, RFN). Szkiełko z naniesionymi próbkami surowicy suszono na powietrzu i utrwalano w 100% etanolu przez 1 minutę w -20°C. Po jednogodzinnej inkubacji w temperaturze pokojowej z hiperimmumzowaną surowicą króliczą przeciw B. burgdorferi (rozcieńczenie 1: 20) szkiełka przemywano PBS i barwiono przez godzinę kozią surowicą antykróliczą koniugowaną z PITC (rozcieńczenie 1:120, Jackson Lab., West Grove, USA). Szkiełka przemywano, pokrywano gliceryną-żelatyną według Kaisere i natychmiast badano w mikroskopie fluoroscencyjnym. Krople krwi niczym nie traktowano suszono na powietrzu, utrwalano w metanolu, barwiono odczynnikiem Giemsy (0,1%, Darmstadt, RFN), odbarwiano PBS i zatapiano w entellanie (Merck, Darmstadt, RFN).
Preparaty histologiczne i ich barwienie.
W różnych okresach czasu po zakażeniu myszy B. burgdorferi pobierano narządy wewnętrzne (mózg, serce, płuca, wątroba, nerki, śledziona, stawy) i przechowywano je albo w ciekłym azocie dla przygoUowywania skrawków mrożonych, albo w 5% formalinie (w PBS) dla zatopienia w parafinie Iub metakrylanie. Skrawki grubości 4 do 7 pm barwiono hematoksyliną-eozyną i zatapiano w entellanie (Merck AG, Darmstadt, RFN). Badania immunohistologiczne wykonano używając systemu Streptawidyna-Biotyna-Peroksydaza (Kramer i in., 1989, Eur. J. Immunol., 19, 151).
Jak pokazuje tabela 1, u myszy Scid zakażonych żywymi zarazkami, obecność B. burgdorferi ZS7 i B31 we krwi stwierdzano przez cały okres doświadczenia. Tylko krętki szczepu ZS7 udało się po izolacji hodować in vitro, natomiast nie udało się to ze szczepem B31. Porównanie rekultywowanych komórek z pierwotnym izolatem B. burgdorferi ZS7 nie wykazało żadnych zmian w zawartości białka i obrazie plazmidów. W czasie całego okresu obserwacji u myszy Scid zakażonych B. burgdorferi nie stwierdzono przeciwciał Iub tylko nieznaczne ich miano. U tych zwierząt nie
170 229 znaleziono przeciwciał IgM Iub IgG swoistych dla B. burgdorferi (tabela 1). Natomiast wszystkie myszy kontrolne C.B-17, zakażone B. burgdorferi, wytworzyły duże ilości całkowitych Ig i podwyższone miano przeciwciał IgM i IgG swoistych dla B. burgdorferi. Między 7 a 20 dniem po zakażeniu B. burgdorferi ZS7 myszy Scid wykazały pierwsze kliniczne objawy zapalenia stawów (zaczerwienienie i obrzmienie obu stawów goleniowo-stępowych), które nasilały się z czasem. Nie stwierdzono natomiast objawów zapalenia stawów u myszy Scid, którym podano komórki B burgdorferi ZS7 naświetlone promieniami UV albo żywe komórki B. burgdorferi B31, a także u myszy kontrolnych C.B-17 zakażonych żywymi komórkami B. burgdorferi ZS7.
Zmiany zapalne stawów stwierdzono również histopatologicznie u myszy Scid zakażonych żywym zarazkiem B. burgdorferi ZS7 (tabela 1). Stwierdzono ciężkie uszkodzenia stawów manifestujące się obecnością przerostowych zmian zapalnych komórek błony maziowej, połączonych z erozją i zniszczeniem tkanki chrzęstnej i/lub kości. Następnie obserwowano ogólne zapalenie serca, z naciekami komórek jednojądrzastych we wsierdziu, mięśniu sercowym i osierdziu. Obserwowano także postępujące zapalenie wątroby wraz z naciekiem komórek jednojądrzastych w okolicy żyły wrotnej i żyły centralnej, odczyny ziarninowe i w końcu wystąpienie zwłóknienia wątroby. Ponadto stwierdzono nieznaczne uszkodzenia nerek, płuc, mózgu i mięśni prążkowanych.
Tabela 1
Zakażenie myszy C B-17 Scid i myszy kontrolnych C.B-17 B burgdorferi Reizolacja krętków z tkanek, miano przeciwciał i rozwój zapalenia stawów
| B | burgdorferi | B | burgdorferi | Zapalenie stawów | Przeciwciała (pg/ml) | ||||||
| szczep myszy | szczep | dawka zakaża- jąca | dzień po zakażeniu | detekcja we krwi * | izolacja ** | klimcz- O nie | histo- pato- logicznie | całko - wite | Ig | swoiste | Ig |
| C B-17 | ZS7 | 5x105 | 7 | + | - | 20 | |||||
| Scid | 36 | + | +B | + | + | - | 21 | - | - | ||
| (n = 1) | 49 | + | +B | + | + | - | 26 | - | - | ||
| 59 | + | +B | + | + | - | 336 | - | - | |||
| ZS7 | 1x 108 | 7 | + | - | + | + | - | 108 | - | - | |
| 23 | + | +B | + | + | - | 54 | - | - | |||
| ZS7 | 1x108 | 22 | + | - | + | + | - | 41 | - | - | |
| 29 | + | +G | + | + | - | - | - | - | |||
| 87 | + | +B/G | + | + | - | - | - | - | |||
| ZS7 | 1x105 | - | n.b. | n b. | + | n.b. | n.b. | n b. | n b | n b | |
| 1x106 | - | n.b. | n.b | + | n.b. | n b. | n.b. | n.b. | n.b | ||
| ZS7 | 1x108 | 16 | + | + | + | + | - | - | - | - | |
| ZS 7 | 1x108 | 16 | - | - | - | - | - | - | - | - | |
| B31 | 1x108 | 22 | + | - | - | - | 26 | 32 | - | - | |
| B31 | 1x108 | 29 | + | - | - | - | - | - | - | - | |
| - | 22 | - | - | - | - | - | 47 | - | - | ||
| - | 29 | - | - | - | - | 54 | 364 | - | - | ||
| C.B-17 | ZS7 | 1x108 | 16 | - | - | - | - | 2,515 | 5,963 | 438 | 56 |
| n=7 | 24 | - | - | - | - | 2,145 | 6,374 | 506 | 94 | ||
| - | - | - | - | - | - | - | - | 304 | 3,804 | - | - |
| - | - | - | - | - | - | - | - | 216 | 1,952 | - | - |
* Zabarwienie metodą Giemsa lub lmmunofluorescencja, **Izolacja z krwi (B), stawów (G), °+ Zaczerwienienie i obrzmienie stawów goleniowo-stępowych 00 -:7,5 pg/ml surowicy
170 229
Przykład II. Wpływ przeciwciała monoklonalnego swoistego dla antygenu 31 kD B. burgdorferi na przebieg boreliozy Lyme u myszy Scid
Wytworzenie przeciwciała monoklonalnego.
Mysz posiadająca sprawny układ immunologiczny, uodporniona komórkami B. burgdorferi, wytworzyła przeciwciała poliklonalne swoiste dla B. burgdorferi (patrz tabela 1).
