HU212716B - Method for the preparation of vaccine against lyme disease - Google Patents
Method for the preparation of vaccine against lyme disease Download PDFInfo
- Publication number
- HU212716B HU212716B HU905816A HU581690A HU212716B HU 212716 B HU212716 B HU 212716B HU 905816 A HU905816 A HU 905816A HU 581690 A HU581690 A HU 581690A HU 212716 B HU212716 B HU 212716B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- priority
- burgdorferi
- cells
- producing
- september
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 31
- 208000016604 Lyme disease Diseases 0.000 title claims description 30
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims description 26
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 12
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 claims description 59
- 241000589969 Borreliella burgdorferi Species 0.000 claims description 52
- 108700006640 OspA Proteins 0.000 claims description 47
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 45
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 45
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 45
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 38
- 241000448699 Borrelia burgdorferi ZS7 Species 0.000 claims description 28
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 19
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 claims description 17
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 claims description 16
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims description 13
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 13
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 12
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 12
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 10
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 9
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 9
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 9
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 9
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 8
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 8
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 8
- 238000002649 immunization Methods 0.000 claims description 7
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 5
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 5
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 5
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 4
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 4
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 claims description 3
- 241000831652 Salinivibrio sharmensis Species 0.000 claims description 3
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 claims description 3
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 claims description 3
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 claims description 3
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 claims description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 claims 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 claims 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 claims 1
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 18
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 17
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 17
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 16
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 15
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 13
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 12
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 12
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 12
- 210000001503 joint Anatomy 0.000 description 12
- 206010062746 Carditis Diseases 0.000 description 9
- 208000009525 Myocarditis Diseases 0.000 description 8
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- 208000021646 inflammation of heart layer Diseases 0.000 description 8
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 8
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 241001180364 Spirochaetes Species 0.000 description 7
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 7
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 7
- 108010040721 Flagellin Proteins 0.000 description 6
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 6
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 6
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 6
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 6
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 6
- 241000276440 Borrelia burgdorferi B31 Species 0.000 description 5
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 5
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 4
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 4
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 4
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 4
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 4
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 4
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 4
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 4
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 4
- 241000238876 Acari Species 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 3
- 238000002738 Giemsa staining Methods 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 3
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 3
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 3
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 3
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 3
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 3
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 3
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 3
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 210000004165 myocardium Anatomy 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 229940099789 ospa protein Drugs 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 3
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 2
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 2
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 2
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 2
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011579 SCID mouse model Methods 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 210000004081 cilia Anatomy 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 238000005534 hematocrit Methods 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 2
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 2
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 2
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 2
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 2
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 2
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 210000003516 pericardium Anatomy 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CTSLUCNDVMMDHG-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-3-(butan-2-yl)-6-methylpyrimidine-2,4(1H,3H)-dione Chemical compound CCC(C)N1C(=O)NC(C)=C(Br)C1=O CTSLUCNDVMMDHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001552669 Adonis annua Species 0.000 description 1
- 241000589968 Borrelia Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 235000008730 Ficus carica Nutrition 0.000 description 1
- 244000025361 Ficus carica Species 0.000 description 1
- GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N Fluorouracil Chemical compound FC1=CNC(=O)NC1=O GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 241000238681 Ixodes Species 0.000 description 1
- 241001480843 Ixodes ricinus Species 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-M Methacrylate Chemical compound CC(=C)C([O-])=O CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108020002230 Pancreatic Ribonuclease Proteins 0.000 description 1
- 102000005891 Pancreatic ribonuclease Human genes 0.000 description 1
- 206010034464 Periarthritis Diseases 0.000 description 1
- 108010090127 Periplasmic Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010036030 Polyarthritis Diseases 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000589973 Spirochaeta Species 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N [4-(4-hydrazinylphenyl)phenyl]hydrazine Chemical compound C1=CC(NN)=CC=C1C1=CC=C(NN)C=C1 SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 229940019748 antifibrinolytic proteinase inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 230000002917 arthritic effect Effects 0.000 description 1
- PXXJHWLDUBFPOL-UHFFFAOYSA-N benzamidine Chemical compound NC(=N)C1=CC=CC=C1 PXXJHWLDUBFPOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000009640 blood culture Methods 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- WHLPIOPUASGRQN-UHFFFAOYSA-N butyl 2-methylprop-2-enoate;methyl 2-methylprop-2-enoate Chemical compound COC(=O)C(C)=C.CCCCOC(=O)C(C)=C WHLPIOPUASGRQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N chloroform;phenol Chemical compound ClC(Cl)Cl.OC1=CC=CC=C1 YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 239000012050 conventional carrier Substances 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 229940009976 deoxycholate Drugs 0.000 description 1
- KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N deoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 210000001174 endocardium Anatomy 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 230000003628 erosive effect Effects 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000001400 expression cloning Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000009313 farming Methods 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002949 fluorouracil Drugs 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000033687 granuloma formation Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000000521 hyperimmunizing effect Effects 0.000 description 1
- 206010020718 hyperplasia Diseases 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 description 1
- 210000002346 musculoskeletal system Anatomy 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 201000008482 osteoarthritis Diseases 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 210000001428 peripheral nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 208000030428 polyarticular arthritis Diseases 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 210000003240 portal vein Anatomy 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000009589 serological test Methods 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 210000003699 striated muscle Anatomy 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 210000002437 synoviocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000009281 ultraviolet germicidal irradiation Methods 0.000 description 1
- 210000005166 vasculature Anatomy 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/20—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Spirochaetales (O), e.g. Treponema, Leptospira
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
- C07K16/1203—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria
- C07K16/1207—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria from Spirochaetales (O), e.g. Treponema, Leptospira
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
A találmány szerint Lyme-kór elleni aktív és passzív oltóanyagot állítanak elő oly módon, hogy a B. burgdorferi OspA és/vagy OspB antigénjére specifikus monoklonális antitestet termelő hibridóma sejtvonalat állítanak elő, ezzel antitestet termelnek és ezt vakciná(73) Szabadalmasok:
Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des Öffentlichen Rechts, Heidelberg (DE) Max-Planck Gesellschaft zűr Förderung dér Wissenschaften e.V., Göttingen (DE) (74) Képviselő:
Gödölle, Kékes, Mészáros & Szabó Szabadalmi és Védjegy Iroda, Budapest oltóanyag előállítására vá alakítják. A találmány tárgyát képezi a monoklonális sejtvonal és rekombináns antigén előállítására, valamint a patogén B. burgdorferi ZS7 mikroorganizmus törzs izolálására szolgáló eljárás is.
A leírás terjedelme: 12 oldal (ezen belül 2 lap ábra)
HU 212 716 B
HU 212 716 Β
A Lyme-borreliózis a leggyakoribb, kullancsok által terjesztett mérsékelt égövi fertőzőbetegség, amelyet a spirochaeták családjához tartozó Borrelia burgdorferi okoz és ezt főleg az Ixodes törzshöz tartozó kullancs viszi át az emberre. A betegség egy krónikus, progresszív fertőző megbetegedés, amely több szervet támad meg, így a bőrt, a központi és perifériás idegrendszert, a szívet, a májat, a vesét és az izom-csont rendszert. Mivel a betegség megbízható kezelése antibiotikum terápiával nehézkes, jelenleg nagy erőfeszítéssel kutatják magát a kórokozót és az immunválaszt, amelyet a gazdaszervezet ad a B. burgdorferi fertőzésre. Megállapították, hogy bár a Lyme-kórban szenvedő egyénekben a B. burgdorferi elleni antitestek titere magas, ez azonban semmilyen védelmet nem nyújt a fertőzéssel szemben. Feltehető, hogy a kórokozó a vérpályából igen gyorsan átlép a szövetekbe, ahol az immunrendszer számára már többé közvetlenül nem érhető el. Ez azt jelenti, hogy az antitestek nyújtotta védelem csak közvetlenül a fertőzés kezdete után hatásos, azaz addig, amíg a kórokozó az érpályában tartózkodik.
Az a tény, hogy a B. burgdorferi-vei való természetes fertőzöttség különböző állatfajtákban megtalálható, olyan próbálkozáshoz vezetett, amely szerint laboratóriumi modelleket dolgoztak ki a Lyme-kór részére. Ezek azonban csak korlátozott eredménnyel jártak. Olyan kísérletekben, amelyeknek az volt a céljuk, hogy egérben a B. burgdorferi-re specifikus immunválaszt váltsanak ki, azt találták, hogy beltenyésztett egér törzsekben egy már hosszú ideje tenyésztett izolált B. burgdorferi-vel való fertőzés enyhe, de szignifikáns olyan patomorfológiai elváltozásokhoz vezet a különböző szervekben, így az agyban, szívben, tüdőben és a vesékben, amelyekhez hasonlókat a Lyme-kóros betegekben lehetett megfigyelni [Schaible és munkatársai, Infect. Immun., 1., 41. (1988)].
A komolyabb kórkép kialakulását az állatoknál valószínűleg vagy a gazdaszervezet védekező immunrendszere akadályozta meg, vagy az, hogy a hosszabb ideig in vitro tenyésztett spirochaeták virulenciája lecsökkent [Johnson és munkatársai, J. Clin. Mierobiol., 20., 747. (1984) ; Schwan és munkatársai, Infect. Immun., 56., 1837.(1988)].
A találmány alapfeladata egy Lyme-kór elleni hatékony oltóanyag előállítása. Ehhez mindenekelőtt alkalmas laboratóriumi állat-modellre van szükség. Ezért javasoljuk egy funkcióképes T és B sejt hiányos egér törzs, az úgynevezett Scid-egér [Bosma és munkatársai, Natúré, 10., 52. (1983)] kísérleti állatként való alkalmazását, ugyanis izolált patogén B. burgdorferi törzzsel fertőzött Scid-egereknél sokszisztémás betegség alakul ki, mégpedig főként polyarthritis és carditis. Ezzel az állatmodellel vált először lehetővé a Lymekór elleni oltóanyagok hatásának a kipróbálása.
A találmány tárgyát egy olyan Lyme-kór elleni passzív oltóanyag képezi, amely egy vagy több, a B. burgdorferi 31 kD antigénjére (OspA) vagy/és 34 kD antigénjére (OspB), főként pedig a B. burgdorferi B31 (ATCC 35 210) vagy/és ZS7 (DSM 5527) törzsének
OspA vagy/és OspB antigénjére specifikus monoklonális antitestet tartalmaz.
