RU2129611C1 - Полипептид, рекомбинантный полинуклеотид, вакцина - Google Patents
Полипептид, рекомбинантный полинуклеотид, вакцина Download PDFInfo
- Publication number
- RU2129611C1 RU2129611C1 RU95107705A RU95107705A RU2129611C1 RU 2129611 C1 RU2129611 C1 RU 2129611C1 RU 95107705 A RU95107705 A RU 95107705A RU 95107705 A RU95107705 A RU 95107705A RU 2129611 C1 RU2129611 C1 RU 2129611C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- bronchiseptica
- gene
- dna
- fimbrial
- vaccine
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title abstract description 31
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title abstract description 28
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title abstract description 25
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title abstract description 17
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 title abstract description 16
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 title abstract description 16
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 title abstract description 16
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 84
- 241000588779 Bordetella bronchiseptica Species 0.000 abstract description 64
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 18
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 abstract description 13
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 abstract description 12
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 abstract description 8
- 241000282887 Suidae Species 0.000 abstract description 7
- 241001076388 Fimbria Species 0.000 abstract description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 abstract 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 44
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 40
- 101710177917 Fimbrial protein Proteins 0.000 description 24
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 22
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 19
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 18
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 18
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 18
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 18
- 238000000034 method Methods 0.000 description 18
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 17
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 16
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 15
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 14
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 13
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 13
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 12
- 241000588832 Bordetella pertussis Species 0.000 description 11
- 241000588807 Bordetella Species 0.000 description 10
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 10
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 10
- JWPRTLPEVKPSEG-UHFFFAOYSA-N [6'-acetyloxy-6-[3-[3-[4-(1-methylindol-3-yl)-2,5-dioxopyrrol-3-yl]indol-1-yl]propylcarbamoyl]-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-3'-yl] acetate Chemical compound C1=C(C=2C(NC(=O)C=2C=2C3=CC=CC=C3N(C)C=2)=O)C2=CC=CC=C2N1CCCNC(=O)C(C=C12)=CC=C2C(=O)OC21C1=CC=C(OC(C)=O)C=C1OC1=CC(OC(=O)C)=CC=C21 JWPRTLPEVKPSEG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 10
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 10
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 10
- UTPGRZGMQVAYAA-UHFFFAOYSA-N 4-fluoro-n-methyl-n-[4-[6-(methylamino)pyrimidin-4-yl]-1,3-thiazol-2-yl]benzamide Chemical compound C1=NC(NC)=CC(C=2N=C(SC=2)N(C)C(=O)C=2C=CC(F)=CC=2)=N1 UTPGRZGMQVAYAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 9
- 101100120321 Bordetella pertussis (strain Tohama I / ATCC BAA-589 / NCTC 13251) fimX gene Proteins 0.000 description 9
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 9
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 8
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 8
- 101150033489 fimX gene Proteins 0.000 description 7
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 7
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 6
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 210000003437 trachea Anatomy 0.000 description 6
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 5
- 201000005702 Pertussis Diseases 0.000 description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 5
- 210000001989 nasopharynx Anatomy 0.000 description 5
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- 241000588851 Bordetella avium Species 0.000 description 4
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 210000001331 nose Anatomy 0.000 description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 4
- 241000588780 Bordetella parapertussis Species 0.000 description 3
- 101100446841 Bordetella pertussis (strain Tohama I / ATCC BAA-589 / NCTC 13251) fim2 gene Proteins 0.000 description 3
- 206010011224 Cough Diseases 0.000 description 3
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 description 3
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 3
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 3
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- 239000000304 virulence factor Substances 0.000 description 3
- 230000007923 virulence factor Effects 0.000 description 3
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 2
- 201000008283 Atrophic Rhinitis Diseases 0.000 description 2
- 208000018150 Bordetella infection Diseases 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 2
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 2
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 2
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 2
- 241000606856 Pasteurella multocida Species 0.000 description 2
- 108010081690 Pertussis Toxin Proteins 0.000 description 2
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 2
- 206010039088 Rhinitis atrophic Diseases 0.000 description 2
- 241000831652 Salinivibrio sharmensis Species 0.000 description 2
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 2
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 2
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000002729 catgut Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 210000004081 cilia Anatomy 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 229940051027 pasteurella multocida Drugs 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 229940124551 recombinant vaccine Drugs 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 2
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 2
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 2
- PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N tris acetate Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 2
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 2
- 229940126580 vector vaccine Drugs 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101150028074 2 gene Proteins 0.000 description 1
- HQFLTUZKIRYQSP-UHFFFAOYSA-N 3-ethyl-2h-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)C1=CC=C2N(CC)CSC2=C1 HQFLTUZKIRYQSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000606748 Actinobacillus pleuropneumoniae Species 0.000 description 1
- 206010003694 Atrophy Diseases 0.000 description 1
- 241000589893 Brachyspira hyodysenteriae Species 0.000 description 1
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M Bromide Chemical compound [Br-] CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 206010006542 Bulbar palsy Diseases 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000282421 Canidae Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 241000111471 Convolvulus scoparius Species 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 1
- 102000000634 Cytochrome c oxidase subunit IV Human genes 0.000 description 1
- 108050008072 Cytochrome c oxidase subunit IV Proteins 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 101710110818 Dermonecrotic toxin Proteins 0.000 description 1
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 101710081048 Endonuclease III Proteins 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 206010018910 Haemolysis Diseases 0.000 description 1
- 108010006464 Hemolysin Proteins Proteins 0.000 description 1
- 235000019687 Lamb Nutrition 0.000 description 1
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 240000000220 Panda oleosa Species 0.000 description 1
- 235000016496 Panda oleosa Nutrition 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 102100034014 Prolyl 3-hydroxylase 3 Human genes 0.000 description 1
- 241000125945 Protoparvovirus Species 0.000 description 1
- 101100502817 Pseudomonas aeruginosa (strain ATCC 15692 / DSM 22644 / CIP 104116 / JCM 14847 / LMG 12228 / 1C / PRS 101 / PAO1) fimL gene Proteins 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 101710157507 Serotype 2 fimbrial subunit Proteins 0.000 description 1
- 241000194021 Streptococcus suis Species 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 241000701093 Suid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- 239000008049 TAE buffer Substances 0.000 description 1
- 241000711484 Transmissible gastroenteritis virus Species 0.000 description 1
- 241000589884 Treponema pallidum Species 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010047700 Vomiting Diseases 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 102000030621 adenylate cyclase Human genes 0.000 description 1
- 108060000200 adenylate cyclase Proteins 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 230000004523 agglutinating effect Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000037444 atrophy Effects 0.000 description 1
- 229940125717 barbiturate Drugs 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 210000000254 ciliated cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical group NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 108091005899 fibrous proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034240 fibrous proteins Human genes 0.000 description 1
- -1 fimbriae Proteins 0.000 description 1
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 210000003128 head Anatomy 0.000 description 1
- 239000003228 hemolysin Substances 0.000 description 1
- 230000008588 hemolysis Effects 0.000 description 1
- 229940094991 herring sperm dna Drugs 0.000 description 1
- 229920000140 heteropolymer Polymers 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000009851 immunogenic response Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 244000039328 opportunistic pathogen Species 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 238000012261 overproduction Methods 0.000 description 1
- 210000003254 palate Anatomy 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000036285 pathological change Effects 0.000 description 1
- 231100000915 pathological change Toxicity 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- DGUKXCVHOUQPPA-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid tungsten Chemical compound [W].OP(O)(O)=O DGUKXCVHOUQPPA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 201000002241 progressive bulbar palsy Diseases 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 208000009305 pseudorabies Diseases 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 210000001533 respiratory mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 210000001944 turbinate Anatomy 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- 230000008673 vomiting Effects 0.000 description 1
- 230000004584 weight gain Effects 0.000 description 1
- 235000019786 weight gain Nutrition 0.000 description 1
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/235—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bordetella (G)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Oncology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
Изобретение относится к вакцине для борьбы с инфекциями, вызываемыми В. bronchiseptica у восприимчивых животных (таких, как собаки и свиньи), содержащей белки или полипептиды, типичные для белка фимбрий В. bronchiseptica или содержащей рекомбинантные полинуклеотиды. Вакцину можно применять перорально, интраназально или внутримышечно. 7 с.п. ф-лы, 7 ил., 1 табл.
Description
Данное изобретение относится к вакцине, защищающей от инфекции, вызываемой Bordetella Bronchiseptica у собак, с помощью характерных полипептидов B. bronchiseptica и ее получение с помощью технологии с использованием рекомбинантных ДНК.
Род Bordetella включает четыре вида: Bordetella pertussis (B. pertussis), Bordetella parapertussis (B. parapertussis), Bordetella bronchiseptica (B. bronchiseptica), Bordetella avium (B. avium). Bordetella - это мелкие грамотрицательные коккобациллы, облигатные аэробы, часто биполярно окрашенные и положительные на цитохромоксидазу. Колонии на среде Борде-Жану окружены зоной гемолиза, за исключением B. avium.
Все виды Bordetella вызывают очень сходные заболевания в отношении контагиозности, пролиферации, клинических симптомов и гистопатологии. Младенцы людей и животных наиболее восприимчивы к инфекции, вызываемой Bordetella. У них заболевание протекает наиболее тяжело, и смертность наиболее высока.
