NO319988B1 - Polypeptid omfattende et fimbralt protein fra Bordetella Bronchiseptica, polynukleotid og ekspresjonsvektor som koder for et slikt protein, samt en vaksine eller farmasoytisk preparat for a bekjempe B. Bronchiseptica infeksjoner. - Google Patents
Polypeptid omfattende et fimbralt protein fra Bordetella Bronchiseptica, polynukleotid og ekspresjonsvektor som koder for et slikt protein, samt en vaksine eller farmasoytisk preparat for a bekjempe B. Bronchiseptica infeksjoner. Download PDFInfo
- Publication number
- NO319988B1 NO319988B1 NO19950582A NO950582A NO319988B1 NO 319988 B1 NO319988 B1 NO 319988B1 NO 19950582 A NO19950582 A NO 19950582A NO 950582 A NO950582 A NO 950582A NO 319988 B1 NO319988 B1 NO 319988B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- bronchiseptica
- protein
- gene
- fimbrial
- dna
- Prior art date
Links
- 241000588779 Bordetella bronchiseptica Species 0.000 title claims abstract description 67
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 39
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 36
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 33
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 title claims abstract description 19
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 title claims abstract description 19
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 title claims abstract description 19
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 title claims abstract description 17
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 15
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 title claims description 6
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 title claims description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title abstract description 85
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title abstract description 21
- 101710177917 Fimbrial protein Proteins 0.000 claims abstract description 24
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 41
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 7
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 2
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 abstract description 11
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 abstract description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 3
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 32
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 24
- 238000000034 method Methods 0.000 description 22
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 20
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 18
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 18
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 17
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 17
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical group O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 17
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 17
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 15
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 14
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 14
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 14
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 13
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 13
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 11
- 241000588807 Bordetella Species 0.000 description 10
- 241000588832 Bordetella pertussis Species 0.000 description 10
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 10
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 10
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 10
- 101150033489 fimX gene Proteins 0.000 description 9
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 9
- 101710154643 Filamentous hemagglutinin Proteins 0.000 description 8
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 8
- UTPGRZGMQVAYAA-UHFFFAOYSA-N 4-fluoro-n-methyl-n-[4-[6-(methylamino)pyrimidin-4-yl]-1,3-thiazol-2-yl]benzamide Chemical compound C1=NC(NC)=CC(C=2N=C(SC=2)N(C)C(=O)C=2C=CC(F)=CC=2)=N1 UTPGRZGMQVAYAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 7
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 7
- 101100120321 Bordetella pertussis (strain Tohama I / ATCC BAA-589 / NCTC 13251) fimX gene Proteins 0.000 description 6
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 6
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 6
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 6
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 5
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 5
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 5
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 5
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- 241000588851 Bordetella avium Species 0.000 description 4
- 101100446841 Bordetella pertussis (strain Tohama I / ATCC BAA-589 / NCTC 13251) fim2 gene Proteins 0.000 description 4
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 4
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 210000001989 nasopharynx Anatomy 0.000 description 4
- 210000001331 nose Anatomy 0.000 description 4
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 4
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 4
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 4
- 210000003437 trachea Anatomy 0.000 description 4
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 3
- 241000588780 Bordetella parapertussis Species 0.000 description 3
- 206010011224 Cough Diseases 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 description 3
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 3
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 3
- 239000000304 virulence factor Substances 0.000 description 3
- 230000007923 virulence factor Effects 0.000 description 3
- 239000001987 Bordet-Gengou agar Substances 0.000 description 2
- 208000018150 Bordetella infection Diseases 0.000 description 2
- 241000589875 Campylobacter jejuni Species 0.000 description 2
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 240000000220 Panda oleosa Species 0.000 description 2
- 235000016496 Panda oleosa Nutrition 0.000 description 2
- 241000606856 Pasteurella multocida Species 0.000 description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 2
- 201000005702 Pertussis Diseases 0.000 description 2
- 108010081690 Pertussis Toxin Proteins 0.000 description 2
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 2
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 208000037065 Subacute sclerosing leukoencephalitis Diseases 0.000 description 2
- 206010042297 Subacute sclerosing panencephalitis Diseases 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- AFYNADDZULBEJA-UHFFFAOYSA-N bicinchoninic acid Chemical compound C1=CC=CC2=NC(C=3C=C(C4=CC=CC=C4N=3)C(=O)O)=CC(C(O)=O)=C21 AFYNADDZULBEJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 210000004081 cilia Anatomy 0.000 description 2
- 210000000254 ciliated cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 2
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 2
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N tris acetate Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940126580 vector vaccine Drugs 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QGXCOCVWIKYPKW-UHFFFAOYSA-N 3-ethyl-2h-1,3-benzothiazole-6-sulfinic acid Chemical compound OS(=O)C1=CC=C2N(CC)CSC2=C1 QGXCOCVWIKYPKW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000008283 Atrophic Rhinitis Diseases 0.000 description 1
- 206010003694 Atrophy Diseases 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 101100446842 Bordetella pertussis (strain Tohama I / ATCC BAA-589 / NCTC 13251) fim3 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000589893 Brachyspira hyodysenteriae Species 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000589876 Campylobacter Species 0.000 description 1
- 241000282421 Canidae Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 241000710777 Classical swine fever virus Species 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 1
- 102000000634 Cytochrome c oxidase subunit IV Human genes 0.000 description 1
- 108050008072 Cytochrome c oxidase subunit IV Proteins 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 1
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 101710110818 Dermonecrotic toxin Proteins 0.000 description 1
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000701533 Escherichia virus T4 Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 206010018910 Haemolysis Diseases 0.000 description 1
- 241000424725 Heide Species 0.000 description 1
- 108010006464 Hemolysin Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000589902 Leptospira Species 0.000 description 1
- 241001430197 Mollicutes Species 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 1
- 241000125945 Protoparvovirus Species 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 206010039088 Rhinitis atrophic Diseases 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 101710157507 Serotype 2 fimbrial subunit Proteins 0.000 description 1
- 101710089230 Serotype 3 fimbrial subunit Proteins 0.000 description 1
- 241000194021 Streptococcus suis Species 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 241000701093 Suid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 239000008049 TAE buffer Substances 0.000 description 1
- 241000711484 Transmissible gastroenteritis virus Species 0.000 description 1
- 241000589884 Treponema pallidum Species 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010047700 Vomiting Diseases 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 102000030621 adenylate cyclase Human genes 0.000 description 1
- 108060000200 adenylate cyclase Proteins 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 230000037444 atrophy Effects 0.000 description 1
- OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N azane;(2e)-3-ethyl-2-[(e)-(3-ethyl-6-sulfo-1,3-benzothiazol-2-ylidene)hydrazinylidene]-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound [NH4+].[NH4+].S/1C2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N(CC)C\1=N/N=C1/SC2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N1CC OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N 0.000 description 1
- 229940125717 barbiturate Drugs 0.000 description 1
- HNYOPLTXPVRDBG-UHFFFAOYSA-N barbituric acid Chemical compound O=C1CC(=O)NC(=O)N1 HNYOPLTXPVRDBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 239000007465 bordet-gengou-medium Substances 0.000 description 1
- 210000000424 bronchial epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001680 brushing effect Effects 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000002729 catgut Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 108010052305 exodeoxyribonuclease III Proteins 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- -1 fimbriae Proteins 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000012252 genetic analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 210000003128 head Anatomy 0.000 description 1
- 239000003228 hemolysin Substances 0.000 description 1
- 230000008588 hemolysis Effects 0.000 description 1
- 229920000140 heteropolymer Polymers 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000009851 immunogenic response Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 238000012261 overproduction Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 229940051027 pasteurella multocida Drugs 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- AVFBYUADVDVJQL-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;trioxotungsten;hydrate Chemical compound O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.OP(O)(O)=O AVFBYUADVDVJQL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 229940124551 recombinant vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 206010039083 rhinitis Diseases 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 1
- 210000004894 snout Anatomy 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000017550 sodium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000001228 trophic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001944 turbinate Anatomy 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 239000002435 venom Substances 0.000 description 1
- 231100000611 venom Toxicity 0.000 description 1
- 210000001048 venom Anatomy 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- 230000008673 vomiting Effects 0.000 description 1
- 230000004584 weight gain Effects 0.000 description 1
- 235000019786 weight gain Nutrition 0.000 description 1
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/235—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bordetella (G)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Description
Foreliggende oppfinnelse angår et polypeptid omfattende et fimbrialt protein fra Bordetella bronchiseptica, polynukleotid og ekspresjonsvektor som koder for et slikt protein, samt en vaksine eller et farmasøytisk preparat for å bekjempe B. bronchi septicainfeksj oner.