Az OspA és OspB felületi antigéneket, ezek klónozását pBR322 plazmidba és az ezek elleni monoklonális antitesteket a Microbiology, 1986., 35-38. irodalmi helyen ismertetik. Ugyanitt leírják az OspA és OspB antigének aminosavszekvenciáját is. A Mól. Microbíol., 3(4)., 479-486. (1989) az OspA és OspB gén klónozását és szekvenálását ismerteti. Az EP 252 641 számú közrebocsátási iratban a 31 kD-os és 34 kD-os antigénre specifikus hibridóma módszerrel termelt monoklonális antitestet ismertetnek, amely antigén-antitest komplex képzésére képes. A J. Clin, Invest., 84., (1), 322-330. (1989) irodalmi helyen az endoflagellin antigént, a Nucleic Acids Rés., 17., (9), 3590. (1989) helyen pedig a B31 törzs flagellint írják le.
Az irodalomból azonban nem ismert, hogy a B. burgdorferi OspA és OspB antigénjére specifikus monoklonális antitestek Lyme-kór elleni passzív oltóanyag készítésre alkalmasak.
A találmány tehát eljárást nyújt Lyme-kór elleni passzív oltóanyag előállítására a B. burgdorferi OspA és/vagy OspB antigénjére specifikus monoklonális antitest felhasználásával. Az olyan oltóanyag az előnyös, amely egy IgG osztályba tartozó, találmány szerinti antitestet tartalmaz. Különösen előnyösek az IgG2b vagy IgGl alosztálybeli antitestek. Elő patogén B. burgdorferi sejtekkel, előnyösen B. burgdorferi ZS7 sejtekkel megfertőzött kísérleti állatoknál, előnyösen Scid-egereknél a találmány szerinti antitest adása ellentétben egy más antitest adásával, például a B. burgdorferi 41 kD antigénjére (flagellin) elleni antitest adásával - az arthritis, carditis és hepatitis kifejlődését meglepő módon teljesen vagy legalábbis nagymértékben gátolja.
A találmány szerinti oltóanyag adott esetben a hatóanyag antitest mellett még a szokásos vivő-, töltő- és segédanyagokat is tartalmazhatja.
A találmány tárgyát képezi továbbá egy eljárás Lyme-kór elleni passzív oltóanyag előállítására B. burgdorferi sejtekkel vagy részeivel, előnyösen teljes B. burgdorferi B31 és/vagy ZS7 sejtekkel immunizált kísérleti állat, előnyösen egér limfociták vagy lépsejtek felhasználása révén, amikoris az immunizált állat limfocitáiból vagy lépsejteiből sejtfúzióval olyan hibridomát állítunk elő, amely egy találmány szerinti monoklonális antitestet termel.
A találmány további tárgyát képezi egy olyan hibridoma sejtvonal (ECACC 89 091 302) is, amely a találmány szerinti AspA elleni LA-2 antitestet (IgG2b) termeli. Vonatkozik a találmány az OspA elleni LA26.1 antitest (IgGl) termelő hidridóma sejtvonalra (ECACC 90 050 406) is, valamint az OspB elleni LA25.1, illetve LA-27.1 antitest (IgG2b, illetve IgGl) termelő ECACC 90 050 405, illetve ECACC 90 050 407 hibridóma sejtvonalakra.
A találmány tárgyát képezi a patogén B. burgdorferi ZS7 törzs is (DSM 5527).
- (ECACC = European Collection of Animál Cell Cultures;
HU 212 716 B
DSM = Deutsche Sammlung von Mikroorganismen) Vonatkozik továbbá a találmány egy olyan antigénre, amely egy találmány szerinti monoklonális antitesttel immunológiai reakcióba lép. Ezalatt egy olyan antigén értendő, amely az OspA, illetve az OspB teljes aminosav szekvenciáját vagy az OspA-ból, illetve az OspB-ből csak egy immunogénként ható rész-szekvenciát (immunogén epitóp) tartalmaz. Egy szakember nehézség nélkül meg tudja határozni ezen proteinek immunogén epitópjait az OspA-protein szerkezetének analízise (ilyen például a Chou-Fassmann analízis) révén, majd kísérletileg meghatározhatja a hatásosságukat.
A találmány egy lényeges tárgyát egy olyan rekombináns antigén képezi, amely a találmány szerinti antitesttel immunológiailag reagál, és az antigént kódoló DNS szekvenciát egy rekombináns vektor, előnyösen egy olyan prokarióta vektor tartalmazza, amely alkalmas proteinek expressziójára.
Atalálmány különösen a B. burgdorferi ZS7-ből származó antigénre vonatkozik, amely a találmány szerinti antitesttel immunológiai reakcióba lép és amely az 1. ábrán bemutatott aminosav szekvenciát vagy ebből a szekvenciából egy immunogén epitópot tartalmaz. Eszerint a találmány egy olyan rekombináns DNS-re is vonatkozik, amely (1) az 1. ábrán bemutatott szekvenciát tartalmazza, (2) a genetikai kód degenerációja keretén belül egy ennek megfelelő nukleinsav szekvenciát vagy (3) és (l)-ből és/vagy (2)-ből származó egy szekvenciával szigorúan meghatározott feltételek között hibridizáló szekvenciát tartalmaz, amely a B. burgdorferi ZS7 31 kD antigénjét vagy ennek egy immunogén epitópját kódolja. A „szigorúan meghatározott feltételek” fogalmának meghatározását lásd Maniatis és munkatársai,Molecular Cloning” c. munkájában [A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1982)].
Különösen előnyös találmány szerinti antigén a rekombináns nem fúziós protein vagy a β-galaktozidázfúziós protein.
Foglalkozik továbbá a találmány olyan rekombináns vektorral is, amely a találmány szerinti DNS egy vagy több másolatát tartalmazza. A találmány szerinti vektor, előnyösen prokarióta vektor. A rekombináns vektor a gazdasejtben extrakromoszómálisan helyezkedik el (például egy plazmid) vagy a gazdasejt genomjába integrálódhat (például a lambda bakteriofág). A találmány szerinti vektor előnyösen egy plazmid. Különösen előnybe helyezzük a pZS-7/31-2 vektort (DSM 5528).
A találmány tárgya eljárás találmány szerinti antigének előállítására olyan módon, hogy egy B. burgdorferi génbankot egy vagy több találmány szerinti antitesttel átvizsgálunk és ezután azokat a kiónokat izoláljuk, amelyek az alkalmazott antitestekkel pozitív immunreakciót adnak.
Minthogy egy találmány szerinti antigén maga is felhasználható aktív immunizálásra, azaz antitest képzés redukálására a szervezetben, így a találmány magában foglal egy olyan Lyme-kór elleni aktív oltóanyagot, amely hatóanyagként egy találmány szerinti antigént tartalmaz, adott esetben a szokásos vivő-, töltő- és segédanyagokkal. Az előnyös kivitelezési eljárás szerint a találmány szerinti antigént géntechnológiai úton állítjuk elő.
Valóban igazoltuk, hogy a normál egerekben adott natív, illetve rekombináns OspA olyan proteku'v (védő) antitestek képződését indukálja, amelyek Scid-egerekbe való passzív átvitel után a Lyme-borreliózis ellen védnek. Megállapítottuk mindenekelőtt, hogy a rekombináns OspA a natív OspA-hoz hasonlóan protektív immunválaszt indukál, s így az emberek Lyme-borreliózisa elleni vakcinához sokat ígérő jelöltként jön számításba.
A találmány további tárgyát képezi egy Lyme-kór elleni passzív oltóanyag előállítására szolgáló eljárás, amikoris kísérleti állatokat, előnyösen egereket immunizálunk egy találmány szerinti antigénnel és az immunizált kísérleti állatból, a szokásos módon, protektív poliklonális vagy monoklonális antitesteket izolálunk.
Végül a találmány tárgyal még egy eljárást patogén B. burgdorferi mikroorganizmusok izolálására és kitenyésztésére. Erre az eljárásra jellemző, hogy a kórokozóval előzőleg megfertőzött immunhiányos kísérleti állatokból, előnyösen egerekből, a kórokozót izoláljuk és a kórokozó patogenitása megmarad. Különösen előnyös egy olyan eljárás, amikor a fertőzött Scid-egerek véréből és/vagy ízületeiből tenyésztjük ki a patogén B. burgdorferi ZS7 (DSM 5527) mikroorganizmust.
A találmányt a következő példákon keresztül és az
1. és 2. ábra segítségével ismertetjük, ugyanakkor ezekkel nem korlátozzuk a találmány oltalmi körét.
Az alábbiakban az ábrák leírása következik. Az
1. ábra a B. burgdorferi ZS7 31 kD antigénjének (OspA) DNS és aminosav szekvenciáját mutatja be. A
2. ábrán az rZS7/31-2 rekombináns protein immunológiai jellemzése látható.
1. példa
Arthritis, carditis és hepatitis előidézése Scid-egerekben B. burgdorferi ZS7 törzzsel való fertőzéssel Az egerek kezelése B. burgdorferi-vel
C.B-17 Scid törzsből (Scid-mutáció szempontjából homozigóta) és C.B-17 törzsből származó kifejlett egereket lxl05, 5x105, lxlO6 vagy lxlO8 élő vagy elölt (UV-besugárzás) B. burgdorferi sejttel oltunk be szubkután a farok tövénél.
B. burgdorferi izolálása kullancsból és egerekből
A kísérleteket a már hosszú ideje tenyésztett B. burgdorferi B31 törzzsel (ATCC 35 210) és a frissen izolált - nőstény Ixodes ricinus kullancsból izolált B. burgdorferi ZS7 (DSM 5527) törzzsel végeztük. Mindegyik B. burgdorferi törzset módosított Kelly táptalajban tenyésztettük [Barbour és munkatársai, Curr. Microbiol., 8., 123. (1983) Svájc], Az etanollal sterilizált kullancs vékonybeléből vagy a befertőzött egerek véréből izolált B. burgdorferi sejteket kezdetben 8 gg/ml kanamicinnel és 230 μg/ml fluor-uracillal kiegészített Kelly táptalajban tenyésztettük [Johnson és munkatársai, J. Clin. Microbiol., 1., 81. (1984)].