Dziesięciotygodniowe samice myszy szczepu wsobnego BALB/c uodporniono krętkami zhomogenizowanymi przez sonikację (B. burgdorferi szczep B31, ATCC 35210).
Schemat uodpornienia.
Dzień 0: 200 ąg antygenu krętkowego z pełnym adjuwantem Freunda podskórnie.
Dzień 21, 35, 49, 63: dawka przypominająca 100 ąg antygenu krętkowego w roztworze soli buforowanym fosforanami dootrzewnowo.
Dzień 66: pobranie śledziony i przygotowanie jednokomórkowej zawiesiny.
Immunizowane komórki śledziony poddano fuzji z komórkami linii szpiczaka Ag8-PAI, metodami standardowymi przy użyciu glikolu polietylenowego (J. H. Peters, H. Baumgarten, H. Schulze Monoklonale Antikroper Springer Verlag, Heidelberg).
Produkty fuzji wysiewano na płytki o 96 dołkach. Po 8 dniach hodowle komórkowe badano na obecność przeciwciał monoklonalnych swoistych dla B. burgdorferi metodą ELIS A na fazie stałej (J. H. Peters i in., j.w.).
Komórki hybrydoma z hodowli produkujących przeciwciała klonowano metodą granicznych rozcieńczeń. Charakterystykę komórek potomnych poszczególnych klonów określano ponownie testem ELISA na fazie stałej a także analizą Westem-Blot i badaniem lmmunofluorescencyjnym. Przeciwciało monoklonalne LA-2 podklasy IgG2b było produkowane i wydzielane przez jedną monoklonalną linię hybrydoma i reagowało w Western-Biot ze strukturą 31kDa (OspA) wszystkich badanych szczepów B. burgdorferi (m. in. z izolatem ZS7 i B31) przy kontakcie z białkami B. burgdorferi rozdzielonymi elektroforetycznie na żelu z SDS i przeniesionymi na błonę przy pomocy Western-lot. Przeciwciała monoklonalne LA-26.1C (anti OspA IgG1), LA-25.1 (anti OspB (antygen 34 kDa) IgG2b) i LA-27.1 (anti OspB (34 kDa antygen) IgG1) otrzymywano i charakteryzowano w sposób analogiczny.
Zakażenie myszy B. burgdorferi ZS7.
Myszy C.B-17 Scid zakażono dawką 1x108 żywych komórekB. burgdorferi ZS7 podskórnie w okolicy nasady ogona.
Traktowanie myszy antysurowicami.
Zakażone myszy Scid otrzymywały dwa razy w tygodniu różne antysurowice. Jednej grupie podawano NMS (normalna surowica mysia), drugiej IMS (surowica mysia odpornościowa), trzeciej przeciwciało monoklonalne LA-2 (przeciw antygenowi 31 kD B. burgdorferi). Dawki podawanych antysurowic wynosiły w pierwszym tygodniu 100 ąl względnie 100 ąg dla LA-2, w drugim tygodniu 200 ąl względnie 200 ąg dla LA-2, w trzecim tygodniu 300 μΐ względnie 300 ąg dla LA-2.
Jak widać w tabeli 2 myszy Scid niczym nie traktowane Iub te, którym podano NMS po 12 dniach wykazały kliniczne i histopatologiczne objawy zapalenia stawów względnie stanu zapalnego serca i zapalenia wątroby. Natomiast po podaniu myszom Scid przeciwciała monoklonalnego LA-2 objawy były wyraźnie słabsze. Klinicznie obserwowano tylko lekkie zaczerwienienia stawów, zaś histopatologicznie tylko nieznaczne zmiany. Myszy traktowane IMS nie wykazały klinicznych znamion zapalenia stawów.
Zarazki B. burgdorferi stwierdzono w hodowli in vitro tylko u myszy niczym nie traktowanych Iub tych, które otrzymały NMS. U myszy, którym podano LA-2 Iub IMS B. burgdorferi nie stwierdzono (tabela 2).
170 ))9
Tabela )
Podawanie B burgdorferi oraz antysurowicy myszom C.B-17 Scid
| Szczep myszy C B-17 Scid | Podanie antysurowicy | Zapalenie stawów (po 12 dniach) kliniczne histopat. | Zapalenie serca/zapalenie wątroby histopat. | Izolacja B burgdorferi | |
| kliniczne | histopatolog | ||||
| n =3 | - | + | + | + | + |
| n =3 | NMS | + | + | + | + |
| n =2 | IMS | - | - | - | - |
| n =3 | LA-2 | _* | .** | - | - |
* lekkie zaczerwienienie stawów ** tylko nieznaczne zmiany
Przykład III. Klonowanie przez ekspresję antygenu 31kD (OspA) B. burgdorferi.
Przygotowanie DNA.
Wysokocząsteczkowy DNA oczyszczano z hodowli szczepu ZS7 B. burgdorferi w zmodyfikowanym podłożu Kelly. Krętki pelletowano przez wirowanie przy 10 000 g i przemywano trzykrotnie buforem PBS. Wysuszony pellet krętków zawieszano w 10 ml TE (10 mmol/l Tris, 1 mmol/1 EDTA, pH 7,4), traktowano lizozymem (5 mg/ml) przez 15 minut w 30°C i DNA uwalniano przez dodanie 1 ml 20% SDS. Po dodaniu 1,5 ml NaCl (5 mol/l) roztwór ekstrahowano równą objętością fenolu, a następnie chloroformem. DNA wytrząsano przez dodanie 2 objętości etanolu absolutnego i inkubację w -20°C przez noc. Po odwirowaniu osad rozpuszczono w 0,5 ml TE i inkubowano z RNAzą A wolną od DNA-azy (20 pl/ml) przez 45 minut w 55°C, następnie trawiono przez godzinę proteazą K (0,1 pg/ml) w 37°C. Do roztworu dodawano 0,3 mol/l NaOAc i ponownie ekstrahowano fenolem-chloroformem jak wyżej. Po wytrąceniu etanolem DNA rozpuszczano w TE.
Wytworzenie puli genów.
Wysokocząsteczkowy DNA został losowo rozerwany przez działanie ultradźwięków przez trzy sekundy. Zastosowano polimerazę TA-DNA (30 minut w 37°C) i enzym Klenowa (5 minut w )0°C) celem wyrównania końców otrzymanych fragmentów DNA. DNA o tępych końcach ligowano z wektorem ekspresji pUEXl w pozycji BamHI według strategii klonowania dopełniającego (Bresan i Stanley 1987, Nuc1. Acid. Res., str. 1056). Po selekcji według wielkości przy pomocy chromatografii na sicie molekularnym Sephacryl S-1000i transformacji kompetentnych komórek E. coli (MC 1061) udział powstałych w wyniku rekombinacji jednostek tworzących łysinki (pfu) oznaczono następująco: losowo wybrane kolonie przeniesiono do podłoża selekcyjnego () ml) (LB z 25 pg/ml ampicyliny) i hodowano do nasycenia. DNA plazmidowy izolowano zwykłą metodą lizy zasadowej i cięto przy pomocy BamHI. Ponad 50% analizowanych plazmidów zawierało inserty DNA średniej długości > 1,5 kb.
Wysiew na płytki i screening puli genów B. burgdorferi ZS7.
