DE69333467T2

DE69333467T2 - Bordetella bronchiseptica impfstoff

Info

Publication number: DE69333467T2
Application number: DE69333467T
Authority: DE
Inventors: Paul H.M. Savelkoul; Willem Gaastra
Original assignee: Dimminaco AG
Current assignee: Pfizer AG
Priority date: 1992-08-18
Filing date: 1993-07-28
Publication date: 2005-01-20
Anticipated expiration: 2013-07-29
Also published as: FI950740A0; FI950740A; ATE263244T1; NO950582D0; JPH08500734A; HU219819B; EP0656948A1; CZ285307B6; RU2129611C1; NO950582L; DE69333467D1; US6284256B1; CA2142712C; EP0656948B1; CA2142712A1; FI113242B; PL307505A1; HU9500491D0; CZ41095A3; US5939064A

Description

Die vorliegende Erfindung befasst sich mit einem Vakzin, welches Hunde gegen Bordetella bronchiseptica-Infektionen schützt, mit Polypeptiden, die charakteristisch für B. bronchiseptica sind, und mit der Herstellung davon unter Verwendung von rek. DNA-Technologie.
Die Gattung Bordetella umfasst vier Arten: Bordetella pertussis (B. pertussis), Bordetella parapertussis (B. parapertussis), Bordetella bronchiseptica (B. bronchiseptica) und Bordetella avium (B. avium). Bordetella sind kleine gramnegative Kokkobacilli, die obligat aerob, oftmals bipolar gefärbt und Cytochromoxidase-positiv sind. Kolonien auf Bordet-Gengou-Medium sind von einer Hämolyse-Zone umgeben, ausgenommen B. avium.
Alle Arten von Bordetella verursachen hinsichtlich der Adhäsion, Proliferation, klinischen Symptomen und Histopathologie ähnliche Krankheiten. Kinder und Tiere sind am ehesten empfänglich für Bordetella-Infektionen. In diesen Fällen ist die Krankheit am schwersten und die Sterblichkeit am höchsten.
B. bronchiseptica ist primär ein Pathogen von Labor-, Haus- und Wildtieren und nur ausnahmsweise von Menschen. Kaninchen, Meerschweinchen, Ratten, nicht-menschliche Primaten, Hunde, Schweine, Katzen, Pferde und Füchse werden oft epidemisch infiziert. B. bronchiseptica verursacht besonders Zwingerhusten bei Hunden und die atrophe Rhinitis bei Ferkeln. Bei Hunden ist der infektiöse Vorgang zum Großteil auf den Tracheobronchitis-Stamm beschränkt und ist, nach der Adhäsion an den Zilien, durch Proliferation an dem trachealen Epithelium gekennzeichnet. Die schwersten Symptome der Krankheit sind die ausgeprägten trachealen Schleimanreicherungen, Erbrechen, Lungenläsion und Gewichtsverlust. Hunde haben einen trockenen, kurzen, aber ununterbrochenen Husten. Infektion von Ferkeln mit B. bronchiseptica ist gekennzeichnet durch Schwund der Nasenmuschel, Schnauzendeformierung, Lungenentzündung und verringerte Gewichtszunahme. Obwohl es so aussah, als ob B. bronchiseptica das verantwortliche Agens für die atrophe Rhinitis ist, gibt es nunmehr erhebliche Beweise dafür, dass Pasteurella multicoida das Hauptpathogen ist, wobei B. bronchiseptica wahrscheinlich eine induzierende oder opportunistische Rolle spielt. Die gezeigten Trägerstadien, ohne klinische Zeichen, sind für Hunde, Schweine und Kaninchen sehr hoch.
Mehrere Virulenzfaktoren wurden in Bordetellae gefunden. Diese umfassen: Pertussistoxin, filamentöses Haemagglutinin, Fimbrien, Adenylatzyklase, dermonekrotisches Toxin, Tracheal-Toxin und Hämolysin. Diese Virulenzfaktoren werden nicht in allen Arten exprimiert, beispielsweise das Gen, welches Pertussistoxin in B. pertussis kodiert, ist als ein „silent"-Gen des Chromosoms von B. parapertussis und B. bronchiseptica vorhanden. Neben diesen Virulenzfaktoren gibt es wahrscheinlich noch mehr, nicht identifizierte, Faktoren, welche in die Pathogenität des Bakteriums involviert sind. In „Microbial Pathogeneiss", 1987, 2, Seiten 473 – 484 wird die Charakterisierung von Fimbrien-Untereinheiten aus Bordetella-Arten beschrieben.
Bordetella-Infektionen gehen von den zilientragenden Zellen der Atemwege aus. Bakterielle Adhäsion ist eine Voraussetzung für den Ausbruch der Infektion, da andernfalls der Spülvorgang der Zilien die Bakterien zusammen mit anderen Partikeln aus der Trachea entfernt. Die Adhäsion von Bordetella an zilientragenden Zellen wird durch serologisch unterschiedliche Fimbrien und das filamentöse Hämagglutinin (FHA) (FHA ist jedoch nicht in B. avium vorhanden) vermittelt. Fimbrien sind haarähnliche Strukturen, bestehend aus identischen Protein-Untereinheiten, die von der bakteriellen Zelloberfläche ausgehen. Das FHA ist ein oberflächenassoziiertes Protein, welches ebenso in die extrazellulare Umgebung ausgeschieden wird und zum Agglutinieren einer Vielzahl von Erythrozyten fähig ist. Sowohl die Fimbrien- als auch die FHA-Expression wird durch den bvg-Locus reguliert, obwohl die Expression der Fimbrien-Untereinheit-Gene, in B. pertussis, ebenso durch einen 13-15 Cytosin-Restlängen-Bereich vor den Fimbrien-Untereinheit-Genen beeinflusst wird. Alle virulenten Bordetellae zeigen auf ihrer Oberfläche Adhäsionsfaktoren, wohingegen nicht-virulente Stämme dies nicht tun. Da diese Adhäsine essentiell für den Ausbruch der Krankheit sind, sind diese interessante Vakzinbestandteile.
Der Zweck der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines rekombinanten DNA-Vakzins gegen B. bronchiseptica-Infektion. Die Forschung hat sich auf die Adhäsions-Faktoren konzentriert, da das Verhindern der Adhäsion, als ein Ergebnis einer Immunreaktion, welche sich gegen Adhäsions-Faktoren richtet, eine Infektion verhindert. In B. bronchiseptica sind mehrere serologische Fimbrien und FHA für die Adhäsion des Bakteriums an den zilientragenden trachealen Epithelzellen verantwortlich. Wenn der Wirt eine Immunreaktion gegen die Adhäsions-Faktoren des mikrobischen Organismus aufweist, ist keine Kolonisierung möglich. Die Bakterien werden vor der Erzeugung von jeglichen Toxinen abgetötet und es entwickeln sich keine klinischen Symptome.