Slekten Bordetella består av fire arter: Bordetella pertussis (B. pertissis), Bordetella parapertussis (B. parapertussis), Bordetella bronchiseptica (B. bronchiseptica) og Bordetella avium (B. avium). Bordetella er små gram-negative coccobacilli, obligate aerobe, ofte bipolart fargede og cyto-kromoksidase positive. Koloniene på Bordet-Gengou medium er omgitt av en sone med hemolyse unntatt B. avium.
Alle arter av Bordetella forårsaker meget lik sykdom med hensyn på adherens, proliferasjon, kliniske symptomer og histopatologi. Nyfødte mennesker og dyr er mottagelige for infeksjon med Bordetella. Her er sykdommen mest alvorlig og dødeligheten er høyest.
B. bronchiseptica er hovedsakelig et patogen hos laboratoriedyr, husdyr og ville dyr og av og til hos mennesker. Kaniner, marsvin, rotter, ikke-humane primater, hunder, svin, katter, hester og rever blir ofte infisert i epidemier. B. bronchiseptica forårsaker kennelhoste hos hunder og atropisk rhinitt hos griser. Hos hunder er den infeksiøse prosessen stort sett begrenset til trakeobronchial-treet og er karakterisert ved proliferering av trankealt epitel, etter adherens til flimmerhår. De mest alvorlige symptomene ved sykdommen er omfattende trankeal slim akkumulering, oppkast, lungelesjoner og vekttap. Hundene har en tørr, grov hakkende hoste. Infeksjon hos små griser med B. bronchiseptica er karakterisert ved turbinat atrofi, snutedeformeringer, lungebetennelse og redusert vektøkning. Til tross for at det er kjent at B. bronchiseptica var det ansvarlige middelet for trofisk rhinitt tyder mye nå på at Pasteurella multocida er det viktigste patogenet med B. bronchiseptica som sannsynligvis spiller en induserende eller opportunistisk rolle.
Rapporterte bærertilstander, uten kliniske tegn, er høye hos hunder, svin og kaniner.
Flere virulensfaktorer er blitt identifisert i Bordetellae. Disse innbefatter pertussis toksin, filamentøs hemagglutinin, fimbriae, adenylat cyklase, dermonekrotisk toksin, trankealt toksin og hemolysin. Disse virulensfaktorene blir ikke uttrykt i alle artene, for eksempel er genet kodende for pertussis toxin i B. pertussis til stede som et stille gen i kromosomet til B. parapertussis og B. bronchiseptica. Bortsett fra disse virulensfaktorene er det sannsynligvis flere, enda uidentifiserte, faktorer som involvert i patogenisiteten til bakteriene.
Bordetella infeksjoner begynner ved de cilierte cellene til Iuftveiskanalen. Bakteriell adherens er en forutsetning for initiering av infeksjon på grunn av at den børstede virk-ningen til flimmerhår fjerner bakteriene sammen med andre partikler fra luftrøret. Adherens av Bordetella til cilierte celler blir formidlet ved serologiske forskjellige fimbriae og filamentøs hemagglutinin (FHA) (FHA finnes derimot ikke i B. avium). Fimbriae er hårlignende strukturer bestående av identiske subenhet proteiner som rager ut fra den bakterielle celleoverflaten. FHA er et overflateassosiert protein, også utskilt i det ekstracellulære miljøet og som kan agglutinere forskjellige erytrocytter. Både fimbrial- og FHA-ekspresjonen er regulert av bvg-lokuset til tross for at ekspresjonen av fimbrialsubenhetgenene i B. pertussis, også er innvirket av lengden på et område med 13-15 cysteinresidier foran fimbrial-subenhetgenene. Alle virulente Bordetellae uttrykker adherens faktorer på deres overflater, mens ikke-virulente stammer ikke gjør dette. På grunn av at disse adhesinene er vesentlige for initiering av sykdommen er disse attraktive vaksine komponenter.
F.R. Mooi et al., Microbial Pathogenesis, vol. 2, 1987, s. 473-484, S.W. Lee et al., Infection and Immunity, vol. 51,1986, s. 586-593 og EP 141671 beskriver nært beslektet teknikk, dvs. de omhandler Bordetella infeksjoner og bekjempelse av slike infeksjoner. Imidlertid beskrives ikke de nye polypeptidene og subenhetgenene som beskrives ifølge foreliggende oppfinnelse og utnyttelse av disse bestemte polypeptider og subenhetgener for å bekjempe B. Brochisepticainfeksjoner.
Hensikten ifølge foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe en rekombinant-DNA vaksine mot B. bronchisepticainfeksjon.
Forskning har fokusert på adhesjonsfaktorene på grunn av at forhindring av adhesjon, som et resultat av en immun-respons rettet mot adhesjonsfaktorene, vil forhindre en infeksjon. IB. bronchiseptica er flere serologiske fimbriae og FHA ansvarlige for adherering av bakterien til cilierte luftrørepitelceller. Når verten har en immunrespons mot adhesjonsfaktorene til den mikrobielle organismen vil ingen kolonisering være mulig. Bakteriene vil bli drept før noen toksiner blir produsert og ingen kliniske symptomer vil bli utviklet.
En vaksine ifølge oppfinnelsen som forhindrer kolonisering av B. bronchiseptica inneholder fortrinnsvis så mye som mulig av komponentene som er nødvendige for adherering. En rekombinat vaksine kan bli konstruert som en subenhetvaksine. Det er derimot ikke kjent hvor mange serologiske forskjellige fimbriaer som blir produsert og hvilket bidrag i adhereringen hver faktor (fimbriae og FHA) har. For vaksineutvikling er det nødvendig å undersøke bidraget til adherering fra alle komponentene separat. Proteinene av interesse kan bli anvendt som en subenhetvaksine etter overproduksjon i en egnet mikrobiell organisme.
Ifølge foreliggende oppfinnelse blir to forskjellige subenhetgener kodende for adherens faktorene til B. bronchiseptica isolert og karakterisert.
Foreliggende oppfinnelse vedrører derfor et polypeptid, kjennetegnet ved at det omfatter et fimbrialt protein fra B. bronchiseptica med aminosyresekvensene representert ved seq. id no. 4 og 6, funksjonelle fragmenter derav og sekvenser inneholdende konservative substitusjoner av disse.
Foreliggende oppfinnelse vedrører videre et polynukleotid, kjennetegnet ved at det blir valgt fra nukleotidsekvensene representert ved seq id no. 3 eller 5, og koder for et polypeptid ifølge oppfinnelsen.
Foreliggende oppfinnelse vedrører også en ekspresjonsvektor, kjennetegnet ved at den omfatter polynukleotidsekvensen ifølge oppfinnelsen.
Foreliggende oppfinnelse vedrører videre en vaksine for å bekjempe B. bronchisepticainfeksjon, kjennetegnet ved at den inneholder en effektiv mengde av et polypeptid eller en ekspresjonsvektor ifølge oppfinnelsen.
Foreliggende oppfinnelse vedrører videre anvendelse av et polypeptid for fremstilling av et farmasøytisk preparat for å bekjempe B. bronchisepticainfeksjoner.
Fimbrial protein og polypeptider avledet derfra kan utløse en immunrespons mot B. bronchiseptica.
