PL170229B1

PL170229B1 - Sposób wytwarzania antygenów PL PL

Info

Publication number: PL170229B1
Application number: PL90307358A
Authority: PL
Inventors: Markus M Simon; Ulrich E Schaible; Klaus Eichmann; Michael Kramer; Wallich Reinhard
Original assignee: Deutsches Krebsforsch; Max Planck Gesellschaft
Priority date: 1989-09-19
Filing date: 1990-09-18
Publication date: 1996-11-29
Also published as: KR100205462B1; SK280285B6; ATE186646T1; JP2001204467A; SK283088B6; GR3018995T3; PT95349B; EP0418827A1; PL169804B1; PT95349A; FI102248B1; KR100202128B1; EP0418827B1; NO20014624D0; US6613331B1; CA2025597C; US5780030A; ATE131732T1; ES2129551T3; CA2025597A1

Abstract

1. Sposób wytwarzania antygenów, które daja reakcje immunologiczna z przeciwcialem przeciw OspA, znamienny tym, ze pule genów B. burgdorferi przeszukuje sie za pomoca jednego Iub wiecej przeciwcial monoklonalnych swoistych dla antygenu 31 kD (OspA) Borrellia burgdorferi i izoluje sie klony, które z przeciwcialem Iub przeciwcialami daja dodatnia reakcje immunologiczna i eksprymuje sie DNA kodujacy te antygeny wyizolowany z dodatnich klonów 7. Sposób wytwarzania antygenów, które daja reakcje immunologiczna z przeciwcialem przeciw OspB, znamienny tym, ze pule genów B. burgdorferi przeszukuje sie za pomoca jednego Iub wiecej przeciwcial monoklonalnych swoistych dla antygenu 34 kD (OspB) Borrellia burgdorferi i izoluje sie klony, które z przeciwcialem Iub przeciwcialami daja dodatnia reakcje immunologiczna i eksprymuje sie DNA kodujacy te antygeny wyizolowany z dodatnich klonów. PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania antygenów, które dają reakcje immunologiczne z przeciwciałem przeciw OspA lub z przeciwciałem przeciw OspB B. burgdorferi. Antygeny takie mogą być użyte do czynnego uodparniania przeciw chorobie Lyme, tj. do indukowania wytwarzania przeciwciał przez organizm oraz mogą służyć do uodparniania zwierząt doświadczalnych, z których w zwykły sposób otrzymuje się przeciwciała poliklonalne lub monoklonalne przeciw OspA i/lub OspB.

Borelioza Lyme jest najczęstszą przenoszoną przez kleszcze chorobą zakaźną w umiarkowanych szerokościach geograficznych. Wywołuje ją krętek Borrellia burgdorferi, przenoszony na człowieka przede wszystlkm przez kleszcze rodzaju Ixodes. Chorobajest przewlekłym postępującym zakażeniem obejmującym liczne narządy, jak skóra, ośrodkowy i obwodowy układ nerwowy, serce, wątrobę, nerki i układ mięśni szkieletowych. Ponieważ skuteczne leczenie tego schorzenia antybiotykami jest trudne, podejmuje się duże wysiłki dla zbadania samego zarazka oraz odpowiedzi immunologicznej gospodarza na zakażenie B.burgdorferi. Wprawdzie u osób dotkniętych chorobą Lyme stwierdza się wysokie miano przeciwciał przeciw B.burgdorferi, nie stanowi ono jednak ochrony przeciw zakażeniu. Przyjmuje się, że zarazek bardzo szybko przechodził z krążenia krwi do tkanek, gdzie staje się niedostępny bezpośrednio dla układu immunologicznego. Znaczyłoby to, ze ochrona poprzez przeciwciała jest możliwa tylko na samym początku po zakażeniu, tak długo, jak długo zarazek krąży jeszcze we krwi.

Fakt, ze naturalne zakażenie B.burgdorferi stwierdzono u różnych gatunków zwierząt, doprowadził do prób ustalenia modelu laboratoryjnego choroby Lyme. Dały one ograniczone powodzenie. W doświadczeniach, których celem było wywołanie swoistej odpowiedzi immunologicznej myszy na B.burgdorferi stwierdzono, że zakażenie wsobnych szczepów myszy izolatem B.burgdotferi hodowanym przez dłuższy czas prowadzi do umiarkowanych, ale wyraźnych zmian patomorfologicznych w różnych narządach, takich jak mózg, serce, płuca i nerki. Zmiany te były porównywalne ze zmianami obserwowanymi u pacjentów z chorobą Lyme (Schaible i in., 1988, Infect. Immun. 1, 41). Rozwój pierwotnego obrazu choroby u zwierzątjest przypuszczalnie hamowany przez obronę immunologiczną gospodarza i/lub na skutek zmniejszonej zjadliwości krętków hodowanych przez dłuższy czas in vitro (Johnson i in., 1984, J. Clin. Microbiol. 20,747, Schwan i in., 1988, Infect, and Immun. 56, 1837).

U podstaw wynalazku leży zadanie przygotowania skutecznej szczepionki przeciw chorobie Lyme. W tym celu jednak potrzebne jest opracowanie odpowiedniego zwierzęcego modelu laboratoryjnego. Założono obecnie, że szczep myszy pozbawionych czynnych komórek B i T, tak zwane myszy Scid (Bosma i in., 1983, Nature 10, 52), mogą służyć jako model zwierzęcy, ponieważ u tych myszy po zakażeniu patogennym B.burgdorferi izolatem rozwija się choroba wieloukładowa, a mianowicie głównie zapalenie wielostawowe i stan zapalny serca. Na tym modelu zwierzęcym stało się dopiero możliwe wypróbowanie działania szczepionek przeciw chorobie Lyme.

170 229

Według wynalazku sposób wytwarzania antygenów, które dają reakcje immunologiczne z przeciwciałem przeciw OspA lub z przeciwciałem przeciw OspB B burgdorferi, polega na tym, ze pule genów B. burgdorferi przeszukuje się za pomocą jednego lub więcej przeciwciał monoklonalnych swoistych dla antygenu 31 kD (OspA) lub dla antygenu 34 kD (OspB) Borrellia burgdorferi i izoluje się klony, które z przeciwciałem lub przeciwciałami dają dodatnią reakcję immunologiczną i ekspryrnuje się DNA kodujący te antygeny wyizolowany z dodatnich klonów.