HU 212716 Β
Szerológiai vizsgálatok
A B. burgdorferi specifikus antitestek kimutatását hagyományos ELISA eljárással végezzük [Justus és munkatársai, Wehrmed. Mschr., 32., 263. (1988)]. Az immunoglobulin (lg) tartalom standard görbéjét úgy kapjuk meg. hogy a csészét anti-egér Ig-vel [Paesel féle szérum (Frankfurt, NSZK) 1:500 hígításban] töltünk meg és titráljuk a teljes egér IgG vagy IgM tartalmat (Calbiochem, La Jolla, USA). Az ossz szérum IgM és IgG mérése hasonlóan történik. A B. burgdorferi specifikus IgM vagy IgG antitest koncentrációt lg pg/szérum ml-ben adjuk meg.
Immunfluoreszcencia és Giemsa festés μΐ vért pipettázunk egy hematokrit csövecskébe (Becton és Dickinson, Heidelberg, NSZK) és 5000 g mellett hematokrit centrifugában (ECCO, NSZK) lecentrifugáljuk. A csövecskéket a szérum és vörösvérsejt határrétegénél átvágjuk és a szérumból 5 pl-t tárgylemezre visszük (Superior, Bad Mergentheim, NSZK). A szérum mintákat tartalmazó tárgylemezeket levegőn megszárítjuk és 100%-os etanolban 1 percig -20 ”C-on fixáljuk. A tárgylemezeket ezután 1 órán át nyúl anti-B. burgdorferi hiperimmun szérummal (1:100 hígítás) inkubáljuk szobahőmérsékleten, majd ötször mossuk PBS-ben és ezután FITC-el konjugált kecske anti-nyúl antiszérummal (1:20 hígítás: Jackson Láb., West Grove, USA) festjük 1 órán át. A tárgylemezeket mossuk, Kaiser-féle glicerinzselatin-ba (Merck, Darmstadt, NSZK) beágyazzuk, majd rögtön fluoreszcens mikroszkóp alatt vizsgáljuk. A kezeletlen vércseppeket levegőn megszárítjuk, metanolban fixáljuk, Giemsa oldattal (0,1%; Merck. Darmstadt, NSZK) megfestjük, PBS-sel kimossuk és entellanba (Merck, Darmstadt, NSZK) beágyazzuk.
Szövettani preparátumok készítése és festési eljárások
Előzőleg B. burgdorferi-vel fertőzött egerekből a fertőzés után különböző időpontokban különböző szerveket (agy, szív, tüdő, máj, vese, lép és ízületek) távolítunk el és/vagy folyékony nitrogénben - fagyasztott metszetek készítéséhez - vagy 5%-os formaldehidben (PBS-ben) paraffinba vagy metakrilátba való beágyazáshoz - tároljuk. Az immun-hisztológiai vizsgálatokat sztreptavidinbiotin-peroxidáz rendszerben végezzük [Kramerés munkatársai, Eur. J. Immunoi., 19., 151. (1989)].
Az 1. táblázat mutatja, hogy az izolált ZS7 és B31 B. burgdorferi mikroorganizmusokat a kísérlet egész időtartama alatt ki lehetett mutatni azoknak a Scid-egereknek a vérében, amelyeket előzőleg élő mikroorganizmusokkal oltottuk. Azonban csak a ZS7 spirochaeta törzset lehetett in vitro újból kitenyészteni, a B31 törzset nem. Az újból tenyésztésbe vont mikroorganizmusoknak a primer izolált B. burgdorferi ZS7 sejtekkel való összehasonlításakor nem lehetett megállapítani semmilyen változást a protein tartalomban vagy a plazmid-profilban. A B. burgdorferivel fertőzött Scid-egerekben a megfigyelés egész időtartama alatt vagy semmilyen vagy csak rendkívül alacsony irreleváns antitest titer volt kimutatható. Ezekben az állatokban B. burgdorferi specifikus IgM vagy IgG antitesteket nem találtunk (1. táblázat). Ezzel szemben mindegyik B. burgdorferi-vel fertőzött C.B-17 kontroll egér nagymennyiségű össz-Ig-t és magas titerű B. burgdorferi specifikus IgM és IgG antitestet termelt. AB. burgdorferi ZS7el való fertőzés után a 7. és a 20. nap között mutatták a Scid-egerek az arthritis első klinikai tüneteit (mindkét tibiotarzális ízület piros és duzzadt lett), amik idővel erősödtek. Ezzel szemben azokban a Scid-egerekben, amelyeket UV-besugárzott B. burgdorferi B31 sejtekkel fertőztünk meg és a C.B-17 kontroll egerekben, amelyeket élő B. burgdorferi ZS7 sejtekkel fertőztük meg, nem találtunk arthritis-es tüneteket. Az élő B. burgdorferi ZS7-tel megfertőzött Scid-egerekben kórszövettanilag is ki lehetett mutatni az arthritises ízületi elváltozásokat (1. táblázat). Súlyos ízületi károsodásokat állapítottunk meg, amelyeket a hiperpláziával járó gyulladásos szinoviális béléssejtek jelenléte jelzett, és ezeket a jegyeket erózió (hámhiány) és a porc-szövetek és/vagy csontok roncsolódása kísérte. Ezenkívül pancarditist állapítottunk meg, mononukleáris sejtek infiltrációjával az endocardiumban (szívbelhártyában), myocardiumban (szívizomban) és pericardiumban (szívburokban). A máj progresszív gyulladását is észleltük, amelynél a mononukleáris sejtek infiltrációja a kapuér (véna portáé) területére és a központi gyűjtőérre korlátozódott, továbbá granuloma képződéssel járó reakciókat és végül máj fibrózist észleltünk. Ezenkívül a vesékben, tüdőben, agyban és a harántcsíkolt izomzatban kisebb károsodásokat észleltünk.
1. táblázat
C.B-17 Scid-egerek és C.B-17 kontroll egerek fertőzése B. burgdorferi-vel: Spirochaeták kitenyésztése szövetekből: Antitest titer és arthritis kialakulása
| Egér törzs | Törzs | B. burgdorferi | B. burgdorferi | ||
| fertőzés- hez használt sejtszám | fertőzés után eltelt napok | észlelése vérben* | izolálá- sa* | ||
| C.B-17 Scid (n= 1) | ZS7 | 5xlO5 | 7 36 49 59 | + + + + | +B +B +B |
| ZS7 | IxlO8 | 7 23 | + + | +B | |
| ZS7 | lxlO8 | 22 29 87 | + + + | +G +B/G | |
| ZS7 | lxlO5 lxlO6 IxlO8 | 16 | n. b. n. b. + | n. b. n. b. + | |
| ZS7uv | IxlO8 | 16 | - | - | |
| B31 | lxlO8 | 22 29 | + + | - | |
| - | 22 | - | - | ||
| - | 29 | - | - |
HU 212716 Β
| Egér | Törzs | B. burgdorferi | B. burgdorferi | ||
| törzs C.B-17 (n = 7) | ZS7 | lxlO8 | 16 24 | ||
| - | - | - | - | - | |
| - | - | - | - | - |
* giemsa festéssel vagy immunfluoreszcenciával ·* izolálás vérből (B = Blut), ízületekből (G = Gelenken) + tibiotarzális ízületek pirossága és duzzanata <7,5 pg/ml szérum n. b. meghatározás nem történt
1. táblázat (folytatás)
C.B-17 Scid-egerek és C.B-17 kontroll egerek fertőzése B. burgdorferi-vel; Spirochaeták kitenyésztése szövetekből; Antitest titer és arthritis kialakulása
| Egér törzs | Törzs | Arthritis | Antitest (pg/ml)” | ||||
| klini- kai' | kór- SZÖ- vetta- ni | Ősz - szes μ | lg 7 | speci- fikus μ | ig μ | ||
| 20 | |||||||
| ZS7 | + | + | - | 21 26 | - | - | |
| 396 | |||||||
| 108 | |||||||
| ZS7 | + | - | 108 | - | - | ||
| + | + | - | 54 | - | - | ||
| CB- | 41 | ||||||
| + | + | — | |||||
| 17 | ZS7 | + | + | ||||
| Scid | ++ | ||||||
| (n = 1) | |||||||
| + | n. b. | n. b. | n. b. | n. b. | n. b. | ||
| ZS7 | + | n. b. | n. b. | n. b. | n, b. | n. b. | |
| + | + | - | - | - | - | ||
| ZS7 | |||||||
| UV | |||||||
| - | - | 26 | 37 | - | - | ||
| B31 | - | - | - | - | - | - | |
| - | - | - | 47 | - | - | ||
| - | - | 54 | 364 | - | - | ||
| CB- | - | - | 2515 | 5963 | 438 | 56 | |
| 17 | ZS7 | - | - | 2145 | 6374 | 506 | 94 |
| (n= 7) | - | - | 304 216 | 3804 1952 | - | - |
* giemsa festéssel vagy immunfluoreszcenciával izolálás vérből (B = Blut), ízületekből (G = Gelenken) tibiotarzális ízületek pirossága és duzzanata <7,5 pg/ml szérum
n. b. meghatározás nem történt
2. példa
A B. burgdorferi 3IkD antigénre specifikus monoklonális antitest hatása Lyme-borreliózisra Scidegerekben
A monoklonális antitest előállítása
Ha intakt immunrendszerrel rendelkező egeret B.
burgdorferi mikroorganizmusokkal immunizálunk, a B.
burgdorferi-re specifikus poliklonális antitesteket fog termelni (lásd az 1. táblázatot).
Tíz hetes beltenyésztett BALB/c nőstény egereket ultrahanggal homogenizált Bomelia mikroorganizmussal (B. burgdorferi B351 törzs; ATCC 35 210) immunizálunk.
Immunizálási séma:
0. nap: 200 pg Boréiba antigén komplett Freund adjuvánsban, szubkután,
21., 35., 49., 63. nap: ráoltás 100 pg Borrelia antigénnel foszfáttal pufferolt konyhasó oldatban (PBS), intraperitoneálisan,
66. nap: lép kivétel és egysejt szuszpenzió előállítása. Az immun lépsejteket az Ag8-PAI myeloma sejtvonallal fuzionáljuk standard módszerek szerint, polietilén-glikol alkalmazásával (J. H. Peters, H. Baumgarten, M. Schulze, „Monoklonale Antikörper” SpringerVerlag, Heidelberg, Német Szövetségi Köztársaság).
