NO319988B1 - Polypeptid omfattende et fimbralt protein fra Bordetella Bronchiseptica, polynukleotid og ekspresjonsvektor som koder for et slikt protein, samt en vaksine eller farmasoytisk preparat for a bekjempe B. Bronchiseptica infeksjoner. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår et polypeptid omfattende et fimbrialt protein fra Bordetella bronchiseptica, polynukleotid og ekspresjonsvektor som koder for et slikt protein, samt en vaksine eller et farmasøytisk preparat for å bekjempe B. bronchi septicainfeksj oner.

Slekten Bordetella består av fire arter: Bordetella pertussis (B. pertissis), Bordetella parapertussis (B. parapertussis), Bordetella bronchiseptica (B. bronchiseptica) og Bordetella avium (B. avium). Bordetella er små gram-negative coccobacilli, obligate aerobe, ofte bipolart fargede og cyto-kromoksidase positive. Koloniene på Bordet-Gengou medium er omgitt av en sone med hemolyse unntatt B. avium.

Alle arter av Bordetella forårsaker meget lik sykdom med hensyn på adherens, proliferasjon, kliniske symptomer og histopatologi. Nyfødte mennesker og dyr er mottagelige for infeksjon med Bordetella. Her er sykdommen mest alvorlig og dødeligheten er høyest.

B. bronchiseptica er hovedsakelig et patogen hos laboratoriedyr, husdyr og ville dyr og av og til hos mennesker. Kaniner, marsvin, rotter, ikke-humane primater, hunder, svin, katter, hester og rever blir ofte infisert i epidemier. B. bronchiseptica forårsaker kennelhoste hos hunder og atropisk rhinitt hos griser. Hos hunder er den infeksiøse prosessen stort sett begrenset til trakeobronchial-treet og er karakterisert ved proliferering av trankealt epitel, etter adherens til flimmerhår. De mest alvorlige symptomene ved sykdommen er omfattende trankeal slim akkumulering, oppkast, lungelesjoner og vekttap. Hundene har en tørr, grov hakkende hoste. Infeksjon hos små griser med B. bronchiseptica er karakterisert ved turbinat atrofi, snutedeformeringer, lungebetennelse og redusert vektøkning. Til tross for at det er kjent at B. bronchiseptica var det ansvarlige middelet for trofisk rhinitt tyder mye nå på at Pasteurella multocida er det viktigste patogenet med B. bronchiseptica som sannsynligvis spiller en induserende eller opportunistisk rolle.

Rapporterte bærertilstander, uten kliniske tegn, er høye hos hunder, svin og kaniner.

Flere virulensfaktorer er blitt identifisert i Bordetellae. Disse innbefatter pertussis toksin, filamentøs hemagglutinin, fimbriae, adenylat cyklase, dermonekrotisk toksin, trankealt toksin og hemolysin. Disse virulensfaktorene blir ikke uttrykt i alle artene, for eksempel er genet kodende for pertussis toxin i B. pertussis til stede som et stille gen i kromosomet til B. parapertussis og B. bronchiseptica. Bortsett fra disse virulensfaktorene er det sannsynligvis flere, enda uidentifiserte, faktorer som involvert i patogenisiteten til bakteriene.

Bordetella infeksjoner begynner ved de cilierte cellene til Iuftveiskanalen. Bakteriell adherens er en forutsetning for initiering av infeksjon på grunn av at den børstede virk-ningen til flimmerhår fjerner bakteriene sammen med andre partikler fra luftrøret. Adherens av Bordetella til cilierte celler blir formidlet ved serologiske forskjellige fimbriae og filamentøs hemagglutinin (FHA) (FHA finnes derimot ikke i B. avium). Fimbriae er hårlignende strukturer bestående av identiske subenhet proteiner som rager ut fra den bakterielle celleoverflaten. FHA er et overflateassosiert protein, også utskilt i det ekstracellulære miljøet og som kan agglutinere forskjellige erytrocytter. Både fimbrial- og FHA-ekspresjonen er regulert av bvg-lokuset til tross for at ekspresjonen av fimbrialsubenhetgenene i B. pertussis, også er innvirket av lengden på et område med 13-15 cysteinresidier foran fimbrial-subenhetgenene. Alle virulente Bordetellae uttrykker adherens faktorer på deres overflater, mens ikke-virulente stammer ikke gjør dette. På grunn av at disse adhesinene er vesentlige for initiering av sykdommen er disse attraktive vaksine komponenter.

F.R. Mooi et al., Microbial Pathogenesis, vol. 2, 1987, s. 473-484, S.W. Lee et al., Infection and Immunity, vol. 51,1986, s. 586-593 og EP 141671 beskriver nært beslektet teknikk, dvs. de omhandler Bordetella infeksjoner og bekjempelse av slike infeksjoner. Imidlertid beskrives ikke de nye polypeptidene og subenhetgenene som beskrives ifølge foreliggende oppfinnelse og utnyttelse av disse bestemte polypeptider og subenhetgener for å bekjempe B. Brochisepticainfeksjoner.

Hensikten ifølge foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe en rekombinant-DNA vaksine mot B. bronchisepticainfeksjon.

Forskning har fokusert på adhesjonsfaktorene på grunn av at forhindring av adhesjon, som et resultat av en immun-respons rettet mot adhesjonsfaktorene, vil forhindre en infeksjon. IB. bronchiseptica er flere serologiske fimbriae og FHA ansvarlige for adherering av bakterien til cilierte luftrørepitelceller. Når verten har en immunrespons mot adhesjonsfaktorene til den mikrobielle organismen vil ingen kolonisering være mulig. Bakteriene vil bli drept før noen toksiner blir produsert og ingen kliniske symptomer vil bli utviklet.