Små antigener er ofte unyttige som immunogener. Fimbrial proteinet eller polypeptidene kan derfor bli dannet som homopolymerer (en mengde sammenboblete identiske fimbriale polypeptider) eller heteropolymerer (en eller flere fimbrial polypeptider koblet til en eller flere forskjellige fimbriale polypeptider, eller koblet til en eller flere forskjellige polypeptider som er karakteristisk med B. bronchiseptica eller et annet patogen), eller kan bli koblet til en eller flere andre forbindelser for å forsterke immunogenisiteten.
Fimbrialpolypeptidet ifølge foreliggende oppfinnelse kan bli dannet ved rekombinante DNA-teknikker eller syntetisk, for eksempel ved homogen eller ved fast-fase polypeptidsyntese.
De bestemte aminosyresekvensene til egnede immunogene fimbrialpolypeptider kan bli avledet fra aminosyresekvensen ifølge sekvens ID NO: 2,4 eller 6 og eventuelt også fra den romlige konfigurasjonen til fimbrialproteinet.
Et antall metoder er blitt utviklet for å bestemme beliggen-heten til immunogene viktige epitoper på proteinene.
Resultatet av de kombinerte antagelsene sier mye om de antigene setene.
Egnede fimbriale polypeptider kan bli valgt fra de mest hydrofile delene av fimbrialproteinet, for eksempel ved anvendelse av teknikken beskrevet av Hopp og Woods [T.P Hopp og K. R. Woods (1981): Proe. Nati. Acad. Sei, USA. 78, 3824-3828]. En annen egnet metode for selektering av slike polypeptider er beskrevet av Chou og Fasman [P.Y. Chou og G.D. Fasman (1987) Advances in Enzymology 47, 45-148].
Forskjellige ytterligere algoritmer kan bli anvendt for endelig å bestemme de viktige antigene regionene på B. bronchiseptica fimbrialproteinet, så som en antagelse om fleksibiliteten til polypeptidkjeden (P.A. Karplus og G.E. Schultz, 1985. Naturwissenschaften 72,212-213), en betadreiet sannsynlighetsprofil til B. bronchiseptica fimbrialproteinet ifølge P.Y. Chou og G.D. Fasman, 1979, [Biophys. J. 26,367-385), sannsynlighetsprofiler i tre konformasjoner for sekvensen til B. bronchiseptica fimbrialproteinene ifølge Gascuel, O og J. L. Golmard, 1988 [CABIOS 4, 357-365], en antagelse om den sekundære strukturen av sekvensen til B. bronchiseptica fimbrialproteinet ifølge J. Novotny og C. Auffray, 1984 [Nucleic Acids Research 12, 243-255].
Ytterligere informasjon angående beliggenheten til relevante epitoper kan bli oppnådd ved anvendelse av PEPSCAN-metoden, utviklet av Geysen og Meloen [H.M. Geysen, R.H. Meloen og S.J. Barteling (1984); Proe. Nati. Acad. Sei., 81 (13): 3998-4002]. Denne metoden anvender syntetiske peptider med tilstrekkelig lengde for å reagere i en enzymkoblet immunosorbent analyse. Disse peptidene blir syntetisert ifølge en gitt DNA-sekvens. De er karakterisert ut fra det faktumet at det første peptidet omfatter aminosyre nr. 1-9, det andre peptidet omfatter aminosyre nr. 2-10 osv. Hvert peptid blir testet for dets reaktivitet med antisera eller monoklonale antistoffer. Reaktive peptider må følgelig representere en immunogen epitope.
For å identifisere immunreaktive epitoper (og å korrelere disse reaktivitetene med det fysiske kartet til fimbrial-proteinet) kan DNA-fragmenter fra fimbrialproteingenet bli uttrykt i egnede plasmider, så som pEX-plasmidene [K. Stanley og J.P. Luzio, 1984, EMBO J. 3,1429-1434 og J.G. Kusters, EJ. Jager og B.A.M. Van der Zeijst, 1989. Nucl. Acids. Res., 17,8007]. I dette systemet fører heterolog ekspresjon til
syntese av en C-terminal ekstensjon av cro-p-galaktosidase hybridproteinet. Restriksjons©endonukleaseseter i fimbrialprotein-DNA-sekvensene kan bli anvendt for å oppnå fragmenter av fimbrialproteingenet for innskudd inn i pEX-plasmidene. pEX-kloner som syntetiserer fusjonsproteiner avledet fra forskjellige overlappende regioner av fimbrialproteinet blir deretter anvendt for ytterligere karakterisering. pEX-
kodede fimbrialproteinfragmenter blir renset, separert ved polyakrylamid
gelelektroforese og blottet på nitrocellulose-membraner. Disse membranene blir deretter reagert med sera fra griser eller hunder som er immune overfor B. bronchi-septica. Bare fragmenter inneholdende de immunreaktive epitopene reagerer med disse seraene. For å oppstille den minimale lengden av epitopene kan DNA-innskuddene til de
reaktive klonene progressivt bli forkortet ved eksonuklease III-spaltning, eller ved kloning av syntetiske oligo-nukleotider kodende for små overlappende deler av fimbrialproteinet J.G. Kusters, E.J. Jager, G. Koch, J.A. Lenstra, W.P.A. Posthumus, R.H. Meloen og B.A.M. Van der Zeijst, 1989, J. Immunol., 143,2692-2698]. Epitopene kan deretter bli testet for beskyttende effektivitet.
Ifølge en spesiell utførelsesform av foreliggende oppfinnelse blir et fimbrialproteinspesifikt polypeptid produsert ved ekspresjon av et polynukleotid hvor i det minste en del av polynukleotidene sekvens ID NO: 1,3 eller 5 danner en del av et rekombinant polynukleotid. Det rekombinante polynukleotidet kan fortrinnsvis være basert på en vektor med et B. bronchisepticaspesifikt polynukleotidfragment innskutt deri. Egnede vektorer er plasmider, bakteriofager, kosmider, vimser, minikromosomer eller stabilt integrerte vektorer, i det sistnevnte gjelder spesielt for plante- eller dyreceller. Disse vektorene har egenskapen autonom replikasjon med unntagelse av de stabilt integrerende vektorene som innskyter seg selv i det genetiske materialet til vertscellen og replikerer med vertens genetiske materiale. Egnede vertsceller kan enten være prokaryotiske eller eukaryotiske, så som bakterier, gjær, mykoplasmer, alger, planteceller eller dyreceller. Planteceller eller dyreceller kan bli dyrket in vitro eller kan danne en del av henholdsvis en inntakt plante eller et dyr. Det rekombinante polynukleotidet kan inneholde som et innskudd et fullstendig polynukleotid kodende for fimbrialproteinet eller et fragment derav. Innskuddet kan omfatte en enkelt kodende sekvens, eller flere kopier av den
samme kodende sekvensen, eller et hybrid polynukleotid inneholdende minst en
firnbrialprotein kodende sekvens og minst en annen sekvens så som en annen del av den fimbrialprotein kodende sekvensen eller et polynukleotid kodende for et protein som er karakteristisk med et annet patogen eller for et inert protein som virker som en bærer for minst et lite fimbrialpolypeptid.
Et spesifikt tilfelle av ovennevnte overførselsform vedrører rekombinante polynukleotider med virale vektorer som er direkte nyttige som såkalte vektor vaksiner. Virus som kan anvendes for dette formålet bør ha evnen til å replikere i dyr som skal bli immunisert, dvs. i hunder og/eller svin. Disse virus bør videre ha en genomisk region egnet for innskudd av et fremmed gen (for eksempel kodende for B. bronchisepticafimbrialprotein eller polypeptidet) som også skal bli uttrykt i det vaksinerte dyret. Egnede virus for dette formålet utgjør for eksempel enterale virus så som visse adenovirus.
Som angitt ovenfor er proteiner og polypeptider, og rekombinante polypeptider ifølge oppfinnelsen nyttige for frem-stilling av vaksiner. Disse vaksinene utgjør også derfor en del av oppfinnelsen.
En spesiell anvendelse vedrører bakterielle vektorvaksiner. Bakterier med evne for kolonisering av hunder og/eller svin blir transformert for å muliggjøre at de uttrykker et fimbrialprotein eller fimbrialpolypeptid på en slik måte at det vil føre til en immunogen respons mot B. bronchiseptica. Egnede bakterier for dette formålet er for eksempel Salmonella bakterier.
En vaksine ifølge oppfinnelsen kan også inneholde hjelpe-bestanddeler for vaksinen, så som bærere, buffere, stabili-serings midler, oppløsningsmidler, adjuvanser og konser-veirngsmidler. Disse vaksinene er fortrinnsvis frysetørkede produkter som blir rekonstituert ved tilsetning av en egnet væske (vann, buffer) før applikasjon.
Vaksinen kan for eksempel bli applisert oralt, intranasalt eller intramuskulært.
Vaksinen kan i tillegg inneholde andre immunogener for at dyrene skal bli immunisert (hunder og svin) så som immunogent materiale karakteristisk for virus så som pseudorabies virus, influensa virus, transmissible gastroentritis virus,
parvo virus, grise endemisk diaré virus, hog cholera virus eller immunogent materiale karakteristisk for mycoplasma, så som Mycoplasma hyponeumoniae og Mycoplasma lyorhinis, eller immunogent materiale karakteristisk for bakterier, så som Escherichia coli, Leptospira, Actinobacilluspleuro-pneuminiae, Pateurellamultocida, Streptococcussuis, Treponema hyodysenteriae.
Oppfinnelsen vil nå bli illustrert med følgende arbeidseksempler.
EKSEMPEL 1
KARAKTERISERING AV FIMX- GENET
MATERIALER OG METODER
Bakteriestammer, medier og vekstbetingelser. Alle anvendte bakteriestammer er oppført i tabell l.
Alle Bordetella stammene ble dyrket på Bordet-Gengou agar (Difco Laboratories, Detroit, MI) tilsatt 1% glycerol og 20% defibrinert saueblod eller i Tryptose fosfat næringsløsning (TPB) (Difco Laboratories, Detroit, MI). For å undertrykke ekspresjonen av virulensgenene ble mediet tilsatt 20 mmol/1 MgSCV B. bronchiseptica stamme 401 og anvendt for DNA-preparater. Escherichia coli stamme PC2495 ble anvendt for propagering av vektoren Bluescript (Stratagene) og derivatene derav. Stamme PC2495 ble dyrket på Lureano-Bertoni (LB) bouillon eller LB agar. Ampicillin (50-100 ug/ml resp.), 50 ug/ml 5-brom-4-klor-3-indolyl-p-D-galaktopyranosid (X-gal) og 20 (ig/ml isopropyl-P-D-thiogalaktopyranosid (IPTG) ble anvendt for identifikasjon av plasmid inneholdende stammer inneholdende et DNA-innskudd. Alle bakteriekulturene ble dyrket ved 37°C i 16-24 timer.
Rekombinante DNA metoder
Kromosomalt DNA ble isolert fra Bordetella stammer som beskrevet av Maniatis et al.
[T. Maniatis, E.F. Fritsch og J. Sambrook 1982. Molecular cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, new York: Cold Spring Harbor Laboratory
Press]. Etter spaltning ble DNA-elektroforesen utført i 1% agarosegeler i TAE buffer (40 mmol/1 Tris-acetat, 2 mmol/1 EDTA) inneholdende 1 u,g/ml ethidiumbromid. Gene Clean kit ble anvendt for å isolere DNA fragmenter fra agarosegelene
(Bio Inc. 101 Corp., La Jolla). Ende-merking av oligonukleo-tidene ble utført med [y-P]dATP ved anvendelse av T4 polynukleotidkinase [Maniatis et al.]. Hybridiseringen ble utført i 5 x SSPE, 5 x Denhardts oppløsning, 0,1% SDS og 100 ug/ml laksesperm DNA ved 55 °C. Blotene ble vasket med 5 x SSPE og 0.1% SDS ved 55 °C.
Southern blot analyse
Kromosomalt DNA av B. bronchiseptica stammen 401 ble renset og spaltet med flere restriksjonsenzymer. Fragmenter ble separert ved elektroforese, overført til en nylonmembran og hybridisert med en DNA probe avledet fra fimX-fimbrial subenhetgenet til B. pertussis. DNA fragmentene av interesse, identifisert fra hybridiseringssignalene ble isolert av Gene Clean kit (Bio Inc. 101 Corp., La Jolla). Etter ligering inn i Bluescript vektor (Stratagene) ble kromosomale DNA-
fragmenter transformert til Escherichia coli, stamme PC2495, ifølge CaCb-metoden [Dagert, M., og Ehrlich, S.D. 1979. Forlenget inkubasjon i kalsiumklorid forbedrer kompetansen til Escherichia coli cellene. [Gene 6:23-28]. Positive kolonier ble identifisert etter hybridisesering.
Nukleotidsekvensbestemmelse
Plasmid ble isolert ifølge alkalisk lyseringsmetode [H.C. Birnboim og J.A. Doly, 1979. Nukleotidsekvensen til de klonede innskuddene ble bestemt ved dideoksykjedetermineringsmetoden [F. Sanger, S. Nicklen, A.R. Coulson 1977. DNA sequencing with chain©terminating inhibitors, proe. Nati. Acad. Sei. USA 74: 5463-5467] ved anvendelse av T7 polymerase sekvenseringskitet (Amersham). Analyser av DNA sekvens data ble utført med PC/Gene software (release 6.5,
Genofit, Heidelberg S.A., Geneva, Switzerland).
Delvis fimbriaerensing
B. bronchiseptica stamme 401 ble dyrket på Tryptosefosfatagar (Difco Laboratories, Detroit, MI). Bakteriene ble vasket i fosfatbufret saltvann (PBS). Bakteriepelleten ble suspendert i 15 ml fosfatbufret saltvann tilsatt 4 mol/I ureum. Denne suspensjonen ble plassert ved 40åøåC i 30 minutter. Bakteriene ble fjernet fra suspensjonen ved sentrifugering ved 20.000 rpm (Beckman, JA20 rotor) i 10 minutter. Fimbriae ble isolert fra supernatanten etter sentrifugering ved 40.000 rpm (Beckman ultracentrifuge, Ti60 rotor) i 16 timer. Pelleten ble deretter suspendert i 5 ml fosfatbuffret saltvann. Proteinkonsentrasjonen ble bestemt med Bicinchonin syre (BCA) analyse (Pierce Chemical Company, USA). Proteinanalyse ble utført på et 15% SDS-polyakrylamidgel elektroforesesystem.
RESULTATER
Sekvensanalyse og oppstilling
Et BamHI-EcoRI DNA fragment avledet fra fimX-genet til B. pertussis ble anvendt som en probe for å identifisere B. bronchiseptica kromosomal DNA-fragmenter inneholdende fim gener. Et 1.3kb Pstl DNA-fragment fra B. bronchiseptica, som hybridiserer til fimX-proben, ble isolert og sekvensert. På dette fragmentet var det fullstendige fimX-genet, inkludert promotersekvensene foran genet, beliggende (sekvens ID NO: 1).
E. coli PC 2495 bakterier inneholdende plasmid pIVN 3-420 inneholdende det fullstendige fimX-genet ble deponert til Centraalbureau voor Schimmelcultures, Baarn, Nederland 13. august 1992, under deponeringsnummer CBS 364.92.
Ekspresjon av fimX-genet til B. bronchiseptica
For å identifisere fimX-produktet ble en delesjonsmutant stamme som ikke kan uttrykke fimX genet konstruert. Denne mutante stammen ble konstruert ved generstatning. Frem til nå var et sentralt EcoRV-fragment av B. bronchiseptica fimX-genet erstattet med et kanamycingen og klonet i Bluescript vektoren. Denne konstruksjonen ble anvendt for generstatning i B. bronchiseptica (fig. 1). En kanamycin resistent mutant stamme ble identifisert. Stammen hybridiserte ikke deretter med EcoRV fragmentet. Fra denne mutante stammen ble delvis rensede fimbriae dannet. Denne rensingen av fimbriae fra fimX-negative stammen sammenlignet med villtype stammen viste klart av fimX-genet blir uttrykt i et høyt nivå i B.bbronchiseptica (fig. 2).
EKSEMPEL 2
Karakterisering av fim2- og fim3-fimbrialsubenhetgenet til Bordetella bronchiseptica
MATERIALER OG METODER
Bakterielle stammer, plasmider og vekstbetingelser.
Villtype B. bronchiseptica stammen som ble anvendt ble isolert fra hunder som lider av kennelhoste. Denne stammen ble oppnådd fra Dr. J.M. Musser (stammen nr. 685) og betegnet nr. 401. Denne stammen ble dyrket i tryptosefosfatnæringsløsninge eller agar (Difco Laboratories, Detroit, MI). B. pertussis stamme Wellcome 28 [A. Robinson, L.A.E. Ashworth, A. Baskerville og L.I. Irons. 1085. Proceedings of the 4th International Symposium on pertussis, Geneva, 1984. Dev. Biol. Stand.
61:165-172] ble dyrket på Bordet Gengou agar (Difco Labora-tories, Detroit, MI). For ikke-virulent B. bronchiseptica ble vekstmediet tilsatt med 20 mmol/1 MgS04. E. coli Kl 2 stamme PC2495 ble anvendt som vert for kloningsvektor pBluescript. E. coli stammen ble dyrket på LB-agar eller LB-næringsløsning tilsatt 100 ug/ml amp.: 50 mg/ml X-Gal og 20 mg/ml IPTG for identifisering av rekombinante stammer inneholdende et klonet DNA-fragment. Alle bakterielle kulturer ble dyrket ved 37°C i 16-48 timer.
DNA-isolering og nukleotidsekvens bestemmelse.
Isolering av kromosomalt DNA ble utført ifølge Manniatis et al. Plasmidisolering ble utført ifølge metoden til Bimboim og Doly. Kromosomale DNA fragmenter ble isolert fra TAE (40 mmol/1 Tris-acetat, 2 mmol/1 EDTA) agarosegeler ved anvendelse av Gene Clean kit (Bio Inc. 101 Corp., La Jolla). DNA fragmenter ble ligert i pBluescript KS M13+ og M13-(Stratagene, La Jolla, CA) for alle kloningsformål. Nukleo-tidsekvensbestemmelsen ble utført med T7-polymerasesekvens kittet (Amersham) ved dideoksykjedetermineringsmetoden til Sanger et al. PC/Gene computing software (release 6.5, Genofit, Heidelberg S.A., Geneva, Switzerland) ble anvendt for analysering av DNA-sekvensdataene. Restriksjonsenzymer og
T4 DNA-ligase ble oppnådd fra Pharmacia og ble anvendt ifølge instruksjonene til forhandleren. Plasmider ble transformert til E. coli stamme PC2495 ved CaClVÆ metoden til Dagert og Ehrlich.
Southern blotting
Southern blotting ble utført ifølge Maniatis et al.
SDS-polyakrylamid gelelektroforese og
immunologiske teknikker.
For SDS-PAGE og Western blot analyse ble like mengder
bakterier anvendt. Bakteriene ble høstet i fosfatbuffret saltvann (PBS) og fortynnet til ODeoo = 1.0. Fra denne suspensjonen ble 50 ul Iysert i 20 ul Laemmli-buffer og elektroforert på 15% akrylamidgeler som beskrevet av Laemmli (Laemmli, U.K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227:680-685). Overføring av proteinene til nitrocellulose ble vesentlig utført som beskrevet av van Embden et al. (J.D.A. van Embden, H.J. van der Di\onk, H.J. van Eijk, H.G. van der Heide, J.A. de Jong, M.F. van Olderen, A.D. Osterhaus, L.M. Schouls, 1983. Molecular cloning and expression of Treponema pallidum DNA i Escherichia coli Kl 2. Infect. Immun. 42:187-196). Polyklonale antistoffer dannet mot SDS-denaturert serotype 2 eller 3 fimbrial subenhet proteinene fra B. pertussis ble anvendt for deteksjon av B. bronchiseptica fimbrial subenhetproteiner.
Fim2- og fim3-spesifikke monoklonale antistoffer dannet mot B.
pertussis ble anvendt i en ELISA på flatbunnede mikrotiterskåler belagte med hele bakterier (OD60o= 0.1,1:10 fortynnet i 15 mmol/1 Na2C03, 35 mmol/1 MaC03 pH 9.6). Bundet geite anti-muse IgG-peroksidase konjugat (Nordic) ble bestemt med 2,2'-azino-bis(3-etylbenzthiazolin-6-sulfinsyre (ABTS) (Sigma). Absorbansen ble målt ved 405 nm.
Elektronmikroskopi.
For elektronmikroskopi ble en B. bronchiseptica kultur fortynnet i PBS-buffer. Pilioformbelagte kobbergitter ble plassert på 50 ul bakteriell suspensjon i 5 min. Gifterene ble vasket to ganger i H20 =. Fargingen ble utført i løpet av 2 min
i 1% TPA (Tungstofosforsyre, Merck). Formene ble undersøkt i et Philips EM 201 elektronmikroskop.
RESULTATER
Nukleotidsekvensen til fim2- og fim3- fimbrialsubenhetgener.
B. bronchiseptica fim2- og fim3-subenhetgenene kunne bli identifisert på grunnlag av deres homologi med B. pertussis fim2- og fim3-gener. Et AccL-Pstl DNA-fragment på lOOObp ble anvendt som en probe for fim2-genet [I. Livey, C.J. Duggleby og A. Robinson, 1987. Cloning and nucleotide sequence analysis of the serotype 2 fimbrial subunit gene of Bordetella pertussis, Mol. Microb. 1:203-209], Et Sall-DNA-fragment på 900 bp ble anvendt som en probe for fim3-genet [Mooi, F.R., A ter Avest, og H.G.J, van der Heide. 1990. Structure of the Bordetella pertussis genecoding for the serotype 3 fimbrial subunit. FEMS Microb. Lett. 66: 327-332]. Hybridisering av kromosomalt DNA fra B. bronchiseptica, spaltet med restriksjonsendonuklease Pstl, ga flere positive signaler med begge probene på grunn av homologi mellom de to probene. To regioner av DNA-fragmentene ble isolert fra B. bronchiseptica kromosomalt DNA som ga det sterkeste signalet med enten fim2- eller fim3-proben. Disse Pstl DNA-fragmentene var på omtrent 2.3 kb og 2.8 kb og ble klonet inn i Bluescript vektoren. Etter transformering og koloniløfting ble to kloner identifisert ved hybridisering med en av fim probene. En klon, med et innskudd på 2.3 kb, kodet for fim2 (pIVB3-402)-genet. Den andre klonen, med et innskudd på 2.8 kb, kodet for fim3 (pIVB3-430) genet til B. bronchiseptica. Nukleotidsekvensen til begge genene ble bestemt og er representert som sekvens ID NO 3 (fim2) og sekvens ID NO 5
(fim3). E. coli bakteriene PC 2495 (pIVB3-402) og PC 2495 (pIVB3-430) ble deponert til Centraalbureau voor Schimmelcutlures Baam, Nederland 13. august 1992 under numrene CBS 362.92 og CBS 361.92
EKSEMPEL 3
Konstruksjon av to Bordetella bronchiseptica stammer
som ikke produserer en type fimbriae
Bordetella bronchiseptica stammer som ikke produserer fimX-fimbriae (BbfX) eller fim2-fimbriae (Bbf2) er blitt konstruert. Dette ble oppnådd ved generstatning med de ødelagte genene etter homolog rekombinasjon. De ødelagte genene ble transformert til B. bronchiseptica ved elektroporasjon. Delesjonen i fimbrialsubenhetgenene ble konstruert ved erstatning av et EcoRV-fragment i villtype genene med et kanamycinresistensgen.
MATERIALER OG METODER
Bakterielle stammer, plasmider og vekstbetingelser.
Villtype B. bronchiseptica stamme nr. 401 ble anvendt i alle eksperimentene. Bakterien ble oppnådd fra Dr. J.M. Musser (stamme nr. 685). Denne stammen ble dyrket på tryptosefosfat agar (TPA) (Difco Laboratories) eller på Bordet Gengou (BG)
agar (Difco Laboratories) tilsatt med 15% friske saueerythrocyter, ved 37°C i 24-48 timer. For kloningsformål ble Escherichia coli Kl 2 stamme PC2495 anvendt med Bluescript KS og SK plasmid (Stratagene). E. coli PC2495 ble dyrket på
Luria Bertoni agar med riktige antibiotika i løpet av 16timer ved 37°C. For ampicillin og/eller kanamycin ble enkonsentrasjon på 100 ug/ml anvendt.
Rekombinante DNA teknikker
Kloningsprosedyrene ble utført som beskrevet av Maniatis et al. Hvert fimbrial subenhetgen, inkludert ved siden avliggende sekvenser, ble klonet i Bluescript vektoren. Disse vektorene ble isolert ved alkalisk ekstraheirngsmetode til Birnboim og Doly. Et DNA-fragment innenfor et subenhetgen ble erstattet med et kanamycinresistensgen [A. Labigne-Roussel, J. Harel og L. Tompkins. 1987. Gene transfer from Escherichia coli to Campylobacter species: Development of shuttle vectors for genetic analysis of Campylobacter jejuni. J. Bacteriol. 169:5320-5323]. Denne sistnevnte konstruksjonen ble anvendt i elektroporasjonseksperimentene.
Elektroporasjonseksperimenter
Elektroporasjonen ble utført vesentlig som beskrevet av Miller et al. [J.F. Miller, WJ. Dower og L.S. Tomkins, 1988. High-voltage electroporation of bacteria: Genetic transfor-mation of Campylobacter jejuni with plasmid DNA. Proe. Nati.
Acad. Sei. USA 85:856-860]. Villtype B. bronchiseptica stamme401 ble dyrket på BG-agar i 16 timer. Cellene ble høstet i 1 ml av en 15% glycerol-272 mmol/1 sukrose oppløsning (GlySuc) (0°C), vasket og resuspendert i 400 ul GlySuc. Fra denne suspensjonen ble alikvoter på 50 fil frosset ved -80°C. Disse alikvotene ble anvendt i elektroporasjonseksperimentene for å transformere B. bronchiseptica med 1-3
ug DNA, oppløst i destillert vann. Elektroporasjonsbetingelsene som ble anvendt er:0,7kV, 25uF og 600Q (Biorad Gene Pulser, ved anvendelse av 0.56 mm gap-kuvetter fra Biotechnologies and Experimental Research, Inc., San Diego,
CA). Tidskonstantene som ble målt var mellom 3.5-7 ms. Cellene ble isolert i 1 ml tryptosefosfatnæringsløsning (Difco Laboratories) i løpet av 90 minutter ved 37°C og sådd ut på TPA (Difco Laboratories) inneholdende 100 ug/ml kanamycin.
Screening av rekombinante stammer ble utført ved Southem blotting på kromosomale DNA-preparater.
Kromosomal DNA rensing og Southem blot analyser
Kromosomalt DNA ble renset ifølge Maniatis et al. Southern blot analyse ble utført som tidligere beskrevet.
DNA-prober anvendt i hybridiseringseksperimentene
For hybridiseringseksperimenter vedrørende fimX-genet ble to prober anvendt og angitt som fXEv og OSE. Et 450bp DNA-fragment, anvendt som probe fXEv, ble isolert fra spaltning av pIVB3-426 med restriksjonsendonuklease EcoRV (fig. 3). 580bp DNA fragmentet til proben f3SE ble oppnådd etter spaltning av pIVB3-430 med restriksjonsendonukleasene SphI og EcoRI (fig. 4). For hybridiseringseksperimentene vedrørende fim2 genet ble tre prober anvendt og angitt som f2Ev, kana og f2PE (fig. 5). Probe f2Ev var et 900bp EcoRV DNA fragment isolert fra pIVB3©417, probe kana var et 900bp EcoRV DNA-fragment innenfor kanamycingenet og probe f2PE var et 610bp Pstl-EcoRV DNA-fragment av pIVB3-417.
RESULTATER
To plasmider med DNA fragmenter inneholdende enten fimX eller
fim2-fimbrial subenhetgen ble anvendt for å transformere villtype B. bronchiseptica bakterier ved elektroporasjon. Genene til begge subenhetene ble ødelagt ved erstatning av et EcoRV DNA-fragment med et kanamycin resistens gen. Før dette kunne bli utført var det nødvendig å fjerne det tredje EcoRV setet til stede i polylinkeren til Bluescript vektoren. Dette ble utført ved subkloning av DNA-fragmentene inn i EcoRV Bluescriptvektoren som resulterte i pIVB3-426 for fimX og pIVB3-417 for fim2 (fig. 3, 5). Begge klonene ble deretter spaltet med restriksjonsendonuklease EcoRV. Med denne spaltningen ble et fragment på 450 bp fjernet fra fimX genklonen (pIVB3-426) inkludert 51 promotersekvensene (fig. 3). Etter at EcoRV fragmentet var tjernet ble vektoren med gjenværende DNA sekvenser isolert og et 1.4kb Smal-HincII DNA fragment inneholdende et kanamycinresistensgen ble klonet inn i EcoRV setene. Transformering til E. coli PC2495 ble utført ved plasmidisolering og ga klon pIVB3-427 (fig. 3). Den samme strategien ble fulgt for fim2-fimbrial subenhetgenet. Spaltning av klon pIVB3-417 med restriksjonsendonukleasen EcoRV (fig. 5) fjernet et 900bp DNA fragment mot 3' delen av genet sammen med ved siden av liggende sekvenser. Ligering av kanamycinresistens genet i konstruksjonen ga klonen pIVB3-418 (fig. 59).
Begge plasmidene ((pIVB3-427 og pIVB3-418) ble isolert og separat anvendt i elektroporasjonseksperimenter for å transformere B. bronchiseptica. Etter hvert elektroporasjonseksperiment ble opp til 10 andre kanamycin resistent B. bronchiseptica-kolonier observert. Etter elektroporasjon med plasmid pIVB3-427 (partiell fimX-fimbrialsubenhetgen), ble 4 kolonier analysert (fXI-IV). Etter elektroporasjon med plasmid pIVB3-418 (partiell fim2-fimbrialsubenhetgen), ble 7 kolonier analysert (fil-VII). Kromosomalt DNA ble isolert fra disse kanamycinresistente B. bronchiseptica stammene og spaltet med Pstl- og EcoRV-restriksjonsendonukleaser. En Southem hybridisering ble utført med spaltet kromosomalt DNA, isolert fra kanamycinresistensstammene og villtype B. bronchiseptica stammen. Spaltet kTomosomlat DNA fra fire stammer isolert etter elektroporasjon med pIVB3-427 ble hybridisert med henholdsvis probene fXEv og f3SE (fig. 3,4). Spaltet kromosomalt DNA til 7 stammer isolert etter elektroporasjon med plasmid pIVB3-418 ble hybridisert med henholdsvis probene f2Ev, kan og f2SE (fig. 5). Ut fra hybridiseringsmønstrene med probene fXEv og f2Ev fremkom det klart at rekombinante stammer som enten mangler en del av fim (fig. 6A, 6B) eller fim2 (fig. 7A, 7B), fimbrialsubenhetgenet, ble isolert. Fra hybridiseringseksperimenter med kanamycin genet som en probe ble det demonstrert for fim2-genet at alle de isolerte stammene (f2I-VII) inneholdt kanamycingenet (fig. 7C).
På grunn av at kanamycingenet var til stede i alle fim2-rekombinante stammer kunne generstatning av oppstått i et av de andre fimbrialsubenhet genene på grunn av homologier blant subenhetgenene. For å bestemme om dette var tilfelle ble hybridiseringseksperimenter utført under betingelser med lav stringens hvor krysshybirdisering kunne bli observert ved anvendelse av prober avledet fra de andre subenhetgenene. Hybridiseringseksperimenter på fimX-kanamycinresistente B. bronchiseptica stammer (fX I-IV) med fiSE probe (fim3-subenhetgenet) demonstrerte at generstatning i fimbrialsubenhetgenet oppsto bare innenfor stammen BbFX\ I denne stammen og også i de andre rekombinante stammene (fX II-IV) var hybridiseringssignaler med DNA-fragmenter inneholdende fim3- og fim2-genene tilstede (fig. 6C). På grunn av at disse sistnevnte signalene var de samme som i villtype B. bronchiseptica hadde ingen rekombinasjon i et eller annet subenhet gen oppstått (fig. 6C). Hybridisering av fim2-mutante stammer med f2PE proben viste at generstatningen i fim2-genet bare var oppstått innenfor stammen BbF2" (fig. 7D). Med anvendelse
av denne proben ble hybridiseringssignaler med alle tre subenhetgenene observert. På grunn av at Pstl-EcoRV fragmentet (probe f2PE) er til stede innenfor pIVB3-418, anvendt i elektroporasjonen, kan et fjerde hybridiseirngssignal bli observert i de
rekombinante stammene (f2II-VII). Dette indikerer at plasmidet pIVB3-418 fortsatt kan være til stede i de kanamycinresistent stammene. Rekombinasjon har sannsynligvis oppstått andre steder i kromosomet ved en uidentifisert beliggenhet på utsiden av et fimbrialsubenhetgen.
EKSEMPEL 4
Vaksinasjonseksperiment med Bordetella bronchiseptica
mutantene BBFX" og BBF2" i mus
MATERIALER OG METODER
Tre grupper med hver 80 mus (6 uker gamle hunn BALB/C mus)ble infisert intranasalt med villtype B. bronchiseptica, BbfX" og Bbf2' (siste to dannet ifølge eksempel 2) (2 x 10e7 cfu hver). Antall levedyktige bakterier i åndedrettskanalen til 8 mus ble bestemt ved bestemte tidsintervaller (0,1, 3,7,11 og 36 dager). I hver mus ble luftrøret, nese, nese-svelg og lunger undersøkt for tilstedeværelse av IevedyktigebB. bronchiseptica. Musene ble avlivet ved en barbituratinjeksjon omtrent 1 time etter infeksjon (angitt som dag 0) og på de forskjellige dagene deretter. Lungene og luftrøret ble fjernet og homogenisert i PBS med vevsmaler. "Noseswabs"ble tatt med "eat gut". "Cat gut" ble plassert i 0.5 ml PBS og vorteks behandlet i 5 minutter. Nese-svelget ble skylt med PBS helt til 5 dråper (omtrent 0.5 ml) ble samlet. For-tynninger av alle homogenater og dråpene til nesesvelget ble sådd ut på tryptosefosfatagar og CFU ble telt etter 2
dagers inkubasjon.
52 dager etter vaksineringen ble grupper vaksinert med BbfX* eller Bbf2" og en ikke-vaksinert kontrollgruppe utsatt for en virulent B. bronchiseptica stamme. Kolonisering av ånde-drettskanalen ble målt på dagene 0,1,4 og 14 etter eksponering.
RESULTATER
Resultatene på kolonisering av øvre åndedrettskanal fra begge de mutante stammene og villtype stammen blir sammenlignet. Det er ingen forskjell i kolonisering i de forskjellige organene til den øvre åndedrettskanalen etter at de ble utsatt for BbfX" eller Bbf2" mutant stamme sammenlignet med villtype stammen. På dag 36 ble mus fra BbfX" og Bbfi" gruppene screenet for tilstedeværelse av Bordetella. Lunger og luftrør var fri for Bordetella, mens små mengder Bordetella var fortsatt til stede i nese og nesesvelget. 52 dager etter vaksinering ble musene vaksinert med BbfX" og Bbf2' mutanter og en kontrollgruppe ble eksponert for en virulent B. bronchiseptica stamme. Kolonisering av nese"svelget med virulent B. bronchiseptica stamme ble ikke forhindret i begge de vaksinerte gruppene. Lunge og luftrør kolonisering av villtype stammen i vaksinerte grupper kunne bare bli demonstrert 1 time etter eksponering, mens kontrollgruppen var omfattende kolonisert.
Kolonisering av nesen til mus vaksinert med mutant stamme kunne bare bli detektert på dag 0 og i noen mus på dag 1, mens nesen til mus fra kontrollgruppen var kraftig kolonisert.
Claims (5)
1.
Polypeptid, karakterisert ved at det omfatter et fimbrialt protein fra B. bronchiseptica med aminosyresekvensene representert ved seq id no. 4 og 6, funksjonelle fragmenter derav og sekvenser inneholdende konservative substitusjoner av disse.
2.
Polynukleotid, karakterisert ved at det blir valgt fra nukleotidsekvensene representert ved seq id no. 3 eller 5, og koder for et polypeptid ifølge krav 1.
3.
Ekspresjonsvektor, karakterisert ved at den omfatter polynukieotidsekvensen ifølge krav 2.
4.
Vaksine for å bekjempe B. bronchiesepticainfeksjon, karakterisert ved at den inneholder en effektiv mengde av et polypeptid ifølge krav 1 eller en ekspresjonsvektor ifølge krav 3.
5.