Na płytki 24 x 24 cm wysiewano komórki o gęstości 7 000 pfu na płytkę i inkubowano przez noc w 30°C. Kolonie przenoszono na filtr nitrocelulozowy (NC) i przez dwugodzinną inkubację w 42°C indukowano ekspresję białka sprzężonego z beta-gaaaktozydazą w wyniku fuzji. Filtry umieszczano na bibule Whatman 3MM, uprzednio nasączonej 5% SDS, i inkubowano około 25 minut w 95°C. Następnie białka rozdzielano elektrycznie przy użyciu zwykłej aparatury do Westernblotting. Po obróbce filtra NC DNA-azą klonu immunoreaktywne identyfikowano przy pomocy przeciwciał monoklonalnych przez screening produktów ekspresji. Miejsca nieswoistego wiązania na filtrach NC eliminowano przez czterogodzinną inkubację w temperaturze pokojowej w PBS zawierającym 0,2% (w/v) żelatyny i 3 mmol/l NaN3. Na koniec filtry z pozostałymi na nich hodowlami klonu LA-2 produkującego przeciwciało monoklonalne anty-31 kD inkubowano przez 18 godzin stale wstrząsając. Po dokładnym przemyciu (PBS + 1% v/v Tnton Χ-100, PBS + 0,5 mol/l NaCl, PBS + 1 mol/l NaCl, każdy etap 10 minut) filtry
170 229 inkubowano 1,5 godziny w temperaturze pokojowej stale wstrząsając, z 1:10 000 znakowanym peroksydazą preparatem F(ab)2 z króliczych przeciwciał przeciw mysiej IgG. Filtry ponownie przemywano jak wyżej i inkubowano z dwuaminobenzydyną jako substratem peroksydrn zy. Na 104 rekombinantów PFU 20 klonów reagowało z przeciwciałem monoklonalnym LA-2.
Analiza sekwencji antygenu 31 kD (OspA).
Insert DNA klonu rekombinanta E. coli wykazującego dodatnią reakcję przeciwciała z LA-2 izolowano w zwykły sposób. Insert tego klonu zawierał całą długość genu ospA kodującego antygen 31 kD B. burgdorferi. Plazmid zawierający ten insert został oznaczony pZS-7/31-2 i zgodnie z konwencją budapeszteńską zdeponowany w DSM (pod numerem DSM 5528).
Rekombinowane białko produkowane przez ten immunododatni klon oznaczono rZS7/31-2. Oznaczono kodującą sekwencję DNA genu ospA. Jest ona przedstawiona na fig. 1.1-1.5 wraz z odpowiadającą jej sekwencją aminokwasów białka OspA.
Jak widać na fig. 1.1-1.5, antygen 31 kDB. burgdorferi odpowiada białku zawierającemu 273 aminokwasy.
Wytwarzanie białka niesprzężonego w wyniku fuzji.
a) Klon wytwarzający immunoreaktywne białko rZS7/31-2 hodowano przez noc w 30°C w 10 ml LB z ampicyliną. 1 ml hodowli przeniesiono do 100 ml podłoża selekcyjnego i hodowano w 30°C przy dobrym napowietrzeniu do gęstości 8x107 komórek na ml (A600=0,2). Ekspresję rekombinowanego białka osiągnięto przenosząc komórki gospodarza do 42°C. Po ochłodzeniu i odwirowaniu komórki przemyto buforem STE (10 mmol/l Tris, 100 mmol/l NaCl, 1 mmol/l EDTA pH 8,0) i osad zawieszono w 0,6 ml buforu litycznego (25% sacharoza, 50 mmol/l Tris pH 8,0). Po dodaniu 150 pl lizozymu (10 mg/ml) mieszaninę inkubowano 15 minut na lodzie, po czym przez następne 15 minut na lodzie po dodaniu 18 plDNA-azy 1 (10 mg/ml) w obecności 5 pl 1 mol/l chlorku magnezu. Następnie dodano 250 pl mieszanki detergentowej 4x (1% Triton X 100, 0,5% dezoksycholanu, 0,1 mol/l NaCl, 10 mmol/l Tris, pH 7,4) i inkubowano 5 minut na lodzie. Po odwirowaniu osad przemyto dwukrotnie buforem A (50 mmol/l Tris, 50 mmol/l NaCl, 1 mmol/l EDTA, pH 8,0), zawieszono w 9 objętościach buforu A z dodatkiem 8 M mocznika i inkubowano przez godzinę w temperaturze pokojowej. Próbę rozcieńczono 9 częściami buforu B (50 mmol/l KH2HPO4/K2HPO4, 50 mol/l NaCl, 1 mmol/l EDTA, pH 10,7) i mieszano przez 30 minut w temperaturze pokojowej utrzymując pH 10,7 przez dodawanie KOH. Następnie pH roztworu obniżono do 7,0 dodając HCl. Próbę dializowano przez noc w 4°C wobec buforu A i wirowano 10 minut w 4°C przy 10 000 obr/min. w roztworze SS34. Nadsącz, zawierający rekombinowane białko, przechowywano 2 -20°C.
b) Ponieważ klon wydziela immunoreaktywne białko rZS7/31-2 do podłoża hodowlanego, możliwe jest oczyszczenie go bezpośrednio z podłoża (chromatografia powinowactwa).
Preparacja rekombinowanego białka OspA (niesprzężonego) i oczyszczanie chromatografią powinowactwa.
Rekombinowane białka na koniec oczyszczano chromatografią powinowactwa. W tym celu oczyszczone przeciwciała monoklonalne LA-2 zostały związane kowalencyjnie na aktywowanej Sepharozie CL 4B. Dializowany wyciąg mocznikowy z rekombinowanym białkiem adsorbowano na Sepharozie CL 4B sprzężonej z mysią IgG i nakładano na kolumnę LA-2 - Sepharoza CL 4B. Po intensywnym płukaniu związane białko eluowano 0,1 mol/l glicyną - 0,1 mol/l NaCl, pH 2,5. Wartość pH zebranych frakcji zobojętniano przez natychmiastowe dodanie 1/10 objętości 0,5 mol/l K2HPO4. Frakcje zawierające białko zatężano i dializowano. Stopień oczyszczenia oznaczano elektroforezą w żelu poliakryloamidowwm z SDS.
Charakterystyka immunologiczna rekombinowanego białka rZS7/31-2.
Białko rZS7/31 -2 zbadano immunologicznie. Dla porównania włączono do badań rekombinowane białko rB31/41-9 (antygen powierzchniowy 41 kD B. burgdorferi).
Płytki mikrotitracyjne z dołkami o płaskim dnie powlekano wyciągami mocznikowymi rekombinowanych białek rZS7/31-2 lub rB31-41-9, względnie wyciągiem mocznikowym szczepu MC 1061 E. coli, użytym do ekspresji genów. Nieswoiste miejsca wiązania blokowano 0,2% żelatyną w buforowanym fosforanami roztworze soli. Dołki tak przygotowanych płytek mikro10
170 229 titracyjnych wypełniono podanymi przeciwciałami monoklonalnymi LA-2 (anti-31 kD, Osp-A), LA-1 (anti-41 kD, flagellina), oraz ACHT-2 (anti-alfa-antychymotrypsyna).