En vaksine ifølge oppfinnelsen som forhindrer kolonisering av B. bronchiseptica inneholder fortrinnsvis så mye som mulig av komponentene som er nødvendige for adherering. En rekombinat vaksine kan bli konstruert som en subenhetvaksine. Det er derimot ikke kjent hvor mange serologiske forskjellige fimbriaer som blir produsert og hvilket bidrag i adhereringen hver faktor (fimbriae og FHA) har. For vaksineutvikling er det nødvendig å undersøke bidraget til adherering fra alle komponentene separat. Proteinene av interesse kan bli anvendt som en subenhetvaksine etter overproduksjon i en egnet mikrobiell organisme.

Ifølge foreliggende oppfinnelse blir to forskjellige subenhetgener kodende for adherens faktorene til B. bronchiseptica isolert og karakterisert.

Foreliggende oppfinnelse vedrører derfor et polypeptid, kjennetegnet ved at det omfatter et fimbrialt protein fra B. bronchiseptica med aminosyresekvensene representert ved seq. id no. 4 og 6, funksjonelle fragmenter derav og sekvenser inneholdende konservative substitusjoner av disse.

Foreliggende oppfinnelse vedrører videre et polynukleotid, kjennetegnet ved at det blir valgt fra nukleotidsekvensene representert ved seq id no. 3 eller 5, og koder for et polypeptid ifølge oppfinnelsen.

Foreliggende oppfinnelse vedrører også en ekspresjonsvektor, kjennetegnet ved at den omfatter polynukleotidsekvensen ifølge oppfinnelsen.

Foreliggende oppfinnelse vedrører videre en vaksine for å bekjempe B. bronchisepticainfeksjon, kjennetegnet ved at den inneholder en effektiv mengde av et polypeptid eller en ekspresjonsvektor ifølge oppfinnelsen.

Foreliggende oppfinnelse vedrører videre anvendelse av et polypeptid for fremstilling av et farmasøytisk preparat for å bekjempe B. bronchisepticainfeksjoner.

Fimbrial protein og polypeptider avledet derfra kan utløse en immunrespons mot B. bronchiseptica.

Små antigener er ofte unyttige som immunogener. Fimbrial proteinet eller polypeptidene kan derfor bli dannet som homopolymerer (en mengde sammenboblete identiske fimbriale polypeptider) eller heteropolymerer (en eller flere fimbrial polypeptider koblet til en eller flere forskjellige fimbriale polypeptider, eller koblet til en eller flere forskjellige polypeptider som er karakteristisk med B. bronchiseptica eller et annet patogen), eller kan bli koblet til en eller flere andre forbindelser for å forsterke immunogenisiteten.

Fimbrialpolypeptidet ifølge foreliggende oppfinnelse kan bli dannet ved rekombinante DNA-teknikker eller syntetisk, for eksempel ved homogen eller ved fast-fase polypeptidsyntese.

De bestemte aminosyresekvensene til egnede immunogene fimbrialpolypeptider kan bli avledet fra aminosyresekvensen ifølge sekvens ID NO: 2,4 eller 6 og eventuelt også fra den romlige konfigurasjonen til fimbrialproteinet.

Et antall metoder er blitt utviklet for å bestemme beliggen-heten til immunogene viktige epitoper på proteinene.

Resultatet av de kombinerte antagelsene sier mye om de antigene setene.

Egnede fimbriale polypeptider kan bli valgt fra de mest hydrofile delene av fimbrialproteinet, for eksempel ved anvendelse av teknikken beskrevet av Hopp og Woods [T.P Hopp og K. R. Woods (1981): Proe. Nati. Acad. Sei, USA. 78, 3824-3828]. En annen egnet metode for selektering av slike polypeptider er beskrevet av Chou og Fasman [P.Y. Chou og G.D. Fasman (1987) Advances in Enzymology 47, 45-148].

Forskjellige ytterligere algoritmer kan bli anvendt for endelig å bestemme de viktige antigene regionene på B. bronchiseptica fimbrialproteinet, så som en antagelse om fleksibiliteten til polypeptidkjeden (P.A. Karplus og G.E. Schultz, 1985. Naturwissenschaften 72,212-213), en betadreiet sannsynlighetsprofil til B. bronchiseptica fimbrialproteinet ifølge P.Y. Chou og G.D. Fasman, 1979, [Biophys. J. 26,367-385), sannsynlighetsprofiler i tre konformasjoner for sekvensen til B. bronchiseptica fimbrialproteinene ifølge Gascuel, O og J. L. Golmard, 1988 [CABIOS 4, 357-365], en antagelse om den sekundære strukturen av sekvensen til B. bronchiseptica fimbrialproteinet ifølge J. Novotny og C. Auffray, 1984 [Nucleic Acids Research 12, 243-255].

Ytterligere informasjon angående beliggenheten til relevante epitoper kan bli oppnådd ved anvendelse av PEPSCAN-metoden, utviklet av Geysen og Meloen [H.M. Geysen, R.H. Meloen og S.J. Barteling (1984); Proe. Nati. Acad. Sei., 81 (13): 3998-4002]. Denne metoden anvender syntetiske peptider med tilstrekkelig lengde for å reagere i en enzymkoblet immunosorbent analyse. Disse peptidene blir syntetisert ifølge en gitt DNA-sekvens. De er karakterisert ut fra det faktumet at det første peptidet omfatter aminosyre nr. 1-9, det andre peptidet omfatter aminosyre nr. 2-10 osv. Hvert peptid blir testet for dets reaktivitet med antisera eller monoklonale antistoffer. Reaktive peptider må følgelig representere en immunogen epitope.