B. bronchiseptica сначала считалась возбудителем инфекций у лабораторных, домашних и диких животных и только эпизодически у человека. Кролики, морские, свинки, крысы, нечеловекообразные приматы, собаки, свиньи, кошки, лошади и лисицы часто инфицируются во время эпидемии. Особенно часто B. bronchiseptica вызывает конурный кашель у собак и атрофический ринит у поросят. У собак инфекционный процесс ограничивается большей частью трахеобронхиальным деревом и характеризуется пролиферацией на трахеальном эпителии после прикрепления к ресничкам респираторного эпителия. Наиболее тяжелыми симптомами заболевания являются чрезмерное скопление слизи, рвота, патологические изменения в легких и потеря веса. У собак появляется сухой, резкий, отрывистый кашель. Инфекция у поросят, вызванная B. bronchiseptica, характеризуется атрофией носовых раковин, деформацией рыльца, пневмонией и сниженным повышением веса. Хотя, как кажется, ясно установлено, что B. bronchiseptica является возбудителем, ответственным на атрофический ринит, значительное число данных в настоящее время указывает на то, что главным возбудителем является Pasteurella multocida, а B. bronchiseptica возможно играет роль индивидуального или условно-патогенного возбудителя. Сообщения о состояниях носительства без клинических признаков заболевания встречаются с высокой частотой для собак, свиней и кроликов.
Несколько факторов вирулентности было идентифицировано у Bordetella. Они включают: коклюшный токсин, жгутиковый гемагглютинин, фимбрии, аденилатциклазу, дермонекротический токсин, трахеальный токсин и гемолизин. Эти факторы вирулентности экспрессируются не у всех видов, например ген, кодирующий коклюшный токсин B. pertussis, присутствует в виде молчащего гена хромосомы у B. parapertussis и B. bronchiseptica. Кроме этих факторов вирулентности, возможно, существуют и другие, еще не идентифицированные факторы, участвующие в патогенности бактерий.
Инфекция, вызываемая Bordetella, начинается на клетках мерцательного эпителия респираторного тракта. Прикрепление бактерий является предпосылкой для инициации инфекции, так как в противном случае смывающее действие ресничек удаляет бактерии вместе с другими частицами из трахеи. Прикрепление Bordetella к реснитчатым клеткам опосредуется серологически различными фимбриями и жгутиковым гемагглютинином /ФГА/ /ФГА не обнаружен, однако, у B. avium/, фимбрии являются волоскоподобными структурами, образованными идентичными белками из субъединиц, отходящими от поверхности бактериальной клетки. ФГА является связанным с поверхностью белком, также выделяемым во внеклеточную окружающую среду, и способным агглютинировать множество эритроцитов. Экспрессия как фимбрий, так и ФГА регулируется bvg-локусом, хотя на экспрессию генов фимбриальной субъединицы у B. pertussis также влияет длина участка из 13 - 15 цитозиновых остатков перед генами фимбриальной субъединицы. Все вирулентные Bordetella экспрессируют факторы прикрепления на их поверхности, тогда как невирулентные штаммы не экспрессируют их. Так как эти адгезины существенны для возникновения заболевания, они являются привлекательными вакцинными компонентами.
Цель данного изобретения состоит в том, чтобы создать рекомбинантную вакцину против инфекции, вызываемой B. bronchiseptica. Исследование было сфокусировано на факторах адгезии, так как предотвращение адгезии в результате иммунного ответа, направленного против факторов адгезии, будет предотвращать инфекцию. У B. bronchiseptica несколько серологически отличных фимбрий и ФГА ответственны за прикрепление бактерий к клеткам мерцательного эпителия трахеи. Когда у организма-хозяина существует иммунный ответ на факторы адгезии микроорганизма, колонизация будет невозможна. Бактерии будут уничтожены до того, как образовались какие-либо токсины, и клинические симптомы не разовьются.
Вакцина по этому изобретению, предотвращающая колонизацию B. bronchiseptica, предпочтительно содержит столько компонентов, необходимых для прикрепления, сколько возможно. Рекомбинантная вакцина может быть создана в виде вакцины из субъединиц. Однако неизвестно сколько серологически различных фимбрий продуцируется, и какое значение в прикреплении клетки каждого фактора /фимбрий и ФГА/. Для разработки вакцины необходимо исследовать значение для прикрепления всех компонентов отдельно. Белки, представляющие интерес, могут использоваться в качестве субъединичной вакцины после сверхпродукции в подходящем микробном организме.
В соответствии с данным изобретением выделены и охарактеризованы три различных гена субъединиц, кодирующие факторы прикрепления B. bronchiseptica.
Соответственно, данное изобретение относится к по существу чистому препарату фимбриального белка B. bronchiseptica или к полипептидным фрагментам фимбриального белка /фимбриальным полипептидам/, имеющим по крайней мере часть из одной из аминокислотных последовательностей, выбираемых из последовательностей ИД NN 2, 4 или 6.
Кроме того, данное изобретение имеет отношение не только к фимбриальному белку и полипептидам, но и также к ДНК из последовательностей ИД NN 1 - 3 и их фрагментам и к полинуклеотидам, которые гибридизутся с вышеназванной ДНК и ее фрагментами, и которые гибридизуются с указанными ДНК и их фрагментами, и которые кодируют полипептид, имеющий свойства фимбриального белка B. bronchiseptica
Данное изобретение относится также к полинуклеотиду, который кодирует полипептид, имеющий иммуногенные свойства фимбриального белка B. bronchiseptica, причем по крайней мере часть кодонов ДНК с последовательностями ИД NN 1, 3 или 5 или ее фрагментов, или вышеупомянутого гибридизующегося полинуклеотида замещается альтернативными кодонами для той же самой аминокислоты.
Данное изобретение относится также к полинуклеотиду, который кодирует полипептид, имеющий иммуногенные свойства фимбриального белка B. bronchiseptica, причем по крайней мере часть кодонов ДНК с последовательностями ИД NN 1, 3 или 5 или ее фрагментов, или вышеупомянутого гибридизующегося полинуклеотида замещается альтернативными кодонами для той же самой аминокислоты.
Фимбриальные белок и полипептиды, его производные, способны вызывать иммунный ответ на B. bronchiseptica.
Небольшие антигены часто бесполезны в качестве иммуногенов. Поэтому фимбриальные белок или полипептиды могут готовиться в виде гомополимеров /множество соединенных идентичных фимбриальных полипептидов/ или гетерополимеров /один или более фимбриальных полипептидов, соединенные с одним или более другими фимбриальными полипептидами, или соединенные с одним или более другими полипептидами, характерными для B. bronchiseptica или для другого возбудителя/, или могут соединяться с одним или более другими соединениями для повышения иммуногенности.
По данному изобретению фимбриальный полипептид в любой из модификаций, упомянутых выше, может быть получен с помощью методов генной инженерии или может быть получен синтетически, т.е. с помощью гомогенного или твердофазного полипептидного синтеза.
Конкретные аминокислотные последовательности подходящих иммуногенных фимбриальных полипептидов могут быть выведены из аминокислотной последовательности, соответствующей последовательности ИД NN: 2, 4 или 6 и, по желанию, также из пространственной конфигурации фимбриального белка.
Был разработан ряд методов для предсказания расположения иммуногеннозначимых эпитопов на белках. Результат из объединяемых предсказаний дает хороший прогноз антигенных сайтов.
Подходящие фимбриальные полипептиды могут выбираться из большинства гидрофильных частей фимбриального белка, т.е. с помощью применения методики, описанной Hopp и Woods /T.P. Hoppand K.R. Wood /1981/; Proc. Natl. Acad. Sci. , USA 78, 3824-3828/. Другой подходящий метод для отбора таких полипептидов описан Chou и Fasman (P. Y. Chou aug G.D. Fusman (1987), Advancos in Enzymology 47, 145-148).
Для окончательного предсказания антигеннозначимых областей на фимбриальном белке B. bronchiseptica могут использоваться различные дополнительные алгоритмы, такие как предсказание гибкости полипептидной цепи /P.A.Karpys and G.E.Schultz 1985, Naturwissenschaften 72, 212-213/, профиль вероятности бета-поворота в фимбриальном белке B. bronckiseptica по P.Y. Chou и G.D. Fasman 1979 /Biophys J, 26, 367-385/, профили вероятности 3-х конформаций для последовательности фимбриальных белков B. bronchiseptica no Gascuel O. и J. L. Golmard 1988, /Cabios 4, 357-365/, предсказание вторичной структуры последовательности фимбриального белка B. bronchiseptica no J. Novotny и C. Aubbray, 1984/ Nucleic Acids Research 12, 243-255/.
Дополнительная информация по расположению значимых эпитопов может быть получена путем применения метода разработанного Geysen и Meloen (H.M. Geysen, R. H. Meloen aud S.J. Barteling (1984); Proc. Natl. acad. Sci 81(13); 3998-4002). При этом методе используются пептиды достаточной длины для реакции при иммуносорбентном исследовании со связанным ферментом. Эти пептиды синтезируются в соответствии с данной последовательностью ДНК. Они характеризуются тем фактом, что первый пептид включает аминокислоты NN 1-9, второй пептид включает аминокислоты NN 2-10 и т.д. Каждый пептид испытывается на его реакционную способность с антисывороткой или моноклональными антителами. Реакционные пептиды должны в таком случае представлять иммуногенный эпитоп
Кроме того, чтобы идентифицировать иммунореактивные эпитопы /и скоррелировать эти реактивные эпитопы с физической картой фибриального белка/ фрагменты ДНК из гена фимбриального белка могут соэкспрессироваться в подходящих плазмидах, таких как плазмиды pEX /K. Stanley and J.P. Luzio, 1984, EMBO У. З. 1429-1434, и J.G.Kusters, E.Y. Jager and B.A.M. Vander Ziejst, 1989, Nud. Acids, Res. 17, 8007/. В этой системе гетерологичная экспрессия приводит к синтезу C-концевого удлиняющего сегмента гибридного белка Cro-β-галактозидазы. Сайты рестрикции эндонуклеазой в ДНК последовательностях фимбриального белка могут использоваться для получения фрагментов гена фимбриального белка для встройки в плазмиды pEX, pEX клоны, синтезирующие слитные белки, производные из различных перекрывающих областей фимбриального белка, затем используются для последующего определения свойств. Фрагменты фимбриального белка, кодируемых pEX, очищают, фракционируют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле и наносят на нитроцеллюлозные мембраны. Эти мембраны затем подвергают реакции с сывороткой от свиней или собак, иммунной к B. bronchiseptica. Только фрагменты, содержащие иммунореактивные эпитопы, реагируют с этими сыворотками. Чтобы очертить минимальную длину эпитопов, вставки ДНК реактивных клонов могут постепенно укорачиваться путем отщепления эндонуклеазой III или путем клонирования синтетических олигонуклеотидов, кодирующих небольшие перекрывающие части фимбриального белка /J.G. Kusters, E.J. Jager, G. Koch, J.A. Lenston W.P.A. Posthumus, R.M.Meloen and B.A.M. Van der Zeijst., 1989, J. immunol, 143, 2692-2698/. Эпитопы могут затем испытываться на их защитные эффекты.