Związane przeciwciała monoklonainr reagowały z gatunkowo swoistymi immunoglobulinami anti-mysim.i znakowanymi peroksydazą. Związane przeciwciała znakowne peroksydazą oznaczono ilościowo stosując substrat peroksydazy ortofenylodiaminę. Absorpcję przy 492 nm (A492) mierzono bezpośrednio na płytkach przy pomocy automatycznego czytnika. Natężenie absorpcji jest miarą ilości związanych przeciwciał monoklonalnych.
Przeciwciało monoklonalne LA-2 reaguje swoiście z rZS7/31-2, nie reaguje natomiast z MC 1061 względnie rB31/41-9. Reakcja kontrolna przeciwciała monoklonalnego LA-1 jest swoista dla rB31/41-9. Kontrolne przeciwciało monoklonalne ACHT-2 (kontrolna ujemna) nie wykazuje reakcji z żadnym z tych białek.
Jak widać na fig. 2, epitop antygenowy rozpoznawany swoiście przez przeciwciało monoklonalne LA-2 wchodzi w skład, białka rekombinanta rZS7/31-2 sklonowanego z genomu B. burgdorferi ZS7.
Przykład IV. Porównanie przeciwciał swoistych dla antygenu 31 kD (OspA) względem antygenu 34 kD (OspB) z przeciwciałami swoistymi dla antygenu 41 kD (flagellina).
Przeciwciała monoklonalne LA-2 i LA-26.1 rozpoznają antygen 31 kD OspA i należą do izotypu (podklasy) IgG2b Iub IgG1. Przeciwciała monoklonalne LA-25.1 i LA-27 1 rozpoznają antygen 34 kD OspB i należą do izotypu (podklasy) IgG2b Iub IgG1. Przeciwciała monoklonalne LA-10 1 LA-21 są swoiste dla związanego z rzęskami białka periplazmatycznego 41 kD B burgdorferi i należą do izotypu IgG2a Iub IgG 1. Wszystkie wymienione przeciwciała otrzymano w sposób opisany w przykładzie II. W obecnym doświadczeniu chodziło o ustalenie, czy również przeciwciała monoklonalne przeciw innemu antygenowi B. burgdorferi powodują ochronę myszy Scid przeciw objawom boreliozy Lyme.
Poliklonalną surowicę odpornościowa! anti B31 pobierano od myszy C57BL/6 91 dni po podskórnym podaniu im dawki 1x108 komórek B31 B. burgdorferi. Poliklonalną IMS anti ZS7 pobierano od myszy C57BL/6 68 dni po podskórnym podaniu im dawki 1x108 komórek B burgdorferi ZS7. Obie surowice zawierały 60 ąg/ml swoistych przeciwciał, co stwierdzono metodą ELISA (Schaible i in., J. Exp. Med. 170 (1989), 1427-1432). Normalną surowicę mysią (NMS) pobierano od myszy C57BL niczym nie traktowanych.
W dniu inokulacji myszy B. burgdorferi i później w odstępach co 4 dni myszy Scid otrzymywały dootrzewnowo podane wyżej przeciwciała IMS, NMS Iub PBS według następującego schematu:
Dzień 0 i dzień 3: 100 μΐ
Dzień 7 i dzień 10: 200 μl
Dzień 13 i dzień 17: 300 μl
Myszy Scid, które otrzymały ant.i-ZS7 IMS, anti-B 31 IMS Iub przeciwciało monoklonalne LA-2 nie wykazały widocznych klinicznych objawów zapalenia stawów, to znaczy nie wystąpiło zaczerwienienie i obrzęk stawów goleniowo-stępowych w ciągu 21 obserwacji. Również nie stwierdzono objawów stanu zapalnego serca i zapalenia wątroby. Badania histopatologiczne nie wykazały zmian w stawach, sercu i wątrobie myszy Scid, którym podano anti-ZS7 IMS, anti-B31 IMS Iub przeciwciało monoklonalne LA-2.
Również inne przeciwciało monoklonalne swoiste dla OspA, LA-26.1 izotypu IgG1, a także swoiste dla OspB przeciwciała LA-25.1 i LA-27.1 powodowały złagodzenie objawów zapalenia stawów, stanu zapalnego serca i zapalenia wątroby. Wystąpiły tu lekkie zmiany patologiczne w badanych narządach.
W przeciwieństwie do tego, myszy Scid, którym podano bufor PBS, NMS Iub przeciwciała monoklonalne przeciw flagellinie (LA-10 Iub LA-21) wykazały kliniczne znamiona zapalenia stawów i zmiany patologiczne typowe dla myszy Scid niczym nie traktowanych (tabela 3) U tych ostatnich zwierząt objawy nasilały się z upływem czasu po inokulacji zarazka i nie uległy złagodzeniu do końca okresu obserwacji. U myszy Scid uprzednio traktowanych anti-ZS7 IMS Iub przeciwciałem LA-2 nie udało się izolować krętków. Natomiast wykryto krętki immuno170 229 fluorescencyjnie lub izolacją z krwi u myszy Scid traktowanych buforem PBS, NMS lub przeciwciałami monoklonalnymi LA-25.1, LA-26.1, LA-27.1, LA-10 i LA-21.
Tabela 3
| Szczep C.B-17 Scid (liczba myszy) | Podano | Podklasa IgG | Kliniczne zapalenie stawów | Histopatologia | Wykrywalność B burgdorferi (hodowla i lmmunofluor) | |
| Zapalenie okołostawowe stawów | Zapalenie serca | |||||
| n = 8 | PBS (kontrola ujemna) | + | + | + | + | |
| n = 3 | NMS (kontrola ujemna) | + | + | + | + | |
| n = 3 | anti--331 IMS | - | - | -* | +° | |
| n= 2 | anti-ZS7 IMS | - | - | .* | ||
| n = 6 | LA-2 (OspA) | 2b | - | .* | ||
| n = 3 | LA-10 (flagellina) | 2a | + | + | + | +° |
| n = 3 | LA-21 (flagellina) | 1 | + | + | +/- | + |
| n = 3 | LA-26 1 (OspA) | 1 | + | ± | + | +° |
| n = 3 | LA-25.1 (OspB) | 2b | + | ± | ± | + |
| n = 3 | LA-27.1 (OspB) | 1 | + | + | ± | +° |
Stopień zmian histopatologicznych oznaczono - brak, * subklmiczne, +/- umiarkowane, + ciężkie “Badanie immunofluorescencyjne było możliwe nie u wszystkich osobników
Przykład V. Wpływ surowicy odpornościowej myszy uodpornionych OspA ma przebieg boreliozy Lyme u myszy Scid.
W tym doświadczeniu można było wykazać, ze podanie natywnego OspA (izolowanego z B. burgdorferi ZS7) lub rekombinowanego OspA (izolowanego z E. coli bakterii transformowanych rekombinantowyrn plazmidem pZS-2/31-2 (DSM 5528) indukuje u normalnych myszy C57BL/6 wytwarzanie ochronnych przeciwciał poliklonalnych. Po podaniu tych przeciwciał występuje u myszy Scid przeciw boreliozie Lyme. Stwierdzono przy tym, że rekombinowany OspA wywołuje ochronną odpowiedź immunologiczną porównywalną z odpowiedzią na natywny OspA. Wyniki i szczegółowy przebieg doświadczenia podano w tabeli 4.