For å identifisere immunreaktive epitoper (og å korrelere disse reaktivitetene med det fysiske kartet til fimbrial-proteinet) kan DNA-fragmenter fra fimbrialproteingenet bli uttrykt i egnede plasmider, så som pEX-plasmidene [K. Stanley og J.P. Luzio, 1984, EMBO J. 3,1429-1434 og J.G. Kusters, EJ. Jager og B.A.M. Van der Zeijst, 1989. Nucl. Acids. Res., 17,8007]. I dette systemet fører heterolog ekspresjon til

syntese av en C-terminal ekstensjon av cro-p-galaktosidase hybridproteinet. Restriksjons©endonukleaseseter i fimbrialprotein-DNA-sekvensene kan bli anvendt for å oppnå fragmenter av fimbrialproteingenet for innskudd inn i pEX-plasmidene. pEX-kloner som syntetiserer fusjonsproteiner avledet fra forskjellige overlappende regioner av fimbrialproteinet blir deretter anvendt for ytterligere karakterisering. pEX-

kodede fimbrialproteinfragmenter blir renset, separert ved polyakrylamid

gelelektroforese og blottet på nitrocellulose-membraner. Disse membranene blir deretter reagert med sera fra griser eller hunder som er immune overfor B. bronchi-septica. Bare fragmenter inneholdende de immunreaktive epitopene reagerer med disse seraene. For å oppstille den minimale lengden av epitopene kan DNA-innskuddene til de

reaktive klonene progressivt bli forkortet ved eksonuklease III-spaltning, eller ved kloning av syntetiske oligo-nukleotider kodende for små overlappende deler av fimbrialproteinet J.G. Kusters, E.J. Jager, G. Koch, J.A. Lenstra, W.P.A. Posthumus, R.H. Meloen og B.A.M. Van der Zeijst, 1989, J. Immunol., 143,2692-2698]. Epitopene kan deretter bli testet for beskyttende effektivitet.

Ifølge en spesiell utførelsesform av foreliggende oppfinnelse blir et fimbrialproteinspesifikt polypeptid produsert ved ekspresjon av et polynukleotid hvor i det minste en del av polynukleotidene sekvens ID NO: 1,3 eller 5 danner en del av et rekombinant polynukleotid. Det rekombinante polynukleotidet kan fortrinnsvis være basert på en vektor med et B. bronchisepticaspesifikt polynukleotidfragment innskutt deri. Egnede vektorer er plasmider, bakteriofager, kosmider, vimser, minikromosomer eller stabilt integrerte vektorer, i det sistnevnte gjelder spesielt for plante- eller dyreceller. Disse vektorene har egenskapen autonom replikasjon med unntagelse av de stabilt integrerende vektorene som innskyter seg selv i det genetiske materialet til vertscellen og replikerer med vertens genetiske materiale. Egnede vertsceller kan enten være prokaryotiske eller eukaryotiske, så som bakterier, gjær, mykoplasmer, alger, planteceller eller dyreceller. Planteceller eller dyreceller kan bli dyrket in vitro eller kan danne en del av henholdsvis en inntakt plante eller et dyr. Det rekombinante polynukleotidet kan inneholde som et innskudd et fullstendig polynukleotid kodende for fimbrialproteinet eller et fragment derav. Innskuddet kan omfatte en enkelt kodende sekvens, eller flere kopier av den

samme kodende sekvensen, eller et hybrid polynukleotid inneholdende minst en

firnbrialprotein kodende sekvens og minst en annen sekvens så som en annen del av den fimbrialprotein kodende sekvensen eller et polynukleotid kodende for et protein som er karakteristisk med et annet patogen eller for et inert protein som virker som en bærer for minst et lite fimbrialpolypeptid.

Et spesifikt tilfelle av ovennevnte overførselsform vedrører rekombinante polynukleotider med virale vektorer som er direkte nyttige som såkalte vektor vaksiner. Virus som kan anvendes for dette formålet bør ha evnen til å replikere i dyr som skal bli immunisert, dvs. i hunder og/eller svin. Disse virus bør videre ha en genomisk region egnet for innskudd av et fremmed gen (for eksempel kodende for B. bronchisepticafimbrialprotein eller polypeptidet) som også skal bli uttrykt i det vaksinerte dyret. Egnede virus for dette formålet utgjør for eksempel enterale virus så som visse adenovirus.

Som angitt ovenfor er proteiner og polypeptider, og rekombinante polypeptider ifølge oppfinnelsen nyttige for frem-stilling av vaksiner. Disse vaksinene utgjør også derfor en del av oppfinnelsen.

En spesiell anvendelse vedrører bakterielle vektorvaksiner. Bakterier med evne for kolonisering av hunder og/eller svin blir transformert for å muliggjøre at de uttrykker et fimbrialprotein eller fimbrialpolypeptid på en slik måte at det vil føre til en immunogen respons mot B. bronchiseptica. Egnede bakterier for dette formålet er for eksempel Salmonella bakterier.

En vaksine ifølge oppfinnelsen kan også inneholde hjelpe-bestanddeler for vaksinen, så som bærere, buffere, stabili-serings midler, oppløsningsmidler, adjuvanser og konser-veirngsmidler. Disse vaksinene er fortrinnsvis frysetørkede produkter som blir rekonstituert ved tilsetning av en egnet væske (vann, buffer) før applikasjon.

Vaksinen kan for eksempel bli applisert oralt, intranasalt eller intramuskulært.

Vaksinen kan i tillegg inneholde andre immunogener for at dyrene skal bli immunisert (hunder og svin) så som immunogent materiale karakteristisk for virus så som pseudorabies virus, influensa virus, transmissible gastroentritis virus,

parvo virus, grise endemisk diaré virus, hog cholera virus eller immunogent materiale karakteristisk for mycoplasma, så som Mycoplasma hyponeumoniae og Mycoplasma lyorhinis, eller immunogent materiale karakteristisk for bakterier, så som Escherichia coli, Leptospira, Actinobacilluspleuro-pneuminiae, Pateurellamultocida, Streptococcussuis, Treponema hyodysenteriae.