Кроме того, чтобы идентифицировать иммунореактивные эпитопы /и скоррелировать эти реактивные эпитопы с физической картой фибриального белка/ фрагменты ДНК из гена фимбриального белка могут соэкспрессироваться в подходящих плазмидах, таких как плазмиды pEX /K. Stanley and J.P. Luzio, 1984, EMBO У. З. 1429-1434, и J.G.Kusters, E.Y. Jager and B.A.M. Vander Ziejst, 1989, Nud. Acids, Res. 17, 8007/. В этой системе гетерологичная экспрессия приводит к синтезу C-концевого удлиняющего сегмента гибридного белка Cro-β-галактозидазы. Сайты рестрикции эндонуклеазой в ДНК последовательностях фимбриального белка могут использоваться для получения фрагментов гена фимбриального белка для встройки в плазмиды pEX, pEX клоны, синтезирующие слитные белки, производные из различных перекрывающих областей фимбриального белка, затем используются для последующего определения свойств. Фрагменты фимбриального белка, кодируемых pEX, очищают, фракционируют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле и наносят на нитроцеллюлозные мембраны. Эти мембраны затем подвергают реакции с сывороткой от свиней или собак, иммунной к B. bronchiseptica. Только фрагменты, содержащие иммунореактивные эпитопы, реагируют с этими сыворотками. Чтобы очертить минимальную длину эпитопов, вставки ДНК реактивных клонов могут постепенно укорачиваться путем отщепления эндонуклеазой III или путем клонирования синтетических олигонуклеотидов, кодирующих небольшие перекрывающие части фимбриального белка /J.G. Kusters, E.J. Jager, G. Koch, J.A. Lenston W.P.A. Posthumus, R.M.Meloen and B.A.M. Van der Zeijst., 1989, J. immunol, 143, 2692-2698/. Эпитопы могут затем испытываться на их защитные эффекты.
В соответствии с конкретным осуществлением данного изобретения специфичный полипептид из фимбриального протеина продуцируется путем экспрессии полинуклеотида, обладающего по крайней мере частью полинуклеотидов последовательности ИД N: 1,3 или 5, образующей часть рекомбинантного полинуклеотида. Рекомбинантный полинуклеотид предпочтительно может базироваться на векторе с встроенным в него специфичным для B. bronchiseptica полинуклеотидным фрагментом. Подходящими векторами являются плазмиды, бактериофаги, космиды, вирусы, михромосомы или прочно интегрирующие векторы; последний, в частности, для клеток растительных и животных. В основном эти векторы обладают свойством автономной репликации, за исключением прочно интегрирующих векторов, которые сами встраиваются в генетический материал клетки-хозяина и реплицируются с генетическим материалом клетки-хозяина. Подходящими клетками - хозяевами могут быть или прокариотические или аукариорические, такие как бактерии, дрожжи, микроплазмы, водоросли, растительные клетки или клетки животных. Растительные клетки или животных могут культивироваться in vitro или могут формировать часть интактного растения или животного, соответственно. Рекомбинантный полинуеклеотид может содержать в виде вставки полный полинуклеотид, кодирующий белок фимбрий или его фрагмент. Вставка может содержать единичную кодирующую последовательность или множественные копии одной и той же кодирующей последовательности или гибридный полинуклеотид, содержащий по крайней мере последовательность, кодирующую один фимбриальный белок, и по крайней мере одну вторую последовательность, такую как последовательность, кодирующую другую часть фимбриального протеина, или полинуклеотид, кодирующий белок, характерный для другого возбудителя, или инертный протеин, функционирующий в качестве носителя для по крайней мере одного небольшого фимбриального полипептида.
Частный случай вышеуказанного осуществления относится к рекомбинантным полинуклеотидам с вирусными векторами, непосредственно применяемыми в виде так называемых векторных вакцин. Вирусы, применимые для этой цели, должны обладать способностью реплицироваться у животных, которых нужно иммунизировать, т.е. у собак и/или свиней. Эти вирусы, кроме того, должны иметь геномную область, пригодную для встройки чужеродного гена /например, кодирующего фимбриальный белок или полипептид B. bronchiseptica/, который также должен экспрессироваться у вакцинированных животных. Подходящими вирусами для этой цели являются, например, энтеральные вирусы, такие как некоторые аденовирусы.
Как было указано выше, белки и полипетиды и рекомбинантные полинуклеотиды по этому изобретению пригодны для приготовления вакцин. Следовательно, эти вакцины также составляют часть этого изобретения.
Конкретное применение данного изобретения касается бактериальных векторных вакцин. При этом бактерии, способные к колонизации собак и/или свиней, трансформируются так, чтобы сделать их способными экспрессировать фимбриальный белок или фимбриальный полипептид так, что это будет приводить к иммуногенной реакции против B. bronchiseptica. Подходящими бактериями для этой цели являются, например, бактерии рода Salmonella.
Вакцина по этому изобретению может также содержать вспомогательные составляющие вакцины, такие как носители, буферы, стабилизаторы, растворители, адьюванты и консерванты. Преимущественно эти вакцины представляют собой лиофильно высушенные продукты, которые воспроизводятся добавлением подходящей жидкости /воды, буфера/ перед применением.
Вакцина может применяться перорально, интравазально или внутримышечно.
Вакцина может дополнительно содержать другие иммуногены для животных, которых нужно иммунизировать /собак и свиней/, такие как иммуногенный материал, характерный для вирусов, такие как вирус псевдобешенства /инфекционный бульбарный паралич, болезнь Ауески/, вирус гриппа, вирус трансмиссивного гастроэнтерита, парвовирус, вирус эндемичной диареи свиней, вирус холеты свиней или иммуногенный материал, характерный для микоплазмы, таких как Mycoplasma hyepneumoniae и Mycoplasma lyerhinis, или иммуногенный материал, характерный для бактерий, таких как Escherichia coli; Liptospira, Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida, Streptococcus suis, Treponema hyodysenteriae.
Изобретение иллюстрируется следующими рабочими примерами.
Пример 1.
Описание характеристик гена Г1МХ, материалы и методы
Бактериальные штаммы, среды и условия роста.
Бактериальные штаммы, среды и условия роста.
Все использованные бактериальные штаммы перечислены в таблице 1 (см. в конце описания).
Все штаммы Bordetella выращивали на агаре Борде-Жану /Difco Laboratories, Detroit. M.I./, дополненной 1% глицерина и 20% дефибринированной бараньей крови, или в триптозофосфатном бульоне /ТФБ/ /Difco Laboratories, Detroit, M.I./. Чтобы подавить экспрессию генов вирулентности среды дополняли 20 ммоль/л MgSO4 B.bronchiseptica штамм 401 использован для получения препаратов ДНК. Escherichia coli штамм PC2495 использовали для размножения вектора Bluescript /Stratagene/ и его производных. Штамм PC2495 выращивали на бульоне Луреано-Бертони /ЛБ/ или на агаре ЛБ. Ампициллин /50-100 мкг/мл соот./, 50 мкг/мл 5-бром-4-хлор-3-индолил-β-D-галактопиренозида /X-гал/ и 20 мкг/мл изопропил-β-D-тиогалактопиранозида /ИПТГ/ использовали для идентификации штаммов, содержащих плазмиду, несущую вставку ДНК. Все бактериальные культуры выращивали при 37oC в течение 16 - 24 часов.
Методы рекомбинантной ДНК
Хромосомную ДНК выделяли из штаммов Bordetella, как описано у Maniatis et al., (T. Maniatis, E.F.Fritsch and J.Sambrook 1982, Molecular cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press).
Хромосомную ДНК выделяли из штаммов Bordetella, как описано у Maniatis et al., (T. Maniatis, E.F.Fritsch and J.Sambrook 1982, Molecular cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press).
после расщепления производили электрофорез ДНК в 1% агарозном геле на буфере TAE /40 ммоль/л Трис-ацетата, 2 ммоль/л ЭДТУ/, содержащем 1 мкг/мл стадия бромида. Для выделения фрагментов ДНК из агарозного геля использовали набор Geneglean /Bio Inc 101 Corp., La Jolla/. Концевое мечение олигонуклеотидов выполняли с помощью [γ-32p)d АТФ, используя T4 полинуклеотидкиназу /Maniatis et al./. Гибридизацию выполняли в 5 x PE, 5 х растворе Денхардта, 0,1% додецилсульфата натрия и 100 мкг/мл ДНК спермы сельди при 55%oC. Пятна промыли 5х PE и 0,1% додецилсульфатом натрия при 55oC.