Otrzymywanie rekombinanta OspA opisano w przykładzie III.
Otrzymywanie OspA oraz uodpornienie myszy OspA przebiegało jak niżej:
Krętki w ilości 3,2x1010 mieszano przez dwie godziny na mieszadle magnetycznym w 5 ml PBS/7,5 ml n-butanolu, w obecności inhibitorów proteaz (5 mmol/l EDTA, 5 mmol/l benzamidyny i 0,5 mmol/l PMSF). Następnie mieszaninę wirowano przez 90 minut w 4 °C przy 10 000 obr./min. w wirówce Sorvall (rotor kątowy). Fazę wodną, zawierającą białka powierzchniowe, zbierano i przemywano trzykrotnie chloroformem. Zawartość białka oznaczano mierząc ekstynkcję przy 280 nm, lub testem BCA.
W żelu srebrowym lub metodą Westernblot z surowicą króliczą anti B. burgdorferi stwierdzono dla szczepu ZS7 główny prążek w zakresie ciężaru cząsteczkowego 31 kDa, oraz słabe prążki w zakresie 20, 34 i 65-68 kDa. Preparat butanolow-O-wodny szczepu B31 B. burgdorferi wykazał główny prążek przy 31 kDa oraz słabe prążki przy 20 i 34 kDa.
Uodpornienie myszy natywnym i rekombinowanym OspA.
Myszom C57BL/6 lub C.B-17 wstrzykiwano podskórnie w okolicy nasady ogona 3x w odstępach 7 do 10 dni 5 pg (natywny OspA szczepu B31) lub 10 pg (natywny OspA szczepu ZS7, rekombinowany OspA ZS7) w 100 pl adjuwantu (ABM3, Fa, Sebak, Aidenbach, RfN).
170 229
Począwszy od 3 tygodni po ostatniej dawce surowice można było pobierać przez 3 do 4 miesięcy Zawartość swoistych przeciwciał oznaczano metodą ELISA.
Tabela 4
Wpływ monoklonalnych i poliklonalnych przeciwciał swoistych dla B burgdorferi na wykrywalność krętków i rozwój zapalenia stawów u myszy Scid zakażonych B burgdorferi
| Szczep C B-17 liczba myszy | Podano | Rozwój zapalenia stawów Tygodnie | Wykrywal- ność B burgdorferi | ||
| 1 | 2 | 3 | |||
| n = 6 | PBS (kontrola ujemna) | + | + | + | 6/6 |
| n = 6 | LA-2 | - | - | - | 0/3 |
| n = 2 | anti OspA IMS (natywny) | - | - | - | 0/2 |
| n = 3 | anti OspA IMS (rekomb) | - | - | - | 0/3 |
Pierwsza dawka przeciwciał dootrzewnowo (100 pl) w dniu 0 (dzień zakażenia B. burgdorferi ZS7 1x 108 komórek podskórnie u nasady ogona). Następne dawki przeciwciał dzień 4(100pl,dzień7 (200 pl), dzień 11 (200 pl), dzień 14 (300 pl), dzień 18 (300 pl) dootrzewnowo.
170 229 cttgagctfaaaggaacttctgataaaaacaafggatctggagtacttgaaggcgtaaaa L E L K G T S D K N N G S G V LE G V K gdgacaaaagtaaagtaaaattaacaaftfdgacgatdaggdaaaccacacttgaa A D K S K V K L T 1 S D D L G Q T T L E gttttcaaagaagacggraaaacactagtatcaaaaaaagtaacttccaaagacaagtca
V F K E D G K T L V S K K V T S K D K S
FIG. 1(2) fcaacagaagaaaaattcaatgaaaaaggłgaagtaktgaaaaaataałaacaagagca STE EKFNEKGEVSEKIITRA gacggaaccagadtgaatacacagaaattaaaagcgafggatdggaaaagctaaagag
DGTRLEYTEIKSDGSGKAKE gttftaaaaagcfatgttdtgaaggaaddaadgctgaaaaaacaacadggtggtt
V L K S Y V L E G TITAEKT T L V V
FIG. 1 (3)
170 229 aaagaaggaactgttacttt-aagcooaaatattl-caaaatctggggaagtttcagttgaa
K E G Τ V T L S K N 1SKS GE V S V E cttaatgacactgacagfagtgcfgdactaaaaaaactgcagcttggaattcaggcact LNDTDSSAATK KTAAWNSGT fcaadttaacaattadgtaaacagtaaaaaaadaaagacdtgtgtttacaaaagaa S T L Τ I Τ V N S K K Τ K D L V F Τ K E
FIG. 1(4 aacacaadacagtacaacaatacgadcaaatggcaccaaadagaggggfcagcagd N Τ I Τ V 0 Q Y DS N G Τ K L E G S A V gaaattacaaaactfgatgaaattaaaaacgctttaaaataa E ITKLDEIKNALK*
FIG. 1(5)
170 229
Charakterystyka immunologiczna rekombinowanego białka rZS7/ 31- 2
Białka powierzchniowe
492
Przeciwciała monoklonalne
FIG. 2
170 229
Sekwencja DNA i odpowiadająca jej sekwencja aminokwasów antygenu 31 kDa (OspA) B. burgdorferi ZS7.
o
LJ cn
O
a c
o o
o o
o cn c
cn
| 3 | ÓZ | |||
| cn | > | 3 o 3 | a | |
| o | cn | |||
| O | 3 | |||
| O | Λ | -t— | > | |
| o | cn | cn | ||
| ej | ΣΖ | g | t— | |
| YZ | O O cn | LU | 3 3 cn | < |
| CD | cn | CD | ||
| cn | 3 | |||
| < | o | CL | _3 | _1 |
| cn | ||||
| _1 | ~3 | a | ||
| -i— | cn | |||
| _1 | a | a | ||
| cn | _3 | >- | ||
| < | _c | > | cn | |
| _1 | cn 3 o | cz> | 3 3 t_J | hZ |
| cn | CD | |||
| — | -4— | -> | cn | |
| cn | LJ | |||
| (Z) | 3 | a | ||
| _1 | cn | cn | ||
| ϋ | 3 | |||
| CD | O | 3 | YZ | |
| O | 2: | 3 | ||
| O | o | |||
| 3 | 3 | z | ||
| 3 | hZ | 3 | ||
| CD | 3 cn | 3 3 | ÓZ | |
| _1 | 3 cn | LU | 3 3 | |
| uj | a | 3 | 1 1 1 | |
| _1 | 3 | cn | ||
| cn | 3 | |||
| >- | tj | _j | 3 3 | 2Z |
| o | ||||
| ÓZ | cn | (Z) | cn | CZ) |
| 3 | 3 | |||
| YZ | O cn | CZ) | _3 | > |
| O | cn | |||
| Σ | cn | > | 0 | _1 |
Departament Wydawnictw UP RP Nakład 90 egz. Cena 4,00 zł
Claims (13)
- Zastrzeżenia patentowe1. Sposób wytwarzania antygenów, które dają reakcję immunologiczną z przeciwciałem przeciw OspA, znamienny tym, że pule genów B. burgdorferi przeszukuje się za pomocą jednego lub więcej przeciwciał monoklonalnych swoistych dla antygenu 31 kD (OspA) Borrellia burgdorferi i izoluje się klony, które z przeciwciałem lub przeciwciałami dają dodatnią reakcję immunologiczną i eksprymuje się DNA kodujący te antygeny wyizolowany z dodatnich klonów.
