JP2001069969A - 病原性ボレリア・ブルグドルフェリ菌株、病原性ボレリア・ブルグドルフェリの単離及び再培養法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 病原性ボレリア・ブルグトフェリ菌株ＺＳ
７、その単離及び再培養法 【解決手段】 予め病原体で感染された免疫欠失実験動
物から病原体を取得し、この際、この病原性を保持残留
させることにより、病原性ボレリア・ブルグドフェリ菌
株ＺＳ７（ＤＳＭ５５２７）組織を単離し、再培養す
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ライム−病（Ｌｙ
ｍｅ−Ｋｒａｎｋｈｅｉｔ）に対するワクチン、その取
得法、モノクローナル抗体、病原性ボレリア・ブルグド
ルフェリ菌株、抗原、組換えＤＮＡ、組換えベクター、
抗原の取得法及び病原性Ｂ．ブルグドルフェリを単離か
つ再培養する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ライム−ボレリオース（Ｌｙｍｅ−Ｂｏ
ｒｒｅｌｉｏｓｅ）は、温帯における屡々、ダニにより
媒介される伝染病である。これは、スピロヘータ ボレ
リア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇ
ｄｏｒｆｅｒｉ）により惹起され、この菌は特にマダニ
（Ｉｘｏｄｅｓ）によりヒトに伝染される。この病気
は、多くの臓器例えば皮ふ、中枢又は末梢神経系、心
臓、肝臓、腎臓及び骨格筋系に羅病する慢性で漸進性の
伝染病である。抗生物質を用いる治療によるこの病気の
可能な処置は困難であるので、現在は、病原菌そのもの
及び宿主のＢ．ブルグドルフェリでの感染に対する免疫
応答を研究する多大の努力がなされている。ライム病に
かかったヒトでは、Ｂ．ブルグドルフェリに対する高い
抗体価が確認されるが、この感染に対する保護の作用は
得られない。この病原体は非常に迅速に血管から組織中
に移行し、そこで、免疫系にもはや直接到達可能ではな
いと考えられる。このことは、抗体による保護は、感染
の開始の直後にのみ、病原体がなお血管内に存在するか
ぎりにおいて可能であることを意味している。

【０００３】種々の動物におけるＢ．ブルグドルフェリ
による自然の感染が発見された事実は、ライム病に関す
る実験室内モデルを作る試みをもたらした。このこと
は、限られた結果で成功した。例えば、マウスにおける
Ｂ．ブルグドルフェリに対して特異的な免疫応答の誘発
を目的とした実験では、既に長時間培養したＢ．ブルグ
ドルフェリ−単離体での同系交配−マウス種の感染は、
種々の臓器例えば脳、心臓、肺及び腎臓内での、ライム
病を有する患者で観察されるそれと匹敵する中程度であ
るが顕著な病理形態学的な変化をもたらしたことが判明
した（Ｓｃｈａｉｂｌｅ等による（１９８８）、Ｉｎｆ
ｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．１，４１）。動物における重大な
病気の発症は、おそらく、宿主の免疫防御及び／又は長
時間にわたり試験管内で培養されたスピロヘータの減少
された毒性に依り、阻止された（Ｊｏｈｎｓｏｎ等によ
る（１９８４）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２
０，７４７，Ｓｃｈｗａｎ等による（１９８８）Ｉｎｆ
ｅｃｔ．ａｎｄ Ｉｍｍｕｎ．５６，１８３７）。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明の基礎となって
いる課題は、ライム病に対する有効なワクチンを製造す
ることである。しかしながら、このためには、まず、適
当な実験動物モデルの開発が必要である。ところで、機
能的Ｔ−及びＢ−細胞のないマウス、いわゆるＳｃｉｄ
−マウス（Ｓｃｉｄ−Ｍａｕｓ；Ｂｏｓｍａ等によるＮ
ａｔｕｒｅ（１９８３）１０，５２参照）を実験動物と
して使用することが提案された。それというのも、Ｓｃ
ｉｄ−マウスは病原性Ｂ．ブルグドルフェリ−単離体で
の感染時に、多系統疾病しかも、主として多発関節炎及
び心筋炎を発症するからである。この動物モデルによ
り、はじめて、ライム病に対するこのワクチンの作用を
確かめることが可能になる。

【０００５】本発明の対象物は、Ｂ．ブルグドルフェリ
の３１ｋＤ抗原（ＯｓｐＡ）又は／及び３４ｋＤ抗原
（ＯｓｐＢ）殊に菌株Ｂ３１（ＡＴＣＣ３５２１０）又
は／及びＺＳ７（ＤＳＭ５５２７）のＯｓｐＡ又は／及
びＯｓｐＢに関して特異的なモノクローナル抗体１種以
上を含有する、ライム病に対する受動ワクチンである。
ＩｇＧ群特にＩｇＧ２ｂ又はＩｇＧ１亜群の本発明によ
る抗体を含有するワクチンが有利である。本発明による
抗体の適用は、意外にも、例えばＢ．ブルグドルフェリ
の４１ｋＤ表面抗原（Ｆｌａｇｅｌｌｉｎ）に対する他
の抗体の適用とは反対に、免疫欠失実験動物特に生存可
能な病原性Ｂ．ブルグドルフェリ特にＢ．ブルグドルフ
ェリＺＳ７で感染されたＳｃｉｄ−マウスにおいて、関
節炎、心筋炎及び肝炎の発症を完全に又は少なくとも充
分に阻止する作用をする。

【０００６】場合によっては、本発明によるワクチン
は、作用物質としての抗体と共になお慣用の担持剤、充
填剤及び助剤をも含有していてもよい。

【０００７】更に、本発明は、実験動物特に、Ｂ．ブル
グドルフェリ生物体又はその１部、特に完全Ｂ．ブルグ
ドルフェリＢ３１又は／及びＺＳ７生物体で免疫化され
ているマウスのリンパ細胞又は脾臓細胞からの、ライム
病に対する受動ワクチンの取得法にも関し、この際、免
疫化された動物のリンパ細胞又は脾臓細胞から細胞融合
により、本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブ
リドーマを取得する。