Ein Vakzin gemäß dieser Erfindung, welches die Kolonisierung von B. bronchiseptica verhindert, umfasst vorzugsweise so viele zur Adhäsion notwendigen Bestandteile wie möglich. Ein rekombinantes Vakzin kann als ein Untereinheit-Vakzin hergestellt sein. Es ist jedoch nicht bekannt, wie viele serologisch unterschiedliche Fimbrien hergestellt werden und was der Beitrag von jedem Faktor (Fimbrien und FHA) zur Adhäsion ist. Bei der Entwicklung von Vakzinen ist es notwendig, dass der Beitrag der Adhäsion aller Bestandteile getrennt voneinander untersucht wird. Die gesuchten Proteine können als ein Untereinheit-Vakzin nach der Überproduktion in einem geeigneten mikrobiellen Organismus verwendet werden.
Die Erfindung stellt ein Polypeptid mit den immunogenen Merkmalen eines Fimbrien-Proteins von B. bronchiseptica und mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQUENZ ID Nr. 4 oder SEQUENZ ID Nr. 6 bereit. Die Erfindung stellt ferner ein isoliertes Polynukleotid bereit, welches ein hierin beschriebenes Polypeptid exprimieren kann, und hat eine Nukleotidsequenz entsprechend SEQUENZ ID Nr. 3, SEQUENZ ID Nr. 5 oder einer Sequenz, die infolge des genetischen Codes zur SEQUENZ TD Nr. 3 oder SEQUENZ ID Nr. 5 degeneriert ist.
Die Erfindung stellt ferner einen B. bronchiseptica-Stamm bereit, welcher ein hierin beschriebenes isoliertes Polynukleotid enthält, und welcher ein Polypeptid mit den immunogenen Merkmalen eines Fimbrien-Proteins von B. bronchiseptica herstellen kann. Die Erfindung stellt ferner ein Vakzin zur Generierung einer immunologischen Reaktion gegen B. bronchiseptica-Infektion in dafür empfänglichen Tieren bereit, welches ein hierin beschriebenes Polypeptid oder einen hierin beschriebenen B. bronchiseptica-Stamm und einen inerten Träger umfasst.
Das Fimbrien-Protein und die daraus erhaltenen Polypeptide können eine Immunreaktion gegen B, bronchiseptica auslösen.
Kleine Antigene sind oft als Immunogen unbrauchbar. Deshalb können das Fimbrien-Protein oder die Polypeptide als Homopolymere (eine Vielzahl an identischen gekoppelten Fimbrien-Polypeptiden) oder Heteropolymere (ein oder mehrere Fimbrien-Polypeptide, die mit einem oder mehreren verschiedenen Fimbrien-Polypeptiden verbunden sind, oder mit einem oder mehreren verschiedenen Polypeptiden verbunden sind, welche charakteristisch für B. bronchiseptica's oder ein anderes Pathogen sind), oder mit einem oder mehreren anderen Bestandteilen zum Verbessern der Immunogenizität verbunden sein.
Gemäß der vorliegenden Erfindung können die Fimbrien-Polypepti de, mit jeglichen oben erwähnten Modifikationen, durch rekombinante DNA-Techniken oder können synthetisch hergestellt werden, beispielsweise durch homogene oder durch Festphasen-Polypeptid-Synthese.
Die besonderen Aminosäuresequenzen aus geeigneten Fimbrien-Polypeptiden können aus der Aminosäuresequenz gemäß der SEQUENZ ID Nr. 2, 4 oder 6 und wahlweise auch aus der räumlichen Konfiguration des Fimbrien-Proteins abgeleitet werden.
Eine Anzahl an Verfahren wurde entwickelt, um die Lage von für die Immunität wichtigen Epitopen auf Proteinen vorherzusagen. Das Ergebnis der kombinierten Prognosen bietet eine gute Vorhersage der antigenen Bereiche.
Geeignete Fimbrien-Polypeptide können aus den hydrophilsten Teilen des Fimbrien-Proteins ausgewählt werden, beispielsweise durch Anwendung der durch Hopp und Woods beschriebenen Technik (T.P. Hopp and K.R. Woods (1981): Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 78, 3824-3828). Ein weiteres geeignetes Verfahren zur Auswahl solcher Polypeptide wird von Chou und Fasman (P.Y. Chou und G.D. Fasman (1987), „Advances in Enzymology A7", 45-148) beschrieben.
Verschiedene zusätzliche Algorithmen können verwendet werden, um die wichtigen antigenen Bereiche des B. bronchiseptica-Fimbrien-Proteins schließlich vorherzusagen, wie beispielsweise eine Prognose der Flexibilität der Polypeptidkette (P.A. Karplus und G. E. Schultz, 1985, Naturwissenschaften 72, 212-213), einem Beta-Turn-Wahrscheinlichkeitsprofil des B. bronchiseptica-Fimbrien-Proteins gemäß P.Y. Chou und G.D. Fasman, 1979, (Biophys. J. 26, 367-385), den Wahrscheinlichkeitsprofilen in den 3 Konformationen für die Sequenz von B, bronchiseptica-Fimbrien-Proteinen gemäß Gascuel, O und J.L. Golmard, 1988 (CABIOS 4, 357-365), eine Vorhersage der Sekundär-Struktur der Sequenz des B. bronchiseptica-Fimbrien-Proteins gemäß J. Novotny und C. Auffray, 1984 (Nucleic Acids Research 12, 243-255).
Zusätzliche Informationen über die Lage von relevanten Epitopen können unter Verwendung des PEPSCAN-Verfahrens erhalten werden, welches von Geysen und Meloen entwickelt wurde (H.M. Geysen, R. H. Meloen und S.J. Barteling (1984): Proc. Natl. Acad. Sci., 81 (13); 3998-4002). Dieses Verfahren verwendet synthetische Peptide mit ausreichender Länge zum Reagieren in einem enzymverbundenen Immunosorbens-Test. Diese Peptide werden nach einer gegebenen DNA-Sequenz synthetisiert. Sie sind gekennzeichnet durch die Tatsache, dass das erste Peptid die Aminosäuren Nr. 1-9 abdeckt, das zweite Peptid die Aminosäuren Nr. 2-10 abdeckt, etc. Jedes Peptid wird auf seine Reaktivität mit Antiseren oder monoklonalen Antikörpern getestet. Reaktionsfähige Peptide müssen dann ein immunogenes Epitop darstellen.