A fúziós terméket 96 tartályos szövettenyésztő lemezekre oltjuk. Nyolc nap múlva a sejt tenyészetek felülúszóit B. burgdorferi-re specifikus monoklonális antitestek jelenlétére vizsgáljuk, szilárdfázisú ELISA segítségével (J. H. Peters és munkatársai, lásd fentebb).
Az antitest termelő tenyészetek hibridóma sejtjeit határhígításos módszerrel klónozzuk. Az egyedi kiónok tenyészetének felülúszóját ezután újból szilárdfázisú ELISA-val, valamint Western-Blot analízissel és immunfluoreszcens vizsgálatokkal jellemezzük. Az IgG2b alosztályba tartozó LA-2 monoklonális antitestet egy monoklonális hibridóma vonal termeli és választ ki, a Western-Blot vizsgálatban minden vizsgált B. burgdorferi törzs (ilyen a ZS7 izolált törzs és a B31 törzs) 31 kD struktúrájával (OspA) reagál, amikor SDS-gélben eleklroforézissel elválasztott és WesternBlot segítségével membránra átvitt B. burgdorferi proteinekkel érintkezik. A LA-26.10 (anti-OspA IgG 1), a LA-25.1 (anti-OspB, 34 kD antigén; IgG2b) és a LA27.1 (anti-OspB, 34 kD antigén; IgGl) monoklonális antitesteket azonos módon állítottunk elő és vizsgáltunk.
Egerek fertőzése B. burgdorferi ZS7-tel
C.B-17 Scid-egereket lxlO8 élő B. burgdorferi ZS7 mikroorganizmussal fertőzünk meg a farok-tőbe való szubkután oltással.
Az egerek kezelése antiszérumokkal
A megfertőzött Scid-egereket hetenként kétszer különböző antiszérumokkal kezeltük. Az egyik csoportot normál egér szérummal (NMS = normál Mausserum), a második csoportot egér immunszérummal (IMS-immunes Mausserum) és egy harmadik csoportot a LA-2 monoklonális antitesttel (a B. burgdorferi 31 kD antigénje elleni antitest) kezeltük. Az adagolt antiszérumok mennyisége az első héten 100 pl, illetve LA-2 esetén 100 pg volt, a második héten 200 p, illetve LA-2 esetén 200 pg és a harmadik héten 300 pl, illetve LA-2 300 pg volt.
A 2. táblázatban bemutatjuk, hogy a kezeletlen vagy az NMS-sel kezelt Scid-egereknél 12 nap múlva
HU 212 716 Β az arthritis, carditis és hepatitis klinikai és kórszövettani jelei mutatkoztak. Ezzel szemben a LA-2 monoklonális antitest adása Scid-egereknél a kórtünetek jelentős csökkenését idézte elő. Klinikailag csak az ízületek enyhe pirossága mutatkozott és kórszövettanilag csak csekély elváltozások voltak megállapíthatók. Az IMSsel kezelt egereknél klinikai arthritis-re utaló leletet nem találtunk.
A B. burgdorferi kórokozó kimutatása in vitro kitenyésztéssel csak azoknál az egereknél járt sikerrel, amelyek vagy kezeletlen voltak, vagy NMS-sel voltak kezelve. A LA-2-vel vagy IMS-sel kezelt egereknél B. burgdorferi-t nem lehetett kimutatni (2. táblázat).
2. táblázat
C.B-17 Scid-egerek kezelése B. burgdorferi-vel és antiszérumokkal
| C.B-17 Scid- egér- törzs | Kezelés antiszé- rummal | Arthritis (12 nap után) | Carditis/hepatitis kórszövettani | B. burgdorferi kimutatása (tenyésztéssel) | |
| klinikai | kórszö- vettani | ||||
| n = 3 | - | + | + | + | + |
| n - 3 | NMS | + | + | + | + |
| n = 2 | IMS | - | - | - | - |
| n = 3 | LA-2 | _0 | _oo | - | - |
Az ízületek enyhe pirossága Csak csekély elváltozások
3. példa
A B. burgdorferi ZS7 31 kD antigénjének (OspA) expressziós klónozása DNS izolálás
A B. burgdorferi ZS7 törzsből módosított Kelly-féle táptalajon való tenyésztés után nagymolekulájú DNS-t tisztítunk. A spirochaetákat 10.000 g mellett centrifugálva ülepítjük és háromszor mossuk PBS-pufferben. A száraz üledéket 100 ml TE-pufferben (10 mmol/1 törzs, 1 mmol/1 EDTA, pH = 7,4) reszuszpendáljuk, lizozimmel (5 mg/ml) kezeljük 15 percig 30 °C-on és a DNS-t 1 ml 20%-os SDS hozzáadásával felszabadítjuk. Ezután hozzáadunk 1,5 ml NaCl oldatot (5 mol/1), ezt az oldatot azonos térfogatú fenollal extraháljuk, majd kloroformos extahálás következik. A DNS-t kétszeres térfogat abszolút etanol hozzáadásával és egy éjszakán át -20 ”C-on való inkubálással csapjuk ki. Centrifugálás után az üledéket 0,5 ml TE-pufferben oldjuk fel, majd DNáz mentes RNáz A-val (20 pg/ml) inkubáljuk 45 percig 55 “C-on és ezután egy órán át proteináz K-val (0,1 pg/ml) kezeljük 37 °C-on. Az oldathoz nátrium-acetátot adunk 0,3 mol/1ig és fenol-kloroformmal extraháljuk a fent leírtak szerint. Etanollal való kicsapás után a DNS-t újból TE-pufferben vesszük fel.
Génbank előállítása
A nagymolekulájú DNS-t három másodpercig tartó ultrahang kezeléssel statisztikusan feldaraboljuk. A kapott DNS fragmentumok végeit T4-DNS polimeráz (37 °C, 30 perc) és Klenow enzim (20 °C, 5 perc) segítségével kiegyenlítjük. A tompa végű DNS-t a pUEXL expressziós vektor BamHI helyére ligáljuk egy adapterklónozó stratégia alkalmazásával [Bresan és Stanley, Nucl. Acid. Rex., 1056. (1987)]. Egy nagyság szerinti szelekciós lépés után, amelyet molekulaszűrő kromatografálással végzünk Sepharyl S-1000 alkalmazásával, E. coli (MC 1061) gazdasejteket transzformálunk, s a rekombináns, plakk képző egységet (pfu = plaques farming unit) mutató sejteket a következőképpen mutatjuk ki: a véletlenszerűen kiválasztott telepeket kiszűrjük és 2 ml szelektív táptalajban (LB táptalaj 25 pg/ml ampicillinnel kiegészítve) tenyésztjük telítésig. A plazmid-DNS-t a szokásos alkalikus lizáló módszenei izoláljuk, s ezután BamHI-gyel hasítjuk. Az analizált plazmidok több mint 50%-a átlag >1,5 kb hosszú DNS inszertumot tartalmazott.
A B. burgdorferi ZS7 génbank lemezre vitele és szűrése
A sejteket 24x24 cm-es lemezekre öntjük lemezenként 7.000 pfu sűrűségben és egy éjszakán át 30 °C-on inkubáljuk. A telepeket ezután nitrocellulóz (NC) szűrőkre visszük át, majd a β-galaktozidáz-fúziós proteinek expresszióját 42 °C-on való két órás inkubálással indukáljuk. A szűrőket előzőleg 5%-os SDS-sel kezelt Whatman 3MM papírra visszük át és körülbelül 25 percig 95 °C-on inkubáljuk. Ezután a proteineket elektroblot révén - megfelelő készülék alkalmazásával Westem-Blot eljárással (félszáraz) analizáljuk. Az NCszűrőket DNáz-zal kezeljük, majd az immunreaktív kiónokat expresszióra való szűréssel - monoklonális antitestek használatával - azonosítjuk. Az NC szűrőn az aspecifikus kötőhelyeket 0,2% (tömeg/térf) zselatin és 3 mmol/1 NaN3 tartalmú PBS-ben 4 órás inkubálással - szobahőmérsékleten - telítjük. Ezután a szűrőket a LA-2 anti-31 kD monoklonális antitest klón tenyészetének felülúszójával inkubáljuk 18 órán át folyamatos rázás mellett. Alapos mosás [PBS+1% (térf/térf) triton X-100; PBS+0,5 mol/1 NaCl, PBS+1 mol/1 NaCl; mindegyik lépés 10 percig tart] után a szűrőket 1:10.000 hígítású peroxidázzal jelzett nyúl anti-egér IgG F(ab)2 készítménnyel inkubáljuk 1,5 órán át szobahőmérsékleten folyamatos rázás közben. A szűrőket újból mossuk, mint fent leírtuk, majd ezután diaminobenzidinnel (a peroxidáz szubsztrátuma) inkubáljuk. 104 rekombináns pfu-ből 20 klón reagált a LA-2 monoklonális antitesttel.
A 31 kD antigén (OspA) szekvencia analízise
Egy rekombináns E. coli klónból - amely pozitív reakciót adott LA-2 antitesttel - a DNS inszertumot a szokásos módon izoláljuk. Ennek a kiónnak a DNS inszertuma a B. burgdorferi 31 kD antigénjét kódoló teljes hosszúságú OspA-gént tartalmazza. Az inszertumot tartalmazó plazmid pZS-7/31-2 elnevezést kapott és a budapesti egyezmény alapján letétbe helyeztük a DSM intézménynél DSM 5528 letéti szám alatt.
HU 212 716 Β
Ezen immunpozitív klón által termelt rekombináns proteint rZS7/31-2-vel jelöltük. Az OspA gént kódoló DNS szekvenciát meghatároztuk, s ezt az OspA protein innen levezetett aminosav szekvenciájával együtt az 1. ábrán mutatjuk be.
Az 1. ábrából kitűnik, hogy a B. burgdorferi 31 kD antigénje egy 273 aminosavból álló proteinnek felel meg.