【０００８】ＯｓｐＡに対する本発明による抗体ＬＡ−
２（ＩｇＧ２ｂ）を産生するハイブリドーマ−セルライ
ン（ＥＣＡＣＣ８９０９１３０２）も本発明の対象物で
ある。更に、ＯｓｐＡに対する抗体ＬＡ−２６．１（Ｉ
ｇＧ１）を産生するハイブリドーマ−セルラインＥＣＡ
ＣＣ９００５０４０６並びにＯｓｐＢに対する抗体ＬＡ
−２５．１もしくはＬＡ−２７．１（ＩｇＧ２ｂもしく
はＩｇＧ１）産生性のハイブリドーマ−セルラインＥＣ
ＡＣＣ９００５０４０５もしくはＥＣＡＣＣ９００５０
４０７も本発明の対象物である。

【０００９】同様に、本発明には、病原性Ｂ．ブルグド
ルフェリ菌株ＺＳ７（ＤＳＭ５５２７）も包含される。

【００１０】更に、本発明のモノクローナル抗体と免疫
反応する抗原も本発明の対象物である。これは、Ｏｓｐ
ＡもしくはＯｓｐＢの全アミノ酸配列又はＯｓｐＡもし
くはＯｓｐＢの免疫原作用をする部分配列（免疫原性エ
ピトープ）のみをも含有する抗原である。当業者は、こ
の蛋白質の可能な免疫原性エピトープを困難なく、Ｏｓ
ｐＡ−蛋白質の構造分析（例えばＣｈｏｕ-Ｆａｓｓｍ
ａｎｎ Ａｎａｌｙｓｅ）により確認し、実験的にその
作用を試験することができる。

【００１１】本発明の１目的物は、殊に本発明の抗体と
免疫反応する組換え抗原でもあり、この際、抗原に関し
て暗号化するＤＮＡ−配列は、組換えベクター特に蛋白
質表現のために好適である原核性ベクター上に存在す
る。

【００１２】殊に、本発明の目的物は、特異的に本発明
の抗体と免疫反応し、図１に記載のアミノ酸配列又はこ
の配列からの免疫原性エピトープを有する、Ｂ．ブルグ
ドルフェリからの抗原である。相応して、本発明は、
（１）図１に記載の配列、（２）遺伝子コードの変性の
範囲内でそれに相応する核酸配列又は（３）（１）又は
／及び（２）からの配列と厳しい条件下にハイブリド形
成し、Ｂ．ブルグドルフェリＺＳ７の３１ｋＤ抗原又は
その免疫原性エピトープに関して暗号化する配列を有す
る組換えＤＮＡにも関する。ここで、「厳しいハイブリ
ド形成条件」なる概念は、マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉ
ｓ）等のモレキュラー・クローニング・ア・ラボラトリ
イ・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ
Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８
２），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に記載のような条
件と解すべきである。

【００１３】特に、組換え非融合蛋白質又はβ−ガラク
トシダーゼ−融合蛋白質である、本発明の抗原が有利で
ある。

【００１４】更に、本発明は、本発明による組換えＤＮ
Ａの１以上のコピーを有する組換えベクターをも包含す
る。この本発明によるベクターは、原核性及び／又は真
核性のベクターであってよく、原核性ベクターが有利で
ある。この組換えベクターは、宿主細胞中に染色体外に
存在（例えばプラスミド）していてよいか又は宿主細胞
のゲノム内に組み込むこともできる（例えばバクテリオ
ファージラムダ）。本発明のベクターはプラスミドが有
利である。特に、組換えベクターｐＺＳ−７／３１−２
（ＤＳＭ５５２８）が有利である。

【００１５】１以上の本発明による抗体を用いるＢ．ブ
ルグドルフェリ遺伝子バンクの検査により、本発明によ
る抗原を取得する方法も本発明の対象であり、ここで
は、使用抗体と正の免疫反応を示すクローンを単離す
る。

【００１６】本発明による抗原は、それ自体、活性免疫
化のため、即ち、生物体内での抗体形成を誘発するため
に使用することができるので、作用物質としての本発明
の抗原を、場合によっては慣用の担持剤、充填剤及び助
剤と共に含有する、ライム病に対する活性ワクチンも本
発明に包含される。本発明による抗原を遺伝子工学的な
方法で取得するのが有利な実施形である。

【００１７】天然のもしくは組換えＯｓｐＡを正常マウ
スに適用すると、Ｓｃｉｄ−マウスへの受動的伝達の後
にこれをライム−ボレリオースに対して保護する防御抗
体の形成を誘発する事実が判明した。殊に、組換えＯｓ
ｐＡは、天然のＯｓｐＡと匹敵する保護的免疫応答を誘
発し、従って、ヒトのライム−ボレリオースに対するワ
クチンに関する有望な候補であることが判明した。

【００１８】更に、本発明の対象は、ライム病に対する
受動ワクチンを取得する方法であり、この際、実験動物
特にマウスを本発明による抗原で免疫化し、この免疫化
された実験動物から常法で、保護性の、ポリクローナル
又はモノクローナルの抗体を取得する。

【００１９】最後に、本発明には、病原性Ｂ．ブルグド
ルフェリ生物体の単離及び再培養法も包含され、これ
は、免疫欠失実験動物特に、予め病原体で感染されたマ
ウスから病原体を取得し、この際、病原体の病原性を保
持残留させることよりなる。特に、感染されたＳｃｉｄ
−マウスの血液及び／又は関節から病原性Ｂ．ブルグド
ルフェリＺＳ７（ＤＳＭ５５２７）生物体を取得する方
法が有利である。

【００２０】次の実施例及び図１及び図２により本発明
を詳述する。

【００２１】図１はＢ．ブルグドルフェリＺＳ７からの
３１ｋＤ抗原（ＯｓｐＡ）のＤＮＡ−及びアミノ酸配列
を示す図であり、図２は、組換え蛋白質ｒＺＳ７／３１
−２の免疫学的特性を示す図である。

【００２２】

【実施例】例 １ Ｂ．ブルグドルフェリ菌株での感染によるＳｃｉｄ−マ
ウスでの関節炎、心臓炎及び肝炎の誘発 Ｂ．ブルグドルフェリでのマウスの処置 Ｃ．Ｂ−１７ Ｓｃｉｄ種（Ｓｃｉｄ−突然変異に関す
るホモ接合体）及びＣ．Ｂ−１７種の成長したマウスに
生存可能であるか又は殺した（ＵＶ−照射）Ｂ．ブルグ
ドルフェリ生物体１×１０⁵、５×１０⁵、１×１０⁶又
は１×１０⁸を尻尾のつけ根に皮下注射する。