Ferner können zur Identifizierung von immunoreaktiven Epitopen (und zur Korrelation dieser Reaktive mit der physischen Karte des Fimbrien-Proteins) DNA-Fragmente aus dem Fimbrien-Protein-Gen in geeigneten Plasmiden exprimiert werden, z.B. in pEX-Plasmiden (K. Stanley und J.P. Luzio, 1984, EMBO J. 3, 1429-1434, und J.G. Kusters, E.J. Jager und B.A.M. Van der Zeijst, 1989, Nucl. Acids Res., 17, 8007). In diesem System führt die heterologe Expression zu der Synthese einer C-terminalen Ausdehnung des cro-β-Galactosidase-Hybridproteins. Restriktions-Endonuklease-Schnittstellen in den Fimbrien-Protein-DNA-Sequenzen können verwendet werden, um Fragmente des Fimbrien-Protein-Gens zum Inserieren in die pEX-Plasmide zu erhalten. pEX-Klone, die Fusions-Proteine synthetisieren, welche aus unterschiedlichen überlappenden Bereichen des Fimbrien-Proteins erhalten werden, werden dann zur weiteren Charakterisierung verwendet. Die pEX-kodierten Fimbrien-Protein-Fragmente werden gereinigt, durch Polycrylamid-Gel-Elektrophorese fraktioniert und auf Nitrocellulosemembranen geblottet. Diese Membranen werden dann mit Serum von Schweinen oder Hunden zur Reaktion gebracht, die gegen B. bronchiseptica immun sind. Nur die Fragmente, welche die immunreaktiven Epitope enthalten, reagieren mit diesen Sera. Um die minimale Länge der Epitope beschreiben zu können, können die DNA-Inserts der reaktiven Klone durch progressive Exonuklease-III-Verdauung oder durch Klonieren von synthetischen Oligonukleotiden, die kleine überlappende Teile des Fimbrien-Proteins kodieren (J.G. Kusters, E.J. Jager, G. Koch, J.A. Lenstra, W.P.A. Posthumus, R.H. Meloen und B.A.M Van der Zeijst, 1989, J. Immunol., 143, 2692-2698), verkürzt werden. Die Epitope können dann auf ihre protektiven Wirkungen getestet werden.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Fimbrien-Protein-spezifisches Polypeptid durch Expression eines Polynukleotides mit wenigstens einem Teil des die Polynukleotid-SEQUENZ ID Nr. 1, 3 oder 5 bildenden Teils eines rekombinanten Polynukleotides erzeugt. Das rekombinante Polynukleotid basiert vorzugsweise auf einem Vektor mit einem darin inserierten B. bronchiseptica-spezifischen Polynukleotid-Fragment. Geeignete Vektoren sind Plasmide, Bakteriophagen, Cosmide, Viren, Minichromosome oder stabilintegrierende Vektoren; die Letzteren im Besonderen für Pflanzen- oder Tierzellen. Im Allgemeinen haben diese Vektoren die Eigenschaft zur selbständigen Reproduktion, mit Ausnahme der stabilintegrierenden Vektoren, welche sich selbst in das genetische Material der Wirtszelle inserieren und sich mit dem genetischen Material des Wirts replizieren. Geeignete Wirtszellen können entweder prokaryotisch oder eukaryotisch sein, wie beispielsweise Bakterien, Hefen, Mycoplasmen, Algen, Pflanzenzellen oder Tierzellen; die Pflanzenzellen oder Tierzellen können in vitro kultiviert werden oder Teil einer intakten Pflanze bzw. Tieres bilden. Das rekombinante Polynukleotid kann als ein Insert eine komplette Polynukleotidkodierung für das Fimbrien-Protein oder ein Fragment davon umfassen. Das Insert kann eine einzelne Kodierungssequenz oder mehrfache Kopien derselben Kodierungssequenz oder ein Hybridpolynu kleotid umfassen, enthaltend wenigstens eine Fimbrien-Protein-Kodierungssequenz und wenigstens eine zweite Sequenz, wie beispielsweise einen unterschiedlichen Teil der Fimbrien-Protein-Kodierungssequenz oder eine Polynukleotidkodierung für ein Proteinmerkmal eines anderen Pathogens oder für ein inertes Protein, welches als ein Träger für wenigstens ein kleines Fimbrien-Polypeptid agiert.
Ein spezifischer Fall der obigen Ausführungsform befasst sich mit rekombinanten Polynukleotiden mit Virusvektoren, welche direkt als sogenannte Vektorvakzine verwendbar sind. Die für diesen Zweck verwendbaren Viren sollten die Fähigkeit zur Replikation in den zu immunisierenden Tieren haben, d.h, in Hunden und/oder Schweinen. Diese Viren sollten ferner einen genomischen Bereich besitzen, der zum Inserieren eines fremden Gens (zum Beispiel Kodierung für das B. bronchiseptica-Fimbrien-Protein oder Polypeptid) geeignet ist, welches ebenso in dem geimpften Tier exprimiert werden soll. Geeignete Viren für diesen Zweck sind beispielsweise enterale Viren, wie beispielsweise bestimmte Adeno-Viren.
Wie oben angegeben, sind die Proteine und Polypeptide und die rekombinanten Polynukleotide gemäß der Erfindung, bei der Herstellung von Vakzinen nützlich. Daher bilden diese Vakzine ebenso einen Teil der Erfindung.
Eine besondere Anwendung der vorliegenden Erfindung befasst sich mit den bakteriellen Vektorvakzinen. Darin werden Bakterien, welche zur Kolonisierung von Hunden und/oder Schweinen befähigt sind, transformiert, um ihnen das Exprimieren eines Fimbrien-Proteins oder Fimbrien-Polypeptides auf solch eine Art und Weise zu ermöglichen, so dass es zu einer Immunreaktion gegen B. bronchiseptica kommt. Geeignete Bakterien für diesen Zweck sind beispielsweise Salmonella-Bakterien.
Ein Vakzin gemäß der Erfindung kann ferner zusätzliche Vakzinbestandteile umfassen, beispielsweise Träger, Puffer, Stabilisatoren, Lösungsvermittler, Hilfsmittel und Konservierungsmittel. Vorzugsweise sind diese Vakzine gefriergetrocknete Produkte, welche vor der Anwendung durch die Zugabe einer geeigneten Flüssigkeit (Wasser, Puffer) rekonstituiert werden.
Das Vakzin kann beispielsweise oral, intranasal oder intramuskulär eingebracht werden.
Das Vakzin kann zusätzlich andere Immunstoffe für die zu immunisierenden Tiere (Hunde und Schweine) enthalten, wie beispielsweise immunogene Materialmerkmale von Viren, wie beispielsweise Pseudorabies-Virus, Influenza-Virus, transmissiblen Gastroenteritis-Virus, Parvovirus, schweineendemischen Diarrhoe-Virus, Schweinecholeravirus, oder immunogene wesentliche Merkmale von Mycoplasma, wie beispielsweise Mycoplasma hyopneumoniae und Mycoplasma lyorhinis, oder immunogene wesentliche Merkmale von Bakterien, wie beispielsweise Escherichia coli, Leptospira, Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida, Streptococcussuis, Treponema hyodysenteriae.