A nem-fúziós proteinek előállítása (a) A kiónt, amely az rZS7/31-2 immunreaktív proteint fejezi ki, egy éjszakán át 30 °C-on ampicillinnel kiegészített 10 ml LB táptalajban tenyésztjük. A tenyészetből 1 ml-t 100 ml szelekciós táptalajba mérünk és 30 °C-on jó levegőztetéssel 8xl07 sejt/ml sűrűségig (A600 = 0,2) tenyésztjük. A rekombináns protein expresszióját a gazdasejtek 42 °C-ra való melegítéssel érjük el. Lehűtés és centrifugálás után a sejteket STE-pufferben (10 mmol/1 trisz, 100 mmol/1 NaCl, 1 mmol/1 EDTA; pH = 8,0) mossuk és az üledéket 0,6 ml lizáló pufferben (25% szacharóz, 50 mmol/1 trisz; pH = 8,0) reszuszpendáljuk. 150 μΐ lizozim (10 mg/ml) hozzáadása után az elegyet 15 percig jégen inkubáljuk, majd tovább inkubáljuk (15 percig jégen) 18 μΐ DNáz 1-gyel (10 mg/ml) 5 μΐ 1 mólos MgCl2 jelenlétében. A reakcióelegyhez végül 250 μΐ 4x detergens-mix-et (1% triton X-100, 0,5% dezoxikolát, 0,1 mol/1 NaCl, 10 mmol/1 trisz; pH = 7,5) adunk és 5 percig jégen inkubáljuk. Centrifugálás után az üledéket kétszer mossuk puffer A-val (50 mmol/1 trisz. 50 mmol/1 NaCl, 1 mmol/1 EDTA pH = 8,0); majd 9 térfogatnyi 8 mól karbamid tartalmú puffer A-ban reszuszpendáljuk és 1 órán át szobahőmérsékleten inkubáljuk. A mintát 9 rész puffer Bvel (50 mmol/1 KH2PO4/K2HPO4, 50 mmol/1 NaCl, 1 mmol/1 EDTA; pH = 10,7) hígítjuk és 30 percig szobahőmérsékleten keverjük, miközben a pH-t KOH adagolással 107,-en tartjuk. Az oldat pH-ját ezután HCI hozzáadásával 7,0-re állítjuk be, majd egy éjszakán át puffer A-val szemben dializáljuk (4 °C-on) és 10 percig 4 °C-on 10.000 ford/perc mellett SS34-rotorban centrifugáljuk. A felülúszót, amely a rekombináns proteint tartalmazza, -20 °C-on tároljuk.
(b) Minthogy a klón az rZS7/31-2 immunreaktív proteint a tápoldatban is kiválasztja, a tisztítást (affinitás-kromatográfiával) a tenyészet felülúszójából is el lehet végezni.
Rekombináns OspA protein (nem-infúziós) előállítása és tisztítása affinitás-kromatográfiával A rekombináns proteineket végezetül affinitás-kromatográfiával tisztítjuk.
Erre a célra a tisztított LA-2 monoklonális antitestet aktivált Sepharose CL 4B-hez kötjük, kovalens kötéssel. A rekombináns proteint tartalmazó dialkilázt karbamid-extraktumot egér IgG-Sepharose CL 4B-re adszorbeáljuk és ezután egér a LA-2-Sepharose CL 4B oszlopra visszük. Intenzív mosás után a megkötött rekombináns proteint 0,1 mol/I glicin/HCl—0,1 mol/1 NaCl oldattal (pH = 2,5) eluáljuk. A leszedett frakciók pH-ját semlegesre állítjuk be 1/10 térfogat 0,5 mol/1 K2HPO4 azonnali hozzáadásával. A proteint tartalmazó frakciókat koncentráljuk és dializáljuk. SDS-poliakrilamid gél elektroforézis segítségével határozzuk meg a tisztítás fokát.
Az rZS7/31-2 rekombináns protein immunológiai jellemzése
Elvégeztük az rZS7/31-2 rekombináns protein immunológiai vizsgálatát. Összehasonlításul az rB31/41— 9 rekombináns proteint (B. burgdorferi 41 kD felületi antigén) használtuk fel.
Laposfenekű mikrotitráló lemezeket az rZS/31-2 és rB31/41—9 rekombináns proteinek karbamid-extraktumával, illetve génexpresszióhoz használt E. coli MC 1061 törzs karbamidos kivonatával fedünk. Az aspecifikus kötőhelyeket 0,2% zselatint tartalmazó foszfáttal pufferolt konyhasó oldattal (PBS) blokkoljuk. Az így előkészített mikrotitráló lemezek tartályaiba bemérjük a LA-2 (anti-31 kD, OspA), LA-1 (anti-41 kD, flagellin = csillófehérje), illetve ACHT-2 (anti-a,-antikimotripszin) adott monoklonális antitesteket. A megkötött monoklonális antitesteket peroxidázzal jelzett fajspecifikus anti-egér immunglobulinnal reagáltatjuk. A megkötött, peroxidázzal jelzett antitestek mennyiségét orto-fenilén-diamin (a peroxidáz szubsztrátuma) segítségével határozzuk meg. Az abszorpciókat 492 nm-en (A492) közvetlenül a mikrotitráló lemezen - automata lemez-fotométer segítségével - határozzuk meg. Az abszorpció erőssége a megkötött monoklonális antitest mennyiségére jellemző mérték.
A LA-2 monoklonális antitest specifikusan reagál az rZS7/31-2-vel, de nem reagál az MC 1061-el, illetve rB31 /41 -9-el. A LA-1 monoklonális antitest kontroli-reakció az rB31/41-9-re specifikus. Az ACHT-2 kontroli-reakció az rB31/41-9-re specifikus. Az ACHT-2 kontroll antitest (negatív kontroll) egyik proteinnel sem ad szignifikáns reakciót.
A 2. ábrán bemutatjuk, hogy a LA-2 monoklonális antitest által specifikusan felismert antigén-epitópot, amely az rZS7/31-2 rekombináns proteinen fejeződik ki, a B. burgdorferi ZS7 genomjából klónoztuk.
4. példa
A 31 kD (OspA) antigénre, illetve a 34 kD (OspB) antigénre specifikus antitestek összehasonlítása azokkal az antitestekkel, amelyek a 41 kD antigénre (flagellin) specifikusak
A LA-2 és LA-26.1 monoklonális antitestek felismerik a 31 kD OspA antigént és az IgG2b, illetve IgG 1 izotípushoz tartoznak. ALA-25.1 ésaLA-27.1 monoklonális antitestek a 34 kD OspB antigént ismerik fel és az IgG2b, illetve IgG 1 izotípushoz tartoznak. A LA-10 és LA-21 monoklonális antitestek a B. burgdorferi csillófehérjével kapcsolatos 41 kD periplazmatikus proteinre specifikusak és IgG2a, illetve IgGl izotípusúak. Mindegyik fent említett antitestet a 2. példában leírt eljárással állítottuk elő. Ebben a kísérletben azt kell megállapítanunk, hogy vajon más B. burgdorferi antigénnel szembeni monoklonális antitestek védőhatást gyakorolnak-e
HU 212 716 Β
Scid-egerekben a Lyme-borreliózis klinikai tüneteivel szemben.
A poliklonális anti-B31 immunszérumot (IMS) C57NL/6 egerekből vettük le. Az egereket lxlO8 B. burgdorferi B31 sejttel oltottuk szubkután és a szérum levétele az oltás után 91 nappal történt. A poliklonális antiZS7 IMS-t az lxlO8 B. burgdorferi ZS7-tel szubkután oldott C57BL/6 egerekből oltás után 68 nappal vettük le. Mindkét szérum 60 pg/ml specifikus antitestet tartalmazott ELISA rendszerben való meghatározás szerint [Schaible és munkatársai, J.Exp. Med., 170., 1427-1432. (1989)]. Normál egér szérumot (NMS) nem oltott C57BL/6 egerekből vettünk.
Az oltás időpontjában és ezután 4 napos időközönként az adott antitesteket, az IMS-t, az NMS-t vagy a PBS-t passzív intraperitoneális oltással Scid-egereknek adtuk be a következő séma szerint:
0. nap és 3. nap: 100 μΐ
7. nap és 10. nap: 200 μΐ
13. nap és 17. nap: 300 μΐ.
Azokon a Scid-egereken, amelyeket akár az antiZS7 IMS-sel, az antiB31-IMS-sel vagy a LA-2 monoklonális antitesttel kezeltünk, a 21 napos megfigyelési idő alatt nem mutatkoztak az arthritis klinikai tünetei, azaz a tibiotarzális ízületeknél nem lépett fel pirosság és duzzanat. Nem lehetett megállapítani carditisre és hepatitisre utaló tüneteket sem. Kórszövettani vizsgálatok nem mutattak ki elváltozásokat azoknak a Scid-egereknek az ízületeiben, szívében és májában, amelyeket akár anti-ZS7 IMS-sel, anti-B31 IMS-sel vagy akár a LA-2 monoklonális antitesttel kezeltünk.
A többi OspA specifikus monoklonális antitest, így az IgGl izotípusú LA-26.1, valamint az OspB specifikus LA-25.1 és LA-27.1 szintén képesek voltak az arthritis, carditis és hepatitis klinikai tüneteit enyhíteni. Itt enyhe kóros elváltozások mutatkoztak a vizsgált szervekben.
Ezzel szemben azok a Scid-egerek, amelyek vagy PBS puffért vagy NMS-t vagy flagellin ellenes monoklonális antitestet (LA-10 vagy LA-21) kaptak, arthritises klinikai tüneteket mutattak, hasonlókat a kezeletlen Scid-egereknél tipikus kóros elváltozásokhoz (3. táblázat). A tünetek súlyossága ez utóbbi állatoknál az oltás után eltelt idővel növekedett és nem gyengült a megfigyelés egész időtartama alatt. Az előzőleg antiZS7 IMS-sel vagy a LA-2 antitesttel kezelt Scid-egerekből nem lehetett spirochaetákat izolálni. Ezzel szemben a PBS pufferrel, NMS-sel vagy a LA-25.1, LA-26.1, LA-27.1, LA-10 és LA-21 monoklonális antitestekkel kezelt Scid-egerekből ki lehetett mutatni a spirochaetákat immunfluoreszcenciával és vérből való kitenyésztéssel.