【００２３】ダニ及びマウスからのＢ．ブルグドルフェ
リの単離 この実験をすでに長期間培養されてきたＢ．ブルグドル
フェリ菌株Ｂ３１（ＡＴＣＣ３５２１０）及び雌のイキ
ソデス・リチヌスダニ（Ｉｘｏｄｅｓ ｒｉｚｉｎｕｓ
Ｚｅｃｋｅ）から単離された、新らしい単離体Ｂ．ブ
ルグドルフェリＺＳ７（ＤＳＭ５５２７）を用いて実施
した。すべてのＢ．ブルグドルフェリ株を変性ケリーの
培地（Ｋｅｌｌｙ'ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）中で培養した
（Ｂａｒｂｏｕｒ等著、１９８３年、Ｓｗｉｔｚｅｒｌ
ａｎｄ．Ｃｕｒｒ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．第８巻、第１
２３頁）。エタノールで殺菌したダニの腸中部から、又
は感染したマウスの血液から得られたＢ．ブルグドルフ
ェリ有機体をカナマイシン８μｇ／ｍｌ及びフルオルウ
ラシル２３０μｇ／ｍｌの添加下にケリーの培地中でま
ず培養した（Ｊｏｈｎｓｏｎ等著、１９８４年、Ｊ．Ｃ
ｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．第１巻、第８１頁）。

【００２４】血清学的テスト Ｂ．ブルグドルフェリ特異的抗体の検出を慣用のエリザ
（ＥＬＩＳＡ）法により実施した（Ｊｕｓｔｕｓ等著、
１９８８年、Ｗｅｈｒｍｅｄ．Ｍｓｃｈｒ．第３２巻、
第２６３頁）。免疫グロブリン（Ｉｇ）の含量に関する
標準曲線を抗マウスＩｇ（Ｐａｅｓｅｌ，フランクフル
ト、西独からの血清溶液の１：５００希釈）を含有する
シャーレの塗布及び全−マウスＩｇＧ−又はＩｇＭ含量
の滴定（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ．ＬａＪｏｌｌａ，ＵＳ
Ａ）により得た。全血清ＩｇＭ及びＩｇＧを同様に測定
した。Ｂ．ブルグドルフェリ特異的ＩｇＭ−又はＩｇＧ
−抗体の濃度をＩｇ μｇ／ｍｌ血清で示した。

【００２５】免疫蛍光法及びギームザ（Ｇｉｅｍｓａ）
染色 血液５０μｌをヘマトクリット管中にピペットで採取し
（Ｂｅｃｔｏｎ ｕｎｄ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｈｅｉ
ｄｅｌｂｅｒｇ，ＢＲＤ）、ヘマトクリット遠心分離機
（ＥＣＣＯ，ＢＲＤ）中５０００ｇで遠心分離した。こ
の管を血清と赤血球の中間相で切開し、血清の５μｌを
スライドプレート上に担持した（Ｓｕｐｅｒｉｏｒ，Ｂ
ａｄ Ｍｅｒｇｅｎｔｈｅｉｍ，ＢＲＤ）。血清試料で
被覆されたスライドプレートを空中で乾燥し、１００％
エタノール中−２０℃で１分間固定する。家兎−抗Ｂ．
ブルグドルフェリ高免疫血清（１：１００希釈）と共に
室温で１時間恒温保持した後、このスライドプレートを
ＰＢＳ中で５回洗浄し、次いでＦＩＴＣ結合山羊−家兎
−抗血清（１：２０希釈、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂ．，
Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＵＳＡ）で１時間染色する。こ
のスライドプレートを洗浄し、カイザー（Ｋａｉｓｅ
ｒ）のグリセリン−ゼラチン（Ｍｅｒｃｋ，Ｄａｒｍｓ
ｔａｄｔ，ＢＲＤ）中に埋め込み、すぐに蛍光顕微鏡で
検査した。未処置の血液滴を空気中で乾燥し、メタノー
ル中で固定し、ギームザ（０．１％、Ｍｅｒｃｋ，Ｄａ
ｒｍｓｔａｄｔ，ＢＲＤ）で染色し、ＰＢＳ中で脱色
し、エンテラン（Ｅｎｔｅｌｌａｎ；Ｍｅｒｃｋ，Ｄａ
ｒｍｓｔａｄｔ，ＢＲＤ）中に埋め込む。

【００２６】組織学的標本作製及び染色法 あらかじめＢ．ブルグドルフェリで感染させたマウスか
ら種々の内部器官（脳、心臓、肺、肝臓、腎臓、脾臓及
び関節）を感染後の種々異なる時点で取り出し、凍結薄
片の調製のために液体窒素中で保存するか、又はパラフ
ィン又はメタクリレート中への埋め込みのために５％ホ
ルムアルデヒド（ＰＢＳ中）中で保存する。４〜７μｍ
の薄片を製造し、ヘマトキシリン−エオシンで染色し、
エンテラン（Ｅｎｔｅｌｌａｎ；Ｍｅｒｃｋ社、ダルム
シュタット、ＢＲＤ）中に埋め込む。免疫組織学をスト
レプトアビジン／ビオチン／ペルオキシダーゼシステム
を使用して実施した（Ｋｒａｍｅｒ等著、１９８９年、
Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第１９巻、第１５１
頁）。