Antygen wytworzony na drodze rekombinacji DNA zawiera następującą sekwencję aminokwasów lub immunogenny epitop tej sekwencji:

M

K

Y

L

G

I

G

L

I

L

A

L

I

A

C

K

Q

N

V

S

L

D

E

K

N

S

V

S

V

D

L

P

G

E

M

N

V

L

V

S

K

E

K

N

K

D

G

K

Y

D

L

I

A

T

V

D

K

L

E

L

K

G

T

S

D

K

N

G

S

G

V

L

E

G

V

K

A

D

K

S

K

V

K

L

T

I

S

D

L

G

Q

T

L

E

V

F

K

E

D

G

K

T

L

V

S

K

V

T

S

K

D

K

S

T

E

K

F

N

E

K

G

E

V

S

E

K

I

T

R

A

D

G

T

R

L

E

Y

T

E

I

K

S

D

G

S

G

K

A

K

E

V

L

K

S

Y

V

L

E

G

T

L

T

A

E

K

T

L

V

K

E

G

T

V

T

L

S

K

N

I

S

K

S

G

E

V

S

V

E

L

N

D

T

D

S

A

T

K

T

A

V

N

S

G

T

S

T

L

T

I

T

V

N

S

K

T

K

D

L

V

F

T

K

E

N

T

I

T

V

Q

Y

D

S

N

G

T

K

L

E

C

S

A

V

E

I

T

K

L

D

E

I

K

N

A

L

K

*

Szczególnie istotny jest antygen, który jest rekombinowanym białkiem sprzężonym z beta-galaktozydazą lub niesprzężonym. Do przeszukiwania stosuje się przeciwciało monoklonalne swoiste dla antygenu 31 kD lub antygenu 34 kD szczepów ZS7 (DSM 5527) i/lub B31 (ATCC 35210) B. burgdorferi, zwłaszcza przeciwciało monoklonalne klasy IgG, a zwłaszcza podklasy IgG2b lub IgG1.

Sekwencja DNA kodująca antygen znajduje się w wektorze prokariotycznym i/lub eukariotycznym, w szczególności w wektorze prokariotycznym.

Rekombinantowy wektor może być zlokalizowany w komórce gospodarza pozachromosomalnie (na przykład plazmid), albo może być zintegrowany z genomem komórki gospodarza (na przykład bakteriofag Lambda). Szczególnie istotny jest rekombinowany wektor pZS-7/31 -2 (DSM 5528).

DNA kodujący antygen 31 kD B. burgdorferi ZS7 lub jego immunogenny epitop zawiera (1) sekwencję kwasów nukleinowych przedstawioną na fig. 1.1-1.5, (2) odpowiadającą jej sekwencją wynikającą z degeneracji kodu genetycznego lub (3) sekwencję, która hybrydyzuje w ostrych warunkach hybrydyzacji z sekwencją (1) i/lub (2). Pojęcie ostre warunki hybrydyzacji należy rozumieć według Maniatisa i in., Molecular Cloning, A laboratory Manual (1982) Cold Spring Harbor Lab., New York.

Antygen wytwarzany sposobem według wynalazku może stanowić substancję czynną szczepionki do czynnego uodpamiania przeciwko chorobie Lyme. Szczepionka taka zawiera także konwencjonalny nośnik, wypełniacz i substancje pomocnicze.

Wykazano, ze podanie natywnego względnie rekombinowanego OspA normalnym myszom indukowało wytwarzanie ochronnych przeciwciał, które po przeniesieniu na myszy Scid

170 229 chroniły je biernie przeciw chorobie Lyme. W szczególności stwierdza się, ze rekombinowany OspA indukuje ochronną odpowiedź immunologiczną porównywalną z odpowiedzią na natywny OspA, stąd tez jest on obiecującym kandydatem do szczepionki przeciw boreliozie Lyme u ludzi.

Podane poniżej przykłady oraz fig. 1.1-1.5 i fig. 2 objaśniają wynalazek. Figury 1.1-1.5 SekwencjaDNA i sekwencja aminokwasów antygenu 31 KD (OspA) B. burgdorferi ZS7. Figura 2 - Charakterystyka immunologiczna rekombinantowego białka rZS7/31-2.

Przykład I. Wywoływanie zapalenia stawów, stanu zapalnego serca i zapalenia wątroby u myszy Scid przez zakażenie szczepem ZS7, B. burgdorferi.

Traktowanie myszy B. burgdorferi.

Dorosłym myszom C.B-17 Scid (homozygotyczne pod względem mutacji Scid) i C.B-17 wstrzyknięto podskórnie u nasady ogona dawki 1x10⁵, 5x10⁵, 1x10⁶ lub 1x10⁸ żywych lub zabitych (promienie UV) komórek B. burgdorferi.

Izolacja B. burgdorferi z kleszczy i myszy.

Badania przeprowadzono używając hodowanego przez dłuższy czas szczepu B31 (ATCC 35210) oraz szczepu ZS7 (DSM 5527) B. burgdorferi świeżo izolowanego z samicy kleszcza Ixodes ricinus. Wszystkie szczepy B. burgdorferi hodowano w zmodyfikowanym podłożu Kelly (Barbour i in., 1983, Switzerland Curr. Microbiol., 8, 123). Komórki B. burgdorferi, izolowane z przewodu pokarmowego kleszczy uprzednio wyjałowionych etanolem lub z krwi zakażonych myszy, hodowano początkowo w podłożu Kelly z dodatkiem 8 fil/ml kanamycyny i 230 (tg/ml fluorouracylu (Johnson i in., 1984, J. Clin. Microbiol. 1, 81).

Odczyny serologiczne,

Swoiste przeciwciała przeciw B. burgdorferi wykrywano konwencjonalną metodą ELISA (Justus i in., 1988, Wehrmed. Mschr. 32, 263). Krzywą standardową dla zawartości immunoglobulin (Ig) otrzymywano przez powlekanie płytki anty-mysią IgG (rozcieńczenie 1:500, roztwór surowicy firmy Paesel, Frankfurt, RFN) i miareczkowanie całkowitej zawartości mysiej IgG Iub IgM (Calbiochem, LaJolla, USA). Całkowitą IgM i IgG w surowicy oznaczano podobnie. Stężenie przeciwciał IgM Iub IgG swoistych dla B. burgdorferi podano w pg/ml.

Barwienie immunofluoroscencyjne i metodą Giemsy.