- 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że kodująca antygen sekwencja DNA znajduje się w wektorze, zwłaszcza w wektorze prokariotycznym, odpowiednim dla ekspresji białka.
- 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że antygen zawiera następującą sekwencję aminokwasów lub immunogenny epitop tej sekwencji:
M K K Y L L G I G L I L A L I A C K Q N V S S L D E K N S V S V D L P G E M N V L V S K E K N K D G K Y D L I A T V D K L E L K G T S D K N N G S G V L E G V K A D K S K V K L T I S D D L G Q T T L E V F K E D G K T L V S K K V T S K D K S S T E E K F N E K G E V S E K I I T R A D G T R L E Y T E I K S D G S G K A K E V L K S Y V L E G T L T A E K T T L V V K E G T V T L S K N I S K S G E V S V E L N D T D S S A A T K K T A A W N S G T S T L T I T V N S K K T K D L V F T K E N T I T V Q Q Y D S N G T K L E G S A V E I T K L D E I K N A L K * - 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że antygen jest białkiem sprzężonym z beta-gal<dktozydazą lub jest białkiem niesprzężonym.
- 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że do przeszukiwania stosuje się przeciwciało monoklonalne swoiste dla antygenu 31 kD szczepów ZS7 (DSM 5527) i/lub B31 (ATCC 35201) B. burgdorferi.
- 6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że do przeszukiwania stosuje się przeciwciało monoklonalne klasy IgG, a zwłaszcza podklasy IgG1.
- 7. Sposób wytwarzania antygenów, które dają reakcję immunologiczną z przeciwciałem przeciw OspB, znamienny tym, że pule genów B. burgdorferi przeszukuje się za pomocą jednego lub więcej przeciwciał monoklonalnych swoistych dla antygenu 34 kD (OspB) Borrellia burgdorferi i izoluje się klony, które z przeciwciałem lub przeciwciałami dają dodatnią reakcję immunologiczną i eksprymuje się DNA kodujący te antygeny wyizolowany z dodatnich klonów.170 229
- 8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że kodująca antygen sekwencja DNA znajduje się w wektorze, zwłaszcza w wektorze prokariotycznym, odpowiednim dla ekspresji białka.
- 9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że jako wektor prokariotyczny stosuje się plazmid.
- 10. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, żejako wektor stosuje się pZS-7/31 -2 (DSM 5528).
- 11. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że antygen jest białkiem sprzężonym z beta-galaktozydazą lub jest białkiem niesprzężonym.
- 12. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że do przeszukiwania stosuje się przeciwciało monoklonalne swoiste dla antygenu 34 kD szczepów ZS7 (DSM 5527) i/lub B31 (ATCC 35201) B. burgdorferi.
- 13. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, ze do przeszukiwania stosuje się przeciwciało monoklonalne klasy IgG, a zwłaszcza podklasy lgG2b lub IgG1.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3931236 | 1989-09-19 | ||
| DE4015911A DE4015911A1 (de) | 1989-09-19 | 1990-05-17 | Impfstoff gegen die lyme-krankheit |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL170229B1 true PL170229B1 (pl) | 1996-11-29 |
Family
ID=25885304
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL90286918A PL169804B1 (pl) | 1989-09-19 | 1990-09-18 | Sposób wytwarzania nowej szczepionki do biernego uodparniania przeciw boreliozie z Lyme PL PL |
| PL90307358A PL170229B1 (pl) | 1989-09-19 | 1990-09-18 | Sposób wytwarzania antygenów PL PL |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL90286918A PL169804B1 (pl) | 1989-09-19 | 1990-09-18 | Sposób wytwarzania nowej szczepionki do biernego uodparniania przeciw boreliozie z Lyme PL PL |
Country Status (24)
| Country | Link |
|---|---|
| US (6) | US5178859A (pl) |
| EP (5) | EP0633313B1 (pl) |
| JP (3) | JP3205932B2 (pl) |
| KR (2) | KR100205462B1 (pl) |
| AT (4) | ATE131732T1 (pl) |
| AU (1) | AU651560B2 (pl) |
| CA (1) | CA2025597C (pl) |
| CZ (2) | CZ284538B6 (pl) |
| DE (5) | DE4015911A1 (pl) |
| DK (4) | DK0633028T3 (pl) |
| ES (4) | ES2082812T3 (pl) |
| FI (1) | FI102248B (pl) |
| GR (3) | GR3018995T3 (pl) |
| HK (2) | HK1002405A1 (pl) |
| HR (1) | HRP940545B1 (pl) |
| HU (2) | HU212716B (pl) |
| IE (1) | IE903377A1 (pl) |
| NO (2) | NO311767B1 (pl) |
| NZ (1) | NZ235260A (pl) |
| PL (2) | PL169804B1 (pl) |
| PT (1) | PT95349B (pl) |
| SI (1) | SI9011773B (pl) |
| SK (3) | SK456090A3 (pl) |
| YU (2) | YU48250B (pl) |
Families Citing this family (45)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK590288D0 (da) | 1988-10-24 | 1988-10-24 | Symbicom Ab | Kemiske forbindelser |
| WO1993008306A1 (en) * | 1991-10-22 | 1993-04-29 | Symbicom Aktiebolag | Improvement in borrelia burgdorferi diagnosis and prophylaxis |
| US5777095A (en) * | 1988-10-24 | 1998-07-07 | Symbicom Aktiebolag | Osp A and B Sequence of Borrelia burgdonferi strains ACA1 and IP90 |
| US6143872A (en) * | 1988-10-24 | 2000-11-07 | Symbicom Aktiebolag | Borrelia burdorferi Osp A and B proteins and immunogenic peptides |
| US7094391B1 (en) * | 1988-10-24 | 2006-08-22 | The University Of Texas System | Compositions and methods for administering Borrelia burgdorferi antigens |
| DE4015911A1 (de) * | 1989-09-19 | 1991-03-28 | Max Planck Gesellschaft | Impfstoff gegen die lyme-krankheit |
| US5582829A (en) * | 1990-04-05 | 1996-12-10 | Rx Technologies, Inc. | Sonicated borrelia burgdorferi vaccine |
| CA2084413A1 (en) | 1990-06-15 | 1991-12-16 | Richard A. Flavell | Compositions and methods for the prevention and diagnosis of lyme disease |
| DK0465204T3 (da) * | 1990-07-06 | 2000-10-09 | American Home Prod | Vaccine mod Lyme sygdom |
| CA2057536C (en) * | 1990-12-21 | 1999-10-26 | John J. Dunn | Cloning and expression of borrelia lipoproteins |
| US6221363B1 (en) * | 1991-07-11 | 2001-04-24 | Baxter Aktiengesellschaft | Vaccine for the prevention of lyme disease |
| US6872550B1 (en) | 1991-07-11 | 2005-03-29 | Baxter Vaccine Ag | Immunogenic formulation of OspC antigen vaccines for the prevention and treatment of lyme disease and recombinant methods for the preparation of such antigens |
| EP0874051A3 (en) * | 1991-08-15 | 1998-11-04 | SMITHKLINE BEECHAM BIOLOGICALS s.a. | OSP a protein of borrelia burgdorferi subgroups, encoding genes and vaccines. |
| US6676942B1 (en) * | 1991-08-15 | 2004-01-13 | Smithkline Beecham Biologicals (S.A.) | Osp a proteins of Borrelia burgdorferi subgroups, encoding genes and vaccines |
| JPH06511154A (ja) * | 1991-10-18 | 1994-12-15 | コノート ラボラトリーズ インコーポレイテッド | 組換えＢｏｒｒｅｌｉａタンパクの製造法 |
| US6303129B1 (en) * | 1992-07-28 | 2001-10-16 | Rx Technologies | Production of borrelia burgdorferi vaccine, product produced thereby and method of use |
| US6716591B1 (en) | 1993-07-30 | 2004-04-06 | Yale University | B. burgdorferi polypeptides |
| US5656451A (en) * | 1993-07-30 | 1997-08-12 | Yale University | OspE, OspF, and S1 polypeptides in borrelia burgdorferi |
| US7008625B2 (en) | 1993-11-01 | 2006-03-07 | Research Foundation Of The State University Of New York | Recombinant constructs of Borrelia burgdorferi |
| US5558993A (en) * | 1994-06-17 | 1996-09-24 | The Regents Of The University Of California | Cloned Borrelia burgdorferi virulence protein |
| GB9511909D0 (en) * | 1995-06-12 | 1995-08-09 | Microbiological Res Authority | Vaccine |
| EP0894143B2 (en) | 1996-02-21 | 2012-04-18 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Vmp-like sequences of pathogenic borrelia |
| DE19632862B4 (de) | 1996-08-14 | 2006-08-03 | Mikrogen Molekularbiologische Entwicklungs-Gmbh | Immunologisch aktive Proteine von Borrelia burgdorferi, dafür kodierende Nukleinsäuren sowie deren Verwendung in Testkits und als Impfstoffe |
| US6458555B1 (en) * | 1996-08-21 | 2002-10-01 | Gerd Bach | Cytologic method of examining mucous membranes |
| US6060082A (en) * | 1997-04-18 | 2000-05-09 | Massachusetts Institute Of Technology | Polymerized liposomes targeted to M cells and useful for oral or mucosal drug delivery |
| DE19740735A1 (de) * | 1997-09-16 | 1999-03-18 | Max Planck Gesellschaft | Arzneimittel zur Therapie einer manifesten Lyme-Borreliose |
| US6306623B1 (en) | 1998-02-24 | 2001-10-23 | The University Of California | Leptospiral major outer membrane protein LipL32 |
| ATE386805T1 (de) | 1998-07-31 | 2008-03-15 | Gundersen Lutheran Medical Fou | Verwendungen eines borreliaziden epitops des aussermembranproteins c von borrelia burgdorferi (ospc) als impstoff |
| WO2000056298A2 (en) * | 1999-03-19 | 2000-09-28 | Luitpold Pharmaceuticals, Inc. | Treatment of lyme disease with polysulfated glycosaminoglycan formulations |
| WO2000078345A1 (en) * | 1999-06-21 | 2000-12-28 | Milkhaus Laboratory, Inc. | Method for treatment of lyme disease |
| WO2002016421A2 (en) | 2000-08-18 | 2002-02-28 | Research Foundation Of The State University Of New York | Altered ospa of borrelia burgdorferi |
| US7847084B2 (en) | 2002-12-20 | 2010-12-07 | Board Of Regents, The University Of Texas System | VMP-like sequences of pathogenic Borrelia species and strains |
| NZ576564A (en) | 2006-11-03 | 2012-03-30 | Schering Plough Ltd | Canine lyme disease vaccine |
| WO2008116468A2 (en) | 2007-03-26 | 2008-10-02 | Dako Denmark A/S | Mhc peptide complexes and uses thereof in infectious diseases |
| EP2167537A2 (en) | 2007-07-03 | 2010-03-31 | Dako Denmark A/S | Compiled methods for analysing and sorting samples |
| US10611818B2 (en) | 2007-09-27 | 2020-04-07 | Agilent Technologies, Inc. | MHC multimers in tuberculosis diagnostics, vaccine and therapeutics |
| US10968269B1 (en) | 2008-02-28 | 2021-04-06 | Agilent Technologies, Inc. | MHC multimers in borrelia diagnostics and disease |
| WO2010009735A2 (en) | 2008-07-23 | 2010-01-28 | Dako Denmark A/S | Combinatorial analysis and repair |
| GB0817244D0 (en) | 2008-09-20 | 2008-10-29 | Univ Cardiff | Use of a protein kinase inhibitor to detect immune cells, such as T cells |
| US11992518B2 (en) | 2008-10-02 | 2024-05-28 | Agilent Technologies, Inc. | Molecular vaccines for infectious disease |
| US10369204B2 (en) | 2008-10-02 | 2019-08-06 | Dako Denmark A/S | Molecular vaccines for infectious disease |
| AU2010322085B2 (en) * | 2009-11-17 | 2016-09-15 | Zoetis Services Llc | Peptides and methods for the detection of Lyme disease antibodies |
| US8758772B2 (en) | 2011-11-04 | 2014-06-24 | Abaxis, Inc. | Peptides and methods for the detection of lyme disease antibodies |
| PL223175B1 (pl) | 2012-10-22 | 2016-10-31 | Inst Chemii Bioorganicznej Polskiej Akademii Nauk | Szczepionka przeciw boreliozie, konstrukt genetyczny, rekombinowane białko, sposób otrzymywania konstruktu genetycznego, sposób otrzymywania szczepionki, sposób otrzymywania rekombinowanych białek, zastosowanie rekombinowanych białek do wytwarzania szczepionki przeciwko boreliozie |
| US9610336B1 (en) * | 2014-07-16 | 2017-04-04 | Amiram Katz | Immunotherapy for lyme disease |
Family Cites Families (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK590288D0 (da) * | 1988-10-24 | 1988-10-24 | Symbicom Ab | Kemiske forbindelser |
| US4772464A (en) | 1985-08-01 | 1988-09-20 | Miles Laboratories, Inc. | Protective antibodies to serotypic determinants of flagellar antigens |
| US4888276A (en) * | 1986-06-26 | 1989-12-19 | Minnesota Mining And Manufacturing Company | Method and composition for the diagnosis of Lyme disease |
| US4721617A (en) | 1986-08-14 | 1988-01-26 | Regents Of The University Of Minnesota | Vaccine against lyme disease |
| US5034515A (en) * | 1987-09-22 | 1991-07-23 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Staphylococcal fibronectin receptor, monoclonal antibodies thereto and methods of use |
| DE4015911A1 (de) * | 1989-09-19 | 1991-03-28 | Max Planck Gesellschaft | Impfstoff gegen die lyme-krankheit |
| ES2092560T5 (es) * | 1989-12-22 | 2004-09-16 | Mikrogen Molekularbiologische Entwicklungs-Gmbh | Proteinas inmunologicamente activas de borrelia burgdorferi, estuches de ensayo relacionados y vacuna. |
| CA2084413A1 (en) * | 1990-06-15 | 1991-12-16 | Richard A. Flavell | Compositions and methods for the prevention and diagnosis of lyme disease |
| DK0465204T3 (da) * | 1990-07-06 | 2000-10-09 | American Home Prod | Vaccine mod Lyme sygdom |
| CA2057536C (en) * | 1990-12-21 | 1999-10-26 | John J. Dunn | Cloning and expression of borrelia lipoproteins |
| EP0874051A3 (en) * | 1991-08-15 | 1998-11-04 | SMITHKLINE BEECHAM BIOLOGICALS s.a. | OSP a protein of borrelia burgdorferi subgroups, encoding genes and vaccines. |
| ATE174378T1 (de) * | 1991-08-27 | 1998-12-15 | Novo Nordisk As | Waschmittelzusammensetzungen |
| JPH06511154A (ja) * | 1991-10-18 | 1994-12-15 | コノート ラボラトリーズ インコーポレイテッド | 組換えＢｏｒｒｅｌｉａタンパクの製造法 |
| JPH07502646A (ja) * | 1991-10-21 | 1995-03-23 | メディミューン，インコーポレーテッド | リポタンパク質の分泌シグナルをコード化するｄｎａを含む細菌発現ベクター |
-
1990
- 1990-05-17 DE DE4015911A patent/DE4015911A1/de not_active Withdrawn
- 1990-09-07 HU HU905816A patent/HU212716B/hu not_active IP Right Cessation
- 1990-09-11 NZ NZ235260A patent/NZ235260A/xx unknown
- 1990-09-12 AU AU62444/90A patent/AU651560B2/en not_active Ceased
- 1990-09-18 DE DE59010888T patent/DE59010888D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-09-18 PL PL90286918A patent/PL169804B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1990-09-18 EP EP94112144A patent/EP0633313B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-09-18 DE DE59010863T patent/DE59010863D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-09-18 DE DE59009978T patent/DE59009978D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-09-18 EP EP94112145A patent/EP0633028B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-09-18 AT AT90117943T patent/ATE131732T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-09-18 DK DK94112145T patent/DK0633028T3/da active
- 1990-09-18 EP EP98105444A patent/EP0861664A3/de not_active Withdrawn
- 1990-09-18 EP EP94112143A patent/EP0643974B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-09-18 DK DK90117943.2T patent/DK0418827T3/da active
- 1990-09-18 DK DK94112143T patent/DK0643974T3/da active
- 1990-09-18 ES ES90117943T patent/ES2082812T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-09-18 IE IE337790A patent/IE903377A1/en not_active IP Right Cessation
- 1990-09-18 FI FI904597A patent/FI102248B/fi not_active IP Right Cessation
- 1990-09-18 PL PL90307358A patent/PL170229B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1990-09-18 AT AT94112143T patent/ATE175576T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-09-18 DK DK94112144T patent/DK0633313T3/da active
- 1990-09-18 ES ES94112144T patent/ES2145077T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-09-18 NO NO19904062A patent/NO311767B1/no unknown
- 1990-09-18 YU YU177390A patent/YU48250B/sh unknown
- 1990-09-18 AT AT94112145T patent/ATE186646T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-09-18 DE DE59010903T patent/DE59010903D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-09-18 CA CA002025597A patent/CA2025597C/en not_active Expired - Fee Related
- 1990-09-18 EP EP90117943A patent/EP0418827B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-09-18 ES ES94112143T patent/ES2129551T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-09-18 ES ES94112145T patent/ES2141182T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-09-18 AT AT94112144T patent/ATE191499T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-09-18 SI SI9011773A patent/SI9011773B/sl not_active IP Right Cessation
- 1990-09-19 JP JP24765090A patent/JP3205932B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1990-09-19 SK SK4560-90A patent/SK456090A3/sk unknown
- 1990-09-19 PT PT95349A patent/PT95349B/pt active IP Right Grant
- 1990-09-19 CZ CS904560A patent/CZ284538B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1990-09-19 SK SK1511-98A patent/SK283089B6/sk unknown
- 1990-09-19 KR KR1019900014814A patent/KR100205462B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1990-09-19 US US07/585,310 patent/US5178859A/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-09-19 CZ CZ95970A patent/CZ284616B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1990-09-19 SK SK1510-98A patent/SK283088B6/sk unknown
-
1993
- 1993-05-27 US US08/068,063 patent/US5434077A/en not_active Expired - Fee Related
-
1994
- 1994-09-15 HR HR940545A patent/HRP940545B1/xx not_active IP Right Cessation
-
1995
- 1995-03-20 US US08/406,623 patent/US5780030A/en not_active Expired - Fee Related
- 1995-03-20 US US08/407,350 patent/US5686267A/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-04-24 HU HU95P/P00108P patent/HU211228A9/hu unknown
-
1996
- 1996-02-14 GR GR960400397T patent/GR3018995T3/el unknown
-
1997
- 1997-03-12 YU YU9097A patent/YU49370B/sh unknown
-
1998
- 1998-02-13 HK HK98101147A patent/HK1002405A1/xx not_active IP Right Cessation
- 1998-02-23 US US09/027,843 patent/US5856447A/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-08-29 KR KR1019980035375A patent/KR100202128B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1998-12-23 HK HK98114958A patent/HK1013620A1/xx not_active IP Right Cessation
-
1999
- 1999-10-07 US US09/413,858 patent/US6613331B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1999-11-30 GR GR990403104T patent/GR3032010T3/el unknown
-
2000
- 2000-06-14 GR GR20000401362T patent/GR3033675T3/el not_active IP Right Cessation
- 2000-07-26 JP JP2000225341A patent/JP3328644B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2000-12-11 JP JP2000376159A patent/JP3418171B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2001
- 2001-09-24 NO NO20014624A patent/NO315905B1/no unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| PL170229B1 (pl) | Sposób wytwarzania antygenów PL PL | |
| Liao et al. | Antibody-mediated autoimmune myocarditis depends on genetically determined target organ sensitivity. | |
| US5747294A (en) | Compositions and methods for the prevention and diagnosis of lyme disease | |
| US7022328B1 (en) | Therapeutic and diagnostic compositions | |
| JP2907813B2 (ja) | コクシジウム症予防用抗原性蛋白質およびそれを含有するワクチン | |
| US4454121A (en) | Synthetic peptides corresponding to antigenic determinants of the M protein of Streptococcus pyogenes | |
| JP2004536885A (ja) | 抗原性ポリペプチド | |
| US5807685A (en) | OspE, OspF, and S1 polypeptides in Borrelia burgdorferi | |
| US7074894B2 (en) | Antigen composition against mycoplasma | |
| CA2244147A1 (en) | Decorin binding protein compositions and methods of use | |
| RU2555530C2 (ru) | СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ ПОЛИПЕПТИДОВ И БЕЛКОВ H.parasuis | |
| US6716591B1 (en) | B. burgdorferi polypeptides | |
| DK169749B1 (da) | DNA-fragment, der koder for et Pasteurella multocida-toxin eller for en immunogen subsekvens eller analog deraf, ekspressionsvektor, der omfatter DNA-fragmentet, fremgangsmåde til fremstilling af et Pasteurella multocida-toxin og anvendelse af Pasteurella multocida-toxinsekvens eller -analog til fremstilling af en vaccine |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Decisions on the lapse of the protection rights |
Effective date: 20050918 |