Блот-анализ по Саузерну
Хромосомную ДНК из B. bronchiseptica штамм 401 очищали и расщепляли с помощью нескольких рестрикционных ферментов. Фрагменты разделяли путем электрофореза, переносили на нейлоновую мембрану и гибридизовали с пробой ДНК, полученной из гена фибриальной субъединицы fimX B.pertussis. Фрагменты ДНК, представляющие интерес, идентифицированные по показателям гибридизации, выделяли с помощью набора Gene Glean (Bio Inc. 101 Corp., La Jolla). После лигирования в вектор Bluescript (Strategene) фрагменты хромосомной ДНК трансформировали в Escherichia coli, штамм PC2495 до CaCl2 методу /Dagert, M. and Ehrlich S. D. , 1979. Prolonged incubation in calcium chloride improves the competence of Escherichia coli cells Gene 6: 23 - 28).
Хромосомную ДНК из B. bronchiseptica штамм 401 очищали и расщепляли с помощью нескольких рестрикционных ферментов. Фрагменты разделяли путем электрофореза, переносили на нейлоновую мембрану и гибридизовали с пробой ДНК, полученной из гена фибриальной субъединицы fimX B.pertussis. Фрагменты ДНК, представляющие интерес, идентифицированные по показателям гибридизации, выделяли с помощью набора Gene Glean (Bio Inc. 101 Corp., La Jolla). После лигирования в вектор Bluescript (Strategene) фрагменты хромосомной ДНК трансформировали в Escherichia coli, штамм PC2495 до CaCl2 методу /Dagert, M. and Ehrlich S. D. , 1979. Prolonged incubation in calcium chloride improves the competence of Escherichia coli cells Gene 6: 23 - 28).
После гибридизации были идентифицированы положительные колонии.
Определение нуклеотидной последовательности
Плазмиду выделяли по методу щелочного лизиса /H.C.Birnboim and J.A.Doly 1979. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA, Nuclear Acids Res. J: 1513-1523).
Плазмиду выделяли по методу щелочного лизиса /H.C.Birnboim and J.A.Doly 1979. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA, Nuclear Acids Res. J: 1513-1523).
Нуклеотидную последовательность клонированных вставок определяли с помощью метода терминации дидезоксицепи /F.Sanger, S.Nicklen, A.R. Coulson 1977. DNA sequencing with claim-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci USA 74: 5463-5467), используя набор T7 полимеразного секвенирования /Amersham/. Анализ данных по последовательности ДНК выполняли с помощью программного обеспечения PC/Gene /версия 6,5, Genofit, Heidelberg SA, Женева, Швейцария/.
Частичная очистка фимбрий
B. bronchiseptica штамм 401 выращивали на триптозно-фосфатном агаре /Difco Laboratories, Detroit, M.I./. Бактерии промывали в фосфатно-буферном физрастворе /ФБФР/. Осадок бактерий суспендировали в 15 мл фосфатно-буферного физраствора с добавлением 4 моль/л мочевины. Эту суспензию помещали в термостат при температуре 40oC на 30 мин. Бактерии выделяли из суспензии путем центрифугирования при 20000 об/мин /Beckman, JA20 ротор/ в течение 10 мин. Фимбрии выделяли из супернатанта после центрифугирования при 40000 об/мин /ультрацентрифуга Beckman, ротор TC 60/ в течение 16 часов. Осадок затем суспендировали в 5 мл фосфатно-буферного физраствора. Концентрацию белка определяли с помощью исследования с бицинхининовой кислотой /БЦК/ /Pierre Chemical Comp. , USA). Анализ белка выполняли в системе для электрофореза в 15% ДСН-полиакриламидном геле.
B. bronchiseptica штамм 401 выращивали на триптозно-фосфатном агаре /Difco Laboratories, Detroit, M.I./. Бактерии промывали в фосфатно-буферном физрастворе /ФБФР/. Осадок бактерий суспендировали в 15 мл фосфатно-буферного физраствора с добавлением 4 моль/л мочевины. Эту суспензию помещали в термостат при температуре 40oC на 30 мин. Бактерии выделяли из суспензии путем центрифугирования при 20000 об/мин /Beckman, JA20 ротор/ в течение 10 мин. Фимбрии выделяли из супернатанта после центрифугирования при 40000 об/мин /ультрацентрифуга Beckman, ротор TC 60/ в течение 16 часов. Осадок затем суспендировали в 5 мл фосфатно-буферного физраствора. Концентрацию белка определяли с помощью исследования с бицинхининовой кислотой /БЦК/ /Pierre Chemical Comp. , USA). Анализ белка выполняли в системе для электрофореза в 15% ДСН-полиакриламидном геле.
Результаты
Анализ последовательности и сравнительный анализ первичной структуры
Фрагмент ДНК BamHI-EcorI, полученный из гена fimX B.pertussis, использовали в качестве пробы для идентификации фрагментов хромосомной ДНК B. bronchiseptica содержащих fim гены. Pstl фрагмент ДНК 1,3 кв из B.bronchiseptica гибридизующийся с пробой fimX, выделяли и секвенировали. На этом фрагменте располагался полный ген fimX, включая промоторные последовательности перед геном /последовательность ИД N: 1/.
Анализ последовательности и сравнительный анализ первичной структуры
Фрагмент ДНК BamHI-EcorI, полученный из гена fimX B.pertussis, использовали в качестве пробы для идентификации фрагментов хромосомной ДНК B. bronchiseptica содержащих fim гены. Pstl фрагмент ДНК 1,3 кв из B.bronchiseptica гибридизующийся с пробой fimX, выделяли и секвенировали. На этом фрагменте располагался полный ген fimX, включая промоторные последовательности перед геном /последовательность ИД N: 1/.
E. coli PC 2495, содержащие плазмиду plVB 3-420, включающую полный ген fimX, поместили на хранение в Centraal bureau voor Schimmelcultures dt Baarn, Нидерланды, 13 августа 1992 под номером хранения CBS 364.92.
Экспрессия гена fimX B.bronchiseptica
Чтобы идентифицировать продукт fimX, был сконструирован мутантный штамм с делецией, неспособный экспрессировать ген fimX. Этот мутантный штамм был сконструирован путем замены гена. К этому концу центрального фрагмента EcoRI гена fimX B.bronchiseptica замешали канамициновым геном и клонировали в вектор Bluescript. Эту конструкцию, изображенную на фиг. 1, использовали для замены гена в B.bronchiseptica. Устойчивый к канамицину мутантный штамм идентифицировали. Этот штамм больше не гибридизовался с фрагментом EcoRI. Из этого мутантного штамма готовили частично очищенные фимбрии. Это выделение фимбрий из штамма fimX - отрицательного по сравнению со штаммом дикого типа ясно показывает, что ген fimX экспрессируется на высоком уровне в B.bronchiseptica, как изображено на фиг. 2.
Чтобы идентифицировать продукт fimX, был сконструирован мутантный штамм с делецией, неспособный экспрессировать ген fimX. Этот мутантный штамм был сконструирован путем замены гена. К этому концу центрального фрагмента EcoRI гена fimX B.bronchiseptica замешали канамициновым геном и клонировали в вектор Bluescript. Эту конструкцию, изображенную на фиг. 1, использовали для замены гена в B.bronchiseptica. Устойчивый к канамицину мутантный штамм идентифицировали. Этот штамм больше не гибридизовался с фрагментом EcoRI. Из этого мутантного штамма готовили частично очищенные фимбрии. Это выделение фимбрий из штамма fimX - отрицательного по сравнению со штаммом дикого типа ясно показывает, что ген fimX экспрессируется на высоком уровне в B.bronchiseptica, как изображено на фиг. 2.
Пример 2
Описание характеристик гена фимбриальных субъединиц fim2 и fim3 Bordetella bronchiseptica
Бактериальные штаммы, плазмиды и условия роста
Использованный штамм B.bronchiseptica дикого типа был выделен от собак, страдающих от конурного кашля. Этот штамм был получен от доктора J.M.Musser /штамм N 685/ и обозначен N 401. Этот штамм выращивали в триптозно-фосфатном бульоне или агаре /Difco Laboratories, Detroit, M.I./. Штамм B.pertussis, Wellcome 28 /A. Robinson, L. A.E. Ashworth, A.Baskerville, and L.I.Irons, 1085, Proceedings of the 4th International Symposium on pertussis, Geneva, 1984. Dev. Bid. Stand. 61:165-172/ выращивали на агаре Борде-Жану /Difco Laboratories, Detroit, M. I./. Для невирулентных B.bronchiseptica ростовая среда дополнялась 20 ммоль/л MgSO4. Штамм E.coliK12 PC2495 использовали в качестве хозяина для клонирующего вектора p.Bluescript. Штамм E.coli выращивали на агаре LB или бульоне LB, дополненными 100 мкг/мл ампициллина; 50 мкг/мл X-Gal и 20 мкг/мл IPTG для идентификации рекомбинантных штаммов, содержащих клонированный фрагмент ДНК. Все культуры бактерий выращивали при 37oC в течение 16-48 часов.
