HU211228A9 - Vaccine against lyme disease - Google Patents
Vaccine against lyme disease Download PDFInfo
- Publication number
- HU211228A9 HU211228A9 HU95P/P00108P HU9500108P HU211228A9 HU 211228 A9 HU211228 A9 HU 211228A9 HU 9500108 P HU9500108 P HU 9500108P HU 211228 A9 HU211228 A9 HU 211228A9
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- burgdorferi
- antigen
- ospa
- antibody
- mice
- Prior art date
Links
- 208000016604 Lyme disease Diseases 0.000 title claims description 25
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims description 21
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 claims description 58
- 241000589969 Borreliella burgdorferi Species 0.000 claims description 52
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 47
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 47
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 47
- 108700006640 OspA Proteins 0.000 claims description 41
- 241000448699 Borrelia burgdorferi ZS7 Species 0.000 claims description 23
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 23
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 claims description 19
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims description 18
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 16
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 16
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 13
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 12
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 11
- 206010062746 Carditis Diseases 0.000 claims description 10
- 244000052769 pathogen Species 0.000 claims description 10
- 208000009525 Myocarditis Diseases 0.000 claims description 9
- 238000010171 animal model Methods 0.000 claims description 9
- 208000021646 inflammation of heart layer Diseases 0.000 claims description 9
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 8
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 8
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 8
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 claims description 8
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 claims description 8
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 8
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 claims description 8
- 238000011161 development Methods 0.000 claims description 7
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 claims description 7
- 238000002649 immunization Methods 0.000 claims description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 7
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 7
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims description 6
- 241000276440 Borrelia burgdorferi B31 Species 0.000 claims description 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 5
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 claims description 4
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims description 4
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 4
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 4
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 claims description 3
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 3
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 3
- 241001529936 Murinae Species 0.000 claims description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 claims description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 2
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 claims 4
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 claims 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 17
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 17
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 16
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 16
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 12
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 12
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 12
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 12
- 210000001503 joint Anatomy 0.000 description 12
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 11
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 8
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 241001180364 Spirochaetes Species 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- 108010040721 Flagellin Proteins 0.000 description 6
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 5
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 5
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 4
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 4
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 4
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 4
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 4
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 4
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 4
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 3
- 238000002738 Giemsa staining Methods 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000011579 SCID mouse model Methods 0.000 description 3
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 3
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 3
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 3
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 3
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 3
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 3
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 3
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 3
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 210000004165 myocardium Anatomy 0.000 description 3
- 229940099789 ospa protein Drugs 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 3
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 3
- 241000238876 Acari Species 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000589968 Borrelia Species 0.000 description 2
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 2
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 2
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- WHLPIOPUASGRQN-UHFFFAOYSA-N butyl 2-methylprop-2-enoate;methyl 2-methylprop-2-enoate Chemical compound COC(=O)C(C)=C.CCCCOC(=O)C(C)=C WHLPIOPUASGRQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 238000005534 hematocrit Methods 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 2
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 2
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 2
- 210000003516 pericardium Anatomy 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001552669 Adonis annua Species 0.000 description 1
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 235000008730 Ficus carica Nutrition 0.000 description 1
- 244000025361 Ficus carica Species 0.000 description 1
- GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N Fluorouracil Chemical compound FC1=CNC(=O)NC1=O GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 241000238681 Ixodes Species 0.000 description 1
- 241001480843 Ixodes ricinus Species 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-M Methacrylate Chemical compound CC(=C)C([O-])=O CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 108020002230 Pancreatic Ribonuclease Proteins 0.000 description 1
- 102000005891 Pancreatic ribonuclease Human genes 0.000 description 1
- 206010034464 Periarthritis Diseases 0.000 description 1
- 108010090127 Periplasmic Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 206010036030 Polyarthritis Diseases 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 241000831652 Salinivibrio sharmensis Species 0.000 description 1
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 1
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000589973 Spirochaeta Species 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N [4-(4-hydrazinylphenyl)phenyl]hydrazine Chemical compound C1=CC(NN)=CC=C1C1=CC=C(NN)C=C1 SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 229940019748 antifibrinolytic proteinase inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 230000002917 arthritic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- PXXJHWLDUBFPOL-UHFFFAOYSA-N benzamidine Chemical compound NC(=N)C1=CC=CC=C1 PXXJHWLDUBFPOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 238000009640 blood culture Methods 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N chloroform;phenol Chemical compound ClC(Cl)Cl.OC1=CC=CC=C1 YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003541 chymotrypsin inhibitor Substances 0.000 description 1
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000012050 conventional carrier Substances 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 229940009976 deoxycholate Drugs 0.000 description 1
- KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N deoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 210000001174 endocardium Anatomy 0.000 description 1
- 230000003628 erosive effect Effects 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000001400 expression cloning Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002949 fluorouracil Drugs 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000033687 granuloma formation Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000000521 hyperimmunizing effect Effects 0.000 description 1
- 206010020718 hyperplasia Diseases 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 description 1
- 210000002346 musculoskeletal system Anatomy 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 201000008482 osteoarthritis Diseases 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 210000001428 peripheral nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 208000030428 polyarticular arthritis Diseases 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 210000003240 portal vein Anatomy 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 210000001957 retinal vein Anatomy 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 238000012882 sequential analysis Methods 0.000 description 1
- 238000009589 serological test Methods 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 210000003699 striated muscle Anatomy 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 210000002437 synoviocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 238000009281 ultraviolet germicidal irradiation Methods 0.000 description 1
- 210000005166 vasculature Anatomy 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/20—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Spirochaetales (O), e.g. Treponema, Leptospira
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
- C07K16/1203—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria
- C07K16/1207—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria from Spirochaetales (O), e.g. Treponema, Leptospira
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
A Lyme-borreliózis a leggyakoribb, kullancsok által terjesztett mérsékelt égövi fertőző betegség. Ezt a Spirochaeták családjához tartozó Borrelia burgdorferi okozza, és főleg az Ixodes törzshöz tartozó kullancs viszi át az emberre. A betegség egy krónikus, progresszív fertőző megbetegedés, amely több szervet támad meg, így a bőrt, a központi és perifériás idegrendszert, a szívet, a májat, a vesét és az izom-csont rendszert. Mivel a betegség megbízható kezelése antibiotikum terápiával nehézkes, jelenleg nagy erőfeszítéssel kutatják magát a kórokozót és az immunválaszt, amelyet a gazdaszervezet ad a B. burgdorferi fertőzésre. Megállapították, hogy bár a Lyme-kórban szenvedő egyénekben a B. burgdorferi elleni antitestek titere magas, ez azonban semmilyen védelmet nem nyújt a fertőzéssel szemben. Feltehető, hogy a kórokozó a vérpályából igen gyorsan átlép a szövetekbe, ahol az immunrendszer számára már többé közvetlenül nem érhető el. Ez azt jelenti, hogy az antitestek nyújtotta védelem csak közvetlenül a fertőzés kezdete után, azaz addig, amíg a kórokozó az érpályában tartózkodik, hatásos.
Az a tény, hogy a B. burgdorferi-vei való természetes fertőzöttség különböző állatfajtákban megtalálható, olyan próbálkozáshoz vezetett, hogy laboratóriumi modelleket dolgozzanak ki a Lyme-kór részére. Ezek azonban csak korlátozott eredménnyel jártak. Olyan kísérletekben, amelyeknek az volt a céljuk, hogy egérben a B. burgdorferi-re specifikus immunválaszt váltsanak ki, azt találták, hogy beltenyésztett egér törzsekben egy már hosszú ideje tenyésztett izolált B. burgdorferi-vel való fertőzés enyhe, de szignifikáns olyan patomorfológiai elváltozásokhoz vezet a különböző szervekben, így az agyban, szívben, tüdőben és a vesékben, amelyekhez hasonlókat a Lyme-kóros betegekben lehetett megfigyelni [Schaible és munkatársai, Infect. Immun., 7., 41. (1988)]. A komolyabb kórkép kialakulását az állatoknál valószínűleg vagy a gazdaszervezet védekező immunrendszere akadályozta meg, vagy az, hogy a hosszabb ideig in vitro tenyésztett spirochaeták virulenciája lecsökkent [Johnson és munkatársai, J. Clin. Microbiol 20., 747. (1984); Schwan és munkatársai, Infect. Immun., 56., 1837. (1988)].
A találmány alapjául szolgáló feladat egy Lyme-kór elleni hatékony oltóanyag előállítása. Ehhez mindenekelőtt alkalmas laboratóriumi állat-modell kifejlesztésére van szükség. Ezért javasoljuk egy funkcióképes T és B sejt hiányos egér törzs, az úgynevezett Scid-egér [Bosma és munkatársai, Natúré, 70., 52. (1983)] kísérleti állatként való alkalmazását, ugyanis izolált patogén B. burgdorferi törzzsel fertőzött Scid-egereknél sokszisztémás betegség alakul ki, mégpedig főként polyarthritis és carditis. Ezzel az állatmodellel vált először lehetővé a Lyme-kór elleni oltóanyagok hatásának a kipróbálása.
A találmány tárgyát egy olyan Lyme-kór elleni passzív oltóanyag képezi, amely egy vagy több, a B.
burgdorferi 31 kD antigénjére (OspA) vagy/és 34 kD antigénjére (OspB), különösen a B. burgdorferi B31 (ATCC 35 210) vagy/és ZS7 (DSM 5527) törzsének
OspA vagy/és OspB antigénjére specifikus monoklonális antigént tartalmaz. Egy olyan oltóanyag az előnyös, amely egy IgG osztályba tartozó, találmány szerinti antitestet, különösen az IgG2b vagy IgGl alosztálybeli antitestet tartalmaz. Élő patogén B. burgdorferi sejtekkel, előnyösen B. burgdorferi ZS7 sejtekkel megfertőzött kísérleti állatoknál, előnyösen Scid-egereknél a találmány szerinti antitest adása - ellentétben egy más antitest adásával, például a B. burgdorferi 41 kD antigénje (flagellin) elleni antitest adásával - az arthritis, carditis és hepatitis kifejlődését meglepő módon teljesen vagy legalábbis nagymértékben gátolja.