【００２７】第１表は単離体ＺＳ７及びＢ３１のＢ．ブ
ルグドルフェリ生物体が、あらかじめ生存可能な生物体
を接種したＳｃｉｄ-マウスの血液中に全実験期間の間
検出されたことを示す。いずれにせよ、試験管内におい
ては、菌株ＺＳ７のスピロヘーターのみを再培養するこ
とができ、菌株Ｂ３１を再培養することはできなかっ
た。再培養した生物体と最初のＢ．ブルグドルフェリＺ
Ｓ７単離体との比較の際に、蛋白質含量において又はプ
ラスミドプロフィルにおいて全く変化を確認することは
できなかった。Ｂ．ブルグドルフェリで感染したＳｃｉ
ｄ-マウス中には全監察期間の間、重要でない抗体の力
価は全く検出されなかったか、又は著しく僅かであっ
た。この動物中では、Ｂ．ブルグドルフェリ特異的Ｉｇ
Ｍ−又はＩｇＧ−抗体は全く見い出されなかった（第１
表）。これに対し、Ｂ．ブルグドルフェリで感染したす
べてのＣ．Ｂ−１７−対照マウスは多量の全−Ｉｇ及び
Ｂ．ブルグドルフェリ特異的ＩｇＭ−及びＩｇＧ−抗体
の高められた力価を示した。Ｂ．ブルグドルフェリＺＳ
７での感染７日〜２０日後に、Ｓｃｉｄ-マウスは関節
炎の第１次臨床症状（両方の脛骨足根骨関節の発赤及び
はれ）を示し、これは時間と共にひどくなった。これに
対してＵＶ−照射Ｂ．ブルグドルフェリＺＳ７で又は生
存可能なＢ．ブルグドルフェリＢ３１生物体で感染した
Ｓｃｉｄ-マウス及び生存可能なＢ．ブルグドルフェリ
ＺＳ７生物体で感染したＣ．Ｂ−１７−対照マウスには
全く関節炎の症状は見い出されなかった。

【００２８】組織病理学も、生存可能なＢ．ブルグドル
フェリＺＳ７で感染したＳｃｉｄ-マウス中での関節炎
による関節変化を証明した（第１表）。軟骨組織及び／
又は骨の糜爛及び破壊を伴なう、形成過度の炎症性関節
液−被覆細胞の存在により特徴付けられる重症の関節障
害が確認された。更に心内膜、心筋層及び心膜中への単
核細胞の浸潤を伴なう心臓全壁炎が確認された。同様
に、肝臓の進行性の炎症が確認され、この際、門脈域及
び中心静脈に限定された単核細胞の浸潤、肉芽腫症反応
及び最後に肝臓線維症が確認された。更に、腎臓、肺、
脳及び横紋筋中で僅かな障害が確認された。

【００２９】

【表１】

【００３０】＊ ：ギームザ（Ｇｅｉｍｓａ）-染色又
は免疫蛍光； ＊＊：血液（Ｂ）、関節（Ｇ）からの単離； ° ：（＋）脛骨足根骨関節の発赤及びはれ； °°：（−）＜７．５μｇ／ｍｌ 血清 例 ２ Ｓｃｉｄ-マウスのライム・ボレリオース（Ｌｙｍｅ-Ｂ
ｏｒｒｅｌｉｏｓｅ）の経過に対するＢ．ブルグドルフ
ェリ３１ｋＤ抗原にとって特異的なモノクローナル抗体
の作用 モノクローナル抗体の製造 完全な免疫システムを有するマウスをＢ．ブルグドルフ
ェリ有機体で免疫にする際に、Ｂ．ブルグドルフェリに
特異的であるポリクローナル抗体が表現される（第１表
参照）。

【００３１】生後１０週の、同血統交配種ＢＡＬＢ／ｃ
の雌マウスを超音波ホモジナイズドボレリエン（Ｂｏｒ
ｒｅｌｉｅｎ；Ｂ．ブルグドルフェリ、Ｂ３１株；ＡＴ
ＣＣ３５２１０）で免疫にする。

【００３２】免疫法： ０日目：完全フロインドのアジュバント中のボレリエン
−抗原２００μｇを皮下注射 ２１日目、３５日目、４９日目、６３日目：燐酸塩緩衝
食塩水中のボレリエン−抗原１００μｇで促進（腹腔
内） ６６日目：脾臓の取り出し、及び個々の細胞懸濁液の製
造 この免疫脾臓細胞を骨髄腫細胞系Ａｇ８−ＰＡＩとポリ
エチレングリコールの使用下に標準法により融合させた
（Ｊ，Ｈ．Ｐｅｔｅｒｓ、Ｈ．Ｂａｕｍｇａｒｔｅｎ，
Ｍ．Ｓｃｈｕｌｚｅ著、“Ｍｏｎｏｋｌｏｎａｌｅ Ａ
ｎｔｉｋｏｅｒｐｅｒ”Ｓｐｒｉｎｇｅｒ-Ｖｅｒｌａ
ｇ社、ハイデルベルグ）。

【００３３】融合生成物を９６穴組織培養プレート中に
播種した。８日後、Ｂ．ブルグドルフェリ特異的モノク
ローナル抗体の存在に関して細胞培養上澄を固層−エリ
ザを用いて調べた（Ｊ，Ｈ．Ｐｅｔｅｒｓ等著、前
記）。

【００３４】抗体−生産性培養からのハイブリドーマ細
胞を限界希釈法によりクローン化した。引き続き、個々
のクローンの培養上澄を新たに固相エリザ中で、かつウ
エスタンブロット分析により、かつ免疫蛍光試験により
特徴付けた。亜クラスＩｇＧ２ｂのモノクローナル抗体
ＬＡ−２はモノクローナルハイブリドーマ系から生産さ
れ、分泌され、かつウエスタンブロット法で、電気泳動
法によりＳＤＳ−ゲル上で分離され、ウエスタンブロッ
ト法で膜上に搬送されたＢ．ブルグドルフェリ蛋白質と
接触する際にすべての実験したＢ．ブルグドルフェリ菌
株（特に、単離体ＺＳ７及びＢ３１）からの３１ｋＤａ
−構造、（Ｏｓｐ−Ａ）と反応する。モノクローナル抗
体ＬＡ−２６．１ｃ（抗−ＯｓｐＡＩｇＧ１）、ＬＡ２
５．１（抗−ＯｓｐＢ（３４ｋＤａ抗原）；ＩｇＧ２
ｂ）及びＬＡ２７．１（抗−ＯｓｐＢ（３４ｋＤａ抗
原）、ＩｇＧ１）は同様に製造され、特徴付けられた。

【００３５】Ｂ．ブルグドルフェリＺＳ７でのマウスの
感染 Ｃ．Ｂ−１７Ｓｃｉｄ-マウスに生存可能なＢ．ブルグ
ドルフェリＺＳ７−生物体１×１０⁸を尻尾のつけ根に
皮下注射した。