Описание характеристик гена фимбриальных субъединиц fim2 и fim3 Bordetella bronchiseptica
Бактериальные штаммы, плазмиды и условия роста
Использованный штамм B.bronchiseptica дикого типа был выделен от собак, страдающих от конурного кашля. Этот штамм был получен от доктора J.M.Musser /штамм N 685/ и обозначен N 401. Этот штамм выращивали в триптозно-фосфатном бульоне или агаре /Difco Laboratories, Detroit, M.I./. Штамм B.pertussis, Wellcome 28 /A. Robinson, L. A.E. Ashworth, A.Baskerville, and L.I.Irons, 1085, Proceedings of the 4th International Symposium on pertussis, Geneva, 1984. Dev. Bid. Stand. 61:165-172/ выращивали на агаре Борде-Жану /Difco Laboratories, Detroit, M. I./. Для невирулентных B.bronchiseptica ростовая среда дополнялась 20 ммоль/л MgSO4. Штамм E.coliK12 PC2495 использовали в качестве хозяина для клонирующего вектора p.Bluescript. Штамм E.coli выращивали на агаре LB или бульоне LB, дополненными 100 мкг/мл ампициллина; 50 мкг/мл X-Gal и 20 мкг/мл IPTG для идентификации рекомбинантных штаммов, содержащих клонированный фрагмент ДНК. Все культуры бактерий выращивали при 37oC в течение 16-48 часов.
Выделение ДНК и определение нуклеотидной последовательности
Выделение хромосомной ДНК проводили по Maniatis et al. Выделение плазмиды осуществляли методом Birnboim и Doly Фрагменты хромосомной ДНК выделяли из TAE /40 ммоль/л Трис-ацетата, 2 ммоль /л ЭДТУ/ агарозного геля, используя набор Gene Clean (Bio. Inc. 101 Corp., La Jolla/. Фрагменты ДНК лигировали в pBluescript KSMB+ и MB- (Strategene, La Jolla, CA) в целях клонирования. Определение нуклеотидной последовательности проводили с помощью набора для T7 полимеразного секвенирования /Amercham/ по методу терминации дидезоксицепи Sanger et al. Для анализа данных по последовательности ДНК использовали расчетное программное обеспечение PC /Gene/ версия 6,5, Genofit. Heidelberg S. A. Женева, Швейцария/. Рестрикционные ферменты и T4 ДНК-лигазу закупали в Pharmacia и использовали в соответствии с инструкциями производителя. Плазмиды трансформировали в E.coli штамм PC2495 по CaCl2 методу Dagert и Ehrilich.
Выделение хромосомной ДНК проводили по Maniatis et al. Выделение плазмиды осуществляли методом Birnboim и Doly Фрагменты хромосомной ДНК выделяли из TAE /40 ммоль/л Трис-ацетата, 2 ммоль /л ЭДТУ/ агарозного геля, используя набор Gene Clean (Bio. Inc. 101 Corp., La Jolla/. Фрагменты ДНК лигировали в pBluescript KSMB+ и MB- (Strategene, La Jolla, CA) в целях клонирования. Определение нуклеотидной последовательности проводили с помощью набора для T7 полимеразного секвенирования /Amercham/ по методу терминации дидезоксицепи Sanger et al. Для анализа данных по последовательности ДНК использовали расчетное программное обеспечение PC /Gene/ версия 6,5, Genofit. Heidelberg S. A. Женева, Швейцария/. Рестрикционные ферменты и T4 ДНК-лигазу закупали в Pharmacia и использовали в соответствии с инструкциями производителя. Плазмиды трансформировали в E.coli штамм PC2495 по CaCl2 методу Dagert и Ehrilich.
Суазерн-болоттинг
Саузерн-блоттинг приводили по Maniatic et al.
Саузерн-блоттинг приводили по Maniatic et al.
Электрофорез в ДСН-полиакриламидном геле и иммунологические методики
Для SDS-PACE и вестерн-блот-анализа использовали равные количества бактерий. Бактерии собирали в фосфатно-буферном физрастворе /ФБФР/ и разбавляли до O600 = 1,0. 50 мкл этой суспензии лизировали в 20 мкл буфера Лэммли и подвергали электрофорезу в 15% полиакриламидном геле, как описано у Laemmli /Laemmli, U.K. 1970, Cleavage of Structurae proteins during the assembly of the head of bacteriophage T.U.Nature, 227: 680-585/. Перенос белков на нитроцеллюлозу проводили по существу как описано Van Embden et al. (J.D.A. van Embden, M.J. Van. der Dont, H.J. van Eijk, H.C. van der Heide. H.A. de Jong, M. F. Van Olderen, A.D. Osterhans, L.M. Schouls, 1983. Mdecular cloning and exoression of Treponema pallidum, DNA in E. coli K12 Infect. Immun. 42:187 - 196/. Поликлональные антитела, выработанные к денатурированным ДСН белкам фимбриальных субъединиц серотипов 2 или 3 B. pertussis, использовали для определения белков фимбриальных субъедиц B. bronchiseptica
Специфичные моноклональные антитела fim2 и fim3, выработанные к B.pertussis, использовали при ELISA в плоскодонных микротитровальных платах, покрытых целыми бактериями /OD600 = 0,1; разведенных 1:10 в 15 ммоль/л Na2 CO3, 35 ммоль/л NACO3. pH 9,6/. Связанный козий противомышиный IgG - пероксидазный конъюгат /Nordic/ определялся с помощью 2,2-азино-бис/3-этилбензтиазолин-6-сульфоновой кислотой /ABTC/ /Sigma/. Поглощение определяли при 405 нм.
Для SDS-PACE и вестерн-блот-анализа использовали равные количества бактерий. Бактерии собирали в фосфатно-буферном физрастворе /ФБФР/ и разбавляли до O600 = 1,0. 50 мкл этой суспензии лизировали в 20 мкл буфера Лэммли и подвергали электрофорезу в 15% полиакриламидном геле, как описано у Laemmli /Laemmli, U.K. 1970, Cleavage of Structurae proteins during the assembly of the head of bacteriophage T.U.Nature, 227: 680-585/. Перенос белков на нитроцеллюлозу проводили по существу как описано Van Embden et al. (J.D.A. van Embden, M.J. Van. der Dont, H.J. van Eijk, H.C. van der Heide. H.A. de Jong, M. F. Van Olderen, A.D. Osterhans, L.M. Schouls, 1983. Mdecular cloning and exoression of Treponema pallidum, DNA in E. coli K12 Infect. Immun. 42:187 - 196/. Поликлональные антитела, выработанные к денатурированным ДСН белкам фимбриальных субъединиц серотипов 2 или 3 B. pertussis, использовали для определения белков фимбриальных субъедиц B. bronchiseptica
Специфичные моноклональные антитела fim2 и fim3, выработанные к B.pertussis, использовали при ELISA в плоскодонных микротитровальных платах, покрытых целыми бактериями /OD600 = 0,1; разведенных 1:10 в 15 ммоль/л Na2 CO3, 35 ммоль/л NACO3. pH 9,6/. Связанный козий противомышиный IgG - пероксидазный конъюгат /Nordic/ определялся с помощью 2,2-азино-бис/3-этилбензтиазолин-6-сульфоновой кислотой /ABTC/ /Sigma/. Поглощение определяли при 405 нм.
Электронная микроскопия
Для электронной микроскопии культуру B. bronchiseptica разводили в ФБФР. Полиоформу, покрытую медными сетками, помещали на 50 мкл бактериальной суспензии на 5 минут. Сетки промывали 3 раза в H2O. Окрашивание проводили в течение 2 мин в 1% ВФК /вольфрамофосфорная кислота, Merck/. Сетки исследовали в электронном микроскопе PHilips EM 201.
Для электронной микроскопии культуру B. bronchiseptica разводили в ФБФР. Полиоформу, покрытую медными сетками, помещали на 50 мкл бактериальной суспензии на 5 минут. Сетки промывали 3 раза в H2O. Окрашивание проводили в течение 2 мин в 1% ВФК /вольфрамофосфорная кислота, Merck/. Сетки исследовали в электронном микроскопе PHilips EM 201.
Результаты
Нуклеотидная последовательность генов фимбриальной субъединицы fim 2 и fim 3.
Нуклеотидная последовательность генов фимбриальной субъединицы fim 2 и fim 3.
Гены субъединицы fim 2 и fim 3 B. fronchiseptica могли идентифицироваться на основе их гомологии и генами fim 2 и fim 3 B.pertussis соответственно. Фрагмент ДНК из 1000 bp. ACCl-Pstl использовался в качестве пробы для гена fim2 /I.Livey, C.J.Dugglely and A.Robinson 1987. Cloning and nucleotide sequence analysis of the serotype 2 fimbrial subunit gene of Bordetella pertussis Mol.Microb 1: 203 - 209/.
Фрагмент ДНК Sall их 900 bp использовался в качестве пробы для гена fim 3 /Mooi, F.R., A. ter Avest and H.G.J. Van der Heide 1990. Structure of the Bordetella pertussis gene codyng serotype 3 fimbrial Subinit Fems Microb. Lett 66: 327 - 332/.
Гибридизация хромосомной ДНК из B. bronchiseptica, расщепленной с помощью рестрикционной эндонуклеазы Pstl давала несколько положительных сигналов с обеими пробами из-за гомологии между двумя пробами. Из хромосомной ДНК B. bronchiseptica были выделены две области фрагментов ДНК, дающие наиболее сильный сигнал или с fim 2 или с fim 3 пробой. Эти Pstl фрагменты ДНК, равные 2,3 кв и 2,8 кв соответственно, были клонированы в векторе Bluescript. После трансформации и развития колоний были идентифицированы два клона путем гибридизации с каждой из fim проб. Один клон со вставкой 2,3 кв кодировал ген fim 2 /p1 B3-402/. Другой клон со вставкой из 2,8 кв кодировал ген fim 3 /p1 B3-430/ B. bronchiseptica. Нуклеотидная последовательность обоих генов была определена, и они представлены как последовательность ИД N 3 /fim 2/ и последовательность ИД N 5 /fim 3/ соответственно. Бактерии E.coli PC 2495 /p1 B3-402/ и PC 2495 /p1 B3-430/ были помещены на хранении в Centraalbureau voor Shimmelculture в Баарне, Нидерланды, 13 августа 1992 года под ТТ CBS 362.92 и CBS 361.92 оответственно.