Oppfinnelsen vil nå bli illustrert med følgende arbeidseksempler.

EKSEMPEL 1

KARAKTERISERING AV FIMX- GENET

MATERIALER OG METODER

Bakteriestammer, medier og vekstbetingelser. Alle anvendte bakteriestammer er oppført i tabell l.

Alle Bordetella stammene ble dyrket på Bordet-Gengou agar (Difco Laboratories, Detroit, MI) tilsatt 1% glycerol og 20% defibrinert saueblod eller i Tryptose fosfat næringsløsning (TPB) (Difco Laboratories, Detroit, MI). For å undertrykke ekspresjonen av virulensgenene ble mediet tilsatt 20 mmol/1 MgSCV B. bronchiseptica stamme 401 og anvendt for DNA-preparater. Escherichia coli stamme PC2495 ble anvendt for propagering av vektoren Bluescript (Stratagene) og derivatene derav. Stamme PC2495 ble dyrket på Lureano-Bertoni (LB) bouillon eller LB agar. Ampicillin (50-100 ug/ml resp.), 50 ug/ml 5-brom-4-klor-3-indolyl-p-D-galaktopyranosid (X-gal) og 20 (ig/ml isopropyl-P-D-thiogalaktopyranosid (IPTG) ble anvendt for identifikasjon av plasmid inneholdende stammer inneholdende et DNA-innskudd. Alle bakteriekulturene ble dyrket ved 37°C i 16-24 timer.

Rekombinante DNA metoder

Kromosomalt DNA ble isolert fra Bordetella stammer som beskrevet av Maniatis et al.

[T. Maniatis, E.F. Fritsch og J. Sambrook 1982. Molecular cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, new York: Cold Spring Harbor Laboratory

Press]. Etter spaltning ble DNA-elektroforesen utført i 1% agarosegeler i TAE buffer (40 mmol/1 Tris-acetat, 2 mmol/1 EDTA) inneholdende 1 u,g/ml ethidiumbromid. Gene Clean kit ble anvendt for å isolere DNA fragmenter fra agarosegelene

(Bio Inc. 101 Corp., La Jolla). Ende-merking av oligonukleo-tidene ble utført med [y-P]dATP ved anvendelse av T4 polynukleotidkinase [Maniatis et al.]. Hybridiseringen ble utført i 5 x SSPE, 5 x Denhardts oppløsning, 0,1% SDS og 100 ug/ml laksesperm DNA ved 55 °C. Blotene ble vasket med 5 x SSPE og 0.1% SDS ved 55 °C.

Southern blot analyse

Kromosomalt DNA av B. bronchiseptica stammen 401 ble renset og spaltet med flere restriksjonsenzymer. Fragmenter ble separert ved elektroforese, overført til en nylonmembran og hybridisert med en DNA probe avledet fra fimX-fimbrial subenhetgenet til B. pertussis. DNA fragmentene av interesse, identifisert fra hybridiseringssignalene ble isolert av Gene Clean kit (Bio Inc. 101 Corp., La Jolla). Etter ligering inn i Bluescript vektor (Stratagene) ble kromosomale DNA-

fragmenter transformert til Escherichia coli, stamme PC2495, ifølge CaCb-metoden [Dagert, M., og Ehrlich, S.D. 1979. Forlenget inkubasjon i kalsiumklorid forbedrer kompetansen til Escherichia coli cellene. [Gene 6:23-28]. Positive kolonier ble identifisert etter hybridisesering.

Nukleotidsekvensbestemmelse

Plasmid ble isolert ifølge alkalisk lyseringsmetode [H.C. Birnboim og J.A. Doly, 1979. Nukleotidsekvensen til de klonede innskuddene ble bestemt ved dideoksykjedetermineringsmetoden [F. Sanger, S. Nicklen, A.R. Coulson 1977. DNA sequencing with chain©terminating inhibitors, proe. Nati. Acad. Sei. USA 74: 5463-5467] ved anvendelse av T7 polymerase sekvenseringskitet (Amersham). Analyser av DNA sekvens data ble utført med PC/Gene software (release 6.5,

Genofit, Heidelberg S.A., Geneva, Switzerland).

Delvis fimbriaerensing

B. bronchiseptica stamme 401 ble dyrket på Tryptosefosfatagar (Difco Laboratories, Detroit, MI). Bakteriene ble vasket i fosfatbufret saltvann (PBS). Bakteriepelleten ble suspendert i 15 ml fosfatbufret saltvann tilsatt 4 mol/I ureum. Denne suspensjonen ble plassert ved 40åøåC i 30 minutter. Bakteriene ble fjernet fra suspensjonen ved sentrifugering ved 20.000 rpm (Beckman, JA20 rotor) i 10 minutter. Fimbriae ble isolert fra supernatanten etter sentrifugering ved 40.000 rpm (Beckman ultracentrifuge, Ti60 rotor) i 16 timer. Pelleten ble deretter suspendert i 5 ml fosfatbuffret saltvann. Proteinkonsentrasjonen ble bestemt med Bicinchonin syre (BCA) analyse (Pierce Chemical Company, USA). Proteinanalyse ble utført på et 15% SDS-polyakrylamidgel elektroforesesystem.

RESULTATER

Sekvensanalyse og oppstilling

Et BamHI-EcoRI DNA fragment avledet fra fimX-genet til B. pertussis ble anvendt som en probe for å identifisere B. bronchiseptica kromosomal DNA-fragmenter inneholdende fim gener. Et 1.3kb Pstl DNA-fragment fra B. bronchiseptica, som hybridiserer til fimX-proben, ble isolert og sekvensert. På dette fragmentet var det fullstendige fimX-genet, inkludert promotersekvensene foran genet, beliggende (sekvens ID NO: 1).

E. coli PC 2495 bakterier inneholdende plasmid pIVN 3-420 inneholdende det fullstendige fimX-genet ble deponert til Centraalbureau voor Schimmelcultures, Baarn, Nederland 13. august 1992, under deponeringsnummer CBS 364.92.

Ekspresjon av fimX-genet til B. bronchiseptica

For å identifisere fimX-produktet ble en delesjonsmutant stamme som ikke kan uttrykke fimX genet konstruert. Denne mutante stammen ble konstruert ved generstatning. Frem til nå var et sentralt EcoRV-fragment av B. bronchiseptica fimX-genet erstattet med et kanamycingen og klonet i Bluescript vektoren. Denne konstruksjonen ble anvendt for generstatning i B. bronchiseptica (fig. 1). En kanamycin resistent mutant stamme ble identifisert. Stammen hybridiserte ikke deretter med EcoRV fragmentet. Fra denne mutante stammen ble delvis rensede fimbriae dannet. Denne rensingen av fimbriae fra fimX-negative stammen sammenlignet med villtype stammen viste klart av fimX-genet blir uttrykt i et høyt nivå i B.bbronchiseptica (fig. 2).

EKSEMPEL 2

Karakterisering av fim2- og fim3-fimbrialsubenhetgenet til Bordetella bronchiseptica

MATERIALER OG METODER

Bakterielle stammer, plasmider og vekstbetingelser.

Villtype B. bronchiseptica stammen som ble anvendt ble isolert fra hunder som lider av kennelhoste. Denne stammen ble oppnådd fra Dr. J.M. Musser (stammen nr. 685) og betegnet nr. 401. Denne stammen ble dyrket i tryptosefosfatnæringsløsninge eller agar (Difco Laboratories, Detroit, MI). B. pertussis stamme Wellcome 28 [A. Robinson, L.A.E. Ashworth, A. Baskerville og L.I. Irons. 1085. Proceedings of the 4th International Symposium on pertussis, Geneva, 1984. Dev. Biol. Stand.

61:165-172] ble dyrket på Bordet Gengou agar (Difco Labora-tories, Detroit, MI). For ikke-virulent B. bronchiseptica ble vekstmediet tilsatt med 20 mmol/1 MgS04. E. coli Kl 2 stamme PC2495 ble anvendt som vert for kloningsvektor pBluescript. E. coli stammen ble dyrket på LB-agar eller LB-næringsløsning tilsatt 100 ug/ml amp.: 50 mg/ml X-Gal og 20 mg/ml IPTG for identifisering av rekombinante stammer inneholdende et klonet DNA-fragment. Alle bakterielle kulturer ble dyrket ved 37°C i 16-48 timer.

DNA-isolering og nukleotidsekvens bestemmelse.

Isolering av kromosomalt DNA ble utført ifølge Manniatis et al. Plasmidisolering ble utført ifølge metoden til Bimboim og Doly. Kromosomale DNA fragmenter ble isolert fra TAE (40 mmol/1 Tris-acetat, 2 mmol/1 EDTA) agarosegeler ved anvendelse av Gene Clean kit (Bio Inc. 101 Corp., La Jolla). DNA fragmenter ble ligert i pBluescript KS M13+ og M13-(Stratagene, La Jolla, CA) for alle kloningsformål. Nukleo-tidsekvensbestemmelsen ble utført med T7-polymerasesekvens kittet (Amersham) ved dideoksykjedetermineringsmetoden til Sanger et al. PC/Gene computing software (release 6.5, Genofit, Heidelberg S.A., Geneva, Switzerland) ble anvendt for analysering av DNA-sekvensdataene. Restriksjonsenzymer og

T4 DNA-ligase ble oppnådd fra Pharmacia og ble anvendt ifølge instruksjonene til forhandleren. Plasmider ble transformert til E. coli stamme PC2495 ved CaClVÆ metoden til Dagert og Ehrlich.

Southern blotting

Southern blotting ble utført ifølge Maniatis et al.

SDS-polyakrylamid gelelektroforese og

immunologiske teknikker.

For SDS-PAGE og Western blot analyse ble like mengder

bakterier anvendt. Bakteriene ble høstet i fosfatbuffret saltvann (PBS) og fortynnet til ODeoo = 1.0. Fra denne suspensjonen ble 50 ul Iysert i 20 ul Laemmli-buffer og elektroforert på 15% akrylamidgeler som beskrevet av Laemmli (Laemmli, U.K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227:680-685). Overføring av proteinene til nitrocellulose ble vesentlig utført som beskrevet av van Embden et al. (J.D.A. van Embden, H.J. van der Di\onk, H.J. van Eijk, H.G. van der Heide, J.A. de Jong, M.F. van Olderen, A.D. Osterhaus, L.M. Schouls, 1983. Molecular cloning and expression of Treponema pallidum DNA i Escherichia coli Kl 2. Infect. Immun. 42:187-196). Polyklonale antistoffer dannet mot SDS-denaturert serotype 2 eller 3 fimbrial subenhet proteinene fra B. pertussis ble anvendt for deteksjon av B. bronchiseptica fimbrial subenhetproteiner.

Fim2- og fim3-spesifikke monoklonale antistoffer dannet mot B.

pertussis ble anvendt i en ELISA på flatbunnede mikrotiterskåler belagte med hele bakterier (OD60o= 0.1,1:10 fortynnet i 15 mmol/1 Na2C03, 35 mmol/1 MaC03 pH 9.6). Bundet geite anti-muse IgG-peroksidase konjugat (Nordic) ble bestemt med 2,2'-azino-bis(3-etylbenzthiazolin-6-sulfinsyre (ABTS) (Sigma). Absorbansen ble målt ved 405 nm.

Elektronmikroskopi.

For elektronmikroskopi ble en B. bronchiseptica kultur fortynnet i PBS-buffer. Pilioformbelagte kobbergitter ble plassert på 50 ul bakteriell suspensjon i 5 min. Gifterene ble vasket to ganger i H20 =. Fargingen ble utført i løpet av 2 min

i 1% TPA (Tungstofosforsyre, Merck). Formene ble undersøkt i et Philips EM 201 elektronmikroskop.

RESULTATER

Nukleotidsekvensen til fim2- og fim3- fimbrialsubenhetgener.

B. bronchiseptica fim2- og fim3-subenhetgenene kunne bli identifisert på grunnlag av deres homologi med B. pertussis fim2- og fim3-gener. Et AccL-Pstl DNA-fragment på lOOObp ble anvendt som en probe for fim2-genet [I. Livey, C.J. Duggleby og A. Robinson, 1987. Cloning and nucleotide sequence analysis of the serotype 2 fimbrial subunit gene of Bordetella pertussis, Mol. Microb. 1:203-209], Et Sall-DNA-fragment på 900 bp ble anvendt som en probe for fim3-genet [Mooi, F.R., A ter Avest, og H.G.J, van der Heide. 1990. Structure of the Bordetella pertussis genecoding for the serotype 3 fimbrial subunit. FEMS Microb. Lett. 66: 327-332]. Hybridisering av kromosomalt DNA fra B. bronchiseptica, spaltet med restriksjonsendonuklease Pstl, ga flere positive signaler med begge probene på grunn av homologi mellom de to probene. To regioner av DNA-fragmentene ble isolert fra B. bronchiseptica kromosomalt DNA som ga det sterkeste signalet med enten fim2- eller fim3-proben. Disse Pstl DNA-fragmentene var på omtrent 2.3 kb og 2.8 kb og ble klonet inn i Bluescript vektoren. Etter transformering og koloniløfting ble to kloner identifisert ved hybridisering med en av fim probene. En klon, med et innskudd på 2.3 kb, kodet for fim2 (pIVB3-402)-genet. Den andre klonen, med et innskudd på 2.8 kb, kodet for fim3 (pIVB3-430) genet til B. bronchiseptica. Nukleotidsekvensen til begge genene ble bestemt og er representert som sekvens ID NO 3 (fim2) og sekvens ID NO 5

(fim3). E. coli bakteriene PC 2495 (pIVB3-402) og PC 2495 (pIVB3-430) ble deponert til Centraalbureau voor Schimmelcutlures Baam, Nederland 13. august 1992 under numrene CBS 362.92 og CBS 361.92

EKSEMPEL 3

Konstruksjon av to Bordetella bronchiseptica stammer

som ikke produserer en type fimbriae

Bordetella bronchiseptica stammer som ikke produserer fimX-fimbriae (BbfX) eller fim2-fimbriae (Bbf2) er blitt konstruert. Dette ble oppnådd ved generstatning med de ødelagte genene etter homolog rekombinasjon. De ødelagte genene ble transformert til B. bronchiseptica ved elektroporasjon. Delesjonen i fimbrialsubenhetgenene ble konstruert ved erstatning av et EcoRV-fragment i villtype genene med et kanamycinresistensgen.

MATERIALER OG METODER

Bakterielle stammer, plasmider og vekstbetingelser.

Villtype B. bronchiseptica stamme nr. 401 ble anvendt i alle eksperimentene. Bakterien ble oppnådd fra Dr. J.M. Musser (stamme nr. 685). Denne stammen ble dyrket på tryptosefosfat agar (TPA) (Difco Laboratories) eller på Bordet Gengou (BG)

agar (Difco Laboratories) tilsatt med 15% friske saueerythrocyter, ved 37°C i 24-48 timer. For kloningsformål ble Escherichia coli Kl 2 stamme PC2495 anvendt med Bluescript KS og SK plasmid (Stratagene). E. coli PC2495 ble dyrket på

Luria Bertoni agar med riktige antibiotika i løpet av 16timer ved 37°C. For ampicillin og/eller kanamycin ble enkonsentrasjon på 100 ug/ml anvendt.

Rekombinante DNA teknikker

Kloningsprosedyrene ble utført som beskrevet av Maniatis et al. Hvert fimbrial subenhetgen, inkludert ved siden avliggende sekvenser, ble klonet i Bluescript vektoren. Disse vektorene ble isolert ved alkalisk ekstraheirngsmetode til Birnboim og Doly. Et DNA-fragment innenfor et subenhetgen ble erstattet med et kanamycinresistensgen [A. Labigne-Roussel, J. Harel og L. Tompkins. 1987. Gene transfer from Escherichia coli to Campylobacter species: Development of shuttle vectors for genetic analysis of Campylobacter jejuni. J. Bacteriol. 169:5320-5323]. Denne sistnevnte konstruksjonen ble anvendt i elektroporasjonseksperimentene.

Elektroporasjonseksperimenter

Elektroporasjonen ble utført vesentlig som beskrevet av Miller et al. [J.F. Miller, WJ. Dower og L.S. Tomkins, 1988. High-voltage electroporation of bacteria: Genetic transfor-mation of Campylobacter jejuni with plasmid DNA. Proe. Nati.

Acad. Sei. USA 85:856-860]. Villtype B. bronchiseptica stamme401 ble dyrket på BG-agar i 16 timer. Cellene ble høstet i 1 ml av en 15% glycerol-272 mmol/1 sukrose oppløsning (GlySuc) (0°C), vasket og resuspendert i 400 ul GlySuc. Fra denne suspensjonen ble alikvoter på 50 fil frosset ved -80°C. Disse alikvotene ble anvendt i elektroporasjonseksperimentene for å transformere B. bronchiseptica med 1-3

ug DNA, oppløst i destillert vann. Elektroporasjonsbetingelsene som ble anvendt er:0,7kV, 25uF og 600Q (Biorad Gene Pulser, ved anvendelse av 0.56 mm gap-kuvetter fra Biotechnologies and Experimental Research, Inc., San Diego,

CA). Tidskonstantene som ble målt var mellom 3.5-7 ms. Cellene ble isolert i 1 ml tryptosefosfatnæringsløsning (Difco Laboratories) i løpet av 90 minutter ved 37°C og sådd ut på TPA (Difco Laboratories) inneholdende 100 ug/ml kanamycin.

Screening av rekombinante stammer ble utført ved Southem blotting på kromosomale DNA-preparater.

Kromosomal DNA rensing og Southem blot analyser

Kromosomalt DNA ble renset ifølge Maniatis et al. Southern blot analyse ble utført som tidligere beskrevet.

DNA-prober anvendt i hybridiseringseksperimentene

For hybridiseringseksperimenter vedrørende fimX-genet ble to prober anvendt og angitt som fXEv og OSE. Et 450bp DNA-fragment, anvendt som probe fXEv, ble isolert fra spaltning av pIVB3-426 med restriksjonsendonuklease EcoRV (fig. 3). 580bp DNA fragmentet til proben f3SE ble oppnådd etter spaltning av pIVB3-430 med restriksjonsendonukleasene SphI og EcoRI (fig. 4). For hybridiseringseksperimentene vedrørende fim2 genet ble tre prober anvendt og angitt som f2Ev, kana og f2PE (fig. 5). Probe f2Ev var et 900bp EcoRV DNA fragment isolert fra pIVB3©417, probe kana var et 900bp EcoRV DNA-fragment innenfor kanamycingenet og probe f2PE var et 610bp Pstl-EcoRV DNA-fragment av pIVB3-417.

RESULTATER

To plasmider med DNA fragmenter inneholdende enten fimX eller

fim2-fimbrial subenhetgen ble anvendt for å transformere villtype B. bronchiseptica bakterier ved elektroporasjon. Genene til begge subenhetene ble ødelagt ved erstatning av et EcoRV DNA-fragment med et kanamycin resistens gen. Før dette kunne bli utført var det nødvendig å fjerne det tredje EcoRV setet til stede i polylinkeren til Bluescript vektoren. Dette ble utført ved subkloning av DNA-fragmentene inn i EcoRV Bluescriptvektoren som resulterte i pIVB3-426 for fimX og pIVB3-417 for fim2 (fig. 3, 5). Begge klonene ble deretter spaltet med restriksjonsendonuklease EcoRV. Med denne spaltningen ble et fragment på 450 bp fjernet fra fimX genklonen (pIVB3-426) inkludert 51 promotersekvensene (fig. 3). Etter at EcoRV fragmentet var tjernet ble vektoren med gjenværende DNA sekvenser isolert og et 1.4kb Smal-HincII DNA fragment inneholdende et kanamycinresistensgen ble klonet inn i EcoRV setene. Transformering til E. coli PC2495 ble utført ved plasmidisolering og ga klon pIVB3-427 (fig. 3). Den samme strategien ble fulgt for fim2-fimbrial subenhetgenet. Spaltning av klon pIVB3-417 med restriksjonsendonukleasen EcoRV (fig. 5) fjernet et 900bp DNA fragment mot 3' delen av genet sammen med ved siden av liggende sekvenser. Ligering av kanamycinresistens genet i konstruksjonen ga klonen pIVB3-418 (fig. 59).

Begge plasmidene ((pIVB3-427 og pIVB3-418) ble isolert og separat anvendt i elektroporasjonseksperimenter for å transformere B. bronchiseptica. Etter hvert elektroporasjonseksperiment ble opp til 10 andre kanamycin resistent B. bronchiseptica-kolonier observert. Etter elektroporasjon med plasmid pIVB3-427 (partiell fimX-fimbrialsubenhetgen), ble 4 kolonier analysert (fXI-IV). Etter elektroporasjon med plasmid pIVB3-418 (partiell fim2-fimbrialsubenhetgen), ble 7 kolonier analysert (fil-VII). Kromosomalt DNA ble isolert fra disse kanamycinresistente B. bronchiseptica stammene og spaltet med Pstl- og EcoRV-restriksjonsendonukleaser. En Southem hybridisering ble utført med spaltet kromosomalt DNA, isolert fra kanamycinresistensstammene og villtype B. bronchiseptica stammen. Spaltet kTomosomlat DNA fra fire stammer isolert etter elektroporasjon med pIVB3-427 ble hybridisert med henholdsvis probene fXEv og f3SE (fig. 3,4). Spaltet kromosomalt DNA til 7 stammer isolert etter elektroporasjon med plasmid pIVB3-418 ble hybridisert med henholdsvis probene f2Ev, kan og f2SE (fig. 5). Ut fra hybridiseringsmønstrene med probene fXEv og f2Ev fremkom det klart at rekombinante stammer som enten mangler en del av fim (fig. 6A, 6B) eller fim2 (fig. 7A, 7B), fimbrialsubenhetgenet, ble isolert. Fra hybridiseringseksperimenter med kanamycin genet som en probe ble det demonstrert for fim2-genet at alle de isolerte stammene (f2I-VII) inneholdt kanamycingenet (fig. 7C).