Porcje po 50 pl krwi umieszczano pipetą w probówkach hematokrytowych (Bector-Dickinson, Reidelberg, RFN) i wirowano w wirówce hematokrytowej przy 5000 g (ECCO, RFN). Probówki przecinano na granicy między surowicą i erytrocytami i 5 pi i surowicy nakładano na szkiełko podstawowe (Superior, Bad Mergentheim, RFN). Szkiełko z naniesionymi próbkami surowicy suszono na powietrzu i utrwalano w 100% etanolu przez 1 minutę w -20°C. Po jednogodzinnej inkubacji w temperaturze pokojowej z hiperimmumzowaną surowicą króliczą przeciw B. burgdorferi (rozcieńczenie 1: 20) szkiełka przemywano PBS i barwiono przez godzinę kozią surowicą antykróliczą koniugowaną z PITC (rozcieńczenie 1:120, Jackson Lab., West Grove, USA). Szkiełka przemywano, pokrywano gliceryną-żelatyną według Kaisere i natychmiast badano w mikroskopie fluoroscencyjnym. Krople krwi niczym nie traktowano suszono na powietrzu, utrwalano w metanolu, barwiono odczynnikiem Giemsy (0,1%, Darmstadt, RFN), odbarwiano PBS i zatapiano w entellanie (Merck, Darmstadt, RFN).

Preparaty histologiczne i ich barwienie.

W różnych okresach czasu po zakażeniu myszy B. burgdorferi pobierano narządy wewnętrzne (mózg, serce, płuca, wątroba, nerki, śledziona, stawy) i przechowywano je albo w ciekłym azocie dla przygoUowywania skrawków mrożonych, albo w 5% formalinie (w PBS) dla zatopienia w parafinie Iub metakrylanie. Skrawki grubości 4 do 7 pm barwiono hematoksyliną-eozyną i zatapiano w entellanie (Merck AG, Darmstadt, RFN). Badania immunohistologiczne wykonano używając systemu Streptawidyna-Biotyna-Peroksydaza (Kramer i in., 1989, Eur. J. Immunol., 19, 151).

Jak pokazuje tabela 1, u myszy Scid zakażonych żywymi zarazkami, obecność B. burgdorferi ZS7 i B31 we krwi stwierdzano przez cały okres doświadczenia. Tylko krętki szczepu ZS7 udało się po izolacji hodować in vitro, natomiast nie udało się to ze szczepem B31. Porównanie rekultywowanych komórek z pierwotnym izolatem B. burgdorferi ZS7 nie wykazało żadnych zmian w zawartości białka i obrazie plazmidów. W czasie całego okresu obserwacji u myszy Scid zakażonych B. burgdorferi nie stwierdzono przeciwciał Iub tylko nieznaczne ich miano. U tych zwierząt nie

170 229 znaleziono przeciwciał IgM Iub IgG swoistych dla B. burgdorferi (tabela 1). Natomiast wszystkie myszy kontrolne C.B-17, zakażone B. burgdorferi, wytworzyły duże ilości całkowitych Ig i podwyższone miano przeciwciał IgM i IgG swoistych dla B. burgdorferi. Między 7 a 20 dniem po zakażeniu B. burgdorferi ZS7 myszy Scid wykazały pierwsze kliniczne objawy zapalenia stawów (zaczerwienienie i obrzmienie obu stawów goleniowo-stępowych), które nasilały się z czasem. Nie stwierdzono natomiast objawów zapalenia stawów u myszy Scid, którym podano komórki B burgdorferi ZS7 naświetlone promieniami UV albo żywe komórki B. burgdorferi B31, a także u myszy kontrolnych C.B-17 zakażonych żywymi komórkami B. burgdorferi ZS7.

Zmiany zapalne stawów stwierdzono również histopatologicznie u myszy Scid zakażonych żywym zarazkiem B. burgdorferi ZS7 (tabela 1). Stwierdzono ciężkie uszkodzenia stawów manifestujące się obecnością przerostowych zmian zapalnych komórek błony maziowej, połączonych z erozją i zniszczeniem tkanki chrzęstnej i/lub kości. Następnie obserwowano ogólne zapalenie serca, z naciekami komórek jednojądrzastych we wsierdziu, mięśniu sercowym i osierdziu. Obserwowano także postępujące zapalenie wątroby wraz z naciekiem komórek jednojądrzastych w okolicy żyły wrotnej i żyły centralnej, odczyny ziarninowe i w końcu wystąpienie zwłóknienia wątroby. Ponadto stwierdzono nieznaczne uszkodzenia nerek, płuc, mózgu i mięśni prążkowanych.

Tabela 1

Zakażenie myszy C B-17 Scid i myszy kontrolnych C.B-17 B burgdorferi Reizolacja krętków z tkanek, miano przeciwciał i rozwój zapalenia stawów

B	burgdorferi	B	burgdorferi	Zapalenie stawów	Przeciwciała (pg/ml)
szczep myszy	szczep	dawka zakaża- jąca	dzień po zakażeniu	detekcja we krwi *	izolacja **	klimcz- O nie	histo- pato- logicznie	całko - wite	Ig	swoiste	Ig
C B-17	ZS7	5x10⁵	7	+	-				20
Scid			36	+	+B	+	+	-	21	-	-
(n = 1)			49	+	+B	+	+	-	26	-	-
			59	+	+B	+	+	-	336	-	-
	ZS7	1x 10⁸	7	+	-	+	+	-	108	-	-
			23	+	+B	+	+	-	54	-	-
	ZS7	1x10⁸	22	+	-	+	+	-	41	-	-
			29	+	+G	+	+	-	-	-	-
			87	+	+B/G	+	+	-	-	-	-
	ZS7	1x10⁵	-	n.b.	n b.	+	n.b.	n.b.	n b.	n b	n b
		1x106	-	n.b.	n.b	+	n.b.	n b.	n.b.	n.b.	n.b
	ZS7	1x108	16	+	+	+	+	-	-	-	-
	ZS 7	1x108	16	-	-	-	-	-	-	-	-
	B31	1x108	22	+	-	-	-	26	32	-	-
	B31	1x108	29	+	-	-	-	-	-	-	-
	-		22	-	-	-	-	-	47	-	-
	-		29	-	-	-	-	54	364	-	-
C.B-17	ZS7	1x108	16	-	-	-	-	2,515	5,963	438	56
n=7			24	-	-	-	-	2,145	6,374	506	94
-	-	-	-	-	-	-	-	304	3,804	-	-
-	-	-	-	-	-	-	-	216	1,952	-	-

* Zabarwienie metodą Giemsa lub lmmunofluorescencja, **Izolacja z krwi (B), stawów (G), °+ Zaczerwienienie i obrzmienie stawów goleniowo-stępowych ⁰⁰ -:7,5 pg/ml surowicy

170 229

Przykład II. Wpływ przeciwciała monoklonalnego swoistego dla antygenu 31 kD B. burgdorferi na przebieg boreliozy Lyme u myszy Scid

Wytworzenie przeciwciała monoklonalnego.