3. táblázat
| C.B-17 Scidegér törzs (az egerek száma) | Mivel történt a kezelés | IgG szubtípus | Klinikai arthritis | Kórszövettani | B. burgdorferi kimutatása (tenyésztéssel és immunfluoreszcenciával) | |
| periarthritis/arth- ritis | carditis | |||||
| n = 8 | PBS (negatív kontrollok) | + | + | + | + | |
| n = 3 | NMS (negatív kontrollok) | + | + | + | + | |
| n = 3 | anti-B31 IMS | - | - | _* | +° | |
| n = 2 | anti-ZS7 IMS | - | - | _* | - | |
| n = 6 | LA-2 (OspA) | 2b | - | _* | _* | - |
| n = 3 | LA-10 (flagellin) | 2a | + | + | + | +’ |
| n = 3 | LA-21 (flagellin) | 1 | + | + | +/- | + |
| n = 3 | LA-26.1 (OspA) | 1 | + | ± | ± | +° |
| n = 3 | LA-25.1 (OspB) | 2b | + | + | ± | + |
| n = 3 | LA-27.1 (OspB) | 1 | + | ± | + | +° |
A kórszövettani elváltozások fokának jele: - nincs; -* szubklinikai; +/- enyhe; + súlyos; ’ A. B burgdorferi-I nem leheteti kimutatni immunofluoreszcentával minden vizsgált egyedben.
5. példa
OspA-val immunizált egerekből nyert antiszérum hatása a Lyme-borreliózis lefolyására Scid-egerekben
Ebben a kísérletben ki tudtuk mutatni, hogy a natív OspA (B. burgdorferi ZS7-ből izolálva) vagy a rekom55 bináns OspA [rekombináns pZS7/31-2 plazmiddal (DSM 5528) transzformált E. coli baktériumokból izolálva adása normál egerekben (C57BL/6 egér törzs) protektív poliklonális antitestek képződését indukálja. Ha ezeket az antitesteket Scid-egereknek adjuk be, védő hatást gyakorolnak a Lyme-borreliózissal szem8
HU 212716 Β ben. Emellett megállapítható, hogy a rekombináns OspA a natív OspA-hoz hasonlóan protektív immunválasz indukál. E kísérlet eredményét és a kísérlet végrehajtásának részleteit a 4. táblázat tartalmazza.
A rekombináns OspA előállítását a 3. példa tartalmazza.
A natis OspA előállítása és az egerek immunizálása OspA-val a következőképpen történik.
A natív 31 kD OspA feldúsítása
3,2x1010 spirochaetát 2 órán át 4 °C-on 5 ml
PBS/7,5 ml n-butanol oldatban proteináz inhibitorok (5 mmol/1 EDTA, 5 mmol/1 benzamidin, 5 mmol/1 PMSF) jelenlétében mágneses keverővei kevertetünk. Ezután a keveréket 90 percig 10.000 ford/perc mellett 4 °C-on Sorval centrifugában (fix-szögű rotorban) centrifugáljuk. A vizes fázist, ami a felületi proteineket tartalmazza, levesszük és háromszor mossuk kloroformmal. A protein tartalmat 280 nm-en mért extinkció révén, illetve a BCA-teszt segítségével határozzuk meg.
Az ezüstgélben, illetve az anti-B. burgdorferi nyúlszérummal végzett Western-Blot vizsgálatban a ZS7 törzsnél egy fő sáv jelenik meg a 31 kD molekulatömeget jelentő területen és gyenge sávok láthatók a 20, 34 és 65-68 kD területén. A B. burgdorferi B31 törzsből előállított butanol/víz készítmény egy fő sávot ad 31 kD-nál és gyenge sávokat ad 20 és 34 kDnál.
Egerek immunizálása natív és rekombináns OspAval
C57BL/6, illetve C.B-17 egereket háromszor 710 napos időközönként 5 pg (natív OspA a B31 törzsből). illetve 10 pg (natív OspA a ZS7 törzsből, rekombináns OspA ZS7-ből) OspA-t adunk be 100 pl adjuvánsban (ANM3; Sebak cég, Aidenbach, NSZK) szubkután a farok-tőbe. Az utolsó immunizáló oltás után legkorábban 3 hét múlva lehet szérumot levenni 3-4 hónapig. A specifikus antitest tartalmat ELISA rendszerben határozzuk meg.
4. táblázat
A B. burgdorferi specifikus monoklonális és poliklonális antitestek hatása a spirochaetózisra és az arthritis kialakulására B. burgdorferi-vel megfertőzött
Scid-egereken
| C. B-17 Scidegér törzs (az egerek száma) | Mivel történt a kezelés | Arthritis kialakulása | B. burgdorferi kimutatása | ||
| 1 | 2 | 3 | |||
| hét múlva | |||||
| n = 6 | PBS (negatív kontrollok) | 2E | + | + | 6/6 |
| n = 6 | LA-2 | - | - | - | 0/3 |
| C. B-17 Scidegér törzs (az egerek száma) | Mivel történt a kezelés | Arthritis kialakulása | B. burgdorferi kimutatása | ||
| 1 | 2 | 3 | |||
| hét múlva | |||||
| n = 2 | anti-OspA (natív) IMS | - | - | - | 0/2 |
| n = 3 | anti-OspA (rekomb.) IMS | - | - | - | 0/3 |
Az első antitest beadást (100 pl) i. p. végezzük a 0. napon (aO. napon oltjuk az egereket lxlO8 B. burgdorferi ZS7 sejttel, s. c. a faroktőbe).
A további antitest adást a 4. napon (100 pl), a 7. napon (200 pl), a 11. napon (200 pl), a 14. napon (300 pl) és a
18. napon (300 pl) végezzük (i. p.).
Claims (24)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Eljárás Lyme-kór elleni passzív oltóanyag előállítására, azzal jellemezve, hogy (i) egy donor állatot - előnyösen egeret - B. burgdorferi ZS7 vagy ZS7 és B31 mikroorganizmussal vagy ezek részeivel immunizálunk, (ii) immunkompetens B-sejteket izolálunk az immunizált donor állat limfocitáiból vagy 1 épsejtjei bői, (iii) a B-sejteket mielómasejtekkel fuzionáltatjuk és (iv) a keletkező hibridómák közül szelektáljuk az OspA és/vagy OspB antigént felismerő antitesteket termelő sejteket, (v) a szelektált hibridómákat tenyésztjük és a termelt antitesteket a tenyészetből elválasztjuk, majd egy vagy több antitestet a vakcinakészítésben szokásos hordozó-, töltő- és segédanyaggal összekeverünk. (Elsőbbsége: 1990.05. 17.)
- 2. Az i. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (i) lépésben az immunizáláshoz teljes B. burgdorferi ZS7 mikroorganizmust (DSM 5527) alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1990.05. 17.)
- 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (iv) lépésben az IgG osztályba, különösen az IgGl alosztályba tartozó antitestet termelő sejteket szelektáljuk. (Elsőbbsége: 1990. 05. 17.)
- 4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (iv) lépésben az ECACC 90 050 405 sejtvonallal megegyező tulajdonságú sejteket szelektáljuk. (Elsőbbsége: 1990. 05. 17.)
- 5. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a (iv) lépésben az ECACC 90 050 406 sejtvonallal megegyező tulajdonságú sejteket szelektáljuk. (Elsőbbsége: 1990.05. 17.)
- 6. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a (iv) lépésben az ECACC 90 050 407 sejtvonal9HU 212716 Β lal megegyező tulajdonságú sejteket szelektáljuk. (Elsőbbsége: 1990.05. 17.)
- 7. Eljárás Lyme-kór elleni passzív oltóanyag előállítására, azzal jellemezve, hogy (i) egy donor állatot - előnyösen egeret - B. burgdorferi ZS7 vagy ZS7 és B31 mikroorganizmussal vagy ezek részeivel immunizálunk, (ii) immunkompetens B-sejteket izolálunk az immunizált donor állat limfocitáiból vagy lépsejtjeiből, (iii) a B-sejteket mielómasejtekkel fuzionáltatjuk és (iv) a keletkező hibridómák közül szelektáljuk az OspA antigént felismerő antitesteket termelő sejteket, (v) a szelektált hibridómákat tenyésztjük és a termelt antitesteket a tenyészetből elválasztjuk, majd egy vagy több antitestet a vakcinakészítésben szokásos hordozó-, töltő- és segédanyaggal összekeverünk. (Elsőbbsége: 1989.09. 19.)
- 8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (i) lépésben az immunizáláshoz teljes B. burgdorferi ZS7 mikroorganizmust (DSM 5527) alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1989. 09. 19.)
- 9. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a (iv) lépésben az IgG osztályba, különösen az IgGl alosztályba tartozó antitestet termelő sejteket szelektáljuk. (Elsőbbsége: 1989.09. 19.)
- 10. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a (iv) lépésben az ECACC 89 89 091 302 sejtvonallal megegyező tulajdonságú sejteket szelektáljuk. (Elsőbbsége: 1989. 09. 19.)
- 11. Eljárás Lyme-kór ellen passzív oltóanyag hatóanyagként alkalmazható monoklonális antitest előállítására. azzal jellemezve, hogy az ECACC 89 091 302 hibridóma sejtvonalal tenyésztjük, és a termelt LA-2 monoklonális antitestet elválasztjuk a tenyészettől. (Elsőbbsége: 1989.09. 19.)
- 12. Eljárás Lyme-kór elleni passzív oltóanyag hatóanyagaként alkalmazható monoklonális antitest előállítására, azzal jellemezve, hogy az ECACC 9 005 406 hibridóma sejtvonalat tenyésztjük, és a termelt LA26.1 monoklonális antitestet elválasztjuk a tenyészettől. (Elsőbbsége: 1990. 05. 17.)
- 13. Eljárás Lyme-kór elleni passzív oltóanyag hatóanyagaként alkalmazható monoklonális antitest előállítására, azzal jellemezve, hogy az ECACC 9 005 405 hibridóma sejtvonalat tenyésztjük, és a termelt LA25.1 monoklonális antitestet elválasztjuk a tenyészettől. (Elsőbbsége: 1990. 05. 17.)
- 14. Eljárás Lyme-kór elleni passzív oltóanyag hatóanyagaként alkalmazható monoklonális antitest előállítására. azzal jellemezve, hogy az ECACC 9 005 407 hibridóma sejtvonalat tenyésztjük, és a termelt LA27.1 monoklonális antitestet elválasztjuk a tenyészettől. (Elsőbbsége: 1990. 05. 17.)