Anvendelse av et polypeptid ifølge krav 1 for fremstilling av et farmasøytisk preparat for å bekjempe B. bronchiespticainfeksjoner.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP92202525 | 1992-08-18 | ||
PCT/NL1993/000161 WO1994004683A1 (en) | 1992-08-18 | 1993-07-28 | Bordetella bronchiseptica vaccine |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
NO950582D0 NO950582D0 (no) | 1995-02-16 |
NO950582L NO950582L (no) | 1995-02-16 |
NO319988B1 true NO319988B1 (no) | 2005-10-10 |
Family
ID=8210860
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO19950582A NO319988B1 (no) | 1992-08-18 | 1995-02-16 | Polypeptid omfattende et fimbralt protein fra Bordetella Bronchiseptica, polynukleotid og ekspresjonsvektor som koder for et slikt protein, samt en vaksine eller farmasoytisk preparat for a bekjempe B. Bronchiseptica infeksjoner. |
Country Status (14)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US5939064A (no) |
EP (1) | EP0656948B1 (no) |
JP (1) | JPH08500734A (no) |
AT (1) | ATE263244T1 (no) |
CA (1) | CA2142712C (no) |
CZ (1) | CZ285307B6 (no) |
DE (1) | DE69333467T2 (no) |
FI (1) | FI113242B (no) |
HU (1) | HU219819B (no) |
NO (1) | NO319988B1 (no) |
PL (1) | PL307505A1 (no) |
RU (1) | RU2129611C1 (no) |
SK (1) | SK21495A3 (no) |
WO (1) | WO1994004683A1 (no) |
Families Citing this family (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
FR2646776B1 (fr) | 1989-05-12 | 1994-06-03 | Pasteur Institut | Utilisation de preparations vaccinantes a base d'adenyl cyclase ou de bacteries les produisant en tant qu'antigenes protecteurs contre les effets des bordetella |
FR2728170A1 (fr) * | 1994-12-15 | 1996-06-21 | Pasteur Institut | Vaccin de type acellulaire anti-bordetella |
US6475754B1 (en) * | 1999-05-14 | 2002-11-05 | University Of Tennessee Research Corporation | Polynucleotides encoding Bordatella bronchiseptica fimbrial proteins (FimN), vectors, and expression systems therefor |
US7435422B2 (en) * | 2004-01-15 | 2008-10-14 | Intervet International B.V. | Non-animal origin stabilizers and processes for producing the same |
US7521059B2 (en) * | 2004-06-14 | 2009-04-21 | Fenwick Bradley W | Kennel cough vaccine |
BRPI0519923A8 (pt) * | 2004-12-17 | 2018-01-23 | De Staat Der Nederlanden Vertegenwoordigd Door De Mini Van Vws | polipeptídeo, seqüência de dna, vetor de dna, anticorpo, bactéria, método para produzir lps parcialmente 3-0-desacilado, composição, usos da bactéria, e de lps de bordetella isolado compreendendo lps pelo menos parcialmente 3-0-desacilado, vacina, e, método in vitro para a desacilação de lps gram-negativo ou de composições compreendendo lps gram-negativo, e, para induzir uma resposta imune contra bordetella. |
CN112375127B (zh) * | 2020-11-25 | 2022-09-09 | 江苏省农业科学院 | 一种用作支气管败血波氏菌病疫苗的重组蛋白及其应用 |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU575086B2 (en) * | 1983-11-07 | 1988-07-21 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Bordetella bronchiseptica pili subunit protein and vaccine |
DK594084A (da) * | 1984-12-12 | 1986-06-13 | Novo Industri As | Fremgangsmaade til stabilisering af extra-chromosomale elementer i bakterier under dyrkning |
IT1223579B (it) * | 1987-12-22 | 1990-09-19 | Eniricerche Spa | Clonaggio e sequenziamento del gene codificante per una nuova subunita' pilinica di bordetella pertussis |
IT1231961B (it) * | 1989-09-22 | 1992-01-16 | Eniricerche Spa | Clonaggio del gene codificante la subunita' pilinica fim3 di bordetella pertussis. |
-
1993
- 1993-07-28 US US08/381,881 patent/US5939064A/en not_active Expired - Lifetime
- 1993-07-28 CZ CZ95410A patent/CZ285307B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1993-07-28 CA CA002142712A patent/CA2142712C/en not_active Expired - Lifetime
- 1993-07-28 AT AT93919704T patent/ATE263244T1/de not_active IP Right Cessation
- 1993-07-28 JP JP6506121A patent/JPH08500734A/ja active Pending
- 1993-07-28 PL PL93307505A patent/PL307505A1/xx unknown
- 1993-07-28 DE DE69333467T patent/DE69333467T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1993-07-28 HU HU9500491A patent/HU219819B/hu unknown
- 1993-07-28 EP EP93919704A patent/EP0656948B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1993-07-28 RU RU95107705A patent/RU2129611C1/ru active
- 1993-07-28 WO PCT/NL1993/000161 patent/WO1994004683A1/en active IP Right Grant
-
1995
- 1995-02-16 NO NO19950582A patent/NO319988B1/no not_active IP Right Cessation
- 1995-02-16 SK SK214-95A patent/SK21495A3/sk not_active IP Right Cessation
- 1995-02-17 FI FI950740A patent/FI113242B/fi not_active IP Right Cessation
-
1999
- 1999-03-30 US US09/281,221 patent/US6284256B1/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO1994004683A1 (en) | 1994-03-03 |
NO950582D0 (no) | 1995-02-16 |
CA2142712C (en) | 2004-01-06 |
US5939064A (en) | 1999-08-17 |
CA2142712A1 (en) | 1994-03-03 |
RU95107705A (ru) | 1997-03-27 |
FI950740A (fi) | 1995-02-17 |
RU2129611C1 (ru) | 1999-04-27 |
EP0656948A1 (en) | 1995-06-14 |
DE69333467D1 (de) | 2004-05-06 |
NO950582L (no) | 1995-02-16 |
HU9500491D0 (en) | 1995-04-28 |
US6284256B1 (en) | 2001-09-04 |
CZ285307B6 (cs) | 1999-07-14 |
EP0656948B1 (en) | 2004-03-31 |
SK21495A3 (en) | 1995-07-11 |
DE69333467T2 (de) | 2005-01-20 |
CZ41095A3 (en) | 1995-08-16 |
FI950740A0 (fi) | 1995-02-17 |
PL307505A1 (en) | 1995-05-29 |
FI113242B (fi) | 2004-03-31 |
HU219819B (hu) | 2001-08-28 |
JPH08500734A (ja) | 1996-01-30 |
ATE263244T1 (de) | 2004-04-15 |
HUT70984A (en) | 1995-11-28 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Luo et al. | Cloning and characterization of the major outer membrane protein gene (ompH) of Pasteurella multocida X-73 | |
Ruffolo et al. | Cloning, sequencing, expression, and protective capacity of the oma87 gene encoding the Pasteurella multocida 87-kilodalton outer membrane antigen | |
Gilmore Jr et al. | The 120 kilodalton outer membrane protein (rOmp B) of Rickettsia rickettsii is encoded by an unusually long open reading frame: evidence for protein processing from a large precursor | |
JP3380559B2 (ja) | ヘリコバクター・ピロリ抗原及びワクチン組成物 | |
Mooi et al. | Characterization of fimbrial subunits from Bordetella species | |
RU2556813C2 (ru) | Живые аттенуированные вакцины | |
IE903377A1 (en) | Vaccine against lyme disease | |
CN107529534B (zh) | 一种副鸡禽杆菌的保护性抗原、及其表达和应用 | |
Kasten et al. | Pasteurella multocida produces a protein with homology to the P6 outer membrane protein of Haemophilus influenzae | |
NZ234933A (en) | Vaccine against e.coli infection and toxin therefor derived from flagella of a single e.coli strain | |
Singh et al. | Molecular heterogeneity of plpE gene in Indian isolates of Pasteurella multocida and expression of recombinant PlpE in vaccine strain of P. multocida serotype B: 2 | |
JP3236610B2 (ja) | 豚胸膜肺炎用ワクチン | |
NO319988B1 (no) | Polypeptid omfattende et fimbralt protein fra Bordetella Bronchiseptica, polynukleotid og ekspresjonsvektor som koder for et slikt protein, samt en vaksine eller farmasoytisk preparat for a bekjempe B. Bronchiseptica infeksjoner. | |
EP2916863B1 (en) | Attenuated mannheimia haemolytica vaccines and methods of making and use | |
JP2023503057A (ja) | ヘモフィルス・パラスイスに対する新規ワクチン | |
JP2023503058A (ja) | ヘモフィルス・パラスイスに対する新規ワクチン | |
KR20060129163A (ko) | 로소니아 인트라셀룰라리스 서브유닛 백신 | |
JP2006500914A (ja) | ブタ赤痢(Brachyspirahyodysenteriae)ワクチン | |
JPH10290695A (ja) | アクチノバシラス・プレウロニューモニアの弱毒化生菌 | |
Smerdou et al. | A continuous epitope from transmissible gastroenteritis virus S protein fused to E. coli heat-labile toxin B subunit expressed by attenuated Salmonella induces serum and secretory immunity | |
MXPA02010418A (es) | Vacuna de leucotoxina de fusobacterium necrophorum recombinante y preparacion de la misma. | |
Liu et al. | Cloning, expression, and characterization of TonB2 from Actinobacillus pleuropneumoniae and potential use as an antigenic vaccine candidate and diagnostic marker | |
RU2822516C1 (ru) | Новая вакцина против haemophilus parasuis | |
EP1350796A1 (en) | Attenuated gram negative bacteria | |
BRAMBILA et al. | Two outer membrane lipoproteins from histophilus somni are Immunogenic in rabbits and sheep and induce protection against bacterial challenge in mice |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MK1K | Patent expired |