Die Erfindung wird durch die folgenden Arbeitsbeispiele illustriert.
BEISPIEL 1
CHARAKTERISIERUNG DES FIMX-GENS
MATERIALIEN UND VERFAHREN
Bakterienstämme, Medien und Wachstumsbedingungen.
Alle verwendeten Bakterienstämme sind in Tabelle 1 aufgeführt.
TABELLE 1
Alle Bordetella-Stämme wurden auf Bordet-Gengou-Agar (Difco Laboratories, Detroit, MI) gezüchtet, supplementiert mit 1% Glycerol und 20% defibriniertem Schafsblut oder in Tryptose-Phosphat„Brühe" (TPB) (Difco Laboratories, Detroit, MI). Um die Expression von Virulenzgenen zu unterdrücken wurden die Medien mit 20 mmol/l MgSO₄ supplementiert. Der B. bronchiseptica-Stamm wird für DNA-Präparationen verwendet. Der Escherichia coli-Stamm PC2495 wurde für die Propagation des Vektors Bluescript (Stratagene) und seiner Derivate verwendet. Der Stamm PC2495 wurde auf Lureano-Bertoni-(LB)-Bouillon oder LB-Agar gezüchtet. Ampicillin (50-100 μg/ml, jeweils), 50 μg/ml 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-Galactopyranosid (X-gal) und 20 μg/ml Isopropyl-β-D-Thiogalactopyranosid (IPTG) wurden zur Identifizierung von Stämmen verwendet, welche ein Plasmid mit einem DNA-Insert enthalten. Alle bakteriellen Kulturen wurden bei 37°C für 16-24 Stunden gezüchtet.
Rekombinante DNA-verfahren
Chromosomale DNA wurde aus Bordetella-Stämmen isoliert, wie durch Maniatis et al. (T. Maniatis, E.F. Fritsch und J. Sambrook, 1982, „Molecular cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor, New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press) beschrieben. Nach der Verdauung wurde eine Elektrophorese der DNA in 1%-igen Agarosegelen in TAE-Puffer (40 mmol/l Tris-Acetat, 2 mmo1/l EDTA), enthaltend 1 μg/ml Ethidiumbromid, durchgeführt. Der Geneclean-Kit wurde zur Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarose-Gelen (Bio Inc. 101 Corp., La Jolla) verwendet. Das End-Labeling der Oligonukleotide wurde mit (γ^–32P)dATP unter Verwendung von T4-Polynukleotidkinase (Maniatis et al.) durchgeführt. Die Hybridisierung wurde in 5 × SSPE, 5 × Denhardt's Lösung, 0,1% SDS und 100 μg/ml Heringsamen-DNA bei 55°C durchgeführt. Die Blots wurden mit 5 × SSPE und 0,1% SDS bei 55°C gewaschen.
Southern-Blot-Analyse
Chromosomale DNA des B, bronchiseptica-Stammes 401 wurde gereinigt und mit mehreren Restriktions-Enzymen verdaut. Fragmente wurden durch Elektrophorese getrennt, an eine Nylonmembran transformiert und mit einer DNA-Sonde aus dem fimX-Fimbrien-Untereinheit-Gen von B. pertussis hybridisiert. Interessante DNA-Fragmente, welche aus Hybridisierungssignalen identifiziert wurden, wurden durch den Gene Clean Kit (Bio Inc. 101 Corp., La Jolla) isoliert. Nach der Ligation in einen Bluescript-Vektor (Stratagene) wurden die chromosomalen DNA-Fragmente in Escherichia coli-Stamm PC2495 gemäß dem CaCl₂-Verfahren (Dagert, M. und Ehrlich, S.D., 1979, „Prolonged incubation in calcium chloride improves the competence of Escherichia coli cells", Gen 6: 23-28) transformiert. Positive Kolonien wurden nach der Hybridisierung identifiziert.
Nukleotidsequenz-Ermittlung
Die Plasmide wurden gemäß dem Alkalin-Lyse-Verfahren (H.C. Birnboim und J.A. Doly, 1979, „A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA", Nucleic Acids Res. 7: 1513-1523) isoliert. Die Nukleotidsequenz des klonierten Inserts wurde durch das Dideoxy-Ketten-Terminationsverfahren (F. Sanger, S. Nicklen, A.R. Coulson, 1977, „DNA sequencing with chainterminating inhibitors", Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74: 5463-5467) unter Verwendung des T7 Polymerase-Sequenzierungs-Kits (Amersham) ermittelt. Analyse der DNA-Sequenzdaten wurde mit der PC/Gene-Software (Ausgabe 6.5, Genofit, Heidelberg S.A., Genf, Schweiz) durchgeführt.
Partielle Fimbrien-Reinigung
Der B. bronchiseptica-Stamm 401 wurde auf Tryptose-Phosphat-Agar (Difco Laboratories, Detroit, MI) gezüchtet. Die Bakterien wurden in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen. Das Bakterienpellet wurde in 15 ml phosphatgepufferter Salzlösung suspendiert, das mit 4 mol/l Ureum supplementiert wurde. Diese Suspension wurde bei 40°C für 30 min. angeordnet. Die Bakterien wurden von der Suspension durch Zentrifugieren mit 20 000 Umdrehungen pro Minute (Beckman, JA20 Rotor) über 10 min. entfernt. Die Fimbrien wurden aus dem Überstand nach dem Zentrifugieren bei 40 000 Umdrehungen pro Minute (Beckman Ultrazentrifuge, Ti60 Rotor) über 16 Stunden isoliert. Das Pellet wurde dann in 5 ml phosphatgepufferter Salzlösung suspendiert. Die Proteinkonzentration wurde mit dem Bicinchonin-Säure-(BCA)-Assay (Pierce Chemical Company, USA) ermittelt. Die Proteinanalyse wurde auf einem 15%-SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese-System durchgeführt.
ERGEBNISSE
Sequenzanalyse und Alignment
Ein BamHI-EcoRI-DNA-Fragment, welches aus dem fimX-Gen von B. Pertussis abstammt, wurde als eine Sonde zum Identifizieren von B. bronchiseptica-chromosomalen DNA-Fragmenten enthaltend fim-Gene verwendet. Ein 1,3kb PstI-DNA-Fragment aus B. bronchiseptica, welches an der fimX-Sonde hybridisiert wurde, wurde isoliert und sequenziert. Auf diesem Fragment wird das komplette fimX- Gen, umfassend Promotorsequenzen vor dem Gen, angeordnet (SEQUENZ ID Nr. 1).
E. coli PC 2495-Bakterien enthaltend das Plasmid p1VB 3-420, welches das komplette fimX-Gen umfasst, wurden bei dem Centraalbureau voor Schimmelcultures in Baarn, Niederlande, am 13. August 1992 unter der Hinterlegungsnummer CBS 364.92 hinterlegt.