A találmány szerinti oltóanyag adott esetben a hatóanyag antitest mellett még a szokásos vivő- töltő- és segédanyagokat is tartalmazhatja.
A találmány tárgyát képezi továbbá egy eljárás Lyme-kór elleni passzív oltóanyag előállítására B. burgdorferi sejtekkel vagy részeivel, előnyösen teljes B. burgdorferi B31 és/vagy ZS7 sejtekkel immunizált kísérleti állat, előnyösen egér limfociták vagy lépsejtek felhasználása révén, amikor is az immunizált állat limfocitáiból vagy lépsejtjeiből sejtfúzióval olyan hibridomát állítunk elő, amely egy találmány szerinti monoklonális antitestet termel.
A találmány további tárgyát képezi egy olyan hibridoma sejtvonal (ECACC 89 091 302) is, amely a találmány szerinti AspA elleni LA-2 antitestet (IgG2b) termeli. A találmány az OspA elleni LA-26.1 antitest (IgGl) termelő hibridoma sejtvonalra (ECACC 90 050 406), valamint az OspB elleni LA-25.1, illetve LA-27.1 antitest (IgG2b, illetve IgGl) termelő ECACC 90 050 405, illetve ECACC 90 050 407 hibridoma sejtvonalakra is vonatkozik.
A találmány tárgyát képezi a patogén B. burgdorferi ZS7 törzs is (DSM 5527).
A találmány továbbá egy olyan antigénre vonatkozik, amely egy találmány szerinti monoklonális antitesttel immunológiai reakcióba lép. Ezalatt egy olyan antigén értendő, amely az OspA, illetve az OspB teljes aminosav szekvenciáját vagy az OspA-ból, illetve az OspB-ből csak egy immunogénként ható rész-szekvenciát (immunogén epitóp) tartalmaz. Egy szakember nehézség nélkül meg tudja határozni ezen proteinek immunogén epitópjait az OspA-protein szerkezetének analízise (ilyen például a Chou-Fassmann analízis) révén, majd kísérletileg meghatározhatja a hatásosságukat.
A találmány tárgya különösen egy olyan rekombináns antigén is, amely a találmány szerinti antitesttel immunológiailag reagál, és az antigént kódoló DNS szekvenciát egy rekombináns vektor, előnyösen egy olyan prokarióta vektor tartalmazza, amely alkalmas proteinek expressziójára.
A találmány különösen a B. burgdorferi ZS7-ből származó antigénre vonatkozik, amely a találmány szerinti antitesttel immunológiai reakcióba lép és amely az 1. ábrán bemutatott aminosav szekvenciát vagy ebből a szekvenciából egy immunogén epitópot tartalmaz. Eszerint a találmány egy olyan rekombináns DNS-re is vonatkozik, amely (1) az 1. ábrán bemutatott szekven2
HU 211 228 A9 ciát tartalmazza, (2) a genetikai kód degenerációja keretén belül egy ennek megfelelő nukleinsav szekvenciát vagy (3) az (l)-ből és/vagy (2)-ből származó egy szekvenciával szigorúan meghatározott feltételek között hibridizáló szekvenciát tartalmaz, amely a B. burgdorferi ZS7 31 kD antigénjét, vagy ennek egy immunogén epitópját kódolja. A „szigorúan meghatározott hibridizáló feltételek” fogalmának meghatározását lásd Maniatis és munkatársai .Molecular Cloning” c. munkájában [A Laboratory Manual: Cold Spring Harbor Laboratory, New York, (1982)].
Külünösen előnyös találmány szerinti antigén a rekombináns nem fúziós protein vagy a β-galaktozidázfúziós protein.
A találmány tárgyát képezi továbbá egy olyan rekombináns vektor is, amely a találmány szerinti rekombináns DNS egy vagy több másolatát tartalmazza. A találmány szerinti vektor egy prokarióta vagy/és eukarióta vektor lehet, előnyösen prokarióta vektor. A rekombináns vektor a gazdasejtben extrakromoszómálisan helyezkedhet el (például egy plazmid) vagy a gazdasejt genomjába integrálódhat (például a lambda bakteriofág). A találmány szerinti vektor előnyösen egy plazmid. Különösen előnyös a pZS-7/31-2 vektor (DSM 5528).
A találmány tárgya egy eljárás is a találmány szerinti antigének előállítására olyan módon, hogy egy B. burgdorferi génbankot egy vagy több találmány szerinti antitesttel átvizsgálunk és ezután azokat a kiónokat izoláljuk, amelyek az alkalmazott antitestekkel pozitív immunreakciót adnak.
Minthogy egy találmány szerinti antigén maga is felhasználható aktív immunizálásra, azaz antitest képzés indukálására a szervezetben, így a találmány magában foglal egy olyan Lyme-kór elleni aktív oltóanyagot is, amely hatóanyagként egy találmány szerinti antigént tartalmaz, adott esetben a szokásos vivő-, töltő- és segédanyagokkal. Egy előnyös kiviteli mód szerint a találmány szerinti antigént géntechnológiai úton állítjuk elő.
Valóban igazoltuk, hogy a normál egereknek adott natív, illetve rekombináns OspA olyan protektív antitestek képződését indukálja, amelyek Scid-egerekbe való passzív átvitel után a Lyme-borreliózis ellen védnek. Megállapítottuk mindenekelőtt, hogy a rekombináns OspA a natív OspA-hoz hasonlóan protektív immunválaszt indukál, s így az emberek Lyme-borreliózisa elleni vakcinához sokatígérő jelöltként jön számításba.
A találmány további tárgyát képezi egy Lyme-kór elleni passzív oltóanyag előállítására szolgáló eljárás, amikor is kísérleti állatokat, előnyösen egereket immunizálunk egy találmány szerinti antigénnel és az immunizált kísérleti állatból a szokásos módon, protektív poliklonális vagy monoklonális antitesteket izolálunk.
Végül a találmány oltalmi körébe tartozik még egy eljárás patogén B. burgdorferi mikroorganizmusok izolálására és kitenyésztésére, amelyet az jellemez, hogy a kórokozóval előzőleg megfertőzött immunhiányos kísérleti állatokból, előnyösen egerekből, a kórokozót izoláljuk és a kórokozó patogenitása megmarad. Különösen előnyös egy olyan eljárás, amikor a fertőzött
Scid-egerek véréből és/vagy ízületeiből tenyésztjük ki a patogén B. burgdorferi ZS7 (DSM 5527) mikroorganizmust.
A találmányt a kővetkező példákon keresztül és az 1. és 2. ábra segítségével ismertetjük. Az 1. ábra a B. burgdorferi ZS7 31 kD antigénjének (OspA) DNS és aminosav szekvenciáját mutatja be, a 2. ábrán az ZS7/31-2 rekombináns protein immunológiai jellemzése látható.
/. példa
Arthritis, canditis és hepatitis előidézése Scid-egerekben B. burgdorferi ZS7 törzzsel való fertőzéssel Az egerek kezelése B. burgdorferivel C.B-17 Scid törzsből (Scid mutáció szempontjából homozigóta) és C.B-17 törzsből származó kifejlett egereket lxlO5, 5xlO5, lxlO6 vagy lxlO8 élő vagy elölt (UV-besugárzás) B. burgdorferi sejttel oltunk be szubkután a farok tövénél.
B. burgdorferi izolálása kullancsból és egerekből
A kísérleteket a már hosszú ideje tenyésztett B. burgdorferi B31 törzzsel (ATCC 35 210) és a frissen izolált - nőstény Ixodes ricinus kullancsból izolált - B. burgdorferi ZS7 (DSM 5527) törzzsel végeztük. Mindegyik B. burgdorferi törzset módosított Kelly táptalajban tenyésztettük [Barbour és munkatársai, Curr. Microbiol., 8, 123. (1983) Svájc]. Az etanollal sterilizált kullancs vékonybeléből vagy a befertőzött egerek véréből izolált B. burgdorferi sejteket kezdetben 8 pg/ml kanamicinnel és 230 pg/ml fluor-uracillal kiegészített Kelly táptalajban tenyésztettük [Johnson és munkatársai, J. Clin. Microbiol., /., 81. (1984)].
Szerológiai vizsgálatok
A B. burgdorferi specifikus antitestek kimutatását hagyományos ELISA eljárással végezzük [Justus és munkatársai, Wehrmed. Mschr., 32., 263. (1988)]. Az immunglobulin (lg) tartalom standard görbéjét úgy kapjuk meg, hogy a csészét anti-egér Ig-vel [Passel féle szérum (Frankfurt, NSZK)] 1:500 hígítással töltünk meg és titráljuk a teljes egér IgG vagy IgM tartalmat (Calbiochem., La Jolla, USA). Az össz-szérum IgM és IgG-mérése hasonlóan történik. AB. burgdorferi specifikus IgM vagy IgG antitest koncentrációt lg pg/szérum ml-ben adjuk meg.
Immunfluoreszcencia és Giemsa festés pl vért pipettázunk egy hematokrit csövecskébe (Becton és Dickinson, Heidelberg, NSZK) és 5,000 g mellett hematokrit centrifugában (ECCO, NSZK) lecentrifugáljuk. A csövecskéket a szérum és vörösvérsejt határrétegénél átvágjuk és a szérumból 5 pl-t tárgylemezre visszük (Superior, Bad Mergentheim, NSZK). A szérum mintákat tartalmazó tárgylemezeket levegőn megszárítjuk és 100%-os etanolban 1 percig -20 °C-on fixáljuk. A tárgylemezeket ezután 1 órán át nyúl anti-B burgdorferi hiperimmunszérummal (1:100
HU 211 228 A9 hígítás) inkubáljuk szobahőmérsékleten, majd ötször mossuk PBS-ben és ezután FITC-el konjugált kecske anti-nyúl antiszérummal (1:20 hígítás: Jackon Láb., West Grove, USA) festjük 1 órán át. A tárgylemezeket mossuk, Kaiser féle glicerin-zselatinba (Merck, Darmstadt, NSZK) beágyazzuk, majd rögtön fluoreszcens mikroszkóp alatt vizsgáljuk. A kezeletlen vércseppeket levegőn megszárítjuk, metanolban fixáljuk, Giemsa oldattal (0,1%; Merck, Darmstadt, NSZK) megfestjük, PBS-sel kimossuk és entellanba (Merck, Darmstadt, NSZK) beágyazzuk.
Szövettani preparátumok készítése és festési eljárások
Előzőleg B. burgdorferi-vel fertőzött egerekből a fertőzés után különböző időpontokban különböző szerveket (agy, szív, tüdő, máj, vese, lép és ízületek) távolítunk el és vagy folyékony nitrogénben - fagyasztott metszetek készítéséhez - vagy 5%-os formaldehidben (PBS-ben) - paraffinba vagy metakrilátba való beágyazáshoz - tároljuk. 4—7 pm-es metszeteket készítünk, hematoxilin-eozinnal megfestjük őket és entellanba (Merck, Darmstadt, NSZK) beágyazzuk. Az immunhisztológiai vizsgálatokat sztreptavidin-biotin-peroxidáz rendszerben végezzük [Kramer és munkatársai, Eur. J. Immunoi., 79., 151. (1989)].
Az 1. táblázat mutatja, hogy az izolált ZS7 és B31 B. burgdorferi mikroorganizmusokat a kísérlet egész időtartama alatt ki lehetett mutatni azoknak a Scid-egereknek a vérében, amelyeket előzőleg élő mikroorganizmusokkal oltottunk. Azonban csak aZS7 spirochaeta törzset lehetett in vitro újból kitenyészteni, a B31 törzset nem. Az újból tenyésztésbe vont mikroorganizmusoknak a primer izolált B. burgdorferi ZS7 sejtekkel való összehasonlításakor nem lehetett megállapítani semmilyen változást a protein tartalomban vagy a plazmid-profilban. A B. burgdorferi-vel fertőzött Scid-egerekben a megfigyelés egész időtartama alatt vagy semmilyen, vagy csak rendkívül alacsony irreleváns antitest titer volt kimutatható. Ezekben az állatokban B. burgdorferi specifikus IgM vagy IgG antitesteket nem találtunk (1. táblázat). Ezzel szemben mindegyik B. burgdorferivel fertőzött C.B-17 kontroll egér nagymennyiségű össz-Ig-t és magas titerű B. burgdorferi specifikus IgM és IgG antitestet termelt.
A B. burgdorferi ZS7-teI való fertőzés után a 7. és
20. nap között mutatták a Scid-egerek az arthritis első klinikai tüneteit (mindkét tibiotarzális ízület piros és duzzadt lett), amik idővel erősödtek. Ezzel szemben azokban a Scid-egerekben, amelyeket UV-besugárzott B. burgdorferi B31 sejtekkel fertőztünk meg és a C.B17 kontroll egerekben, amelyeket élő B. burgdorferi ZS7 sejtekkel fertőztünk meg, nem találtunk arthritises tüneteket.
Az élő B. burgdorferi ZS7-tel megfertőzött Scid-egerekben kórszövettanilag is ki lehetett mutatni az arthritises ízületi elváltozásokat (1. táblázat). Súlyos ízületi károsodásokat állapítottunk meg, amelyeket a hiperpláziával járó gyulladásos szinoviális bélés-sejtek jelenléte jelzett, és ezeket a jegyeket erózió (hám-hiány) és a porcszövetek és/vagy csontok roncsolódása kísérte. Ezenkívül pancarditist állapítottunk meg, mononukleáris sejtek infíltrációjával az endocardiumban (szívbelhártyában), myocardiumban (szívizomban) és pericardiumban (szívburokban). A máj progresszív gyulladását is észleltük, amelynél a mononukleáris sejtek infiltrációja a kapuér (véna portáé) területére és a központi gyűjtóérre korlátozódott, továbbá granulóma képződéssel járó reakciókat és végül máj fibrózist észleltünk. Ezenkívül a vesékben, tüdőben, agyban és a harántcsíkolt izomzatban kisebb károsodásokat észleltünk.
1. táblázat
C.B-17 Scid-egerek és C.B-17 kontroll egerek fertőzése B. burgdorferi-vel; Spirochaeták kitenyésztése szövetekből: Antitest titer és arthritis kialakulása
| Egér törzs | Törzs | B. burgdorferi | B. burgdorferi | ||
| fertőzés- hez használt sejtszám | fertőzés után eltelt napok | észlelése vérben* | izolálá- sa** | ||
| C.B-17 scid (n=l) | ZS7 | 5xl05 | 7 36 49 59 | + + + + | +B +B +B |
| ZS7 | lxlO8 | 7 23 | + + | +B | |
| ZS7 | lxlO8 | 22 29 87 | + + | +G +B/G | |
| ZS7 | lxlO5 lxlO6 lxlO8 | 16 | n. b. n. b. + | n. b. n. b. + | |
| ZS7uv | lxlO8 | 16 | - | - | |
| B31 | lxlO8 | 22 29 | + + | - | |
| - | 22 | - | - | ||
| - | 29 | - | - | ||
| C.B-17 (n = 7) | ZS7 | lxlO8 | 16 24 | - | - |
| - | - | - | - | - | |
| - | - | - | - | - |
* Giemsa festéssel vagy immunfluoreszcenciával ** izolálás vérből (B = Blut), ízületekből (G = Gelenken) o+ tibiotarzális ízületek pirossága és duzzanata oo- <7,5 pg/ml szérum
n. b. meghatározás nem történt
HU 211 228 A9
1. táblázat (folytatás)
C.B—17 Scid-egerek és C.B-17 kontroll egerek fertőzése E. burgdorferivel; Spirochaeták kitenyésztése szövetekből: Antitest titer és arthritis kialakulása
| Egér törzs | Törzs | Arthritis | Antitest (gg/ml)°° | ||||
| klini- kai | kór- szö- vetta- ni | ősz szes μ | IG τ | speci- fikus μ | lg τ | ||
| - | - | 20 | - | ||||
| ZS7 | + | + | - | 21 | - | - | |
| + | + | — | 26 | — | - | ||
| + | + | - | 396 | - | - | ||
| ZS7 | + | + | - | 108 | - | - | |
| + | + | — | 54 | — | - | ||
| C.B-17 | ZS7 | + | + | - | 41 | - | - |
| + | + | ||||||
| Scid | |||||||
| (n = 1) | |||||||
| + | n. b. | n. b. | n. b. | n. b. | n. b. | ||
| ZS7 | + | n. b. | n. b. | n. b. | n. b. | n. b. | |
| + | + | - | - | - | - | ||
| ZS7uv | - | - | - | - | - | - | |
| - | - | 26 | 37 | - | - | ||
| B31 | — | — | - | - | - | - | |
| - | - | - | 47 | - | - | ||
| - | 54 | 364 | - | - | |||
| 2515 | 5963 | 438 | 56 | ||||
| C.B-17 | ZS7 | - | - | 2145 | 63747 | 506 | 94 |
| (n = 7) | — | 304 216 | 3804 | - | — | ||
| 1952 |
* Giemsa festéssel vagy immunfluoreszcenciával ** izolálás vérből (B = Blut), ízületekből (G = Gelenken) 04 tibiotarzális ízületek pirossága és duzzanata <7,5 pg/ml szérum n. b. meghatározás nem történt
2. példa
A B. burgdorferi 31 kD antigénre specifikus monoklonális antitest hatása Lyme-borreliózisra Scidegerekben
A monoklonális antitest előállítása
Ha intakt immunrendszerrel rendelkező egeret B. burgdorferi mikroorganizmusokkal immunizálunk, az B. burgdorferi-re specifikus poliklonális antitesteket fog termelni (lásd az 1. táblázatot).
Tíz-hetes beltenyésztett BALB/c nőstény egereket ultrahanggal homogenizált Borrelia mikroorganizmussal (E. buigdorferi B31 törzs; ATCC 35 210) immunizálunk.
Immunizálási séma;
0. nap: 200 gg Borelia antigén komplett Freund adjuvánsban, szubkután,
21., 35., 49., 63. nap: ráoltás 100 gg Borrelia antigénnel foszfáttal pufferolt konyhasó oldatban (PBS), intraperitoneálisan,
66. nap: lép kivétel és egysejt szuszpenzió előállítása.
Az immun lépsejteket az Ag8-PAI myeloma sejtvonallal fuzionáljuk standard módszerek szerint, polietilén-glikol alkalmazásával (J. H. Peters, H. Baumgarten, M. Schulze, „Monoklonale Antikörper” SpringerVerlag, Heidelberg, Német Szövetségi Köztársaság).
A fúziós terméket 96-tartályos szövettenyésztő lemezekre oltjuk. Nyolc nap múlva a sejttenyészetek feliilúszóit B. burgdorferi-re specifikus monoklonális antitestek jelenlétére vizsgáljuk, szilárdfázisú ELISA segítségével (J. H. Peters és munkatársai, lásd fentebb). Az antitest termelő tenyészetek hibridoma sejtjeit határhígításos módszerrel klónozzuk. Az egyedi kiónok tenyészetének felülúszóját ezután újból szilárdfázisú ELIS A-val, valamint Westem-Blot analízissel és immunfluoreszcens vizsgálatokkal jellemezzük. Az IgG2b alosztályba tartozó LA-2 monoklonális antitestet egy monoklonális hibridoma vonal termeli és választja ki, a Westem-Blot vizsgálatban minden vizsgált B. burgdorferi törzs (ilyen a ZS7 izolált törzs és a B31 törzs) 31 kD-struktúrájával (OspA) reagál, amikor SDS-gélben elektroforézissel elválasztott és WestemBlot segítségével membránra átvitt B. burgdorferi proteinekkel érintkezik. A LA-26.10 (anti-OspA IgGl), a LA-25.1 (anti-OspB, 34 kD antigén, IgG2b) és a LA27.1 (anti-OspB, 34 kD antigén: IgGl) monoklonális antitesteket azonos módon állítottuk elő és vizsgáltuk.
Egerek fertőzése B. burgdorferi ZS7-tel
C.B-17 Scid-egereket lxlO8 élő B. burgdorferi ZS7 mikroorganizmussal fertőzünk meg a farok-tőbe való szubkután oltással.
Az egerek kezelése antiszérumokkal
A megfertőzött Scid-egereket hetenként kétszer különböző antiszérumokkal kezeltük. Az egyik csoportot normál egér szérummal (NMS = normál Mausserum), a második csoportot egér immunszérummal (IMS = immunes Mausserum) és egy harmadik csoportot a LA-2 monoklonális antitesttel (a B. burgdorferi 31 kD antigénje elleni antitest) kezeltük. Az adagolt antiszérumok mennyisége az első héten 100 gl, illetve LA-2 esetén 100 gg volt, a második héten 200 gl, illetve LA-2 200 gg és a harmadik héten 300 gl, illetve LA-2 esetén 300 gg volt.
A 2. táblázatban bemutatjuk, hogy a kezeletlen vagy az NMS-sel kezelt Scid-egereknél 12 nap múlva az arthritis, carditis és hepatitis klinikai és kórszövettani jelei mutatkoztak. Ezzel szemben a LA-2 monoklonális antitest adása Scid-egereknél a kórtünetek jelentős csökkenését idézte elő. Klinikailag csak az ízületek enyhe pirossága mutatkozott és kőrszövettanilag csak csekély elváltozások voltak megállapíthatók. Az IMSsel kezelt egereknél klinikai arthritis-re utaló leletet nem találtunk.
A B. burgdorferi kórokozó kimutatása in vitro kitenyésztéssel csak azoknál az egereknél járt sikerrel, amelyek vagy kezeletlenek voltak, vagy NMS-sel voltak kezelve. A LA-2-vel vagy IMS-sel kezelt egereknél B. burgdorferit nem lehetett kimutatni (2. táblázat).
HU 211 228 A9
2. táblázat
C. B-17 Scid-egerek kezelése B. burgdorferi-vel és antiszérumokkal
| C.B-17 Scid- egér- törzs | Kezelés antiszé- rummal | Arthritis (12 nap után) klinikai kórszövettani | Carditis/hepatitis kórszövettani | B. burgdorferi kimutatása (tenyésztéssel) | |
| n = 3 | - | + | + | + | + |
| n = 3 | NMS | + | + | + | + |
| n = 2 | IMS | - | - | - | - |
| n = 3 | LA-2 | _0 | _OO | - | - |
° az ízületek enyhe pirossága 00 Csak csekély elváltozások
5. példa
A B. burgdorferi ZS7 31 kD antigénjének (OspA) expressziós klónozása DNS izolálás
AB. burgdorferi ZS7 törzsből módosított Kelly féle táptalajon való tenyésztés után nagymolekulájú DNS-t tisztítunk. A spirochaetákat 10.000 g mellett centrifugálva ülepítjük és háromszor mossuk PBS-pufferben. A száraz üledéket 10 ml TE-pufferben (10 mmol/1 trisz, 1 mmol/1 EDTA, pH = 7,4) reszuszpendáljuk, lizozimmel (5 mg/ml) kezeljük 15 percig 30 ’C-on és a DNS-t 1 ml 20%-os SDS hozzáadásával felszabadítjuk. Ezután hozzáadunk 1,5 ml NaCl oldatot (5 mol/1), ezt az oldatot azonos térfogatú fenollal extraháljuk, majd kloroformos extrahálás következik. A DNS-t kétszeres térfogat abszolút etanol hozzáadásával és egy éjszakán ál -20 °C-on való inkubálással csapjuk ki. Centrifugálás után az üledéket 0,5 ml TS-pufferben oldjuk fel, majd DNáz mentes RNáz A-val (20 pg/ml) inkubáljuk 45 percig 55 °C-on és ezután egy órán át proteináz K-val (0,1 pg/ml) kezeljük 37 ’C-on. Az oldathoz nátrium-acetátot adunk 0,3 mol/l-ig és fenol-kloroformmal extraháljuk a fent leírtak szerint. Etanollal való kicsapás után a DNS-t újból TE-pufferben vesszük fel.
Génbank előállítása
A nagymolekulájú DNS-t három másodpercig tartó ultrahang kezeléssel statisztikusan feldaraboljuk. A kapott DNS fragmentumok végeit T4-DNS polimeráz (37 ’C, 30 perc) és Klenow enzim (20 ”C, 5 perc) segítségével kiegyenlítjük. A tompa végű DNS-t a pUEXL expressziós vektor BamHI helyére ligáljuk egy adapterklónozó stratégia alkalmazásával [Bresan és Stanley, Nucl. Acid. Rés., 1056. (1987)]. Egy nagyság szerinti szelekciós lépés után, amelyet molekulaszűrő kromatografálással végzünk Sephacryl S-1000 alkalmazásával, E. coli (MC 1061) gazdasejteket transzformálunk, és a rekombináns, plakk képző egységet (pfu) mutató sejteket a következőképpen mutatjuk ki: a véletlenszerűen kiválasztott telepeket kiszúrjuk és 2 ml szelektív táptalajban (LB táptalaj 25 pg/ml ampicillinnel kiegészítve) tenyésztjük telítésig. A plazmid-DNS-t a szokásos alkalikus lizáló módszerrel izoláljuk, és ezután BamHI-gyel hasítjuk. Az analizált plazmidok több, mint 50%-a átlag Jl,5 kb hosszú DNS inszertumot tartalmazott.
A. B. burgdorferi ZS7 génbank lemezre vitele és szűrése
A sejteket 24x24 cm-es lemezekre öntjük lemezenként 7000 pfu sűrűségben és egy éjszakán át 30 °C-on inkubáljuk. A telepeket ezután nitro-cellulóz (NC) szűrőkre visszük át, majd a β-galaktozidáz-fúziós proteinek expresszióját 42 °C-on való két órás inkubálással indukáljuk. A szűrőket előzőleg 5%-os SDS-sel kezelt Whatman 3MM papíiTa visszük át és körülbelül 25 percig 95 °C-on inkubáljuk. Ezután a proteineket elektroblot révén megfelelő készülék alkalmazásával - Western biot eljárással (félszáraz) analizáljuk. Az NC-szűrőket DNáz-zal kezeljük, majd az immunreaktív kiónokat expresszióra való szűréssel - monoklonális antitestek használatával azonosítjuk. Az NC-szűrőn az aspecifikus kötőhelyeket 0,2% (tömeg/térf) zselatin és 3 mmol/1 NaN3 tartalmú PBS-ben 4 órás inkubálással - szobahőmérsékleten - telítjük. Ezután a szűrőket a LA-2 anti-31 kD monoklonális antitest klón tenyészetének felülúszójával inkubáljuk 18 órán át folyamatos rázás mellett. Alapos mosás [PBS +1% (térf/térf) triton X-100; PBS+0,5 mol/1 NaCl; PBS + 1 mol/1 NaCl; mindegyik lépés 10 percig tart] után a szűrőket 1:10 000 hígítású peroxidázzal jelzett nyúl antiegér lg G F(ab)2 készítménnyel inkubáljuk 1,5 órán át szobahőmérsékleten, folyamatos rázás közben. A szűrőket újból mossuk, mint fent leírtuk, majd ezután diaminobenzidinnel (a peroxidáz szubsztrátuma) inkubáljuk. 104 rekombináns pfu-ból 20 klón reagált a LA-2 monoklonális antitesttel.
A 31 kD antigén (OspA) szekvenciális analízise
Egy rekombináns E. coli kiónból - amely pozitív reakciót adott LA-2 antitesttel - a DNS inszertumot a szokásos módon izoláljuk. Ennek a kiónnak a DNS inszertuma a B. burgdorferi 31 kD antigénjét kódoló teljes hosszúságú OspA-gént tartalmazza. Az inszertumot tartalmazó plazmid pZS-7/31-2 elnevezést kapott és a Budapesti Egyezmény alapján letétbe helyeztük a DSM intézménynél (DSM 5528 letéti szám alatt).
Ezen immunpozitív klón által termelt rekombináns proteint rZS7/31-2-vel jelöltük. Az OspA gént kódoló DNS szekvenciát meghatároztuk. Ezt az OspA protein innen levezetett aminosav szekvenciájával együtt az 1. ábrán mutatjuk be.
Az 1. ábrából kitűnik, hogy a B. burgdorferi 31 kD antigénje egy 273 aminosavból álló proteinnek felel meg.
A nem-fuziós proteinek előállítása (a) A kiónt, amely az rZS7/31-2 immunreaktív proteint fejezi ki, egy éjszakán át 30 °C-on ampicillinnel kiegészített 10 ml LB táptalajban tenyésztjük. A tenyészetből 1 ml-t 100 ml szelekciós táptalajba mérünk és 30 'C-on jó levegőztetéssel 8xl07 sejt/ml sűrűségig (Aóoo = θ’2) tenyésztjük. A rekombináns protein expresszióját a gazdasejtek 42 ’C-ra való melegítésével
HU 211 228 A9 érjük el. Lehűtés és centrifugálás után a sejteket STEpufferben (10 mmol/1 trisz, 100 mmol/1 NaCl, 1 mmol/1 EDTA; pH = 8,0) mossuk és az üledéket 0,6 ml lizáló pufferben (25% szacharóz, 50 mmol/1 trisz; pH = 8,0) reszuszpendáljuk. 150 pl lizozin (10 mg/ml) hozzáadása után az elegyet 15 percig jégen inkubáljuk, majd tovább inkubáljuk (15 percig jégen) 18 pl DNáz 1-gyel (10 mg/ml) 5 pl 1 mólos MgCl2 jelenlétében. A reakcióelegyhez végül 250 pl 4x detergens-mix-et (1% triton X-100, 0,5% dezoxikolát, 0,1 mol/1 NaCl, 10 mmol/1 trisz; pH = 7,4) adunk és 5 percig jégen inkubáljuk. Centrifugálás után az üledéket kétszer mossuk puffer A-val (50 mmol/1 trisz, 50 mmol/1 NaCl, 1 mmol/1 EDTA; pH-8,0); majd 9 térfogatnyi 8 mól karbamid tartalmú puffer A-ban reszuszpendáljuk és 1 órán át szobahőmérsékleten inkubáljuk. A mintát 9 rész puffer-E-vel (50 mmol/1 KHjPOyKjHPÖ,, 50 mmol/1 NaCl, 1 mmol/1 EDTA; pH = 10,7) hígítjuk és 30 percig szobahőmérsékleten keverjük, miközben a pH-t KOH adagolással 10,7-en tartjuk. Az oldat pH-ját ezután HCl hozzáadásával 7,0-re állítjuk be, majd egy éjszakán át puffer A-val szemben dializáljuk (4 ’C-on) és 10 percig 4 ’C-on 10 000 ford/perc mellett SS34-rotorban centrifugáljuk. A felülúszót, amely a rekombináns proteint tartalmazza, -20 ’C-on tároljuk.
(b) Minthogy a klón az rZS7/31-2 immunreaktív proteint a tápoldatba is kiválasztja, a tisztítást (affinitáskromatográfiával) a tenyészet felülúszójából is el lehet végezni.
Rekombináns OspA protein (nem-fúziós) előállítása és tisztítása affinitáskromatográfiával A rekombináns proteineket végezetül affinitáskromatográfiával tisztítjuk.
Erre a célra a tisztított LA-2 monoklonális antitestet aktivált Sepharose CL 4B-hez kötjük kovalens kötéssel. A rekombináns proteint tartalmazó dializált karbamidextraktumot egér IgG-Sepharose CL 4B-re adszorbeáljuk és ezután a LA-2-Sepharose CL 4B oszlopra visszük. Intenzív mosás után a megkötött rekombináns proteint 0,1 mol/1 glicin/HCl - 0,1 mol/1 NaCl oldattal (pH = 2,5) eluáljuk. Az összegyűjtött frakciók pH-ját semlegesre állítjuk be 1/10 térfogat 0,5 mol/1 K2HPO4 azonnali hozzáadásával. A proteint tartalmazó frakciókat koncentráljuk és dializáljuk. SDS poliakrilamid gél elektroforézis segítségével határozzuk meg a tisztítás fokát.
A rZS7/31-2 rekombináns protein immunológiai jellemzése
Elvégeztük az rZS7/31-2 rekombináns protein immunológiai vizsgálatát. Összehasonlításul az rB31/419 rekombináns proteint (B. burgdorferi 41 kD felületi antigén) használtuk fel.
Laposfenekű mikrotitráló lemezeket az rZS7/31-2 és rB31/41-9 rekombináns proteinek karbamid-extraktumával, illetve a génexpresszióhoz használt E. coli MC 1061 törzs karbamidos kivonatával fedünk. Az aspecifikus kötőhelyeket 0,2% zselatint tartalmazó foszfáttal pufferolt konyhasó oldattal (PRS) blokkoljuk. Az így előkészített mikrotitráló lemezek tartályaiba bemérjük a megadott LA-2 (anti-31 kD, OspA),
LA-1 (anti-41 kD, flagellin), illetve ACHT-2 (anti-a,antikimotripszin) monoklonális antitesteket.
A megkötött monoklonális antitesteket peroxidázzal jelzett fajspecifikus anti-egér immunglobulinnal reagáltatjuk. A megkötött, peroxidázzal jelzett antitestek mennyiségét orto-fenilén-diamin (a peroxidáz szubsztrátuma) segítségével határozzuk meg. Az abszorpciót 492 nm-en (A4922) közvetlenül a mikrotitráló lemezen - automata lemezfotométer segítségével - határozzuk meg. Az abszorpció erőssége a megkötött monoklonális antitest mennyiségére jellemző mérték.
A LA-2 monoklonális antitest specifikusan reagál az rZS7/31-2-vel, de nem reagál az MC 1061-el, illetve rB31/41-9-el. A LA-1 monoklonális antitest kontroli-reakció az rB31/41-9-re specifikus. Az ACHT-2 kontroll antitest (negatív kontroll) egyik proteinnel sem ad szignifikáns reakciót.
A 2. ábrán bemutatjuk, hogy a LA-2 monoklonális antitest által specifikusan felismert antigén-epitópot, amely az rZS7/31-2 rekombináns proteinen fejeződik ki, a B. burgdorferi ZS7 genomjából klónoztuk.
4. példa
A 31 kD (OspA) antigénre, illetve a 34 kD (OspE) antigénre specifikus antitestek összehasonlítása azokkal az antitestekkel, amelyek a 41 kD antigénre (flagellin) specifikusak
A LA-2 és LA-26.1 monoklonális antitestek felismerik a 31 kD OspA antigént és az IgG2b, illetve IgGl izotípushoz tartoznak. ALA-25.1 és aLA-27.1 monoklonális antitestek a 34 kD OspB antigént ismerik fel és az IgG2b, illetve IgGl izotípushoz tartoznak. A LA-10 és LA-21 monoklonális antitestek a B. burgdorfei flagellinjével kapcsolatos 41 kD periplazmatikus proteinre specifikusak és IgG2a, illetve IgGl izotfpusúak. Mindegyik fent említett antitestet a 2. példában leírt eljárással állítottuk elő. Ebben a kísérletben azt kell megállapítanunk, hogy más B. burgdorferi antigénnel szembeni monoklonális antitestek védőhatást gyakorolnak-e Scid-egerekben a Lyme-borreliózis klinikai tüneteivel szemben.
A poliklonális anti-B31 immunszérumot (IMS) C57BL/6 egerekből vettük le. Az egereket lxlO8 B. burgdorferi B31 sejttel oltottuk szubkután és a szérum levétele az oltás után 91 nappal történt A poliklonális anti-ZS7 IMS-t az lxlO8 B. burgdorferi ZS7-tel szubkután oldott 057BL/6 egerekből oltás után 68 nappal vettük le. Mindkét szérum 60 pg/ml specifikus antitestet tartalmazott ELISA rendszerben való meghatározás szerint [Schaible és munkatársai, J. Exp. Med., 170, 1427-1432. (1989)]. Normál egér szérumot (NMS) nem oltott CS7BL/6 egerekből vettünk.
Az oltás időpontjában és ezután 4 napos időközönként az adott antitesteket, az IMS-t, az NMS-t vagy a PBS-t passzív intraperitoneális oltással Scid-egereknek adtuk be a következő séma szerint:
0. nap és 3. nap 100 pl
7. nap és 10. nap 200 pl
13. nap és 17. nap 300 pl
HU 211 228 A9
Azokon a Scid-egereken, amelyeket akár az antiZS7 IMS-el, az anti-B31 IMS-sel vagy a LA-2 monoklonális antitesttel kezeltünk, a 21 napos megfigyelési idő alatt nem mutatkoztak az arhtritis klinikai tünetei, azaz a tibiotarzális ízületeknél nem lépett fel pirosság 5 és duzzanat. Nem lehetett megállapítani carditisre és hepatitisre utaló tüneteket sem.
Kórszövettani vizsgálatok nem mutattak ki elváltozásokat azoknak a Scid-egereknek az ízületeiben, szívében és májában, amelyeket akár anti-ZS7 IMS-sel, anti-B31 IMS-sel vagy akár a LA-2 monoklonális antitesttel kezeltünk.
A többi OspA specifikus monoklonális antitest, így az IgGl izotípusú LA-26.1, valamint az OspB specifikus LA-25.1 és LA-27.1 szintén képesek voltak az arthritis, carditis és hepatitis klinikai tüneteit enyhíteni.
Itt enyhe kóros elváltozások mutatkoztak a vizsgált szervekben.
Ezzel szemben azok a Scid-egerek, amelyek vagy PBS puffért vagy NMS-t vagy flagellin ellenes monoklonális antitestet (LA-10 vagy LA-21) kaptak, arthritises klinikai tüneteket mutattak, hasonlókat a kezeletlen Scidegereknél tipikus kóros elváltozásokhoz (3. táblázat). A tünetek súlyossága ez utóbbi állatoknál az oltás után eltelt idővel növekedett és nem gyengült a megfigyelés egész időtartama alatt. Az előzőleg anti-ZS7 IMS-sel vagy a LA-2 antitesttel kezelt Scid-egerekből nem lehetett spirochaetákat izolálni. Ezzel szemben a PBS pufferrel, NMS-sel vagy a LA-25.1, LA-26.1, LA-27.1 LA-10 és LA-21 monoklonális antitestekkel kezelt Scid-egerekből ki lehetett mutatni a spirochaetákat immunfluoreszcenciával és vérből való kitenyésztéssel.
3. táblázat
| C.B-17 Scidtörzs (az egerek száma) | Mivel történt a kezelés | IgG szubíipus | Klinikai arthritis | Kórszövettani | B. burgdorferi kimutatása (tenyésztéssel és immun fluoreszcenciával) | |
| periarthritis/arth- ritis | carditis | |||||
| n = 8 | PBS (negatív kontrollok) | + | + | + | + | |
| n = 3 | NMS (negatív kontrollok) | + | + | + | + | |
| n = 3 | anti-B 31 IMS | - | - | —* | _0 | |
| n = 2 | anti-ZS7 IMS | - | - | _* | - | |
| n = 6 | LA-2 (OspA) | 2b | - | _* | _* | - |
| n = 3 | LA-10 (flagellin) | 2a | + | + | + | +° |
| n = 3 | LA-21 (flagellin) | 1 | + | + | +/- | + |
| n = 3 | LA-26.1 (OspA) | 1 | + | + | ± | +° |
| n = 3 | LA-25.1 (OspB) | 2b | + | + | + | + |
| n = 3 | LA-27.1 (OspB) | 1 | ± | + | + | +° |
A kórszövettani elváltozások fokának jele: - nincs; -* szubklinikai; +/- enyhe; + súlyos; 0 A B. burgdorferi-t nem lehetett kimutatni immunfluoreszcenciával minden vizsgált egyedben.
5. példa
OspA-val immunizált egerekből nyert antiszérum hatása a Lyme-borreliózis lefolyására Scid-egerekben Ebben a kísérletben ki tudtuk mutatni, hogy a natív
OspA (B. burgdorferi ZS7-ből izolálva) vagy a rekombináns OspA [rekombináns pZS7/31-2 plazmiddal (DSM 5528) transzformált E. coli baktériumokból izolálva] adása normál egerekben (C57BL/6 egér törzs) protektív poliklonális antitestek képződését indukálja. Ha ezeket az antitesteket Scid-egereknek adjuk be, védő hatást gyakorolnak a Lyme-borreliózissal szemben. Emellett megállapítottuk, hogy a rekombináns OspA a natív OspA-hoz hasonlóan protektív immunválaszt indukál. E kísérlet eredményét és a kísérlet végrehajtásának részleteit a 4. táblázat tartalmazza.
A rekombináns OspA előállítását a 3. példa tartalmazza. A natív OspA előállítása és az egerek immunizálása OspA-val a következőképpen történik.
A natív 31 kD OspA feldúsítása
3x2x10'° spirochaetát 2 órán át 4 ’C-on 5 ml
PB 8/7,5 ml n-butanol oldatban proteináz inhibitorok (5 mmol/1 EDTA, 5 mmol/1 benzamidin, 5 mmol/1 PMSF) jelenlétében mágneses keverővei kevertetünk. Ezután a keveréket 90 percig 10 000 ford/perc mellett 4 ’C-on Sorvall centrifugában (Fix-szögü rotorban) cent50 rifugáljuk. A vizes fázist, ami a felületi proteineket tartalmazza, levesszük és háromszor mossuk kloroformmal.
A protein tartalmat 280 nm-en mért extinkció révén, illetve a BCA-teszt segítségével határozzuk meg.
Az ezüstgélben, illetve az anti-B. burgdorferi nyúl55 szérummal végzett Western biot vizsgálatban a ZS7 törzsnél egy fő sáv jelenik meg a 31 kD molekulatömeget jelentő területen és gyenge sávok láthatók a 20, 34 és 65-68 kD területén. A B. burgdorferi B31 törzsből előállított butanol/víz készítmény egy fő sávot ad
31 kD-nál és gyenge sávokat ad 20 és 34 kD-nál.
HU 211 228 A9
Egerek immunizálása natív és rekombináns OspA* val
C57BL/6, illetve C.B-17 egereket háromszor 7-10 napos időközönként 5 gg (natív OspA a B31 törzsből), illetve 10 gg (natív OspA a ZS7 törzsből, rekombináns OspA ZS7-ből) OspA-t adunk be 100 gl adjuvánsban (ABM3; Sebak cég, Aidenbach, NSZK) szubkután a farok-tőbe. Az utolsó immunizáló oltás után legkorábban 3 hét múlva lehet szérumot levenni 3-4 hónapig. A specifikus antitest tartalmat ELISA rendszerben határozzuk meg.
4. táblázat
A B. burgdorferi specifikus monoklonális és poliklonális antitestek hatása a spirochaetózisra és az arhtritis kialakulására B. burgdorferivel megfertőzött
Scid-egereken
| C.B-17 Scid-egér törzs (az egerek száma) | Mivel történt a kezelés | Arthritis kialakulása | B. burg- dorferi kimuta- tása | ||
| 1 | 2 | 3 | |||
| hét múlva | |||||
| n = 6 | PBS (negatív kontrollok) | ± | + | + | 6/ |
| n = 6 | LA-2 | - | - | - | 0/3 |
| n = 2 | anti-OspA (natív) IMS | - | - | - | 0/2 |
| n = 3 | anti-OspA (rekomb.) IMS | - | - | - | 0/3 |
Az első antitest beadást (100 gl) i. p. végeztük a 0. napon (a 0. napon oltjuk az egereket lxlO8 B. burgdorferi ZS7 sejttel, s. c. a faroktőbe)
A további antitest adást a 4. napon (100 gl), a 7. napon (200 gl), all. napon (200 gl), a 14. napon (300 gl) és a
18. napon (300 gl) végezzük (i. p.)
Claims (26)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Lyme-kór elleni oltóanyag, azzal jellemezve, hogy egy vagy több olyan monoklonális antitestet tartalmaz, amelyek a B. burgdorferi 31 kD antigénjére (OspA) vagy 34 kD antigénjére specifikusak.
- 2. Az 1. igénypont szerinti oltóanyag, azzal jellemezve, hogy az antitest a B. burgdorferi ZS7 törzs (DSM 5527) vagy/és a B31 törzs (ATCC 35 210) 31 kD antigénjére (OspA) vagy 34 kD antigénjére specifikus.
- 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti oltóanyag, azzal jellemezve, hogy IgG osztályba tartozó, előnyösen az IgG2b vagy az IgGl alosztályba tartozó monoklonális antitestet tartalmaz hatóanyagként.
- 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti oltóanyag, azzal jellemezve, hogy olyan immunhiányos kísérleti állatokban, amelyeket élő, patogén B. burgdorferi mikroorganizmusokkal fertőztünk meg, az arthritis, carditis és hepatitis kialakulását meggátolja.
- 5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti oltóanyag, azzal jellemezve, hogy olyan immunhiányos Scid-egerekben, amelyeket élő B. burgdorferi ZS7 törzzsel fertőztünk meg, az arthritis, carditis és hepatitis kialakulását messzemenően gátolja.
- 6. Eljárás Lyme-kór elleni oltóanyag előállítására B. burgdorferi mikroorganizmusokkal vagy ezek részeivel immunizált kísérleti állat, előnyösen egér limfocitáiból vagy lépsejtjeiből, azzal jellemezve, hogy a limfociták vagy a lépsejtek sejtfúziójából olyan hibridomát nyerünk ki, amely az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti monoklonális antitestet termeli.
- 7. A 6. igényponti szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az immunizáláshoz teljes B. burgdorferi B31 vagy/és ZS7 mikroorganizmusokat alkalmazunk.
- 8. OspA elleni LA-2 monoklonális antitest, amelyet az ECACC 89 091 302 sejtvonal szekretál.
- 9. OspA elleni LA-26.1 monoklonális antitest, amelyet az ECACC 90 050 406 sejtvonal szekretál.
- 10. OspB elleni LA-25.1 monoklonális antitest, amelyet az ECACC 90 050 405 sejtvonal szekretál.
- 11. OspB elleni LA-27.1 monoklonális antitest, amelyet az ECACC 90 050 407 sejtvonal szekretál.
- 12. Patogén B. burgdorferi ZS7 törzs, DSM 5527.
- 13. Antigén, azzal jellemezve, hogy valamely, 1-5. igénypontok bármelyike szerinti, OspA elleni antitesttel immunológiai reakciót ad és az alábbi aminosav szekvenciát vagy e szekvenciából egy immunogén epitópot tartalmaz
M K K Y L L GIGLILALIACKQN V S S L D E KNSVSVDLPGEMNV L V S K Ε K NKDGKYDLIATVDK L E L K G T SDKNNGSGVLEGVK A D K S K V KLTISDDLGQTTLE V F K E D G KTLV.SKKVTSKDKS S T Ε Ε K F NEKGEVSEKI ITRA D G T R L E YTEIKSDGSGKAKE V L K S Y V LEGTLTAEKTTLVV K E G T V T LSKNISKSGEVSVE L N D T D S SAATKKTAAWNSGT S T L T I T VNSKKTKDLVFTKE N T I T V Q QYDSNGTKLEGSAV E ITKLDEIKNALK* 14. Antigén, azzal jellemezve, hogy valamely, 1-5 igénypontok bármelyike szerinti, OspB elleni antitesttel immunológiai reakciót ad. - 15. A 13. vagy 14. igénypont szerinti antigén, azzal jellemezve, hogy az antigént kódoló DNS szekvenciát egy olyan vektor, előnyösen egy prokarióta vektor tartalmazza, amely protein expressziójára alkalmas.
- 16. A 13-15. igénypontok szerinti antigén, azzal jellemezve, hogy az egy β-galaktozidáz-fúziós protein vagy egy nem fuzionált protein.
- 17. Rekombináns DNS, azzal jellemezve, hogy egy 13. vagy 14. igénypont szerinti antigént kódol és az alábbi nukleinsav szekvenciát tartalmazza atgaaaaaatatttattgggaataggtctaatattagccttaatagcatgtaagcaaaatHU 211 228 A9 gttagcagccttgacgagaaaaacagcgtttcag tagat ttgcctggtgaaatgaaogtt cttgtaagcaaagaaaaaaacaaagacggcaagtacgatctaattgcaacagtagacaag cttgagcttaaaggaacttctgataaaaacaatggatctggagtacttgaaggcgtaaaa gctgacaaaagtaaagtaaaattaacaatttctgacgatctaggtcaaaccacacttgaa gttttcaaagaagacggcaaaacactagtatcaaaaaaagtaacttccaaagacaagtca tcaacagaagaaaaattcaatgaaaaaggtgaagtatctgaaaaaataataacaagagca gacggaaccagacctgaatacacagaaattaaaagcgatggatctggaaaagctaaagag gttttaaaaagctatgttcttgaaggaactttaactgctgaaaaaacaacattggtggtt aaagaaggaactgttactttaagcaaaaatatttcaaaatctgggaagtttcagttgaa cttaatgacactgacagtagtgctgctactaaaaaaactgcagcttggaattcaggcact tcaactttaacaattactgtaaacagtaaaaaaactaaagaccttgtgtttacaaaagaa aacacaattacagtacaacaatacgactcaaatggcaccaaattagaggggtcagcagtt gaaattacaaaacttgatgaaattaaaaacgctttaaaataa
- 18. Rekombináns vektor, azzal jellemezve, hogy egy 17. igénypont szerinti rekombináns DNS egy vagy több másolatát tartalmazza.
- 19. A 18. igénypont szerinti rekombináns vektor, azzal jellemezve, hogy az egy prokarióta vektor.
- 20. A 19. igénypont szerinti rekombináns vektor, azzal jellemezve, hogy az egy plazmid.
- 21. ApZS7/31-2 rekombináns vektor (DSM 5528).
- 22. Eljárás a 13-16. igénypontok bármelyike szerinti antigének kinyerésére, azzal jellemezve, hogy egy B. burgdorferi génbankot egy vagy több, az 1-5. igénypontok valamelyike szerinti antitesttel átvizsgálunk és azt a kiónt izoláljuk, amelyik az antitesttel vagy antitestekkel pozitív immunológiai reakciót ad.
- 23. Lyme-kór elleni aktív oltóanyag, azzal jellemezve, hogy egy vagy több antigént tartalmaz és az említett antigének egy, az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti, OspA vagy OspB elleni antitesttel immunológiai reakciót adnak.
- 24. A 23. igénypont szerinti oltóanyag, azzal jellemezve, hogy az antigént géntechnológiai eljárással állítjuk elő.
- 25. Eljárás Lyme-kór elleni oltóanyag előállítására, azzal jellemezve, hogy kísérleti állatokat, előnyösen egereket valamely, a 13-16. igénypontok bármelyike szerinti antigénnel immunizálunk és az immunizált állatból a szokásos módon OspA vagy/és OspB elleni protektív poliklonális vagy monoklonális antitesteket veszünk le.
- 26. Eljárás patogén B. burgdorferi mikroorganizmusok izolálására és kitenyésztésére, azzal jellemezve, hogy az immunhiányos kísérleti állatokból, előnyösen egerekből, amelyeket előzőleg a kórokozóval megfertőztünk, a kórokozót úgy izoláljuk, hogy a kórokozó patogenitása megmaradjon.
- 27. A 26. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy patogén B. burgdorferi ZS7 mikroorganizmusokat tenyésztünk ki megfertőzött Scid-egerek véréből vagy/és ízületeiből.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3931236 | 1989-09-19 | ||
| DE4015911A DE4015911A1 (de) | 1989-09-19 | 1990-05-17 | Impfstoff gegen die lyme-krankheit |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU211228A9 true HU211228A9 (en) | 1995-11-28 |
Family
ID=25885304
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU905816A HU212716B (en) | 1989-09-19 | 1990-09-07 | Method for the preparation of vaccine against lyme disease |
| HU95P/P00108P HU211228A9 (en) | 1989-09-19 | 1995-04-24 | Vaccine against lyme disease |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU905816A HU212716B (en) | 1989-09-19 | 1990-09-07 | Method for the preparation of vaccine against lyme disease |
Country Status (24)
| Country | Link |
|---|---|
| US (6) | US5178859A (hu) |
| EP (5) | EP0633028B1 (hu) |
| JP (3) | JP3205932B2 (hu) |
| KR (2) | KR100205462B1 (hu) |
| AT (4) | ATE186646T1 (hu) |
| AU (1) | AU651560B2 (hu) |
| CA (1) | CA2025597C (hu) |
| CZ (2) | CZ284616B6 (hu) |
| DE (5) | DE4015911A1 (hu) |
| DK (4) | DK0418827T3 (hu) |
| ES (4) | ES2145077T3 (hu) |
| FI (1) | FI102248B (hu) |
| GR (3) | GR3018995T3 (hu) |
| HK (2) | HK1002405A1 (hu) |
| HR (1) | HRP940545B1 (hu) |
| HU (2) | HU212716B (hu) |
| IE (1) | IE903377A1 (hu) |
| NO (2) | NO311767B1 (hu) |
| NZ (1) | NZ235260A (hu) |
| PL (2) | PL170229B1 (hu) |
| PT (1) | PT95349B (hu) |
| SI (1) | SI9011773B (hu) |
| SK (3) | SK283088B6 (hu) |
| YU (2) | YU48250B (hu) |
Families Citing this family (45)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK590288D0 (da) * | 1988-10-24 | 1988-10-24 | Symbicom Ab | Kemiske forbindelser |
| US7094391B1 (en) * | 1988-10-24 | 2006-08-22 | The University Of Texas System | Compositions and methods for administering Borrelia burgdorferi antigens |
| US5777095A (en) * | 1988-10-24 | 1998-07-07 | Symbicom Aktiebolag | Osp A and B Sequence of Borrelia burgdonferi strains ACA1 and IP90 |
| US6143872A (en) * | 1988-10-24 | 2000-11-07 | Symbicom Aktiebolag | Borrelia burdorferi Osp A and B proteins and immunogenic peptides |
| DE4015911A1 (de) * | 1989-09-19 | 1991-03-28 | Max Planck Gesellschaft | Impfstoff gegen die lyme-krankheit |
| US5582829A (en) * | 1990-04-05 | 1996-12-10 | Rx Technologies, Inc. | Sonicated borrelia burgdorferi vaccine |
| JPH06501382A (ja) | 1990-06-15 | 1994-02-17 | エール ユニバーシティ | ライム病の予防および診断に用いる組成物および方法 |
| EP0465204B1 (en) * | 1990-07-06 | 2000-09-20 | American Home Products Corporation | Vaccine against Lyme disease |
| CA2057536C (en) * | 1990-12-21 | 1999-10-26 | John J. Dunn | Cloning and expression of borrelia lipoproteins |
| US6221363B1 (en) * | 1991-07-11 | 2001-04-24 | Baxter Aktiengesellschaft | Vaccine for the prevention of lyme disease |
| US6872550B1 (en) | 1991-07-11 | 2005-03-29 | Baxter Vaccine Ag | Immunogenic formulation of OspC antigen vaccines for the prevention and treatment of lyme disease and recombinant methods for the preparation of such antigens |
| US6676942B1 (en) | 1991-08-15 | 2004-01-13 | Smithkline Beecham Biologicals (S.A.) | Osp a proteins of Borrelia burgdorferi subgroups, encoding genes and vaccines |
| EP0878545A3 (en) * | 1991-08-15 | 1998-12-16 | SMITHKLINE BEECHAM BIOLOGICALS s.a. | OSP a protein of borrelia burgdorferi subgroups, encoding genes and vaccines |
| EP0620860A4 (en) * | 1991-10-18 | 1997-05-02 | Connaught Lab | Preparation of recombinant borrelia proteins. |
| AU2903892A (en) * | 1991-10-22 | 1993-05-21 | Symbicom Aktiebolag | Improvement in (borrelia burgdorferi) diagnosis and prophylaxis |
| US6303129B1 (en) * | 1992-07-28 | 2001-10-16 | Rx Technologies | Production of borrelia burgdorferi vaccine, product produced thereby and method of use |
| US5656451A (en) * | 1993-07-30 | 1997-08-12 | Yale University | OspE, OspF, and S1 polypeptides in borrelia burgdorferi |
| US6716591B1 (en) | 1993-07-30 | 2004-04-06 | Yale University | B. burgdorferi polypeptides |
| US7008625B2 (en) | 1993-11-01 | 2006-03-07 | Research Foundation Of The State University Of New York | Recombinant constructs of Borrelia burgdorferi |
| US5558993A (en) * | 1994-06-17 | 1996-09-24 | The Regents Of The University Of California | Cloned Borrelia burgdorferi virulence protein |
| GB9511909D0 (en) * | 1995-06-12 | 1995-08-09 | Microbiological Res Authority | Vaccine |
| ATE301716T1 (de) * | 1996-02-21 | 2005-08-15 | Univ Texas | Vmp-ähnliche sequenzen von pathogener borrelia |
| DE19632862B4 (de) * | 1996-08-14 | 2006-08-03 | Mikrogen Molekularbiologische Entwicklungs-Gmbh | Immunologisch aktive Proteine von Borrelia burgdorferi, dafür kodierende Nukleinsäuren sowie deren Verwendung in Testkits und als Impfstoffe |
| US6458555B1 (en) * | 1996-08-21 | 2002-10-01 | Gerd Bach | Cytologic method of examining mucous membranes |
| US6060082A (en) * | 1997-04-18 | 2000-05-09 | Massachusetts Institute Of Technology | Polymerized liposomes targeted to M cells and useful for oral or mucosal drug delivery |
| DE19740735A1 (de) * | 1997-09-16 | 1999-03-18 | Max Planck Gesellschaft | Arzneimittel zur Therapie einer manifesten Lyme-Borreliose |
| US6306623B1 (en) | 1998-02-24 | 2001-10-23 | The University Of California | Leptospiral major outer membrane protein LipL32 |
| ATE386805T1 (de) | 1998-07-31 | 2008-03-15 | Gundersen Lutheran Medical Fou | Verwendungen eines borreliaziden epitops des aussermembranproteins c von borrelia burgdorferi (ospc) als impstoff |
| WO2000056298A2 (en) * | 1999-03-19 | 2000-09-28 | Luitpold Pharmaceuticals, Inc. | Treatment of lyme disease with polysulfated glycosaminoglycan formulations |
| US6592875B1 (en) | 1999-06-21 | 2003-07-15 | Milkhaus Laboratory, Inc. | Method for treatment of lyme disease |
| WO2002016421A2 (en) | 2000-08-18 | 2002-02-28 | Research Foundation Of The State University Of New York | Altered ospa of borrelia burgdorferi |
| EP1572714A4 (en) | 2002-12-20 | 2006-08-09 | Univ Texas | SEQUENCES OF SPECIES AND STRAINS OF I BORRELIA / I PATHOGENIC VMP TYPE |
| KR101192127B1 (ko) | 2006-11-03 | 2012-10-17 | 쉐링-프라우 리미티드 | 개 라임병 백신 |
| WO2008116468A2 (en) | 2007-03-26 | 2008-10-02 | Dako Denmark A/S | Mhc peptide complexes and uses thereof in infectious diseases |
| EP3023436A1 (en) | 2007-07-03 | 2016-05-25 | Dako Denmark A/S | Improved methods for generation, labeling and use of mhc multimers |
| EP2197908A2 (en) | 2007-09-27 | 2010-06-23 | Dako Denmark A/S | Mhc multimers in tuberculosis diagnostics, vaccine and therapeutics |
| US10968269B1 (en) | 2008-02-28 | 2021-04-06 | Agilent Technologies, Inc. | MHC multimers in borrelia diagnostics and disease |
| WO2010009735A2 (en) | 2008-07-23 | 2010-01-28 | Dako Denmark A/S | Combinatorial analysis and repair |
| GB0817244D0 (en) | 2008-09-20 | 2008-10-29 | Univ Cardiff | Use of a protein kinase inhibitor to detect immune cells, such as T cells |
| US10369204B2 (en) | 2008-10-02 | 2019-08-06 | Dako Denmark A/S | Molecular vaccines for infectious disease |
| US11992518B2 (en) | 2008-10-02 | 2024-05-28 | Agilent Technologies, Inc. | Molecular vaccines for infectious disease |
| EP2501719B1 (en) * | 2009-11-17 | 2015-11-04 | Abaxis, Inc. | Peptides and methods for the detection of lyme disease antibodies |
| US8758772B2 (en) | 2011-11-04 | 2014-06-24 | Abaxis, Inc. | Peptides and methods for the detection of lyme disease antibodies |
| PL223175B1 (pl) | 2012-10-22 | 2016-10-31 | Inst Chemii Bioorganicznej Polskiej Akademii Nauk | Szczepionka przeciw boreliozie, konstrukt genetyczny, rekombinowane białko, sposób otrzymywania konstruktu genetycznego, sposób otrzymywania szczepionki, sposób otrzymywania rekombinowanych białek, zastosowanie rekombinowanych białek do wytwarzania szczepionki przeciwko boreliozie |
| US9610336B1 (en) * | 2014-07-16 | 2017-04-04 | Amiram Katz | Immunotherapy for lyme disease |
Family Cites Families (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK590288D0 (da) * | 1988-10-24 | 1988-10-24 | Symbicom Ab | Kemiske forbindelser |
| US4772464A (en) | 1985-08-01 | 1988-09-20 | Miles Laboratories, Inc. | Protective antibodies to serotypic determinants of flagellar antigens |
| US4888276A (en) * | 1986-06-26 | 1989-12-19 | Minnesota Mining And Manufacturing Company | Method and composition for the diagnosis of Lyme disease |
| US4721617A (en) | 1986-08-14 | 1988-01-26 | Regents Of The University Of Minnesota | Vaccine against lyme disease |
| US5034515A (en) * | 1987-09-22 | 1991-07-23 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Staphylococcal fibronectin receptor, monoclonal antibodies thereto and methods of use |
| DE4015911A1 (de) * | 1989-09-19 | 1991-03-28 | Max Planck Gesellschaft | Impfstoff gegen die lyme-krankheit |
| DE59010422D1 (de) * | 1989-12-22 | 1996-08-22 | Mikrogen Molekularbiol Entw | Immunologisch aktive proteine von borrelia burgdorferi, zusammenhängende testkits und impfstoff |
| JPH06501382A (ja) * | 1990-06-15 | 1994-02-17 | エール ユニバーシティ | ライム病の予防および診断に用いる組成物および方法 |
| EP0465204B1 (en) * | 1990-07-06 | 2000-09-20 | American Home Products Corporation | Vaccine against Lyme disease |
| CA2057536C (en) * | 1990-12-21 | 1999-10-26 | John J. Dunn | Cloning and expression of borrelia lipoproteins |
| EP0878545A3 (en) * | 1991-08-15 | 1998-12-16 | SMITHKLINE BEECHAM BIOLOGICALS s.a. | OSP a protein of borrelia burgdorferi subgroups, encoding genes and vaccines |
| JP3246603B2 (ja) * | 1991-08-27 | 2002-01-15 | ノボザイムス アクティーゼルスカブ | 洗 剤 |
| EP0620860A4 (en) * | 1991-10-18 | 1997-05-02 | Connaught Lab | Preparation of recombinant borrelia proteins. |
| AU681572B2 (en) * | 1991-10-21 | 1997-09-04 | Med Immune, Inc. | Bacterial expression vectors containing DNA encoding secretion signals of lipoproteins |
-
1990
- 1990-05-17 DE DE4015911A patent/DE4015911A1/de not_active Withdrawn
- 1990-09-07 HU HU905816A patent/HU212716B/hu not_active IP Right Cessation
- 1990-09-11 NZ NZ235260A patent/NZ235260A/xx unknown
- 1990-09-12 AU AU62444/90A patent/AU651560B2/en not_active Ceased
- 1990-09-18 NO NO19904062A patent/NO311767B1/no unknown
- 1990-09-18 EP EP94112145A patent/EP0633028B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-09-18 ES ES94112144T patent/ES2145077T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-09-18 EP EP94112143A patent/EP0643974B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-09-18 DE DE59010863T patent/DE59010863D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-09-18 SI SI9011773A patent/SI9011773B/sl not_active IP Right Cessation
- 1990-09-18 ES ES94112143T patent/ES2129551T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-09-18 FI FI904597A patent/FI102248B/fi not_active IP Right Cessation
- 1990-09-18 PL PL90307358A patent/PL170229B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1990-09-18 AT AT94112145T patent/ATE186646T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-09-18 PL PL90286918A patent/PL169804B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1990-09-18 DK DK90117943.2T patent/DK0418827T3/da active
- 1990-09-18 YU YU177390A patent/YU48250B/sh unknown
- 1990-09-18 AT AT90117943T patent/ATE131732T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-09-18 AT AT94112143T patent/ATE175576T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-09-18 DK DK94112145T patent/DK0633028T3/da active
- 1990-09-18 DE DE59009978T patent/DE59009978D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-09-18 DE DE59010903T patent/DE59010903D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-09-18 ES ES90117943T patent/ES2082812T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-09-18 EP EP94112144A patent/EP0633313B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-09-18 DE DE59010888T patent/DE59010888D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-09-18 ES ES94112145T patent/ES2141182T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-09-18 EP EP98105444A patent/EP0861664A3/de not_active Withdrawn
- 1990-09-18 AT AT94112144T patent/ATE191499T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-09-18 DK DK94112143T patent/DK0643974T3/da active
- 1990-09-18 DK DK94112144T patent/DK0633313T3/da active
- 1990-09-18 EP EP90117943A patent/EP0418827B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-09-18 IE IE337790A patent/IE903377A1/en not_active IP Right Cessation
- 1990-09-18 CA CA002025597A patent/CA2025597C/en not_active Expired - Fee Related
- 1990-09-19 CZ CZ95970A patent/CZ284616B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1990-09-19 SK SK1510-98A patent/SK283088B6/sk unknown
- 1990-09-19 SK SK4560-90A patent/SK280285B6/sk unknown
- 1990-09-19 KR KR1019900014814A patent/KR100205462B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1990-09-19 PT PT95349A patent/PT95349B/pt active IP Right Grant
- 1990-09-19 SK SK1511-98A patent/SK283089B6/sk unknown
- 1990-09-19 JP JP24765090A patent/JP3205932B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1990-09-19 US US07/585,310 patent/US5178859A/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-09-19 CZ CS904560A patent/CZ284538B6/cs not_active IP Right Cessation
-
1993
- 1993-05-27 US US08/068,063 patent/US5434077A/en not_active Expired - Fee Related
-
1994
- 1994-09-15 HR HR940545A patent/HRP940545B1/xx not_active IP Right Cessation
-
1995
- 1995-03-20 US US08/407,350 patent/US5686267A/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-03-20 US US08/406,623 patent/US5780030A/en not_active Expired - Fee Related
- 1995-04-24 HU HU95P/P00108P patent/HU211228A9/hu unknown
-
1996
- 1996-02-14 GR GR960400397T patent/GR3018995T3/el unknown
-
1997
- 1997-03-12 YU YU9097A patent/YU49370B/sh unknown
-
1998
- 1998-02-13 HK HK98101147A patent/HK1002405A1/xx not_active IP Right Cessation
- 1998-02-23 US US09/027,843 patent/US5856447A/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-08-29 KR KR1019980035375A patent/KR100202128B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1998-12-23 HK HK98114958A patent/HK1013620A1/xx not_active IP Right Cessation
-
1999
- 1999-10-07 US US09/413,858 patent/US6613331B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1999-11-30 GR GR990403104T patent/GR3032010T3/el unknown
-
2000
- 2000-06-14 GR GR20000401362T patent/GR3033675T3/el not_active IP Right Cessation
- 2000-07-26 JP JP2000225341A patent/JP3328644B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2000-12-11 JP JP2000376159A patent/JP3418171B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2001
- 2001-09-24 NO NO20014624A patent/NO315905B1/no unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HU211228A9 (en) | Vaccine against lyme disease | |
| US5747294A (en) | Compositions and methods for the prevention and diagnosis of lyme disease | |
| IE83320B1 (en) | Vaccine against lyme disease | |
| US5656451A (en) | OspE, OspF, and S1 polypeptides in borrelia burgdorferi | |
| US5324630A (en) | Methods and compositions for diagnosing lyme disease | |
| US5879952A (en) | 43 Kd protein vaccine and method for the production thereof | |
| US5885589A (en) | Pasteurella vaccine | |
| US6716591B1 (en) | B. burgdorferi polypeptides | |
| AU673912B2 (en) | Vaccine against lyme disease | |
| CA2324981A1 (en) | Peptides | |
| EP0492525A2 (en) | Babesial protease antigen | |
| IE83340B1 (en) | Vaccine against lyme disease |