Mysz posiadająca sprawny układ immunologiczny, uodporniona komórkami B. burgdorferi, wytworzyła przeciwciała poliklonalne swoiste dla B. burgdorferi (patrz tabela 1).

Dziesięciotygodniowe samice myszy szczepu wsobnego BALB/c uodporniono krętkami zhomogenizowanymi przez sonikację (B. burgdorferi szczep B31, ATCC 35210).

Schemat uodpornienia.

Dzień 0: 200 ąg antygenu krętkowego z pełnym adjuwantem Freunda podskórnie.

Dzień 21, 35, 49, 63: dawka przypominająca 100 ąg antygenu krętkowego w roztworze soli buforowanym fosforanami dootrzewnowo.

Dzień 66: pobranie śledziony i przygotowanie jednokomórkowej zawiesiny.

Immunizowane komórki śledziony poddano fuzji z komórkami linii szpiczaka Ag8-PAI, metodami standardowymi przy użyciu glikolu polietylenowego (J. H. Peters, H. Baumgarten, H. Schulze Monoklonale Antikroper Springer Verlag, Heidelberg).

Produkty fuzji wysiewano na płytki o 96 dołkach. Po 8 dniach hodowle komórkowe badano na obecność przeciwciał monoklonalnych swoistych dla B. burgdorferi metodą ELIS A na fazie stałej (J. H. Peters i in., j.w.).

Komórki hybrydoma z hodowli produkujących przeciwciała klonowano metodą granicznych rozcieńczeń. Charakterystykę komórek potomnych poszczególnych klonów określano ponownie testem ELISA na fazie stałej a także analizą Westem-Blot i badaniem lmmunofluorescencyjnym. Przeciwciało monoklonalne LA-2 podklasy IgG2b było produkowane i wydzielane przez jedną monoklonalną linię hybrydoma i reagowało w Western-Biot ze strukturą 31kDa (OspA) wszystkich badanych szczepów B. burgdorferi (m. in. z izolatem ZS7 i B31) przy kontakcie z białkami B. burgdorferi rozdzielonymi elektroforetycznie na żelu z SDS i przeniesionymi na błonę przy pomocy Western-lot. Przeciwciała monoklonalne LA-26.1C (anti OspA IgG1), LA-25.1 (anti OspB (antygen 34 kDa) IgG2b) i LA-27.1 (anti OspB (34 kDa antygen) IgG1) otrzymywano i charakteryzowano w sposób analogiczny.

Zakażenie myszy B. burgdorferi ZS7.

Myszy C.B-17 Scid zakażono dawką 1x10⁸ żywych komórekB. burgdorferi ZS7 podskórnie w okolicy nasady ogona.

Traktowanie myszy antysurowicami.

Zakażone myszy Scid otrzymywały dwa razy w tygodniu różne antysurowice. Jednej grupie podawano NMS (normalna surowica mysia), drugiej IMS (surowica mysia odpornościowa), trzeciej przeciwciało monoklonalne LA-2 (przeciw antygenowi 31 kD B. burgdorferi). Dawki podawanych antysurowic wynosiły w pierwszym tygodniu 100 ąl względnie 100 ąg dla LA-2, w drugim tygodniu 200 ąl względnie 200 ąg dla LA-2, w trzecim tygodniu 300 μΐ względnie 300 ąg dla LA-2.

Jak widać w tabeli 2 myszy Scid niczym nie traktowane Iub te, którym podano NMS po 12 dniach wykazały kliniczne i histopatologiczne objawy zapalenia stawów względnie stanu zapalnego serca i zapalenia wątroby. Natomiast po podaniu myszom Scid przeciwciała monoklonalnego LA-2 objawy były wyraźnie słabsze. Klinicznie obserwowano tylko lekkie zaczerwienienia stawów, zaś histopatologicznie tylko nieznaczne zmiany. Myszy traktowane IMS nie wykazały klinicznych znamion zapalenia stawów.

Zarazki B. burgdorferi stwierdzono w hodowli in vitro tylko u myszy niczym nie traktowanych Iub tych, które otrzymały NMS. U myszy, którym podano LA-2 Iub IMS B. burgdorferi nie stwierdzono (tabela 2).

170 ))9

Tabela )

Podawanie B burgdorferi oraz antysurowicy myszom C.B-17 Scid

Szczep myszy C B-17 Scid	Podanie antysurowicy	Zapalenie stawów (po 12 dniach) kliniczne histopat.	Zapalenie serca/zapalenie wątroby histopat.	Izolacja B burgdorferi
		kliniczne	histopatolog
n =3	-	+	+	+	+
n =3	NMS	+	+	+	+
n =2	IMS	-	-	-	-
n =3	LA-2	_*	.**	-	-

* lekkie zaczerwienienie stawów ** tylko nieznaczne zmiany

Przykład III. Klonowanie przez ekspresję antygenu 31kD (OspA) B. burgdorferi.

Przygotowanie DNA.

Wysokocząsteczkowy DNA oczyszczano z hodowli szczepu ZS7 B. burgdorferi w zmodyfikowanym podłożu Kelly. Krętki pelletowano przez wirowanie przy 10 000 g i przemywano trzykrotnie buforem PBS. Wysuszony pellet krętków zawieszano w 10 ml TE (10 mmol/l Tris, 1 mmol/1 EDTA, pH 7,4), traktowano lizozymem (5 mg/ml) przez 15 minut w 30°C i DNA uwalniano przez dodanie 1 ml 20% SDS. Po dodaniu 1,5 ml NaCl (5 mol/l) roztwór ekstrahowano równą objętością fenolu, a następnie chloroformem. DNA wytrząsano przez dodanie 2 objętości etanolu absolutnego i inkubację w -20°C przez noc. Po odwirowaniu osad rozpuszczono w 0,5 ml TE i inkubowano z RNAzą A wolną od DNA-azy (20 pl/ml) przez 45 minut w 55°C, następnie trawiono przez godzinę proteazą K (0,1 pg/ml) w 37°C. Do roztworu dodawano 0,3 mol/l NaOAc i ponownie ekstrahowano fenolem-chloroformem jak wyżej. Po wytrąceniu etanolem DNA rozpuszczano w TE.