Expression des fimX-Gens von B. bronchiseptica
Um das fimX-Produkt zu identifizieren, wurde ein Deletions-mutanter Stamm, der nicht zum Exprimieren des fimX-Gens fähig ist, hergestellt. Dieser mutante Stamm wurde durch Genersetzung hergestellt. Dabei wurde ein zentrales EcoRV-Fragment des B. bronchiseptica fimX-Gens durch ein Kanamycin-Gen ersetzt und in den Bluescript-Vektor kloniert. Dieses Konstrukt wurde für die Genersetzung in B. bronchiseptica (1) verwendet. Ein kanamycinresistenter mutanter Stamm wurde identifiziert. Der Stamm hybridisierte nicht mehr mit dem EcoRV-Fragment. Aus diesem mutanten Stamm wurden teilweise gereinigte Fimbrien hergestellt. Diese Reinigung von Fimbrien aus dem fimX-negativen Stamm zeigte bei Vergleich mit dem Wildtyp-Stamm deutlich, dass das fimX-Gen auf hohem Niveau in B. bronchiseptica (2) exprimiert wurde.
BEISPIEL 2
Charakterisierung des fim2- und fim3-Fimbrien-Untereinheit-Gens von Bordetella bronchiseptica
MATERIALIEN UND VERFAHREN
Bakterienstämme, Plasmide und Wachstumsbedingungen
Der verwendete Wildtyp-B. bronchiseptica-Stamm wurde aus Hunden isoliert, die an Zwingerhusten litten. Dieser Stamm wurde von Dr. J.M. Musser (Stamm Nr. 685) mit der Bezeichnung Nr. 401 erhalten. Dieser Stamm wurde in einer Tryptose-Phosphat-„Brühe" oder Agar (Difco Laboratories, Detroit, MI) gezüchtet. Der B. pertussis-Stamm Wellcome 28 (A. Robinson, L.A.E. Ashworth, A. Baskerville und L.I. Irons, 1085, "Proceedings of the 4th International Symposium on pertussis", Genf, 1984, Dev. Biol. Stand, 61:165-172) wurde auf Bordet-Gengou-Agar (Difco Laboratories, Detroit, MI) gezüchtet. Bei nicht-virulenten B. bronchiseptica wurde das Wachstumsmedium mit 20 mmol/l MgSO₄ supplementiert. E. coli K12 Stamm PC2495 wurde als Wirt für den Klonierungsvektor pBluescript verwendet. Der E. coli-Stamm wurde auf LB-Agar oder LB-Bouillon gezüchtet, der mit 100 μg/ml Amp.; 50 μg/ml X-Gal und 20 μg/ml IPTG zur Identifizierung von rekombinanten Stämmen, enthaltend ein kloniertes DNA-Fragment, supplementiert wurde. Alle bakteriellen Kulturen wurden bei 37°C für 16-48 Stunden gezüchtet.
DNA-Analyse und Nukleotidsequenzermittlung
Isolierung der chromosomalen DNA wurde gemäß Maniatis et al. durchgeführt. Plasmidisolierung wurde unter Verwendung des Verfahrens von Birnboim und Doly durchgeführt. Die chromosomalen DNA-Fragmente wurden aus TAE (40 mmol/l Tris-Acetat, 2 mmol/l EDTA) Agarosegelen unter Verwendung des Gene Clean Kit (Bio Inc. 101 Corp., La Jolla) isoliert. DNA-Fragmente wurden in pBluescript KS M13+ und M13- (Stratagene, La Jolla, CA) für alle Klonierungszwecke ligiert. Die Nukleotidsequenzermittlung wurde mit dem T7 Polymerase-Sequenzierungskit (Amersham) durch das Dideoxy-Ketten-Terminationsverfahren von Sanger et al. durchgeführt. Die PC/Gen Berechnungssoftware (Ausgabe 6,5, Genofit, Heidelberg S.A., Genf, Schweiz) wurde zum Analysieren von DNA-Sequenzdaten verwendet. Restriktionsenzyme und T4 DNA-Ligase wurden von Pharmacia gekauft und gemäß den Herstelleranweisungen verwendet. Plasmide wurden zu dem E. coli-Stamm PC2495 unter Verwendung des CaCl₂-Verfahrens von Dagert und Ehrlich trans formiert.
Southern Blotting
Southern Blotting wurde gemäß Maniatis et al. durchgeführt.
SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese und immunologische Techniken.
Für die SDS-PAGE- und Western Blot-Analyse wurden gleiche Mengen an Bakterien verwendet. Die Bakterien wurden in einem phosphatgepufferten Salzlösungs-(PBS)-Puffer geerntet und auf OD₆₀₀ = 1,0 verdünnt. Aus dieser Suspension wurden 50 μl in einem 20 μl Laemmli-Puffer gelöst und auf 15 % Polyacrylamidgelen, wie von Laemmli (Laemmli, U.K, 1970, „Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4", Nature 227: 680-685) beschrieben, elektrophoretisiert. Der Transfer der Proteine auf Nitrocellulose wurde im Wesentlichen wie von van Embden et al. (J. D. A. van Embden, H.J. van der Donk, H.J. von Eijk, H.G. van der Heide, J.A. de Jong, M.F. van Olderen, A.D. Osterhaus, L.M. Schouls, 1983, „Molecular cloning and expression of Treponema pallidum DNA in Escherichia coli K12", Infect. Immun. 42:187-196) beschrieben, durchgeführt. Polyklonale Antikörper, welche gegen SDS-denaturierte Fimbrien-Untereinheit-Proteine der Serotypen 2 oder 3 aus B. pertussis gezüchtet wurden, wurden zum Nachweis von B. bronchiseptica-Fimbrien-Untereinheit-Proteinen verwendet.
Fim2- und fim3-spezifische monoklonale Antikörper, welche gegen B. pertussis gezüchtet wurden, wurden in einem ELISA auf Mikrotiterplatten mit flachem Boden, welche mit ganzen Bakterien (OD₆₀₀ = 0,1, 1:10 verdünnt in 15 mmol/l Na₂CO₃, 35 mmol/l NaCO₃, pH 9,6 ) beschichtet waren, verdünnt. Gebundenes Ziegen-anti-Maus-IgG-peroxidase-Konjugat (Nordic) wurde mit 2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzthialzolin-6-sulfonsäure (ABTS) (Sigma) bestimmt. Die Ab sorption wurde bei 405 nm gemessen.
Elektronenmikroskopie
Für die Elektronenmikroskopie wurde eine B. bronchiseptica-Kultur in PBS-Puffer verdünnt. Pilioform-beschichtete Kupferraster wurden auf 50 μl bakterieller Suspension für 5 Minuten angeordnet. Die Raster wurden zweimal in H₂O gewaschen. Das Färben wurde für 2 Minuten in 1% TPA („Tungstophosphoric acid"; Wolframphosphorische Säure, Merck) durchgeführt. Die Raster wurden unter einem Philips EM 201 Elektronenmikroskop untersucht.