- 15. Eljárás az 1. ábra szerinti aminosav-szekvenciával rendelkező rekombináns OspA-antigén előállítására, azzal jellemezve, hogy a nevezett antigént kódoló DNS-szekvenciát egy vektorba - előnyösen egy prokarióta vektorba - beépítjük, az így kapott rekombináns vektorral egy alkalmas gazdasejtet transzformálunk, a transzformált gazdasejtet megfelelő körülmények között tenyésztve az antigént kifejezzük. (Elsőbbsége: 1989.09. 19.)15. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy (1) az 1. ábra szerinti DNS-szekvenciát vagy (2) a genetikai kód keretén belül ennek megfelelő szekvenciát építjük be egy rekombináns vektorba. (Elsőbbsége: 1989.09. 19.)
- 17. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy rekombináns vektorként egy plazmid vektort alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1990. 05. 17.)
- 18. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy rekombináns plazmid vektorként a ZS7/31-2 jelű plazmidot (DSM 5528) alkalmazzuk. (Elsőbbsége: 1990.05. 17.)
- 19. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az antigént β-galaktozidáz-fúziós protein vagy nem-fuzionált protein formájában fejezzük ki. (Elsőbbsége: 1989. 09. 19.)
- 20. Eljárás OspA és/vagy OspB antigén előállítására, azzal jellemezve, hogy a B. burgdorferi ZS7 genomjából származó génbankot az ECACC 9 005 405, 9 005 406 vagy 9 005 407 hibridóma sejtvonal által termelt egy vagy több antitesttel átvizsgáljuk, és a nevezett antitesttel vagy antitestekkel pozitív immunológiai reakciót adó kiónokat izoláljuk. (Elsőbbsége: 1990.05. 17.)
- 21. Eljárás OspA antigén előállítására, azzal jellemezve, hogy a B. burgdorferi ZS7 genomjából származó génbankot all. igénypont szerint előállított, egy vagy több antitesttel átvizsgáljuk, és a nevezett antitesttel vagy antitestekkel pozitív immunológiai reakciót adó kiónokat izoláljuk. (Elsőbbsége: 1989. 09. 19.)
- 22. A 21. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a gének átvizsgálását all. igénypont szerint előállított LA-2 monoklonális antitesttel végezzük. (Elsőbbsége: 1989. 09. 19.)
- 23. Eljárás Lyme-kór elleni aktív oltóanyag előállítására, azzal jellemezve, hogy egy rekombináns OspA antigént vagy egy immunogén epitópját a vakcinakészítésben szokásos hordozóanyaggal, töltőanyaggal és segédanyaggal összekeverjük. (Elsőbbsége: 1989. 09. 19.)
- 24. Eljárás patogén B. burgdorferi mikroorganizmus törzs izolálása, azzal jellemezve, hogy immunhiányos Scid-egereket a fenti törzzsel megfertőzzünk, és Scid-egerek véréből és/vagy ízületeiből a patogén mikroorganizmust izoláljuk. (Elsőbbsége: 1989. 09. 19.)
- 25. A 24. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a DSM 5527 számon letétbe helyezett B. burgdorferi ZS7 törzset izoláljuk. (Elsőbbsége: 1989. 09. 19.)HU 212716 Β
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3931236 | 1989-09-19 | ||
| DE4015911A DE4015911A1 (de) | 1989-09-19 | 1990-05-17 | Impfstoff gegen die lyme-krankheit |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU905816D0 HU905816D0 (en) | 1991-03-28 |
| HUT59613A HUT59613A (en) | 1992-06-29 |
| HU212716B true HU212716B (en) | 1996-10-28 |
Family
ID=25885304
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU905816A HU212716B (en) | 1989-09-19 | 1990-09-07 | Method for the preparation of vaccine against lyme disease |
| HU95P/P00108P HU211228A9 (en) | 1989-09-19 | 1995-04-24 | Vaccine against lyme disease |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU95P/P00108P HU211228A9 (en) | 1989-09-19 | 1995-04-24 | Vaccine against lyme disease |
Country Status (24)
| Country | Link |
|---|---|
| US (6) | US5178859A (hu) |
| EP (5) | EP0643974B1 (hu) |
| JP (3) | JP3205932B2 (hu) |
| KR (2) | KR100205462B1 (hu) |
| AT (4) | ATE191499T1 (hu) |
| AU (1) | AU651560B2 (hu) |
| CA (1) | CA2025597C (hu) |
| CZ (2) | CZ284538B6 (hu) |
| DE (5) | DE4015911A1 (hu) |
| DK (4) | DK0418827T3 (hu) |
| ES (4) | ES2082812T3 (hu) |
| FI (1) | FI102248B1 (hu) |
| GR (3) | GR3018995T3 (hu) |
| HK (2) | HK1002405A1 (hu) |
| HR (1) | HRP940545B1 (hu) |
| HU (2) | HU212716B (hu) |
| IE (1) | IE903377A1 (hu) |
| NO (2) | NO311767B1 (hu) |
| NZ (1) | NZ235260A (hu) |
| PL (2) | PL170229B1 (hu) |
| PT (1) | PT95349B (hu) |
| SI (1) | SI9011773B (hu) |
| SK (3) | SK283089B6 (hu) |
| YU (2) | YU48250B (hu) |
Families Citing this family (45)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK590288D0 (da) | 1988-10-24 | 1988-10-24 | Symbicom Ab | Kemiske forbindelser |
| US6143872A (en) * | 1988-10-24 | 2000-11-07 | Symbicom Aktiebolag | Borrelia burdorferi Osp A and B proteins and immunogenic peptides |
| US7094391B1 (en) * | 1988-10-24 | 2006-08-22 | The University Of Texas System | Compositions and methods for administering Borrelia burgdorferi antigens |
| US5777095A (en) * | 1988-10-24 | 1998-07-07 | Symbicom Aktiebolag | Osp A and B Sequence of Borrelia burgdonferi strains ACA1 and IP90 |
| DE4015911A1 (de) * | 1989-09-19 | 1991-03-28 | Max Planck Gesellschaft | Impfstoff gegen die lyme-krankheit |
| US5582829A (en) * | 1990-04-05 | 1996-12-10 | Rx Technologies, Inc. | Sonicated borrelia burgdorferi vaccine |
| SG47447A1 (en) | 1990-06-15 | 1998-04-17 | Univ Yale | Compositions and methods for the prevention and diagnosis of lyme disease |
| ATE196425T1 (de) * | 1990-07-06 | 2000-10-15 | American Home Prod | Impfstoff gegen die lyme-krankheit |
| CA2057536C (en) * | 1990-12-21 | 1999-10-26 | John J. Dunn | Cloning and expression of borrelia lipoproteins |
| US6872550B1 (en) | 1991-07-11 | 2005-03-29 | Baxter Vaccine Ag | Immunogenic formulation of OspC antigen vaccines for the prevention and treatment of lyme disease and recombinant methods for the preparation of such antigens |
| US6221363B1 (en) * | 1991-07-11 | 2001-04-24 | Baxter Aktiengesellschaft | Vaccine for the prevention of lyme disease |
| US6676942B1 (en) | 1991-08-15 | 2004-01-13 | Smithkline Beecham Biologicals (S.A.) | Osp a proteins of Borrelia burgdorferi subgroups, encoding genes and vaccines |
| EP0877085A1 (en) * | 1991-08-15 | 1998-11-11 | SMITHKLINE BEECHAM BIOLOGICALS s.a. | OspA protein of borrelia burgdorferi subgroups, encoding genes and vaccines |
| WO1993008299A1 (en) * | 1991-10-18 | 1993-04-29 | Connaught Laboratories Inc. | Preparation of recombinant borrelia proteins |
| EP0540457A1 (en) * | 1991-10-22 | 1993-05-05 | Symbicom Ab | Improvements in Borrelia burgdorferi diagnosis and prophylaxis |
| US6303129B1 (en) * | 1992-07-28 | 2001-10-16 | Rx Technologies | Production of borrelia burgdorferi vaccine, product produced thereby and method of use |
| US5656451A (en) * | 1993-07-30 | 1997-08-12 | Yale University | OspE, OspF, and S1 polypeptides in borrelia burgdorferi |
| US6716591B1 (en) | 1993-07-30 | 2004-04-06 | Yale University | B. burgdorferi polypeptides |
| US7008625B2 (en) | 1993-11-01 | 2006-03-07 | Research Foundation Of The State University Of New York | Recombinant constructs of Borrelia burgdorferi |
| US5558993A (en) * | 1994-06-17 | 1996-09-24 | The Regents Of The University Of California | Cloned Borrelia burgdorferi virulence protein |
| GB9511909D0 (en) * | 1995-06-12 | 1995-08-09 | Microbiological Res Authority | Vaccine |
| US6437116B1 (en) | 1996-02-21 | 2002-08-20 | Board Of Regents, The University Of Texas System | VMP-like sequences of pathogenic borrelia |
| DE19632862B4 (de) | 1996-08-14 | 2006-08-03 | Mikrogen Molekularbiologische Entwicklungs-Gmbh | Immunologisch aktive Proteine von Borrelia burgdorferi, dafür kodierende Nukleinsäuren sowie deren Verwendung in Testkits und als Impfstoffe |
| US6458555B1 (en) * | 1996-08-21 | 2002-10-01 | Gerd Bach | Cytologic method of examining mucous membranes |
| US6060082A (en) * | 1997-04-18 | 2000-05-09 | Massachusetts Institute Of Technology | Polymerized liposomes targeted to M cells and useful for oral or mucosal drug delivery |
| DE19740735A1 (de) * | 1997-09-16 | 1999-03-18 | Max Planck Gesellschaft | Arzneimittel zur Therapie einer manifesten Lyme-Borreliose |
| US6306623B1 (en) * | 1998-02-24 | 2001-10-23 | The University Of California | Leptospiral major outer membrane protein LipL32 |
| WO2000006745A1 (en) | 1998-07-31 | 2000-02-10 | Gundersen Lutheran Medical Foundation, Inc. | Uses of the borreliacidal epitope(s) of borrelia burgdorferi outer surface protein c (ospc) as vaccine |
| WO2000056298A2 (en) * | 1999-03-19 | 2000-09-28 | Luitpold Pharmaceuticals, Inc. | Treatment of lyme disease with polysulfated glycosaminoglycan formulations |
| WO2000078345A1 (en) * | 1999-06-21 | 2000-12-28 | Milkhaus Laboratory, Inc. | Method for treatment of lyme disease |
| ES2298249T3 (es) | 2000-08-18 | 2008-05-16 | Research Foundation Of State University Of New York | Ospa modificada de borrelia burgdorferi. |
| US7847084B2 (en) | 2002-12-20 | 2010-12-07 | Board Of Regents, The University Of Texas System | VMP-like sequences of pathogenic Borrelia species and strains |
| SG176451A1 (en) | 2006-11-03 | 2011-12-29 | Schering Plough Ltd | Canine lyme disease vaccine |
| EP2361930A3 (en) | 2007-03-26 | 2011-10-26 | Dako Denmark A/S | Multimers of MHC-peptide complexes and uses thereof in Borrelia infectious diseases |