Пример 3
Конструирование двух штаммов Bordetella Bronchiseptica, которые дефицитны по продукции одного типа фимбрий
Были созданы штаммы Bordetella bronchiseptica, дефицитные по продукции фимбрий Fim X /Bbfx-/ или фимбрий Fim 2 (Bbf 2). Это было получено путем замены гена разорванными генами после гомологичной рекомбинации. Разорванные гены трансформировали в B.bronchiseptica путем электропорации. Деления в генах фимбриальной субъединицы создавалась путем замены фрагмента EcoPI в генах дикого типа геном резистентности к канамицину.
Конструирование двух штаммов Bordetella Bronchiseptica, которые дефицитны по продукции одного типа фимбрий
Были созданы штаммы Bordetella bronchiseptica, дефицитные по продукции фимбрий Fim X /Bbfx-/ или фимбрий Fim 2 (Bbf 2). Это было получено путем замены гена разорванными генами после гомологичной рекомбинации. Разорванные гены трансформировали в B.bronchiseptica путем электропорации. Деления в генах фимбриальной субъединицы создавалась путем замены фрагмента EcoPI в генах дикого типа геном резистентности к канамицину.
Материалы и методы
Бактериальные штаммы, плазмиды и условия роста
Штамм B. bronchiseptica N 401 дикого типа использовался во всех экспериментах. Бактерии были получены от доктора J.M.Musser /штамм N 685/. Этот штамм выращивали на триптознофосфатном агаре /ТФА/ /Difco Laboratories/ или на агаре Борде-Жану /БЖ/ /Difco Laboratories/, дополненном 15% свежих бараньих эритроцитов, при 37oC в течение 24 - 48 часов. В целях клонирования использовался штамм Escherichia coli K12 PC2495 с плазмидой Bluescript KSu Sk (Stratagene) E. coli PC 2495 выращивали на агаре Луриа-Бертони с соответствующими антибиотиками в течение 16 часов при 37oC. Для ампициллина и/или канамицина использовалась концентрация 100 мкг/мл.
Бактериальные штаммы, плазмиды и условия роста
Штамм B. bronchiseptica N 401 дикого типа использовался во всех экспериментах. Бактерии были получены от доктора J.M.Musser /штамм N 685/. Этот штамм выращивали на триптознофосфатном агаре /ТФА/ /Difco Laboratories/ или на агаре Борде-Жану /БЖ/ /Difco Laboratories/, дополненном 15% свежих бараньих эритроцитов, при 37oC в течение 24 - 48 часов. В целях клонирования использовался штамм Escherichia coli K12 PC2495 с плазмидой Bluescript KSu Sk (Stratagene) E. coli PC 2495 выращивали на агаре Луриа-Бертони с соответствующими антибиотиками в течение 16 часов при 37oC. Для ампициллина и/или канамицина использовалась концентрация 100 мкг/мл.
Методика рекомбинантных ДНК
Процедуру клонирования выполняли, как описано Maniatis et al. Каждый ген фимбриальной субъединицы, включая примыкающие последовательности, был клонирован в вектор Bluescript. Эти векторы выделяли с помощью метода щелочной экстракции Birnboim и Doly. Фрагмент ДНК в гене субъединицы замещали геном резистентности к канамицину (J.F. Miller, W.J. Dower and L.S. Tompkins 1988, High-vol-voltage electroporation of bacteria: Genetic transformation of Compylobacter jejuni with plasmid DNA. Proc. Natl. Acad. Sci., USA. 169:5320-5323/. Эта последняя конструкция была использована в экспериментах электропорации.
Процедуру клонирования выполняли, как описано Maniatis et al. Каждый ген фимбриальной субъединицы, включая примыкающие последовательности, был клонирован в вектор Bluescript. Эти векторы выделяли с помощью метода щелочной экстракции Birnboim и Doly. Фрагмент ДНК в гене субъединицы замещали геном резистентности к канамицину (J.F. Miller, W.J. Dower and L.S. Tompkins 1988, High-vol-voltage electroporation of bacteria: Genetic transformation of Compylobacter jejuni with plasmid DNA. Proc. Natl. Acad. Sci., USA. 169:5320-5323/. Эта последняя конструкция была использована в экспериментах электропорации.
Эксперименты по электропорации
Электропорацию выполняли по существу так, как описано Miller et al (J.F. Miller, W. J. Dower and L.S. Tompkins 1988. High voltage electroporation of bacteria: Genetic transformation of Compylobacter jejuni wit plasmid DNA. Proc. Natl. Acad. Sci., USA. 85: 856-860/. Штамм 401 B.bronchiseptica дикого типа выращивали на агаре БЖ в течение 16 часов. Клетки собирали в 1 мл раствора 15% глицерина - 272 ммоль/л сахарозы /ГлиСах/ /0oC/, промывали и ресуспендировали в 400 мкл ГлиСах. Образцы этой суспензии по 50 мкл замораживали при -80oC. Эти образцы использовали в экспериментах электропорации для трансформации B.bronchiseptica 1-3 мкг ДНК, растворенной в дистиллированной воде. Использованные условия электропорации были следующими: 0,7 к, 25 мкГ и 600 Ом /Biorad Gene Pulser, используя кюветы с зазором 0,56 мл от Biotechnologic an Experimental Research Inc., San Diego CA/. Измеренные временные константы находились между 3,5-7 мс. Клетки восстанавливали в 1 мл триптозофосфатного бульона /Difco Laboratories/ в течение 90 мин, при 37oC и высевали на чашки с ТФВ /Difco Laboratories/, содержащие 100 мкг/мл канамицина. Отбор рекомбинантных штаммов выполняли с помощью саузерн-блоттинга на препараты хромосомной ДНК.
Электропорацию выполняли по существу так, как описано Miller et al (J.F. Miller, W. J. Dower and L.S. Tompkins 1988. High voltage electroporation of bacteria: Genetic transformation of Compylobacter jejuni wit plasmid DNA. Proc. Natl. Acad. Sci., USA. 85: 856-860/. Штамм 401 B.bronchiseptica дикого типа выращивали на агаре БЖ в течение 16 часов. Клетки собирали в 1 мл раствора 15% глицерина - 272 ммоль/л сахарозы /ГлиСах/ /0oC/, промывали и ресуспендировали в 400 мкл ГлиСах. Образцы этой суспензии по 50 мкл замораживали при -80oC. Эти образцы использовали в экспериментах электропорации для трансформации B.bronchiseptica 1-3 мкг ДНК, растворенной в дистиллированной воде. Использованные условия электропорации были следующими: 0,7 к, 25 мкГ и 600 Ом /Biorad Gene Pulser, используя кюветы с зазором 0,56 мл от Biotechnologic an Experimental Research Inc., San Diego CA/. Измеренные временные константы находились между 3,5-7 мс. Клетки восстанавливали в 1 мл триптозофосфатного бульона /Difco Laboratories/ в течение 90 мин, при 37oC и высевали на чашки с ТФВ /Difco Laboratories/, содержащие 100 мкг/мл канамицина. Отбор рекомбинантных штаммов выполняли с помощью саузерн-блоттинга на препараты хромосомной ДНК.
Очистка хромосомой ДНК и саузерн-блот-анализ
Хромосомную ДНК очищали по Maniatis et al. Саузерн-блот-анализ выполняли, как описано ранее.
Хромосомную ДНК очищали по Maniatis et al. Саузерн-блот-анализ выполняли, как описано ранее.
Пробы ДНК, использованные в экспериментах гибридизации
Для экспериментов гибридизации, касающихся гена fimX, были использованы две пробы, обозначенные fXEV и f3SE фрагмент ДНК 450 bp, используемый в качестве пробы fXEv, был выделен при расщеплении pI v B3-426 с помощью рестрикционной эндонуклеазы EcoRV /фиг. 3/. Фрагмент ДНК 580 bp пробы f3SE был получен после расщепления pIv B3-430 с помощью рестрикционных эндонуклеаз SpnI и EcoRI /фиг. 4/. Для экспериментов гибридизации, касающихся гена fim 2, были использованы три пробы, обозначенные f2Ev, kana и f2PE /фиг. 5/. Проба f2Ev была EcoRV фрагментом ДНК 900 bp, выделенным из pIV B3-417; проба капа была EcoRV фрагментом ДНК в 900 bp в гене устойчивости к канамицину, а проба f2PE была PSTl-EcoRV фрагментом ДНК в 610 bp из pIV B3-417.
Для экспериментов гибридизации, касающихся гена fimX, были использованы две пробы, обозначенные fXEV и f3SE фрагмент ДНК 450 bp, используемый в качестве пробы fXEv, был выделен при расщеплении pI v B3-426 с помощью рестрикционной эндонуклеазы EcoRV /фиг. 3/. Фрагмент ДНК 580 bp пробы f3SE был получен после расщепления pIv B3-430 с помощью рестрикционных эндонуклеаз SpnI и EcoRI /фиг. 4/. Для экспериментов гибридизации, касающихся гена fim 2, были использованы три пробы, обозначенные f2Ev, kana и f2PE /фиг. 5/. Проба f2Ev была EcoRV фрагментом ДНК 900 bp, выделенным из pIV B3-417; проба капа была EcoRV фрагментом ДНК в 900 bp в гене устойчивости к канамицину, а проба f2PE была PSTl-EcoRV фрагментом ДНК в 610 bp из pIV B3-417.