Wytworzenie puli genów.

Wysokocząsteczkowy DNA został losowo rozerwany przez działanie ultradźwięków przez trzy sekundy. Zastosowano polimerazę TA-DNA (30 minut w 37°C) i enzym Klenowa (5 minut w )0°C) celem wyrównania końców otrzymanych fragmentów DNA. DNA o tępych końcach ligowano z wektorem ekspresji pUEXl w pozycji BamHI według strategii klonowania dopełniającego (Bresan i Stanley 1987, Nuc1. Acid. Res., str. 1056). Po selekcji według wielkości przy pomocy chromatografii na sicie molekularnym Sephacryl S-1000i transformacji kompetentnych komórek E. coli (MC 1061) udział powstałych w wyniku rekombinacji jednostek tworzących łysinki (pfu) oznaczono następująco: losowo wybrane kolonie przeniesiono do podłoża selekcyjnego () ml) (LB z 25 pg/ml ampicyliny) i hodowano do nasycenia. DNA plazmidowy izolowano zwykłą metodą lizy zasadowej i cięto przy pomocy BamHI. Ponad 50% analizowanych plazmidów zawierało inserty DNA średniej długości > 1,5 kb.

Wysiew na płytki i screening puli genów B. burgdorferi ZS7.

Na płytki 24 x 24 cm wysiewano komórki o gęstości 7 000 pfu na płytkę i inkubowano przez noc w 30°C. Kolonie przenoszono na filtr nitrocelulozowy (NC) i przez dwugodzinną inkubację w 42°C indukowano ekspresję białka sprzężonego z beta-gaaaktozydazą w wyniku fuzji. Filtry umieszczano na bibule Whatman 3MM, uprzednio nasączonej 5% SDS, i inkubowano około 25 minut w 95°C. Następnie białka rozdzielano elektrycznie przy użyciu zwykłej aparatury do Westernblotting. Po obróbce filtra NC DNA-azą klonu immunoreaktywne identyfikowano przy pomocy przeciwciał monoklonalnych przez screening produktów ekspresji. Miejsca nieswoistego wiązania na filtrach NC eliminowano przez czterogodzinną inkubację w temperaturze pokojowej w PBS zawierającym 0,2% (w/v) żelatyny i 3 mmol/l NaN3. Na koniec filtry z pozostałymi na nich hodowlami klonu LA-2 produkującego przeciwciało monoklonalne anty-31 kD inkubowano przez 18 godzin stale wstrząsając. Po dokładnym przemyciu (PBS + 1% v/v Tnton Χ-100, PBS + 0,5 mol/l NaCl, PBS + 1 mol/l NaCl, każdy etap 10 minut) filtry

170 229 inkubowano 1,5 godziny w temperaturze pokojowej stale wstrząsając, z 1:10 000 znakowanym peroksydazą preparatem F(ab)2 z króliczych przeciwciał przeciw mysiej IgG. Filtry ponownie przemywano jak wyżej i inkubowano z dwuaminobenzydyną jako substratem peroksydrn zy. Na 10⁴ rekombinantów PFU 20 klonów reagowało z przeciwciałem monoklonalnym LA-2.

Analiza sekwencji antygenu 31 kD (OspA).

Insert DNA klonu rekombinanta E. coli wykazującego dodatnią reakcję przeciwciała z LA-2 izolowano w zwykły sposób. Insert tego klonu zawierał całą długość genu ospA kodującego antygen 31 kD B. burgdorferi. Plazmid zawierający ten insert został oznaczony pZS-7/31-2 i zgodnie z konwencją budapeszteńską zdeponowany w DSM (pod numerem DSM 5528).

Rekombinowane białko produkowane przez ten immunododatni klon oznaczono rZS7/31-2. Oznaczono kodującą sekwencję DNA genu ospA. Jest ona przedstawiona na fig. 1.1-1.5 wraz z odpowiadającą jej sekwencją aminokwasów białka OspA.

Jak widać na fig. 1.1-1.5, antygen 31 kDB. burgdorferi odpowiada białku zawierającemu 273 aminokwasy.

Wytwarzanie białka niesprzężonego w wyniku fuzji.

a) Klon wytwarzający immunoreaktywne białko rZS7/31-2 hodowano przez noc w 30°C w 10 ml LB z ampicyliną. 1 ml hodowli przeniesiono do 100 ml podłoża selekcyjnego i hodowano w 30°C przy dobrym napowietrzeniu do gęstości 8x10⁷ komórek na ml (A600=0,2). Ekspresję rekombinowanego białka osiągnięto przenosząc komórki gospodarza do 42°C. Po ochłodzeniu i odwirowaniu komórki przemyto buforem STE (10 mmol/l Tris, 100 mmol/l NaCl, 1 mmol/l EDTA pH 8,0) i osad zawieszono w 0,6 ml buforu litycznego (25% sacharoza, 50 mmol/l Tris pH 8,0). Po dodaniu 150 pl lizozymu (10 mg/ml) mieszaninę inkubowano 15 minut na lodzie, po czym przez następne 15 minut na lodzie po dodaniu 18 plDNA-azy 1 (10 mg/ml) w obecności 5 pl 1 mol/l chlorku magnezu. Następnie dodano 250 pl mieszanki detergentowej 4x (1% Triton X 100, 0,5% dezoksycholanu, 0,1 mol/l NaCl, 10 mmol/l Tris, pH 7,4) i inkubowano 5 minut na lodzie. Po odwirowaniu osad przemyto dwukrotnie buforem A (50 mmol/l Tris, 50 mmol/l NaCl, 1 mmol/l EDTA, pH 8,0), zawieszono w 9 objętościach buforu A z dodatkiem 8 M mocznika i inkubowano przez godzinę w temperaturze pokojowej. Próbę rozcieńczono 9 częściami buforu B (50 mmol/l KH2HPO4/K2HPO4, 50 mol/l NaCl, 1 mmol/l EDTA, pH 10,7) i mieszano przez 30 minut w temperaturze pokojowej utrzymując pH 10,7 przez dodawanie KOH. Następnie pH roztworu obniżono do 7,0 dodając HCl. Próbę dializowano przez noc w 4°C wobec buforu A i wirowano 10 minut w 4°C przy 10 000 obr/min. w roztworze SS34. Nadsącz, zawierający rekombinowane białko, przechowywano 2 -20°C.

b) Ponieważ klon wydziela immunoreaktywne białko rZS7/31-2 do podłoża hodowlanego, możliwe jest oczyszczenie go bezpośrednio z podłoża (chromatografia powinowactwa).