【００３６】抗血清でのマウスの処置 感染したＳｃｉｄ−マウスを種々の抗血清で１週間あた
り２回処置した。第１の群をＮＭＳ（正常マウス血清）
で、第２の群をＩＭＳ免疫マウス血清）で、かつ第３の
群をモノクローナル抗体ＬＡ−２（Ｂ．ブルグドルフェ
リからの３１ｋＤ抗原に対する）で処置した。投与抗血
清の量は第１週目は１００μｌもしくはＬＡ−２におい
て１００μｇ、第２週目は２００μｌもしくはＬＡ−２
において２００μｇ及び第３週目は３００μｌもしくは
ＬＡ−２において３００μｇであった。

【００３７】第２表は未処置又はＮＭＳ処置Ｓｃｉｄ−
マウスが１２日後に関節炎もしくは心臓炎及び肝炎の臨
床的及び組織病理学的徴候を現わしたことを示す。これ
に対してモノクローナル抗体ＬＡ−２の投与がＳｃｉｄ
−マウスにおいて明らかに症状の減少に作用した。臨床
的には関節のわずかな発赤、そして組織病理学的には辺
縁の変化のみが確認された。ＩＭＳで処置したマウスは
全く臨床的関節炎の所見を示さなかった。

【００３８】Ｂ．ブルグドルフェリ病原体の検出は、未
処置又はＮＭＳ処置のマウスにおいてのみ試験管内培養
において得られた。ＬＡ−２又はＩＭＳ処置マウスにお
いてはＢ．ブルグドルフェリは検出されなかった（第２
表）。

【００３９】

【表２】

【００４０】例 ３ Ｂ．ブルグドルフェリＺＳ７からの３１ｋＤ抗原（Ｏｓ
ｐＡ）の発現クローン化 ＤＮＡ−調製 Ｂ．ブルグドルフェリ株ＺＳ７からの高分子ＤＮＡを変
性ケリーの培地中で培養することにより精製した。この
スピロヘーターを１００００ｇで遠心分離することによ
りペレットにし、ＰＢＳ−緩衝液中で３回洗浄する。乾
燥したペレットをＴＥ（トリス１０ｍｍｏｌ／ｌ、ＥＤ
ＴＡ１ｍｍｏｌ／ｌ、ｐＨ７．４）１０ｍｌ中に再懸濁
し、リゾチーム（５ｍｇ／ｍｌ）で３０℃で１５分間処
置し、２０％ＳＤＳ１ｍｌを添加することによりＤＮＡ
を遊離する。ＮａＣｌ １．５ｍｌ（５ｍｏｌ／ｌ）の
添加後、この溶液を同容量のフェノールで抽出し、次い
でクロロホルムでの抽出を行なう。次いで、このＤＮＡ
を無水エタノール２容量を添加し、−２０℃で１夜恒温
保持することにより沈殿させた。遠心分離後、残分をＴ
Ｅ０．５ｍｌ中に溶かし、ＤＮＡｓｅ不含ＲＮＡｓｅＡ
（２０μｇ／ｍｌ）と４５分間５５℃で恒温保持し、３
７℃でプロティナーゼＫ（０．１μｇ／ｍｌ）で１時間
の処置を行なった。この溶液を０．３ｍｏｌ／ｌ Ｎａ
ＯＡｃで調節し、フェノール−クロロホルムで前記のよ
うに抽出した。エタノールで沈殿させた後、ＤＮＡを再
びＴＥ中に取り込む。

【００４１】遺伝子バンクの製造 高分子ＤＮＡを３秒間の超音波処置により静力学的に破
砕する。Ｔ４−ＤＮＡ−ポリメラーゼ（３７℃で３０分
間）及びクレノウ酵素（２０℃で５分間）を、生じたＤ
ＮＡ−フラグメントの末端を平面にするために使用し
た。平らな末端を有するＤＮＡを発現ベクターｐＵＥＸ
１のＢａｍＨＩ−位中にアダプター／クロン化法の適用
下に連結する（Ｂｒｅｓａｎ及びＳｔａｎｌｅｙ著、１
９８７年、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，第１０５６
頁）。セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）Ｓ−１００
０を介するモレキュラーシーブ・クロマトグラフィーに
よる大きさ選択工程及びコンピテント宿主細胞大腸菌
（ＭＣ１０６１）の形質転換の後、組換えプラーク形成
単位（ｐｆｕ）の量を次のように測定した：任意抽出ク
ローンをとり出し、選択培地（２５μｇ／ｍｌアンピシ
リンを有するＬＢ）２ｍｌ中で飽和まで培養する。この
プラスミド−ＤＮＡを常用のアルカリ性溶菌法により単
離し、引き続きＢａｍＨＩで切断する。分析したプラス
ミドの５０％より多くが平均≧１．５ｋｂの長さのＤＮ
Ａ−挿入を有した。

【００４２】Ｂ．ブルグドルフェリＺＳ７−遺伝子バン
クの平板培養及びスクリーニング 細胞を２４×２４ｃｍプレート上に、プレートあたり７
０００ｐｆｕの密度で平板培養し、３０℃で１夜恒温保
持する。ニトロセルロースフィルター（ＮＣ）上にクロ
ーンを移した後、β−ガラクトシダーゼ−融合蛋白質の
発現を４２℃で２時間の恒温保持により誘発した。この
フィルターを５％ＳＤＳ処置したワットマン（Ｗｈａｔ
ｍａｎ）３ＭＭ紙上に移し、９５℃で約２５分間恒温保
持した。次いで、この蛋白質を、常用の半乾燥ウエスタ
ンブロット法装置を使用して電気ブロットした。ＮＣ−
フィルターをＤＮＡｓｅ−処置した後、免疫活性クロー
ンをモノクローナル抗体の使用下に発現スクリーニング
により同定した。ＮＣ−フィルター上の非特異的結合位
を０．２％（重量／容量）ゼラチンと３ｍｍｏｌ／ｌ
ＮａＮ₃を含有するＰＢＳと４時間恒温保持することに
より飽和した。引き続き、このフィルターを抗−３１ｋ
Ｄモノクローナル抗体クローンＬＡ−２の培養上澄と共
に１８時間連続的な振盪下に恒温保持した。十分な洗浄
（ＰＢＳ＋１％（容量／容量）トライトンＸ−１００；
ＰＢＳ＋０．５ｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウム；ＰＢＳ＋１
ｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウム；各工程１０分間）の後、こ
のフィルターを家兎−抗−マウス−ＩｇＧ−抗体のペル
オキシダーゼ標識Ｆ（ａｂ）₂−調剤の１：１００００
希釈と室温で１．５時間連続的振盪下に恒温保持した。
このフィルターを再び前記のように洗浄し、次いでペル
オキシダーゼ基質としてのジアミノベンチジンと共に恒
温保持する。組換ＰＦＵ１０⁴のうちの２０クローンが
モノクローナル抗体ＬＡ−２と反応した。

【００４３】３１ｋＤ抗原（ＯｓｐＡ）の配列分析 ＬＡ−２との抗体反応プラスの組換え大腸菌の挿入ＤＮ
Ａを常法で単離した。このクローンのＤＮＡ−挿入分は
Ｂ．ブルグドルフェリ３１ｋＤ抗原をコードするＯｓｐ
Ａ−遺伝子を完全な長さで含有する。この挿入分を有す
るプラスミドをｐＺＳ−７／３１−２と表わし、ＤＳＭ
にブタペスト条約にのっとり寄託した（ＤＳＭ５５２
８）。

【００４４】この免疫プラスのクローンから生産された
組換蛋白質はｒＺＳ７／３１−２として示された。Ｏｓ
ｐＡ−遺伝子のコードしたＤＮＡ−配列を決定した。こ
の配列をこれから誘導したＯｓｐＡ蛋白質のアミノ酸配
列と共に図１に示した。

【００４５】図１は、Ｂ．ブルグドルフェリの３１ｋＤ
抗原がアミノ酸２７３を有する蛋白質に相当すること明
らかにする。

【００４６】非融合蛋白質の調製 ａ） 免疫反応性蛋白質ｒＺＳ７／３１−２を発現する
クローンをアンピシリンを含有するＬＢ１０ｍｌ中で３
０℃で一夜培養した。培養物１ｍｌを選択培地１００ｍ
ｌ中に装入し、良好な通気下に３０℃で密度８×１０⁷
細胞／ｍｌ（Ａ６００＝０．２）まで培養した。組換蛋
白質の発現を４２℃への宿主細胞の移動により得た。冷
却し、遠心分離した後、細胞をＳＴＥ−緩衝液（１０ｍ
ｍｏｌ／ｌトリス、１００ｍｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウ
ム、１ｍｍｏｌ／ｌＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）中で洗浄
し、残分を溶菌緩衝液（２５％蔗糖、５０ｍｍｏｌ／ｌ
トリス、ｐＨ８．０）０．６ｍｌ中に再懸濁させた。リ
ゾチーム（１０ｍｇ／ｍｌ）１５０μｌを添加し、この
混合物を氷上で１５分間恒温保持した後、ＤＮＡｓｅ１
（１０ｍｇ／ｍｌ）１８μｌと共に１ｍｏｌ／ｌ塩化マ
グネシウム５μｌの存在下に、更に恒温保持（氷上１５
分間）した。最後に４×洗浄剤混合物（１％トライトン
×１００、０．５％デオキシコレート、０．１ｍｏｌ／
ｌＮａＣｌ、１０ｍｍｏｌ／ｌトリス、ｐＨ７．４）２
５０μｌを添加し、氷上で５分間恒温保持した。遠心分
離後、残分を２回緩衝液Ａ（５０ｍｍｏｌ／ｌ トリ
ス、５０ｍｍｏｌ／ｌ ＮａＣｌ、１ｍｍｏｌ／ｌ Ｅ
ＤＴＡ、ｐＨ８．０）で洗浄し、付加的に８Ｍ尿素を含
有する緩衝液Ａ９容量中に再懸濁し、室温で１時間恒温
保持した。この試料を緩衝液Ｂ（５０ｍｍｏｌ ＫＨ₂
ＰＯ₄／Ｋ₂ＨＰＯ₄、５０ｍｏｌ／ｌ ＮａＣｌ、１ｍ
ｍｏｌ／ｌ ＥＤＴＡ、ｐＨ１０．７）９部で希釈し、
室温で３０分間撹拌し、この際ｐＨ−値をＫＯＨの添加
下に１０．７に保持した。溶剤のｐＨ値をＨＣｌの添加
により７．０に調節した後、この試料を一夜緩衝液Ａに
対して透析し（４℃で）、ＳＳ３４−回転装置中で４
℃、１００００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。組換蛋
白質を含有する上澄を−２０℃で保存した。

【００４７】ｂ） このクローンは免疫反応性蛋白質ｒ
ＺＳ７／３１−２を培地中にも分泌するので、培養上澄
から直接精製（アフィニティークロマトグラフィー）す
ることも可能である。

【００４８】組換ＯｓｐＡ（非融合）蛋白質の調製及び
アフィニティークロマトグラフィー精製 引き続き組換蛋白質をアフィニティークロマトグラフィ
ーにより精製した。この目的のためには精製したモノク
ローナル抗体ＬＡ−２を活性化セファロースＣＬ４Ｂに
共有結合させた。組換蛋白質を含有する透析尿素抽出液
をマウスＩｇＧ−セファロースＣＬ４Ｂに吸着し、引き
続きＬＡ−２−セファロースＣＬ４Ｂカラムを介して加
えた。強力な洗浄後、結合した組換蛋白質を０．１ｍｏ
ｌ／ｌグリセリン／ＨＣｌ−０．１ｍｏｌ／ｌ ＮａＣ
ｌ、ｐＨ２．５で溶離した。集めたフラクションのｐＨ
値を０．５ｍｏｌ／ｌ Ｋ₂ＨＰＯ₄ １／１０容量の添
加により、すぐに中和した。蛋白質含有フラクションを
濃縮し、透析した。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動を用いて精製の度合を測定した。

【００４９】組換蛋白質ｒＺＳ７／３１−２の免疫学的
特徴付け 組換蛋白質ｒＺＳ７／３１−２を免疫学的に調べた。比
較のために組換蛋白質ｒＢ３１／４１−９（Ｂ．ブルグ
ドルフェリ４１ｋＤ表面抗原）を用いた。

【００５０】平板−マイクロ力価プレートを組換蛋白質
ｒＺＳ７／３１−２及びｒＢ３１／４１−９の尿素抽出
液で、もしくは遺伝子発現のために使用した大腸菌株Ｍ
Ｃ１０６１の尿素抽出液で塗布した。非特異的結合位を
燐酸塩緩衝食塩溶液中の０．２％ゼラチンで封鎖した。
このように準備したマイクロ力価プレートの窪みを前記
モノクローナル抗体ＬＡ−２（抗−３１ｋＤ、Ｏｓｐ−
Ａ）、ＬＡ−１（抗−４１ｋＤ、フラジェリン）もしく
はＡＣＨＴ−２（抗−α₁−抗キモトリプシン）で配合
した。結合したモノクローナル抗体をペルオキシダーゼ
標識した種特異性抗−マウス免疫グロブリンと反応させ
た。結合したペルオキシダーゼ標識抗体をペルオキシダ
ーゼ基質オルトフェニレンジアミンを使用して定量し
た。マイクロ力価プレート中で４９２ｎｍ（Ａ₄₉₂）に
おける吸収を自動プレート測光機を用いて直接測定し
た。吸収の強度は結合したモノクローナル抗体の量に関
する尺度である。

【００５１】モノクローナル抗体ＬＡ−２は特異的な方
法でｒＺＳ７／３１−２と反応するが、ＭＣ１０６１も
しくはｒＢ３１／４１−９とは反応しない。モノクロー
ナル抗体ＬＡ−１の対照反応はｒＢ３１／４１−９に関
して特異的である。モノクローナル対照抗体ＡＣＨＴ−
２（負対照）は蛋白質のいずれとも注目に値する反応を
示さない。

【００５２】図２はモノクローナル抗体ＬＡ−２により
特異的な方法で認識される抗原エピトープがＢ．ブルグ
ドルフェリＺＳ７のゲノムからクローン化された組換蛋
白質ｒＺＳ７／３１−２上に発現されることを示す。

【００５３】例 ４ ３１ｋＤ（ＯｓｐＡ）もしくは３４ｋＤ抗原（Ｏｓｐ
Ｂ）に関して特異的な抗体と４１ｋＤ抗原（フラジェリ
ン）に特異的な抗体との比較 モノクローナル抗体ＬＡ−２及びＬＡ-２６．１は３１
ｋＤ抗原ＯｓｐＡを認識し、アイソタイプＩｇＧ２ｂも
しくはＩｇＧ１からのものである。モノクローナル抗体
ＬＡ−２５．１及びＬＡ−２７．１は３４ｋＤ抗原Ｏｓ
ｐＢを認識し、アイソタイプＩｇＧ２ｂもしくはＩｇＧ
１からのものである。モノクローナル抗体ＬＡ−１０及
びＬＡ−２１はＢ．ブルグドルフェリのフラジェリン−
結合４１ｋＤペリプラズム蛋白質に関して特異的であ
り、アイソタイプＩｇＧ２ａもしくはＩｇＧ１からのも
のである。すべての前記抗体は例２に記載された方法に
より得られた。この実験においてはＳｃｉｄ−マウス中
の他のＢ．ブルグドルフェリに対するモノクローナル抗
体もライム−ボレリオース（Ｌｙｍｅ-Ｂｏｒｒｅｌｉ
ｏｓｅ）の臨床的症状の保護に作用するかどうかを確認
した。

【００５４】Ｂ．ブルグドルフェリＢ３１−有機体１×
１０⁸での皮下接種後９１日でＣ５７ＢＬ／６−マウス
からポリクローナル抗−Ｂ３１−免疫血清（ＩＭＳ）を
採取した。Ｂ．ブルグドルフェリＺＳ７ １×１０⁸で
の皮下接種後６８日でＣ５７ＢＬ／６−マウスからポリ
クローナル抗−ＺＳ７ ＩＭＳを採取した。両方の血清
はエリザ−システムで測定したように特異的抗体６０μ
ｇ／ｍｌを含有した（Ｓｃｈａｉｂｌｅ等著、Ｊ．Ｅｘ
ｐ．Ｍｅｄ．，第１７０巻、１９８９年、第１４２７〜
１４３ ２頁）。正常マウス血清（ＮＭＳ）を非感染Ｃ
５７ＢＬ／６−マウスから採取した。

【００５５】接種時及びこれに続き４日間の間隔で、前
記抗体、ＩＭＳ、ＮＭＳ又はＰＢＳ−緩衝液を次の記録
によりＳｃｉｄ−マウス中に腹腔内に受動移動した： ０日目及び ３日目：１００μｌ ７日目及び１０日目：２００μｌ １３日目及び１７日目：３００μｌ 抗−ＺＳ７ ＩＭＳ、抗−Ｂ３１ ＩＭＳで、又はモノ
クローナル抗体ＬＡ−２で処置したＳｃｉｄ−マウスは
全く関節炎の臨床的症状を示さなかった、すなわち２１
日間の監察期間の間、脛骨足根骨関節の発赤及びはれは
全く現われなかった。同様に心臓炎及び肝炎の症状も全
く確認されなかった。組織病理学的検査は抗−ＺＳ７−
ＩＭＳ、抗−Ｂ３１−ＩＭＳで、又はモノクローナル抗
体ＬＡ−２で処置したＳｃｉｄ−マウスの関節、心臓及
び肝臓に全く変化がないということを示した。

【００５６】アイソタイプＩｇＧ１の他のＯｓｐＡ−特
異的モノクローナル抗体ＬＡ−２６．１並びにＯｓｐＢ
特異的抗体ＬＡ−２５．１及びＬＡ−２７．１は関節
炎、心臓炎及び肝炎の臨床的症状をやわらげる。ここで
は検査した器官中に弱い病理学的変化が見られた。

【００５７】これとは反対に、ＰＢＳ−緩衝液、ＮＭＳ
又はフラジェリンに対するモノクローナル抗体（ＬＡ−
１０又はＬＡ−２１）を投与されたＳｃｉｄ−マウスは
未処置のＳｃｉｄ−マウスに典型的な関節炎の臨床的徴
候、病理学的変化を示した（第３表）。最後にあげた動
物の症状の重さは接種後時間と共に上昇し、全監察期間
の間低下しなかった。まず抗ＺＳ７ ＩＭＳで、又は抗
ＬＡ−２で処置したＳｃｉｄ−マウスからは全くスピロ
ヘーターは単離されなかった。これとは反対に、ＰＢＳ
−緩衝液、ＮＭＳ又はモノクローナル抗体ＬＡ−２５．
１、ＬＡ−２６．１、ＬＡ−２７．１、ＬＡ−１０又は
ＬＡ２１で処置したＳｃｉｄ−マウスの血液からの免疫
蛍光法により、かつ培養によりスピロヘーターの検出が
可能である。

【００５８】

【表３】

【００５９】例 ５ ＯｓｐＡで免疫したマウスからの抗血清の、Ｓｃｉｄ−
マウスのライム・ボレリオースの経過に対する作用 この実験において、天然ＯｓｐＡ（Ｂ．ブルグドルフェ
リＺＳ−７から単離）又は組換ＯｓｐＡ（組換プラスミ
ドｐＺＳ−７／３１−２（ＤＳＭ５５２８）で形質転換
した大腸菌から単離）の正常マウス（マウス種Ｃ５７Ｂ
Ｌ／６）中への投与は保護ポリクローナル抗体を生産す
る。この抗体をＳｃｉｄ−マウスに投与する場合、ライ
ム・ボレリオースに対する保護が生じる。この際、組換
ＯｓｐＡは天然ＯｓｐＡと比較可能な保護免疫応答を誘
発することが確認される。この実験における結果及び実
施方法の詳細を第４表に記載する。

【００６０】組換ＯｓｐＡの獲得は例３に記載した。

【００６１】天然ＯｓｐＡの獲得並びにＯｓｐＡでのマ
ウスの免疫を次のように行なう： 天然３１ｋＤａ ＯｓｐＡの富化 スピロヘーター３．２×１０¹⁰をプロテアーゼ阻害剤
（５ｍｍｏｌ／ｌ ＥＤＴＡ、５ｍｍｏｌ／ｌベンズア
ミジン及び０．５ｍｍｏｌ／ｌ ＰＭＳＦ）の存在下に
ＰＢＳ５ｍｌ／７．５ｍｌ ｎ−ブタノール中で２時間
マグネットスターラーで撹拌する。その後、この混合物
を１００００ｒｐｍ及び４℃でゾルバル（Ｓｏｒｖａｌ
ｌ）−遠心分離機（固定角度ローター）中で９０分間遠
心分離する。表面蛋白質を含有する水相を取り出し、ク
ロロホルムで３回洗浄する。

【００６２】蛋白質含量を２８０ｎｍでの吸光により、
もしくはＢＣＡ−テストで測定する。

【００６３】抗−Ｂ．ブルグドルフェリ家兎血清でのウ
エスタンブロットもしくはジルベルゲル（Ｓｉｌｂｅｒ
-ｇｅｌ）法においては、菌株ＺＳ７にとって主バンド
は３１ｋＤａの分子量範囲に、かつ弱いバンドは２０，
３４及び６５〜６８ｋＤａに見い出された。Ｂ．ブルグ
ドルフェリ菌株Ｂ３１のブタノール／水調剤は主バンド
を３１ｋＤａに、弱いバンドを２０及び３４ｋＤａに有
する。

【００６４】天然及び組換ＯｓｐＡでのマウスの免疫 Ｃ５７ＢＬ６もしくはＣ．Ｂ−１７マウスを７〜１０日
間の間隔で３回アジュバント（ＡＢＭ３；Ｓｅｂａｋ
社、Ａｉｄｅｎｂａｃｈ，ＢＲＤ）１００μｌ中の５μ
ｇ（菌株Ｂ３１からの天然ＯｓｐＡ）もしくは１０μｇ
（菌株ＺＳ７からの天然ＯｓｐＡ、ＺＳ７からの組換Ｏ
ｓｐＡ）を尻尾のつけねに皮下注射した。

【００６５】最後の免疫の後、早くても３週間後、３〜
４ケ月の血清を取り出すことができた。特異的な抗体の
含量はエリザシステムで測定する。

【００６６】

【表４】

【図面の簡単な説明】

【図１】Ｂ．ブルグドルフェリＺＳ７からの３１ｋＤ抗
原（ＯｓｐＡ）のＤＮＡ配列及びアミノ酸配列を示す図
である。

【図２】組換え蛋白質ｒＺＳ７／３−２の免疫学的特徴
を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ Ｃ１２Ｐ 21/08 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 15/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (71)出願人 390040420 Ｂｅｒｌｉｎ，ＢＲＤ (71)出願人 500349247 ドイチェス クレープスフォルシュングス ツェントルム スチフツング デス エッ フェントリッヒェン レヒツ ドイツ連邦共和国 ハイデルベルク １ イム ノイエンハイマー フェルト 280 (72)発明者 マルクス エム ジモン ドイツ連邦共和国 フライブルク カルト イザーシュトラーセ 35 (72)発明者 ウルリッヒ エー シャイブレ ドイツ連邦共和国 フライブルク ツェー リンガーシュトラーセ ２ (72)発明者 クラウス アイヒマン ドイツ連邦共和国 フライブルク ロイテ バッハガッセ 38 エフ (72)発明者 ミヒアエル クラマー ドイツ連邦共和国 ハイデルベルク イム ノイエンハイマー フェルト 324 (72)発明者 ヴァリッヒ ラインハルト ドイツ連邦共和国 ハイデルベルク ウン テレン ロンバッハ ６ アー

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 病原性ボレリア・ブルグドルフェリ生物
   体菌株ＺＳ７（ＤＳＭ５５２７）。
2. 【請求項２】 病原性ボレリア・ブルグドルフェリ生物
   体を単離又は再培養する方法において、予め病原体で感
   染された免疫欠失実験動物から病原体を取得し、この
   際、この病原体の病原性を保持残留させることを特徴と
   する、病原性ボレリア・ブルグドルフェリを単離し、再
   培養する方法。
3. 【請求項３】 感染Ｓｃｉｄ−マウスの血液又は／及び
   関節から病原性ボレリア・ブルグドルフェリＺＳ７生物
   体を取得する、請求項２記載の方法。