ERGEBNISSE
Nukleotidsequenz der fim2 und fim3 Fimbrien-Untereinheit-Genen
Die B. bronchiseptica fim2 und fim3 Untereinheit-Gene konnten auf der Basis ihrer Homologie mit den B. pertussis fim2- beziehungsweise fim3-Genen identifiziert werden. Ein AccI-PstI-DNA-Fragment mit 1000 bp wurde als eine Sonde für das fim2-Gen (I. Livey, C.J. Duggleby und A. Robinson, 1987, „Cloning and nucleotide sequence analysis of the serotype 2 fimbrial subunit gene of Bordetella pertussis", Mol. Microb. 1:203-209) verwendet. Ein Sall-DNA-Fragment mit 900 bp wurde als eine Sonde für das fim3-Gen (Mooi, F.R., A. ter Avest und H.G.J. van der Heide, 1990, „Structure of the Bordetella pertussis gene coding for the serotype 3 fimbrial subunit", FEMS Microb. Lett, 66:327-332) verwendet. Die Hybridisierung von chromosomaler DNA aus B. bronchiseptica, verdaut mit der Restriktionsendonuklease PstI ergab wegen der Homologie zwischen den zwei Sonden mehrere positive Signale bei beiden Sonden. Zwei Bereiche der DNA-Fragmente wurden aus B. bronchiseptica chromosomaler DNA isoliert, wobei sich das stärkste Signal entweder mit der fim2- oder der fim3-Sonde zeigte. Diese PstI-DNA-Fragmente von etwa 2,3 kb beziehungsweise 2,8 kb wurden in den Bluescript-Vektor kloniert. Nach der Transformati on und dem „Colony-Lifting" wurden zwei Klone durch Hybridisierung mit einer der fim-Sonden identifiziert. Ein Klon mit einem Insert von 2,3 kb kodierte für das fim2-(p1VB3-402) Gen. Der andere Klon mit einem Insert von 2,8 kb kodierte für das fim3-(p1VB3-430) Gen von B. bronchiseptica. Die Nukleotidsequenz beider Gene wurde ermittelt und als SEQUENZ ID Nr. 3 (fim2) beziehungsweise SEQUENZ ID Nr. 5 (fim3) dargestellt. Die E. coli-Bakterien PC 2495 (p1VB3-402) und PC 2495 (p1VB3-430) wurden bei dem Centraalbureau voor Schimmelcultures in Baarn, Niederlande, am 13. August 1992 unter den Nummern CBS 362.92 beziehungsweise CBS 361.92 hinterlegt.
BEISPIEL 3
Konstruktion von zwei Bordetella bronchiseptica-Stämmen, welche bei der Herstellung von einem Typ von Fimbrien defizient sind.
Bordetella bronchiseptica-Stämme, welche bei der Herstellung von FimX-Fimbrien (BbfX^–) oder Fim2-Fimbrien (Bbf2^–) defizient sind, wurden hergestellt. Dies wurde durch Genaustausch mit den unterbrochenen Genen nach der homologen Rekombination erreicht. Die unterbrochenen Gene wurden durch Elektroporation in B. bronchiseptica transformiert. Die Unterbrechung in den Fimbrien-Untereinheit-Genen wurde durch Deletion eines EcoRV-Fragments in den Wildtyp-Genen mit einem Kanamycin-Resistenz-Gen erzeugt.
MATERIALIEN UND VERFAHREN
Bakterienstämme, Plasmide und Wachstumsbedingungen
Der Wildtyp-Stamm B. bronchiseptica Nr. 401 wurde in allen Experimenten verwendet. Das Bakterium wurde von Dr. J.M. Musser (Stamm Nr. 685) erhalten. Dieser Stamm wurde auf Tryptose-Phosphat-Agar (TPA) (Difco Laboratories) oder auf Bordet-Gengou (BG)-Agar (Difco Laboratories), welches mit 15% frischen Schaf erythrozyten supplementiert ist, bei 37°C für 24-48 Stunden gezüchtet. Für Klonierungszwecke wurde Escherichia coli K12-Stamm PC2495 mit dem Bluescript KS und SK Plasmid (Stratagene) verwendet. E. coli PC2495 wurde auf Luria-Bertoni-Agar mit den geeigneten Antibiotika über 16 Stunden bei 37°C gezüchtet. Für Ampicillin und/oder Kanamycin wurde eine Konzentration von 100 μg/ml verwendet.
Rekombinante DNA-Techniken
Klonierungsverfahren wurden wie von Maniatis et al. beschrieben, verwendet. Jedes Fimbrien-Untereinheit-Gen, umfassend benachbarte Sequenzen, wurde in dem Bluescript-Vektor kloniert. Diese Vektoren wurden durch das Alkali-Extraktionsverfahren von Birnboim und Doly isoliert. Ein DNA-Fragment innerhalb eines Untereinheit-Gens wurde durch ein Kanamycin-Resistenz-Gen ersetzt (A. Labigne-Roussel, J. Harel und L. Tompkins, 1987, „Gene transfer from Escherichia coli to Campylobacter species: Development of shuttle vectors for genetic analysis of Campylobacter jejuni", J. Bacteriol, 169:5320-5323). Dieses letztere Konstrukt wurde in Elektroporations-Experimenten verwendet.
Elektroporationsexperimente
Die Elektroporation wurde im Wesentlichen wie von Miller et al. beschrieben (J. F. Miller, W.J. Dower und L.S. Tompkins, 1988, „High-voltage electroporation of bacteria: Genetic transformation of Campylobacter jejuni with plasmid DNA", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:856-860) durchgeführt. Der B. bronchiseptica Wildtyp-Stamm 401 wurde auf BG-Agar über 16 Stunden gezüchtet. Die Zellen wurden in 1 ml einer 15% Glycerol-272 mmol/l Sucroselösung (GlySuc) (0°C) geerntet, gewaschen und in 40 μl GlySuc resuspendiert. Aus dieser Suspension wurden Aliquots zu 50 μl bei –80°C eingefroren. Diese Aliquots wurden in den Elektroporationsexperimenten zur Transformation von B. bronchiseptica mit 1–3 μg DNA, gelöst in aqua dest., verwendet. Die verwendeten Elektroporationsbedingungen waren wie folgt: 0,7 kV, 25 μF und 600Ω (Biorad Gene Pulsen unter Verwendung von Küvetten mit 0,56 mm Abstand von Biotechnologies and Experimental Research Inc., San Diego, CA). Die gemessenen Zeitkonstanten lagen zwischen 3,5-7 Millisekunden. Die Zellen wurden in 1 ml Tryptose-Phosphat-"Brühe" (Difco Laboratories) über 90 Minuten bei 37°C wiederhergestellt und auf TPA (Difco Laboratories) enthaltend 100 μg/ml Kanamycin, angeordnet. Das Screening der rekombinanten Stämme wurde durch Southern-Blotting auf chromosomalen DNA-Präparationen durchgeführt.
Chromosomale DNA-Reinigung und Southern-Blot-Analyse
Chromosomale DNA wurde nach Maniatis et al. gereinigt. Die Southern-Blot-Analyse wurde wie vorher beschrieben durchgeführt.
Bei den Hybridisierungsexperimenten verwendete DNA-Sonden
Für die Hybridisierungsexperimente, welche das fimX-Gen betreffen, wurden zwei Sonden mit den Bezeichnungen fXEv und f3SE verwendet. Ein 450bp-DNA-Fragment, welches als Sonde fXEv verwendet wurde, wurde aus der Verdauung von p1VB3-426 mit der Restriktionsendonuklease EcoRV (3) isoliert. Das 580 bp-DNA-Fragment von Sonde f3SE wurde nach der Verdauung von p1VB3-430 mit den Restriktionsendonukleasen SphI und EcoRI (4) erhalten. Für die Hybridisierungsexperimente, welche das fim2-Gen betreffen, wurden drei Sonden mit den Bezeichnungen f2Ev, kana und f2PE (5) verwendet. Die Sonde f2EV war ein aus p1VB3-417 isoliertes 900 bp EcoRV-DNA-Fragment. Die Sonde kana war ein 900 bp-EcoRV-DNA-Fragment innerhalb des Kanamycin-Gens und die Sonde f2PE war ein 610bp-PstI-EcoRV-DNA-Fragment aus p1VB3-417.
ERGEBNISSE
Zwei Plasmide mit DNA-Fragmenten, welche entweder das fimX- oder das fim2-Fimbrien-Untereinheit-Gen enthielten, wurden zur Transformation der B. bronchiseptica-Wildtyp-Bakterien durch Elektroporation verwendet. Die Gene beider Untereinheiten wurden durch Ersetzung eines EcoRV-DNA-Fragments mit einem Kanamycin-Resistenz-Gen unterbrochen. Bevor dies möglich war, musste eine dritte EcoRV-Schnittstelle, welche in dem Polylinker des Bluescriptvektors vorhanden war, entfernt werden. Dies wurde durch Subklonierung der DNA-Fragmente in einen EcoRV-Bluescript-Vektor erreicht, was zu p1VB3-426 für fimX und p1VB3-417 für fim2 (3, 5) führte. Beide Klone wurden dann mit der Restriktionsendonuklease EcoRV verdaut. Bei dieser Verdauung wurde ein Fragment mit 450 by aus dem fimX-Genklon (p1VB3-426) umfassend die 5'-Promotorsequenzen (3) entfernt. Nachdem das EcoRV-Fragment entfernt wurde, wurde der Vektor mit den übrigen DNA-Sequenzen isoliert und ein 1,4 kb SmaI-HincII-DNA-Fragment umfassend ein Kanamycin-Resistenz-Gen wurde in die EcoRV-Schnittstellen kloniert. Die Transformation zu E. coli PC2495, gefolgt von der Plasmidisolierung brachte den Klon p1VB3-427 (3) hervor. Dieselbe Strategie wurde für das fim2-Fimbrien-Untereinheit-Gen verwendet. Die Verdauung des Klons p1VB3-417 mit der Restriktionsendonuklease EcoRV (5) entfernte ein 900 pb DNA-Fragment in Richtung des 3'-Teils des Gens zusammen mit benachbarten Sequenzen. Die Ligation des Kanamycin-Resistenz-Gens in diesem Konstrukt brachte den Klon p1VB3-418 (5) hervor.
Beide Plasmide (p1VB3-427 und p1VB3-418) wurden isoliert und getrennt in den Elektroporationsexperimenten verwendet, um B. bronchiseptica zu transformieren. Nach jedem Elektroporationsexperiment waren bis zu 10² kanamycinresistente B. bronchiseptica-Kolonien zu beobachten. Nach der Elektroporation mit Plasmid p1VB3-427 (partiell fimX-Fimbrien-Untereinheit-Gen) wurden 4 Kolonien (fX I–IV) analysiert. Nach der Elektroporation mit Plas mid p1VB3-418 (partiell fim2-Fimbrien-Untereinheit-Gen) wurden 7 Kolonien analysiert (f2 V–VII). Die chromosomale DNA wurde aus diesen kanamycinresistenten B. bronchiseptica-Stämmen isoliert und mit der PstI- beziehungsweise EcoRV-Restriktionsendonuklease verdaut. Eine Southern-Hybridisierung wurde mit der verdauten chromosomalen DNA durchgeführt, welche aus den kanamycinresistenten Stämmen und dem Wildtyp-B. bronchiseptica-Stamm isoliert wurde. Die verdaute chromosomale DNA aus den 4 nach der Elektroporation mit p1VB3-427 isolierten Stämmen wurde mit den Sonden fXEv beziehungsweise f3SE (3, 4) hybridisiert. Die verdaute chromosomale DNA aus den 7 nach der Elektroporation mit Plasmid p1VB3-418 isolierten Stämmen wurde mit den Sonden f2Ev, kan beziehungsweise f2SE (5) hybridisiert. Aus den Hybridisierungsmustern mit den Sonden fXEv und f2Ev wurde offensichtlich, dass rekombinante Stämme, bei denen entweder ein Teil des fimX- (6A, 6B) oder des fim2- (7A, 7B) Fimbrien-Untereinheit-Gens fehlte, isoliert wurden. Aus den Hybridisierungsexperimenten mit dem Kanamycingen als eine Sonde war ersichtlich, dass in dem fim2-Gen alle isolierten Stämme (f2 I–VII) das Kanamycingen (7C) enthielten.
Da das Kanamycingen in allen fim2-rekombinanten Stämmen vorhanden war, könnte eine Genersetzung innerhalb eines der anderen Fimbrien-Untereinheit-Gene bedingt durch die Homologien unter den Untereinheit-Genen stattgefunden haben. Um festzustellen, ob dies der Fall war, wurden Hybridisierungsexperimente mit niedriger Stringenz durchgeführt, wobei eine Kreuzhybridisierung zu erkennen war, wobei Sonden verwendet wurden, die aus den anderen Untereinheit-Genen stammten. Hybridisierungsexperimente auf den fimX-kanamycinresistenten B. bronchiseptica-Stämmen (fX I–IV) mit der f3SE-Sonde (fim3-Untereinheit-Gen) zeigten, dass sich eine Genersetzung in dem Fimbrien-Untereinheit-Gen nur innerhalb des Stammes BbFX^– ereignete. In diesem Stamm, als auch in den anderen rekombinanten Stämmen (fX II–IV), waren Hybridisierungssignale mit DNA-Fragmenten, enthaltend die fim3- und fim2-Gene, vorhanden (6C). Da diese letzteren Signale dieselben waren wie in der Wildtyp-B. bronchiseptica, hat sich keine Rekombination in einem der anderen Untereinheit-Gene ereignet (6C). Die Hybridisierung der fim2-mutanten Stämme mit der f2PE-Sonde zeigte, dass sich nur innerhalb des Stammes BbF2^– (7D) in dem fim2-Gen eine Genersetzung ereignet hat. Durch die Verwendung dieser Sonde sind Hybridisierungssignale in allen drei Untereinheit-Genen ersichtlich. Da das PstI-EcoRV-Fragment (Sonde f2PE) innerhalb des p1VB3-418 vorhanden ist, welches in der Elektroporation verwendet wird, ist ein viertes Hybridisierungssignal in den rekombinanten Stämmen (f2 II–VII) ersichtlich. Dies weist darauf hin, dass das Plasmid p1VB3-418 noch immer in den kanamycinresistenten Stämmen vorhanden sein könnte. Wahrscheinlich hat sich an einer anderen Stelle im Chromosom, an einer nicht identifizierten Stelle außerhalb eines Fimbrien-Untereinheit-Gens, eine Ersetzung ereignet.
BEISPIEL 4
IMPFUNGS-INFIZIERUNGSEXPERIMENT MIT BORDETELLA BRONCHISEPTICA-MUTANTEN BBFX^– UND BBF2^– IN EINER MAUS
MATERIALIEN UND VERFAHREN
Drei Gruppen mit jeweils 80 Mäusen (6 Wochen alte weibliche BALB/C-Mäuse) wurden intranasal mit Wildtyp B. bronchiseptica-BbfX^– beziehungsweise -Bbf2^– infiziert (die letzteren zwei wurden gemäß BEISPIEL 2 hergestellt) (2 × 10e7 cfu jeweils). Die Anzahl der lebenden Bakterien in dem Respirationstrakt von 8 Mäusen wurde in spezifizierten Zeitintervallen (0, 1, 3, 7, 11 und 36 Tagen) ermittelt. Bei jeder Maus wurde Nasopharynx, Nase, Trachea und Lungen auf Anwesenheit von lebendem B. bronchiseptica untersucht. Die Mäuse wurden etwa 1 Stunde nach der Infektion (bezeichnet als Tag 0) und mehrere Tage danach mittels einer Barbituratinjektion getötet. Die Lungen und Trachea wurden ent fernt und in PBS mit einer Gewebemühle (tissue grinder) homogenisiert. Ein Nasenabstrich wurde mit Catgut genommen. Das Catgut wurde in 0,5 ml PBS angeordnet und für 5 min. verwirbelt. Das Nasopharynx wurde mit PBS gespült, bis 5 Tröpfchen (etwa 0,5 ml) gesammelt waren. Lösungen aus allen Homogenaten und die Tröpfchen des Nasopharynx wurden auf Tryptose-Phosphat-Agar angeordnet und nach 2 Tagen der Inkubation wurde die CFU gezählt.
52 Tage nach der Impfung wurden die Gruppen mit BbfX^– oder Bbf2^– geimpft und eine ungeimpfte Kontrollgruppe wurde mit einem virulenten B. bronchiseptica-Stamm infiziert. Die Kolonisierung des Respirationstraktes wurde an Tag 0, 1, 4 und 14 nach der Infizierung gemessen.
ERGEBNISSE
Die Ergebnisse aus der Kolonisierung des oberen Respirationstraktes beider mutanter Stämme mit dem Wildtyp-Stamm werden verglichen. Es gibt bei Vergleich mit dem Wildtyp-Stamm keinen Unterschied der Kolonisierung der verschiedenen Organe des oberen Respirationstraktes nach der Infizierung mit dem BbfX^– oder Bbf2^– mutanten Stamm.
An Tag 36 wurden Mäuse der BbfX^–- und Bbf2^–- Gruppen auf Anwesenheit von Bordetella gescreent. Lungen und Trachea waren frei von Bordetella, wohingegen noch geringe Mengen von Bordetella in Nase und Nasopharynx vorhanden waren.
An Tag 52 nach der Impfung wurden die Mäuse mit BbfX^–und Bbf2^–Mutanten geimpft und eine Kontrollgruppe wurde mit einem virulenten B. bronchiseptica-Stamm infiziert. Die Kolonisierung des Nasopharynx mit dem virulenten B. bronchiseptica-Stamm konnte in beiden geimpften Gruppen nicht verhindert werden.
Lungen- und Tracheakolonisierung des Wildtyp-Stammes in den ge impften Gruppen konnte nur eine Stunde nach Infizierung nachgewiesen werden, wohingegen die Kontrollgruppe ernstlich kolonisiert war.
Die Kolonisierung der Nase der mit dem mutanten Stamm geimpften Mäuse konnte nur an Tag 0 und bei einigen Mäusen an Tag 1 ermittelt werden, wohingegen die Nase der Mäuse der Kontrollgruppe stark kolonisiert war.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Polypeptid mit den immunogenen Merkmalen eines Fimbrien-Proteins von B. bronchiseptica und mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQUENZ ID Nr. 4 oder SEQUENZ ID Nr. 6.
Isoliertes Polynukleotid, welches ein wie in Anspruch 1 beanspruchtes Polypeptid exprimieren kann und mit einer Nukleotidsequenz entsprechend SEQUENZ ID Nr. 3, SEQUENZ ID Nr. 5 oder einer Sequenz, die infolge des genetischen Codes zur SEQUENZ ID Nr. 3 oder SEQUENZ ID Nr. 5 degeneriert ist.
Isoliertes Polynukleotid gemäß Anspruch 2, welches ein Polypeptid mit den immunogenen Merkmalen eines Fimbrien-Proteins von B. bronchiseptica exprimieren kann, welches weiters einen geeigneten, mit diesem funktionell verbundenen Vektor aufweist.
Vakzin zur Erzeugung einer immunologischen Reaktion auf eine B. bronchiseptica-Infektion in dafür empfänglichen Tieren, umfassend ein Polypeptid nach Anspruch 1 und einen inerten Träger.
B. bronchiseptica-Stamm, welcher ein isoliertes Polynukleotid nach Anspruch 3 enthält und welcher ein Polypeptid mit den immunogenen Merkmalen eines Fimbrien-Proteins von B. bronchiseptica erzeugen kann.
Vakzin zur Erzeugung einer immunologischen Reaktion auf eine B. bronchiseptica-Infektion in dafür empfänglichen Tieren, welches einen B. bronchiseptica-Stamm nach Anspruch 5 und einen inerten Träger umfasst.