| EP2167536A1 (en) | 2007-07-03 | 2010-03-31 | Dako Denmark A/S | Mhc multimers, methods for their generation, labeling and use |
| US10611818B2 (en) | 2007-09-27 | 2020-04-07 | Agilent Technologies, Inc. | MHC multimers in tuberculosis diagnostics, vaccine and therapeutics |
| US10968269B1 (en) | 2008-02-28 | 2021-04-06 | Agilent Technologies, Inc. | MHC multimers in borrelia diagnostics and disease |
| US10722562B2 (en) | 2008-07-23 | 2020-07-28 | Immudex Aps | Combinatorial analysis and repair |
| GB0817244D0 (en) | 2008-09-20 | 2008-10-29 | Univ Cardiff | Use of a protein kinase inhibitor to detect immune cells, such as T cells |
| US10369204B2 (en) | 2008-10-02 | 2019-08-06 | Dako Denmark A/S | Molecular vaccines for infectious disease |
| US11992518B2 (en) | 2008-10-02 | 2024-05-28 | Agilent Technologies, Inc. | Molecular vaccines for infectious disease |
| CA2781110C (en) * | 2009-11-17 | 2018-07-31 | Abaxis, Inc. | Peptides and methods for the detection of lyme disease antibodies |
| US8758772B2 (en) | 2011-11-04 | 2014-06-24 | Abaxis, Inc. | Peptides and methods for the detection of lyme disease antibodies |
| PL223175B1 (pl) | 2012-10-22 | 2016-10-31 | Inst Chemii Bioorganicznej Polskiej Akademii Nauk | Szczepionka przeciw boreliozie, konstrukt genetyczny, rekombinowane białko, sposób otrzymywania konstruktu genetycznego, sposób otrzymywania szczepionki, sposób otrzymywania rekombinowanych białek, zastosowanie rekombinowanych białek do wytwarzania szczepionki przeciwko boreliozie |
| US9610336B1 (en) * | 2014-07-16 | 2017-04-04 | Amiram Katz | Immunotherapy for lyme disease |
Family Cites Families (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK590288D0 (da) * | 1988-10-24 | 1988-10-24 | Symbicom Ab | Kemiske forbindelser |
| US4772464A (en) | 1985-08-01 | 1988-09-20 | Miles Laboratories, Inc. | Protective antibodies to serotypic determinants of flagellar antigens |
| US4888276A (en) | 1986-06-26 | 1989-12-19 | Minnesota Mining And Manufacturing Company | Method and composition for the diagnosis of Lyme disease |
| US4721617A (en) | 1986-08-14 | 1988-01-26 | Regents Of The University Of Minnesota | Vaccine against lyme disease |
| US5034515A (en) * | 1987-09-22 | 1991-07-23 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Staphylococcal fibronectin receptor, monoclonal antibodies thereto and methods of use |
| DE4015911A1 (de) * | 1989-09-19 | 1991-03-28 | Max Planck Gesellschaft | Impfstoff gegen die lyme-krankheit |
| WO1991009870A1 (de) * | 1989-12-22 | 1991-07-11 | Mikrogen Molekularbiologische Entwicklungs-Gmbh | Immunologisch aktive proteine von borrelia burgdorferi, zusammenhängende testkits und impfstoff |
| SG47447A1 (en) * | 1990-06-15 | 1998-04-17 | Univ Yale | Compositions and methods for the prevention and diagnosis of lyme disease |
| ATE196425T1 (de) * | 1990-07-06 | 2000-10-15 | American Home Prod | Impfstoff gegen die lyme-krankheit |
| CA2057536C (en) * | 1990-12-21 | 1999-10-26 | John J. Dunn | Cloning and expression of borrelia lipoproteins |
| EP0877085A1 (en) * | 1991-08-15 | 1998-11-11 | SMITHKLINE BEECHAM BIOLOGICALS s.a. | OspA protein of borrelia burgdorferi subgroups, encoding genes and vaccines |
| WO1993004157A1 (en) * | 1991-08-27 | 1993-03-04 | Novo Nordisk A/S | Detergent compositions |
| WO1993008299A1 (en) * | 1991-10-18 | 1993-04-29 | Connaught Laboratories Inc. | Preparation of recombinant borrelia proteins |
| WO1993007897A1 (en) * | 1991-10-21 | 1993-04-29 | Medimmune, Inc. | Bacterial expression vectors containing dna encoding secretion signals of lipoproteins |
-
1990
- 1990-05-17 DE DE4015911A patent/DE4015911A1/de not_active Withdrawn
- 1990-09-07 HU HU905816A patent/HU212716B/hu not_active IP Right Cessation
- 1990-09-11 NZ NZ235260A patent/NZ235260A/xx unknown
- 1990-09-12 AU AU62444/90A patent/AU651560B2/en not_active Ceased
- 1990-09-18 EP EP94112143A patent/EP0643974B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-09-18 AT AT94112144T patent/ATE191499T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-09-18 ES ES90117943T patent/ES2082812T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-09-18 AT AT90117943T patent/ATE131732T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-09-18 DE DE59010863T patent/DE59010863D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-09-18 SI SI9011773A patent/SI9011773B/sl not_active IP Right Cessation
- 1990-09-18 EP EP90117943A patent/EP0418827B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-09-18 ES ES94112143T patent/ES2129551T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-09-18 AT AT94112143T patent/ATE175576T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-09-18 DE DE59010888T patent/DE59010888D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-09-18 IE IE337790A patent/IE903377A1/en not_active IP Right Cessation
- 1990-09-18 DK DK90117943.2T patent/DK0418827T3/da active
- 1990-09-18 PL PL90307358A patent/PL170229B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1990-09-18 DE DE59009978T patent/DE59009978D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-09-18 AT AT94112145T patent/ATE186646T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-09-18 CA CA002025597A patent/CA2025597C/en not_active Expired - Fee Related
- 1990-09-18 EP EP94112144A patent/EP0633313B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-09-18 DK DK94112144T patent/DK0633313T3/da active
- 1990-09-18 EP EP94112145A patent/EP0633028B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-09-18 ES ES94112144T patent/ES2145077T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-09-18 NO NO19904062A patent/NO311767B1/no unknown
- 1990-09-18 YU YU177390A patent/YU48250B/sh unknown
- 1990-09-18 DK DK94112145T patent/DK0633028T3/da active
- 1990-09-18 DK DK94112143T patent/DK0643974T3/da active
- 1990-09-18 DE DE59010903T patent/DE59010903D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-09-18 EP EP98105444A patent/EP0861664A3/de not_active Withdrawn
- 1990-09-18 PL PL90286918A patent/PL169804B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1990-09-18 FI FI904597A patent/FI102248B1/fi not_active IP Right Cessation
- 1990-09-18 ES ES94112145T patent/ES2141182T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-09-19 JP JP24765090A patent/JP3205932B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1990-09-19 SK SK1511-98A patent/SK283089B6/sk unknown
- 1990-09-19 CZ CS904560A patent/CZ284538B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1990-09-19 US US07/585,310 patent/US5178859A/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-09-19 CZ CZ95970A patent/CZ284616B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1990-09-19 KR KR1019900014814A patent/KR100205462B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1990-09-19 PT PT95349A patent/PT95349B/pt active IP Right Grant
- 1990-09-19 SK SK1510-98A patent/SK283088B6/sk unknown
- 1990-09-19 SK SK4560-90A patent/SK456090A3/sk unknown
-
1993
- 1993-05-27 US US08/068,063 patent/US5434077A/en not_active Expired - Fee Related
-
1994
- 1994-09-15 HR HR940545A patent/HRP940545B1/xx not_active IP Right Cessation
-
1995
- 1995-03-20 US US08/406,623 patent/US5780030A/en not_active Expired - Fee Related
- 1995-03-20 US US08/407,350 patent/US5686267A/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-04-24 HU HU95P/P00108P patent/HU211228A9/hu unknown
-
1996
- 1996-02-14 GR GR960400397T patent/GR3018995T3/el unknown
-
1997
- 1997-03-12 YU YU9097A patent/YU49370B/sh unknown
-
1998
- 1998-02-13 HK HK98101147A patent/HK1002405A1/xx not_active IP Right Cessation
- 1998-02-23 US US09/027,843 patent/US5856447A/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-08-29 KR KR1019980035375A patent/KR100202128B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1998-12-23 HK HK98114958A patent/HK1013620A1/xx not_active IP Right Cessation
-
1999
- 1999-10-07 US US09/413,858 patent/US6613331B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1999-11-30 GR GR990403104T patent/GR3032010T3/el unknown
-
2000
- 2000-06-14 GR GR20000401362T patent/GR3033675T3/el not_active IP Right Cessation
- 2000-07-26 JP JP2000225341A patent/JP3328644B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2000-12-11 JP JP2000376159A patent/JP3418171B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2001
- 2001-09-24 NO NO20014624A patent/NO315905B1/no unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HU212716B (en) | Method for the preparation of vaccine against lyme disease | |
| IE83320B1 (en) | Vaccine against lyme disease | |
| US5656451A (en) | OspE, OspF, and S1 polypeptides in borrelia burgdorferi | |
| CA2071863C (en) | Recombinant vaccine for porcine pleuropneumonia | |
| US5879952A (en) | 43 Kd protein vaccine and method for the production thereof | |
| US5300632A (en) | Method for purifying an outer membrane protein of Haemophilus influenzae | |
| AU673912B2 (en) | Vaccine against lyme disease |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees |