CZ284538B6 - Očkovací látka proti boreliose, způsob její výroby a monoklonální protilátky - Google Patents

Očkovací látka proti boreliose, způsob její výroby a monoklonální protilátky Download PDF

Info

Publication number
CZ284538B6
CZ284538B6 CS904560A CS456090A CZ284538B6 CZ 284538 B6 CZ284538 B6 CZ 284538B6 CS 904560 A CS904560 A CS 904560A CS 456090 A CS456090 A CS 456090A CZ 284538 B6 CZ284538 B6 CZ 284538B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
burgdorferi
antigen
ospa
vaccine
borrelia burgdorferi
Prior art date
Application number
CS904560A
Other languages
English (en)
Inventor
Markus Dr. Simon
Ulrich E. Schaible
Klaus Dr. Eichmann
Michael Dr. Kramer
Wallich Dr. Reinhard
Original Assignee
MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V.
Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung Desöffentlichen Rechts
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=25885304&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CZ284538(B6) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V., Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung Desöffentlichen Rechts filed Critical MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V.
Publication of CZ456090A3 publication Critical patent/CZ456090A3/cs
Publication of CZ284538B6 publication Critical patent/CZ284538B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/20—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Spirochaetales (O), e.g. Treponema, Leptospira
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
    • C07K16/1203—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria
    • C07K16/1207—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria from Spirochaetales (O), e.g. Treponema, Leptospira
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Abstract

Očkovací látka proti boreliose, onemocnění Lyme, obsahuje jednu nebo větší počet monoklonálních protilátek, specifických pro antigen 31 kD, OspA, nebo 34 kD, OspB, Borrelia burgdorferi. Očkovací látku je možno získat tak, že se z lymfocytů nebo slezinných buněk pokusných zvířat, s výhodou myší, imunizovaných organismy Borrelia burgdorferi nebo jejich částmi vytvoří fúzi buněk hybridom, produkující monoklonální protilátky. ŕ

Description

Očkovací látka proti borelióze, způsob její výroby a monoklonální protilátky
Oblast techniky
Vynález se týká očkovací látky proti borelióze, obsahující monoklonální protilátky, specifické proti antigenům Borelia burgdorferi, způsobu její výroby a příslušných monoklonálních protilátek.
Dosavadní stav techniky
Borelióza, onemocnění Lyme nebo lymská horečka, je v současné době nejčastějším infekčním onemocněním, které se přenáší klíšťaty. Toto onemocnění je vyvoláváno spirochetou Borelia burgdorferi, onemocnění přenášejí na člověka především klíšťata kmene Ixodes. Jde o chronickou progresivní infekci, napadající řadu orgánů, jako jsou pokožka, centrální a periferní nervový systém, srdce, játra, ledviny a svalový a kostní systém. Vzhledem k tomu, že dostatečná léčba antibiotiky je obtížná, je v současné době prováděna řada výzkumů s cílem změnit a zvýšit odpověď imunitního systému na infekci uvedeným mikroorganismem. U lidí s uvedeným onemocněním byl zjištěn vysoký titr protilátek proti B. burgdorferi, tato skutečnost však nebyla ukazatelem ochrany proti infekci. Původce infekce pravděpodobně velmi rychle přechází z krevního oběhu do tkání, kde již není pro imunitní systém bezprostředně dosažitelný. To znamená, že ochrana pomocí protilátky je možná pouze bezprostředně po začátku infekce, kdy se mikroorganismus ještě nachází v krevním oběhu.
Skutečnost, že přirozená infekce B. burgdorferi byla nalezena u řady živočišných druhů, vedla k pokusům vytvořit laboratorní modely pro toto onemocnění, až dosud s omezeným úspěchem. Při pokusech se specifickou odpovědí u myši bylo prokázáno, že infekce u inbredních myších kmenů, pěstovaných již delší dobu s izolátem B. burgdorferi, vedla k mírným, avšak významným patomorfologickým změnám různých orgánů, jako je mozek, srdce, plíce a ledviny, přičemž tyto změny byly srovnatelné se změnami u lidí s tímtéž onemocněním, jak bylo uvedeno v publikaci Schaible a další, (1988), Infect. Immun. 1, 41. Skutečnost, že se vytvořily pouze mírné změny, byla způsobena patrně poklesem schopnosti vyvolat protilátky a sníženou virulencí mikroorganismu, již dlouho pěstovaného in vitro, nebo schopnostmi myší vyvinout dostatečnou imunologickou odpověď, jak bylo popsáno v publikacích Johnson a další, (1984), J. Clin. Microbiol. 20, 747; Schwan a další (1988), Infect. and Immun. 56, 1837.
Vynález si klade za úkol připravit účinnou očkovací látku proti uvedenému onemocnění. K. tomuto účelu je zapotřebí nejprve získat vhodný laboratorní model. Bylo nyní navrženo užít kmen myší bez funkčních T- a B-buněk, tzv. kmen Scid-myší popsaný v publikaci Bosma a další, (1983) Nátuře 10, 52, protože tyto myši vyvinou po infekci B. burgdorferi ve formě izolátu vícesystémové onemocnění a převážně polyarthritis a karditis. Na tomto modeluje poprvé možné zkoušet účinnost očkovacích látek proti uvedenému onemocnění.
Podstata vynálezu
Podstatu vynálezu tvoří očkovací látka proti borelióze, onemocnění Lyme. Tato očkovací látka obsahuje jednu nebo větší počet monoklonálních protilátek, specifických pro antigen 31kD, OspA nebo 34 kD, OspB, Borellia burgdorferi.
Očkovací látka podle vynálezu může obsahovat jednu nebo větší počet monoklonálních protilátek, specifických pro antigen 31 kD (OspA) B. burgdorferi, nebo jednu nebo větší počet monoklonálních protilátek, specifických pro antigen 34 kD (OspB) B. burgdorferi.
- 1 CZ 284538 B6
Ze specifických protilátek je zejména možno použít protilátku, specifickou pro antigen 41 kD B. burgdorferi z kmenů ZS7 (DSM 5527) nebo/a B31 (ATCC 35210), nebo protilátku, specifickou pro antigen 34 kD B. burgdorferi z kmenů ZS7 (DSM 5527) nebo/a B31 (ATCC 35210).
Výhodné jsou zejména očkovací látky, které obsahují protilátku podle vynálezu ze třídy IgG, zejména podtřídy IgG2b nebo IgGl.
Podstatu vynálezu tvoří také způsob výroby očkovací látky proti borelióze, který spočívá v tom, že se z lymfocytů nebo slezinných buněk pokusných zvířat, s výhodou myší, imunizovaných organismy B. burgdorferi nebo jejich částmi, vytvoří fúzí buněk hybrid, produkující monoklonální protilátku LA2 nebo monoklonální protilátky LA 25.1, LA 26.1 nebo LA 27.1. K. imunizaci je možno použít kompletní organismy B. burgdorferi B31 nebo/a ZS7.
Součást podstaty vynálezu tvoří také příslušné monoklonální protilátky, a to LA-2 proti OspA, vylučovaná buněčnou linií hybridomu ECACC 89091302, nebo LA-26.1 proti OspA, vylučovaná buněčnou linií hybridomu ECACC 90050406. Mimoto může jít ještě o protilátky proti OspB, a to LA-25.1, vylučovanou buněčnou linií hybridomu ECACC 90050405 a LA27.1, vylučovanou buněčnou linií hybridomu ECACC 90050407.
Použití protilátek podle vynálezu působí neočekávaně na rozdíl od použití jiných protilátek, například proti povrchovému antigenu 41 kD B. burgdorferi (Flagelin) u imunodeficientních pokusných zvířat, s výhodou Scid-myší, infikovaných životaschopnou patogenní B. burgdorferi, zvláště kmene ZS7, zbrzdění zánětu kloubů, srdečního svalu a jater, a to úplně nebo ve značné míře.
Patogenní organismy B. burgdorferi je možno získávat tak, že se z imunodeficientních pokusných zvířat, s výhodou myší, předem infikovaných tímto mikroorganismem, mikroorganismy získají zpět, přičemž jejich patogenita zůstává zachována.
Protilátka podle vynálezu může být zpracována na lékovou formu při použití běžných nosičů, plniv a pomocných látek.
Vynález bude dále osvětlen příklady provedení v souvislosti s přiloženými výkresy.
Přehled obrázků na výkresech
Na obr. 1 je znázorněna DNA a řetězec aminokyselin antigenu 31 kD, OspA, B. burgdorferi.
Na obr. 2 je uvedena imunologická charakteristika rekombinantní bílkoviny rZS7/31-2.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Indukce arthritis, karditis a hepatitis u Scid-myší infekcí kmenem B. burgdorferi ZS7
Infekce myší B- burgdorferi
Dospělé myši kmene C.B-17 Scid (homozygot pro Scid-mutaci) a C.B-17 se infikují podkožní injekcí 1 x 105, 5 x 105, 1 x 106 nebo 1 x 108 životaschopných nebo usmrcených (UV-světlo) B. burgdorferi do kořene ocasu.
-2CZ 284538 B6
Izolace B. burgdorferi z klíšťat a myší
Výzkumy byly prováděny sjiž dlouho pěstovaným kmenem B. burgdorferi B31, ATCC 35210 a s čerstvým izolátem ZS7, DSM 5527, který byl izolován z klíštěcí samice kmene Ixodes rizinus. 5 Všechny kmeny B. burgdorferi byly pěstovány v modifikovaném Kellyho prostředí z publikace
Barboura další, (1983) Switzerland. Curr. Microbiol. 8, 123. Organismy, izolované ze středního střeva klíšťat, sterilizovaných ethanolem, nebo z krve infikovaných myší, byly zpočátku pěstovány v Kellyho prostředí s přidáním 8 pg/ml kanamycinu a 230 pg/ml fluoruracilu podle publikace Johnson a další, (1984) J. Clin. Microbil. 1,81.
Sérologické testy
Zjištění specifických protilátek proti B. burgdorferi se provádí běžným testem ELISA podle publikace Justus a další, (1988) Wehrmed. Mschr. 32, 283. Standardní křivka pro obsah 15 imunoglobulinu (Ig) byla získána převrstvením vyhloubení Ig proti myším (ředění 1 : 500 roztoku séra, Paesel, Frankfurt, SNR) a titrací obsahu celkového množství IgG nebo IgM proti myši (Calbiochem, LaJolle, USA). Obdobným způsobem byl měřen celkový obsah IgM a IgG v séru. Koncentrace těchto specifických protilátek se udává v pg/ml séra, vztaženo na Ig.
Imunofluorescence a barvení podle Gimmsy μΐ krve se napipetuje do zkumavek hematokritu (Becton a Dickinson, Heidelberg, NSR) a pak se odstředí při 5000 g v odstředivce pro hematokrit (ECCO, NSR). Zkumavky se rozříznou ve fázi mezi sérem a erythrocyty a 5 μΐ séra se nanese na nosič (Superior, Bad Mergentheim, NSR). 25 Nosič se vzorkem séra se suší na vzduchu a pak se fixuje 100% ethanolem 1 minutu při -20 °C.
Po inkubaci 1 hodinu s králičím hyperimunním sérem proti B. burgdorferi v ředění 1 : 100 při teplotě místnosti se nosič pětkrát promyje PBS a pak se 1 hodinu barví při použití kozího antiséra proti králíkům, konjugovaného s FITC (ředění 1 : 20, Jackson Lab., West Grove, USA). Pak se nosič promyje, uloží do směsi glycerolu a želatiny (Měrek, Darmstadt, NSR) a okamžitě 30 se sleduje ve fluorescenčním mikroskopu. Neošetřené kapky krve se usuší na vzduchu, fixují v methanolu, barví se podle Giemsy (0,1 %, Měrek, Darmstadt, NSR), odbarví v PBS a uloží do prostředku Entellan (Měrek, Darmstadt, NSR).
Histologické preparáty a postupy při barvení
Různé vnitřní orgány, jako mozek, srdce, plíce, játra, ledviny, slezina a klouby myší, infikovaných B. burgdorferi, se v různé době po infekci odstraní a uchovávají buď v kapalném dusíku pro přípravu zmrazených řezů, nebo v 5% formaldehydu v PBS pro uložení do parafínu nebo methakrylátu. Pak se vytvářejí řezy o tloušťce 4 až 7 pm, které se barví Hematoxylinem-Eosin a 40 pak se ukládají do prostředku Entellan (Měrek AG, Darmstadt, NSR). Imunohistologické sledování se provádí při použití systému s obsahem streptavidinu, biotinu a peroxidázy podle publikace Kramer a další, (1989) Eur. J. Immunol. 19, 151.
Následující tabulka 1 ukazuje, že organismy B. burgdorferi, izoláty ZS7 a B31 bylo možno zjistit 45 v krvi Scid-myší, naočkovaných životaschopnými mikroorganismy, po celou dobu pokusu. Jinak bylo možno rekultivovat pouze spirochety kmene ZS7, avšak nikoliv kmene B31 in vitro. Při srovnání rekultivovaných organismů s primárním izolátem ZS7 nebylo možno prokázat žádné změny v obsahu bílkovin nebo v profilu plazmidu. Po celou dobu pozorování bylo možno u Scid-myší, infikovaných B. burgdorferi, prokázat jen velmi malý nebo žádný titr irelevantních 50 protilátek. Nebylo možno prokázat žádné protilátky typu IgM- nebo IgG, specifické proti uvedenému mikroorganismu. Naproti tomu docházelo u kontrolních myší C.B-17, rovněž infikovaných, k expresi velkého množství celkových protilátek Ig a současně bylo možno prokázat vysoký titr specifických protilátek IgM a IgG proti B. burgdorferi. Mezi 7 a 22 dnem po
-3CZ 284538 B6 infekci izolátem ZS7 bylo možno pozorovat u Scid-myší první klinické příznaky zánětů kloubů, a to zčervenání a otok obou tibioterálních kloubů, stav se zhoršoval. Nebylo však možno pozorovat žádné takové příznaky u Scid-myší, infikovaných izolátem ZS7 po jeho ozáření UVsvětlem, nebo izolátem B31, a to životaschopným, ani u kontrolních myší C.B-17, infikovaných životaschopným izolátem ZS7.
Také histopatologicky bylo možno prokázat kloubní změny u Scid-myší, infikovaných životaschopným izolátem ZS7, jak je zřejmé z tabulky 1. Bylo možno prokázat těžké poškození kloubů, které se projevovalo zánětlivou hyperplasií synoviální výstelky, spojenou s rozrušením chrupavky a/nebo kosti. Dále byl zjištěn zánět celého srdce s průnikem mononukleárních buněk do endokardu, myokardu a perikardu. Dále bylo možno pozorovat progresivní zánět jater, přičemž byl možno pozorovat vznik jatemí fibrózy, infiltrace mononukleárních buněk byla omezena na portální žíly a velkých žil. Mimoto bylo možno pozorovat menší poškození hlavy, plic, mozku a příčně pruhovaných svalů.
Tabulka 1
Infekce Scid-myší C.B-17 a kontrolních myší C.B-17, reizolace spirochety, titr protilátek, arthritis
Myši B.burgdorferi Dny po infekci B. burgdorferi Arthritis Protilátky pg/ml00
Kmen Počet Detek- ce vkrvix Izolace“ kli- nicky0 histopatolog. Celkem Ig Specifické Ig
μ y μ y
C.B-17 ZS7 5xl05 7 + _ _ _ 20 _ _
scid
(n=l) 36 + +B + + - 21 - -
49 + +B + + — 26 — —
59 + +B + + — 396 — —
ZS7 lxlO8 7 + — + + - 108 — —
23 + +B + + — 54 — —
ZS7 lxlO8 22 + - + + - 41 - -
29 4- +G + + - — — —
87 + +B/G + + — — — —
ZS7 lxlO5 — n.b. n.b. + n.b. n.b. n.b.
lxlO6 — n.b. n.b. + n.b. n.b. n.b.
lxlO8 16 + + + + — - — —
ZS7uvtt lxlO8 16 - - - - - - - -
B31 lxlO8 22 + - - - 26 37 - -
29 + - - - - — — —
— 22 — - - — - 47 —
— 29 - - - - 54 364 - -
C.B-17 ZS7 lxlO8 16 - - - - 2.515 5.963 438 56
(n=7) 24 - - - - 2.145 6.374 506 94
— — — — - - - 304 3.804 - -
- - - - - - - 216 1.952 - -
x: Giemsovo barvení nebo imunofluorescence, “z izolace z krve (B) nebo kloubů (G) °: + znamená zrudnutí a otok tibiotarsálních kloubů, °°: - znamená méně než 7,5 pg/ml séra
n.b.: nebylo provedeno
-4CZ 284538 B6
Příklad 2
Účinnost specifické monoklonální protilátky proti antigenu B. burgdorferi 31kD na průběh Borreliosy-Lyme u Scid-myší
Získání monoklonální protilátky
Při imunizaci myši s neporušeným imunologickým systémem dochází při infekci B. burgdorferi k expresi polyklonálních protilátek, specifických pro B. burgdorferi, jak je zřejmé z tabulky 1.
Myší samice inbredního kmene BALB/c ve stáří 10 týdnů byly imunizováriy B. burgdorferi, kmenem B31, ATCC 35 210, kmen byl homogenizován ultrazvukem. Imunizace byla prováděna následujícím způsobem:
Den 0: 200 pg antigenu Borrelia v úplném Freundově pomocném prostředku podkožně.
Den 21, 35, 49, 63: dalších 100 pg antigenu intraperitoneálně ve fyziologickém roztoku chloridu sodného, obsahujícím fosfátový pufr.
Den 66: vyjmutí sleziny a získání suspenze jednotlivých buněk.
Imunní slezinné buňky byly podrobeny fúzí s myelomovou buněčnou linií Ag8-PAI standardním způsobem při použití polyethylenglykolu podle publikace J. H. Peters, H. Baumgarten, M. Schulze, Monoklonale Antikorper, Springer-Verlag, Heidelberg.
Produkty fúze byly naočkovány do desek s 96 vyhloubeními. Po osmi dnech byly supematanty kultury sledovány zkouškou ELISA v pevné fázi na přítomnost specifických monoklonálních protilátek proti B. burgdorferi podle svrchu uvedené publikace J. H. Peters a dalších.
Buňky hybridomu z kultur, produkujících protilátky, byly po zředění dále klonovány. Supematanty kultur jednotlivých klonů byly znovu vyšetřeny zkouškou ELISA v pevné fázi, analýzou Westem-Blot a imunofluorescencí. Monoklonální protilátky LA-2 podtřídy IgG2b byly produkovány monoklonální linií hybridomu a touto linií rovněž vylučovány a reagovaly při zkoušce Westem-Blot se strukturou 3 lkDa (Osp-A) všech vyšetřovaných kmenů B. burgdorferi, mimo jiné také izoláty ZS7 a B31. Tyto protilátky byly děleny elektroforeticky na SDS-gelu a také zkouškou Westem-blot pomocí bílkoviny B. burgdorferi přeneseny na membránu. Monoklonální protilátky LA-26.1C (anti-OspA IgGl), LA 25.1 (anti-OspB, 34 kDa antigen, IgG2b) a LA 27.1 (anti OspB, 34 kDa antigen, IgGl) je možno získat a charakterizovat analogickým způsobem.
Infekce myší B. burgdorferi ZS7
Scid-myši C.B-17 byly infikovány podkožně v oblasti kořene ocasu množstvím 1 x 108 životaschopných jedinců izolátu B. burgdorferi ZS7.
Ošetření myší antisérem
Infikované Scid-myši byly ošetřeny 2x týdně různými antiséry. První skupině bylo podáno sérum NMS (normální myší sérum), druhé skupině sérum IMS (imunní myší sérum) a třetí skupině bylo podáno sérum s obsahem monoklonální protilátky LA-2 proti antigenu 31 kD B. burgdorferi. Dávka antiséra byla v prvním týdnu 100 μΐ nebo 100 pg pro LA-2, ve druhém týdnu 200 μΐ nebo 200 pg pro LA-2 a ve třetím týdnu 300 pg nebo 300 pl pro LA-2.
Z následující tabulky 2 je zřejmé, že myši Scid, neošetřené nebo ošetřené NMS měly po 12 dnech klinické a histopatologické projevy zánětů kloubů, srdce a jater. Oproti tomu mono
-5CZ 284538 B6 klonální protilátka LA-2 podstatně omezila tyto příznaky. Klinicky došlo pouze k lehkému zrudnutí a histopatologicky pouze k marginálním změnám. Při podání IMS nebylo možno pozorovat žádné klinické projevy.
Průkaz B. burgdorferi kultivací in vitro bylo možno získat pouze u neošetřených myší nebo myší, ošetřených NMS, nikoliv v případě LA-2 nebo IMS.
Tabulka 2
Ošetření Scid-myší C.B-17 antisérem po infekci B. burgdorferi
Scid C.B-17 antisérum zánět kloubů po 12 dnech karditis/hepatitis histopatologicky průkaz B. burgdorferi kultivací
klinicky histopatologicky
n = 3 _ + + + +
n = 3 NMS + + + +
n = 2 IMS - - - -
n = 3 LA-2 X XX - -
x lehké zrudnutí kloubů xx pouze marginální změny
Příklad 3
Klonování a exprese antigenu 31kD (OspA) z B. burgdorferi ZS7
Příprava DNA
Vysokomolekulámí DNA z kmene B. burgdorferi ZS7 byla čištěna po kultivaci v modifikovaném Kellyho prostředí. Spirochety byly peletovány odstředěním při 10 000 g a třikrát promyty PBS-pufrem. Usušená peleta byla znovu suspendována v 10 ml TE s obsahem 10 mmol/1 tris a 1 mmol/1 EDTA při pH 4, pak byl na 15 minut při teplotě 30 °C přidán lysozym v množství 5 mg/ml, načež byla DNA uvolněna přidáním 1 ml 20% SDS. Po přidání 1,5 ml roztoku NaCl s obsahem 5 mol/1 byl roztok extrahován stejným objemem fenolu a pak chloroformem. DNA pak byla vysrážená přidáním dvou objemů absolutního ethanolu s následnou inkubací přes noc při teplotě -20 °C. Po odstředění byl zbytek rozpuštěn v 0,5 ml TE, pak byl inkubován s DNAázou, prostou RNA-ázy A (20 pg/ml) po dobu 45 minut při teplotě 55 °C, načež byla na 1 hodinu při teplotě 37 °C přidána proteináza K v množství 0,1 pg/ml. Pak byl přidán NaOAc do koncentrace 0,3 mol/1 a směs byla jako svrchu extrahována fenolem a chloroformem. Po vysrážení ethanolem byla DNA znovu uvedena do roztoku v TE.
Příprava genové banky
Vysokomolekulámí DNA byla statisticky rozdělena na menší části působením ultrazvuku po dobu 3 sekundy. Pak byla užita T4-DNA-polymeráza (30 minut při 37 °C) a Klenowův enzym (5 minut při 20 °C) k vyrovnání zakončení vzniklých fragmentů. Vzniklá DNA byla pak navázána do místa štěpení enzymu BamHI vektoru pro expresi pUEXl při použití strategie klonování použitím adaptéru podle publikace Bresan und Stanley (1987) Nucl. Acid. Res., str. 1056. Po selekci podle velikosti při použití chromatografie s molekulárním sítem a prostředku Sephacryl S-1000 a po transformaci kompetentních buněk E. coli MC 1061 byl podíl rekombinantních jednotek pro tvorbu plaků (pfu) stanoven následujícím způsobem. Náhodně
-6CZ 284538 B6 zvolené kolonie byly odebrány a pěstovány ve 2 ml selekčního prostředí LB s 25 pg/ml ampicilinu až do nasycení. DNA plazmidu byla pak izolována běžným rozrušením za alkalických podmínek a pak byla rozštěpena enzymem BamHI. Více než 50 % analyzovaného plazmidu obsahovala včleněné řetězce DNA se středním průměrem > 1,5 kb.
Pěstování na plotnách a screening genové banky B. burgdorferi ZS7
Buňky byly naneseny na desku s rozměrem 24 x 24 cm v množství 7000 pfu na jedné desce a byly inkubovány přes noc při teplotě 30 °C. Po přenosu kolonií na nitrocelulózový filtr (NC) byla indukována exprese složené bílkoviny s obsahem β-galaktosidázy dvouhodinovou inkubací při teplotě 42 °C. Filtr byl přenesen na papír Whatman 3MM, předem zpracovaný 5% SDS a papír byl inkubován 25 minut při teplotě 95 °C. Pak byly bílkoviny podrobeny elektroblotu při použití běžného zařízení k provedení metody Western blot při použití částečně usušeného materiálu. Po zpracování NC-filtrů DNA-ázou byly imunoreaktivní klony identifikovány za použití monoklonálních protilátek. Nespecifická vazná místa na NC-filtrech byla vysycena čtyřhodinovou inkubací s PBS s obsahem 0,2 % hmotnostních želatiny a 3 mmol/1 NaN3 při teplotě místnosti. Nakonec byly filtry inkubovány 18 hodin za stálého protřepávání se supematanty kultury anti-31 KD monoklonálního klonu LA-2. Po důkladném promytí (PBS + 1 % objemové Tritonu X-100, pak PBS + 0,5 mol/1 chloridu sodného a nakonec PBS + 1 mol/l chloridu sodného, každý stupeň trvá 10 minut) byly filtry inkubovány 1,5 hodin při teplotě místnosti za stálého protřepávání s králičí protilátkou proti myšímu IgG, značenou peroxidázou F(ab)2 v ředění 1 : 10 000. Filtry byly znovu promyty jako svrchu a pak byly inkubovány s diaminobenzidinem jako substrátem pro peroxidázu. Z 104 rekombinantních pfu reagovalo 20 klonů s monoklonální protilátkou LA-2.
Analýza řetězce antigenu 31 kD (OspA)
Běžným způsobem byla izolována včleněná DNA rekombinantního kmene E. coli, klonu s pozitivní reakcí s protilátkou LA-2. Včleněná DNA tohoto klonu obsahovala gen OspA, který je kódem pro antigen 31 kD B. burgdorferi v celé jeho délce. Plazmid, který obsahoval tento řetězec, byl označen pZS-7/3/-2 a byl označen podle budapešťské úmluvy a uložen do veřejné sbírky po číslem DSM 5528.
Rekombinantní bílkovina, produkovaná tímto pozitivním klonem, byla označena rZS7/31-2 a byl stanoven kódový řetězec DNA genu OspA. Tento řetězec je uveden v tabulce 5 společně s odvozeným řetězcem aminokyselin pro bílkovinu OspA.
Z tabulky 5 je rovněž zřejmé, že antigen 31 kD zB. burgdorferi je bílkovina, která obsahuje 273 aminokyselin.
Příprava nesložené bílkoviny
a) Klon, u nějž dochází k expresi imunoreaktivní bílkoviny rZS7/31-2, byl pěstován přes noc při 30 °C v 10 ml prostředí LB s ampicilinem. 1 ml kultury byl pak přidán ke 100 ml selekčního prostředí a materiál byl pěstován při 30 °C za provzdušňování až do hustoty 8 χ 107 buněk v 1 ml (AĎoo = 0,2). Exprese rekombinantních bílkovin byla dosažena přenesením buněk do teploty 42 °C. Po zchlazení a odstředění byly buňky promyty pufrem STE, který obsahoval 10 mmol 1 tris, 100 mmol/1 chloridu sodného a 1 mmol/1 EDTA při pH 8,0, a získaný materiál byl znovu uveden do suspenze v 0,6 ml pufru pro rozrušení buněk s obsahem 25 % sacharózy a 50 mmol/1 tris při pH 8,0. Po přidání 150 μΙ roztoku s obsahem 10 mg/ml lysozymu byla směs inkubována 15 minut v ledu a pak ještě dalších 15 minut v ledu za přítomnosti 18 μΐ roztoku s obsahem 10 mg/ml DNA-ázy 1 za přítomnosti 5 μΙ 1 mol/1 chloridu hořečnatého. Pak bylo přidáno 250 μΐ 4x směsi smáčedel (1 % Triton X 100, 0,5 % Deoxycholátu, 0,1 mol/1 NaCl, 10 mmol/1 tris, o pH
-7CZ 284538 B6
7,4) a směs byla znovu inkubována 5 minut v ledu. Po odstředění byla usazenina dvakrát promyta pufrem A (50 mmol/1 tris, 50 mmol/1 NaCl, 1 mmol/1 EDTA o pH 8,0) a pak byl materiál znovu uveden do suspenze v devíti objemech pufru A s obsahem 8 M močoviny a směs byla 1 hodinu inkubována při teplotě místnosti. Pak byl vzorek zředěn devíti díly pufru B (50 mmol/1 dihydrogenfosforečnanu a hydrogenfosforečnanu draselného, 50 mol/l NaCl, 1 mmol/1 EDTA o pH 10,7), směs se ještě 30 minut míchá při teplotě místnosti a pH se udržuje hydroxidem draselným na hodnotě 10.7. Pak se pH roztoku upraví na 7,0 přidáním kyseliny chlorovodíkové a vzorek se dialyzuje přes noc proti pufru A při teplotě 4 °C, pak 10 minut při teplotě 4 °C, načež se odstřeďuje 10 minut při teplotě 4 °C a 10 000 ot/min (rotor SS34). Supematant s obsahem rekombinantní bílkoviny se uchovává při -20 °C.
b) Vzhledem ktomu, že tento klon vylučuje imunoreaktivní bílkovinu rZS7/31-2 také do živného prostředí, je možné čištění afinitní chromatografií přímo ze supematantu kultury.
Příprava rekombinantní nesložené bílkoviny OspA a čištění afinitní chromatografií
Rekombinantní bílkoviny pak byly čištěny afinitní chromatografií. K tomuto účelu byly na aktivovanou Sepharose CL 4B kovalentně vázány čištěné monoklonální protilátky LA-2. Dialyzovaný extrakt močoviny byl s rekombinantní bílkovinou navázán na Sepharose CL 4B s myším IgG a nakonec byla tato směs přidána do sloupce LA-2-Sepharosy CL 4B. Po intenzivním promytí byla vázaná rekombinantní bílkoviny podrobena eluci směsí 0,1 mol/l glycinhydrochloridu a 0,1 mol/l NaCl o pH 2,5. Pak bylo pH této frakce neutralizováno okamžitým přidáním 1/10 objemu 0,5 mol/l K2HPO4. Frakce s obsahem bílkoviny byly koncentrovány a dialyzovány. Pomocí elektroforézy na SDS-polyakrylamidovém gelu byl stanoven stupeň čistoty.
Imunologická charakteristika rekombinantní bílkoviny rZS7/31-2
Rekombinantní bílkovina rZS7/31-2 byla imunologicky zkoumána. Pro srovnání byla užita rekombinantní bílkovina rB31/41-9 (povrchový antigen 41 kD B. burgdorferi).
Mikrotitrační plotny s plochým dnem byly převrstveny extraktem rekombinantní bílkoviny rZS7/31-2 a rB31/41-9 s použitím extraktu močovinou, popřípadě extraktem kmene E. coli MC 1061, který byl použit k expresi genu. Nespecifická vazná místa byla blokována 0,2% želatinou v roztoku chloridu sodného s obsahem fosfátového pufru. Do vyhloubení takto připravených mikrotitračních ploten byly přidány monoklonální protilátky LA-2 (anti-31 kD, Osp-A), La-1 (anti-41 kD, Flagellin) a ACHT-2 (anti-ai-Antichymotrypsin).
Vázané monoklonální protilátky byly uvedeny do reakce s imunoglobuliny, specifickými proti myším a značenými peroxidázou. Vázané protilátky, značené peroxidázou, byly kvantitativně stanoveny pomocí orthofenylendiaminu jako substrátu pro peroxidázu. Absorpce při 492 nm (A492) byla stanovena přímo na mikrotitrační plotně pomocí automatizovaného fotometru. Velikost absorpce je přímo úměrná množství vázané monoklonální protilátky.
Monoklonální protilátka LA-2 specificky reaguje s bílkovinou rZS7/31-2, avšak nikoliv s MC 1061 nebo rB31/41-9. Kontrolní reakce monoklonální protilátky LA-1 je specifická pro rB31/41-9. Monoklonální kontrolní protilátka ACHT-2 (negativní kontrola) se neváže na žádnou z uvedených bílkovin.
V tabulce 6 je znázorněno, že dochází k expresi antigenního epitopu na rekombinantní bílkoviny rZS7/31-2 po klonování zgenomu B. burgdorferi ZS7, přičemž tento antigenní epitop je specificky rozpoznáván monoklonální protilátkou LA-2.
-8CZ 284538 B6
Příklad 4
Srovnání specifických protilátek proti antigenu 31 kD (OspA) a 34 kD (OspB) s protilátkami, které jsou specifické pro antigen 41 kD (Flagellin)
Monoklonální protilátky LA-2 a LA-26.1 rozpoznávají antigen 31 kD OspA a je možno je přiřadit k izotypu IgG2b a IgGl. Monoklonální protilátky LA-25.1 a LA-27.1 rozpoznávají antigen 34 kD OspB a je možno je přiřadit k izotypu IgG2b a IgGl. Monoklonální protilátky LA-10 a LA-21 jsou specifické pro pcriplazmatickou bílkovinu 41 kD, spojenou s bičíky B. burgdorferi j ie možno je přiřadit k izotjp.i IgG2a a IgGl. Všec' ny svrchu uvedené protilátky je možno zisk, způsobem podle příkladu 2. Mělo by být stanoveno, zda také monoklonální protilátky proti jinému antigenu B. burgdorferi poskytují Scid-myším ochranu před klinickými projevy infekce.
Polyklonální imunní séra anti-B31-(IMS) byla odebrána z myší C57BL/6 91 dnů po podkožním podání 1 χ 108 organismů B. burgdorferi B31. Polyklonální anti-ZS7 IMS byla odebrána z myší C57BL/6 po 68 dnech po podkožním naočkování 1 χ 108 organismů B. burgdorferi ZS7. Obě séra obsahovala 60 gg/ml specifických protilátek, jak bylo možno prokázat zkouškou ELISA podle publikace Schaible a další, J. Exp. Med. 170 (1989), 1427- 1432. Normální myší sérum (NMS) bylo odebráno z neinfikovaných myší C57BL/6.
Od naočkování v intervalech čtyř dnů byly svrchu uvedené protilátky nebo PBS-pufr podávány pasivně intraperitoneálně Scid-myším následujícím způsobem;
den 0 a 3: 100 μΐ, den 7 a 10: 200μ1, den 13 a 17: 300 μΐ.
Scid-myši, ošetřené protilátkami anti-ZS7IMS, anti-B31IMS nebo monoklonální protilátkou LA-2 nevykazovaly žádné viditelné klinické příznaky zánětu kloubů, nedošlo ke zčervenání ani otoku tibiotarsálních kloubů v průběhu 21 dnů. Neobjevily se ani příznaky zánětu srdce a jaté?. Histopatologická vyšetření neprokázala změnu kloubů, srdce a jater u Scid-myší, které obdržely jakoukoliv z těchto protilátek.
Také další Osp-A specifické monoklonální protilátky LA-26.1 (IgGl) a OspB specifické protilátky LA-25.1 a LA-27.1 potlačovaly nebo zmírňovaly všechny příznaky, zde však došlo k lehkým patologickým změnám uvedených orgánů.
Naproti tomu měly Scid-myši po podání pufru PBS, NMS nebo monoklonální protilátky proti Flagellinu (LA-10 nebo LA-21) klinické příznaky typické artritidy, jak je zřejmé u neošetřených myší a jak je uvedeno v tabulce 3. Těžké příznaky se zvyšovaly v průběhu času po naočkování a po celou dobu pozorování se nezmírnily. Ze Scid-myší, předem ošetřených anti-ZS7IMS nebo LA-2 nebylo možno izolovat spirochety. Oproti tomu bylo možno prokázat spirochety imunofluorescencí a kultivací z krve těch Scid-myší, které byly ošetřeny podáním pufru PBS, NMS nebo monoklonálními protilátkami LA-25.1, LA-26.1, LA-27.1, LA-10 nebo LA-21.
-9CZ 284538 B6
Tabulka 3
Scid- C.B.-17 počet myší ošetření Subtyp IgG klinická arthritis histopatologická periarthritis/ arthritis carditis průkaz B. burgdorferi kultivace a imunofluorescence
n = 8 PBS (neg. kontrola) + + + +
n = 3 NMS (neg. kontrola) + + + +
n = 3 anti-B31 1MS - - X +°
n = + anti-ZS7 IMS - - X -
n = 6 LA-2 (OspA) 2b - X X -
n = 3 LA-10 (Flagellin) 2a + + + +°
n = 3 LA-21 (Flagellin) 1 + + +/- +
n = 3 LA-26.1 (OspA) 1 ± ± ± +°
n = 3 LA-25.1 (OspB) 2b ± ± ± +
n = 3 LA-27.1 (OspB) 1 + + ± +°
Stupeň patologických změn je označován takto: - žádný, -x subklinický, +/- mírný, + těžký. 0 = průkaz B. burgdorferi imunofluorescencí nebyl možný u všech jedinců.
Příklad 5
Vliv antiséra myší, imunizovaných OspA, na průběh onemocnění u Scid-myší
V tomto pokusu bylo prokázáno, že podání nativního OspA, izolovaného z B. burgdorferi ZS-7 nebo rekombinantního OspA, izolovaného z bakterií E. coli, transformovaných rekombinantním plazmidem pZS-7/31-2, DSM 5528 vyvolává u normálních myší kmene C57BL/6 tvorbu ochranných polyklonálních protilátek. V případě, že tyto protilátky jsou podány Scid-myším, chrání proti onemocnění. Bylo tedy možno prokázat, že rekombinantní OspA vyvolává ochrannou imunologickou odpověď, srovnatelnou s odpovědí na nativní OspA. Výsledky a podrobnosti pokusu jsou uvedeny v tabulce 4.
Získání rekombinantního OspA je uvedeno v příkladu 3.
Získání nativního OspA a imunizace myší tímto materiálem bude dále popsána.
Získání nativního 31 kDa OspA
3,2 x 1O10 spirochet se míchá 2 hodiny při 4 °C v 5 ml PBS/7,5 ml n-butanolu za přítomnosti inhibitoru proteázy (5 mmol/1 EDTA, 5 mmol/1 benzamidinu a 0,5 mmol/1 PMSF) při použití magnetického míchadla. Pak se směs odstřeďuje 90 minut s 10 000 ot/min a 4 °C v odstředivce (Sorvall). Vodná fáze s obsahem povrchové bílkoviny se izoluje a třikrát promyje chloroformem. Obsah bílkoviny se zjistí extinkcí při 280 nm nebo testem BCA.
V gelu s obsahem stříbra nebo metodou Westemblot s králičím sérem proti B. burgdorferi lze prokázat pro kmen ZS7 hlavní pás s molekulovou hmotností 31 000 a slabší pásy při 20 000, 34 000 a 65 000 až 68 000. Ve směsi butanolu a vody poskytuje kmen B31 hlavní pás při 31 000 a slabší pásy 20 000 a 34 000.
- 10CZ 284538 B6
Imunizace myší nativním a rekombinantním OspA
Myši C57BL6 a myši C.B-17 byly očkovány třikrát v odstupu 7 až 10 dnů podáním 5 pg nativního OspA kmene B31 nebo 10 mg nativního OspA kmene ZS7 nebo rekombinantního OspA téhož kmene ve 100 μΐ pomocného prostředku (ABM3, Fa. Sebak, Aidenbach, NSR) podkožně v oblasti kořene ocasu. Nejdříve 3 týdny po posledním podání bylo možno odebírat sérum 3 a 4 měsíce. Obsah specifických protilátek byl stanoven metodou ELISA.
Tabulka 4
Vliv specifických monoklonálních a polyklonálních protilátek proti B. burgdorferi na spirochetózu a vývoj zánětu kloubů u infikovaných Scid-myší.
Scid-myši C.B.-17 počet ošetření vývoj zánětu kloubů týdny průkaz B. burgdorferi
1 2 3
n = 6 PBS (negativní kontrola) ± + + 6/6
n = 6 LA-2 — — - 0/3
n = 2 anti OspA (nativní) IMS - - - 0/2
n = 3 anti OspA (rekomb.) IMS - - - 0/3
První dávka protilátky byla podána intraperitoneálně v objemu 100 μΐ ve dni 0, tj. současně s infekcí B. burgdorferi ZS-7, 1 x 108 organismů podkožně do oblasti kořene ocasu.
Další dávky protilátek byly podány ve dnech 4 (100 μΐ, 7 (200 μΐ), 11 (200 μΐ), 14 (300 μΐ), 18 (300 μΙ), vždy intraperitoneálně.
PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (15)

1. Očkovací látka proti borelióze, onemocnění Lyme, vyznačující se tím, že obsahuje jednu nebo větší počet monoklonálních protilátek, specifických pro antigen 31 kD, OspA nebo 34 kD, OspB, Borrelia burgdorferi.
2. Očkovací látka proti borelióze, onemocnění Lyme, vyznačující se tím, že obsahuje jednu nebo větší počet monoklonálních protilátek, specifických pro antigen 31 kD, OspA, Borrelia burgdorferi.
3. Očkovací látka proti borelióze, onemocnění Lyme, vyznačující se tím, že obsahuje jednu nebo větší počet monoklonálních protilátek, specifických pro antigen 34 kD, OspB, Borrelia burgdorferi.
4. Očkovací látka podle nároku 1, vyznačující se tím, že obsahuje protilátku, specifickou pro antigen 31 kD Borrelia burgdorferi, kmenů ZS7, DSM 5527, nebo/a B31, ATCC 35210.
-11 CZ 284538 B6
5. Očkovací látka podle nároku 1, vyznačující se tím, že obsahuje protilátku, specifickou pro antigen 34 kD Borrelia burgdorferi, kmenů ZS7, DSM 5527, nebo/a B31, ATCC 35210.
6. Očkovací látka podle nároku 2, vyznačující se tím, že obsahuje monoklonální protilátku ze skupiny IgG, s výhodou podskupiny IgG2b nebo IgGl.
7. Očkovací látka podle nároku 3, vyznačující se tím, že obsahuje monoklonální protilátku ze skupiny IgG, s výhodou podskupiny IgG2b nebo IgGl.
8. Způsob výroby očkovací látky proti borelióze, vyznačující se 'tím, že se z lymfocytů nebo slezinných buněk pokusných zvířat, s výhodou myší, imunizovaných organismy Borrelia burgdorferi nebo jejich částmi, vytvoří fúzí buněk hybridom, produkující monoklonální protilátku LA2 podle nároku 2.
9. Způsob výroby očkovací látky proti borelióze, vyznačující se tím, že se z lymfocytů nebo slezinných buněk pokusných zvířat, s výhodou myší, imunizovaných organismy Borrelia burgdorferi nebo jejich částmi, vytvoří fúzí buněk hybridom, produkující monoklonální protilátky LA 25.1, LA 26.1 a LA 27.1 podle nároku 3.
10. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, žesek imunizaci užijí kompletní organismy Borrelia burgdorferi B31 nebo/a ZS7.
11. Způsob podle nároku 9, vyznačující se tím, žesek imunizaci užijí kompletní organismy Borrelia burgdorferi B31 nebo/a ZS7.
12. Monoklonální protilátka LA-2 proti OspA podle nároku 2, vylučovaná buněčnou linií hybridomu ECACC 89091302.
13. Monoklonální protilátka LA-26.1 proti OspA podle nároku 3, vylučovaná buněčnou linií hybridomu ECACC 90050406.
14. Monoklonální protilátka LA-25.1 proti OspB podle nároku 3, vylučovaná buněčnou linií hybridomu ECACC 90050405.
15. Monoklonální protilátka LA-27.1 proti OspB podle nároku 3, vylučovaná buněčnou linií hybridomu ECACC 90050407.
2 výkresy
- 12CZ 284538 B6
OBR. i
Řetězec DNA s odvozeným řetězcem aminokyselin pro antigen 31 kDa (OspA) z B. burgdorferi ZS7 atcaaaaaatatttattgggaataggtctaatattagccttaatagcatgtaagcaaaat: M KKYLLGIGLILAL I A C K Q N gctagcagccttgacgagaaaaacagcgtttcagtagattcgcctgcr.gaaatgaacgct vššldeknšvsvdlp; e m n v cttgtaagcaaagaaaaaaacaaagacggcaagtacgatctaattgcaacagtčgacaag
L S K e k n k d g k y d l i a t v dk cttgagcttaaaggaacr.tctgataaaaacaatggatctggagtacttgaaggcgtaaaa L E^ L K *G T S D K N N g S G V L Ξ G VK gctgacaaaactaaagúaaaattaacaatttctgacgatctaggtcaaaccacactitgaa adkskvkltisddlgqttle ctztzcaaagaagacggcaaaacactagtatcaaaaaaagzaacutccaaagacaagzca
V F K 'i ’□ G K T L V S K λ ~V T S K Dk” 3 tcaacagaagaaaaatucaatgaaaaaggtgaagtatctgaaaaaa<:aataacaagagca
S 7 ξ Ξ K F N Ξ K G Ί1 V S Ξ K I I T R 'k gacgcaaccagac£tg.=atacacagaaaut.aaaagcgatggatc::gga=aagc£=a=gag DGTRLEYTE I K S D G S G K 'k K Ξ gtc.u.L.aaaaagdaiigc.íidtigaaggaactiL—aadgcÉgaaaaaaca.acat cggcggUtL
VLKŠYVL EGTLTAEKTT 'v aaagaaggaac£gct3CÉt“aagcaaaaacait:tcaaaacctggggaagttccagEgaa
KEGTVTLSKNISKS(Te'vSv’e cxtaatgacactgacagcagtgctgcxactaaaaaaactgcagcttggaaLtcaggcact LNDTDSSAATK-KTAAWNSGT tcaaccttzaacaattactgtaaacagtaaaaaaaccaaagacccÉgticxttiacaaaagaa S T L T I · T V N S K K T K L V F T K Ξ aacacaa£tacagcacaacaacacgactcaaaccjgcaccaaattagaggggr.cagc=cf-t. NT I TVQQYD SNGT K L E G S A V gaaattacaaaacttgatgaaattaaaaacgctttaaaacaa eitki/deiknalk*
CS904560A 1989-09-19 1990-09-19 Očkovací látka proti boreliose, způsob její výroby a monoklonální protilátky CZ284538B6 (cs)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE3931236 1989-09-19
DE4015911A DE4015911A1 (de) 1989-09-19 1990-05-17 Impfstoff gegen die lyme-krankheit

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ456090A3 CZ456090A3 (cs) 1998-08-12
CZ284538B6 true CZ284538B6 (cs) 1998-12-16

Family

ID=25885304

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ95970A CZ284616B6 (cs) 1989-09-19 1990-09-19 Očkovací látka, antigen, kódová rekombinantní DNA pro tento antigen, rekombinantní vektor a způsob výroby antigenu
CS904560A CZ284538B6 (cs) 1989-09-19 1990-09-19 Očkovací látka proti boreliose, způsob její výroby a monoklonální protilátky

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ95970A CZ284616B6 (cs) 1989-09-19 1990-09-19 Očkovací látka, antigen, kódová rekombinantní DNA pro tento antigen, rekombinantní vektor a způsob výroby antigenu

Country Status (24)

Country Link
US (6) US5178859A (cs)
EP (5) EP0861664A3 (cs)
JP (3) JP3205932B2 (cs)
KR (2) KR100205462B1 (cs)
AT (4) ATE175576T1 (cs)
AU (1) AU651560B2 (cs)
CA (1) CA2025597C (cs)
CZ (2) CZ284616B6 (cs)
DE (5) DE4015911A1 (cs)
DK (4) DK0418827T3 (cs)
ES (4) ES2129551T3 (cs)
FI (1) FI102248B (cs)
GR (3) GR3018995T3 (cs)
HK (2) HK1002405A1 (cs)
HR (1) HRP940545B1 (cs)
HU (2) HU212716B (cs)
IE (1) IE903377A1 (cs)
NO (2) NO311767B1 (cs)
NZ (1) NZ235260A (cs)
PL (2) PL169804B1 (cs)
PT (1) PT95349B (cs)
SI (1) SI9011773B (cs)
SK (3) SK283089B6 (cs)
YU (2) YU48250B (cs)

Families Citing this family (44)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK590288D0 (da) 1988-10-24 1988-10-24 Symbicom Ab Kemiske forbindelser
US7094391B1 (en) * 1988-10-24 2006-08-22 The University Of Texas System Compositions and methods for administering Borrelia burgdorferi antigens
US5777095A (en) * 1988-10-24 1998-07-07 Symbicom Aktiebolag Osp A and B Sequence of Borrelia burgdonferi strains ACA1 and IP90
US6143872A (en) * 1988-10-24 2000-11-07 Symbicom Aktiebolag Borrelia burdorferi Osp A and B proteins and immunogenic peptides
DE4015911A1 (de) * 1989-09-19 1991-03-28 Max Planck Gesellschaft Impfstoff gegen die lyme-krankheit
US5582829A (en) * 1990-04-05 1996-12-10 Rx Technologies, Inc. Sonicated borrelia burgdorferi vaccine
JPH06501382A (ja) 1990-06-15 1994-02-17 エール ユニバーシティ ライム病の予防および診断に用いる組成物および方法
EP1016416A3 (en) * 1990-07-06 2002-10-23 Wyeth Vaccine against lyme disease and a challenge model for evaluating vaccine efficacy
CA2057536C (en) * 1990-12-21 1999-10-26 John J. Dunn Cloning and expression of borrelia lipoproteins
US6872550B1 (en) 1991-07-11 2005-03-29 Baxter Vaccine Ag Immunogenic formulation of OspC antigen vaccines for the prevention and treatment of lyme disease and recombinant methods for the preparation of such antigens
US6221363B1 (en) * 1991-07-11 2001-04-24 Baxter Aktiengesellschaft Vaccine for the prevention of lyme disease
JPH07501687A (ja) * 1991-08-15 1995-02-23 スミスクライン・ビーチャム・バイオロジカルス（ソシエテ・アノニム） ボレリア・ブルグドルフェリのサブグループのｏｓｐ　ａ　蛋白、それをコードしている遺伝子およびワクチン
US6676942B1 (en) * 1991-08-15 2004-01-13 Smithkline Beecham Biologicals (S.A.) Osp a proteins of Borrelia burgdorferi subgroups, encoding genes and vaccines
PT100980B (pt) * 1991-10-18 1999-07-30 Connaught Lab Proteinas recombinantes de borrelia, seu processo de producao, vacina contra infeccao por borrelia e agente de imunodiagnostico para a sua deteccao
EP0540457A1 (en) * 1991-10-22 1993-05-05 Symbicom Ab Improvements in Borrelia burgdorferi diagnosis and prophylaxis
US6303129B1 (en) * 1992-07-28 2001-10-16 Rx Technologies Production of borrelia burgdorferi vaccine, product produced thereby and method of use
US6716591B1 (en) 1993-07-30 2004-04-06 Yale University B. burgdorferi polypeptides
US5656451A (en) * 1993-07-30 1997-08-12 Yale University OspE, OspF, and S1 polypeptides in borrelia burgdorferi
US7008625B2 (en) 1993-11-01 2006-03-07 Research Foundation Of The State University Of New York Recombinant constructs of Borrelia burgdorferi
US5558993A (en) * 1994-06-17 1996-09-24 The Regents Of The University Of California Cloned Borrelia burgdorferi virulence protein
GB9511909D0 (en) * 1995-06-12 1995-08-09 Microbiological Res Authority Vaccine
ATE301716T1 (de) 1996-02-21 2005-08-15 Univ Texas Vmp-ähnliche sequenzen von pathogener borrelia
DE19632862B4 (de) 1996-08-14 2006-08-03 Mikrogen Molekularbiologische Entwicklungs-Gmbh Immunologisch aktive Proteine von Borrelia burgdorferi, dafür kodierende Nukleinsäuren sowie deren Verwendung in Testkits und als Impfstoffe
US6458555B1 (en) * 1996-08-21 2002-10-01 Gerd Bach Cytologic method of examining mucous membranes
US6060082A (en) * 1997-04-18 2000-05-09 Massachusetts Institute Of Technology Polymerized liposomes targeted to M cells and useful for oral or mucosal drug delivery
DE19740735A1 (de) * 1997-09-16 1999-03-18 Max Planck Gesellschaft Arzneimittel zur Therapie einer manifesten Lyme-Borreliose
US6306623B1 (en) 1998-02-24 2001-10-23 The University Of California Leptospiral major outer membrane protein LipL32
DK1100922T3 (da) 1998-07-31 2008-06-16 Gundersen Lutheran Medical Fou Anvendelser af én eller flere borreliacide epitoper på ydermembranprotein C fra Borrelia burgdorferi (OspC) som vaccine
WO2000056298A2 (en) * 1999-03-19 2000-09-28 Luitpold Pharmaceuticals, Inc. Treatment of lyme disease with polysulfated glycosaminoglycan formulations
AU4800500A (en) 1999-06-21 2001-01-09 Milkhaus Laboratory, Inc. Method for treatment of lyme disease
DK1311540T3 (da) 2000-08-18 2008-04-28 Brookhaven Sciences Ass Llc Ændret OspA af Borrelia Burgdorferi
AU2003299872A1 (en) 2002-12-20 2004-07-22 Board Of Regents, The University Of Texas System Vmp-like sequences of pathogenic borrelia species and strains
KR101192127B1 (ko) 2006-11-03 2012-10-17 쉐링-프라우 리미티드 개 라임병 백신
EP2361930A3 (en) 2007-03-26 2011-10-26 Dako Denmark A/S Multimers of MHC-peptide complexes and uses thereof in Borrelia infectious diseases
EP2167536A1 (en) 2007-07-03 2010-03-31 Dako Denmark A/S Mhc multimers, methods for their generation, labeling and use
US10611818B2 (en) 2007-09-27 2020-04-07 Agilent Technologies, Inc. MHC multimers in tuberculosis diagnostics, vaccine and therapeutics
US10968269B1 (en) 2008-02-28 2021-04-06 Agilent Technologies, Inc. MHC multimers in borrelia diagnostics and disease
WO2010009735A2 (en) 2008-07-23 2010-01-28 Dako Denmark A/S Combinatorial analysis and repair
GB0817244D0 (en) 2008-09-20 2008-10-29 Univ Cardiff Use of a protein kinase inhibitor to detect immune cells, such as T cells
WO2010037402A1 (en) 2008-10-02 2010-04-08 Dako Denmark A/S Molecular vaccines for infectious disease
WO2011063003A2 (en) * 2009-11-17 2011-05-26 Abaxis, Inc. Peptides and methods for the detection of lyme disease antibodies
US8758772B2 (en) 2011-11-04 2014-06-24 Abaxis, Inc. Peptides and methods for the detection of lyme disease antibodies
PL223175B1 (pl) 2012-10-22 2016-10-31 Inst Chemii Bioorganicznej Polskiej Akademii Nauk Szczepionka przeciw boreliozie, konstrukt genetyczny, rekombinowane białko, sposób otrzymywania konstruktu genetycznego, sposób otrzymywania szczepionki, sposób otrzymywania rekombinowanych białek, zastosowanie rekombinowanych białek do wytwarzania szczepionki przeciwko boreliozie
US9610336B1 (en) * 2014-07-16 2017-04-04 Amiram Katz Immunotherapy for lyme disease

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK590288D0 (da) * 1988-10-24 1988-10-24 Symbicom Ab Kemiske forbindelser
US4772464A (en) 1985-08-01 1988-09-20 Miles Laboratories, Inc. Protective antibodies to serotypic determinants of flagellar antigens
US4888276A (en) 1986-06-26 1989-12-19 Minnesota Mining And Manufacturing Company Method and composition for the diagnosis of Lyme disease
US4721617A (en) 1986-08-14 1988-01-26 Regents Of The University Of Minnesota Vaccine against lyme disease
US5034515A (en) * 1987-09-22 1991-07-23 Wisconsin Alumni Research Foundation Staphylococcal fibronectin receptor, monoclonal antibodies thereto and methods of use
DE4015911A1 (de) * 1989-09-19 1991-03-28 Max Planck Gesellschaft Impfstoff gegen die lyme-krankheit
ATE140461T1 (de) * 1989-12-22 1996-08-15 Mikrogen Molekularbiol Entw Immunologisch aktive proteine von borrelia burgdorferi, zusammenhängende testkits und impfstoff
JPH06501382A (ja) * 1990-06-15 1994-02-17 エール ユニバーシティ ライム病の予防および診断に用いる組成物および方法
EP1016416A3 (en) * 1990-07-06 2002-10-23 Wyeth Vaccine against lyme disease and a challenge model for evaluating vaccine efficacy
CA2057536C (en) * 1990-12-21 1999-10-26 John J. Dunn Cloning and expression of borrelia lipoproteins
JPH07501687A (ja) * 1991-08-15 1995-02-23 スミスクライン・ビーチャム・バイオロジカルス（ソシエテ・アノニム） ボレリア・ブルグドルフェリのサブグループのｏｓｐ　ａ　蛋白、それをコードしている遺伝子およびワクチン
DK0642574T3 (da) * 1991-08-27 1999-08-16 Novo Nordisk As Detergentsammensætninger
PT100980B (pt) * 1991-10-18 1999-07-30 Connaught Lab Proteinas recombinantes de borrelia, seu processo de producao, vacina contra infeccao por borrelia e agente de imunodiagnostico para a sua deteccao
EP0625052A4 (en) * 1991-10-21 1995-07-19 Medimmune Inc SECRETION SIGNAL OF LIPOPROTEIN-ENCODING DNA CONTAINING BACTERIAL EXPRESSION VECTOR.

Also Published As

Publication number Publication date
EP0861664A2 (de) 1998-09-02
NO20014624D0 (no) 2001-09-24
ES2129551T3 (es) 1999-06-16
HU211228A9 (en) 1995-11-28
DE59010903D1 (de) 2000-05-11
HRP940545A2 (en) 1997-04-30
IE903377A1 (en) 1991-04-10
JPH03209400A (ja) 1991-09-12
KR910005889A (ko) 1991-04-27
PT95349B (pt) 1997-06-30
DE4015911A1 (de) 1991-03-28
DE59010863D1 (de) 1999-02-25
DE59010888D1 (de) 1999-12-23
PL170229B1 (pl) 1996-11-29
NO315905B1 (no) 2003-11-10
JP2001069969A (ja) 2001-03-21
HU905816D0 (en) 1991-03-28
DK0633028T3 (da) 2000-04-10
KR100205462B1 (ko) 1999-07-01
EP0633313A1 (de) 1995-01-11
EP0418827A1 (de) 1991-03-27
IE990173A1 (en) 2000-11-01
ES2145077T3 (es) 2000-07-01
SK283089B6 (sk) 2003-02-04
SK151198A3 (en) 1999-04-13
US6613331B1 (en) 2003-09-02
EP0633313B1 (de) 2000-04-05
SK151098A3 (en) 1999-04-13
HUT59613A (en) 1992-06-29
AU6244490A (en) 1991-03-28
EP0418827B1 (de) 1995-12-20
SK283088B6 (sk) 2003-02-04
NO904062L (no) 1991-03-20
DK0418827T3 (da) 1996-05-06
ES2082812T3 (es) 1996-04-01
YU48250B (sh) 1997-09-30
US5434077A (en) 1995-07-18
CA2025597C (en) 2004-02-03
NO20014624L (no) 1991-03-20
DK0633313T3 (da) 2000-07-24
JP3205932B2 (ja) 2001-09-04
EP0643974B1 (de) 1999-01-13
PT95349A (pt) 1991-05-22
GR3018995T3 (en) 1996-05-31
ATE186646T1 (de) 1999-12-15
JP2001204467A (ja) 2001-07-31
SI9011773A (sl) 1998-04-30
GR3033675T3 (en) 2000-10-31
JP3328644B2 (ja) 2002-09-30
NO904062D0 (no) 1990-09-18
SK456090A3 (en) 1999-11-08
DE59009978D1 (de) 1996-02-01
JP3418171B2 (ja) 2003-06-16
NZ235260A (en) 1993-04-28
AU651560B2 (en) 1994-07-28
US5686267A (en) 1997-11-11
KR100202128B1 (en) 1999-06-15
US5178859A (en) 1993-01-12
FI102248B1 (fi) 1998-11-13
SI9011773B (en) 2001-12-31
ES2141182T3 (es) 2000-03-16
DK0643974T3 (da) 1999-09-06
FI102248B (fi) 1998-11-13
FI904597A0 (fi) 1990-09-18
CZ284616B6 (cs) 1999-01-13
GR3032010T3 (en) 2000-03-31
ATE131732T1 (de) 1996-01-15
PL169804B1 (pl) 1996-09-30
ATE175576T1 (de) 1999-01-15
HU212716B (en) 1996-10-28
CZ456090A3 (cs) 1998-08-12
ATE191499T1 (de) 2000-04-15
HRP940545B1 (en) 2000-06-30
EP0861664A3 (de) 1999-02-24
EP0643974A1 (de) 1995-03-22
HK1002405A1 (en) 1998-08-21
YU177390A (sh) 1993-05-28
US5856447A (en) 1999-01-05
EP0633028B1 (de) 1999-11-17
SK280285B6 (sk) 1999-11-08
EP0633028A1 (de) 1995-01-11
NO311767B1 (no) 2002-01-21
CA2025597A1 (en) 1991-03-20
CZ97095A3 (en) 1995-09-13
US5780030A (en) 1998-07-14
HK1013620A1 (en) 1999-09-03
YU49370B (sh) 2005-09-19
YU9097A (sh) 1999-06-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ284538B6 (cs) Očkovací látka proti boreliose, způsob její výroby a monoklonální protilátky
US5747294A (en) Compositions and methods for the prevention and diagnosis of lyme disease
FI111336B (fi) Menetelmä Staphylococcus epidermidis tyyppi I:n polysakkaridiantigeenin sisältävän rokotteen ja antigeeninvastaisen hyperimmunoglobuliinin valmistamiseksi
JP2907813B2 (ja) コクシジウム症予防用抗原性蛋白質およびそれを含有するワクチン
IE83320B1 (en) Vaccine against lyme disease
US4597967A (en) Synthetic polypeptide fragments
US5656451A (en) OspE, OspF, and S1 polypeptides in borrelia burgdorferi
US4521334A (en) Synthetic polypeptide fragments
CZ289302B6 (cs) Polypeptid Streptococcus suis, vakcína proti infekci Streptococcus suis a protilátky, reagující s polypeptidem Streptococcus suis
MX2010010614A (es) Composiciones, metodos y kits.
US6716591B1 (en) B. burgdorferi polypeptides
WO1997042325A1 (en) B. burgdorferi polypeptides expressed in vivo
AU673912B2 (en) Vaccine against lyme disease
Pal et al. Electrophoretic mobility and immune response of outer membrane proteins of Vibrio cholerae O139

Legal Events

Date Code Title Description
IF00 In force as of 2000-06-30 in czech republic
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20050919