Результаты
Две плазмиды с фрагментами ДНК, содержащими ген субъединицы фимбрий fimX или fim2, были использованы для трансформации бактерий B.bronchiseptica дикого типа путем электропорации. Гены обеих субъединиц были разрушены путем замены EcoRV фрагмента ДНК геном устойчивости к канамицину. До того, как это могло быть сделано, должен быть удален третий сайт EcoRV, присутствующий в полилинкере вектора Bluescript. Это было сделано путем субклонирования фрагментов ДНК в EcoRV Bluescript вектор, дающего в результате pIV B3-426 для fimX и pIV B3-417 для fimL /фиг. 3.5/. Оба клона затем расщепляли путем рестрикционной эндонуклеазы EcoRV. При этом расщеплении из клона гена fim X /pIV B3-426/ удалялся фрагмент в 450 bp, включая 5' промоторные последовательности /фиг. 3/. После удаления фрагмента EcoRV выделяли вектор с оставшимися последовательностями ДНК, и фрагмент ДНК Smal-Hincll в 1,4 kb, содержащий ген устойчивости к канамицину, клонировали в сайты EcoRV. Трансформация в E. coli PC2495 с последующим выделением плазмиды давала клон pIV B3-427 /фиг. 3/. Той же самой стратегии следовали в отношении гена фимбриальной субъединицы fim 2. Расщепление клона pIV B3-417 с помощью рестрикционной эндонуклеазы EcoRV /фиг. 5/ перемещало фрагмент ДНК в 900 bpк 3'-части гена вместе с примыкающими последовательностями. Лигирование гена устойчивости к канамицину в эту конструкцию давало клон pIV B3-418 /фиг. 5/.
Две плазмиды с фрагментами ДНК, содержащими ген субъединицы фимбрий fimX или fim2, были использованы для трансформации бактерий B.bronchiseptica дикого типа путем электропорации. Гены обеих субъединиц были разрушены путем замены EcoRV фрагмента ДНК геном устойчивости к канамицину. До того, как это могло быть сделано, должен быть удален третий сайт EcoRV, присутствующий в полилинкере вектора Bluescript. Это было сделано путем субклонирования фрагментов ДНК в EcoRV Bluescript вектор, дающего в результате pIV B3-426 для fimX и pIV B3-417 для fimL /фиг. 3.5/. Оба клона затем расщепляли путем рестрикционной эндонуклеазы EcoRV. При этом расщеплении из клона гена fim X /pIV B3-426/ удалялся фрагмент в 450 bp, включая 5' промоторные последовательности /фиг. 3/. После удаления фрагмента EcoRV выделяли вектор с оставшимися последовательностями ДНК, и фрагмент ДНК Smal-Hincll в 1,4 kb, содержащий ген устойчивости к канамицину, клонировали в сайты EcoRV. Трансформация в E. coli PC2495 с последующим выделением плазмиды давала клон pIV B3-427 /фиг. 3/. Той же самой стратегии следовали в отношении гена фимбриальной субъединицы fim 2. Расщепление клона pIV B3-417 с помощью рестрикционной эндонуклеазы EcoRV /фиг. 5/ перемещало фрагмент ДНК в 900 bpк 3'-части гена вместе с примыкающими последовательностями. Лигирование гена устойчивости к канамицину в эту конструкцию давало клон pIV B3-418 /фиг. 5/.
Обе плазмиды /pIV B3-427 и pIV B3-418/ выделяли и использовали отдельно в экспериментах электропорации для трансформации B.bronchiseptica. После каждого эксперимента электропорации наблюдалось до 102 колоний B.bronchiseptica устойчивых к канамицину. После электропорации с плазмидой pIV B3-427 /частичный ген фимбриальной субъединицы fim XI, было проанализировано 4 колонии /fXI-IV/. После электропорации с плазмидой pIV B3-418 /частичный ген фимбриальной субъединицы fim 2/, было проанализировано 7 колоний /f2 I-VII/. Из этих устойчивых к канамицину штаммов B.bronchiseptica была выделена хромосомная ДНК и расщеплена рестрикционными эндонуклеазами Pstl и EcoRV соответственно. Гибридизацию по Саузерну выполняли с расщепленной хромосомой ДНК, выделенной из штаммов, устойчивых к канамицину, и штамма B.bronchiseptica дикого типа. Расщепленная хромосомная ДНК из 4 штаммов, выделенная после электропорации с pIV B3-427, гибридизовалась с пробами fXEv и f3SE соответственно /фиг. 3, 4/. Расщепленная хромосомная ДНК из 7 штаммов, выделенных после электропорации с плазмидой pIV B3-18, гидридизовалась с пробами f2Ev, kan и f2SE, соответственно /фиг. 5/. Из образцов гибридизации с пробами fXEv и f2Ev было ясно, что были выделены рекомбинантные штаммы с отсутствующей или частью fimX /фиг. 6A, 6B/, или fim2 /фиг. 7A, 7B/ гена фимбриальной субъединицы. В экспериментах гибридизации с канамициновым геном в качестве пробы для гена fim2 было показано, что все выделенные штаммы /f2 I-VII/ содержат канамициновый ген /фиг. 7C/.
Так как канамициновый ген присутствовал во всех fim2 рекомбинантных штаммах, замена гена могла произойти в одном из других генов фимбриальных субъединиц благодаря гомологии между генами субъединиц. Чтобы определить, было ли это событие, эксперименты гибридизации проводили в условиях низкой жесткости, и тем самым могла наблюдаться кросогибридизация при использовании проб, полученных из генов других субъединиц. Эксперименты гибридизации на штаммах B. bronchiseptica fimX, устойчивых к канамицину /fX I-VI/, с пробой f3SE /ген субъединицы fim 3/ показали, что замена гена в гене фимбриальной субъединицы происходило только у штамма BbfX. У этого штамма, а также у других рекомбинантых штаммов /fX II-IV/ присутствовали сигналы гибридизации с фрагментами ДНК, содержащими гены fim3 и fim2 /фиг. 6C/. Так как эти последние сигналы были такими же, что и для B.bronchiseptica дикого типа, ни в одном из других генов субъединиц рекомбинации не наблюдалось /фиг. 6c/. Гибридизация мутантных штаммов fim2 с пробой f 2PE показала, что замена гена только в гене fim2 происходила в штамме B bF2 /фиг. 7/. При использовании этой пробы сигналы гибридизации наблюдались со всеми тремя генами субъединиц. Так как фрагмент Pstl -EcoRV/ проба f2PE/ присутствует в pIV B3-418, использованной для электропорации, в рекомбинантных штаммах /f2 II-VIII/ может наблюдаться четвертый сигнал гибридизации. Это показывает, что плазмида pIV B3-418 может все же присутствовать в штаммах, устойчивых к канамицину. Возможно, рекомбинация происходила где-то еще в хромосоме в неидентифицированном месторасположении вне гена фимбриальной субъединицы.
Пример 4
Эксперимент по вакцинации мышей мутантами Bordetella bronchiseptica BbfX- или Bbf2-
Материалы и методы
Три группы из 80 мышей каждая /мыши - самки BAL B/C, шестинедельного возраста/ интраназально инфицировали диким типом B.bronchiseptica, BbfX- и Bbf2-/ последние два получали в соответствии с примером 2/, соответственно /2 • 107 KOE каждую/. Число живых бактерий в распираторном тракте 8 мышей определяли в указанные временные интервалы /0, 1, 3, 7, 11 и на 36 день/. Носоглотку, нос, трахею и легкие каждой мыши исследовали на присутствие жизнеспособных B.bronchiseptica. Мышей забивали с помощью инъекции барбитуратов примерно через час после инфицирования /обозначенного как 0 день/ и через разное число дней, начиная с этого времени. Легкие и трахею удаляли и гомогенизировали в ФБФР с помощью гомогенизатора тканей. Мазки износа брали с помощью кетгута. Кетгут помещали в 0,5 мл ФБФР и взбалтывали вращением в течение 5 мин. Носоглотку смывали ФБФР до тех пор, пока не собиралось 5 капель /примерно 0,5 мл/. Разведения всех гомогенатов и капель из носоглотки высевали на чашки с триптозо-фосфатным агаром, и после 2-х дней инкубации подсчитывали KOE.
Эксперимент по вакцинации мышей мутантами Bordetella bronchiseptica BbfX- или Bbf2-
Материалы и методы
Три группы из 80 мышей каждая /мыши - самки BAL B/C, шестинедельного возраста/ интраназально инфицировали диким типом B.bronchiseptica, BbfX- и Bbf2-/ последние два получали в соответствии с примером 2/, соответственно /2 • 107 KOE каждую/. Число живых бактерий в распираторном тракте 8 мышей определяли в указанные временные интервалы /0, 1, 3, 7, 11 и на 36 день/. Носоглотку, нос, трахею и легкие каждой мыши исследовали на присутствие жизнеспособных B.bronchiseptica. Мышей забивали с помощью инъекции барбитуратов примерно через час после инфицирования /обозначенного как 0 день/ и через разное число дней, начиная с этого времени. Легкие и трахею удаляли и гомогенизировали в ФБФР с помощью гомогенизатора тканей. Мазки износа брали с помощью кетгута. Кетгут помещали в 0,5 мл ФБФР и взбалтывали вращением в течение 5 мин. Носоглотку смывали ФБФР до тех пор, пока не собиралось 5 капель /примерно 0,5 мл/. Разведения всех гомогенатов и капель из носоглотки высевали на чашки с триптозо-фосфатным агаром, и после 2-х дней инкубации подсчитывали KOE.
Через 52 дня после вакцинации группы, вакцинированные BbfX- или Bbf2-, и невакцинированную группу заражали вирулентным штаммом B.bronchiseptica. Колонизацию респираторного тракта определяли количественно на 0, 1, 4 и 14 день после заражения.