Preparacja rekombinowanego białka OspA (niesprzężonego) i oczyszczanie chromatografią powinowactwa.

Rekombinowane białka na koniec oczyszczano chromatografią powinowactwa. W tym celu oczyszczone przeciwciała monoklonalne LA-2 zostały związane kowalencyjnie na aktywowanej Sepharozie CL 4B. Dializowany wyciąg mocznikowy z rekombinowanym białkiem adsorbowano na Sepharozie CL 4B sprzężonej z mysią IgG i nakładano na kolumnę LA-2 - Sepharoza CL 4B. Po intensywnym płukaniu związane białko eluowano 0,1 mol/l glicyną - 0,1 mol/l NaCl, pH 2,5. Wartość pH zebranych frakcji zobojętniano przez natychmiastowe dodanie 1/10 objętości 0,5 mol/l K2HPO4. Frakcje zawierające białko zatężano i dializowano. Stopień oczyszczenia oznaczano elektroforezą w żelu poliakryloamidowwm z SDS.

Charakterystyka immunologiczna rekombinowanego białka rZS7/31-2.

Białko rZS7/31 -2 zbadano immunologicznie. Dla porównania włączono do badań rekombinowane białko rB31/41-9 (antygen powierzchniowy 41 kD B. burgdorferi).

Płytki mikrotitracyjne z dołkami o płaskim dnie powlekano wyciągami mocznikowymi rekombinowanych białek rZS7/31-2 lub rB31-41-9, względnie wyciągiem mocznikowym szczepu MC 1061 E. coli, użytym do ekspresji genów. Nieswoiste miejsca wiązania blokowano 0,2% żelatyną w buforowanym fosforanami roztworze soli. Dołki tak przygotowanych płytek mikro10

170 229 titracyjnych wypełniono podanymi przeciwciałami monoklonalnymi LA-2 (anti-31 kD, Osp-A), LA-1 (anti-41 kD, flagellina), oraz ACHT-2 (anti-alfa-antychymotrypsyna).

Związane przeciwciała monoklonainr reagowały z gatunkowo swoistymi immunoglobulinami anti-mysim.i znakowanymi peroksydazą. Związane przeciwciała znakowne peroksydazą oznaczono ilościowo stosując substrat peroksydazy ortofenylodiaminę. Absorpcję przy 492 nm (A492) mierzono bezpośrednio na płytkach przy pomocy automatycznego czytnika. Natężenie absorpcji jest miarą ilości związanych przeciwciał monoklonalnych.

Przeciwciało monoklonalne LA-2 reaguje swoiście z rZS7/31-2, nie reaguje natomiast z MC 1061 względnie rB31/41-9. Reakcja kontrolna przeciwciała monoklonalnego LA-1 jest swoista dla rB31/41-9. Kontrolne przeciwciało monoklonalne ACHT-2 (kontrolna ujemna) nie wykazuje reakcji z żadnym z tych białek.

Jak widać na fig. 2, epitop antygenowy rozpoznawany swoiście przez przeciwciało monoklonalne LA-2 wchodzi w skład, białka rekombinanta rZS7/31-2 sklonowanego z genomu B. burgdorferi ZS7.

Przykład IV. Porównanie przeciwciał swoistych dla antygenu 31 kD (OspA) względem antygenu 34 kD (OspB) z przeciwciałami swoistymi dla antygenu 41 kD (flagellina).

Przeciwciała monoklonalne LA-2 i LA-26.1 rozpoznają antygen 31 kD OspA i należą do izotypu (podklasy) IgG2b Iub IgG1. Przeciwciała monoklonalne LA-25.1 i LA-27 1 rozpoznają antygen 34 kD OspB i należą do izotypu (podklasy) IgG2b Iub IgG1. Przeciwciała monoklonalne LA-10 1 LA-21 są swoiste dla związanego z rzęskami białka periplazmatycznego 41 kD B burgdorferi i należą do izotypu IgG2a Iub IgG 1. Wszystkie wymienione przeciwciała otrzymano w sposób opisany w przykładzie II. W obecnym doświadczeniu chodziło o ustalenie, czy również przeciwciała monoklonalne przeciw innemu antygenowi B. burgdorferi powodują ochronę myszy Scid przeciw objawom boreliozy Lyme.

Poliklonalną surowicę odpornościowa! anti B31 pobierano od myszy C57BL/6 91 dni po podskórnym podaniu im dawki 1x10⁸ komórek B31 B. burgdorferi. Poliklonalną IMS anti ZS7 pobierano od myszy C57BL/6 68 dni po podskórnym podaniu im dawki 1x108 komórek B burgdorferi ZS7. Obie surowice zawierały 60 ąg/ml swoistych przeciwciał, co stwierdzono metodą ELISA (Schaible i in., J. Exp. Med. 170 (1989), 1427-1432). Normalną surowicę mysią (NMS) pobierano od myszy C57BL niczym nie traktowanych.

W dniu inokulacji myszy B. burgdorferi i później w odstępach co 4 dni myszy Scid otrzymywały dootrzewnowo podane wyżej przeciwciała IMS, NMS Iub PBS według następującego schematu:

Dzień 0 i dzień 3: 100 μΐ

Dzień 7 i dzień 10: 200 μl

Dzień 13 i dzień 17: 300 μl

Myszy Scid, które otrzymały ant.i-ZS7 IMS, anti-B 31 IMS Iub przeciwciało monoklonalne LA-2 nie wykazały widocznych klinicznych objawów zapalenia stawów, to znaczy nie wystąpiło zaczerwienienie i obrzęk stawów goleniowo-stępowych w ciągu 21 obserwacji. Również nie stwierdzono objawów stanu zapalnego serca i zapalenia wątroby. Badania histopatologiczne nie wykazały zmian w stawach, sercu i wątrobie myszy Scid, którym podano anti-ZS7 IMS, anti-B31 IMS Iub przeciwciało monoklonalne LA-2.

Również inne przeciwciało monoklonalne swoiste dla OspA, LA-26.1 izotypu IgG1, a także swoiste dla OspB przeciwciała LA-25.1 i LA-27.1 powodowały złagodzenie objawów zapalenia stawów, stanu zapalnego serca i zapalenia wątroby. Wystąpiły tu lekkie zmiany patologiczne w badanych narządach.

W przeciwieństwie do tego, myszy Scid, którym podano bufor PBS, NMS Iub przeciwciała monoklonalne przeciw flagellinie (LA-10 Iub LA-21) wykazały kliniczne znamiona zapalenia stawów i zmiany patologiczne typowe dla myszy Scid niczym nie traktowanych (tabela 3) U tych ostatnich zwierząt objawy nasilały się z upływem czasu po inokulacji zarazka i nie uległy złagodzeniu do końca okresu obserwacji. U myszy Scid uprzednio traktowanych anti-ZS7 IMS Iub przeciwciałem LA-2 nie udało się izolować krętków. Natomiast wykryto krętki immuno170 229 fluorescencyjnie lub izolacją z krwi u myszy Scid traktowanych buforem PBS, NMS lub przeciwciałami monoklonalnymi LA-25.1, LA-26.1, LA-27.1, LA-10 i LA-21.

Tabela 3

Szczep C.B-17 Scid (liczba myszy)	Podano	Podklasa IgG	Kliniczne zapalenie stawów	Histopatologia	Wykrywalność B burgdorferi (hodowla i lmmunofluor)
				Zapalenie okołostawowe stawów	Zapalenie serca
n = 8	PBS (kontrola ujemna)		+	+	+	+
n = 3	NMS (kontrola ujemna)		+	+	+	+
n = 3	anti--331 IMS		-	-	-*	+°
n= 2	anti-ZS7 IMS		-	-	.*
n = 6	LA-2 (OspA)	2b	-	.*
n = 3	LA-10 (flagellina)	2a	+	+	+	+°
n = 3	LA-21 (flagellina)	1	+	+	+/-	+
n = 3	LA-26 1 (OspA)	1	+	±	+	+°
n = 3	LA-25.1 (OspB)	2b	+	±	±	+
n = 3	LA-27.1 (OspB)	1	+	+	±	+°

Stopień zmian histopatologicznych oznaczono - brak, * subklmiczne, +/- umiarkowane, + ciężkie “Badanie immunofluorescencyjne było możliwe nie u wszystkich osobników

Przykład V. Wpływ surowicy odpornościowej myszy uodpornionych OspA ma przebieg boreliozy Lyme u myszy Scid.

W tym doświadczeniu można było wykazać, ze podanie natywnego OspA (izolowanego z B. burgdorferi ZS7) lub rekombinowanego OspA (izolowanego z E. coli bakterii transformowanych rekombinantowyrn plazmidem pZS-2/31-2 (DSM 5528) indukuje u normalnych myszy C57BL/6 wytwarzanie ochronnych przeciwciał poliklonalnych. Po podaniu tych przeciwciał występuje u myszy Scid przeciw boreliozie Lyme. Stwierdzono przy tym, że rekombinowany OspA wywołuje ochronną odpowiedź immunologiczną porównywalną z odpowiedzią na natywny OspA. Wyniki i szczegółowy przebieg doświadczenia podano w tabeli 4.

Otrzymywanie rekombinanta OspA opisano w przykładzie III.

Otrzymywanie OspA oraz uodpornienie myszy OspA przebiegało jak niżej:

Krętki w ilości 3,2x10¹⁰ mieszano przez dwie godziny na mieszadle magnetycznym w 5 ml PBS/7,5 ml n-butanolu, w obecności inhibitorów proteaz (5 mmol/l EDTA, 5 mmol/l benzamidyny i 0,5 mmol/l PMSF). Następnie mieszaninę wirowano przez 90 minut w 4 °C przy 10 000 obr./min. w wirówce Sorvall (rotor kątowy). Fazę wodną, zawierającą białka powierzchniowe, zbierano i przemywano trzykrotnie chloroformem. Zawartość białka oznaczano mierząc ekstynkcję przy 280 nm, lub testem BCA.

W żelu srebrowym lub metodą Westernblot z surowicą króliczą anti B. burgdorferi stwierdzono dla szczepu ZS7 główny prążek w zakresie ciężaru cząsteczkowego 31 kDa, oraz słabe prążki w zakresie 20, 34 i 65-68 kDa. Preparat butanolow-O-wodny szczepu B31 B. burgdorferi wykazał główny prążek przy 31 kDa oraz słabe prążki przy 20 i 34 kDa.

Uodpornienie myszy natywnym i rekombinowanym OspA.

Myszom C57BL/6 lub C.B-17 wstrzykiwano podskórnie w okolicy nasady ogona 3x w odstępach 7 do 10 dni 5 pg (natywny OspA szczepu B31) lub 10 pg (natywny OspA szczepu ZS7, rekombinowany OspA ZS7) w 100 pl adjuwantu (ABM3, Fa, Sebak, Aidenbach, RfN).

170 229

Począwszy od 3 tygodni po ostatniej dawce surowice można było pobierać przez 3 do 4 miesięcy Zawartość swoistych przeciwciał oznaczano metodą ELISA.

Tabela 4

Wpływ monoklonalnych i poliklonalnych przeciwciał swoistych dla B burgdorferi na wykrywalność krętków i rozwój zapalenia stawów u myszy Scid zakażonych B burgdorferi

Szczep C B-17 liczba myszy	Podano	Rozwój zapalenia stawów Tygodnie	Wykrywal- ność B burgdorferi
1	2	3
n = 6	PBS (kontrola ujemna)	+	+	+	6/6
n = 6	LA-2	-	-	-	0/3
n = 2	anti OspA IMS (natywny)	-	-	-	0/2
n = 3	anti OspA IMS (rekomb)	-	-	-	0/3

Pierwsza dawka przeciwciał dootrzewnowo (100 pl) w dniu 0 (dzień zakażenia B. burgdorferi ZS7 1x 10⁸ komórek podskórnie u nasady ogona). Następne dawki przeciwciał dzień 4(100pl,dzień7 (200 pl), dzień 11 (200 pl), dzień 14 (300 pl), dzień 18 (300 pl) dootrzewnowo.

170 229 cttgagctfaaaggaacttctgataaaaacaafggatctggagtacttgaaggcgtaaaa L E L K G T S D K N N G S G V LE G V K gdgacaaaagtaaagtaaaattaacaaftfdgacgatdaggdaaaccacacttgaa A D K S K V K L T 1 S D D L G Q T T L E gttttcaaagaagacggraaaacactagtatcaaaaaaagtaacttccaaagacaagtca

V F K E D G K T L V S K K V T S K D K S

FIG. 1(2) fcaacagaagaaaaattcaatgaaaaaggłgaagtaktgaaaaaataałaacaagagca STE EKFNEKGEVSEKIITRA gacggaaccagadtgaatacacagaaattaaaagcgafggatdggaaaagctaaagag

DGTRLEYTEIKSDGSGKAKE gttftaaaaagcfatgttdtgaaggaaddaadgctgaaaaaacaacadggtggtt

V L K S Y V L E G TITAEKT T L V V

FIG. 1 (3)

170 229 aaagaaggaactgttacttt-aagcooaaatattl-caaaatctggggaagtttcagttgaa

K E G Τ V T L S K N 1SKS GE V S V E cttaatgacactgacagfagtgcfgdactaaaaaaactgcagcttggaattcaggcact LNDTDSSAATK KTAAWNSGT fcaadttaacaattadgtaaacagtaaaaaaadaaagacdtgtgtttacaaaagaa S T L Τ I Τ V N S K K Τ K D L V F Τ K E

FIG. 1(4 aacacaadacagtacaacaatacgadcaaatggcaccaaadagaggggfcagcagd N Τ I Τ V 0 Q Y DS N G Τ K L E G S A V gaaattacaaaactfgatgaaattaaaaacgctttaaaataa E ITKLDEIKNALK*

FIG. 1(5)

170 229

Charakterystyka immunologiczna rekombinowanego białka rZS7/ 31- 2

Białka powierzchniowe

492

Przeciwciała monoklonalne

FIG. 2

170 229

Sekwencja DNA i odpowiadająca jej sekwencja aminokwasów antygenu 31 kDa (OspA) B. burgdorferi ZS7.

o

LJ cn

O

a c

o o

o cn c

cn

			3	ÓZ
	cn	>	3 o 3	a
	o		cn
	O		3
	O	Λ	-t—	>
o	cn		cn
ej	ΣΖ	g	t—
YZ	O O cn	LU	3 3 cn	<
CD	cn	CD
	cn		3
<	o	CL	_3	_1
	cn
		_1	~3	a
	-i—		cn
_1	a	a
	cn	_3	>-
<	_c	>	cn
_1	cn 3 o	cz>	3 3 t_J	hZ
			cn	CD
—	-4—	->	cn
	cn		LJ
		(Z)	3	a
_1	cn	cn
	ϋ		3
CD	O		3	YZ
O	2:	3
	O		o
	3		3	z
	3	hZ	3
CD	3 cn		3 3	ÓZ
_1	3 cn	LU	3 3
	uj	a	3	1 1 1
_1	3	cn
	cn		3
>-	tj	_j	3 3	2Z
	o
ÓZ	cn	(Z)	cn	CZ)
	3	3
YZ	O cn	CZ)	_3	>
	O	cn
Σ	cn	>	0	_1

Departament Wydawnictw UP RP Nakład 90 egz. Cena 4,00 zł

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób wytwarzania antygenów, które dają reakcję immunologiczną z przeciwciałem przeciw OspA, znamienny tym, że pule genów B. burgdorferi przeszukuje się za pomocą jednego lub więcej przeciwciał monoklonalnych swoistych dla antygenu 31 kD (OspA) Borrellia burgdorferi i izoluje się klony, które z przeciwciałem lub przeciwciałami dają dodatnią reakcję immunologiczną i eksprymuje się DNA kodujący te antygeny wyizolowany z dodatnich klonów.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że kodująca antygen sekwencja DNA znajduje się w wektorze, zwłaszcza w wektorze prokariotycznym, odpowiednim dla ekspresji białka.

3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że antygen zawiera następującą sekwencję aminokwasów lub immunogenny epitop tej sekwencji:

M K K Y L L G I G L I L A L I A C K Q N V S S L D E K N S V S V D L P G E M N V L V S K E K N K D G K Y D L I A T V D K L E L K G T S D K N N G S G V L E G V K A D K S K V K L T I S D D L G Q T T L E V F K E D G K T L V S K K V T S K D K S S T E E K F N E K G E V S E K I I T R A D G T R L E Y T E I K S D G S G K A K E V L K S Y V L E G T L T A E K T T L V V K E G T V T L S K N I S K S G E V S V E L N D T D S S A A T K K T A A W N S G T S T L T I T V N S K K T K D L V F T K E N T I T V Q Q Y D S N G T K L E G S A V E I T K L D E I K N A L K *

4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że antygen jest białkiem sprzężonym z beta-gal<dktozydazą lub jest białkiem niesprzężonym.
5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że do przeszukiwania stosuje się przeciwciało monoklonalne swoiste dla antygenu 31 kD szczepów ZS7 (DSM 5527) i/lub B31 (ATCC 35201) B. burgdorferi.
6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że do przeszukiwania stosuje się przeciwciało monoklonalne klasy IgG, a zwłaszcza podklasy IgG1.
7. Sposób wytwarzania antygenów, które dają reakcję immunologiczną z przeciwciałem przeciw OspB, znamienny tym, że pule genów B. burgdorferi przeszukuje się za pomocą jednego lub więcej przeciwciał monoklonalnych swoistych dla antygenu 34 kD (OspB) Borrellia burgdorferi i izoluje się klony, które z przeciwciałem lub przeciwciałami dają dodatnią reakcję immunologiczną i eksprymuje się DNA kodujący te antygeny wyizolowany z dodatnich klonów.

170 229
8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że kodująca antygen sekwencja DNA znajduje się w wektorze, zwłaszcza w wektorze prokariotycznym, odpowiednim dla ekspresji białka.
9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że jako wektor prokariotyczny stosuje się plazmid.
10. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, żejako wektor stosuje się pZS-7/31 -2 (DSM 5528).
11. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że antygen jest białkiem sprzężonym z beta-galaktozydazą lub jest białkiem niesprzężonym.
12. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że do przeszukiwania stosuje się przeciwciało monoklonalne swoiste dla antygenu 34 kD szczepów ZS7 (DSM 5527) i/lub B31 (ATCC 35201) B. burgdorferi.
13. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, ze do przeszukiwania stosuje się przeciwciało monoklonalne klasy IgG, a zwłaszcza podklasy lgG2b lub IgG1.