På grunn av at kanamycingenet var til stede i alle fim2-rekombinante stammer kunne generstatning av oppstått i et av de andre fimbrialsubenhet genene på grunn av homologier blant subenhetgenene. For å bestemme om dette var tilfelle ble hybridiseringseksperimenter utført under betingelser med lav stringens hvor krysshybirdisering kunne bli observert ved anvendelse av prober avledet fra de andre subenhetgenene. Hybridiseringseksperimenter på fimX-kanamycinresistente B. bronchiseptica stammer (fX I-IV) med fiSE probe (fim3-subenhetgenet) demonstrerte at generstatning i fimbrialsubenhetgenet oppsto bare innenfor stammen BbFX\ I denne stammen og også i de andre rekombinante stammene (fX II-IV) var hybridiseringssignaler med DNA-fragmenter inneholdende fim3- og fim2-genene tilstede (fig. 6C). På grunn av at disse sistnevnte signalene var de samme som i villtype B. bronchiseptica hadde ingen rekombinasjon i et eller annet subenhet gen oppstått (fig. 6C). Hybridisering av fim2-mutante stammer med f2PE proben viste at generstatningen i fim2-genet bare var oppstått innenfor stammen BbF2" (fig. 7D). Med anvendelse

av denne proben ble hybridiseringssignaler med alle tre subenhetgenene observert. På grunn av at Pstl-EcoRV fragmentet (probe f2PE) er til stede innenfor pIVB3-418, anvendt i elektroporasjonen, kan et fjerde hybridiseirngssignal bli observert i de

rekombinante stammene (f2II-VII). Dette indikerer at plasmidet pIVB3-418 fortsatt kan være til stede i de kanamycinresistent stammene. Rekombinasjon har sannsynligvis oppstått andre steder i kromosomet ved en uidentifisert beliggenhet på utsiden av et fimbrialsubenhetgen.

EKSEMPEL 4

Vaksinasjonseksperiment med Bordetella bronchiseptica

mutantene BBFX" og BBF2" i mus

MATERIALER OG METODER

Tre grupper med hver 80 mus (6 uker gamle hunn BALB/C mus)ble infisert intranasalt med villtype B. bronchiseptica, BbfX" og Bbf2' (siste to dannet ifølge eksempel 2) (2 x 10e7 cfu hver). Antall levedyktige bakterier i åndedrettskanalen til 8 mus ble bestemt ved bestemte tidsintervaller (0,1, 3,7,11 og 36 dager). I hver mus ble luftrøret, nese, nese-svelg og lunger undersøkt for tilstedeværelse av IevedyktigebB. bronchiseptica. Musene ble avlivet ved en barbituratinjeksjon omtrent 1 time etter infeksjon (angitt som dag 0) og på de forskjellige dagene deretter. Lungene og luftrøret ble fjernet og homogenisert i PBS med vevsmaler. "Noseswabs"ble tatt med "eat gut". "Cat gut" ble plassert i 0.5 ml PBS og vorteks behandlet i 5 minutter. Nese-svelget ble skylt med PBS helt til 5 dråper (omtrent 0.5 ml) ble samlet. For-tynninger av alle homogenater og dråpene til nesesvelget ble sådd ut på tryptosefosfatagar og CFU ble telt etter 2

dagers inkubasjon.

52 dager etter vaksineringen ble grupper vaksinert med BbfX* eller Bbf2" og en ikke-vaksinert kontrollgruppe utsatt for en virulent B. bronchiseptica stamme. Kolonisering av ånde-drettskanalen ble målt på dagene 0,1,4 og 14 etter eksponering.

RESULTATER

Resultatene på kolonisering av øvre åndedrettskanal fra begge de mutante stammene og villtype stammen blir sammenlignet. Det er ingen forskjell i kolonisering i de forskjellige organene til den øvre åndedrettskanalen etter at de ble utsatt for BbfX" eller Bbf2" mutant stamme sammenlignet med villtype stammen. På dag 36 ble mus fra BbfX" og Bbfi" gruppene screenet for tilstedeværelse av Bordetella. Lunger og luftrør var fri for Bordetella, mens små mengder Bordetella var fortsatt til stede i nese og nesesvelget. 52 dager etter vaksinering ble musene vaksinert med BbfX" og Bbf2' mutanter og en kontrollgruppe ble eksponert for en virulent B. bronchiseptica stamme. Kolonisering av nese"svelget med virulent B. bronchiseptica stamme ble ikke forhindret i begge de vaksinerte gruppene. Lunge og luftrør kolonisering av villtype stammen i vaksinerte grupper kunne bare bli demonstrert 1 time etter eksponering, mens kontrollgruppen var omfattende kolonisert.

Kolonisering av nesen til mus vaksinert med mutant stamme kunne bare bli detektert på dag 0 og i noen mus på dag 1, mens nesen til mus fra kontrollgruppen var kraftig kolonisert.

Claims (5)

1. Polypeptid, karakterisert ved at det omfatter et fimbrialt protein fra B. bronchiseptica med aminosyresekvensene representert ved seq id no. 4 og 6, funksjonelle fragmenter derav og sekvenser inneholdende konservative substitusjoner av disse.

2. Polynukleotid, karakterisert ved at det blir valgt fra nukleotidsekvensene representert ved seq id no. 3 eller 5, og koder for et polypeptid ifølge krav 1.

3. Ekspresjonsvektor, karakterisert ved at den omfatter polynukieotidsekvensen ifølge krav 2.

4. Vaksine for å bekjempe B. bronchiesepticainfeksjon, karakterisert ved at den inneholder en effektiv mengde av et polypeptid ifølge krav 1 eller en ekspresjonsvektor ifølge krav 3.

5. Anvendelse av et polypeptid ifølge krav 1 for fremstilling av et farmasøytisk preparat for å bekjempe B. bronchiespticainfeksjoner.