Результаты
Сравнили результаты колонизации верхнего распираторного тракта как мутантными штаммами, так и штаммом дикого типа. Не существует различий в колонизации различных органов верхнего респираторного тракта после заражения мутантными штаммами BbfX- или Bbf2- по сравнению со штаммом дикого типа.
Сравнили результаты колонизации верхнего распираторного тракта как мутантными штаммами, так и штаммом дикого типа. Не существует различий в колонизации различных органов верхнего респираторного тракта после заражения мутантными штаммами BbfX- или Bbf2- по сравнению со штаммом дикого типа.
На 36 день мышей из групп BbfX- и Bbf2- контролировали на присутствие Bordetella. Легкие и трахея были свободны от Bordetella, тогда как в носу и носоглотке еще присутстовали небольише количества.
На 52 день после вакцинации мышей вакцинировали мутантами BbfX- и Bbf2-, а контрольную группу заражали вирулентным штаммом B.bronchiseptica. Колонизация носоглотки вирулентным штаммом B.bronchiseptica не моглда прдотвращаться в обеих вакцинированных группах.
Колонизация легких и трахеи диким штаммом в вакцинированных группах могла обнаружиться только через час после заражения, тогда как в контрольной группе присутствовала сильная колонизация.
Колонизация носа мышей вакцинированных мутаннтных штаммов могла обнаруживаться только в 0 день и у некоторых мышей в 1-й день, тогда как у мышей контрольной группы наблюдалась сильная колонизация носа.
Информация по посл. N 1- 6 дана после формулы изобретения.
Claims (1)
- см.текст
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP92202525 | 1992-08-18 | ||
| EP92202525.9 | 1992-08-18 | ||
| NL92202525.9 | 1992-08-18 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU95107705A RU95107705A (ru) | 1997-03-27 |
| RU2129611C1 true RU2129611C1 (ru) | 1999-04-27 |
Family
ID=8210860
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU95107705A RU2129611C1 (ru) | 1992-08-18 | 1993-07-28 | Полипептид, рекомбинантный полинуклеотид, вакцина |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5939064A (ru) |
| EP (1) | EP0656948B1 (ru) |
| JP (1) | JPH08500734A (ru) |
| AT (1) | ATE263244T1 (ru) |
| CA (1) | CA2142712C (ru) |
| CZ (1) | CZ285307B6 (ru) |
| DE (1) | DE69333467T2 (ru) |
| FI (1) | FI113242B (ru) |
| HU (1) | HU219819B (ru) |
| NO (1) | NO319988B1 (ru) |
| PL (1) | PL307505A1 (ru) |
| RU (1) | RU2129611C1 (ru) |
| SK (1) | SK21495A3 (ru) |
| WO (1) | WO1994004683A1 (ru) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2646776B1 (fr) | 1989-05-12 | 1994-06-03 | Pasteur Institut | Utilisation de preparations vaccinantes a base d'adenyl cyclase ou de bacteries les produisant en tant qu'antigenes protecteurs contre les effets des bordetella |
| FR2728170A1 (fr) * | 1994-12-15 | 1996-06-21 | Pasteur Institut | Vaccin de type acellulaire anti-bordetella |
| US6475754B1 (en) * | 1999-05-14 | 2002-11-05 | University Of Tennessee Research Corporation | Polynucleotides encoding Bordatella bronchiseptica fimbrial proteins (FimN), vectors, and expression systems therefor |
| US7435422B2 (en) * | 2004-01-15 | 2008-10-14 | Intervet International B.V. | Non-animal origin stabilizers and processes for producing the same |
| US7521059B2 (en) * | 2004-06-14 | 2009-04-21 | Fenwick Bradley W | Kennel cough vaccine |
| DK1828378T3 (da) * | 2004-12-17 | 2014-09-01 | Staat Der Nederlanden Vert Door De Minister Van Vws Ministerie Van Volksgezondheit Welzijn En Sport | Deacylering af LPS i gram-negative bakterier |
| CN112375127B (zh) * | 2020-11-25 | 2022-09-09 | 江苏省农业科学院 | 一种用作支气管败血波氏菌病疫苗的重组蛋白及其应用 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU575086B2 (en) * | 1983-11-07 | 1988-07-21 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Bordetella bronchiseptica pili subunit protein and vaccine |
| DK594084A (da) * | 1984-12-12 | 1986-06-13 | Novo Industri As | Fremgangsmaade til stabilisering af extra-chromosomale elementer i bakterier under dyrkning |
| IT1223579B (it) * | 1987-12-22 | 1990-09-19 | Eniricerche Spa | Clonaggio e sequenziamento del gene codificante per una nuova subunita' pilinica di bordetella pertussis |
| IT1231961B (it) * | 1989-09-22 | 1992-01-16 | Eniricerche Spa | Clonaggio del gene codificante la subunita' pilinica fim3 di bordetella pertussis. |
-
1993
- 1993-07-28 EP EP93919704A patent/EP0656948B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1993-07-28 HU HU9500491A patent/HU219819B/hu unknown
- 1993-07-28 AT AT93919704T patent/ATE263244T1/de not_active IP Right Cessation
- 1993-07-28 JP JP6506121A patent/JPH08500734A/ja active Pending
- 1993-07-28 PL PL93307505A patent/PL307505A1/xx unknown
- 1993-07-28 CZ CZ95410A patent/CZ285307B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1993-07-28 WO PCT/NL1993/000161 patent/WO1994004683A1/en active IP Right Grant
- 1993-07-28 RU RU95107705A patent/RU2129611C1/ru active
- 1993-07-28 DE DE69333467T patent/DE69333467T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1993-07-28 US US08/381,881 patent/US5939064A/en not_active Expired - Lifetime
- 1993-07-28 CA CA002142712A patent/CA2142712C/en not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-02-16 SK SK214-95A patent/SK21495A3/sk not_active IP Right Cessation
- 1995-02-16 NO NO19950582A patent/NO319988B1/no not_active IP Right Cessation
- 1995-02-17 FI FI950740A patent/FI113242B/fi not_active IP Right Cessation
-
1999
- 1999-03-30 US US09/281,221 patent/US6284256B1/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO1994004683A1 (en) | 1994-03-03 |
| JPH08500734A (ja) | 1996-01-30 |
| CZ285307B6 (cs) | 1999-07-14 |
| NO319988B1 (no) | 2005-10-10 |
| CA2142712C (en) | 2004-01-06 |
| EP0656948A1 (en) | 1995-06-14 |
| FI950740A (fi) | 1995-02-17 |
| US6284256B1 (en) | 2001-09-04 |
| CA2142712A1 (en) | 1994-03-03 |
| NO950582L (no) | 1995-02-16 |
| FI950740A0 (fi) | 1995-02-17 |
| CZ41095A3 (en) | 1995-08-16 |
| NO950582D0 (no) | 1995-02-16 |
| FI113242B (fi) | 2004-03-31 |
| US5939064A (en) | 1999-08-17 |
| HU9500491D0 (en) | 1995-04-28 |
| HUT70984A (en) | 1995-11-28 |
| SK21495A3 (en) | 1995-07-11 |
| HU219819B (hu) | 2001-08-28 |
| DE69333467D1 (de) | 2004-05-06 |
| DE69333467T2 (de) | 2005-01-20 |
| RU95107705A (ru) | 1997-03-27 |
| PL307505A1 (en) | 1995-05-29 |
| ATE263244T1 (de) | 2004-04-15 |
| EP0656948B1 (en) | 2004-03-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3205932B2 (ja) | ライム病に対するワクチン、その取得法、モノクローナル抗体、抗原、組換えｄｎａ、組換えベクター及び抗原の取得法 | |
| Luo et al. | Cloning and characterization of the major outer membrane protein gene (ompH) of Pasteurella multocida X-73 | |
| HU219772B (hu) | Vakcinakészítmény Lyme-kór megelőzésére és eljárás előállítására | |
| Klinkert et al. | Surface proteins of Mycoplasma hyopneumoniae identified from an Escherichia coli expression plasmid library | |
| CA2071863C (en) | Recombinant vaccine for porcine pleuropneumonia | |
| SK279968B6 (sk) | Imunogénny prostriedok, sekvencia rekombinantnej d | |
| RU2129611C1 (ru) | Полипептид, рекомбинантный полинуклеотид, вакцина | |
| US7662390B2 (en) | Lawsonia intracellularis subunit vaccine | |
| US20040091901A1 (en) | Immunogenic Mycoplasma hyopneumoniae polypeptides | |
| JPH10290695A (ja) | アクチノバシラス・プレウロニューモニアの弱毒化生菌 | |
| US20050002946A1 (en) | Vaccines and agents for inducing immunity in fish against rickettsial diseases, and associated preventative therapy | |
| JP2005532804A (ja) | ブラキスピラ・ヒオジセンテリアエワクチン | |
| US20070212373A1 (en) | Lawsonia Intracellularis 26 Kd Subunit Vaccine | |
| CA2622635A1 (en) | Polynucleotides of haemophilus parasuis and its use | |
| RU2102081C1 (ru) | Иммуногенная композиция против боррелиоза лайма, способ иммунизации млекопитающего против боррелиоза лайма, способ получения белка pc borrelia burgdorferi, диагностический агент для обнаружения b.burgdorferi и способ обнаружения антител к b.burgdorferi | |
| KR20060112674A (ko) | 로소니아 인트라셀룰라리스 26 ｋｄ 서브유닛 백신 | |
| CA2281913A1 (en) | A vaccine against piscirickettsia salmonis based on a recombinant 17 kd protein | |
| IE84132B1 (en) | OspA Lipoproteins |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PC41 | Official registration of the transfer of exclusive right |
Effective date: 20101222 |